ES2369487T3 - Combinación farmacéutica de g-csf y plgf útil para células madre de sangre. - Google Patents

Combinación farmacéutica de g-csf y plgf útil para células madre de sangre. Download PDF

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Abstract

Preparación farmacéutica combinada que contiene G-CSF y P1GF como sustancias activas, para uso en la estimulación de la movilización de células progenitoras de sangre periférica (PBPC) para aumentar la factibilidad y eficacia del trasplante de órganos o células y de protocolos de quimio-radioterapia en pacientes con tumores.

Description

Combinación farmacéutica de G-CSF y PLGF útil para células madre de sangre.
Campo de la invención
Esta invención se refiere a una combinación de moléculas biológicamente activas para uso en la movilización de
5 células madre sanguíneas en un paciente o sujeto que tiene necesidad de ello. Más específicamente, la invención proporciona una combinación de G-CSF y P1GF particularmente eficaz en la estimulación de células madre de sangre periféricas (PBPC), aumentando así la factibilidad y eficacia del trasplante de órganos o células y de protocolos quimio-radioterapéuticos en pacientes con tumor.
Antecedentes de la invención
10 Las PBPC autólogas tienen indicaciones significativamente incrementadas de factibilidad y eficiencia en quimioradioterapia a dosis altas y trasplantes de células madre autólogas (SCT)1,2 en pacientes con linfoma no hodgkiniano (NHL)3, linfoma de Hodgkin de recidiva (HL)4 así como mieloma múltiple (MM)5.
Las PBPC alógenas representan la fuente preferida de células madre para SCT que casan con HLA y la única fuente de alógrafos desacoplados a HLA6, 7, 8, 9, 10, 11 que es una terapia potencialmente curativa para pacientes con riesgo
15 alto de leucemia que carecen de un donante acoplado a HLA relacionado o no relacionado, esto es, aproximadamente 40% de la población global de pacientes que se pueden beneficiar de los trasplantes alógrafos.
Los protocolos usados para movilizar PBPC autólogas en pacientes de cáncer incluyen el uso de factores de crecimiento mieloides solos o durante la recuperación de quimioterapia citotóxica, permitiendo este último enfoque una movilización óptima de PBPC12, 13, 14. La movilización de PBPC alógenas de donantes sanos usualmente se
20 logra con tratamientos cortos con factor recombinante humano estimulante de granulocitos (rhG-CSF) en dosis que varían de 10 a 20 μg/kg/día 15, 16, 17,18.
Los pacientes de cáncer autoinjertados con >5 x 106 células CD34+/kg experimentan un pronto y durable injerto hematopoyético, mientras que los que reciben < 2 x 106 células CD34+/kg tienen el riesgo de injerto demorado, fallo de injerto o mielodisplasia19. Por tanto, en la realización de SCT autólogo, la disponibilidad de cantidades adecuadas 25 de células CD34+ representa un prerrequisito esencial. Debido a una quimio-radioterapia anterior o a factores relacionados con enfermedad, una proporción sustancial de pacientes de cáncer con quimioterapia simple (de 10 a 20%) o demorada/refractaria (de 30 a 40%) fracasan en la movilización de cantidades óptimas de células CD34+20,
21, 22
.
La recogida de cantidades adecuadas de células CD+ alógenas no representa una cuestión crítica en receptores de
30 trasplantes de HLA idénticos; sin embargo, de 5 a 1 0% de donantes normales experimentan una mala movilización de células madre y requieren dosis incrementadas de rhG-CSF y múltiples procedimientos aferéticos22, 24, 25. Los receptores de HLA desacoplado requieren la reinfusión de dosis “mega” de células CD34+ empobrecidas en linfocitos para prevenir fallo de injerto y GvHD26 severa. Bajo el régimen de movilización estándar, (esto es, un tratamiento de 7 días de rhG-CSF), donantes de SCT desacoplados a HLA experimentan una media de 4
35 leucoferasas para recoger la dosis diana de células CD34+ (12 x 106 células de CD34+/kg de peso corporal), con una proporción sustancial de donantes (de 20 a 25%) que fracasan en el suministro de la dosis diana de células CD34+.
A pesar de que la edad, el sexo, el programa del tratamiento con citoquinas así como la quimio-radioterapia previa pueden afectar a la movilización de células madre27, 28, 29, no se han identificado claramente características
40 específicas como factores de predicción de la movilización de citosinas. Por tanto, es de esperar que, cualquier procedimiento aplicable a pacientes de cáncer o donantes normales y capaz de aumentar el rendimiento de progenitores circulantes en ausencia de toxicidad añadida, tendrá un impacto profundo sobre la factibilidad, toxicidad y costes de SCT autólogo y alógeno.
Se puede conseguir una movilización aumentada de PBPC usando moléculas capaces de interferir con el(los)
45 mecanismo(s) que regula(n) el tráfico de células madre hematopoyéticas, esto es, la transmigración a través de el endotelio luminal a los espacios extravasculares de la médula espinal en el alojamiento y la reversión en la movilización30, 31, 32, 33. Un enfoque adicional para intensificar la movilización de PBPC se basa en el uso de combinaciones de citocinas, tales como el factor recombinante humano (rh) estimulante de colonias de granulocitosmacrófagos (rhGM-CSF) más rhG-CSF34, interleucina-3 (rhlL-3) más rhG-CSF o rhGM-CSF35 y PlXY-32136.
50 Finalmente, se puede conseguir la intensificación de la movilización de PBPC por incorporación en el régimen estándar de movilización, de citosinas de actuación temprana, tales como el factor de células madre estándar (rhSCF)37, 38 del ligando flt-339, capaz de expandir los progenitores de la médula, aumentando así el número de células susceptibles de posterior movilización por rhG-CSF.
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Los sustituidos o adjuntos de rhG-CSF fracasaron en mejorar sustancialmente la movilización de progenitores de sangre activados con rhgCSF solos, o dieron por resultado una mejora contrarrestada por una toxicidad sustancialmente incrementada de la toxicidad.
El factor de crecimiento placentario (P1FG) es un miembro de la familia de factores de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y funciona como un amplificador señalador a través del receptor-1 de VEGF (VEGFR1). Recientemente, la administración de un vector adenoviral que expresa P1GF (h) humano ha demostrado que ejerce efectos hematopoyéticos complejos, incluida la intensificación de la recuperación de médula ósea después de mielosupresión y movilización de progenitores hematopoyéticos. Sin embargo, la administración de factores de crecimiento después de inyección de vectores adenovirales presenta varias diferencias importantes con la inyección directa de un factor purificado, y es posible no poder predecir sus efectos cuando se administra de acuerdo con las modalidades usadas en el contexto clínico.
Descripción de la invención
Debido al relevante impacto clínico de cualquier procedimiento capaz de mejorar la movilización de células madre, se ensayó la actividad de movilización de P1GF en modelos animales que permiten estimular la movilización de PBPC como se presenta en una situación clínica. Se inyectó intraperitonealmente (IP) en ratones BALB/c normales durante 5 días, vehículo de control (PBS(MSA), rhG-CSF solo (10 μg/d) o una combinación de rhG-CSF (10 μg/d) y P1GF recombinante de murino (rh) (2,5-5 μg/día). Se recogieron muestras de sangre 2 horas después de la última inyección de citocinas y se evaluaron los parámetros siguientes: recuento de leucocitos (WBC), frecuencia y número absoluto de células formadoras de colonia (CFC), número absoluto de células de inicio d cultivo a largo plazo (LTClC).
En las Tablas 1-4 de más adelante se ilustran los efectos de rmP1GF. Es evidente que rmP1GF inyectado solo no tiene efecto sobre la movilización de WBC, CFC y LTC-IC en comparación con mG-CSF solo.
Además, se ensayó la actividad de movilización de combinaciones de P1GF/G-CSF en un modelo no humano de primate (macacos de la India). Los resultados obtenidos en ratones se confirmaron en este modelo animal. En particular, la combinación de P1GF/G-CSF mejoró la movilización de WBC, CFC, HPP-CFC y LTC-C en términos de cinética, frecuencia y números absolutos.
Los estudios indicados antes se han realizado usando procedimientos y condiciones que se asemejan íntimamente a la administración de factores de crecimiento hematopoyéticos a pacientes humanos. Los resultados demuestran claramente la presencia de un efecto sinérgico por G-CSF y rhP1GF en la movilización de células progenitoras de sangre periférica.
Es objetivo de la invención, por tanto, una preparación combinada de G-CSF y P1GF útil para estimular la movilización de células madre de sangre en un paciente o sujeto que lo necesita. Tal como se usan aquí, los términos “paciente” y ”sujeto” se refieren preferiblemente a individuos humanos, aunque también pueden referirse a animales, especialmente mamíferos preferiblemente mamíferos. Entre los ejemplos de estados de enfermedad, afecciones y enfermedades que se pueden beneficiar de la movilización de células madre de sangre figuran, no limitativamente, trasplante de órganos o células y quimio-radioterapia de tumores, en particular SCT autólogo1,2 o alógeno en pacientes con NHL, recidiva de HL4, MM5, o en la fase de recuperación que sigue a quimioterapia mielosupresora.
Los ingredientes activos de la preparación combinada se pueden administrar simultánea o separadamente en formulación con vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables. Se prefiere la administración por vía parenteral. Los procedimientos para la preparación de composiciones farmacéuticas adecuadas para administración parenteral son conocidos en la técnica; se pueden encontrar detalles en “Remington: The Science and Practice of Pharmacie”, Mack Publishing Co. La cantidad de ingredientes activos en las preparaciones combinadas de acuerdo con la invención pueden variar dependiendo, por ejemplo, de la vía de administración, del efecto buscado o la afección a tratar, y de la respuesta del paciente. Como regla general, una cantidad de G-CSF o P1GF eficaz es capaz de producir la respuesta deseada en términos de movilización de células madre. La respuesta del paciente/sujeto se puede controlar durante el tratamiento, por ejemplo, por recuento de células madre de sangre y, si es necesario, las dosificaciones se pueden modificar consecuentemente. En una realización preferente de la invención, se usan hG-CSF recombinante y rhP1GF en forma de soluciones inyectables que suministran una cantidad diaria del compuesto activo comprendida entre 1 y 150, preferiblemente entre 5 y 20 μg/kg de G-CSF y entre 10 y 300, preferiblemente entre 20 y 150 μg/kg de P1GF.
Los ejemplos siguientes ilustran más la invención.
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Ejemplos 1-11. Efectos movilizadores de la combinación de PlGF/G-CSF en un modelo de ratón
Materiales y procedimientos
Animales
Se compraron ratones BALBc hembra de 6 a 8 semanas de un peso de 20 a 25 g, de Charles River (Milán, Italia, EEUU). Se realizaron con animales procedimientos experimentales de acuerdo con las directrices del United Kingdom Coordinating Commitee on Cancer Research (UK Coordinating Commitee on Cancer Research, UKCCCR) para el bienestar de animales en la neoplasia experimental. Br. J. Cancer, 58:109-113,1998). A los ratones se administro diariamente por inyección, intraperitonealmente (IP), durante 5 días, vehículo de control (PBS/MSA), rhG-CSF solo (10 μg/d) o una combinación de rhG-CSF (10 μg/d) con murino recombinante (rm)P1GF (2,5-5 μg/d). Cada experimento se realizó al menos en tres ocasiones separadas y se usaron de tres a cuatro ratones al tiempo por grupo.
Citocinas
El factor recombinante estimulante de colonias de granulocitos humanos (rhG-CSF, Neupogen®) era de Roche (Milán Italia, EEUU); se compró rmP1GF de R&amp;D Systems Inc., Abingdon, RU); rhP1GF se obtuvo de Geymonal SpA (Anagni, Italia, EEUU).
Protocolos de movilización
El protocolo estándar de movilización incluía el tratamiento de BA-L-B/c rhG-CSF-(10 g/ratón, IP) una vez al día durante 5 días, como agente individual o en combinación con rhG-CSF.
A los controles se inyectó PBS/MSA,
Parámetros de movilización
La movilización se evaluó por recuento de leucocitos, frecuencia y números absolutos de células formadoras de colonia (CFC), número absoluto de células que comienzan el cultivo a largo plazo (LTC-IL). A no ser que se establezca lo contrario, los animales se sacrificaron dos horas después del último tratamiento.
Recolección y separación de muestras
Se cosechó PB del plexo orbital en tubos que contenían heparina. Después del recuento de leucocitos, se diluyó PB (1:4, v/v) con PBS y se separaron células mononucleares (MC) por centrifugación (280 g, 30 min, temperatura ambiente) a un gradiente discontinuo de densidad de Ficoll. Las células se lavaron luego dos veces en medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM, Seromed, Berlin, Alemania, EEUU) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS, Stem Cell, Technologies Vancouver, Canadá), L-glutamina 2 mM y antibióticos.
Recuento de leucocitos (WBC)
Se realizaron recuentos de leucocitos usando sangre anticoagulada con heparina y un contador automatizado (ADVIA 120, Bayer, Milán, Italia, EEUU).
Ensayo de células formadoras de colonia (CFC)
Se estimaron en cultivos estándar de metilcelulosa células formadoras de colonia (CFC) en total, esto es, unidades formadoras de colonias de granulocitos-macrófagos (CFU-GM), unidades que forman estallidos de eritroides (BFU-E) y CFU de multilinaje (CFU-GEMM). En resumen, se cultivaron alícuotas de 1 ml de sangre (5 x 104 a 2 x 105 MNC) en discos Petri de 35 mm en medio basado en metilcelulosa (HCC-3434; Stem Cell Technologies) suplementado con factor recombinante de células madre de ratón (rmSCF, 50 ng/ml), interleucina-3 rm de ratón (rmIL-3, 10 ng/ml), interleucina-6 recombinante humana (rh) (rhIL-6, 10 ng/ml) y eritropoietina rh (rhEpo, 3 U/ml. Las colonias se puntuaron de acuerdo con criterios estándar después de 12-14 días de incubación a 37ºC en atmósfera humedecida de 5% de CO2 en aire (Humphries, R.K. y otros, Blood, 53:746-763, 1979).
Ensayo de células de inicio de cultivo a largo plazo (LTC-IC)
Las LTC-IC se estimaron en cultivos a granel (Carlo-Stella C. y otros, Blood. 199;93:3973-82). En resumen, se pusieron en suspensión células de ensayo (5 – 8 x 106) en mdedio completo (MyelocultMC 5100, Stem Cell Technologies) y se sembraron en cultivos que contenían una capa de alimentación de células AFT024 de murino irradiadas (2.000 cGy) (suministradas amablemente por el Dr. K. Moore, Princeton University, Princeton, NJ, USA) (Moore y otros, Blood, 1997; 89:4337-47).
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El medio completo estaba constituido por medio alfa suplementado con FBS (12,5%), suero de caballo (12,5%), Lglutamina (2 mM), 2-mercaptoetanol (10-4 M), inositol (0,2 mM), ácido fólico (20 μM) más hidrocortisona disuelta recientemente (10-6M).. Los cultivos se alimentaron semanalmente reemplazando la mitad del medio de cultivo con medio de cultivo fresco. Después de 4 semanas de cultivo, se reunieron células no adherentes y adherentes 5 cosechadas por tripsinización, se lavaron y se ensayaron en cuanto a células clonogénicas en cultivos de metilcelulosa. El número total de células clonogénicas (esto es, CFU-GEMM más BFU-E más CFU-GM) presentes en LTC de 4 semanas proporciona una medición relativa del número de LTC-IL originalmente presente en la suspensión de ensayo. Los valores absolutos de LTC-IC se calcularon dividiendo el número total de células clonogénicas por 4, que es una producción media de células clonogénicas por LTC-IC (Sutherland HJ y otros, Blood.
10 1989; 74: 1563-70).
Ejemplo 1
Tabla 1: Recuento de leucocitos (WBC) en ratones tratados con mP1GF y/o rhG-CSF
Régimen de movilización *
WBC/μl de sangre
Medio (intervalo)
Mediana (intervalo) Media + d.e.
PBS/MSA rhG-CSF (10 μg/d) rmP1GF (5 μg/d) rhG-CSF (10 μg/d) + rmP1GF (2,5 μg/d) rhG-CSF (10 μg/d) + rmP1GF (5 μg/d)
2.000 (850-4.000) 6.000 (5.200-21.650) 2.450 (1.350-2.950) 5.600 (4.600-13.700) 9.500 (4.800-18.400) 2.165 + 929 9.577 + 5.575 2.450 + 141 7.040 + 3.778 9.980 + 5.715
* Se inyectó a ratones BALB/c IP durante 5 días PMS/MSA, rhG-CSF solo (10 μg/d) o una combinación de rhG-CSF
(10 μg/d) con rmP1GF (2,5-5 μg/d). Las muestras de sangre se recogieron 2 horas después de la última inyección de 15 rmP1GF y/o rhG-CSF.
Ejemplo 2
Tabla 2: Frecuencia de CFC circulantes en ratones tratados con rmP1GF y/o rhG-CSF
Régimen de movilización*
CFC/105 MNC
Mediana (intervalo)
Media + d.e.
PBS/MSA rhG-CSF (μg/d) rmP1GF (5 μg/d) rhG-CSF (10 μg/d) + rmP1GF (2,5 μg/d) rhG-CSF (10 μg/d) + rmP1GF (5 μg/d)
7 (2-15) 76 (51-148) 8 (7-9) 115 (93-184) 195 (113-253) 8 +3 82 + 29 8 + 1 130 + 37 180 + 58
* Se inyectó a ratones BALB/c IP durante 5 días PMS/MSA, rhG-CSF solo (10 μg/d) o una combinación de rhG-CSF (10 μg/d) con rmP1GF (2,5-5 μg/d). Las muestras de sangre se recogieron 2 horas después de la última inyección de
20 rmP1GF y/o rhG-CSF. Los CSF incluyen CFC de granulocitos/macrófagos (CFU-GM), unidad formadora de estallido de eritroides (BFU-E) y CFC multipotente (CFU-mezcla). Los datos de CFU derivan de cultivos cuatriplicados en muestras de cada animal.
Ejemplo 3:
Tabla 3: Número absoluto de CFC circulantes en ratones tratados con rmP1GF y/o rhG-CSF
Régimen de movilización*
CFC por ml de sangre
Mediana (intervalo)
Media + d.e.
PBS/MSA rhG-CSF (μg/d) rmP1GF (5 μg/d) rhG-CSF (10 μg/d) + rmP1GF (2,5 μg/d) rhG-CSF (10 μg/d) + rmP1GF (5 μg/d)
57 (9-288) 3.129 (1.042-5.518) 96 (87-105) 2.568 (1.480-5.885) 6.143 (2.486-11.520) 81 + 75 2.977 + 1.126 96 + 13 3.198 + 1.928 6.015 + 3.674
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* Se inyectó a ratones BALB/c IP durante 5 días PMS/MSA, rhG-CSF solo (10 μg/d) o una combinación de rhG-CSF (10 μg/d) con rmP1GF (2,5-5 μg/d). Las muestras de sangre se recogieron 2 horas después de la última inyección de rmP1GF y/o rhG-CSF. Los CSF incluyen CFC de granulocitos/macrófagos (CFU-GM), unidad formadora de estallido de eritroides (BFU-E) y CFC (CFU-mezcla) multipotente. Los datos de CFU derivan de cultivos cuatriplicados en muestras de cada animal. El número absoluto de CFC circulantes en sangre es una función de la frecuencia de CFC multiplicada por el número total de MNC por ml de sangre.
Ejemplo 4
Tabla 4: Número absoluto de LTC-IC circulantes en ratones tratados con rmP1GF y/o rhG-CSF
Régimen de movilización*
LTC-IC por ml de sangre
Mediana (intervalo)
Media + d.e.
PBS/MSA rhG-CSF (μg/d) rmP1GF (5 μg/d) rhG-CSF (10 μg/d) + rmP1GF (2,5 μg/d) rhG-CSF (10 μg/d) + rmP1GF (5 μg/d)
7 (3-39) 194 (57-337) 4 (3-5) 565 (279-852) 1.173 (852-2.070) 9 + 5 208 + 98 4 + 2 565 + 405 1.365 + 364
10 * Se inyectó a ratones BALB/c IP durante 5 días PMS/MSA, rhG-CSF solo (10 μg/d) o una combinación de rhG-CSF (10 μg/d) con rmP1GF (2,5-5 μg/d). Las muestras de sangre se recogieron 2 horas después de la última inyección de rmP1GF y/o rhG-CSF. El número absoluto de LTC-IC circulantes se ensayó en cultivos a granel. Se sembraron células de ensayo (5 – 8 x 106) en cultivos que contenían una capa de alimentación de células AFT024 de murino irradiadas. Después de 4 semanas en cultivo, se reunieron células no adherentes y células adherentes cosechadas
15 por tripsinización, se lavaron y ensayaron juntas en cuanto a células clonogénicas. El número total de células clonogénicas (esto es, CFU-mezcla más BFU-E más CFU-GM) presente en LTC de 4 semanas proporciona una medición relativa del número de LTC-IL originalmente presente en la suspensión de ensayo. El número absoluto de LTC-IC circulantes es una función de la frecuencia de CFC multiplicada por el número total de MNC por ml de sangre.
20 Ejemplos 5-11 Efectos movilizadores de combinaciones de PIGF/G-CSF en un modelo no humano de primate
Materiales y procedimientos
Diseño experimental
Se movilizó inicialmente con G-CSF sola (100 μg/d, SC, 5 días) (ciclo 1) una cohorte de macacos de la India (n = 4) y después de un período de lavado de 6 semanas, se realizó una segunda movilización que consistió en rhP1GF (130
25 μg/kg, IV, durante 5 días) más rhG-CSF (100 μg/kg/día, SC, durante 5 días) (ciclo 2). Después de un período adicional de lavado de 6 semanas, se realizó una tercera movilización que consistió en rhPIGF (260 μg/kg/día, IV, durante 5 días) más rhG-CSF (100 μg/kg/día, SC, durante 5 días) (ciclo 3), que se administró a la misma cohorte de monos.
Parámetros de movilización
30 Se analizó la cinética de movilización de leucocitos así como la frecuencia y número absoluto de células formadoras de colonia involucradas (CFC), progenitores potenciales muy proliferativos (HPP-CFC) y células de inicio de cultivo a largo plazo (LTC-IC). Se analizaron diariamente los parámetros de movilización durante el tratamiento (días 1 a 5) y 3 y 5 días después del cese de la terapia. Se obtuvieron muestras de sangre periférica de la vena femoral de primates anestesiados (cetamina, intramuscularmente) usando técnicas asépticas
35 Recuento de leucocitos
Los recuentos de leucocitos se realizaron usando sangre coagulada con EDTA y un contador automatizado (ADVIA 120, Bayer, Milán, Italia, EEUU).
Ensayos de CFC y HPP-CFC
Se ensayaron el total de CFC [esto es, unidades que forman colonias de granulocito-macrófago (CFU-GM), unidades
40 que forman estallido de eritroides (BFU-E) y CFU de multilinaje (granulocitos, eritrocitos, macrófagos, magacariocitos) (CFU-GEMM)] y HPP-CFC usando sangre heparinizada de acuerdo con una técnica descrita previamente (41, 42). En resumen, se cultivaron células mononucleares (MNC) (1 x 104 a 2 x 105 obtenidas por centrifugación en un gradiente discontinuo de Ficoll (densidad = 1,077 g/ml) por cuatriplicado en discos Petri en
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medio basado en metilcelulosa (HCC-4100, Stem Cell Technologies, Vancouver, Canadá) suplementado con factor recombinante de células madre humanas (rhSCF, 50 ng/ml, Stem Cell Technologies, Vancouver, Canadá), interleucina-3 (rhIL-3, 20 ng/ml, Stem Cell Technologies), interleucina-6 (rhIL-6, 20 ng/ml, Stem Cell Technologies), rhG-CSF (20 ng/ml, Stem Cell Technologies), factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos (rhG-CSF, 5 20 nmg/ml, Stem Cell Technologies) y eritropoietina (rhEpo, 3U/ml, R&amp;D Systems Inc., Abingdon, RU). Las CFC se puntuaron después de 12-14 días de incubación (37ºC, 5% de CO2) de acuerdo con criterios estándar. Las HPP-CFC, definidas como colonias macroscópicamente visibles de diámetro >1 mm de crecimiento compacto de la colonia, se puntuaron después de 28 días de incubación en cultivo de metilcelulosa suplementado con rhSCF (50 ng/ml), rhIL-3 (20 ng/ml), rhIL-6 (20 ng/ml), rhG-CSF (20 ng/ml), rhGM-CSF (20 ng/ml) y rhEpo (3 U/ml) (43). El
10 número absoluto de CFC circulantes o HPP-CFC en sangre es función de la frecuencia de CFC o HPP-CFC multiplicada por el número total de las MNC por ml de sangre.
Ensayos de LTC-IC
La frecuencia de LTC-IC se estimó en condiciones de dilución limitativa (44). En resumen, diluciones seriales de células de ensayo (2 x 105 a 3 x 103 se pusieron nuevamente en suspensión de 150 μl de medio completo 15 (MyelocultMC 5100, Stem Cell Technologies) consistente en medio alfa suplementado con suero fetal bovino (12,5%), suero de caballo (12,5%), L-glutamina (2 mM), 2-mercaptoetanol (10-4M), inositol (0,2 mM), ácido fólico (20 μM) más hidrocortisona recientemente disuelta (10-6M) y se cultivaron en placas de fondo plano de 96 pocillos. Para cada dosis de células se cultivaron de 16 a 22 replicados. Las células de ensayo se sembraron en placas que contenían una capa de alimentación de células M2-10B4 de murino irradiadas (8.000 cGy) (3 x 104/cm2, proporcionadas 20 amablemente por el Dr. C. Eaves, Terry Fox Laboratory, Vancouver, Canadá), diseñadas por ingeniería por transferencia retroviral de genes para producir IL-3 humano y G-CSF (45). Los cultivos se alimentaron semanalmente reemplazando la mitad del medio de crecimiento con medio completo fresco. Después de 5 semanas de cultivo, se cosecharon por tripsinización células no adherentes y adherentes de pocillos individuales, se lavaron y ensayaron juntas en cuanto al crecimiento de las CFC. Después de 12 a 14 días de incubación, se puntuaron los cultivos como 25 positivos (>1 colonia) o negativos (no hay colonia) y se calcularon las frecuencias de LTC-IC usando software L-Calc (Stem Cell Technologies). Los números absolutos de LTC-IC circulantes se estimaron en cultivos a granel (46). En resumen, células de ensayo (5-8 x106) se pusieron nuevamente en suspensión en medio completo y se sembraron en cultivos que contenían una capa de alimentación de células M2-10B4 de murino (3 x 104/cm2). Después de 5 semanas de cultivo, se reunieron células no adherentes y células adherentes cosechadas por tripsinización, se
30 lavaron y ensayaron juntas en cuanto a células clonogénicas. El número total de células clonogénicas (esto es, CFU-GEMM más BFU-E más CFU-GM) presentes en LTC de 5 semanas proporciona una medición relativa del número de LTC-IL originalmente presente en la suspensión de ensayo. Los valores absolutos de LTC-IC se calcularon dividiendo el número total de células clonogénicas por 4, que es una producción media de células clonogénicas por LTC-IC.
35 Ejemplo 5
Leucocitos circulantes
Una administración durante 5 días de rhG-CSF solo indujo un incremento medio de 5 veces en el número medio (+ d.e.) de leucocitos en comparación con valores antes de tratamiento. La adición de 130 a 260 μg/kg de rhPIGf a rhG-CSF dio por resultado un incremento modesto de los valores de WBC en día 5 de tratamiento.
40 Tabla 5: Recuento de leucocitos en macacos de la India tratados con rhG-CSF solo o rhPIGF más rhG-CSF
Recuento de leucocitos por μl de sangre*
Ciclo 1
Ciclo 2 Ciclo 3
Día
rhG-CSF (100 μl/kg/día, SC, durante 5 días) rhPIGF (130 μg/kg, IV, durante 5 días)+rhG-CSF (100 μg/kg/día, SC, durante 5 días) rhPIGF (260 μg/kg, IV, durante 5 días)+rhG-CSF (100 μg/kg/día, SC, durante 5 días)
1 2 3 4 5 8 10
8.708 + 2.458 31.313 + 3.889 40.600 + 6.274 43.055 + 6.562 43.523 + 13.790 14.363 + 4.163 12.145 + 5.421 13.498 + 5.514 24.533 + 2.789 35.388 + 2.207 39.440 + 6.744 60.040 + 9.508 23.073 + 9.017 16.398 + 8.314 8.370 + 1.585 41.180 + 7.364 44.085 + 6.588 37.960 + 3.598 49.048 + 7.120 17.783 + 5.964 11.150 + 2.915
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* Macacos de la India (n= 4) recibieron tres ciclos de movilización separados por un período de lavado de 6 semanas. La movilización se edujo en el ciclo 1 por rhG-CSF solo (100 μg/kg/día, SC, días 1-5), en el ciclo 2 por una combinación de rhPIGF (130 μg/kg/día, IV, días 1-5) más rhG-CSF (100 μg/kg/día, SC, días 1-5) y en el ciclo 3 por una combinación de rhPIGF (260 μg/kg, V, días 1-5) más rhG-CSF (100 μg/kg/día, SC, días 1-5). Los recuentos de
5 leucocitos se analizaron diariamente durante el tratamiento (días 1 a 5), así como los días 3 y 5 después del cese de la terapia. Los datos se expresan como media + d.e.
Ejemplo 6
Frecuencia de CFC
En comparación con los valores de la línea de base, las frecuencias medias de CFC en sangre (por 105 MNC)
10 detectadas el día 5 de movilización se aumentaron en 19, 53 y 52 veces con rhG-CSF solo, rhG-CSF/rhPIGF (130 μg/kg) y rhG-CSF/rhPIGF (260 μg/kg), respectivamente. En comparación con rhG-CSF solo, el tratamiento combinado con rhPIGF/rhG-CSF indujo un aumento de 2 veces de la frecuencia de CFC el día del pico.
Tabla 6: Frecuencia de CFC circulantes en macacos de la India tratados con rhG-CSF solo o rhPIGF más rhG-CSF
CFC/105 de MNC*
Ciclo 1
Ciclo 2 Ciclo 3
Día
rhG-CSF (100 μl/kg/día, SC, durante 5 días) rhPIGF (130 μg/kg, IV, durante 5 días)+rhG-CSF (100 μg/kg/día, SC, durante 5 días) rhPIGF (260 μg/kg, IV, durante 5 días)+rhG-CSF (100 μg/kg/día, SC, durante 5 días)
1 2 3 4 5 8 10
6 + 1 4 + 2 9 + 1 114 + 51 63 + 26 66 + 11 10 + 7 4 + 1 9 + 1 39+13 213 + 87 196 + 26 40 + 11 19 +10 5 + 3 19 + 8 48 + 26 245 + 151 261 + 83 60 + 39 21 + 18
* Macacos de la India (n= 4) recibieron tres ciclos de movilización separados por un período de lavado de 6 semanas. La movilización se edujo en el ciclo 1 por rhG-CSF solo (100 μg/kg/día, SC, días 1-5), en el ciclo 2 por una combinación de rhPiGF (130 μg/kg/día, IV, días 1-5) más rhG-CSF (100 μg/kg/día, SC, días 1-5) y en el ciclo 3 por una combinación de rhPIGF (260 μg/kg, V, días 1-5) más rhG-CSF (100 μg/kg/día, SC, días 1-5). Las CLC se
20 analizaron diariamente durante el tratamiento (días 1 a 5), así como los días 3 y 5 después del cese de la terapia. Los datos se expresan como media + d.e. CFC incluye granulocitos-macrófagos (CFU-GM), unidad que forma eclosión de eritroides (BFU-E) y CFC multipotente (CFU-mezcla). Los datos de CFC derivan de cultivos por cuatriplicado sobre muestras de cada animal.
Ejemplo 7
25 Valores absolutos de CFC
Los números absolutos de CFC circulantes en sangre se calcularon en función de la frecuencia de las CFC multiplicada por el número total de MNC por ml de sangre. En comparación con los valores de la línea de base, el tratamiento c on rhG-CSF solo, rhCSF/rhPIGF (130 μg/kg) y rhG-CSF/rhPIGF (260 μg/kg) dio por resultado en un aumento de las CFC de 85, 335 y 358 veces, respectivamente. En los ciclos 2 y 3, los niveles de pico de las CFC se
30 aumentaron en 4 y 5 veces sobre el ciclo 1 (rhG-CSF solo).
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Tabla 7: Número absoluto de CFC circulantes en macacos de la India tratados con rhG-CSF solo o rhPIGF más rhG-CSF
CFC por ml de sangre*
Ciclo 1
Ciclo 2 Ciclo 3
Día
rhG-CSF (100 μl/kg/día, SC, durante 5 días) rhPIGF (130 μg/kg, IV, durante 5 días)+rhG-CSF (100 μg/kg/día, SC, durante 5 días) rhPIGF (260 μg/kg, IV, durante 5 días)+rhG-CSF (100 μg/kg/día, SC, durante 5 días)
2 3 4 5 8 10
1.134 + 9 344 + 207 472 + 60 11.406 +4.093 5.397 + 3.074 3.952 + 2.666 224 +164 138 +38 724 + 254 6.420 + 4.775 32.347 + 14.206 46.283 + 8.287 46.283 + 8.287 448 + 168 170 + 120 6.552 + 4.365 9.634 + 7.006 53.002 + 25.250 60.777 + 8.563 3.719 + 1.899 943 + 994
* Macacos de la India (n= 4) recibieron tres ciclos de movilización separados por un período de lavado de 6 semanas. La movilización se edujo en el ciclo 1 por rhG-CSF sola (100 μg/kg/día, SC, días 1-5), en el ciclo 2 por una combinación de rhPIGF (130 μg/kg/día, IV, días 1-5) más rhG-CSF (100 μg/kg/día, SC, días 1-5) y en el ciclo 3 por 5 una combinación de rhPIGF (260 μg/kg, V, días 1-5) más rhG-CSF (100 μg/kg/día, SC, días 1-5). Las CFC se analizaron diariamente durante el tratamiento (días 1 a 5), así como los días 3 y 5 después del cese de la terapia. Los datos se expresan como media + d.e. CFC incluye granulocitos-macrófagos (CFU-GM), unidad que forma eclosión de eritroides (BFU-E) y CFC multipotente (CFU-mezcla). Los datos de CFC derivan de cultivos por cuatriplicado sobre muestras de cada animal. El número absoluto de CFC circulantes en sangre es función de la
10 frecuencia de CFC multiplicada por el número total de MNC por ml de sangre.
Ejemplo 8
Frecuencia de HPP-CFC
En comparación con los valores de la línea de base, las frecuencias medias de HPP-CFC en sangre (por 105 MNC) detectadas el día 5 de movilización se aumentaron en 5 y 12 veces con rhG-CSF solas o rhG-CSF/rhPIGF (130
15 μg/kg) respectivamente. En comparación con rhG-CSF solo el tratamiento combinado con rhPIGF/rhG-CSF indujo un aumento de 2 veces de la frecuencia de HPP-CFC el día del pico.
Tabla 8. Frecuencia de HPP-CFC circulantes en macacos de la India tratados con rhG-CSF solo o rhPIGF más rhG-CSF
HPP-CFC/105 de MNC*
Ciclo 1
Ciclo 2
Día
rhG-CSF (100 μg/kg/día, SC, durante 5 días) rhPIGF (130 μg/kg, IV, durante 5 días), +rhG-CSF (100 μg/kg/día, SC, durante 5 días)
1 2 3 4 5 8 10
4 + 1 6 + 1 13 + 4 15 + 4 20 + 9 18 + 6 6 + 1 3 + 1 3 + 1 11 + 3 27 + 10 37 + 8 6 + 4 5 + 4
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* Macacos de la India (n = 4) recibieron tres ciclos de movilización separados por un período de lavado de 6 semanas. La movilización se edujo en el ciclo 1 por rhG-CSF solo (100 μg/kg/día, SC, días 1-5), en el ciclo 2 por una combinación de rhPIGF (130 μg/kg/día, IV, días 1-5) más rhG-CSF (100 μg/kg/día, SC, días 1-5) y en el ciclo 3 por una combinación de rhPIGF (260 μg/kg, V, días 1-5) más rhG-CSF (100 μg/kg/día, SC, días 1-5). Las HPP-CFC se
5 analizaron diariamente durante el tratamiento (días 1 a 5), así como los días 3 y 5 después del cese de la terapia. Los datos se expresan como media + d.e. Los datos de HPP-CFC derivan de cultivos por cuatriplicado sobre muestras de cada animal.
Ejemplo 9
Valores absolutos de HPP-CFC
10 El número absoluto de las HPP-CFC por ml de sangre detectados el día 5 de la terapia de rhG-CSF fue 17 veces más alto que los valores de pretratamiento. Los monos que recibieron el tratamiento combinado de rhG-CSF/rhPIGF (130 μg/kg) presentaron un aumento de 158 veces de HPP-CFC en comparación con los valores de la línea de base. En el ciclo 2, el nivel de HPP-CFC el día 5 aumentó en 5 veces sobre el ciclo 1.
Tabla 9. Números absolutos de HPP-CFC circulantes en macacos de la India tratados con rhG-CSF solo o rhPIGF 15 más rhG-CSF
HPP-CFC por ml de sangre*
Ciclo 1
Ciclo 2
Día
rhG-CSF (100 μg/kg/día, SC, durante 5 días) rhPIGF (130 μg/kg, IV, durante 5 días), +rhG-CSF (100 μg/kg/día, SC, durante 5 días)
1 2 3 4 5 8 10
96 + 17 493 + 218 683 + 156 1.521 + 332 1.593 + 405 998 + 541 121 + 52 54 + 49 258 + 34 1.709 + 989 3.883 + 1.309 8.557 + 1.142 603 + 384 121 + 87
* Macacos de la India (n = 4) recibieron tres ciclos de movilización separados por un período de lavado de 6 semanas. La movilización se edujo en el ciclo 1 por rhG-CSF solo (100 μg/kg/día, SC, días 1-5), en el ciclo 2 por una combinación de rhPiGF (130 μg/kg/día, IV, días 1-5) más rhG-CSF (100 μg/kg/día, SC, días 1-5) y en el ciclo 3 por
20 una combinación de rhPIGF (260 μg/kg, IV, días 1-5) más rhG-CSF (100 μg/kg/día, SC, días 1-5). Los recuentos de HPP-CFC se analizaron diariamente durante el tratamiento (días 1 a 5), así como los días 3 y 5 después del cese de la terapia. Los datos se expresan como media + d.e. Los datos de HPP-CFC derivan de cultivos por cuatriplicado sobre muestras de cada animal. El número absoluto de HPP-CFC circulantes es función de la frecuencia de HPP-CFC multiplicada por el número total de MNG por ml de sangre.
25 Ejemplo 10.
Frecuencia de LTC-IC
El análisis de la frecuencia de las LTC-IC por un ensayo de dilución limitativa demostró que la administración combinada de rhPIGF (130 μg/kg) y rhG-CSF dio por resultado un aumento medio de la frecuencia de LTC-IC de 11 veces (1 en 5.829 células frente a 1 en 64.064 células), en comparación con rhG-CSF solo.
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Tabla 10. Frecuencia de LTC-IC circulantes en macacos de la India que reciben un tratamiento de 5 días de rhG-CSF solo o rhPIGF más rhG-CSF
Animal nº
Régimen de movilización Frecuencia media* de LTC-IC 95% de CI LTC-ICx105 por MNC
Frecuencia inferior
Frecuencia superior
1
rhG-CSF 1/84.265 1/69.209 1/102.598 1,2
2
rhG-CSF 1/65.835 1/54.341 1/79.761 1,5
3
rhG-CSF ne** ne ne ne
4
rhG-CSF 1/42.091 1/34.837 1/50.854 2,4
1
rhPIGF (130 μg/kg) +rhG-CSF rhPiGF 1/42.009 1/5.977 1/2.689 24,9
2
(130 μg/kg) +rhG-CSF rhPIGF 1/7.562 1/11.100 1/5.152 13,2
3
(130 μg/kg) +rhG-CSF rhPIGF (130 μg/kg) ne ne ne ne
4
+rhG-CSF 1/5.916 2/8.725 1/4.011 16,9
* La frecuencia de LTC-IC se ensayó en condiciones de dilución limitativas usando la línea de células de murino M2-10B4 como capa estromal. Las muestras de sangre se recogieron el día 5 de la terapia de movilización. Diluciones seriales de las células de ensayo (de 2 x 105 a 3 x 103) se cultivaron durante 5 semanas y se cultivaron de 16 a 22 replicados para cada dosis de células de ensayo. Después de 5 semanas se ensayaron células no
5 adherentes y adherentes de pocillos individuales en cuanto a células clonogénicas y las frecuencias de LTC-IC se calcularon usando estadística de Poisson y el procedimiento de máxima probabilidad.
Ejemplo 11.
Valores absolutos de LTC-IC
Bajo rhG-CSF solo, los números absolutos de LTC circulantes aumentaron en 53 veces en comparación con los 10 valores de la línea de base. El tratamiento combinado de rhG-CSF/rhPIGf (130 μg/kg) aumentó LTC-IC en 389 veces en comparación con los valores pretratamiento y en 15 veces en comparación on rhG-CSF solo.

Tabla 11. Números absolutos de LTC-IC circulantes en macacos de la India tratados con rhG-CSF solos o rhPIGF más rhG-CSF
LTC-IC por ml de sangre*
Ciclo 1
Ciclo 2
Día
rhG-CSF (100 μg/kg/día, SC, durante 5 días) rhPIGF (130 μg/kg, IV, durante 5 días), +rhG-CSF (100 μg/kg/día, SC, durante 5 días)
1 2 3 4 5 8 10
4 + 7 92 + 43 111 + 30 211 + 41 130 + 25 63 + 22 6 + 2 8 + 5 56 + 20 624 + 340 742 + 176 3.115 + 988 533 + 270 112 + 40
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* Macacos de la India (n = 4) recibieron tres ciclos de movilización separados por un período de lavado de 6 semanas. La movilización se edujo en el ciclo 1 por rhG-CSF solo (100 μg/kg/día, SC, días 1-5), en el ciclo 2 por una combinación de rhPIGF (130 μg/kg/día, IV, días 1-5) más rhG-CSF (100 μg/kg/día, SC, días 1-5) y en el ciclo 3 por una combinación de rhPIGF (260 μg/kg, IV, días 1-5) más rhG-CSF (100 μg/kg/día, SC, días 1-5). Los recuentos de
5 LTC-IC se analizaron diariamente durante el tratamiento días 1 a 5) así como los días 3 y 5 después del cese del tratamiento. Los datos se expresan como media + d.e. derivados de cultivos por cuatriplicado sobre muestras de cada animal en ese momento. El número absoluto de LTC-IC circulantes se ensayó en cultivos de lote. Las células de ensayo (5-8 x 106) se sembraron en cultivos que contenían una capa de alimentación de células M2-10B4 de murino irradiadas. Después de 5 semanas de cultivo, se reunieron células no adherentes y células adherentes
10 cosechadas por tripsilación, se lavaron y ensayaron juntas en cuanto a células clonogénicas. El número total de células clonogénicas (esto es, CFU-mezcla más BFU-E más CFU-GM) presente en LTC de 5 semanas proporciona una medición relativa del número de LTC-IC originalmente presentes en la suspensión de ensayo. El número absoluto de LTC-IL circulantes en sangre es función de la frecuencia de LTC-IC multiplicada por el número total de MNC por ml de sangre.
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Bibliografìa
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Claims (5)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Preparación farmacéutica combinada que contiene G-CSF y P1GF como sustancias activas, para uso en la estimulación de la movilización de células progenitoras de sangre periférica (PBPC) para aumentar la factibilidad y eficacia del trasplante de órganos o células y de protocolos de quimio-radioterapia en pacientes con tumores.
    5 2. Preparación farmacéutica combinada para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el mencionado trasplante de células es un trasplante de células madre autólogo o alógeno realizado en pacientes con linfoma no hodgkiano (NHL), recidiva de linfoma de Hodgkin (EL), mieloma múltiple o la fase de recuperación que sigue a un trasplante mielosupresor qumioterapéutico.
  2. 3.
    Preparación combinada para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que G-CSF y P1GF se administran 10 simultánea o separadamente al mencionado paciente o sujeto.
  3. 4.
    Preparación combinada para uso de acuerdo con las reivindicaciones 1-3, para administración parenteral.
  4. 5.
    Preparación combinada para uso de acuerdo con las reivindicaciones 1-4, que contiene hG-CSF y rhPILG recombinantes.
  5. 6.
    Preparación combinada para uso de acuerdo con las reivindicaciones 1-5, que contiene de 1 a 150 μg/kg de G15 CSF y de 10 a 300 μg/kg de P1GF.
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