ES2681050T3 - Inhibidores de la tirosina quinasa de Bruton para la movilización hematopoyética - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de tirosina quinasa de Bruton (BTK) para usar en la restauración o mejora de la hematopoyesis en un sujeto que lo necesita y para reducir el alcance o duración de la leucopenia y la neutropenia como resultado de quimioterapia, radioterapia o exposición accidental a la radiación en un sujeto, dicho uso que comprende administrar a dicho sujeto dicha composición farmacéutica en una cantidad eficaz para movilizar células madre y/o progenitoras hematopoyéticas en la sangre periférica de dicho sujeto, en la que el inhibidor de BTK se selecciona de la fórmula I:**Fórmula** en la que: La es CH2, O, NH o S; Ar es un arilo sustituido o no sustituido, fenilo no sustituido o un heteroarilo sustituido o no sustituido; Y es un anillo de cicloalquilo de 4, 5, 6 o 7 miembros, o Y es un anillo de heterocicloalquilo que contiene nitrógeno monocíclico de 4, 5, 6 o 7 miembros; Z es C(>=O), OC(>=O), NHC(>=O), NRC(>=O), C(>=S), S(>=O)x, OS(>=O)x, NHS(>=O)x, donde x es 1 o 2; R7 y R8 se seleccionan independientemente entre H, alquilo C1-C4 no sustituido, alquilo C1-C4 sustituido, alcoxialquilo C1-C6, alquilaminoalquilo C1-C8, alquilo C1-C4(fenilo), heteroalquilo C1-C4 no sustituido, heteroalquilo C1-C4 sustituido, cicloalquilo C3-C6 no sustituido, cicloalquilo C3-C6 sustituido, heterocicloalquilo C2-C6 no sustituido y heterocicloalquilo C2-C6 sustituido; o R7 y R8 tomados juntos forman un enlace; R6 es H, alquilo C1-C4 sustituido o no sustituido, heteroalquilo C1-C4 sustituido o no sustituido, alcoxialquilo C1-C6, alquilaminoalquilo C1-C8, cicloalquilo C3-C6 sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo C2-C8 sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, alquilo C1-C4 (arilo), alquilo C1-C4 (fenilo), alquilo C1-C4 (heteroarilo), alquilo C1-C4 (cicloalquilo C3-C8), o alquilo C1-C4 (heterocicloalquilo C2-C8), o alquilaminoalquilo C1-C8; R es H, o alquilo C1-C6 y solvatos farmacéuticamente aceptables o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

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DESCRIPCION

Inhibidores de la tirosina quinasa de Bruton para la movilización hematopoyética Campo de invención

La invención está en el campo de la terapéutica y la química médica. La presente invención se refiere en general a la administración de un inhibidor de tirosina quinasa de Bruton para movilizar células madre y progenitoras hematopoyéticas de la médula ósea a la sangre periférica y el uso de dichas células hematopoyéticas para mejorar la hematopoyesis y/o el tratamiento de diversos trastornos, como se define en las reivindicaciones.

Antecedentes de la invención

La tirosina quinasa de Bruton (Btk) es un miembro de la familia Tec de tirosina quinasas no receptoras y desempeña un papel en varias vías de señalización de células hematopoyéticas, por ejemplo, receptor tipo Toll (TLR) y producción de TNF-a mediado por receptor de citoquinas en macrófagos, señalización del receptor de IgE (FceRI) en mastocitos, inhibición de la señalización apoptótica Fas/APO-1 en células linfoides del linaje B y agregación plaquetaria estimulada por colágeno. Véase, por ejemplo, Jeffries, et al. (2003) J. Biol. Chem. 278:26258-26264; Horwood et al. (2003) J. Exp. Med. 197:1603-1611; Iwaki et al. (2005) J. Biol. Chem. 280(48):40261-40270; Vassilev et al. (1999) J. Biol. Chem. 274(3):1646-1656, y Quek et al. (1998), Curr. Bio. 8(20):1137-1140. Es particularmente importante en la ruta de señalización iniciada tras la estimulación del receptor de células B y durante el desarrollo de las células B. Las mutaciones en el gen Btk resultan en agammaglobulinemia unida a X, una inmunodeficiencia caracterizada por la falla en la producción de linfocitos B maduros y asociada con una falla en el reordenamiento de la cadena pesada de Ig. Rawlings and Witte (1994) Immun. Rev. 138:105-119. En el ratón, la mutación puntual o la eliminación de Btk causa inmunodeficiencia unida a X (xid), con aproximadamente un 50% menos de células B B2 convencionales, células B B1 ausentes y niveles séricos de Ig reducidos. Khan et al (1995) Immunity 3:283-99; Rawlings et al (1993) Science 261:358-61. Btk también se expresa en células específicas del linaje mieloide, y la evidencia sugiere que contribuye a la activación mediada por el complejo inmune de las vías de señalización FcyR y FceR en monocitos/macrófagos, neutrófilos y mastocitos. Véase, por ejemplo, Jongstra-Bilen et al. (2008) J. Immunol. 181:288-298; Wang et al. (2007) Int. Immunopharmacol. 7:541-546; Hata et al. (1998) J Exp Med. 187:1235-1247.

Debido al papel de Btk en la inhibición de las señales apoptóticas Fas/APO-1 en el linaje de células B, los inhibidores de Btk, también denominados inhibidores de Btk, se han evaluado como agentes para tratar tumores malignos hematopoyéticos (por ejemplo, linfoma de células B). Además, debido al papel de Btk en las vías de señalización de otras células inmunes, los inhibidores de Btk también se han evaluado como agentes para suprimir el sistema inmune, por ejemplo, en pacientes con trastornos autoinmunes o trasplantes de órganos. Véase, por ejemplo, Honinberg et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107:13075-80; Chang et al. (2011) Arthr. Res. & Ther. 13:R115. La evidencia del papel de Btk en la enfermedad autoinmune y/o inflamatoria se ha establecido en modelos de ratón deficientes en Btk. Por ejemplo, en modelos preclínicos murinos estándar de lupus eritematoso sistémico (SLE), se ha demostrado que la deficiencia de Btk da como resultado una mejora notable de la progresión de la enfermedad. Además, los ratones deficientes en Btk también son resistentes al desarrollo de artritis inducida por colágeno y son menos susceptibles a la artritis inducida por Staphylococcus. La inhibición de la actividad de Btk es útil para el tratamiento de enfermedades autoinmunes y/o inflamatorias tales como: SLE, artritis reumatoide, vasculitis múltiples, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), miastenia grave y asma. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 7,393,848.

Los inhibidores de Btk también se han mostrado útiles para prevenir o reducir el riesgo de tromboembolismo. Véase, por ejemplo, Uckun (2008) Int. Rev. Immunol. 27:43-69.

Resumen de la invención

En contraste con los usos de la técnica anterior de inhibidores de tirosina quinasa de Bruton para suprimir células inmunes y/o el sistema inmune, se describe en este documento el descubrimiento sorprendente de que los inhibidores de Btk pueden movilizar células madre hematopoyéticas y células progenitoras a la sangre periférica de un sujeto, por ejemplo, para aumentar el conteo de glóbulos blancos en el sujeto. De acuerdo con lo anterior, en este documento se proporcionan composiciones para mejorar la hematopoyesis y aumentar el recuento de glóbulos blancos en un sujeto que lo necesite, que incluye pacientes sometidos a quimioterapia, radioterapia y/o exposición accidental a la radiación. También se proporcionan en este documento como referencia los métodos para determinar si un inhibidor de Btk es un "inhibidor de Btk de movilización" capaz de movilizar células madre y/o progenitoras hematopoyéticas a la sangre periférica de un sujeto; y métodos para usar un inhibidor de Btk de movilización para movilizar tales células, incluyendo la recolección de tales células para una reinfusión posterior en el mismo sujeto o en un sujeto diferente.

En un aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de tirosina quinasa de Bruton (Btk) como se define en las reivindicaciones para uso en la restauración o mejora de la hematopoyesis en un sujeto que lo necesita y para reducir el alcance o duración de leucopenia y neutropenia

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resultante de quimioterapia, radioterapia o exposición accidental a la radiación en un sujeto, comprendiendo dicho uso administrar a dicho sujeto dicha composición farmacéutica en una cantidad eficaz para movilizar células madre y/o progenitoras hematopoyéticas en la sangre periférica de dicho sujeto.

Como compuestos que aumentan el recuento de glóbulos blancos en un sujeto, los inhibidores de Btk de movilización de la presente invención se pueden administrar como parte de cualquier protocolo terapéutico que tenga como objetivo restaurar o mejorar la hematopoyesis en un paciente que lo necesite, por ejemplo, para mejorar el éxito de trasplante de médula ósea, para reducir el alcance o la duración de la leucopenia y la neutropenia como resultado de la quimioterapia, radioterapia o exposición accidental a la radiación, para mejorar la curación de heridas y el tratamiento de quemaduras, y/o para ayudar a restaurar el tejido del órgano dañado. También pueden combatir las infecciones bacterianas que prevalecen en la leucemia.

Como referencia, se pueden obtener células madre y progenitoras hematopoyéticas movilizadas administrando a un sujeto un inhibidor de Btk de movilización en una cantidad eficaz para aumentar el número de tales células en el sujeto, preferiblemente en la sangre periférica del sujeto. La etapa de administración puede comprender la administración de un inhibidor de Btk de movilización solo o la etapa puede comprender la administración de un inhibidor de Btk de movilización en combinación con otros compuestos, por ejemplo, citoquinas, que también aumentan el recuento de glóbulos blancos en la sangre periférica de un sujeto. Los compuestos apropiados se pueden seleccionar del grupo que consiste en factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM- CSF), interleucina-1 (IL-1), interleucina-3 (IL-3), interleucina-8 (IL-8), PIXY-321 (proteína de fusión GMCSF/IL-3), proteína inflamatoria de macrófagos, factor de células madre, plerixafor, trombopoyetina, oncogén relacionado con el crecimiento, y/o combinaciones de los mismos. De este modo, como referencia, un método puede comprender administrar a un sujeto un inhibidor de Btk de movilización (con o sin otros factores de movilización) en una cantidad eficaz para aumentar el número de células hematopoyéticas madre y progenitoras y/o glóbulos blancos en la sangre periférica del sujeto, y obtener las células inmunes así movilizadas, por ejemplo, por aféresis.

Como referencia, las células recogidas se pueden usar terapéuticamente, por ejemplo, en el trasplante de células madre y/o progenitoras hematopoyéticas administrando a un sujeto un inhibidor de Btk de movilización (con o sin otros factores de movilización) en una cantidad eficaz para aumentar el número de células hematopoyéticas madre, progenitoras y/o glóbulos blancos en la sangre periférica del sujeto, obteniendo las células así movilizadas e introduciendo las células en el paciente. El sujeto y el paciente pueden ser histocompatibles. El sujeto histocompatible y el paciente pueden ser singénicos. El sujeto histocompatible y el paciente pueden ser alogénicos.

Como referencia, las células recogidas se pueden enriquecer y/o cultivar ex vivo antes de la introducción en el paciente. Tal cultivo ex vivo comprende diferenciar las células obtenidas o enriquecerlas para células mieloides, células linfoides y progenitores comunes de las mismas, etc.

Los inhibidores de Btk de movilización se pueden administrar a cualquier sujeto animal con el fin de movilizar las células madre y progenitoras hematopoyéticas. En una realización preferida, el inhibidor de Btk de movilización se administra a un mamífero, y más preferiblemente a un ser humano.

Los inhibidores de Btk de movilización apropiados para su uso en la presente invención comprenden un anillo de pirimidina, esto es, una 1, diazina. El inhibidor de Btk de movilización se selecciona de un compuesto de fórmula I estructural:

imagen1

en la que:

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La es CH2, O, NH o S;

Ar es un arilo sustituido o no sustituido, fenilo no sustituido o un heteroarilo sustituido o no sustituido;

Y es un anillo de cicloalquilo de 4, 5, 6 o 7 miembros, o

Y es un anillo de heterocicloalquilo que contiene nitrógeno monocíclico de 4, 5, 6 o 7 miembros;

Z es C(=O), OC(=O), NHC(=O), NRC(=O), C(=S), S(=O)x, OS(=O)x, NHS(=O)x, donde x es 1 o 2;

R7 y R8 se seleccionan independientemente entre H, alquilo C1-C4 no sustituido, alquilo C1-C4 sustituido, alcoxialquilo C1-C6, alquilaminoalquilo C1-C8, alquilo C1-C4(fenilo), heteroalquilo C1-C4 no sustituido, heteroalquilo C1-C4 sustituido, cicloalquilo C3-C6 no sustituido, cicloalquilo C3-C6 sustituido, heterocicloalquilo C2-C6 no sustituido y heterocicloalquilo C2-C6 sustituido; o

R7 y R8 tomados juntos forman un enlace;

R6 es H, alquilo C1-C4 sustituido o no sustituido, heteroalquilo C1-C4 sustituido o no sustituido, alcoxialquilo C1-C6, alquilaminoalquilo C1-C8, cicloalquilo C3-C6 sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo C2-C8 sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, alquilo C1-C4 (arilo), alquilo C1-C4 (fenilo), alquilo C1-C4 (heteroarilo), alquilo C1-C4 (cicloalquilo C3-C8), o alquilo C1-C4 (heterocicloalquilo C2-C8), o alquilaminoalquilo C1-C8;

R es H, o alquilo C1-C6 y

solvatos farmacéuticamente aceptables o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

En otra realización, el inhibidor de Btk de movilización para usar en la presente invención es 1-[(3R)-3-[4-amino-3-(4- fenoxifenil)pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il]piperidin-1-il]prop-2-en-1-ona.

En ciertas realizaciones, el compuesto de fórmula I puede incluir un centro o centros asimétricos, y puede estar en forma de una composición de una mezcla racémica, una mezcla diastereoisomérica, un enantiómero individual, un diastereómero enantiomérico, un compuesto meso, un epímero puro, o una mezcla de epímeros de los mismos, etc. Además, el compuesto de fórmulas I puede tener uno o más dobles enlaces, y puede estar en forma de una mezcla cis/trans, E/Z o un isómero geométrico E o Z de los mismos.

El compuesto de fórmula I también se puede preparar como una forma de sal, por ejemplo, sales farmacéuticamente aceptables, que incluyen formas ácidas apropiadas, por ejemplo, formas de sal seleccionadas de clorhidrato, bromhidrato, acetato, propionato, butirato, sulfato, hidrogenosulfato, sulfito, carbonato, hidrogenocarbonato, fosfato, fosfinato, oxalato, hemioxalato, malonato, hemimalonato, fumarato, hemifumarato, maleato, hemimaleato, citrato, hemicitrato, tartrato, hemitartrato, aspartato y glutamato.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra los resultados de un ensayo de transwell in vitro usando células CD34+ humanas y migración hacia un gradiente de SDF-1 con concentraciones variables de un inhibidor de Btk basado en pirimidina.

Descripción detallada

Las células sanguíneas desempeñan un papel crucial en el mantenimiento de la salud y la viabilidad de los animales, incluidos los humanos. Los glóbulos blancos incluyen neutrófilos, macrófagos, eosinófilos, basófilos, mastocitos y las células B y T del sistema inmune. Los glóbulos blancos se reemplazan continuamente a través del sistema hematopoyético, por la acción de factores estimulantes de colonias (CSF) y diversas citoquinas en células progenitoras en tejidos hematopoyéticos. Las secuencias de nucleótidos que codifican un número de estos factores de crecimiento se han clonado y secuenciado. Quizás el más conocido es el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) que ha sido aprobado para contrarrestar los efectos negativos de la quimioterapia al estimular la producción de glóbulos blancos y células progenitoras (movilización de células madre de sangre periférica). Se puede encontrar una discusión de los efectos hematopoyéticos de este factor, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos No. 5,582,823.

Se ha informado que varios otros factores aumentan los glóbulos blancos y las células progenitoras tanto en sujetos humanos como animales. Estos agentes incluyen factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM- CSF), interleucina-1 (IL-1), interleucina-3 (IL-3), interleucina-8 (IL-8), PIXY-321 (GM-CSF/Proteína de fusión de IL-3), proteína inflamatoria de macrófagos, factor de células madre, trombopoyetina y oncogén relacionado con el crecimiento, como agentes únicos o en combinación. Dale et al. (1998) Am. J. of Hematol. 57:7-15; Rosenfeld et al.

(1997) Bone Marrow Transplantation 17:179-183; Pruijt et al., (1999) Cur. Op. in Hematol. 6:152-158; Broxmeye et al. (1995) Exp. Hematol. 23:335-340; Broxmeyer et al. (1998) Blood Cells, Molecules and Diseases 24:14-30; Glaspy et al. (1996) Cancer Chemother. Pharmacol. 38 (suppl): S53-S57; Vadhan- Raj et al. (1997) Ann. Intern. Med.126:673-81; King et al. (2001) Blood 97:1534-1542; Glaspy et al. (1997) Blood 90:2939-2951.

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Mientras que los factores de crecimiento endógeno son farmacológicamente eficaces, las desventajas bien conocidas de emplear proteínas y péptidos como productos farmacéuticos subyacen a la necesidad de añadir al repertorio de tales factores de crecimiento con agentes que son moléculas pequeñas. En otro aspecto, tales moléculas pequeñas son ventajosas sobre proteínas y péptidos donde se desea la producción en grandes cantidades.

Como se usa en este documento, el término "célula progenitora" se refiere a una célula que, en respuesta a ciertos estímulos, puede formar células hematopoyéticas o mieloides diferenciadas. La presencia de células progenitoras se puede evaluar mediante la capacidad de las células en una muestra para formar unidades formadoras de colonias de diversos tipos, que incluyen, por ejemplo, CFU-GM (unidades formadoras de colonias, granulocitos-macrófagos); CFU-GEMM (unidades formadoras de colonias, multipotenciales); BFU-E (unidades de formación de ráfagas, eritroides); HPP-CFC (células proliferativas de alto potencial proliferativo); u otros tipos de colonias diferenciadas que se pueden obtener en cultivo utilizando protocolos conocidos.

Como se usa en este documento, las "células madre" son formas menos diferenciadas de células progenitoras. Por lo general, tales células son a menudo positivas para CD34. Sin embargo, algunas células madre no contienen este marcador. Estas células CD34+ se pueden analizar usando clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y, de este modo, su presencia se puede evaluar en una muestra usando esta técnica.

En general, las células CD34+ están presentes solo en bajos niveles en la sangre, pero están presentes en grandes cantidades en la médula ósea. Mientras que otros tipos de células, tales como las células endoteliales y los mastocitos también pueden exhibir este marcador, CD34 se considera un índice de la presencia de células madre.

El desarrollo y la maduración de las células sanguíneas es un proceso complejo. Las células sanguíneas maduras se derivan de células precursoras hematopoyéticas (progenitoras) y células madre presentes en tejidos hematopoyéticos específicos, incluida la médula ósea. Dentro de estos entornos, las células hematopoyéticas proliferan y se diferencian antes de ingresar a la circulación. El receptor de quimiocinas CXCR4 y su factor 1 derivado de células estromales del ligando natural (SDF-1) parecen ser importantes en este proceso. Véase, por ejemplo, Maekawa et al (2000) Internal Med. 39:90-100; Nagasawa et al. (2000) Int. J. Hematol. 72:408 411). Esto se demuestra por los informes que los ratones con deficiencia genética CXCR4 o SDF-1 presentan defectos hematopoyéticos. Ma et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci USA 95:9448 9453; Tachibana et al. (1998) Nature 393:591 594; Zou et al. (1998) Nature 393:595-599.

También se sabe que las células progenitoras CD34+ expresan CXCR4 y requieren SDF-1 producida por células estromales de médula ósea para la quimioatracción y el injerto, Peled et al. (1999) Science 283:845-48, y que in vitro, SDF-1 es quimiotáctico para ambas células CD34+, Aiuti et al. (1997) J. Exp. Med. 185:111-120; Viardot et al.

(1998) Ann. Hematol. 77:194 197, y para las células progenitoras, Jo et al. (2000) J. Clin. Invest. 105:101-111. SDF- 1 también es un quimioatrayente importante, que señaliza a través del receptor CXCR4, para varios otros progenitores hematopoyéticos más comprometidos y células sanguíneas maduras, incluidos linfocitos T y monocitos, Bleul et al. (1996) J. Exp. Med. 184:1101-1109), pro-and pre-B lymphocytes, Fedyk et al. (1999) J. Leukoc. Biol.

(1999) 66:667-673; Ma et al. (1999) Immunity 10:463-71, y megakaryocytes. Hodohara et al. (2000) Blood 95:769- 75; Riviere et al. (1999) Blood 95:1511-23; Majk et al. (2000) Blood 96:4142-51; Gear et al. (2001) Blood 97:937-45; Abi-Younes et al. (2000) Circ. Res. 86:131-38.

Se sabe que el eje de señalización SDF-1/CXCR4 dirige el alojamiento y el injerto de células madre hematopoyéticas a la médula ósea. Kucia et al. (2005) Stem Cells 23:879-94. SDF-1 es una quimiocina CXC y se considera como uno de los quimioatrayentes más potentes de las células madre hematopoyéticas (HSC) en la médula ósea. Lapid et al (2009) "Egress and Mobilization of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells" en StemBook (disponible en
www.stembook.org/node/558). La unión de SDF-1 a CXCR4 desencadena el acoplamiento de proteína G (de conformación inactiva a una conformación activa) y posterior disociación de la proteína G heterotrimérica en subunidades GPy y Gai, que a su vez se unen a varios efectores aguas abajo, lo que resulta en activación de PI3K, proteína quinasa C (PKC) y rutas mediadas por MAPK. Sharma et al. (2011) Stem Cells Dev. 20 (6): 933-46. Los estudios del eje SDF 1/CXCR4 en la migración de células B han identificado la tirosina quinasa de Bruton (Btk) como una quinasa central en la cascada de señalización SDF-1/CXCR4. De Gorter et al. (2007) Immunity 26: 93-104. La expresión de Btk se ha descrito en HSC, células progenitoras multipotentes y células del linaje mieloide, Mohammed et al. (2009) Immunological Reviews 228: 58-73, que incluye células eritroides, plaquetas, monocitos, macrófagos, granulocitos y células dendríticas. En el linaje linfoide, Btk se expresa en células B, pero no en células T o células asesinas naturales (células NK). Schmidt et al (2004) Int Arch Allergy Immunol. 134:65-78.

En particular, el bloqueo del eje de señalización SDF-1/CXCR4 por AMD3100 (plerixafor o Mozobil®), un inhibidor de molécula pequeña que se une a CXCR4 evitando la unión de SDF-1 y la posterior señalización corriente abajo, causa una movilización rápida y reversible de CD34+ HSC en la sangre periférica para cosechar por aféresis. El bloqueo de la cascada de señalización SDF-1/CXCR4 con un inhibidor de Btk (PCI-32765) en pacientes con tumores malignos de células B produce disminuciones rápidas y clínicamente significativas en la linfadenopatía a medida que las células B malignas se movilizan fuera de los ganglios linfáticos y en la sangre periférica produciendo una linfocitosis marcada. La presente invención elucida el papel de Btk en la orientación y movilización de HSC y

proporciona composiciones y métodos para usar inhibidores de Btk para la movilización de células madre y/o progenitoras hematopoyéticas.

Definiciones

"Alquilo" significa un radical de hidrocarburo monovalente saturado de cadena lineal o ramificada. A modo de 5 ejemplo, la cadena de hidrocarburos puede tener de uno a veinte carbonos, de uno a dieciséis carbonos, de uno a catorce carbonos, de uno a doce carbonos, de uno a diez carbonos, de uno a ocho carbonos, de uno a seis carbonos, de uno a cuatro carbonos etc. "Alquilo inferior" puede referirse a alquilos que tienen, por ejemplo, de uno a seis carbonos, de uno a cuatro carbonos, etc. En ciertos ejemplos, un alquilo de cadena lineal puede tener de uno a seis átomos de carbono y un alquilo ramificado de tres a seis átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, 10 2-propilo, butilo (incluidas todas las formas isómeras), pentilo (incluidas todas las formas isoméricas). "Me" significa metilo, "Et" significa etilo, e "iPr" significa isopropilo.

"Arilo" significa un radical hidrocarburo aromático monovalente monocíclico o bicíclico, por ejemplo, que tiene de 6 a 20 o 6 a 10 átomos en el anillo, por ejemplo, fenilo o naftilo.

"Alquilarilo" significa un radical (alquileno)-R donde R es arilo como se definió anteriormente.

15 "Cicloalquilo" significa un radical hidrocarburo monovalente saturado o parcialmente saturado cíclico (o un radical alicíclico). A modo de ejemplo, el cicloalquilo puede tener de tres a veinte átomos de carbono, de tres a dieciséis átomos de carbono, de tres a catorce átomos de carbono, de tres a doce átomos de carbono, de tres a diez átomos de carbono, de tres a ocho átomos de carbono, de tres a seis átomos de carbono, en el que uno o dos átomos de carbono pueden estar reemplazados por un grupo oxo, por ejemplo, admantanilo, ciclopropilo, ciclobutilo, 20 ciclopentilo, ciclohexilo, ciclohexenilo e indanilo.

"Alquilcicloalquilo" significa un radical (alquileno)-R donde R es cicloalquilo como se definió anteriormente; por ejemplo, ciclopropilmetilo, ciclobutilmetilo, ciclopentiletilo o ciclohexilmetilo.

"Heterociclilo" o "heterocicloalquilo" significa un grupo monocíclico monovalente saturado o insaturado, en el que uno o dos átomos en el anillo son heteroátomos seleccionados de N, O o S, siendo los átomos restantes en el anillo C. 25 El anillo heterociclilo opcionalmente está fusionado a un (un) anillo de arilo o heteroarilo como se define en este documento. El anillo de heterociclilo fusionado al anillo de arilo o heteroarilo monocíclico también se denomina en esta solicitud como anillo "heterociclilo bicíclico". Adicionalmente, uno o dos átomos de carbono del anillo en el anillo de heterociclilo se pueden reemplazar opcionalmente por un grupo -CO-. Más específicamente, el término heterociclilo incluye pirrolidino, piperidino, homopiperidino, 2-oxopirrolidinilo, 2-oxopiperidinilo, morfolino, piperazino, 30 tetrahidropiranilo y tiomorfolino. Cuando el anillo de heterociclilo es insaturado, puede contener uno o dos dobles enlaces de anillo. Cuando el grupo heterociclilo contiene al menos un átomo de nitrógeno, también se denomina en este documento heterocicloamino y es un subconjunto del grupo heterociclilo. Cuando el grupo heterociclilo es un anillo saturado y no está fusionado con un anillo arilo o heteroarilo como se ha indicado anteriormente, también se denomina en este documento heterociclilo monocíclico saturado.

35 "Alquilheterocicloalquilo" significa un radical -(alquileno)-R donde R es un anillo heterociclilo como se definió anteriormente, por ejemplo, tetrahidrofuranilmetilo, piperazinilmetilo y morfoliniletilo.

"Heteroarilo" significa un radical aromático monovalente monocíclico o bicíclico, donde uno o más, preferiblemente uno, dos o tres, átomos en el anillo son heteroátomos seleccionados entre N, O o S, siendo los átomos restantes del anillo carbono. Los ejemplos representativos incluyen pirrolilo, tienilo, tiazolilo, imidazolilo, furanilo, indolilo, 40 isoindolilo, oxazolilo, isoxazolilo, diazolilo, pirazolilo, triazolilo, benzotiazolilo, benzoxazolilo, quinolinilo, isoquinolinilo, piridinilo, pirimidinilo, pirazinilo, piridazinilo y tetrazolilo.

"Oxo" o "carbonilo" significa = grupo (O) o grupo C = O, respectivamente.

El término "sustituido" significa que el grupo referenciado está sustituido con uno o más grupo(s) adicional(es) seleccionados individualmente e independientemente de los grupos descritos en este documento. En algunas 45 realizaciones, un sustituyente opcional se selecciona de oxo, halógeno, -CN, -NH2, -OH, -NH(CH3), -N(CH3)2, alquilo (que incluye alquilo de cadena lineal, ramificada y/o insaturada), cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, fluoroalquilo, heteroalquilo sustituido o no sustituido, alcoxi sustituido o no sustituido, fluoroalcoxi, -S-alquilo, -S(O)2-alquilo, -CONH((alquilo sustituido o no sustituido) o (fenilo sustituido o no sustituido), -CON (H o alquilo)2, -OCON (alquilo sustituido o no sustituido^, - NHCONH ((alquilo sustituido o no 50 sustituido) o (fenilo sustituido o no sustituido)), - NHCOalquilo, -N (alquilo sustituido o no sustituido) CO (alquilo sustituido o no sustituido), -NHCOO (alquilo sustituido o no sustituido), -C(OH)(alquilo sustituido o no sustituido^ y - C(NH2) (alquilo sustituido o no sustituido^. En algunas realizaciones, a modo de ejemplo, se selecciona un sustituyente opcional de oxo, flúor, cloro, bromo, yodo, -CN, -NH2, -OH, -NH(CH3), -N(cH3)2, -CH3, -CH2CH3, - CH(CH3)2, -CF3, -CH2CF3, -OCH3, -OCH2CH3, -OCH(CH3)2, -OCF3, - OCH2CF3, -S(O)2-CH3, -CONH2, -CONHCH3, -

55 NHCONHCH3, -COCH3 y -COOH. En algunas realizaciones, los grupos sustituidos están sustituidos con uno, dos o

tres de los grupos precedentes. En algunas realizaciones, los grupos sustituidos están sustituidos con uno o dos de

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los grupos precedentes. En algunas realizaciones, los grupos sustituidos están sustituidos con uno de los grupos precedentes. Además, a menos que se indique lo contrario, una fórmula con enlaces químicos mostrados solo como líneas continuas y no como cuñas o líneas discontinuas contempla cada isómero posible, por ejemplo, cada enantiómero y diastereómero, y una mezcla de isómeros, tales como mezclas racémicas o escalémica.

El término "aminoácido" incluye uno cualquiera de los veinte aminoácidos de origen natural o la forma D de una cualquiera de los aminoácidos naturales. Además, el término "aminoácido" también incluye otros aminoácidos no naturales además de los D-aminoácidos, que son equivalentes funcionales de los aminoácidos naturales. Tales aminoácidos no naturales incluyen, por ejemplo, norleucina ("Nle"), norvalina ("Nva"), L- o D-naftalanina, ornitina ("Orn"), homoarginina (homoArg) y otros bien conocidos en la técnica peptídica, tal como las descritas en M. Bodanzsky, "Principies of Peptide Synthesis," 1st and 2nd Revised Ed., Springer-Verlag, New York, N.Y., 1984 and 1993, y Stewart and Young, "Solid Phase Peptide Synthesis," 2nd Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, Ill., 1984.

Los aminoácidos y análogos de aminoácidos pueden adquirirse comercialmente (Sigma Chemical Co.; Advanced Chemtech) o sintetizarse usando métodos conocidos en la técnica.

"Cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad eficaz" significa la cantidad de una composición, compuesto, terapia o ciclo de tratamiento que, cuando se administra a un sujeto para tratar una enfermedad, trastorno o afección, es suficiente para conseguir tal tratamiento para la enfermedad, trastorno o afección. La "cantidad terapéuticamente eficaz" variará dependiendo de la composición, el compuesto, la terapia, el curso del tratamiento, la enfermedad, trastorno o afección, y su gravedad y la edad, peso del sujeto que se va a tratar.

Inhibidores de Btk

La tirosina quinasa de Bruton es un miembro de la familia de quinasas Tec citoplásmicas. Al igual que otros miembros de la familia Btk, contiene un dominio de homología de pleckstrin (PH) y dominios de homología Src SH3 y SH2. Btk juega un papel importante en el desarrollo de células B. Btk comprende varios dominios del N-terminal: los dominios PH, Tec homology (TH), SH2, SH3 y quinasa (SH1). Cada uno de estos dominios tiene el potencial de interactuar con una plétora de proteínas críticas para la señalización intracelular. Además, la asociación funcional de Btk con muchos de sus socios es crucial para su activación y regulación. Btk es una enzima metaloproteína que requiere Zn2+ para una actividad y estabilidad óptimas. Mohammed (2009) Immuno. Rev. 228:58-73.

Los inhibidores de Btk de movilización apropiados para su uso en la presente invención comprenden un anillo de pirimidina, esto es, una 1, 3 diazina. El inhibidor de Btk de movilización se selecciona de un compuesto de fórmula I estructural:

imagen2

en la que:

La es CH2, O, NH o S;

Ar es un arilo sustituido o no sustituido, fenilo no sustituido o un heteroarilo sustituido o no sustituido;

Y es un anillo de cicloalquilo de 4, 5, 6 o 7 miembros, o

Y es un anillo de heterocicloalquilo que contiene nitrógeno monocíclico de 4, 5, 6 o 7 miembros;

Z es C(=O), OC(=O), NHC(=O), NRC(=O), C(=S), S(=O)x, OS(=O)x, NHS(=O)x, donde x es 1 o 2;

R7 y R8 se seleccionan independientemente entre H, alquilo C1-C4 no sustituido, alquilo C1-C4 sustituido, alcoxialquilo C1-C6, alquilaminoalquilo C1-C8, alquilo Ci-C4(fenilo), heteroalquilo C1-C4 no sustituido, heteroalquilo C1-C4 sustituido, cicloalquilo C3-C6 no sustituido, cicloalquilo C3-C6 sustituido, heterocicloalquilo C2-C6 no sustituido y heterocicloalquilo C2-C6 sustituido; o

5 R7 y R8 tomados juntos forman un enlace;

R6 es H, alquilo C1-C4 sustituido o no sustituido, heteroalquilo C1-C4 sustituido o no sustituido, alcoxialquilo C1-C6, alquilaminoalquilo C1-C8, cicloalquilo C3-C6 sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo C2-C8 sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, alquilo C1-C4 (arilo), alquilo C1-C4 (fenilo), alquilo C1-C4 (heteroarilo), alquilo C1-C4 (cicloalquilo C3-C8), o alquilo C1-C4 (heterocicloalquilo C2-C8), 10 o alquilaminoalquilo C1-C8;

R es H, o alquilo C1-C6 y

solvatos farmacéuticamente aceptables o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Las realizaciones apropiadas de tales compuestos inhibidores de Btk basados en pirimidinas se describen con más detalle en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 8,088,781, 8,008,309, and 7,514,444 y solicitudes pendientes 15 relacionadas.

En otra realización, el inhibidor de Btk de movilización para uso en la presente invención es 1-[(3R)-3-[4-amino-3-(4- fenoxifenil)pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il]piperidin-1-il]prop-2-en-1-ona.

En el alcance de las realizaciones, los inhibidores de Btk descritos en este documento incluyen formas adicionales de los compuestos tales como sales, solvatos (incluyendo hidratos) farmacéuticamente aceptables, fases amorfas, 20 formas parcialmente cristalinas y cristalinas (que incluyen todos los polimorfos), isotópicamente marcados, epímeros, epímeros puros, mezclas de epímeros, enantiómeros que incluyen pero no se limitan a enantiómeros individuales y diastereómeros enantioméricos, mesocompuestos, estereoisómeros, mezclas racémicas y mezclas diastereoisoméricas, los inhibidores de Btk descritos en este documento que tienen uno o más enlaces dobles incluyen isómeros cis/trans, isómeros E/Z e isómeros geométricos, los inhibidores de Btk descritos en este 25 documento se pueden preparar como sales farmacéuticamente aceptables formadas cuando un protón ácido presente en el compuesto original o bien se reemplaza por un ion metálico, por ejemplo un ion de metal alcalino, un ion alcalinotérreo o un ion de aluminio; o se coordina con una base orgánica. Además, las formas de sal de los compuestos descritos se pueden preparar usando sales de los materiales de partida o compuestos intermedios,

En algunas realizaciones, un inhibidor de Btk de la descripción está presente en una composición como una sal. En 30 algunas realizaciones, las sales se obtienen haciendo reaccionar un compuesto de la divulgación con ácidos. En algunas otras realizaciones, se obtienen sales farmacéuticamente aceptables reaccionando un compuesto de la divulgación con una base. En otras realizaciones, los compuestos se usan como forma de ácido libre o base libre en la fabricación de las composiciones descritas en este documento. El tipo de sales incluye, pero no se limita a: (1) sales de adición de ácido, formadas por reacción de la forma de base libre del compuesto con un ácido inorgánico 35 farmacéuticamente aceptable, tal como, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico y ácido metafosfórico; o con un ácido orgánico, tal como, por ejemplo, ácido acético, ácido propiónico, ácido hexanoico, ácido ciclopentanopropiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido láctico, ácido malónico, ácido succínico, ácido málico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido trifluoroacético, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido 3- (4-hidroxibenzoil) benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido 40 etanosulfónico, ácido 1,2-etanodisulfónico, ácido 2-hidroxietanosulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido toluenosulfónico, ácido 2-naftalenosulfónico, ácido 4-metilbiciclo- [2.2.2] oct-2-eno-1-carboxílico, ácido glucoheptonico, 4,4'-metilenbis- (ácido 3-hidroxi-2-eno-1-carboxílico), ácido 3-fenilpropiónico, ácido trimetilacético, ácido butilacético terciario, ácido laurilsulfúrico, ácido glucónico, ácido glutámico, ácido hidroxinaftoico, ácido salilícico, ácido esteárico, ácido mucónico, ácido butírico, ácido fenilacético, ácido fenilbutírico y ácido valpróico; (2) 45 sales formadas cuando un protón ácido presente en el compuesto original se reemplaza por un ion metálico, por ejemplo, un ion de metal alcalino (por ejemplo, litio, sodio, potasio), un ion alcalinotérreo (por ejemplo, magnesio o calcio) o ion de aluminio. En algunos casos, el inhibidor de Btk descrito en este documento se hace reaccionar con una base orgánica, tal como etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, trometamina, N-metilglucamina, diciclohexilamina, tris(hidroximetil) metilamina. En otros casos, los compuestos descritos en este documento forman 50 sales con aminoácidos tales como arginina y lisina. Las bases inorgánicas aceptables utilizadas para formar sales con compuestos que incluyen un protón ácido incluyen hidróxido de aluminio, hidróxido de calcio, hidróxido de potasio, carbonato de sodio e hidróxido de sodio.

Cuando los inhibidores de Btk descritos en este documento incluyen uno o más centros quirales, la estereoquímica de tales centros quirales puede estar independientemente en la configuración R o S, o una mezcla de las dos. Los 55 centros quirales se pueden designar adicionalmente como R o S o R,S o d,D, 1,L o d, l, D,L. Según el caso, los inhibidores de Btk de la invención, si pueden estar presentes en forma ópticamente activa, pueden estar realmente presentes en forma de una mezcla racémica de enantiómeros, o en forma de cualquiera de los enantiómeros

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separados en forma sustancialmente aislada y purificada, o como una mezcla que comprende cualquier proporción relativa de los enantiómeros.

Cuando los inhibidores de Btk descritos en este documento contienen dos o más centros quirales, entonces son posibles diastereómeros. Tales diastereómeros pueden estar presentes como enantiómeros diastereoméricos puros, mezclas racémicas puras de enantiómeros diastereoméricos, mezclas de diastereómeros que pueden ser racémicos o pueden tener actividad óptica por derecho propio debido a permutaciones complejas de diastereómeros enantioméricos en el resto de las mezclas.

Cuando los inhibidores de Btk de la invención pueden estar presentes en formas geométricamente isómeras, entonces pueden estar realmente presentes en forma de una mezcla de isómeros geométricos que comprende cualquier proporción relativa de los isómeros, o en algunos casos en forma de cualquiera de los isómeros geométricos separados en forma sustancialmente aislada y purificada.

Cuando los inhibidores de Btk descritos en este documento incluyen uno o más dobles enlaces aislados o linealmente conjugados, la geometría alrededor de tales dobles enlaces puede ser independientemente una mezcla cis/trans, E/Z o un isómero geométrico E o Z de los mismos.

En algunas realizaciones, los inhibidores de Btk descritos en este documento incluyen formas de adición de solvente o formas cristalinas de los mismos, particularmente solvatos o polimorfos. Los solvatos contienen cantidades ya sea estequiométricas o no estequiométricas de un solvente, y se pueden formar durante el proceso de cristalización con solventes farmacéuticamente aceptables tales como agua y etanol. Los hidratos se forman cuando el solvente es agua, o se forman alcoholatos cuando el solvente es alcohol.

Como se indicó anteriormente, en algunas realizaciones, los inhibidores de Btk descritos en este documento poseen uno o más estereocentros y cada centro existe independientemente en la configuración R o S. Los inhibidores de Btk presentados en este documento incluyen todas las formas diastereoméricas, enantioméricas y epiméricas, así como las mezclas apropiadas de las mismas.

En algunas realizaciones, los sitios en los inhibidores de Btk descritos en este documento son susceptibles a diversas reacciones metabólicas. Por lo tanto, la incorporación de sustituyentes apropiados en los lugares de reacciones metabólicas reducirá, minimizará o eliminará las vías metabólicas. En realizaciones específicas, el sustituyente apropiado para disminuir o eliminar la susceptibilidad del anillo aromático a reacciones metabólicas es, a modo de ejemplo solamente, un halógeno, deuterio o un grupo alquilo.

En algunas realizaciones, los inhibidores de Btk descritos en este documento están marcados isotópicamente, que son idénticos a los enumerados en las diversas fórmulas y estructuras presentadas en este documento, pero por el hecho de que uno o más átomos están reemplazados por un átomo que tiene una masa atómica o número de masa diferente de la masa atómica o el número de masa que se encuentra normalmente en la naturaleza. En algunas realizaciones, uno o más átomos de hidrógeno se reemplazan con deuterio. En algunas realizaciones, los sitios metabólicos en los compuestos descritos en este documento están deuterados. En algunas realizaciones, la sustitución con deuterio proporciona ciertas ventajas terapéuticas resultantes de una mayor estabilidad metabólica, tal como, por ejemplo, una semivida in vivo aumentada o requisitos de dosificación reducidos. A lo largo de la memoria descriptiva, un experto en el campo puede elegir grupos y sustituyentes de los mismos para proporcionar unidades estructurales y compuestos estables.

Los inhibidores de la actividad de Btk quinasa preferiblemente inhiben la actividad de Btk con una IC50 de menos de o igual a 10 micromolar, menos o igual a 1 micromolar, menos o igual a 500 nanomolar, menos de o igual a 100 nanomolar, o menos de o igual a 10 nanomolar en un ensayo ADP-GLO™, bioluminiscente, homogéneo o en un ensayo HTRF® (Fluorescencia homogénea resuelta en el tiempo).

Los inhibidores de la actividad tirosina quinasa de Bruton preferiblemente inhiben la fosforilación de Y551 de Btk con una IC50 de menos de o igual a 10 micromolar, menos de o igual a 1 micromolar, menos de o igual a 500 nanomolar, menor o igual que 112 nanomolar, menos de o igual a 100 nanomolar, o menos de o igual a 10 nanomolar.

Los inhibidores de la actividad tirosina quinasa de Bruton preferiblemente inhiben la fosforilación de Y223 de Btk con una IC50 de menos de o igual a 10 micromolar, menos de o igual a 1 micromolar, menos de o igual a 500 nanomolar, menor o igual que 112 nanomolar, menos de o igual a 100 nanomolar, o menos de o igual a 10 nanomolar. Los inhibidores de la actividad tirosina quinasa de Bruton pueden inhibir la fosforilación de PLCy2 con una IC50 menos de o igual a 10 micromolar, menos de o igual a 1 micromolar, menos de o igual a 500 nanomolar, menos de o igual a 100 nanomolar, o menos de o igual a 10 nanomolar en, por ejemplo, un ensayo de fosfo-PLCg2 de IgM.

Los compuestos descritos en este documento, y otros compuestos relacionados que tienen diferentes sustituyentes se pueden sintetizar usando técnicas y materiales conocidos para los expertos en el arte, tal como se describe, por ejemplo, en March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY 4th Ed., (Wiley 1992); Carey and Sundberg, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY 4th Ed., Vols. A and B (Plenum 2000, 2001), y Green and Wuts, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS 3rd Ed., (Wiley 1999). Los métodos generales para la preparación de los compuestos como

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se describen en este documento pueden derivarse de reacciones conocidas en el campo, y las reacciones pueden modificarse mediante el uso de reactivos y condiciones apropiados, como reconocería el experto, para la introducción de las diversas unidades estructurales encontradas en las fórmulas proporcionadas en este documento. Los métodos de síntesis apropiados para los compuestos de pirimidina en cuestión se describen con más detalle en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 8,088,781, 8,008,309, 7,718,662, 7,514,444 and 7,960,396.

También se describen en este documento composiciones farmacéuticas. Las composiciones farmacéuticas generalmente comprenderán un portador farmacéuticamente aceptable y una cantidad farmacológicamente eficaz de los compuestos, o una mezcla de los mismos, o sales apropiadas de los mismos. La composición farmacéutica puede formularse como polvos, gránulos, soluciones, suspensiones, aerosoles, sólidos, píldoras, comprimidos, cápsulas, geles, cremas tópicas, supositorios, parches transdérmicos y otras formulaciones conocidas en la técnica.

Como se usa en este documento, "portador farmacéuticamente aceptable" comprende cualquiera de los portadores farmacéuticamente aceptados estándar conocidos para los expertos en el arte en la formulación de composiciones farmacéuticas. De este modo, los compuestos, por sí mismos, tales como los que estan presentes como sales farmacéuticamente aceptables, o como conjugados, se pueden preparar como formulaciones en diluyentes farmacéuticamente aceptables; por ejemplo, solución salina, solución salina regulada con fosfato (PBS), etanol acuoso o soluciones de glucosa, manitol, dextrano, propilenglicol, aceites (por ejemplo, aceites vegetales, aceites animales, aceites sintéticos, etc.), celulosa microcristalina, carboximetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, estearato de magnesio, fosfato de calcio, gelatina o polisorbato 80, o como formulaciones sólidas en excipientes apropiados.

Las composiciones farmacéuticas a menudo comprenderán además una o más soluciones reguladoras (por ejemplo, solución salina regulada neutra o solución salina regulada con fosfato), carbohidratos (por ejemplo, glucosa, manosa, sacarosa o dextranos), manitol, proteínas, polipéptidos o aminoácidos tales como glicina, antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito sódico, hidroxitolueno butilado, hidroxianisol butilado, etc.), bacteriostáticos, agentes quelantes como EDTA o glutatión, solutos que hacen que la formulación sea isotónica, hipotónica o débilmente hipertónica con la sangre del receptor, agentes de suspensión, agentes espesantes, conservantes, agentes aromatizantes, edulcorantes y compuestos colorantes, según corresponda.

Aunque se puede emplear cualquier portador apropiado conocido para los expertos en el arte en las composiciones, el tipo de portador variará por lo general dependiendo del modo de administración. Las composiciones terapéuticas se pueden formular para cualquier forma de administración apropiada, que incluye, por ejemplo, administración oral, nasal, mucosal, rectal, vaginal, tópica, intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea e intramuscular.

Para la administración parenteral, las composiciones se pueden administrar como dosificaciones inyectables de una solución o suspensión de la sustancia en un diluyente fisiológicamente aceptable con un portador farmacéutico que puede ser un líquido estéril tal como agua estéril libre de pirógenos, aceites, solución salina, glicerol, polietilenglicol o etanol. Adicionalmente, sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, surfactantes, sustancias reguladoras de pH pueden estar presentes en las composiciones. Otros componentes de las composiciones farmacéuticas son los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, por ejemplo, soluciones no acuosas de aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, oleato de etilo y miristato de isopropilo.

Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando el inhibidor de Btk de movilización en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. En general, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un portador estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son el secado al vacío y la liofilización que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución filtrada previamente estéril del mismo. De acuerdo con un aspecto alternativo de la invención, un agente de la invención como se describió anteriormente se puede formular con uno o más compuestos adicionales que mejoran la solubilidad de estos agentes. La invención también se extiende a tales derivados de tales agentes de la invención.

Las composiciones farmacéuticas descritas en este documento se pueden presentar en recipientes de dosis unitaria o multidosis, tales como ampollas o viales sellados. Tales recipientes por lo general están sellados de tal manera que se conserva la esterilidad y estabilidad de la formulación hasta su uso. En general, las formulaciones se pueden almacenar como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, como se indicó anteriormente. Alternativamente, una composición farmacéutica se puede almacenar en un estado liofilizado que requiere solamente la adición de un portador líquido estéril inmediatamente antes de su uso. En una realización, se proporciona una composición farmacéutica que comprende células progenitoras hematopoyéticas expandidas crioconservadas en un medio de crioconservación apropiado, que luego se puede descongelar y resuspender según sea necesario para la administración a un paciente.

Las composiciones farmacéuticas descritas en este documento también pueden contener el inhibidor de Btk de movilización en una forma apropiada para uso oral, por ejemplo, en forma de comprimidos, trociscos, comprimidos para deshacer en la boca, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o gránulos dispersables, emulsiones, cápsulas

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duras o blandas, o jarabes o elixires. Las composiciones destinadas para uso oral se pueden preparar según cualquier método conocido en la técnica para la fabricación de composiciones farmacéuticas, y tales composiciones pueden contener uno o más agentes seleccionados de, a modo de ejemplo no limitante, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes colorantes y conservantes para proporcionar preparaciones farmacéuticamente elegantes y apetecibles.

Las formulaciones apropiadas para administración oral se pueden presentar como unidades discretas tales como cápsulas, sellos o comprimidos que contienen cada uno una cantidad predeterminada del ingrediente activo; como polvo o gránulos; como una solución o una suspensión en un líquido acuoso o un líquido no acuoso; o como una emulsión líquida de aceite en agua o una emulsión líquida de agua en aceite.

Las preparaciones de composición que se pueden usar por vía oral incluyen comprimidos, cápsulas de ajuste a presión hechas de gelatina, así como cápsulas blandas selladas hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Los comprimidos se pueden preparar mediante compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Los comprimidos preparados por compresión se pueden preparar comprimiendo en una máquina apropiada el ingrediente activo en una forma de flujo libre tal como un polvo o gránulos, opcionalmente mezclado con aglutinantes (por ejemplo, povidona, gelatina, hidroxipropilmetil celulosa), diluyentes inertes, conservante, disgregante (por ejemplo, glicolato sódico de almidón, povidona reticulada, carboximetilcelulosa sódica reticulada) o agentes lubricantes, de actividad de superficie o dispersantes. Los comprimidos moldeados se pueden preparar moldeando en una máquina apropiada una mezcla del compuesto en polvo humedecido con un diluyente líquido inerte. Los comprimidos se pueden recubrir o ranurar opcionalmente y se pueden formular para proporcionar una liberación lenta o controlada del ingrediente activo en el mismo. Los comprimidos pueden proporcionarse opcionalmente con un recubrimiento entérico, para proporcionar liberación en partes del intestino distintas del estómago. Todas las formulaciones para administración oral deben estar en dosificaciones apropiadas para tal administración. Las cápsulas duras pueden contener los ingredientes activos mezclados con una carga tal como lactosa, aglutinantes tales como almidones y/o lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los compuestos activos se pueden disolver o suspender en líquidos apropiados, tales como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, se pueden agregar estabilizantes. Los núcleos de grageas cuentan con recubrimientos apropiados. Para este fin, se pueden usar soluciones concentradas de azúcar, que opcionalmente pueden contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, soluciones de laca y solventes orgánicos apropiados o mezclas de solventes. Se pueden agregar colorantes o pigmentos a las comprimidos o grageas recubiertas para la identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuestos activos.

Se debe entender que, además de los ingredientes particularmente mencionados anteriormente, los compuestos y composiciones descritos en la presente pueden incluir otros agentes convencionales en la técnica con respecto al tipo de formulación en cuestión, por ejemplo, los apropiados para administración oral pueden incluir agentes aromatizantes.

En algunas realizaciones, uno o más inhibidores de Btk de movilización se pueden formular en composiciones farmacéuticas con ingredientes activos adicionales, o administrar en métodos de tratamiento junto con el tratamiento con uno o más medicamentos adicionales, tales como otro agente como se describe en este documento que también aumenta la movilización de células madre, por ejemplo, o uno o más agentes seleccionados del grupo que consiste en: metionil recombinante humano. G-CSF (nEuPOGEN ®, Filgastim; Amgen), GM-CSF (LEUkInE ®, Sargramostim; Immunex), eritropoyetina (rhEPO, EPOGEN®; Amgen), trombopoyetina (rhTPO; Genentech), interleucina-11 (rhlL-11, NEUMEgA®; American Home Products), ligando de Flt3 (Mobista; Immunex), factor hematopoyético multilinaje (MARSTEM™; Maret Pharm.), Mielopoyetina (Leridistem; Searle), IL-3, factor inhibidor mieloide progenitor-1 (Mirostipen; Human Genome Sciences ), factor de células madre (rhSCF, STEMGEN®; Amgen) y plerixafor (Mozobil®; Genzyme-Sanofi).

La cantidad administrada al huésped variará dependiendo de lo que se está administrando, el propósito de la administración, tal como la profilaxis o la terapia, el estado del huésped, la forma de administración, el número de administraciones, el intervalo entre las administraciones. Estos se pueden determinar empíricamente por los expertos en el arte y se pueden ajustar por el alcance de la respuesta terapéutica. Los factores para considerar al determinar una dosis apropiada incluyen el tamaño y el peso del sujeto, la edad y el sexo del sujeto, la gravedad del síntoma, el estadio de la enfermedad, el método de administración del agente, la vida media de los agentes, y eficacia de los agentes. El estadio de la enfermedad a considerar incluye si la enfermedad es aguda o crónica, la fase recurrente o remitente y la progresividad de la enfermedad.

La determinación de las dosificaciones y los tiempos de administración para una cantidad terapéuticamente eficaz están dentro de la experiencia de la persona normal en el arte. Por ejemplo, una dosis eficaz inicial se puede estimar a partir de cultivos celulares u otros ensayos in vitro. A continuación, se puede formular una dosis en modelos animales para generar una concentración circulante o concentración de tejido, que incluye la de la IC50 determinada por los ensayos de cultivo celular.

Además, la toxicidad y la eficacia terapéutica generalmente se determinan mediante ensayos de cultivo celular y/o animales experimentales, por lo general determinando una LD50 (dosis letal al 50% de la población de prueba) y

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ED50 (eficacia terapéutica en 50% de la población de prueba). La orientación se encuentra en trabajos de referencia estándar, por ejemplo, Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th Ed. (Hardman, J. G. et al., eds.) McGraw-Hill, New York, N.Y. (2001).

Para los fines de esta invención, los métodos de administración se eligen dependiendo de la afección a tratar, la forma del (los) inhibidor (es) de Btk de movilización del sujeto y la composición farmacéutica. La administración de los compuestos terapéuticos se puede realizar de varias maneras, que incluyen por vía oral, subcutánea, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular y posiblemente inyección directa a órganos específicos tales como, por ejemplo, bazo o médula ósea, aunque se prefieren la administración sistémica y oral. La administración de las composiciones farmacéuticas se puede realizar a través de una sola ruta o concurrentemente por varias rutas.

Las composiciones se pueden administrar una vez al día, algunas o varias veces al día, o incluso múltiples veces al día, dependiendo de, entre otras cosas, la indicación que se está tratando y el juicio del médico que prescribe.

Como se describe anteriormente, se describen en este documento inhibidores de Btk de movilización y composiciones farmacéuticas que los comprenden. Los inhibidores de Btk de movilización y las composiciones farmacéuticas se pueden administrar a un sujeto para movilizar las células madre y progenitoras hematopoyéticas del sujeto en la sangre periférica del sujeto. De acuerdo con lo anterior, un inhibidor de Btk de movilización se puede administrar a un sujeto que lo necesita, por ejemplo, un paciente que tiene hematopoyesis deteriorada y/o deficiente en glóbulos blancos tales como células mieloides y linfoides.

Hematopoyesis deteriorada

Una variedad de enfermedades, en particular cánceres y trastornos hiperproliferativos, requieren tratamiento con agentes que son preferentemente citotóxicos para las células en división. Estas terapias incluyen por lo general altas dosis de irradiación y/o agentes quimioterapéuticos. Aunque es necesario eliminar las células cancerosas, un efecto secundario significativo de estos enfoques es el impacto patológico de dichos tratamientos sobre las células normales que se dividen rápidamente, tal como los folículos pilosos, las células de la mucosa y las células hematopoyéticas, incluidas las células progenitoras hematopoyéticas primitivas y las células madre. Esta destrucción indiscriminada de células madre hematopoyéticas y células precursoras/progenitoras lleva a la reducción del recuento de células sanguíneas maduras, tales como linfocitos, neutrófilos y plaquetas, lo que finalmente produce una pérdida de la función del sistema inmunitario en estos pacientes y un riesgo sustancialmente mayor de morbilidad y mortalidad por infecciones oportunistas. La leucopenia resultante de la quimioterapia o la terapia de irradiación puede ocurrir unos días después de los tratamientos citotóxicos, aunque el paciente puede ser vulnerable a la infección hasta por un mes hasta que los recuentos de glóbulos blancos se recuperen dentro de un rango normal. Si el recuento reducido de leucocitos (leucopenia), el recuento de neutrófilos (neutropenia), el recuento de granulocitos (granulocitopenia) y/o el recuento de plaquetas (trombocitopenia) se vuelven suficientemente graves, la terapia debe interrumpirse para permitir la recuperación de los glóbulos blancos, lo que puede resultar es la supervivencia de las células cancerosas, un aumento de la resistencia a los medicamentos en las células cancerosas y, de hecho, puede provocar una recaída del cáncer.

Los métodos para movilizar células progenitoras y células hematopoyéticas a un paciente descritos en este documento se pueden usar para el tratamiento de dicha hematopoyesis deteriorada. Una modalidad de tratamiento que mejora las células madre y/o progenitoras en sangre es útil en tratamientos para mejorar los efectos de afecciones que afectan negativamente la médula ósea, tales como la quimioterapia o la irradiación (intencional o accidental) que produce leucopenia, incluida neutropenia, y trombocitopenia. Como referencia, los inhibidores de Btk de movilización descritos en este documento también pueden potenciar el éxito del trasplante de médula ósea y pueden combatir infecciones en el paciente que experimenta tales terapias. En este contexto y como referencia, los compuestos se pueden usar para movilizar y recoger células madre hematopoyéticas o células progenitoras mediante aféresis y las células cosechadas se usan en tratamientos que requieren trasplantes de células madre. Además, los inhibidores de Btk se pueden usar tanto in vivo para promover la movilización de células madre hematopoyéticas o células progenitoras desde la médula ósea a la sangre periférica o se pueden usar para estudios ex vivo, mediante los cuales las células madre del propio paciente se extirpan y extienden en cultivo para trasplantes autólogos. También se contemplan y a modo de referencia son cribados in vitro, por lo que los compuestos candidatos o de prueba pueden medirse en cuanto a sus efectos sobre la movilización antes de administrarse in vivo.

En algunas realizaciones, el trastorno se refiere a la alteración de la hematopoyesis causada por enfermedad o tratamientos mieloablativos. Como se usa en este documento, "tratamiento" se refiere a un tratamiento terapéutico o profiláctico. El tratamiento abarca la administración de un inhibidor de Btk capaz de movilizar células madre y progenitoras hematopoyéticas a la sangre periférica de un primer sujeto.

El tratamiento "profiláctico" o "terapéutico" se refiere a la administración al sujeto de una o más de las composiciones de inhibidor de Btk. Si se administra antes de la manifestación clínica de la hematopoyesis deteriorada (por ejemplo, leucopenia o neutropenia), entonces el tratamiento es profiláctico, esto es, protege al huésped contra el desarrollo de la afección no deseada, mientras que si se administra después de la manifestación de hematopoyesis deteriorada, el tratamiento es terapéutico. (esto es, está destinado a mejorar la hematopoyesis y/o aumentar el

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recuento de glóbulos blancos). "Sujeto" se refiere a un mamífero, preferiblemente un humano, que necesita tratamiento para una afección, trastorno o enfermedad.

Por ejemplo, los regímenes de quimioterapia mielosupresora con agentes citotóxicos tales como doxorrubicina, paclitaxel, cisplatino, carboplatino, etopósido, ifosfamida, daunorrubicina, citosina arabinósido y tioguanina por lo general inducen una mielosupresión transitoria pero profunda en los pacientes, alrededor de siete a catorce días después de la quimioterapia. Esto puede ser seguido por una rápida reaparición de leucocitos en la sangre periférica y un aumento de "rebote" de los leucocitos circulantes por encima de los niveles basales. A medida que aumenta el recuento de leucocitos, las células progenitoras hematopoyéticas también comienzan a aparecer en la sangre periférica y aumentan rápidamente. Los protocolos que implican la intensificación de la dosis (esto es, para aumentar la muerte logarítmica de la terapia tumoral respectiva) o programar la compresión pueden exacerbar el grado y la duración de la mielosupresión asociada con la quimioterapia y/o la radioterapia. Por ejemplo, en la configuración adyuvante, se ha demostrado que ciclos repetidos de tratamiento basado en doxorrubicina producen daño acumulativo y duradero en las poblaciones de células progenitoras de médula ósea (Lorhrman et al., (1978) Br. J. Haematol. 40:369).

El efecto de este daño a corto plazo de las células hematopoyéticas resultante de la quimioterapia se ha dirigido en cierta medida mediante el uso concurrente de G-CSF (Neupogen®), que se usa para acelerar la regeneración de neutrófilos (Le Chevalier (1994) Eur. J. Cancer 30A:410). Sin embargo, este enfoque ha encontrado limitaciones, ya que puede ir acompañado de trombocitopenia progresiva y daño acumulativo de la médula ósea, como se refleja en una reducción de la calidad de las células progenitoras movilizadas durante los sucesivos ciclos de tratamiento. Debido al interés actual en la intensificación de la dosis de quimioterapia como un medio para mejorar las tasas de respuesta tumoral y la supervivencia del paciente, la necesidad de terapias alternativas para mejorar o reemplazar los tratamientos actuales para rescatar los efectos mielosupresores de la quimioterapia y/o la radioterapia se ha intensificado y actualmente es uno de los principales factores limitantes de la tasa de escalada de dosis de terapia tumoral.

En la presente invención, los tratamientos que usan los inhibidores de Btk de movilización descritos pueden proporcionarse a pacientes que padecen una enfermedad cancerosa o hiperproliferativa, por lo que el tratamiento de la enfermedad con quimioterapia o terapia de irradiación da como resultado una disminución en la celularidad de la médula ósea, haciendo de este modo que el paciente sea más propenso a adquirir agentes infecciosos o enfermedades. De este modo, la administración de los inhibidores de Btk de movilización de la presente invención después de la exposición a la quimioterapia y/o a la radiación permite la movilización de células madre y/o progenitoras hematopoyéticas desde la médula ósea a la sangre periférica. Como se usa en este documento, la administración “posterior” puede estar dentro de 1-24 horas, preferiblemente entre 12 y 24 o entre 24 y 36 o 48 horas, preferiblemente entre uno y 30 días, más preferiblemente entre uno y 14 o 21 días, más preferiblemente entre tres o de cinco a diez o catorce días después de la quimioterapia y/o exposición a la radiación. La mejora de la hematopoyesis puede permitir ventajosamente el uso de dosis aceleradas de quimioterapia o terapia de irradiación.

Adicionalmente (y como referencia), el trasplante de células madre y progenitoras hematopoyéticas recolectadas de un sujeto puede proporcionar una recuperación hematopoyética más rápida y sostenida, por ejemplo, después de la administración de dosis altas de quimioterapia o radioterapia en pacientes con tumores malignos hematológicos y tumores sólidos. Esta se ha convertido en la fuente preferida de células madre hematopoyéticas para el trasplante autólogo debido al menor tiempo de injerto y la falta de procedimientos quirúrgicos necesarios para la extracción de médula ósea (Demirer et al. (1996) Stem Cells 14:106-116; Pettengel et al., (1992) Blood 82:2239-2248). Además, este enfoque se ha utilizado con éxito en la configuración alogénica así como en la configuración singénica, que incluye el contexto de células progenitoras hematopoyéticas más diferenciadas, por ejemplo, células progenitoras mieloides. Véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 8,252,587 y 8,383,095.

Es posible expandir las células madre y progenitoras hematopoyéticas en sistemas ornonstrómicos que contienen estroma. Según los informes, los sistemas de expansión han mostrado aumentos en CFU_GM de más de 100 veces. El enriquecimiento de las células CD34+ puede ser necesario antes de la expansión en el cultivo no estromal, pero puede no ser necesario en los sistemas que contienen estroma. Los primeros resultados de los ensayos clínicos son alentadores y se han tomado para demostrar que el potencial de injerto de las células hematopoyéticas expandidas no se ve comprometido por el cultivo. Otras aplicaciones posibles de la expansión de células madre incluyen la purga de células tumorales; producción de células inmunocompetentes, tales como células dendríticas y células NK, y terapia génica.

Enriquecimiento de los progenitores linfoides comunes (como referencia)

Las células madre hematopoyéticas y los progenitores se pueden obtener de un sujeto, y enriquecerse y/o diferenciarse adicionalmente en progenitores de diferentes linajes según métodos bien conocidos. Por ejemplo, las células progenitoras linfoides comunes, que dan lugar a células B, células T y células asesinas naturales, las células progenitoras mieloides comunes que dan lugar a monocitos, granulocitos, megacariocitos y eritrocitos pueden enriquecerse clasificando según los niveles de expresión de ciertas células receptores del factor de crecimiento. Véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 7,979,057; 7,235,623; 6,908,763; y 5,989,660.

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Por ejemplo, los progenitores linfoides comunes (CLP) expresan bajos niveles de c-kit (CD117) en su superficie celular. Los anticuerpos que se unen específicamente a c-kit en humanos, ratones y ratas son conocidos en la técnica. Alternativamente, el ligando de ckit, factor de acero (Slf) se puede usar para identificar células que expresan c-kit. Las células CLP expresan altos niveles de la cadena alfa del receptor de IL-7 (CDw127). Los anticuerpos que se unen a CDw127 humano o de ratón son conocidos en la técnica. Alternativamente, las células se identifican mediante la unión del ligando al receptor, IL-7.

Los CLP murinos expresan niveles bajos de Sca-1 (Ly-6E y Ly-6A, véase van de Rijn (1989) Proc Natl Acad Sci 86:4634-4638). Los anticuerpos específicos para Sca-1 son conocidos en la técnica. La expresión de altos niveles de Sca-1 en células madre hematopoyéticas murinas se ha descrito previamente (Spangrude et al. (1988) J Immunol 141:3697-3707). Un homólogo humano candidato para Sca-1 se describe en Hill et al. (1996) Exp Hematol 24:936- 943, ya que la expresión de alto nivel de un nuevo epítopo de CD59 identifica un subconjunto de células de médula ósea CD34+ que están altamente enriquecidas para células madre pluripotentes.

El subconjunto CLP también tiene el fenotipo de ausencia de expresión de marcadores específicos del linaje, ejemplificados por B220, CD4, CD8, CD3, Gr-1 y Mac-1. Para fines de tinción, se puede usar un cóctel de reactivos de unión, denominado en este documento "lin". El panel lin comprenderá reactivos de unión, por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de unión funcional de los mismos, ligandos y peptidomiméticos, que reconocen dos o más de los marcadores de linaje. Un panel lin generalmente incluirá al menos un marcador expresado en células B maduras, en células T maduras, en granulocitos maduros y en macrófagos maduros. Los marcadores apropiados para su uso en un panel de linaje se expresan por lo general en estas células maduras, pero no están presentes en múltiples linajes, o en células madre y progenitoras. Las células objeto se caracterizan por carecer de expresión de Thy-1, un marcador que es característico de las células madre hematopoyéticas. El fenotipo del CLP se puede caracterizar además como Mel-14-, CD431°, HSA10, CD45+ y la cadena y del receptor de citoquinas común.

Enriquecimiento de progenitores mieloides (como referencia)

Los progenitores mieloides se pueden subdividir en tres subconjuntos distintos: una célula progenitora mieloide común (CMP) que se caracteriza por la actividad de células progenitoras para los linajes mieloides, pero que carece del potencial para diferenciarse en linajes linfoides; una célula progenitora comprometida con monocitos de granulocitos (GMP); y una célula progenitora comprometida eritroide/megacariocito (MEP). El CMP da lugar a los otros dos subconjuntos.

La población de CMP es útil en el trasplante para proporcionar a un receptor células mieloides, que incluyen megacariocitos, plaquetas y células eritroides, además de monocitos y granulocitos; para cribado de fármacos; modelos experimentales de diferenciación e interacción hematopoyética; ensayos de cribado in vitro para definir los factores de crecimiento y diferenciación, y para caracterizar los genes implicados en el desarrollo y regulación mieloide. Las células nativas se pueden usar para estos fines, o se pueden modificar genéticamente para proporcionar capacidades alteradas.

Cada uno de estos subconjuntos de progenitores se puede separar de una mezcla compleja de células usando reactivos que reconocen específicamente marcadores en la superficie de la célula. Tanto en células humanas como de ratón, los tres progenitores del linaje mieloide se tiñen negativamente para los marcadores Thy-1 (CD90), IL- 7R.alfa. (CD127); y con un panel de marcadores de linaje, cuyos marcadores de linaje pueden incluir CD2; CD3; CD4; CD7; CD8; CD10; CD11b; CD14; CD19; CD20; CD56; y glicoforina A (GPA) en humanos y CD2; CD3; CD4; CD8; CD19; IgM; Ter110; Gr-1 en ratones. Con la excepción del subconjunto MEP de ratón, todas las células progenitoras son CD34 positivas. En el ratón, todos los subconjuntos progenitores se pueden caracterizar adicionalmente como Sca-1 negativo, (Ly-6E y Ly-6A), y c-kit alto. En el ser humano, los tres subconjuntos son CD38 +.

Entre los subconjuntos progenitores, esto es, la población de células definida como Lin-IL-7R-Thy-1-, la población se puede dividir en subconjuntos para las células CMP, GMP y MEP. En humanos, los marcadores IL-3Ra (CDw127) y CD45RA son suficientes para separar los tres subconjuntos, donde el CMP es IL-3RalD CD45RA-; el GMP es IL- 3RalD CD45Ra+; y el MEP es IL-3Ra'CD45RA'. En el ratón, el CD34 y receptor Fcy (FcyR) son útiles para hacer estas distinciones. El CMP se caracteriza como población FcyRlD CD34+; el GMP es FcyRhi CD34+; y el subconjunto MEP es FcyRlD CD34-

En presencia del factor de acero (SLF), ligando de flt-3 (FL), interleucina (IL) -3, IL-11, GM-CSF, trombopoyetina (Tpo) y eritropoyetina (Epo), las células de CMP dan lugar a diversos tipos de colonias mieloeritroides, incluyendo CFu-GEMMeg, unidad formadora en estallido-eritroide (BFU-E), megacariocitos CFU (CFU-Meg), CFU- granulocito/macrófago (CFU-GM), CFU-granulocito (CFU -G) y CFU-macrófago (CFU-M).

El subconjunto de GMP genera colonias CFU-M, CFU-G o CFU-GM que contienen macrófagos y/o granulocitos en respuesta a los factores de crecimiento anteriores. Por el contrario, el subconjunto de MEP da lugar a colonias de CFU-Meg, BFU-E o CFU-MEP que contienen solo megacariocitos y/o eritrocitos en respuesta a IL-3, GM-CSF, Tpo y Epo, pero no forman colonias en la ausencia de Tpo y Epo. Las tres poblaciones de progenitores mieloides no requieren "citocinas de acción temprana" tal como SLF, Fl e IL-11 para iniciar la formación de colonias.

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Todos estos progenitores son capaces de una actividad de diferenciación rápida in vivo. Las células CMP dan lugar a células mielomonocíticas Gr-1+/Mac-1+ y colonias megacariocíticas, así como a células eritroides TER119+ en el bazo y la médula ósea. La población de progenitores GMP da lugar a células Gr-1+/Mac-1+; y la población de progenitores MEP a megacariocitos y células eritroides.

Los subconjuntos objeto se pueden separar de una mezcla compleja de células mediante técnicas que enriquecen las células que tienen las características descritas anteriormente para el subconjunto de interés. Se puede usar una solución apropiada para dispersión o suspensión. Dicha solución generalmente será una solución de sal equilibrada, por ejemplo solución salina normal, PBS, solución salina equilibrada de Hank convenientemente suplementada con suero bovino fetal u otros factores naturales, junto con una solución reguladora aceptable a baja concentración, generalmente de 5-25 mM. Las soluciones reguladoras convenientes incluyen HEPES, soluciones reguladoras de fosfato y soluciones reguladoras de lactato.

La separación de las poblaciones celulares en cuestión se puede lograr mediante el uso de separación por afinidad para proporcionar una población sustancialmente pura. Las técnicas para la separación por afinidad pueden incluir separación magnética, usando perlas magnéticas recubiertas de anticuerpo, cromatografía de afinidad, agentes citotóxicos unidos a un anticuerpo monoclonal o usados en conjunción con un anticuerpo monoclonal, por ejemplo complemento y citotoxinas, y "criba" con anticuerpo unido a una matriz sólida, por ejemplo placa, u otra técnica conveniente. Las técnicas que proporcionan separación precisa incluyen clasificadores de células activadas por fluorescencia, que pueden tener diversos grados de sofisticación, tales como canales de color múltiples, canales de detección de dispersión de luz obtusa y de ángulo bajo, canales de impedancia, etc. Las células se pueden seleccionar contra células muertas empleando tintes asociados con células muertas (por ejemplo, yoduro de propidio). Se puede emplear cualquier técnica que no sea indebidamente perjudicial para la viabilidad de las células seleccionadas.

Los reactivos de afinidad pueden ser receptores o ligandos específicos para las moléculas de superficie celular indicadas anteriormente. Además de los reactivos de anticuerpos, se pueden usar pares de antígenos péptido-MHC y receptores de células T; ligandos peptídicos y receptor; moléculas efectoras y receptoras, y similares. Los anticuerpos y los receptores de células T pueden ser monoclonales o policlonales, y se pueden producir mediante animales transgénicos, animales inmunizados, células B humanas o de animales inmortalizadas, células transfectadas con vectores de ADN que codifican el anticuerpo o receptor de células T. Los detalles de la preparación de anticuerpos y su idoneidad para su uso como miembros de unión específica son bien conocidos para los expertos en el arte.

De particular interés es el uso de anticuerpos como reactivos de afinidad. Convenientemente, estos anticuerpos se conjugan con una etiqueta para usar en la separación. Las etiquetas incluyen perlas magnéticas, que permiten la separación directa, biotina, que se puede eliminar con avidina o estreptavidina unida a un soporte, fluorocromos, que se pueden usar con un clasificador celular activado por fluorescencia, o similar, para permitir la facilidad de separación del tipo de célula particular. Los fluorocromos que encuentran uso incluyen ficobiliproteínas, por ejemplo ficoeritrina y aloficocianinas, fluoresceína y rojo Texas. Con frecuencia, cada anticuerpo está marcado con un fluorocromo diferente, para permitir una clasificación independiente para cada marcador.

Los anticuerpos se añaden a una suspensión de células, y se incuban durante un período de tiempo suficiente para unir los antígenos de superficie celular disponibles. La incubación generalmente será de al menos aproximadamente 5 minutos y usualmente de menos de aproximadamente 30 minutos. Es deseable tener una concentración suficiente de anticuerpos en la mezcla de reacción, de modo que la eficacia de la separación no esté limitada por la falta de anticuerpo. La concentración apropiada se determina por titulación. El medio en el que se separan las células será cualquier medio que mantenga la viabilidad de las células. Un medio preferido es solución salina regulada con fosfato que contiene desde 0.1 a 0.5% de BSA. Diversos medios están disponibles en el mercado y se pueden usar según la naturaleza de las células, incluido el medio de Eagle modificado de Dulbecco (dMEM), solución salina básica de Hank (HBSS), solución salina regulada con fosfato de Dulbecco (dPBS), RPMI, medio de Iscove, PBS con 5 EDTA mM, etc., frecuentemente suplementado con suero de ternera fetal, BSA y HSA.

Las células marcadas se separan entonces en cuanto a la expresión de marcadores de superficie celular como se describió previamente. Las células separadas se pueden recoger en cualquier medio apropiado que mantenga la viabilidad de las células, usualmente con un cojín de suero en el fondo del tubo de recolección. Diversos medios están disponibles comercialmente y se pueden usar según la naturaleza de las células, que incluyen dMEM, HBSS, dPBS, RPMI, medio de Iscove frecuentemente suplementado con suero fetal de ternero.

El cultivo puede contener factores de crecimiento a los que las células responden. Los factores de crecimiento, como se definen en este documento, son moléculas capaces de promover la supervivencia, el crecimiento y/o la diferenciación de las células, ya sea en cultivo o en el tejido intacto, a través de efectos específicos sobre un receptor transmembrana. Los factores de crecimiento incluyen polipéptidos y factores no polipeptídicos. Los factores de crecimiento específicos que se pueden usar para cultivar las células objeto incluyen factor de acero (ligando de c- kit), ligando de Flk-2, IL-11, IL-3, GM-CSF, eritropoyetina y trombopoyetina. Las condiciones de cultivo específicas se eligen para lograr un objetivo particular, esto es, la diferenciación en el eritroide de poblaciones de megacariocitos, el mantenimiento de la actividad de células progenitoras.

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Además de, o en lugar de, factores de crecimiento, las células en cuestión se pueden hacer crecer en un cocultivo con células estromales o de la capa de alimentación. Las células del estroma apropiadas para uso en el crecimiento de células hematopoyéticas son conocidas en la técnica. Estos incluyen estroma de médula ósea como se usa en ""Whitlock-Witte" (Whitlock et al. [1985] Annu Rev Immunol 3:213-235) o condiciones de cultivo "Dexter" (Dexter et al. J Exp Med 145:1612-1616); y células estromales tímicas heterogéneas (Small and Weissman [1996] Scand J Immunol 44:115-121).

Las células cultivadas objeto se pueden usar de una amplia variedad de formas. El medio nutriente, que es un medio acondicionado, se puede aislar en diversas etapas y analizar los componentes. La separación se puede lograr con HPLC, HPLC de fase inversa, electroforesis en gel, enfoque isoeléctrico, diálisis u otras técnicas no degradativas, que permiten la separación por peso molecular, volumen molecular, carga o combinaciones de los mismos. Una o más de estas técnicas se pueden combinar para enriquecer aún más fracciones específicas.

Ejemplos

Ejemplo 1: Inhibición de la migración de HSC a SDF-1 in Vitro Materiales y métodos

Se aislaron células progenitoras hematopoyéticas CD34+ humanas a partir de sangre periférica movilizada con G- CSF y se incubaron con concentraciones variables (0.1 |iM, 1.0 |iM y 10 |iM) del inhibidor de BTK basado en pirimidina 1-[(3R)-3-[4-amino-3-(4-fenoxifenil)pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il]piperidin-1-il]prop-2-en-1-ona durante una hora a 37 °C, 5% de CO2 en medio libre de suero (0.5% de albúmina de suero bovino en medio RPMI). Las células se transfirieron entonces a la cámara superior de una placa de migración Transwell (tamaño de poro de 5.0 |im, Costar Inc.). La cámara inferior contenía solo medios sin suero con 100 ng/ml de SDF-1. Las células se incubaron durante cinco horas a 37 °C, 5% de CO2 para permitir la migración celular de la cámara superior a la cámara inferior. Las células que migraron a la cámara inferior se contaron usando un hemocitómetro.

Resultados

Como se muestra en la figura 1, se observó la inhibición de la migración de células madre en todas las concentraciones probadas del inhibidor de Btk. Notablemente, el inhibidor de BTK mostró actividad a una concentración 500 veces menor que la informada para ensayos similares con plerixafor (50 |iM).

Ejemplo 2: Ensayos CFU y LTR murinos

Materiales y métodos

Ratones

Todas las cepas de ratones (C57Bl/6, Congenic C57Bl/6 [CD45.2+], B6.BoyJ [CD45.1+] y NOD/SCID) se pueden comprar en Jackson ImmunoResearch Laboratories.

Células

Las células mononucleares de baja densidad (LDMNC) se purifican a partir de sangre de ratón y humana mediante procedimientos de corte de densidad usando lympholyte murino y Ficoll Hypaque (Amersham Biosciences), respectivamente. Las células humanas CD34+ se aíslan primero en una fracción LDMNC y luego se purifican por selección positiva con un kit de aislamiento de separación de células de afinidad magnética CD34+ (Miltenyi Biotec).

Ensayos de células formadoras de colonias

Los ratones se analizan para detectar CFU-GM, BFU-E y CFUGEMM. Las células se cultivan en medio Methocult GF+ (StemCell Technologies, Vancouver) que consiste en 1% de metilcelulosa, 30% de FBS, 1% de BSA, 50 ng/mL de factor de células madre, 20 ng/mL de factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, 20 ng/mL de IL-3, 20 ng/mL de IL-6, 20 ng/mL de factor estimulante de colonias de granulocitos y 3 unidades/mL de eritropoyetina. Las colonias se puntúan después de siete días de incubación en una atmósfera humidificada con 5% de CO2 y se reduce (5%) 02. Las colonias se puntúan como se describe en "Hematopoiesis: A Practical Approach" (1993) Oxford Press, pp75-106..

Ensayo de repoblación a largo plazo murino (LTR)

El ensayo de células LTR de ratón detecta células madre funcionales y competitivas y se realiza tal como se describió previamente (Harrison (1990) Blood 55:77-81).

Citometría de flujo

Se usaron CD45.2 antiratón conjugado con FITC y C45.1 antiratón (BD Biosciences) para analizar el quimerismo de células donantes de ratón de ratones B6.BoyJ trasplantados, mientras que CD45 antihumano (FITC, clon 2D1; BD

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PharMingen) se usa para evaluar el quimerismo de células donantes humanas de ratones NOD/SCID. CD34 (PE, clon 8G12), Sca-1 biotinilado desarrollado con SA-PerCPCy5.5, los marcadores de linaje conjugados con APC (CD3, B220, Gr-1) y los anticuerpos cKit-FITC se adquieren de BD Biosciences. Estos anticuerpos se utilizan para identificar y tabular células madre humanas y de murino.

Ejemplo 3 - Movilización de células madre de murino

A los ratones C57Bl/6 se les administra un inhibidor de Btk de pirimidina mediante inyección subcutánea. Las inyecciones de solución salina se usan como control. Se realizan las curvas de respuesta a la dosis (0-50 mg/kg) y respuesta al tiempo (0-24 horas). La sangre periférica se recoge de los ratones y se utiliza para los ensayos de formación de colonias (esto es, CFU-GM, BFU-E y CFU-GEMM) para la evaluación de los progenitores hematopoyéticos. La citometría de flujo se usa para contar los cambios en los niveles de HSC (células Lin- Sca1+Kit+).

Ejemplo 4 - Estudios de orientación

Baja densidad movilizada con inhibidor de Btk de pirimidina [N=10] versus control de solución salina) sangre periférica de ratones donantes C57Bl/6 (CD45.2+) se trasplantan a través de inyecciones de vena de cola en ratones receptores B6.BoyJ (CD45.1+) [N = 1-4/grupo]. Los ratones receptores son asesinados y la médula ósea se recolecta. La médula ósea del receptor se fenotipa por citometría de flujo para evaluar la presencia de CD45.2+ HSC (Lin-Sca1 + Kit+).

Ejemplo 5: estudios de injerto a largo plazo

Para evaluar la movilización de HSC murino funcional, se realiza un ensayo de repoblación competitivo en ratones. Células donadoras de ratones C57Bl/6 (CD45.2+) movilizados con inhibidor de pirmidina Btk (N = 36) frente a control de solución salina (N = 18) se administran a ratones B6.BoyJ irradiados letalmente (CD45.1+) (N = 6/grupo). La médula ósea de B6.BoyJ (CD45.1+) no irradiada sirve como células competidoras. Los ratones receptores se sangran una vez al mes después del trasplante durante hasta 4 meses para determinar el porcentaje de CD45.2+ CD45.1-leucocitos de sangre periférica. La médula ósea de los ratones receptores B6.BoyJ (CD45.1 + ) se usa para un segundo experimento de trasplante en ratones B6.BoyJ (CD45.1+). El segundo conjunto de ratones receptores se sangra una vez al mes durante hasta 4 meses para determinar el porcentaje de CD45.2+ CD45.1- leucocitos de sangre periférica. Los ratones receptores reciben una dosis letal de irradiación (950 cGy) antes de inyección i.v. de células del donante

Ejemplo 6: Movilización de células madre humanas

Para evaluar el efecto de la pirimidina Btk con y sin G-CSF sobre la movilización de células madre, se usa un ensayo de células repobladoras de SCID humano (Dick et al (1997) Stem Cells 15:199-203). Los voluntarios sanos (N = 4/grupo) reciben (1) 5 inyecciones diarias de G-CSF (10 |ig/kg); (2) 1 inyección de inhibidor de Btk (dosis TBD) solo en el día 5; o (3) 5 inyecciones diarias de G-CSF (10 |ig/kg) más 1 inyección de inhibidor Btk (dosis TBD) el día 5. Los sujetos se someten a aféresis en el día 6. Se trasplantan 2.5 x 106 células CD34+ por vía intravenosa en NOS/Ratones SCID (N = 3/grupo) acondicionados con 300 cGy de irradiación corporal total. Un día después, la médula ósea se recoge de los ratones y se determina el porcentaje de células humanas mediante medición directa de células CD45+ humanas totales.

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   REIVINDICACIONES

   1. Una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de tirosina quinasa de Bruton (BTK) para usar en la restauración o mejora de la hematopoyesis en un sujeto que lo necesita y para reducir el alcance o duración de la leucopenia y la neutropenia como resultado de quimioterapia, radioterapia o exposición accidental a la radiación en un sujeto, dicho uso que comprende administrar a dicho sujeto dicha composición farmacéutica en una cantidad eficaz para movilizar células madre y/o progenitoras hematopoyéticas en la sangre periférica de dicho sujeto, en la que el inhibidor de BTK se selecciona de la fórmula I:

   imagen1

   en la que:

   La es CH2, O, NH o S;

   Ar es un arilo sustituido o no sustituido, fenilo no sustituido o un heteroarilo sustituido o no sustituido;

   Y es un anillo de cicloalquilo de 4, 5, 6 o 7 miembros, o

   Y es un anillo de heterocicloalquilo que contiene nitrógeno monocíclico de 4, 5, 6 o 7 miembros;

   Z es C(=O), OC(=O), NHC(=O), NRC(=O), C(=S), S(=O)x, OS(=O)x, NHS(=O)x, donde x es 1 o 2;

   R7 y R8 se seleccionan independientemente entre H, alquilo C1-C4 no sustituido, alquilo C1-C4 sustituido, alcoxialquilo C1-C6, alquilaminoalquilo C1-C8, alquilo C1-C4(fenilo), heteroalquilo C1-C4 no sustituido, heteroalquilo C1-C4 sustituido, cicloalquilo C3-C6 no sustituido, cicloalquilo C3-C6 sustituido, heterocicloalquilo C2-C6 no sustituido y heterocicloalquilo C2-C6 sustituido; o

   R7 y R8 tomados juntos forman un enlace;

   R6 es H, alquilo C1-C4 sustituido o no sustituido, heteroalquilo C1-C4 sustituido o no sustituido, alcoxialquilo C1-C6, alquilaminoalquilo C1-C8, cicloalquilo C3-C6 sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo C2-C8 sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, alquilo C1-C4 (arilo), alquilo C1-C4 (fenilo), alquilo C1-C4 (heteroarilo), alquilo C1-C4 (cicloalquilo C3-C8), o alquilo C1-C4 (heterocicloalquilo C2-C8), o alquilaminoalquilo C1-C8;

   R es H, o alquilo C1-C6 y

   solvatos farmacéuticamente aceptables o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
2. 2. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 1, en la que dicho inhibidor de Btk es 1-[(3R)-3- [4- amino-3-(4-fenoxifenil)pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il]piperidin-1-il]prop-2-en-1-ona.
3. 3. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 1, en la que dicho sujeto tiene hematopoyesis deteriorada.
4. 4. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 3, en la que dicha etapa de administración se realiza después de un tratamiento mielosupresor o mieloablativo de dicho sujeto.
5. 5. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 4, en la que dicho tratamiento mielosupresor o mieloablativo comprende quimioterapia.
6. 6. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 3, en la que dicha etapa de administración se realiza después de la exposición accidental a la radiación de dicho sujeto.

   5 7. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 3, en la que dicha etapa de administración se

   realiza después de la radioterapia de dicho sujeto.
7. 8. La composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, comprendiendo además dicho uso la administración simultánea o secuencial de un agente de movilización adicional seleccionado del grupo que consiste en factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), interleucina -1 (IL- 10 1), interleucina-3 (IL-3), interleucina-8 (IL-8), PIXY-321 (proteína de fusión GM-CSF/IL-3), proteína inflamatoria de

   los macrófagos, factor de células madre, plerixafor, trombopoyetina, oncogén relacionado con el crecimiento y combinaciones de los mismos.