CN113121639A

CN113121639A - 澳瑞他汀类似物及其偶联物、其制备方法及其应用

Info

Publication number: CN113121639A
Application number: CN202011603851.7A
Authority: CN
Inventors: 许建烟; 章瑛; 贺峰; 陶维康
Original assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd; Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd; Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2019-12-30
Filing date: 2020-12-30
Publication date: 2021-07-16

Abstract

本公开涉及澳瑞他汀类似物及其偶联物、其制备方法及其应用。具体而言，本公开提供了一种具有式(D)所示结构的MMAE类似物，偶联物，其制备方法，含有其的药物组合物，以及其通过受体调节在制备治疗癌症的药物中的用途。其中通式(D)中的各取代基与说明书中的定义相同。

Description

澳瑞他汀类似物及其偶联物、其制备方法及其应用

技术领域

本公开涉及一类药物澳瑞他汀(MMAE)类似物的配体-药物偶联物。具体地说，本公开涉及一种含全新结构毒素的抗体-药物偶联物，及其制备方法，和包含所述偶联物的药物组合物以及所述偶联物或药物组合物的用途。

背景技术

抗体药物偶联物(antibody drug conjugate，ADC)将单克隆抗体或者抗体片段通过稳定的化学接头化合物与具有生物活性的细胞毒素相连，充分利用了抗体对正常细胞和肿瘤细胞表面抗原结合的特异性和细胞毒素的高效性，同时又避免了前者疗效偏低和后者毒副作用过大等缺陷。这也就意味着，与以往传统的化疗药物相比，抗体药物偶联物能精准地结合肿瘤细胞并降低对正常细胞的影响 (Mullard A,(2013)Nature Reviews DrugDiscovery,12:329–332；DiJoseph JF, Armellino DC,(2004)Blood,103:1807-1814)。

2000年第一个抗体药物偶联物Mylotarg(吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuzumabozogamicin)，惠氏制药有限公司)被美国FDA批准上市，用于治疗急性髓细胞白血病(Drugsof the Future(2000)25(7):686；US4970198；US 5079233；US 5585089； US 5606040；US5693762；US 5739116；US 5767285；US 5773001)。

2011年8月，Adcetris(brentuximab vedotin，西雅图基因遗传公司)通过美国FDA快速审评通道，用于治疗霍奇金淋巴瘤以及复发性间变性大细胞淋巴瘤(Nat.Biotechnol(2003)21(7):778-784；WO2004010957；WO2005001038；US7090843A；US7659241；WO2008025020)。

是一种新型靶向ADC药物，能使药物直接作用于淋巴瘤细胞上的靶点CD30后发生内吞作用从而诱导肿瘤细胞的凋亡。

Mylotarg和Adcetris都是针对血液肿瘤进行靶向治疗，血液肿瘤和实体肿瘤相比组织结构相对简单。2013年2月，Kadcyla(ado-trastuzumab emtansine，T-DM1) 获得美国FDA批准，用于治疗HER2阳性同时对曲妥珠单抗(Tratuzumab，商品名：Herceptin)和紫杉醇有抗药性的晚期或转移性乳腺癌受试者(WO2005037992； US8088387)。Kadcyla是美国FDA批准的治疗实体肿瘤的第一个ADC药物。

但仍需进一步开发疗效更好的ADC药物。

发明内容

本公开提供一种新的MMAE类似物，其为如通式(D)所示的化合物：

或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐，其中：

R¹-R⁶选自氢原子、卤素、羟基、氰基、烷基、烷氧基和环烷基；

R⁷选自氢原子、烷基、烷氧基和环烷基；

R⁸-R¹¹之中的任意两个形成环烷基，余下的两个基团任选自氢原子、烷基和环烷基；

R¹²选自氢原子和烷基；

R¹³-R¹⁵选自氢原子、羟基、烷基、烷氧基和卤素；

R¹⁶选自芳基或杂芳基，所述的芳基或杂芳基任选进一步被选自氢原子、卤素、羟基、烷基、烷氧基和环烷基的取代基所取代。

R⁷选自氢原子、烷基、烷氧基和环烷基；

R¹²选自氢原子和烷基；

R¹³-R¹⁵选自氢原子、羟基、烷基、烷氧基和卤素；

R¹⁶选自芳基或杂芳基，所述的芳基或杂芳基任选进一步被选自氢原子、卤素、羟基、烷基、烷氧基和环烷基中的一个或多个取代基所取代。

在本公开的一些实施方案中，如前所述的通式(D)所示的化合物，其为通式(D₁)所示的化合物：

或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐，

R⁹与R¹⁰形成环烷基；

R²-R⁸，R¹¹-R¹⁶如通式(D)中所定义。

在本公开的一些实施方案中，如前任一项所述的通式(D)所示的化合物，其为：

本公开的另一方面涉及一种配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述配体-药物偶联物包含式(-D)所示的结构：

或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，其中：

R²-R⁶选自氢原子、卤素、羟基、氰基、烷基、烷氧基和环烷基；

R⁷选自氢原子、烷基、烷氧基和环烷基；

R¹²选自氢原子和烷基；

R¹³-R¹⁵选自氢原子、羟基、烷基、烷氧基和卤素；

R¹⁶选自芳基或杂芳基，所述的芳基或杂芳基任选进一步被选自氢原子、卤素、羟基、烷基、烷氧基和环烷基的取代基所取代；

波浪线表示氢原子，或与接头单元或与结合靶细胞所表达抗原的抗体共价连接。

R⁷选自氢原子、烷基、烷氧基和环烷基；

R¹²选自氢原子和烷基；

R¹³-R¹⁵选自氢原子、羟基、烷基、烷氧基和卤素；

R¹⁶选自芳基或杂芳基，所述的芳基或杂芳基任选进一步被选自氢原子、卤素、羟基、烷基、烷氧基和环烷基中的一个或多个取代基所取代；

在本公开的一些实施方案中，如前任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述配体-药物偶联物包含式(-D₁)所示的结构：

R⁹与R¹⁰形成环烷基；

波浪线，R²-R⁸，R¹¹-R¹⁶如通式(-D)中所定义。

在本公开的一些实施方案中，如前任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述配体-药物偶联物包含式如下所示的结构：

或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，其中：波浪线表示氢原子，或与接头单元或与结合靶细胞所表达抗原的抗体共价连接。

在本公开的一些实施方案中，如前任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其为通式(Pc-L-D)所示的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐：

其中：

R²-R¹⁶如通式(D)中所定义；

n为1至10，可以为整数，也可以为小数；

Pc为配体；L为接头单元。

在本公开的一些实施方案中，如前任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其为通式(Pc-L-D1)所示的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐：

其中：

R²-R¹⁶如通式(-D)中所定义；

Pc，L，n如通式(Pc-L-D)中所定义。

在本公开的一些实施方案中，如前任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其为如下所示的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐：

Pc，L，n如通式(Pc-L-D)中所定义。

在本公开的一些实施方案中，如前任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中n可以为1-10之间的整数或小数，n可以为1、2、3、4、5、6、 7、8、9或10的均值。n为1至8，可以为整数，也可以为小数；优选为2至8，可以为整数，也可以为小数。

在本公开的一些实施方案中，如前任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中接头单元-L-为-Y-L¹-L²-L³-L⁴，

Y为拉伸单元，选自

或化学健，X₁选自氢原子、烷基，烷氧基，芳基或卤素，X₂选自亚烷基，所述的亚烷基任选进一步被选自卤素、羟基、氰基、氨基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基的一个或多个取代基所取代；

L¹为拉伸单元，选自-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-W-C(O)-、-CH₂-C(O)-NR¹⁷-W-C(O)-和-C(O)-W-C(O)-，其中W选自C_1-8烷基、C_1-8烷基-环烷基和1至8个原子的直链杂烷基，所述杂烷基包含1至3个选自N、O和S的杂原子，其中所述的C_1-8烷基、环烷基和直链杂烷基各自独立地任选进一步被选自卤素、羟基、氰基、氨基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基的一个或多个取代基所取代；

L²选自-NR¹⁸(CH₂CH₂O)_pCH₂CH₂C(O)-、-NR¹⁸(CH₂CH₂O)_pCH₂C(O)-、 -S(CH₂)_pC(O)-和化学键，其中p为1至20的整数；优选为化学键；

L³为由2至7个氨基酸构成的肽残基，所述的氨基酸优选自缬氨酸、瓜氨酸，甲基缬氨酸；其中氨基酸任选进一步被选自卤素、羟基、氰基、氨基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基中的一个或多个取代基所取代；

R¹⁷和R¹⁸相同或不同，且各自独立地选自氢原子、烷基、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基；

L⁴为延伸单元，优选为PAB。

在本公开的一些实施方案中，所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中Y为

在本公开的一些实施方案中，如前任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中L¹选自-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-(CH₂)_s-C(O)-，其中s为2至8的整数；优选为

在本公开的一些实施方案中，如前任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中L³为二肽氨基酸单元，优选自缬氨酸-瓜氨酸。

在本公开的一些实施方案中，如前任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中接头单元-L-选自：

其中a端连着配体，b端连着药物。

在本公开的一些实施方案中，如前任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其选自以下结构式：

其中：

n为1至10，可以为整数，也可以为小数；

Pc为配体。

在本公开的一些实施方案中，如前任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述Pc为抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体选自嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。

在本公开的一些实施方案中，如前任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的抗体或其抗原结合片段选自抗HER2(ErbB2)抗体、抗 EGFR抗体、抗B7-H3抗体、抗c-Met抗体、抗HER3(ErbB3)抗体、抗HER4(ErbB4) 抗体、抗CD20抗体、抗CD22抗体、抗CD30抗体、抗CD33抗体、抗CD44抗体、抗CD56抗体、抗CD70抗体、抗CD73抗体、抗CD105抗体、抗CEA抗体、抗A33抗体、抗Cripto抗体、抗EphA2抗体、抗G250抗体、抗MUCl抗体、抗 Lewis Y抗体、抗VEGFR抗体、抗GPNMB抗体、抗Integrin抗体、抗PSMA抗体、抗Tenascin-C抗体、抗SLC44A4抗体和抗Mesothelin抗体或其抗原结合片段。

在本公开的一些实施方案中，如前任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的抗体或其抗原结合片段选自Trastuzumab、Pertuzumab、Nimotuzumab、Enoblituzumab、Emibetuzumab、Inotuzumab、Pinatuzumab、 Brentuximab、Gemtuzumab、Bivatuzumab、Lorvotuzumab、cBR96和Glematumamab 或其抗原结合片段。

本公开的另一方面涉及一种制备如通式(D)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐的方法，其包括以下步骤：

通式(DA)脱保护反应，得到通式(D)所示的化合物，

其中：R²-R¹⁶如通式(D)中所定义。

本公开的另一方面涉及一种如下所示的化合物：

或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐，可做为制备本公开配体-药物偶联物的中间体。

本公开的另一方面涉及一种制备化合物2或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐的方法，其包括以下步骤：

化合物1和化合物2a进行缩合反应，得到化合物2。

本公开的另一方面涉及一种制备如通式(Pc-L-D)所示的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐的方法，其包括以下步骤：

还原Pc后，与化合物偶联反应，得到通式(ADC-1)所示的化合物；

其中，Pc，n如通式(Pc-L-D)中所定义。

本公开的另一方面涉及一种药物组合物，其含有治疗有效量的如前任一项通式(Pc-L-D)所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，或包含如前任一项通式(D)所示所述的化合物、其可药用盐，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

本公开的另一方面，进一步涉及一种配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐的制备方法，包含将本公开如前任一项所述的通式(D)所示的化合物、化合物2、或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐与配体连接的步骤，优选通过接头连接至配体，优选配体为单克隆抗体。

本公开的另一方面，进一步涉及本公开如前任一项所述的配体-药物偶联物或化合物、或其药学上可接受的盐，或其药物组合物，其用作药物。

本公开的另一方面，进一步涉及本公开如前任一项所述的配体-药物偶联物或化合物、或其药学上可接受的盐，或其药物组合物在制备用于治疗或预防肿瘤的药物中的用途；优选其中所述的肿瘤为选自与HER2、HER3、B7H3、c-Met、HER4、 CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD56、CD70、CD73、CD105、CEA、A33、 Cripto、EphA2、G250、MUCl、Lewis Y、VEGFR、GPNMB、Integrin、PSMA、 Tenascin-C、SLC44A4、Mesothelin和EGFR表达相关的癌症。

本公开的另一方面，进一步涉及本公开如前任一项所述的配体-药物偶联物或化合物、或其药学上可接受的盐，或药物组合物在制备治疗和/或预防癌症的药物的用途，所述癌症优选选自乳腺癌、卵巢癌、***、子宫癌、***癌、肾癌、尿道癌、、膀胱癌、肝癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、食道癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、肺癌(例如，小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、白血病(例如，急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、慢性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病)、骨癌、皮肤癌、甲状腺癌、胰腺癌、***癌和淋巴瘤(例如，霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或复发性间变性大细胞淋巴瘤)。

本公开的另一方面，进一步涉及一种用于治疗和/或预防肿瘤的方法，该方法包括向需要其的受试者施用治疗有效剂量或预防有效剂量的本公开如前任一项所述的配体-药物偶联物或化合物、或其药学上可接受的盐或包含其的药物组合物；优选其中所述的肿瘤为与HER2、HER3或EGFR表达相关的癌症。

本公开的另一方面，进一步涉及一种用于治疗或预防癌症的方法，该方法包括向需要其的受试者施用治疗有效剂量或预防有效剂量的本公开如前任一项所述的配体-药物偶联物或化合物、或其药学上可接受的盐或包含其的药物组合物；所述癌症优选选自乳腺癌、卵巢癌、***、子宫癌、***癌、肾癌、尿道癌、、膀胱癌、肝癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、食道癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、肺癌(例如小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、白血病(例如，急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、慢性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病)、骨癌、皮肤癌、甲状腺癌、胰腺癌和淋巴瘤(例如霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或复发性间变性大细胞淋巴瘤)。

可将活性化合物(例如根据本披露所述的化合物、或其药学上可接受的盐，配体-药物偶联物、或其药学上可接受的盐)制成适合于通过任何适当途径给药的形式，活性化合物优选是以单位剂量的方式，或者是以受试者能够以单剂进行自我给药的方式。本公开的单位剂量的方式可以是片剂、胶囊、扁囊剂、瓶装药水、药粉、颗粒剂、锭剂、栓剂、再生药粉或液体制剂。

本公开治疗方法中所用活性化合物或组合物的施用剂量通常将随疾病的严重性、受试者的体重和活性化合物的功效而改变。不过，作为一般性指导，合适的单位剂量可以是0.1mg至1000mg。

本公开的药物组合物除活性化合物外，可含有一种或多种辅料，所述辅料选自以下成分：填充剂、稀释剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂或赋形剂等。根据给药方法的不同，组合物可含有0.1至99重量％的活性化合物。

含活性成分的药物组合物可以是适用于口服的形式，例如片剂、糖锭剂、锭剂、水或油混悬液、可分散粉末或颗粒、乳液、硬或软胶囊，或糖浆剂或酏剂。可按照本领域任何已知制备药用组合物的方法制备口服组合物，此类组合物可含有粘合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂或药学上可接受的润湿剂等，此类组合物还可以含有一种或多种选自以下的成分：甜味剂、矫味剂、着色剂和防腐剂，以提供悦目和可口的药用制剂。

水悬浮液含有活性物质和用于混合的适宜制备水悬浮液的赋形剂。水混悬液也可以含有一种或多种防腐剂例、一种或多种着色剂、一种或多种矫味剂和一种或多种甜味剂。

油混悬液可通过使活性成分悬浮于植物油中配制而成。油悬浮液可含有增稠剂。可加入上述的甜味剂和矫味剂，以提供可口的制剂。

药物组合物还可以是用于制备水混悬液的可分散粉末和颗粒提供活性成分，通过加入水混合分散剂、湿润剂、悬浮剂或防腐剂中的一种或多种。也可加入其他赋形剂例如甜味剂、矫味剂和着色剂。通过加入抗氧化剂例如抗坏血酸保存这些组合物。

本公开的药物组合物也可以是水包油乳剂的形式。

药物组合物可以是无菌注射水溶液形式。可以使用的可接受的溶媒或溶剂有水、林格氏液和等渗氯化钠溶液。无菌注射制剂可以是其中活性成分溶于油相的无菌注射水包油微乳。例如将活性成分溶于大豆油和卵磷脂的混合物中。然后将油溶液加入水和甘油的混合物中处理形成微乳。可通过局部大量注射，将注射液或微乳注入受试者的血流中。或者，最好按可保持本公开化合物恒定循环浓度的方式给予溶液和微乳。为保持这种恒定浓度，可使用连续静脉内递药装置。这种装置的实例是Deltec CADD-PLUS.TM.5400型静脉注射泵。

药物组合物可以是用于肌内和皮下给药的无菌注射水或油混悬液的形式。可按已知技术，用上述那些适宜的分散剂或湿润剂和悬浮剂配制该混悬液。无菌注射制剂也可以是在肠胃外可接受的无毒稀释剂或溶剂中制备的无菌注射溶液或混悬液。此外，可方便地用无菌固定油作为溶剂或悬浮介质。

可按用于直肠给药的栓剂形式给予本公开活性化合物。可通过将药物与在普通温度下为固体但在直肠中为液体，因而在直肠中会溶化而释放药物的适宜的无刺激性赋形剂混合来制备这些药物组合物。此类物质包括可可脂、甘油明胶、氢化植物油、各种分子量的聚乙二醇和聚乙二醇的脂肪酸酯的混合物。

如本领域技术人员所熟知的，药物的给药剂量依赖于多种因素，包括但并非限定于以下因素：所用具体化合物的活性、受试者的年龄、受试者的体重、受试者的健康状况、受试者的行为、受试者的饮食、给药时间、给药方式、***的速率、药物的组合等；另外，最佳的治疗方式如治疗的模式、通式化合物(I)的日用量或可药用的盐的种类可以根据传统的治疗方案来验证。

本公开涉及靶向不同癌细胞、传染病生物体的能力改进和/或用于治疗自身免疫性疾病的偶联物，该偶联物包含靶向(结合)部分和属于药物的治疗部分。抗体靶向部分与化合物治疗部分经由增加治疗效力的胞内可裂解的键连接。

多年来，在特异性靶向药物疗法领域中科学家的一个目的是使用单克隆抗体(MAb)用于向人癌症特异性递送毒性剂。已经开发了肿瘤相关MAb与适当毒性剂的偶联物，但在癌症的治疗中成败参半，在其他疾病诸如传染病和自身免疫性疾病中几乎无应用。毒性剂是最通常的化疗药物。目前对开发更有效的用于治疗癌症、病原体和其他疾病的带有胞内可裂解接头的抗体偶联物存在进一步的需要。

目前已公开的抗体毒素偶联物的专利如WO2016127790。

除非另有限定，本公开所用的所有技术和科学术语均与本公开所属领域普通技术人员的通常理解一致。虽然也可采用与本文所述相似或等同的任何方法和材料实施或测试本公开，但本文描述了优选的方法和材料。描述和要求保护本公开时，依据以下定义使用下列术语。

当本公开中使用商品名时，旨在包括该商品名产品的制剂、该商品名产品的非专利药和活性药物部分。

除非有相反陈述，在说明书和权利要求书中使用的术语具有下述含义。

术语“配体”是能识别和结合目标细胞相关的抗原或受体的大分子化合物。配体的作用是将药物呈递给与配体结合的目标细胞群，这些配体包括但不限于蛋白类激素、凝集素、生长因子、抗体或其他能与细胞结合的分子。在本公开实施方式中，配体表示为Pc，配体可通过配体上的杂原子与连接单元形成连接键，优选为抗体或其抗原结合片段，所述抗体选自嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体或鼠源抗体；优选为单克隆抗体。

术语“药物”是指细胞毒性药物，药物表示为D，能在肿瘤细胞内具有较强破坏其正常生长的化学分子。细胞毒性药物原则上在足够高的浓度下都可以杀死肿瘤细胞，但是由于缺乏特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时，也会导致正常细胞的凋亡，导致严重的副作用。该术语包括毒素，如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，放射性同位素(例如At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、 Bi²¹²、P³²和Lu的放射性同位素)，化疗药物，抗生素和核溶酶。

术语“接头单元”、“接头”或连接片段”是指一端与配体(如抗体或其抗原结合片段)连接而另一端与药物相连的化学结构片段或键，也可以连接其他接头后再与药物相连。

接头可以包含一种或多种接头构件。示例性的接头构件包括6-马来酰亚氨基己酰基(“MC”)、马来酰亚氨基丙酰基(“MP”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)、对氨基苄氧羰基(“PAB”)、N-琥珀酰亚氨基4-(2- 吡啶基硫代)戊酸酯(“SPP”)、N-琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1 羧酸酯(“SMCC”，在本文中也称作“MCC”)和N-琥珀酰亚氨基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(“SIAB”)。接头可以包括拉伸单元、间隔单元、氨基酸单元和延伸单元，可以通过本领域已知方法合成，诸如US2005-0238649A1中所记载的。接头可以是便于在细胞中释放药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头(例如腙)、蛋白酶敏感(例如肽酶敏感)接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物接头(Chari等,Cancer Research 52:127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)。

术语“拉伸单元”指一端通过碳原子与配体共价连接而另一端通过硫原子与细胞毒性药物相连的化学结构片段。在本公开中，拉伸单元如通式(Y)所定义。拉伸单元通过还原胺化的方式与抗体中的氨基反应而连接，优选为抗体N端和/或赖氨酸残基上的ε-氨基。进一步的本公开的拉伸单元包括结构MC。

术语“间隔单元”是一种双功能化合结构片段，可用于偶联连接单元和细胞毒性药物最终形成配体-细胞毒性药物偶联物，这种偶联方式可以将细胞毒性药物选择性的连接到连接单元上。

术语“氨基酸单元”是指如果存在延伸单元的情况下，可以将以下结构式Y_R中的羰基与延伸单元相连，如果没有延伸单元的情况下，可以将Y_R直接连接在细胞毒性药物上的氨基酸，在本公开实施方式中，氨基酸单元表示为-K_k-：

-K_k-是二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽或十肽，-K-单元各自独立地具有以下结构式K_a或K_b，k是0-10之间的一个整数：

其中：

R₂₃为-H或甲基；

R₂₄为H、甲基、异丙基、异丁基、仲丁基、苄基、对羟基苄基、-CH₂OH、 -CH(OH)CH₃、-CH₂CH₂SCH₃、-CH₂CONH₂、-CH₂COOH、-CH₂CH₂CONH₂、 -CH₂CH₂COOH、-(CH₂)₃NHC(＝NH)NH₂、-(CH₂)₃NH₂、-(CH₂)₃NHCOCH₃、 -(CH₂)₃NHCHO、-(CH₂)₄NHC(＝NH)NH₂、-(CH₂)₄NH₂、-(CH₂)₄NHCOCH₃、 -(CH₂)₄NHCHO、-(CH₂)₃NHCONH₂、-(CH₂)₄NHCONH₂、-CH₂CH₂CH(OH)CH₂NH₂、2-吡啶基甲基-、3-吡啶基甲基-、4-吡啶基甲基-、苯基、环己基，

R₂₅为-芳基-、-烷基-芳基-、-环烷基-、-烷基-环烷基-、-环烷基-烷基-、-烷基- 环烷基-烷基-、-杂环基-，-烷基-杂环基-、-杂环基-烷基-、-烷基-杂环基-烷基-、- 芳基-、-烷基-芳基-、-芳基-烷基-、-烷基-芳基-烷基-、-杂芳基-、-烷基-杂芳基-、- 杂芳基-烷基-、-烷基-杂芳基-烷基-。

在一个实施方案中，-K_k-为二肽，优选为-缬氨酸-瓜氨酸-、-苯丙氨酸-赖氨酸-或-N-甲基缬氨酸-瓜氨酸-，进一步优选为-缬氨酸-瓜氨酸-。

在另一个实施方案中，-K_k-为二肽，优选为

术语“氨基酸”是指分子结构中含有氨基和羧基、并且氨基和羧基都直接连接在-CH-结构上的有机化合物。通式是H₂NCHRCOOH。根据氨基连结在羧酸中碳原子的位置，可分为α、β、γ、δ、ε……-氨基酸。在生物界中，构成天然蛋白质的氨基酸具有其特定的结构特点，即其氨基直接连接在α-碳原子上，即α-氨基酸，包括甘氨酸(Glycine)、丙氨酸(Alanine)、缬氨酸(Valine)、亮氨酸(Leucine)、异亮氨酸(Isoleucine)、苯丙氨酸(Phenylalanine)、色氨酸(Tryptophan)、酪氨酸 (Tyrosine)、天冬氨酸(Aspartic acid)、组氨酸(Histidine)、天冬酰胺(Asparagine)、谷氨酸(Glutamic acid)、赖氨酸(Lysine)、谷氨酰胺(Glutamine)、甲硫氨酸 (Methionine)、精氨酸(Arginine)、丝氨酸(Serine)、苏氨酸(Threonine)、半胱氨酸(Cysteine)、脯氨酸(Proline)等。

在本公开的一个实施方案中，氨基酸选自

术语“延伸单元”是指当氨基酸单元存在的情况下，可以将氨基酸单元与细胞毒性药物偶联，或当氨基酸单元不存在时，可通过与Y_R上羰基与细胞毒性药物偶联的化学结构。在本公开实施方式中，延伸单元表示为-Q_q-，q选自0，1，2。

本公开中延伸单元为PAB，结构如4-亚氨基苄基氨甲酰基片段，其结构如式 (VI)所示，连接在D上，

缩写

接头组件包括但不限于：

MC＝6-马来酰亚氨基己酰基，结构如下：

Val-Cit或“vc”＝缬氨酸-瓜氨酸(蛋白酶可切割接头中的示例二肽)，

瓜氨酸＝2-氨基-5-脲基戊酸，

PAB＝对氨基苄氧羰基(“自我牺牲”接头组件的示例)，

Me-Val-Cit＝N-甲基-缬氨酸-瓜氨酸(其中接头肽键已经修饰以防止其受到组织蛋白酶B的切割)，

MC(PEG)6-OH＝马来酰亚氨基己酰基-聚乙二醇(可附着于抗体半胱氨酸)，

SPP＝N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯，

SPDP＝N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯，

SMCC＝琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯，

IT＝亚氨基硫烷。

术语“配体-药物偶联物”，指配体通过连接单元与具有生物活性的药物相连。在本公开中“配体-药物偶联物”优选为抗体-药物偶联物(antibody drug conjugate， ADC)，指把单克隆抗体或者抗体片段通过连接单元与具有生物活性的毒素药物相连。

术语“载药量”或“平均药物载荷”是指式(I)分子中每个配体上加载的细胞毒性药物平均数量，也可以表示为药物量和抗体量的比值，药物载量的范围可以是每个配体(Pc)连接0-12个，优选1-10个细胞毒性药物(D)。在本公开的实施方式中，载药量表示为n，也可称为DAR(Drug-antibody Ratio)值，n可以为0至 12的非零整数或小数，优选为1-10之间的整数或小数；更优选为2至8的整数或小数；最优选为3至8的整数或小数。示例性的可以为1，2，3，4，5，6，7，8， 9，10的均值。可用常规方法如UV/可见光光谱法，CE-SDS，RP-HPLC，质谱，ELISA试验和HPLC特征鉴定偶联反应后每个ADC分子的药物品均数量。在本公开的实施方式中，载药量表示为y，示例性的可以为1，2，3，4，5，6，7，8，9， 10的均值，范围为0-12，优选1-10，更优选1-8，或2-8，或2-7，或3-8，或3-7，或3-6，或4-7，或4-6，或4-5的均值。

可以用以下非限制性方法控制配体细胞毒性药物偶联物的载量，包括：

(1)控制连接试剂和单抗的摩尔比，

(2)控制反应时间和温度，

(3)选择不同的反应试剂。

本公开所用的抗体中的氨基酸三字母代码和单字母代码如 J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。

术语“抗体”指免疫球蛋白，是由两条重链和两条轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。根据免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和 IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG 可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类 Ig中每类Ig都可以有κ链或λ链。本公开所述的抗体优选为针对靶细胞上细胞表面抗原的特异性抗体，非限制性实施例为以下抗体：抗HER2(ErbB2)抗体、抗EGFR抗体、抗B7-H3抗体、抗c-Met抗体、抗HER3(ErbB3)抗体、抗HER4(ErbB4) 抗体、抗CD20抗体、抗CD22抗体、抗CD30抗体、抗CD33抗体、抗CD44抗体、抗CD56抗体、抗CD70抗体、抗CD73抗体、抗CD105抗体、抗CEA抗体、抗A33抗体、抗Cripto抗体、抗EphA2抗体、抗G250抗体、抗MUCl抗体、抗 Lewis Y抗体、抗VEGFR抗体、抗GPNMB抗体、抗Integrin抗体、抗PSMA抗体、抗Tenascin-C抗体、抗SLC44A4抗体或抗Mesothelin抗体中一个或多个；优选为曲妥珠单抗(Trastuzumab，商品名Herceptin)、帕妥珠单抗(Pertuzumab，也被称作2C4，商品名Perjeta)、尼妥珠单抗(Nimotuzumab，商品名泰欣生)、 Enoblituzumab、Emibetuzumab、Inotuzumab、Pinatuzumab、Brentuximab、 Gemtuzumab、Bivatuzumab、Lorvotuzumab、cBR96和Glematumamab。

全长抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(Fv区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR) 由3个CDR区4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1，CDR1， FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1、HCDR2和HCDR3。

本公开的抗体包括鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。

术语“鼠源抗体”在本公开中为根据本领域知识和技能用鼠制备抗体。制备时用特定抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。

术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要先建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后***表达载体中，最后在真核***或原核***中表达嵌合抗体分子。

术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-graftedantibody)，是指将鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体框架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量鼠蛋白成分，从而诱导的异源性反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA 数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(在因特网www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可获得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991Sequences ofProteins of Immunological Interest，第 5版中找到。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持活性。本公开的人源化抗体也包括进一步由噬菌体展示对CDR进行亲和力成熟后的人源化抗体。进一步描述参与人源化可使用小鼠抗体的方法的文献包括，例如Queen等，Proc.，Natl.Acad.Sci.USA，88，2869，1991和Winter及其同事的方法[Jones等，Nature， 321，522(1986)，Riechmann，等，Nature，332，323-327(1988)，Verhoeyen，等，Science，239，1534(1988)]。

术语“全人源抗体”、“全人抗体”或“完全人源抗体”，也称“全人源单克隆抗体”，其抗体的可变区和恒定区都是人源的，去除免疫原性和毒副作用。单克隆抗体的发展经历了四个阶段，分别为：鼠源性单克隆抗体、嵌合性单克隆抗体、人源化单克隆抗体和全人源单克隆抗体。本公开为全人源单克隆抗体。全人抗体制备的相关技术主要有：人杂交瘤技术、EBV转化B淋巴细胞技术、噬菌体显示技术(phage display)、转基因小鼠抗体制备技术(transgenic mouse)和单个B 细胞抗体制备技术等。

术语“抗原结合片段”是指抗体的保持结合抗原的能力的一个或多个片段。已显示可利用全长抗体的片段来进行抗体的抗原结合功能。“抗原结合片段”中包含的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')₂片段，包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段，(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VH和 VL结构域组成的Fv片段；(v)单结构域或dAb片段(Ward等人,(1989)Nature341：544-546)，其由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区 (CDR)或(vii)可任选地通过合成的接头连接的两个或更多个分离的CDR的组合。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但可使用重组方法，通过合成的接头连接它们，从而使得其能够产生为其中VL和VH区配对形成单价分子的单个蛋白质链(称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等人 (1988)Science242:423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.SciUSA85:5879-5883)。此类单链抗体也意欲包括在术语抗体的“抗原结合片段”中。使用本领域技术人员已知的常规技术获得此类抗体片段，并且以与对于完整抗体的方式相同的方式就功用性筛选片段。可通过重组DNA技术或通过酶促或化学断裂完整免疫球蛋白来产生抗原结合部分。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或 IgM抗体。

通常，Fab是通过用蛋白酶木瓜蛋白酶(切割H链的224位的氨基酸残基)处理 IgG抗体分子所获得的片段中的具有约50,000的分子量并具有抗原结合活性的抗体片段，其中H链N端侧的约一半和整个L链通过二硫键结合在一起。

通常，F(ab')2是通过用酶胃蛋白酶消化IgG铰链区中两个二硫键的下方部分而获得的分子量为约100,000并具有抗原结合活性并包含在铰链位置相连的两个Fab 区的抗体片段。

通常，Fab'是通过切割上述F(ab')2的铰链区的二硫键而获得的分子量为约 50,000并具有抗原结合活性的抗体片段。

此外，可以通过将编码Fab'片段的DNA***到原核生物表达载体或真核生物表达载体中并将载体导入到原核生物或真核生物中以表达Fab'来生产所述Fab'。

术语“单链抗体”、“单链Fv”或“scFv”意指包含通过接头连接的抗体重链可变结构域(或VH)和抗体轻链可变结构域(或VL)的分子。此类scFv分子可具有一般结构：NH₂-VL-接头-VH-COOH或NH₂-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成，例如使用1-4个重复的变体 (Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448)。可用于本公开的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi等人(2001)， Eur.J.Immuno l.31:94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov 等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。

术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以大约小于10^-7M，例如大约小于10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的亲和力(KD)结合。

术语“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。

术语“表达载体”是指能够运输已与其连接的另一个核酸的核酸分子。在一个实施方案中，表达载体是“质粒”，其是指可将另外的DNA区段连接至其中的环状双链DNA环。在另一个实施方案中，表达载体是病毒载体，其中可将另外的 DNA区段连接至病毒基因组中。本文中公开的表达载体能够在已引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌的复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体) 或可在引入宿主细胞后整合入宿主细胞的基因组，从而随宿主基因组一起复制(例如，非附加型哺乳动物载体)。

现有技术中熟知生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法，如冷泉港的抗体实验技术指南，5-8章和15章。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。发明所述的抗体或抗原结合片段用基因工程方法在非人源的CDR区加上一个或多个人源 FR区。人FR种系序列可以通过比对IMGT人类抗体可变区种系基因数据库和 MOE软件，从ImMunoGeneTics(IMGT)的网站http://imgt.cines.fr得到，或者从免疫球蛋白杂志，Lefranc,G.,The ImmunoglobulinFactsBook,Academic Press， 2001ISBN012441351上获得。

术语“宿主细胞”是指已向其中引入了表达载体的细胞。宿主细胞可包括细菌、微生物、植物或动物细胞。易于转化的细菌包括肠杆菌科(enterobacteriaceae)的成员，例如大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢杆菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；链球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。适当的微生物包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)。适当的动物宿主细胞系包括CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)和NS0细胞。

本公开工程化的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。比如，编码重链和轻链的cDNA序列，可以克隆并重组至表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染宿主细胞。作为一种更推荐的现有技术，哺乳动物类表达***会导致抗体的糖基化，特别是在Fc区的N端位点。阳性的克隆在生物反应器的培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化。比如，用A或G Sepharose FF柱进行纯化。洗去非特异性结合的组分。再用pH梯度法洗脱结合的抗体，用SDS-PAGE检测抗体片段，收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛、离子交换。得到的产物需立即冷冻，如-70℃，或者冻干。

术语“肽”是指介于氨基酸和蛋白质之间的化合物片段，由2个或2个以上氨基酸分子通过肽键相互连接而成，是蛋白质的结构与功能片段。

术语“糖”是指由C、H、O三种元素组成的生物大分子，可分为单糖、二糖和多糖等。

术语“毒素”是指能够对细胞的生长或增殖产生有害效果的任何物质，可以是来自细菌、真菌、植物或动物的小分子毒素及其衍生物，包括喜树碱类衍生物如伊沙替康，美登木素生物碱及其衍生物(CN101573384)如DM1、DM3、DM4，auristatin F(AF)及其衍生物，如MMAF、MMAE、3024(WO 2016/127790A1，化合物7)，白喉毒素、外毒素、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、modeccin、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)局限曲霉素 (restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素 (trichothecenes)。

术语“烷基”指饱和脂肪族烃基团，其为包含1至20个碳原子的直链或支链基团，优选含有1至12个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12个)碳原子的烷基，更优选含有1至10个碳原子的烷基，最优选含有1至6个碳原子的烷基。非限制性实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、 2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2,3-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2,5-二甲基己基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、 2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正壬基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2,2-二乙基戊基、正癸基、3,3- 二乙基己基、2,2-二乙基己基，及其各种支链异构体等。更优选的是含有1至6个碳原子的低级烷基，非限制性实施例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2- 三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基等。烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、氧代基。

术语“杂烷基”指含有一个或多个选自N、O或S的杂原子的烷基，其中烷基如上所定义。

术语“亚烷基”指饱和的直链或支链脂肪族烃基，其具有2个从母体烷的相同碳原子或两个不同的碳原子上除去两个氢原子所衍生的残基，其为包含1至20个碳原子的直链或支链基团，优选含有1至12个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11和12个)碳原子，更优选含有1至6个碳原子的亚烷基。亚烷基的非限制性实例包括但不限于亚甲基(-CH₂-)、1,1-亚乙基(-CH(CH₃)-)、1,2-亚乙基 (-CH₂CH₂)-、1,1-亚丙基(-CH(CH₂CH₃)-)、1,2-亚丙基(-CH₂CH(CH₃)-)、1,3-亚丙基 (-CH₂CH₂CH₂-)、1,4-亚丁基(-CH₂CH₂CH₂CH₂-)和1,5-亚丁基(-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-) 等。亚烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基优选独立地任选选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基和氧代基中的一个或多个取代基所取代。

术语“烷氧基”指-O-(烷基)和-O-(非取代的环烷基)，其中烷基或环烷基的定义如上所述。烷氧基的非限制性实例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基。烷氧基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基。

术语“环烷基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基，环烷基环包含3 至20个碳原子，优选包含3至12个碳原子，更优选包含3至10个碳原子，最优选包含3至8个(例如3、4、5、6、7和8个)碳原子。单环环烷基的非限制性实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环己二烯基、环庚基、环庚三烯基、环辛基等；多环环烷基包括螺环、稠环和桥环的环烷基。

术语“杂环基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基，其包含3至20 个环原子，其中一个或多个环原子为选自氮、氧、硫、S(O)或S(O)_m(其中m是整数0至2)的杂原子，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-的环部分，其余环原子为碳。优选包含3至12个(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11和12个)环原子，其中1～4个(例如1、2、3和4个)是杂原子；更优选环烷基环包含3至10个环原子；更优选包含3至8个环原子(例如3、4、5、6、7和8个)，其中1-3个(例如1、2和3个)是杂原子；更优选包含3至6个环原子，其中1-3个是杂原子；最优选包含5或6个环原子，其中1-3个是杂原子。单环杂环基的非限制性实例包括吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、高哌嗪基等。多环杂环基包括螺环、稠环和桥环的杂环基。

术语“螺杂环基”指5至20元的单环之间共用一个原子(称螺原子)的多环杂环基团，其中一个或多个环原子为选自氮、氧或S(O)_m(其中m是整数0至2)的杂原子，其余环原子为碳。其可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子***。优选为6至14元，更优选为7至10元。根据环与环之间共用螺原子的数目将螺杂环基分为单螺杂环基、双螺杂环基或多螺杂环基，优选为单螺杂环基和双螺杂环基。更优选为4元/4元、4元/5元、4元/6元、5元/5元或5元 /6元单螺杂环基。螺杂环基的非限制性实例包括：

术语“稠杂环基”指5至20元，***中的每个环与体系中的其他环共享毗邻的一对原子的多环杂环基团，一个或多个环可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子***，其中一个或多个环原子为选自氮、氧或S(O)_m(其中m是整数0至2)的杂原子，其余环原子为碳。优选为6至14元，更优选为7 至10元。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环稠杂环基，优选为双环或三环，更优选为5元/5元或5元/6元双环稠杂环基。稠杂环基的非限制性实例包括：

术语“桥杂环基”指5至14元，任意两个环共用两个不直接连接的原子的多环杂环基团，其可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子***，其中一个或多个环原子为选自氮、氧或S(O)_m(其中m是整数0至2)的杂原子，其余环原子为碳。优选为6至14元，更优选为7至10元。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环桥杂环基，优选为双环、三环或四环，更优选为双环或三环。桥杂环基的非限制性实例包括：

所述杂环基环可以稠合于芳基、杂芳基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为杂环基，其非限制性实例包括：

等。

杂环基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、氧代基。

术语“芳基”指具有共轭的π电子体系的6至14元全碳单环或稠合多环(稠合多环是共享毗邻碳原子对的环)基团，优选为6至10元，例如苯基和萘基，优选苯基。所述芳基环可以稠合于杂芳基、杂环基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为芳基环，其非限制性实例包括：

芳基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基。

术语“杂芳基”指包含1至4个(例如1、2、3和4个)杂原子、5至14个环原子的杂芳族体系，其中杂原子选自氧、硫和氮。杂芳基优选为5至10元(例如5、6、 7、8、9或10元)，更优选为5元或6元，例如呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、 N-烷基吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基、四唑基等。所述杂芳基环可以稠合于芳基、杂环基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为杂芳基环，其非限制性实例包括：

杂芳基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基。

术语“氨基保护基”是为了使分子其它部位进行反应时氨基保持不变，用易于脱去的基团对氨基进行保护。非限制性实施例包含9-芴甲氧羰基、叔丁氧羰基、乙酰基、苄基、烯丙基和对甲氧苄基等。这些基团可任选地被选自卤素、烷氧基或硝基中的1-3个取代基所取代。所述氨基保护基优选为9-芴甲氧羰基。

术语“环烷基烷基”指烷基上的氢被一个或多个环烷基取代，优选被一个环烷基取代，其中烷基如上所定义，其中环烷基如上所定义。

术语“卤代烷基”指烷基上的氢被一个或多个卤素取代，其中烷基如上所定义。

术语“氘代烷基”指烷基上的氢被一个或多个氘原子取代，其中烷基如上所定义。

术语“羟基”指-OH基团。

术语“卤素”指氟、氯、溴或碘。

术语“氨基”指-NH₂。

术语“硝基”指-NO₂。

术语“巯基”指-SH。

术语“酰胺基”指-C(O)N(烷基)或(环烷基)，其中烷基、环烷基如上所定义。

本公开还包括各种氘化形式的式(I)化合物。与碳原子连接的各个可用的氢原子可独立地被氘原子替换。本领域技术人员能够参考相关文献合成氘化形式的式 (I)化合物。在制备氘代形式的式(I)化合物时可使用市售的氘代起始物质，或它们可使用常规技术采用氘代试剂合成，氘代试剂包括但不限于氘代硼烷、三氘代硼烷四氢呋喃溶液、氘代氢化锂铝、氘代碘乙烷和氘代碘甲烷等。

“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如，“任选被烷基取代的杂环基团”意味着烷基可以但不必须存在，该说明包括杂环基团被烷基取代的情形和杂环基团不被烷基取代的情形。

“取代的”指基团中的一个或多个氢原子，优选为最多5个，更优选为1～3个氢原子彼此独立地被相应数目的取代基取代。不言而喻，取代基仅处在它们的可能的化学位置，本领域技术人员能够在不付出过多努力的情况下确定(通过实验或理论)可能或不可能的取代。例如，具有游离氢的氨基或羟基与具有不饱和(如烯属)键的碳原子结合时可能是不稳定的。

术语“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。

术语“药学上可接受的盐”或“可药用盐”是指本公开配体-药物偶联物的盐，或本公开中所述的化合物的盐，这类盐用于哺乳动物体内时具有安全性和有效性，且具有应有的生物活性，本公开抗体-抗体药物偶联化合物至少含有一个氨基，因此可以与酸形成盐，药学上可接受的盐的非限制性实例包括：盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、柠檬酸盐、乙酸盐、琥珀酸盐、抗坏血酸盐、草酸盐、硝酸盐、梨酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、水杨酸盐、柠檬酸氢盐、酒石酸盐、马来酸盐、富马酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐。

常规的药物组合物的制备见中国药典。

术语“载体”用于本公开的药物，是指能改变药物进入人体的方式和在体内的分布、控制药物的释放速度并将药物输送到靶向器官的体系。药物载体释放和靶向***能够减少药物降解及损失，降低副作用，提高生物利用度。如可作为载体的高分子表面活性剂由于其独特的两亲性结构，可以进行自组装，形成各种形式的聚集体，优选的实例如胶束、微乳液、凝胶、液晶、囊泡等。这些聚集体具有包载药物分子的能力，同时又对膜有良好的渗透性，可以作为优良的药物载体。

术语“赋形剂”是在药物制剂中除主药以外的附加物，也可称为辅料。如片剂中的黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂；半固体制剂软膏剂、霜剂中的基质部分；液体制剂中的防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂等均可称为赋形剂。

术语“稀释剂”又称填充剂，其主要用途是增加片剂的重量和体积。稀释剂的加入不仅保证一定的体积大小，而且减少主要成分的剂量偏差，改善药物的压缩成型性等。当片剂的药物含有油性组分时，需加入吸收剂吸收油性物，使保持“干燥”状态，以利于制成片剂。如淀粉、乳糖、钙的无机盐、微晶纤维素等。

本公开涉及一类可裂解的特定结构的连接臂和特定结构的活性物，及由连接臂、活性物(毒素)与抗体组成的抗体药物偶联物(ADC)。此类ADC是经由间隔物将一种毒性物质(毒素)连于抗体而形成的复合物。该抗体偶联药物(ADC)在体内经降解而释放出活性分子(毒素)，从而起到抗肿瘤的作用。

本公开的合成方法

为了完成本公开的合成目的，本公开采用如下的合成技术方案：

方案一：

本公开通式(D)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐的方法，其包括以下步骤：

通式(DA)在碱性条件下进行脱保护反应，得到通式(D)所示的化合物，

其中：R²-R¹⁶如通式(D)中所定义。

提供碱性条件的试剂包括有机碱和无机碱类，所述的有机碱类包括但不限于三乙胺、二乙胺、N-甲基吗啉、吡啶、六氢吡啶、N,N-二异丙基乙胺、正丁基锂、二异丙基氨基锂、醋酸钾、叔丁醇钠或叔丁醇钾，所述的无机碱类包括但不限于氢化钠、磷酸钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、氢氧化钠和氢氧化锂；优选二乙胺。

方案二：

本公开的化合物2或其可药用盐的制备方法，该方法包括：

化合物1和化合物2a在碱性条件下，加入缩合剂，进行缩合反应，得到化合物2。

提供碱性条件的试剂包括有机碱和无机碱类，所述的有机碱类包括但不限于三乙胺、二乙胺、N-甲基吗啉、吡啶、六氢吡啶、N,N-二异丙基乙胺、正丁基锂、二异丙基氨基锂、醋酸钾、叔丁醇钠或叔丁醇钾，所述的无机碱类包括但不限于氢化钠、磷酸钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、氢氧化钠和氢氧化锂，优选 N,N-二异丙基乙胺。

缩合剂选自4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐、1-羟基苯并***和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N,N'-二环己基碳化二亚胺、 N,N'-二异丙基碳二酰亚胺、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯、1-羟基苯并***、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲脲六氟磷酸酯、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐或六氟磷酸苯并***-1-基-氧基三吡咯烷基磷，优选4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐或1-羟基苯并***和1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，优选1-羟基苯并***。

方案三：

本公开通式(Pc-L-D)所示的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐的方法，其包括以下步骤：

还原Pc后，与化合物2偶联反应，得到通式(ADC-1)所示的化合物；还原剂优选TCEP，特别地，优选还原抗体上的二硫键；

其中，Pc，n如通式(Pc-L-D)中所定义。

具体实施方式

以下结合实施例进一步描述本公开，但这些实施例并非限制本公开的范围。

本公开实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。

一、化合物的合成

实施例

化合物的结构是通过核磁共振(NMR)或/和质谱(MS)来确定的。NMR位移(δ) 以10^-6(ppm)的单位给出。NMR的测定是用Bruker AVANCE-400核磁仪，测定溶剂为氘代二甲基亚砜(DMSO-d₆)、氘代氯仿(CDCl₃)、氘代甲醇(CD₃OD)，内标为四甲基硅烷(TMS)。

MS的测定用Agilent 1200/1290DAD-6110/6120Quadrupole MS液质联用仪 (生产商：Agilent，MS型号：6110/6120Quadrupole MS)。

waters ACQuity UPLC-QD/SQD(生产商：waters，MS型号：waters ACQuity QdaDetector/waters SQ Detector)THERMO Ultimate 3000-Q Exactive(生产商： THERMO，MS型号：THERMO Q Exactive)

高效液相色谱法(HPLC)分析使用Agilent HPLC 1200DAD、Agilent HPLC 1200VWD和Waters HPLC e2695-2489高压液相色谱仪。

手性HPLC分析测定使用Agilent 1260DAD高效液相色谱仪。

高效液相制备使用Waters 2545-2767、Waters 2767-SQ Detecor2、Shimadzu LC-20AP和Gilson GX-281制备型色谱仪。

手性制备使用Shimadzu LC-20AP制备型色谱仪。

CombiFlash快速制备仪使用Combiflash Rf200(TELEDYNE ISCO)。

薄层层析硅胶板使用烟台黄海HSGF254或青岛GF254硅胶板，薄层色谱法 (TLC)使用的硅胶板采用的规格是0.15mm～0.2mm，薄层层析分离纯化产品采用的规格是0.4mm～0.5mm。

硅胶柱色谱法一般使用烟台黄海硅胶200～300目硅胶为载体。

激酶平均抑制率及IC₅₀值的测定用NovoStar酶标仪(德国BMG公司)。

本公开的已知的起始原料可以采用或按照本领域已知的方法来合成，或可购买自ABCR GmbH&Co.KG，Acros Organics，Aldrich Chemical Company，韶远化学科技(AccelaChemBio Inc)、达瑞化学品等公司。

实施例中无特殊说明，反应能够均在氩气氛或氮气氛下进行。

氩气氛或氮气氛是指反应瓶连接一个约1L容积的氩气或氮气气球。

氢气氛是指反应瓶连接一个约1L容积的氢气气球。

加压氢化反应使用Parr 3916EKX型氢化仪和清蓝QL-500型氢气发生器或 HC2-SS型氢化仪。

氢化反应通常抽真空，充入氢气，反复操作3次。

微波反应使用CEM Discover-S 908860型微波反应器。

实施例中无特殊说明，溶液是指水溶液。

实施例中无特殊说明，反应的温度为室温，为20℃～30℃。

实施例中的反应进程的监测采用薄层色谱法(TLC)，反应所使用的展开剂，纯化化合物采用的柱层析的洗脱剂的体系和薄层色谱法的展开剂体系包括：A：二氯甲烷/甲醇体系，B：正己烷/乙酸乙酯体系，C：石油醚/乙酸乙酯体系，，溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节，也可以加入少量的三乙胺和醋酸等碱性或酸性试剂进行调节。

实施例1

(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((1S,3S,5S)-3-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)-2-氮杂双环[3.1.0]己-2-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰氨基)丁酰胺1

第一步

(9H-芴-9-基)甲基(1S,3S,5S)-3-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1- 甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-羧酸酯1c

将(2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己-3- 基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸1a(1.05g，2.49mmol，采用专利申请“US2019/55223中说明书第20页的步骤7”公开的方法制备而得)和(1S,2R)-2-氨基-1-苯基丙-1-醇1b (0.42g，2.78mmol，采用公知的方法“Journal of Organic Chemistry,2012,vol.77,#12,p.5454-5460”制备而得)加入反应瓶，加入10mL二氯甲烷和2mL N,N-二甲基甲酰胺，氩气置换三次，搅拌下加入2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(1.14g，3.00mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.97g，7.47mmol)，室温搅拌1 小时，加入30mL水，用二氯甲烷(15mL×4)萃取，有机相用饱和氯化钠溶液(30mL) 洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以展开剂体系A 纯化所得残余物，得到标题产物1c(1.38g，产率：99.8％)。

MS m/z(ESI):555.2[M+1]

第二步

(2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-氮杂双环[3.1.0]己-3-基)-N-((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2- 基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺1d

将1c(1.38g，2.49mmol)溶于10mL二氯甲烷中，加入20mL二乙胺，氩气置换三次，室温搅拌反应1小时。反应液浓缩，用硅胶柱色谱法以展开剂体系A 纯化所得残余物，得到标题产物1d(805mg，产率：97.3％)。MS m/z(ESI):333.2[M+1]

第三步

(9H-芴-9-基)甲基((S)-1-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((1S,3S,5S)-3-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1- 羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)-2-氮杂双环[3.1.0]己-2- 基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)(甲基)氨基甲酸酯1f

将(5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二异丙基-12-甲氧基 -4,10-二甲基-3,6,9-三氧代-2-氧杂-4,7,10-三氮杂十四-14-酸1e(1.54g，2.41mmol，供应商：皓元)加入反应瓶，加入30mL乙腈，氩气置换三次，冰水浴降温至0-5℃，加入2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(1.10g，2.89mmol)和 N,N-二异丙基乙胺(0.94g，7.27mmol)，冰浴搅拌10分钟。加入1d(805mg，2.42 mmol)的10mL乙腈混悬液，冰浴搅拌反应40分钟。加入60mL水，用乙酸乙酯 (20mL×4)萃取，有机相用饱和氯化钠溶液(60mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以展开剂体系A纯化所得残余物，得到粗品产物 1f(2.9g)。

MS m/z(ESI):952.3[M+1]

第四步

将粗品1f(510mg，0.53mmol)溶于2mL二氯甲烷中，加入4mL二乙胺，氩气置换三次，室温搅拌反应1小时。反应液浓缩，用硅胶柱色谱法以展开剂体系A 纯化所得残余物，得到标题产物1(266mg，产率：68.0％)。

MS m/z(ESI):730.4[M+1]

¹H NMR(400MHz,CD₃OD):δ7.36-7.40(m,2H),7.31(t,2H),7.24(d,1H),4.69(d,1H),4.56(d,1H),4.17-4.28(m,2H),4.06-4.14(m,1H),3.91(d,1H),3.78(t,1H), 3.27-3.44(m,7H),3.15(s,3H),2.84-2.93(m,1H),2.60-2.67(m,2H),2.30-2.37(m, 3H),2.02-2.10(m,2H),1.79-1.95(m,4H),1.38-1.53(m,2H),1.25-1.36(m,2H),1.21 (d,1H),1.13-1.17(m,2H),1.07-1.11(m,2H),0.93-1.05(m,15H),0.83-0.89(m,4H), 0.70-0.79(m,1H).

实施例2

4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基

((S)-1-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((1S,3S,5S)-3-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基) 氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)-2-氮杂双环[3.1.0]己-2-基)-3-甲氧基-5-甲基-1- 氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)(甲基) 氨基甲酸酯2

将1(30mg，0.041mmol)加入到1mL N,N-二甲基甲酰胺中，加入 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨)-3-甲基丁酰氨)-5-脲基戊酰氨)苄基(4-硝基苯基)碳酸酯2a(45mg，0.061mmol，供应商：Ark)，再加入0.25mL吡啶，氩气置换三次，再加入1-羟基苯并***(12mg，0.089mmol) 和N,N-二异丙基乙胺(16mg，0.123mmol)，室温搅拌反应4小时后补加2a(45mg， 0.061mmol)，继续搅拌16小时。反应液进行高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：XBridge Prep C18 OBD 5um 19*250mm；流动相:A-水(10mmolNH₄OAc)： B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集其相应组分，减压浓缩，得到标题产物2(18mg，产率：33.0％)。

MS m/z(ESI):1329.3[M+1]

¹H NMR(400MHz,CD₃OD):δ7.58(d,2H),7.29-7.42(m,6H),7.20-7.26(m,1H), 6.79(s,2H),5.04-5.20(m,4H),4.47-4.61(m,3H),4.13-4.28(m,3H),4.06-4.12(m, 1H),3.91(d,1H),3.75-3.82(m,1H),3.48(t,3H),3.27-3.41(m,7H),3.16-3.25(m,2H), 3.18(s,3H),2.91-2.97(m,2H),2.60-2.65(m,2H),2.27(t,2H),2.20(t,1H),2.01-2.10 (m,3H),1.69-1.94(m,6H),1.63-1.68(m,6H),1.46-1.51(m,1H),1.27-1.37(m,5H), 1.12-1.21(m,3H),1.09(d,2H),0.93-1.04(m,11H),0.80-0.92(m,11H),0.70-0.77(m, 2H).

二、抗体的合成

抗体(包括但不限于帕妥珠单抗Pertuzumab，尼妥珠单抗Nimotuzumab，曲妥珠单抗Trastuzumab，抗B7H3抗体，抗CD79B抗体)按抗体常规方法进行制备，例如可进行载体构建后，转染真核细胞如HEK293细胞(Life Technologies Cat.No. 11625019)，纯化表达。示例性的抗体序列如下：

(1)以下为曲妥珠单抗(Trastuzumab)的序列(WO2016/127790A1中曲妥珠单抗Trastuzumab)

轻链

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFL YSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRT VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO.1

重链

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYP TNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFY AMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO.2

(2)以下为帕妥珠单抗(Pertuzumab)的序列(WO2016/127790中帕妥珠单抗Pertuzumab)

轻链：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRY TGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTVA APSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE QDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO.3

重链：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVN PNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYF DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK KVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO.4

(3)以下为抗B7H3抗体1F9DS的序列(WO2019/024911A1中的抗体h1702-DS)：轻链

DTVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCGLSSGSVSTSHYPSWYQQTPGQAPRMLIYNTN TRSSGVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDESDYYCAIHVDRDIWVFGGGTKLT VLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKA GVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTE C

SEQ ID NO.5

重链

QVQLVQSGGGVVQPGTSLRLSCAASGFIFSSSAMHWVRQAPGKGLEWVAVISY DGSNKYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSARLYASF DYWGQGALVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKV DKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO.6

(4)以下为CD79 B抗体hAb015的序列(WO2020/156439A1中的抗体hAb015) 轻链：

DFVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVHSDGNTYFEWYLQKPGQSPKLLIYK VSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPWTFGGGTKV EIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGN SQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO.7

重链：

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGSSFSSYGINWVKQAPGQGLEWIGEIFPR SGNTYYNEKFEGRATLTADKSTSTAYMELRSLRSEDTAVYYCAKGDLGDFDYW GQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:8

三、抗体ADC偶联物的制备

ADC原液药物载量分析

1、RP-HPLC法分析DAR

试剂和仪器：

三氟乙酸(TFA)，sigma生产，100mL/瓶；乙腈，LC grade，4L/瓶，Fisher生产；

DTT(0.25M)，1g/瓶，sigma生产。高效液相色谱仪：Agilent 1200。

溶液配制:

0.25M DTT溶液：取DTT 5.78mg，加入150μL纯化水充分溶解后，配得0.25M DTT溶液，-20℃保存。流动相A(0.1％TFA水溶液)：量筒量取1000mL纯化水，加入1mL TFA，充分混匀后使用，2-8℃保存14天。流动相B(0.1％TFA乙腈溶液)：量筒量取1000mL乙腈，加入1mLTFA，充分混匀后使用，2-8℃保存 14天。

裸抗和供测试样品(浓度为1mg/mL，约200μL)，加入4μL DDT还原，37℃水浴1小时，备用。

色谱条件：

色谱柱：Agilent PLRP-S 1000A 8μm 4.6*250mm；柱温：80℃；DAD检测器：检测波长280nm；样品室温度：4℃；流速：1mL/min；进样量为：40μl；色谱梯度：B％(起始20％-5min36％-32min60％)

数据分析：

通过样品与裸抗的谱图比对，区分出轻重链的位置，然后对检测样品的谱图进行积分，计算出DAR值。计算公式如下：LC:0(连接药物数)、LC+1:2(连接药物数)、HC:0(连接药物数)、HC+1:2(连接药物数)、HC+2:4(连接药物数)、 HC+3:6(连接药物数)。LC峰面积总和＝LC峰面积+LC+1峰面积；HC峰面积总和＝HC峰面积+HC+1峰面积+HC+2峰面积+HC+3峰面积；LC DAR＝Σ(连接药物数*峰面积百分比)/LC峰面积总和；HC DAR＝Σ(连接药物数*峰面积百分比)/ HC峰面积总和；DAR＝LC DAR+HC DAR

2、CE-SDS分析药物载量DAR

试剂和仪器：

SDS-Mw Analysis Kit:Beckman生产,货号390953,该试剂盒中包含SDS-MW凝胶分离缓冲液、SDS-MW样品缓冲液(样品稀释液)、酸性清洗液(0.1mol/L盐酸溶液)、碱性清洗液(0.1mol氢氧化钠溶液)、内标物质(10kDa internal standard)。也可采用北京博思雅生化技术研究院生产的SDS试剂盒,货号BSYK018,该试剂盒中包含CE-SDS Gel Buffer、CE-SDSSampleBuffer(样品稀释液)。

烷基化溶液(0.25mo碘乙酰胺溶液):称取约0.046g碘乙酰胺,加入lmL超纯水溶解混匀,可于2-8℃避光保存7天。

毛细管电泳仪：SCIEX公司PA800plus

毛细管:非涂层熔融石英毛细管(内径50μm),切割至总长为30.2cm,高分辨率方法有效分离长度为20cm

供试品溶液制备：用SDS样品缓冲液将供试品稀释至1mg/mL。样。取供试品溶液(1mg/mL)95μL，加入0.8mol/L碘乙酰胺水溶液5μL，涡旋混匀。取空白对照 95μL，加入0.8mol/L碘乙酰胺水溶液5μL，涡旋混匀，从样品管中分别取出75μl 至样品瓶中，立即进行分析。

测定法：

(1)毛细管的预处理：0.1mol/L氢氧化钠溶液在60psi压力下冲洗3分钟，然后用0.1mol/L盐酸溶液在60psi压力下冲洗2分钟，最后用纯水在70psi压力下冲洗1分钟。每次运行前应进行。

(2)毛细管的预填充：SDS凝胶分离缓冲液在50psi压力下冲洗15分钟。每次运行前应进行。

样品进样：10kV反相极性电动进样，还原样品进样20秒

分离：15kV下运行40分钟，反相极性。

样品室温度：18～25℃。

毛细管温度：18～25℃。

结果分析：

数据分析：基于抗体中打开的二硫键游离出的巯基都偶联上相应的Drugs，用Beckman软件对数据进行分析，以重链、非糖基化重链和轻链等校正峰面积分别占所有校正峰面积计算。根据公式:DAR＝[4*重链(H)峰面积+2*半抗(H-L) 峰面积+4*双重链(H-H)峰面积+2*重重轻链(H-H-L)峰面积]/[重链(H) 峰面积/2+半抗(H-L)峰面积/2+双重链(H-H)峰面积+重重轻链(H-H-L) 峰面积+全抗峰面积]，最终计算出该ADC药的加权平均值

实施例3

ADC-1的合成可参照已知文献来进行，如参照CN1938046B中说明书第173 页的实施例12，或WO2014057687中说明书第146页实施例2。其中公开的合成方法通过引用并入本公开，其中所用的毒素化合物部分为本公开的化合物2。

实施例4

ADC-2可参照WO2016127790中说明书第65页实施例18合成。其中公开的合成方法通过引用并入本公开，其中所用的毒素化合物部分为本公开的化合物2。

实施例5ADC-3

在37℃条件下，向抗体Trastuzumab的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M 的PBS缓冲水溶液；10.0mg/mL，1.14mL，77.03nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，20μL，200nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。

将化合物2(1.02mg，767.7nmol)溶解于50μL DMSO中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M 的EDTA)，得到偶联物FADC-3的示例性产物ADC-3的PBS缓冲液(0.90mg/mL， 12.7mL)，于4℃储存。

RP-HPLC计算的载药量平均值：n＝4.47。

实施例6ADC-4

在37℃条件下，向抗体Pertuzumab的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的 PBS缓冲水溶液；10.0mg/mL，1.14mL，77.03nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基) 膦(TCEP)的水溶液(10mM，20μL，200nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。

将化合物2(1.02mg，767.7nmol)溶解于50μL DMSO中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M 的EDTA)，得到偶联物FADC-4的示例性产物ADC-4的PBS缓冲液(1.00mg/mL，11.9mL)，于4℃储存。

RP-HPLC计算的载药量平均值：n＝4.57。

实施例7ADC-5

在37℃条件下，向抗体1F9DS的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS 缓冲水溶液；10.0mg/mL，1.26mL，85.14nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦 (TCEP)的水溶液(10mM，22.1μL，221nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。

将化合物2(1.13mg，850.49nmol)溶解于50μL DMSO中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M 的EDTA)，得到偶联物FADC-5的示例性产物ADC-5的PBS缓冲液(0.99mg/mL， 13.3mL)，于4℃储存。

RP-HPLC计算的载药量平均值：n＝3.76。

实施例8ADC-6

在37℃条件下，向抗体hAb015的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS 缓冲水溶液；10.0mg/mL，5.00mL，337.84nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，85.0μL，850nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。

将化合物MC-vc-PAB-MMAE(4.45mg，3379.79nmol,瀚稥生物科技，Batch NO:20190322)溶解于250μL DMSO中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到偶联物FADC-6的示例性产物ADC-6的PBS缓冲液(2.79mg/mL，17.4mL)，于4℃储存。

CE-SDS计算的载药量平均值：n＝3.09。

实施例9ADC-7

在37℃条件下，向抗体hAb015的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS 缓冲水溶液；10.0mg/mL，1.80mL，121.62nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦 (TCEP)的水溶液(10mM，30.4μL，304nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。

将化合物2(1.62mg，1219.29nmol)溶解于90μL DMSO中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M 的EDTA)，得到偶联物FADC-7的示例性产物ADC-7的PBS缓冲液(1.37mg/mL， 12.0mL)，于4℃储存。

CE-SDS计算的载药量平均值：n＝3.21。

生物学评价

测试例1：通式(D)化合物对肿瘤细胞HepG2和SK-BR-3体外增殖抑制测试

一、试验目的：

检测本公开样品对HepG2和SK-BR-3细胞增殖的抑制作用。

二、试验材料与仪器：

EMEM：购于LONZA，货号：BE12-611F；

McCoy'S5a：购于Gibco，货号16600108；

FBS：购于Gibco，货号：10099-141；

CellTilter-Glo：购于Promega，货号：7572；

PBS：购于上海源培生物科技股份有限公司，货号：B320；

HepG2人肝癌细胞系：购于中科院细胞库；

SK-BR-3人乳腺癌细胞系：购于ATCC，货号HTB-30；

75cm TC-Treated Culture Flask，购于Corning Incorporated，货号：430641；

仪器PHERAstar FS：购于BMG labtech。

三、试验方法：

1.细胞铺板

将HepG2和SK-BR-3细胞分别培养在含有10％FBS的EMEM和McCoy'S5a 培养基中。实验时，将HepG2细胞密度调整为4.4×10⁴个/mL，将SK-BR-3细胞密度调整为3.7×10⁴个/mL，在96孔板的列2至列11每孔加入135μL细胞悬液，列12为空白对照。在5％CO₂的37℃培养箱中培养24小时。

2.化合物药物配制

1)化合物药物原液准备：用DMSO将药物溶解，使原液浓度为20mM。

2)配药板1：起始列1将原液稀释40倍，列2至列11依次3倍梯度稀释。列12为DMSO。

3)配药板2：在列2至列11加入95μL相应培液，从配药板1的列3至列12 吸5μL至配药板2的列2到列11。混匀。

3.处理细胞

从配药板2吸取15μL加入细胞。在5％CO₂的37℃培养箱中继续培养3天。

4.72小时后，每孔加入加入75μL CTG，室温反应10分钟，用PHERAstar FS 读取发光值，经Graphpad Prism 5软件处理后即可得IC₅₀。

表1.本公开化合物对HepG2和SK-BR-3细胞的增殖抑制的IC₅₀

化合物编号	IC<sub>50</sub>(HepG2)/nM	IC<sub>50</sub>(SK-BR-3)/nM
			1	0.81	0.17

结论：本公开的化合物均对HepG和SK-BR-3细胞具有明显的增殖抑制活性。

测试例2：本公开配体-药物偶联物对肿瘤细胞体外增殖抑制测试

一、测试目的

本实验的目的是为了检测本公开配体-药物偶联物，对MCF-7肿瘤细胞(人乳腺癌细胞，ATCC，货号HTB-22)和SK-BR-3肿瘤细胞(人乳腺癌细胞，ATCC，货号HTB-30)体外增殖的抑制活性。以不同浓度的化合物体外处理细胞，经6天培养后，采用CTG(

Luminescent Cell Viability Assay，Promega，货号：G7573)试剂对细胞的增值进行检测，根据IC50值评价该化合物的体外活性。

二、实验方法

下面以对SK-BR-3细胞或MCF-7细胞体外增殖抑制测试方法为例，用于举例说明本公开配体-药物偶联物对肿瘤细胞进行体外增殖抑制活性测试的方法。本方法同样适用于，但不限于对其它肿瘤细胞进行体外增殖抑制活性测试。

1、细胞培养：MCF-7或SK-BR-3细胞用10％FBS的EMEM培养基(GE，货号SH30024.01)和含10％FBS的McCoy's 5A培养基(Gibco，货号16600-108)培养。

2、细胞准备。取对数生长期的MCF-7或SK-BR-3细胞，用PBS(磷酸盐缓冲液，上海源培生物科技股份有限公司)洗涤1次之后，加入2-3mL胰蛋白酶 (0.25％Trypsin-EDTA(1x)，Gibico,Life Technologies公司)消化2-3分钟，待细胞消化完全后，加入10-15mL细胞培养液，将经过消化的细胞洗脱下来，1000rpm 离心5分钟，弃上清，接着加入10-20mL细胞培养液将细胞重悬，制成单细胞悬液。

3、细胞铺板。将MCF-7或SK-BR-3单细胞悬液混匀，用细胞培养液分别调整活细胞密度至2.75×10³细胞/mL和8.25×10³细胞/mL，将密度调整过后的细胞悬液混匀，以180μL/孔加入96孔细胞培养板。96孔板外周孔只加入200μL培养基。将培养板在培养箱培养24小时(37℃，5％CO₂)。

4、配体-药物偶联物样品配制。用PBS调整至首浓度5uM，然后用PBS进行 4倍稀释，9个浓度点，每个浓度设2个复孔。

5、加样操作。向步骤3的培养板中加入20μL步骤4配制的不同浓度的待测样品，每个样品两复孔，在培养箱孵育6天(37℃，5％CO₂)。

6、显色操作。取出96孔细胞培养板，向每孔加入90μL CTG溶液，室温孵育10分钟。

7、读板操作。取出96孔细胞培养板，置于酶标仪(BMG labtech，PHERAstar FS)中，用酶标仪测定化学发光。

三、数据分析

用Microsoft Excel，Graphpad Prism 5对数据进行处理分析。实施例结果参见下表。

表2.本公开中配体-药物偶联物对SK-BR-3细胞体外增殖抑制的IC₅₀值

样品	SK-BR-3细胞IC<sub>50</sub>(nM)	Imax％
			ADC-3	0.069	94.73
ADC-4	0.065	94.6
			Trastuzumab	>500	47
Pertuzumab	>500	8.11

表3.本公开中的配体-药物偶联物对MCF-7细胞体外增殖抑制的IC₅₀值

样品	MCF-7细胞IC<sub>50</sub>(nM)	Imax％
			ADC-5	2.71	88.28
1F9DS	>500	0

结论：本公开中的配体-药物偶联物对SK-BR-3细胞和MCF-7细胞具有明显的增殖抑制活性。

测试例3、本公开活性化合物对人弥漫性大B细胞淋巴瘤WSU-DLCL2裸小鼠皮下移植瘤的疗效

一、实验动物和饲养条件

裸小鼠，BALB/c-nu，雌性，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。生产许可证号：SCXK(京)2019-0008，动物合格证号No.1103222011004014。饲养环境： SPF级。

二、实验设计和实验方法

人弥漫性大B细胞淋巴瘤WSU-DLCL2细胞购自American Type CultureCollection。培养条件为RPMI 1640培养基(Gibco)中加10％胎牛血清以及青、链霉素混合液(Gibco，15140-122)，于37℃、含5％CO₂空气的培养箱中培养。一周2-3次传代,当细胞呈指数生长期时，收集细胞，计数，接种。

每只裸小鼠皮下接种2.1×10⁷WSU-DLCL2细胞，待肿瘤生长至100-150mm³后，根据肿瘤体积将动物分组(D0)。6只/组，共4组。小鼠静脉注射(IV)给药，给药体积10mL/kg。每周测2次肿瘤体积，称小鼠体重，记录数据。

三、实验结果

ADC-6(3mg/kg,IV,D0)对WSU-DLCL2的抑瘤率为65％，有1/6肿瘤部分消退； ADC-7(3、10mg/kg,IV,D0)对WSU-DLCL2的抑瘤率分别为88％和126％,10mg/kg 剂量组有6/6肿瘤部分消退；荷瘤小鼠对以上药物均能较好耐受，没有明显体重减轻等症状发生。具体见下表4。

表4.ADC抑瘤实验结果

抑瘤率计算方法：

肿瘤体积(TV)计算公式：TV＝1/2×L_长×L_短 ²

相对肿瘤增殖率T/C(％)＝(T-T₀)/(C-C₀)×100

抑瘤率TGI(％)＝1-T/C(％)

其中T、C为实验结束时治疗组和对照组的肿瘤体积；T₀、C₀为实验开始时的肿瘤体积。

五、实验结论：

本公开ADC-7偶联物3mg/kg或10mg/kg单次静脉注射均对人弥漫性大B细胞淋巴瘤WSU-DLCL2裸小鼠皮下移植瘤有明显疗效，引起肿瘤部分消退。

序列表

<110> 江苏恒瑞医药股份有限公司

上海恒瑞医药有限公司

<120> 澳瑞他汀类似物及其偶联物、其制备方法及其应用

<150> 201911390425.7

<151> 2020-12-30

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> Trastuzumab轻链

<400> 1

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 2

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> Trastuzumab重链

<400> 2

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 3

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> Pertuzumab轻链

<400> 3

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 4

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> Pertuzumab重链

<400> 4

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 5

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> h1702-DS轻链

<400> 5

Asp Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Phe Ser Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Leu Ser Ser Gly Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

His Tyr Pro Ser Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Pro Arg Met

35 40 45

Leu Ile Tyr Asn Thr Asn Thr Arg Ser Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Ile Leu Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala

65 70 75 80

Gln Ala Asp Asp Glu Ser Asp Tyr Tyr Cys Ala Ile His Val Asp Arg

85 90 95

Asp Ile Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys

210 215

<210> 6

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> h1702-DS重链

<400> 6

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Ser

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Ala Arg Leu Tyr Ala Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ala Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 7

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> hAb015轻链

<400> 7

Asp Phe Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asp Gly Asn Thr Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 8

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> hAb015重链

<400> 8

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ser Ser Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Phe Pro Arg Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Glu Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Asp Leu Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

Claims

1.一种通式(D)所示的化合物：

R¹-R⁶各自独立地选自氢原子、卤素、羟基、氰基、烷基、烷氧基和环烷基；

R⁷选自氢原子、烷基、烷氧基和环烷基；

R⁸-R¹¹之中的任意两个基团与其所键合的原子一起形成环烷基，余下的两个基团各自独立地选自氢原子、烷基和环烷基；

R¹²选自氢原子或烷基；

R¹³-R¹⁵各自独立地选自氢原子、羟基、烷基、烷氧基或卤素；

2.根据权利要求1所述的通式(D)所示的化合物，其为通式(D₁)所示的化合物：

R⁹与R¹⁰与其所键合的原子一起形成环烷基；

R²-R⁸，R¹¹-R¹⁶如权利要求1中所定义。

3.根据权利要求1或2所述的通式(D)所示的化合物，其为：

4.一种配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述配体-药物偶联物包含式(-D)所示的结构：

R²-R⁶各自独立地选自氢原子、卤素、羟基、氰基、烷基、烷氧基和环烷基；

R⁷选自氢原子、烷基、烷氧基和环烷基；

R⁸-R¹¹之中的任意两个基团与其所键合的原子一起形成环烷基，余下的两个基团各自独立地任选自氢原子、烷基和环烷基；

R¹²选自氢原子或烷基；

5.根据权利要求4所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述配体-药物偶联物包含式(-D₁)所示的结构：

R⁹与R¹⁰与其所键合的原子一起形成环烷基；

波浪线，R²-R⁸，R¹¹-R¹⁶如权利要求4中所定义。

6.根据权利要求4所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述配体-药物偶联物包含如下所示的结构：

7.根据权利要求4所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其为通式(Pc-L-D)所示的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐：

其中：

R²-R¹⁶如权利要求4中所定义；

n为1至10，可以为整数，也可以为小数；

Pc为配体；L为接头单元。

8.根据权利要求4所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其为通式(Pc-L-D1)所示的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐：

其中：

R²-R¹⁶如权利要求4中所定义；

Pc，L，n如权利要求7中所定义。

9.根据权利要求4所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其为如下所示的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐：

Pc，L，n如权利要求7中所定义。

10.根据权利要求7至9中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中n为1至8，可以为整数，也可以为小数；优选为2至8，可以为整数，也可以为小数。

11.根据权利要求7至10中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中接头单元-L-为-Y-L¹-L²-L³-L⁴，

Y选自

L¹选自-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-W-C(O)-、-CH₂-C(O)-NR¹⁷-W-C(O)-和-C(O)-W-C(O)-，其中W选自C_1-8烷基、C_1-8烷基-环烷基和1至8个链原子的直链杂烷基，所述杂烷基包含1至3个选自N、O和S的杂原子，其中所述的C_1-8烷基、环烷基和直链杂烷基各自独立地任选进一步被选自卤素、羟基、氰基、氨基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基的一个或多个取代基所取代；

L²选自-NR¹⁸(CH₂CH₂O)_pCH₂CH₂C(O)-、-NR¹⁸(CH₂CH₂O)_pCH₂C(O)-、-S(CH₂)_pC(O)-和化学键，其中p为1至20的整数；优选为化学键；

L⁴为延伸单元，优选为PAB。

12.根据权利要求11所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中Y为

13.根据权利要求11所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中L¹选自-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-(CH₂)_s-C(O)-，其中s为2至8的整数；优选为

14.根据权利要求11至13中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中L³为二肽氨基酸单元，优选自缬氨酸-瓜氨酸。

15.根据权利要求11至14中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中接头单元-L-选自：

其中a端连着配体，b端连着药物。

16.根据权利要求4至15中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其选自以下结构式：

其中：

n为1至10，可以为整数，也可以为小数；

Pc为配体。

17.根据权利要求7至16中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述Pc为抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体选自嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。

18.根据权利要求17所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的抗体或其抗原结合片段选自抗HER2(ErbB2)抗体、抗EGFR抗体、抗B7-H3抗体、抗c-Met抗体、抗HER3(ErbB3)抗体、抗HER4(ErbB4)抗体、抗CD20抗体、抗CD22抗体、抗CD30抗体、抗CD33抗体、抗CD44抗体、抗CD56抗体、抗CD70抗体、抗CD73抗体、抗CD105抗体、抗CEA抗体、抗A33抗体、抗Cripto抗体、抗EphA2抗体、抗G250抗体、抗MUCl抗体、抗Lewis Y抗体、抗VEGFR抗体、抗GPNMB抗体、抗Integrin抗体、抗PSMA抗体、抗Tenascin-C抗体、抗SLC44A4抗体、抗Mesothelin抗体和其抗原结合片段。

19.根据权利要求18所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的抗体或其抗原结合片段选自Trastuzumab、Pertuzumab、Nimotuzumab、Enoblituzumab、Emibetuzumab、Inotuzumab、Pinatuzumab、Brentuximab、Gemtuzumab、Bivatuzumab、Lorvotuzumab、cBR96和Glematumamab，或其抗原结合片段。

20.一种制备如通式(D)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐的方法，其包括以下步骤：

通式(DA)的化合物在碱性条件下进行脱保护反应，得到通式(D)所示的化合物，

其中：R²-R¹⁶如权利要求1中所定义。

21.一种如下所示的化合物：

或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐。

22.一种制备如权利要求21所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐的方法，其包括以下步骤：

23.一种制备如通式ADC-1所示的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐的方法，其包括以下步骤：

其中，Pc，n如权利要求7所定义。

24.一种配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其包含配体和连接至配体的药物，其中所述药物选自根据权利要求1至3中任一项所述的化合物，优选药物通过接头连接至配体。

25.根据权利要求24所述的配体-药物偶联物，其中所述配体为单克隆抗体。

26.一种药物组合物，其含有治疗有效量的根据权利要求4至19中任意一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，或根据权利要求1至3中任意一项通式(D)所示所述的化合物、其可药用盐，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

27.根据权利要求4至19中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，或根据权利要求1至3中任意一项所述的通式(D)所示的化合物或其可药用盐，或根据权利要求26所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防肿瘤的药物中的用途。

28.根据权利要求27所述的用途，其中所述的肿瘤为选自与HER2、HER3、B7H3、c-Met、HER4、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD56、CD70、CD73、CD105、CEA、A33、Cripto、EphA2、G250、MUCl、Lewis Y、VEGFR、GPNMB、Integrin、PSMA、Tenascin-C、SLC44A4、Mesothelin和EGFR表达相关的癌症。

29.根据权利要求4至19中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，或根据权利要求1至3中任意一项所述的通式(D)所示的化合物或其可药用盐，或根据权利要求26所述的药物组合物在制备治疗和/或预防癌症的药物中的用途，其中所述癌症优选选自乳腺癌、卵巢癌、***、子宫癌、***癌、肾癌、尿道癌、膀胱癌、肝癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、食道癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、肺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、白血病、骨癌、皮肤癌、甲状腺癌、胰腺癌和淋巴瘤。