ES2627066T3 - Proteínas elastasas recombinantes y procedimientos de fabricación y uso de las mismas - Google Patents

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F. Nicholas Franano
Kimberly Bland
Marco D. Wong
Bee C. Ding
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Abstract

Una proteina proelastasa autoactivante que comprende (i) una secuencia de propeptidos que comprende una secuencia de peptidos de activacion de elastasa que comprende una secuencia de aminoacidos designada P10-P9- P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1, de la que los aminoacidos P3-P2-P1 estan disenados para formar una secuencia de reconocimiento de elastasa operativamente ligada a (ii) una secuencia de aminoacidos de una elastasa tipo I madura cuyos tres aminoacidos N-terminales estan designados P1'- P2'- P3', en la que (a) la secuencia de propeptidos no es nativa para la elastasa tipo I madura, y (b) cuando se somete a condiciones de autoactivacion, se produce una elastasa tipo I madura.

Description

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Protemas elastasas recombinantes y procedimientos de fabricacion y uso de las mismas DESCRIPCION
1. CAMPO DE LA INVENCION
La presente invencion se refiere a procedimientos recombinantes de fabricacion y formulacion de protemas elastasas para su uso en el tratamiento y la prevencion de enfermedades de conductos biologicos. La presente invencion se refiere ademas a novedosas protemas elastasas recombinantes y composiciones farmaceuticas que contienen tales protemas. Todavfa ademas, la presente invencion se refiere al uso de composiciones farmaceuticas que comprenden protemas elastasas recombinantes para el tratamiento y la prevencion de enfermedades de conductos biologicos.
2. ANTECEDENTES DE LA INVENCION
La elastina es una protema que puede reenrollarse espontaneamente despues de estirarse. La elastina reticulada es el principal componente estructural de las fibras elasticas, que confiere elasticidad al tejido. Una proteinasa puede llamarse una elastasa si posee la capacidad para solubilizar elastina reticulada madura (Bieth, JG “Elastases: catalytic and biological properties” en las pag. 217-320 (Mecham Edition, Regulation of Matrix Accumulation, Nueva York, Academic Press, 1986). Varias solicitudes de patente publicadas (documentos WO 2001/21574; WO 2004/073504; y WO 2006/036804) indican que la elastasa, sola y en combinacion con otros agentes, es beneficiosa en el tratamiento de enfermedades de conductos biologicos, que incluyen conductos biologicos que estan experimentando, o susceptibles a experimentar, obstruccion y vasoespasmo. Para terapia con elastasa de sujetos humanos se desea el uso de una elastasa humana para reducir el riesgo de reaccion inmunitaria a una elastasa no humana.
Sin embargo, hasta la fecha, no hay medios viables comercialmente conocidos de produccion de elastasa biologicamente activa en forma suficientemente pura y en cantidades suficientes para aplicaciones clmicas. Debido a que las elastasas son poderosas proteasas que pueden hidrolizar numerosas protemas distintas de elastina, la actividad proteolttica de la elastasa posee posibles obstaculos para su produccion recombinante. Por ejemplo, la actividad de elastasa madura puede danar la celula huesped que esta expresandola, degradarse a sf misma o degradar agentes usados para ayudar en la produccion o caracterizacion de la elastasa.
Las elastasas se expresan frecuentemente como preproprotemas, que contienen un peptido senal, un peptido de activacion y una porcion activa madura. La escision de la secuencia senal tras la secrecion da una proprotema que puede tener poca o ninguna actividad enzimatica, y cuya secuencia de aminoacidos contiene la secuencia de aminoacidos de un peptido de activacion y una protema madura. Generalmente, para expresion recombinante, un precursor inactivo puede expresarse en lugar de la enzima activa madura para evadir el dano a la celula que la expresa. Por ejemplo, la patente de EE.UU. n° 5.212.068 describe la clonacion de ADNc de elastasa pancreatica humana (denominada allf dentro elastasa “IIA”, “IIB”, “IIIA” y “IIIB”). Las diversas elastasas se expresaron como ADNc de longitud completa, que incluyen las secuencias senal nativas, en celulas COS-1 de mairnfero. Ademas, versiones manipuladas de las elastasas, que contienen una secuencia senal de B. subtilis y una secuencia senal de p-galactosidasa, tambien se expresaron en B. subtilis y E. coli, respectivamente. La patente de EE.UU. n° 5.212.068 tambien sugiere que expresa elastasas en S. cerevisiae. Generalmente, ejemplos de trabajo de expresion de elastasa en la patente de EE.UU. n° 5.212.068 muestran baja actividad de la elastasa recuperada o requieren una etapa de activacion que implica tratamiento con tripsina, para generar la elastasa activa. Ademas, las elastasas estuvieron ampliamente presentes en cuerpos de inclusion cuando se expresaron en E. coli, y solo pequenas porciones de la elastasa expresada fueron solubles y activas. Ninguna de las preparaciones de elastasa descritas en la patente de EE.UU. n° 5.212.068 se purifico a calidad farmaceutica.
Dall’Acqua y col., 1999, Protein Engineering 12, pag. 981-986, desvela la expresion y secrecion del tipo de elastasas de neutrofilos humanos del tipo salvaja y variante humana recombinantes con especifidad de sustrato alterada. Las elastasas se expresaron en Pichia pastorissin una secuencia pro elastasa, y por lo tanto no necesitaron un paso de activacion de zimogeno. La WO00/68363 se refiere a variantes de elastasa con especificidad de sustrato alterada, y preve ademas la produccion de una elastasa o variante de elastas que no require activacion de zimogeno, junto con una molecula de acido nucleico, vector y celula huesped adecuada para su uso en este metodo de produccion, en el que la molecula de acido nucleico codifica una elastasa que carece de una prosecuencia que por lo tanto no requiere de activacion de zimogeno.
Sin embargo, hay una necesidad en la materia de procedimientos de fabricacion recombinantes que permitan la generacion de cantidades terapeuticas de elastasas de calidad farmaceutica biologicamente activas, y preferentemente eviten una etapa de activacion de tripsina que es costosa para preparacion a gran escala y puede producir contaminacion por tripsina del producto final. La administracion de una elastasa que contiene tripsina a un paciente podna producir la activacion de los receptores 1 y 2 activados por proteasa, que puede reducir algunos de los efectos beneficiosos del tratamiento de elastasa.
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La citacion o identificacion de cualquier referencia en la Seccion 2 o en cualquier otra seccion de la presente solicitud no debe interpretarse como una admision de que tal referencia este disponible como tecnica anterior a la presente invencion.
3. RESUMEN DE LA INVENCION
La presente invencion se define en las reivindicaciones. Hasta el punto de que la siguiente descripcion puede explicar detalles referentes a la materia que no esta cubierta por las reivindicaciones, tal materia se proporciona para informacion solo.
La presente invencion proporciona procedimientos eficaces novedosos de preparacion de protemas elastasas recombinantes y el uso de las protemas recombinantes en composiciones, por ejemplo, composiciones farmaceuticas, formulaciones de elastasa o dosificaciones unitarias, para el tratamiento y prevencion de enfermedades de conductos biologicos.
La presente invencion se refiere a protemas proelastasas auto-activadas, acidos nucleicos que codifican protemas proelastasas auto-activadas, celulas huesped que comprenden dichos acidos nucleicos, procedimientos de preparacion de protemas proelastasas auto-activadas y el uso de protemas proelastasas auto-activadas en la fabricacion de protemas elastasas biologicamente activas maduras, por ejemplo, para su uso en formulaciones farmaceuticas. El termino “auto-activadas” (o “autoactivadas”) se usa en el presente documento indistintamente con el terminos “auto-activante” y no pretende implicar que ha tenido lugar una etapa de activacion. El termino “activacion” se usa en el presente documento indistintamente con el termino “conversion” y no pretende implicar que una protema resultante de “activacion” posea necesariamente actividad enzimatica.
Como se usa en el presente documento mas adelante, y a menos que se indique lo contrario, el termino “elastasa” generalmente se refiere a protemas elastasas maduras con actividad de elastasa, ademas de protemas elastasas inmaduras, que incluyen protemas proelastasas inmaduras (tambien denominadas en el presente documento proprotemas elastasas) y protemas preproelastasas inmaduras (tambien denominadas en el presente documento preproprotemas elastasas).
Las elastasas preferidas de la invencion son elastasas pancreaticas tipo I, por ejemplo, elastasa pancreatica tipo I humana y elastasa pancreatica tipo I porcina. Las elastasas pancreaticas tipo I se denominan algunas veces en el presente documento “elastasa-1”, “elastasa I”, “elastasa tipo 1”, “elastasa de tipo 1” o “ELA-1”. La elastasa pancreatica tipo I humana tambien se denomina en el presente documento hELA-1 o ELA-1 humana, y la elastasa pancreatica tipo I porcina tambien se denomina en el presente documento pELA-1 o ELA-1 porcina.
Una protema elastasa madura de la invencion tiene normalmente una secuencia de aminoacidos codificada por un gen elastasa que se produce naturalmente o una variante de tal secuencia. Variantes de secuencia preferidas, que incluyen variantes que contienen sustituciones de aminoacidos, se describen en el presente documento. Una protema proelastasa es un precursor ampliamente inactivo de una protema elastasa madura, y una protema preproelastasa contiene ademas una secuencia senal para la secrecion de protema. Pre y pro secuencias de las protemas elastasas de la invencion son normalmente no nativas para los genes de elastasa que codifican las protemas elastasas maduras de la invencion. Asf, en un sentido, las protemas elastasas inmaduras de la invencion son protemas “quimericas”, con sus porciones maduras codificadas por un gen de elastasa que se produce naturalmente y sus porciones inmaduras codificadas por secuencias de genes de no elastasa.
Para facilidad de referencia, las protemas elastasas de la invencion y sus componentes de la secuencia central se representan en la Figura 2. Como se muestra en la Figura 2, los residuos de aminoacidos dentro de la secuencia de proelastasa que estan en el extremo N para el enlace de escision (es decir, el enlace que se escinde para dar protema elastasa madura) se designan en el presente documento PX,...P5, P4, P3, P2 y P1 en la que P1 esta inmediatamente en el extremo N para el enlace de escision, mientras que los residuos de aminoacidos localizados en el extremo C para el enlace de escision (y con respecto al extremo N) de la protema elastasa madura se designan P1 ’, P2’, P3’,...PX’ en la que P1 ’ esta inmediatamente en el extremo C para el enlace de escision y representa el residuo de aminoacido del extremo N de la protema madura.
La Figura 2 tambien muestra los siguientes componentes:
(1) SECUENCIA SENAL: Una secuencia que aumenta la proporcion de moleculas expresadas que son secretadas de la celula. Una secuencia a modo de ejemplo es los aminoacidos 1-22 de SEC ID N°: 50 o 51.
(2) PROPEPTIDO + ESPACIADOR: Una secuencia de propeptidos opcional, preferentemente una no elastasa (tal como propropeptido de factor a de levadura) que puede incluir adicionalmente opcionalmente una o mas secuencias de espaciador (secuencias de propeptidos de factor a de levadura y secuencias de espaciador de Kex2 y STE 13 se representan en la Figura 1B). En una realizacion espedfica, las secuencia de propeptidos no incluye un espaciador.
(3) PROPEPTIDO DE ELASTASA: Peptido que, cuando esta presente sobre el extremo N de una elastasa, convierte la molecula en inactiva o menos activa con respecto a la protema elastasa madura
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correspondiente. El propeptido de elastasa puede estar contiguo al peptido de activacion o puede contener aminoacidos adicionales con respecto al peptido de activacion. Secuencias de propeptidos de elastasa a modo de ejemplo son los aminoacidos 1-l0 de SEC ID N°: 64 y 69.
(4) PEPTIDO DE ACTIVACION: Usado indistintamente en el presente documento con “secuencia de activacion”, un peptido de activacion es un componente de, y puede ser contiguo a, el propeptido de elastasa. Como se muestra en la Figura 2, el peptido de activacion contiene los residuos de aminoacidos P10 a P1. Una secuencia consenso de peptido de activacion a modo de ejemplo es SEC ID N°: 80; otros ejemplos de secuencias de peptidos de activacion son SEC ID N°: 23, 72 y 73.
(5) SECUENCIA DE RECoNoCIMIENTO: Una secuencia de reconocimiento es un componente del propeptido de elastasa. Como se muestra en la Figura 2, la secuencia de reconocimiento contiene los residuos de aminoacidos P3 a P1. Secuencias consenso de secuencias de reconocimiento a modo de ejemplo son SEC ID N°: 11-13 y 93, y una secuencia de reconocimiento a modo de ejemplo es SEC ID N°: 20.
(6) DOMINIO DE ESCISION: Una region en la protema proelastasa que extiende el enlace de escision. Como se muestra en la Figura 2, el dominio de escision contiene los residuos de aminoacidos P5 a P3’. Secuencias de dominio de escision a modo de ejemplo son SEC ID N°: 42, 43, 48, 49, 53, 53, 54 y 55.
(7) SITIO DE ESCISION: Otra region en la protema proelastasa que tambien extiende el enlace de escision. Como se muestra en la Figura 2, el sitio de escision contiene los residuos de aminoacidos P4 a P4’. Una secuencia de sitio de escision a modo de ejemplo es SEC ID N°: 27.
(8) PROTEfNA PREPROELASTASA: Una protema que puede comprender todas las partes del componente. Una protema preproelastasa a modo de ejemplo puede comprender peptidos de SEC ID N°: 50, 51, 96 o 97, seguido de una protema operativamente ligada de SEC ID N°: 64 o SEC ID N°: 69.
(9) PROTEfNA PROELASTASA: Una protema que comprende protema elastasa madura, un propeptido de elastasa y el propeptido opcional y secuencias de espaciador. Secuencias de proelastasa a modo de ejemplo son sEc ID N°: 64 y 69.
(10) PROTEfNA ELASTASA MADURA: Una protema que cuando se procesa adecuadamente muestra actividad de elastasa. Secuencias maduras a modo de ejemplo son SEC ID N°: 1 (humana) y SEC ID N°: 39 (porcina).
Los componentes de la protema elastasa pueden considerarse unidades estructurales modulares de las protemas elastasas, protemas proelastasas y protemas preproelastasas. Por ejemplo, la presente invencion proporciona una protema proelastasa que comprende la secuencia de un propeptido de elastasa y una protema elastasa madura. El propeptido de elastasa puede contener un peptido de activacion. El propeptido de elastasa tambien puede contener una secuencia de reconocimiento de elastasa. La presente invencion tambien proporciona una protema proelastasa que comprende un dominio de escision o sitio de escision en la region que atraviesa la union entre el propeptido de elastasa y la protema elastasa madura. Las protemas proelastasas pueden comprender ademas una secuencia senal para la secrecion. Tales protemas se consideran protemas preproelastasas. Las protemas preproelastasas pueden comprender ademas un propeptido de factor alfa de levadura y opcionalmente una secuencia de espaciador entre la secuencia senal y el propeptido de elastasa. Las protemas elastasas de la invencion tambien pueden contener componentes, ademas de los componentes modulares del nucleo ilustrados en la Figura 2. Por ejemplo, una protema elastasa puede contener una marca de epitope o una marca de histidina para la purificacion. Debe tambien observarse que las protemas elastasas de la invencion no necesitan contener todos los componentes representados en la Figura 2, pero generalmente contienen al menos uno de los componentes (incluyendo, a modo de ejemplo pero no limitacion, una elastasa madura o una secuencia de proelastasa) representados en la Figura 2. Protemas elastasas a modo de ejemplo de la invencion se exponen en las realizaciones 1-12, 28-39 y 68-69 en la Seccion 8 mas adelante, que incluyen protemas proelastasas tipo I a modo de ejemplo como se exponen en las realizaciones 13-27 en la Seccion 8 mas adelante.
Los acidos nucleicos que codifican las protemas elastasas de la invencion, procedimientos para producir y purificar las protemas, celulas recombinantes y sobrenadantes de cultivo celular, composiciones que comprenden protemas elastasas (por ejemplo, composiciones farmaceuticas, dosificaciones unitarias, formulaciones), el uso de las protemas para fines terapeuticos y kits que comprenden las protemas, formulaciones, composiciones farmaceuticas y dosis unitarias estan englobados en el presente documento. Los acidos nucleicos que codifican las protemas elastasas de la invencion se ejemplifican en las realizaciones 40-67 en la Seccion 8 mas adelante, que incluyen vectores (veanse, por ejemplo, las realizaciones 70-72). Tambien se ejemplifican en la Seccion 8 celulas recombinantes (veanse, por ejemplo, las realizaciones 73-84), sobrenadantes de celulas que contienen protemas elastasas (vease, por ejemplo, la realizacion 88). Los procedimientos para producir protemas elastasas se ejemplifican en las realizaciones 89-224, 261-276 y 347-373 en la Seccion 8. Los procedimientos para producir formulaciones de elastasa se ejemplifican en las realizaciones 225-260 en la Seccion 8. Los procedimientos de produccion de composiciones farmaceuticas se ejemplifican en las realizaciones 374-385 en la Seccion 8. Las composiciones farmaceuticas que comprenden protemas elastasas se ejemplifican en las realizaciones 277-313 y 386 en la Seccion 8, y las dosificaciones unitarias se ejemplifican en las realizaciones 415-420 en la Seccion 8. Las formulaciones de protemas elastasas se ejemplifican en las realizaciones 324-346 en la Seccion 8. El uso de las protemas elastasas para fines terapeuticos se ejemplifica en las realizaciones 387-414 en la Seccion 8. Los kits que comprenden las protemas se ejemplifican en la Seccion 8 a modo de las realizaciones 421-424.
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Diversos aspectos de la invencion con respecto a composiciones farmaceuticas y/o protemas proelastasas con SEC ID N°: 64 y 69 se ejemplifican como realizaciones 425-472 en la Seccion 8 mas adelante; sin embargo, tales realizaciones son aplicables a otras secuencias de protemas elastasas y composiciones desveladas en el presente documento.
Los procedimientos de produccion descritos en el presente documento frecuentemente incluyen una etapa de activacion, por lo que el peptido de activacion se elimina de la secuencia de proelastasa/se separa de la secuencia de elastasa madura, generando asf una protema elastasa madura. Las etapas de activacion descritas en el presente documento pueden ser etapas de auto-activacion, es decir, llevada a cabo por una actividad de elastasa, o etapa de no auto-activacion, es decir, mediada por no elastasa, por ejemplo, llevada a cabo portripsina.
En ciertos aspectos, la presente invencion proporciona una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una protema elastasa (que incluye, pero no se limita a, una protema de una cualquiera de SEC ID N°: 6-9, 64-69, 88-91 o 98-103) que comprende (i) un propeptido de elastasa que comprende una secuencia de activacion de peptidos que comprende una secuencia de reconocimiento de elastasa operativamente ligada a (ii) la secuencia de aminoacidos de una protema que tiene actividad de elastasa. La protema comprende opcionalmente ademas una secuencia senal, tal como un peptido senal de factor a de levadura, y se ejemplifica por la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 34, operativamente ligada a dicho propeptido de elastasa. El factor a se denomina algunas veces en el presente documento “factor alfa” o “factor de apareamiento alfa” o “factor de apareamiento a”. En ciertas realizaciones espedficas, la protema comprende un propeptido de no elastasa tal como el propeptido de factor a de levadura. En ciertas realizaciones espedficas, la protema puede comprender una o mas secuencias de espaciador. Las secuencias de espaciador pueden incluir, pero no se limitan a, sitios de escision de proteasa Kex2 y STE13. En una realizacion espedfica puede usarse un espaciador de Kex2. En otra realizacion, un espaciador de Kex2 puede ligarse operativamente a espaciadores de STE 13 como se muestra en la Figura 1B. Una secuencia de peptidos senal y una secuencia de propeptidos de no elastasa se ejemplifica por las secuencias de aminoacidos de SEC ID N°: 51 o 97. Un peptido que contiene una secuencia de peptidos senal, una secuencia de propeptidos de no elastasa y una secuencia de espaciador se ejemplifica por las secuencias de aminoacidos de SEC ID N°: 50 o 96.
En otras realizaciones espedficas, la secuencia senal es un secuencia senal de la secrecion de marnffero, tal como una secuencia senal de elastasa tipo I porcina o humana (usada indistintamente con una elastasa pancreatica tipo I).
Preferentemente, la secuencia de reconocimiento de elastasa es una secuencia de reconocimiento de elastasa pancreatica tipo I.
En realizaciones espedficas, la protema que tiene actividad de elastasa tipo I es una elastasa tipo I humana madura, por ejemplo, una protema de la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 1, 4, 5, 84 u 87.
La presente invencion tambien proporciona una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una protema que comprende (i) una secuencia senal operable en Pichia pastoris operativamente ligada a (ii) una secuencia de activacion (que incluye, pero no se limita a, una secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 23, 72, 73 u 80) que comprende una secuencia de reconocimiento de proteasa (que incluye, pero no se limita a, una secuencia de aminoacidos de cualquiera de SEC ID N°: 11-23 y 93 que a su vez esta operativamente ligada a (iii) la secuencia de aminoacidos de una elastasa tipo I humana madura. En una realizacion preferida, la secuencia de reconocimiento de proteasa es una secuencia de reconocimiento de elastasa tipo I humana, lo mas preferentemente una secuencia de reconocimiento de elastasa de SEC ID N°: 20.
Tambien se proporcionan protemas proelastasas (que comprenden opcionalmente una secuencia senal y que asf representan protemas preproelastasas) y protemas elastasas maduras codificadas por los acidos nucleicos de la invencion, ya que son composiciones (por ejemplo, composiciones farmaceuticas, formulaciones y dosificaciones unitarias) que comprende dichas protemas elastasas maduras.
En una realizacion preferida, la protema proelastasa o protema elastasa madura no tiene un residuo de metionina del extremo N. En otra realizacion, sin embargo, la protema proelastasa o protema elastasa madura tiene un residuo de metionina del extremo N.
La siguiente Tabla 1 resume los identificadores de secuencia usados en la presente memoria descriptiva. Protemas preferidas de la invencion comprenden o consisten en cualquiera de SEC ID N°: 1-32, 34, 37-73, 77, 78, 82-92 y 98105 enumeradas en la siguiente Tabla 1, o estan codificadas en parte o completamente por las secuencias de nucleotidos de SEC ID N°: 33 y SEC ID N°: 81.
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MOLECULA
NUCLEOTIDO OR AMINOACIDO
Elastasa I humana madura, incluyendo primera "valina," con posible polimorfismo en la posicion 220 (V o L) (la numeracion se refiere a la posicion en el contexto de la preprotelna)
Aminoacido
Elastasa I humana madura, menos primera "valina," with possible polymorphism at position 220 (V or L) (numbering refers to position in context of preproprotein)
Aminoacido
Elastasa I humana madura, menos primeras dos "valinas," con posible polimorfismo en la posicion 220 (V o L) (la numeracion se refiere a la posicion en el contexto de la preprotelna)
Aminoacido
Elastasa I humana madura, con la primera "valina" sustituida por "alanina," con posible polimorfismo en la posicion 220 (V o L) (la numeracion se refiere a la posicion en el contexto de la preprotelna)
Aminoacido
Elastasa I humana madura (isotipo 2), incluyendo primera "valina"
Aminoacido
Proproteina de elastasa manipulada no. 1 (variante pPROT42), con posible polimorfismo en la posicion 220 (V o L) (la numeracion se refiere a la posicion en el contexto de la preprotelna)
Aminoacido
Proproteina de elastasa manipulada no. 2, con posible polimorfismo en la posicion 220 (V o L) (la numeracion se refiere a la posicion en el contexto de la preprotelna)
Aminoacido
Proproteina de elastasa manipulada no. 3, con posible polimorfismo en la posicion 220 (V o L) (la numeracion se refiere a la posicion en el contexto de la preprotelna)
Aminoacido
Proproteina de elastasa manipulada no. 4, con posible polimorfismo en la posicion 220 (V o L) (la numeracion se refiere a la posicion en el contexto de la preprotelna)
Aminoacido
Proproteina de elastasa manipulada no.5 (secuencia tripsina activada pPROT24), con posible polimorfismo en la posicion 220 (V o L) (la numeracion se refiere a la posicion en el contexto de la ______________________preprotelna)______________________
Aminoacido
Secuencia de reconocimiento de elastasa de consenso 1 (Posiciones Xaa1=P3, Xaa2=P2, Xaa3=P1)
Aminoacido
Secuencia de reconocimiento de elastasa de consenso 2 (Posiciones P3-P2-P1)
Aminoacido
Secuencia de reconocimiento de elastasa de consenso 3 (Posiciones P3-P2-P1)
Aminoacido
Secuencia de reconocimiento de elastasa 1 (Posiciones P3-P2-P1)
Aminoacido
Secuencia de reconocimiento de elastasa 2 (Posiciones P3-P2-P1)
Aminoacido
Secuencia de reconocimiento de elastasa 3 (Posiciones P3-P2-P1)
Aminoacido
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Secuencia de reconocimiento de la tripsina del tipo salvaje (pPROT24) (Posiciones P3-P2-P1)
Secuencia de reconocimiento de elastasa 5 (Posiciones P3-P2-
________________________P1________________________
Secuencia de reconocimiento de elastasa 6 (Posiciones P3-P2-
________________________P1________________________
Secuencia de reconocimiento de elastasa 7 (Posiciones P3-P2- P1 de Variantes 48 y 55)
Secuencia de reconocimiento de elastasa 8
Secuencia de activacion de elastasa humana 1
Secuencia de activacion de elastasa humana 2
Sitio de escision pro-PROT-201
Sitio de escision pPROT40
Sitio de escision pPROT41
Sitio de escision pPROT42
Sitio de escision pPROT43
Sitio de escision pPROT44
Sitio de escision pPROT45
Sitio de escision pPROT46
Sitio de escision pPROT47
Region codificante de una elastasa-1 humana (es decir, elastasa pancreatica tipo I humana) (N° de Entrada NCBI NM 001971)
Peptido serial del factor alfa de levadura
Cebador 20F
Cebador 24R
Variante de Elastasa del Sitio de Escision pPROT42 P3, con posible polimorfismo en la posicion 220 (V o L) (la numeracion se refiere a la posicion en el contexto de la preprotelna)
Variante de Elastasa del Sitio de Escision pPROT42 P2, con posible polimorfismo en la posicion 220 (V o L) (la numeracion se refiere a la posicion en el contexto de la preprotelna)
Elastasa I pancreatica porcina madura I (de GenBank Entrada P00772.1)
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Nucleotido
Aminoacido
Nucleotido
Nucleotido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Dominio de Escision del Propeptido de la Variante de Elastasa 40
Aminoacido
Dominio de Escision del Propeptido de la Variante de Elastasa 41
Aminoacido
Dominio de Escision del Propeptido de la Variante de Elastasa 42
Aminoacido
Dominio de Escision del Propeptido de la Variante de Elastasa 43
Aminoacido
Dominio de Escision del Propeptido de la Variante de Elastasa 44
Aminoacido
5
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30
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65
Dominio de Escision del Propeptido de la Variante de Elastasa
________________________45________________________
Dominio de Escision del Propeptido de la Variante de Elastasa
________________________46________________________
Dominio de Escision del Propeptido de la Variante de Elastasa
________________________47________________________
Dominio de Escision del Propeptido de la Variante de Elastasa
________________________48________________________
Dominio de Escision del Propeptido de la Variante de Elastasa ________________________49________________________
Peptido serial, propeptido, y secuencia espaciadora 1 del factor de acoplamiento alfa de levadura
Peptido senal y secuencia del propeptido 2 del factor de acoplamiento alfa de levadura
Dominio de Escision del Propeptido de la Variante de Elastasa
_________________________52_________________________
Dominio de Escision del Propeptido de la Variante de Elastasa
_________________________53_________________________
Dominio de Escision del Propeptido de la Variante de Elastasa
_________________________54_________________________
Dominio de Escision del Propeptido de la Variante de Elastasa
_________________________55_________________________
Dominio de Escision del Propeptido de la Variante de Elastasa
_________________________56_________________________
Dominio de Escision del Propeptido de la Variante de Elastasa
_________________________57_________________________
Dominio de Escision del Propeptido de la Variante de Elastasa
_________________________58_________________________
Dominio de Escision del Propeptido de la Variante de Elastasa
_________________________59_________________________
Dominio de Escision del Propeptido de la Variante de Elastasa
_________________________60_________________________
Dominio de Escision del Propeptido de la Variante de Elastasa
_________________________61_________________________
Dominio de Escision del Propeptido de la Variante de Elastasa
_________________________62_________________________
Dominio de Escision del Propeptido de la Variante de Elastasa _________________________63_________________________
Proenzima de Elastasa con Dominio de Escision variante 48, con posible polimorfismo en la posicion 220 (V o L) (la numeracion se refiere a la posicion en el contexto de la preprotelna)
Proenzima de Elastasa con Dominio de Escision variante 49, con posible polimorfismo en la posicion 220 (V o L) (la numeracion se refiere a la posicion en el contexto de la preprotelna)
Proenzima de Elastasa con Dominio de Escision variante 52, con posible polimorfismo en la posicion 220 (V o L) (la numeracion se refiere a la posicion en el contexto de la preprotelna)
Proenzima de Elastasa con Dominio de Escision variante 53, con posible polimorfismo en la posicion 220 (V o L) (la numeracion se refiere a la posicion en el contexto de la preprotelna)
Proenzima de Elastasa con Dominio de Escision variante 54, con posible polimorfismo en la posicion 220 (V o L) (la numeracion se refiere a la posicion en el contexto de la preprotelna)
Proenzima de Elastasa con Dominio de Escision variante 55, con posible polimorfismo en la posicion 220 (V o L) (la numeracion se refiere a la posicion en el contexto de la preprotelna)
Elastasa del Tipo Salvaje + Variante de Escicion AlaArg, con posible polimorfismo en la posicion 220 (V o L) (la numeracion se refiere a la posicion en el contexto de la preprotelna)
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
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Elastasa del Tipo Salvaje Elastase + Variante de Escision Arg, con posible polimorfismo en la posicion 220 (V o L) (la numeracion se refiere a la posicion en el contexto de la ____________________preproteina)__________________
Peptido de Activacion de la Elastasa Humana Variante 48
Aminoacido
Peptido de Activacion de la Elastasa Humana Variante 55
Aminoacido
Secuencia de Consenso del Dominio de Escision de la Elastasa Humana; se corresponde a los residuos P5, P4, P3, P2, P1, P'1, P'2, y P'3 de un dominio de escision de la elastasa
Cebador de Mutagenesis por PCR para la construccion del ______________________pPROT3______________________
Aminoacido
Acido Nucleico
Cebador de Mutagenesis por PCR o construccion del pPROT3
Variante C-terminal de ELA1 Madura de Talas y otros, 2000, Invest Dermatol. 114(1):165-70.
Variantes de ELA-1 Maduras, con posibles polimorfismos en las posiciones 44 (W o R); 59 (M o V); 220 (V o L); y 243 (Q o R) (la numeracion se refiere a la posicion en el contexto de la preproteina)
Variantes del peptido de activacion (tipo salvaje, escindible por tripsina), con posibles polimorfismos en la posicion 10 (Q o H) (la numeracion se refiere a la posicion en el contexto de la preproteina)
Secuencia de “consenso” del peptido de activacion
Region codificante de ELA-1.2A
Producto de la Traduccion de ELA-1.2A (Secuencia pPROT24 activada por tripsina)
Producto de la Traduccion de ELA-1.2A (Secuencia pPROT24 activada por tripsina), con posibles polimorfismos en las posisiones 44 (W o R); 59 (M o V); 220 (V o L); y 243 (Q o R) (la numeracion se refiere a la posicion en el contexto de la preproteina)
Acido Nucleico
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Elastasa I humana madura, incluyendo primera "valina," con posibles polimorfismos en las posiciones 44 (W o R); 59 (M o V); 220 (V o L); y 243 (Q o R) (la numeracion se refiere a la posicion en el contexto de la preproteina)
Elastasa I humana madura, menos priemra "valina," con posibles polimorfismos en las posisiones 44 (W o R); 59 (M o V); 220 (V o L); y 243 (Q o R) (la numeracion se refiere a la posicion en el
_______________contexto de la preproteina)________________
Elastasa I humana madura, menos las dos primeras "valinas," con posibles polimorfismos en las posiciones 44 (W o R); 59 (M o V); 220 (V o L); y 243 (Q o R) (la numeracion se refiere a la
__________posicion en el contexto de la preproteina)__________
Elastasa I humana madura, con la primera "valina" sustituida por "alanina," con posibles polimorfismos en las posiciones 44 (W o R); 59 (M o V); 220 (V o L); y 243 (Q o R) la numeracion se refiere
________a la posicion en el contexto de la preproteina)________
Proproteina no. 1 de elastasa manipulada (variante pPROT42), con posibles polimorfismos en las posiciones 10 (Q o H); 44 (W o R); 59 (M o V); 220 (V o L); y 243 (Q o R) (la numeracion se
_____refiere a la posicion en el contexto de la preproteina)_____
Proproteina no.2 de elastasa manipulada, con posibles polimorfismos en las posiciones 10 (Q o H); 44 (W o R); 59 (M o V); 220 (V o L); y 243 (Q o R) (la numeracion se refiere a la __________posicion en el contexto de la preproteina)__________
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
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Proprotelna no.3 de elastasa manipulada, con posibles polimorfismos en las posiciones 10 (Q o H); 44 (W o R); 59 (M o V); 220 (V o L); y 243 (Q o R) (la numeracion se refiere a la posicion en el contexto de la preprotelna)
Proprotelna no.4 de elastasa manipulada, con posibles polimorfismos en las posiciones 10 (Q o H); 44 (W o R); 59 (M o V); 220 (V o L); y 243 (Q o R) (la numeracion se refiere a la posicion en el contexto de la preprotelna)
Proprotelna no.5 de elastasa manipulada ( secuencia activada por tripsina pPROT24), con posibles polimorfismos en las posiciones 10 (Q o H); 44 (W o R); 59 (M o V); 220 (V o L); y 243 (Q o R) (la numeracion se refiere a la posicion en el contexto de la preprotelna)
Secuencia de reconocimiento de la elastasa de consenso 4 (Posiciones P3-P2-P1)
Elastasa Variante del Sitio de Escision pPROT42 P3, con posibles polimorfismos en las posiciones 44 (W o R); 59 (M o V); 220 (V o L); y 243 (Q o R) (la numeracion se refiere a la posicion en el contexto de la preprotelna)
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
con posibles polimorfismos en las posiciones 44 (W o R); 59 (M o V); 220 (V o L); y 243 (Q o R) (la numeracion se refiere a la posicion en el contexto de la preprotelna)
Aminoacido
Peptido serial, propeptido, y secuencia espaciadora 1 del factor de acoplamiento alfa de levadura secuencia
Peptido serial y secuencia del propeptido 2 del factor de
______________acoplamiento alfa de levadura______________
Proenzima de Elastasa con Dominio de Escision variante 48 Generico para la SEQ ID NO:64, con posibles polimorfismos en las posisiones 10 (Q o H); 44 (W o R); 59 (M o V); 220 (V o L); y 243 (Q o R) (la numeracion se refiere a la posicion en el contexto de la preprotelna)
Proenzima de Elastasa con Dominio de Escision variante 49, con posibles polimorfismos en las posiciones 10 (Q o H); 44 (W o R); 59 (M o V); 220 (V o L); y 243 (Q o R) (la numeracion se refiere a la posicion en el contexto de la preprotelna)
Proenzima de Elastasa con Dominio de Escision variante 52, con posibles polimorfismos en las posiciones 10 (Q o H); 44 (W o R); 59 (M o V); 220 (V o L); y 243 (Q o R) (la numeracion se refiere a la posicion en el contexto de la preprotelna)
Proenzima de Elastasa con Dominio de Escision variante 53, con posibles polimorfismos en las posiciones 10 (Q o H); 44 (W o R); 59 (M o V); 220 (V o L); y 243 (Q o R) (la numeracion se refiere a la posicion en el contexto de la preprotelna)
Proenzima de Elastasa con Dominio de Escision variante 54, con posibles polimorfismos en las posiciones 10 (Q o H); 44 (W o R); 59 (M o V); 220 (V o L); y 243 (Q o R) (la numeracion se refiere a la posicion en el contexto de la preprotelna)
Proenzima de Elastasa con Dominio de Escision variante 55, con posibles polimorfismos en las posiciones 10 (Q o H); 44 (W o R); 59 (M o V); 220 (V o L); y 243 (Q o R) (la numeracion se refiere a la posicion en el contexto de la preprotelna)
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
Aminoacido
5
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Elastasa del Tipo Salvaje + Variante de escision AlaArg, con posibles polimorfismos en las posiciones 44 (W o R); 59 (M o V); 220 (V o L); y 243 (Q o R) (la numeracion se refiere a la posicion en el contexto de la preprotelna)
Aminoacido 104
Elastasa del Tipo Salvaje + Variante de Escision Arg, con posibles polimorfismos en las posiciones 10 (Q o H); 44 (W o R); 59 (M o V); 220 (V o L); y 243 (Q o R) (la numeracion se refiere a la posicion en el contexto de la preprotelna)
Aminoacido 105
Variante de escision de la elastasa I humana madura que carece de los primeros cuatro Aminoacidos, con posibles polimorfismos en las posiciones 10 (Q o H); 44 (W o R); 59 (M o V); 220 (V o L); y 243 (Q o R) (la numeracion se refiere a la posicion en el contexto de la preprotelna)
Aminoacido 106
Variante de escision de la elastasa I humana madura que carece de los primeros seis Aminoacidos, con posibles polimorfismos en las posiciones 44 (W o R); 59 (M o V); 220 (V o L); y 243 (Q o R) (la numeracion se refiere a la posicion en el contexto de la preprotelna)
Aminoacido 107
Variante de escision de la elastasa I humana madura que carece de los primeros nueve Aminoacidos, con posibles polimorfismos en las posiciones 44 (W o R); 59 (M o V); 220 (V o L); y 243 (Q o R) (la numeracion se refiere a la posicion en el contexto de la preprotelna)
Aminoacido 108
Secuencia de Acidos Nucleicos de la Figura 1A
Acido Nucleico 109
Secuencia de Aminoacidos de la Figura 1A
Aminoacido 110
Secuencia de Acidos Nucleicos de la Figura 1B
Acido Nucleico 111
Secuencia de Aminoacidos de la Figura 1B
Aminoacido 112
Secuencia de Acidos Nucleicos de la Figura 13
Acido Nucleico 113
Secuencia de Aminoacidos de la Figura 14
Aminoacido 114
Secuencia del dominio de escision de la pPROT101-24-V activada por tripsina
Aminoacido 115
Secuencia del dominio de escision de la pPROT101-42-V auto- activada
Aminoacido 116
Secuencia del dominio de escision de la pPROT101-49-V auto- activada
Aminoacido 117
Secuencia del dominio de escision de la pPROT101-55L-V autoactivada
Aminoacido 118
Hay al menos 5 polimorfismos confirmados en protema elastasa tipo I humana, en las posiciones 10 (Q o H); 44 (W o R); 59 (M o V); 220 (V o L); y 243 (Q o R). La protema de longitud completa (preproelastasa) tiene 258 aminoacidos de longitud. Los 8 primeros aminoacidos se corresponden con la secuencia senal o de “pre” peptidos que se escinde para generar una proprotema inactiva, y otra secuencia de “pro” peptidos (que comprende o que consiste en 10 aminoacidos correspondientes a un peptido de activacion) se escinden para generar la protema madura activa. Asf, el polimorfismo en la posicion 10 esta presente en la proprotema, pero no en la protema madura.
Por consiguiente, en la Tabla 2 a continuacion se presentan todas las posibles combinaciones de los 5 polimorfismos de elastasa tipo 1 humana. La presente invencion proporciona protemas preproelastasas y proelastasas (que incluyen, pero no se limitan a, las protemas preproelastasas y proelastasas de variante descritas en el presente documento), tales como las protemas ejemplificadas en las realizaciones 1-39 y 68-69 o las protemas obtenidas u obtenibles mediante el procedimiento de una cualquiera de realizaciones 89-224, 261-276 y 347- 373 en la Seccion 8, que comprende cualquiera de las combinaciones de polimorfismos expuestas en la siguiente Tabla 2.
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Tabla 2: Variantes de protemas elastasas (pre-pro) y proelastasas inmaduras tipo I humanas. La numeracion de posiciones se refiere a la posicion en el contexto de la preproprotema de elastasa tipo I humana nativa.
Posicion
10 44 59 220 243
Realization
Q o H W o R M o V V o L Q o R
1.
Q W M V Q
2.
Q W M V R
3.
Q W M L Q
4.
Q W V V Q
5.
Q R M V Q
6.
Q W M L R
7.
Q W V L Q
8.
Q R V V Q
9.
Q W V V R
10.
Q R M L Q
11.
Q R M V R
12.
Q R V L Q
13.
Q R V V R
14.
Q R M L R
15.
Q W V L R
16.
Q R V L R
17.
H W M V Q
18.
H W M V R
19.
H W M L Q
20.
H W V V Q
21.
H R M V Q
22.
H W M L R
23.
H W V L Q
24.
H R V V Q
25.
H W V V R
26.
H R M L Q
27.
H R M V R
28.
H R V L Q
29.
H R V V R
30.
H R M L R
31.
H W V L R
32.
H R V L R
Ademas, en la Tabla 3 a continuacion se presentan todas las posibles combinaciones de los 4 polimorfismos de elastasa tipo I humana que pueden estar presentes en una protema elastasa madura. La presente invencion proporciona protemas elastasas maduras (que incluyen, pero no se limitan a, las protemas elastasas maduras de variante descritas en el presente documento), tales como las protemas elastasas maduras obtenidas u obtenibles mediante el procedimiento de una cualquiera de las realizaciones 89-224, 261-276 y 347-373 en la Seccion 8, que
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comprende cualquiera de las combinaciones de polimorfismos expuestas en la Tabla 3 a continuacion.
Tabla 3: Variantes de protemas elastasas tipo I humanas madura. La numeracion de posiciones se refiere a la posicion en el contexto de la preproprotema de elastasa tipo I humana nativa.
Posicion
44 59 220 243
Realization
W o R M o V V o L Q o R
1.
W M V Q
2.
W M V R
3.
W M L Q
4.
W V V Q
5.
R M V Q
6.
W M L R
7.
W V L Q
8.
R V V Q
9.
W V V R
10.
R M L Q
11.
R M V R
12.
R V L Q
13.
R V V R
14.
R M L R
15.
W V L R
16.
R V L R
Las elastasas tipo I maduras de la invencion pueden purificarse, por ejemplo, para su uso en composiciones farmaceuticas. En las realizaciones espedficas, las elastasas son al menos el 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% puras.
Las elastasas tipo I maduras de la invencion tienen preferentemente una actividad espedfica superior a 1, superior a 5, superior a 10, superior a 20, superior a 25, o superior a 30 U/mg de protema, como se ha determinado midiendo la tasa de hidrolisis del sustrato de peptidos pequenos N-succinil-Ala-Ala-Ala-p-Nitroanilida (SLAP), que se cataliza mediante la adicion de elastasa. Una unidad de actividad se define como la cantidad de elastasa que cataliza la hidrolisis de 1 micromol de sustrato por minuto a 30 °C y la actividad espedfica se define como la actividad por mg de protema elastasa (U/mg). Preferentemente, una elastasa tipo I humana madura tiene una actividad espedfica dentro de un intervalo en el que el lfmite inferior es 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15 o 20 U/mg de protema y en el que el lfmite superior es, independientemente, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 o 50 U/mg de protema. En realizaciones a modo de ejemplo, la actividad espedfica esta en el intervalo de 1 a 40 U/mg de protema, de 1 a 5 U/mg de protema, de 2 a 10 U/mg de protema, de 4 a 15 U/mg de protema, de 5 a 30 U/mg de protema, de 10 a 20 U/mg de protema, de 20 a 40 U/mg de protema, o cualquier intervalo cuyos lfmites superior e inferior esten seleccionados de cualquiera de los valores anteriores. Una elastasa tipo I porcina madura tiene preferentemente una actividad espedfica dentro de un intervalo en el que el lfmite inferior es 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60 o 75 U/mg de protema y en el que el lfmite superior es, independientemente, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 75, 90, 95 o 100 U/mg de protema. En realizaciones a modo de ejemplo, la actividad espedfica de la elastasa porcina esta en el intervalo de 10 a 50 U/mg de protema, de 20 a 60 U/mg de protema, de 30 a 75 U/mg de protema, de 30 a 40 U/mg de protema, de 20 a 35 U/mg de protema, de 50 a 95 U/mg de protema, de 25 a 100 U/mg de protema, o cualquier intervalo cuyos lfmites superior e inferior esten seleccionados de cualquiera de los valores anteriores.
Por consiguiente, ciertos aspectos de la presente invencion se refieren a composiciones, tales como composiciones farmaceuticas, formulaciones de elastasa y dosificaciones unitarias, tales como aquellas ejemplificadas en las realizaciones 277-314, 346, 386 y 415-420, o aquellas obtenidas u obtenibles mediante el procedimiento de una cualquiera de las realizaciones 261-276 y 374-385 en la Seccion 8 mas adelante.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invencion comprenden protemas elastasas activadas por tripsina, por ejemplo, protemas activadas por tripsina preparadas por cualquiera de los procedimientos desvelados en el
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presente documento. En otras realizaciones, las composiciones comprenden protemas elastasas autoactivadas, por ejemplo, protemas elastasas autoactivadas preparadas por cualquiera de los procedimientos desvelados en el presente documento. En ciertos aspectos, una composicion de la invencion se caracteriza por al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis o al menos siete de las siguientes propiedades: (a) la composicion esta libre de tripsina; (b) la composicion esta sustancialmente libre de tripsina; (c) la composicion esta libre de cualquier protema que consista en SEC ID N°: 70 y 71; (d) la composicion esta sustancialmente libre de cualquier protema que consista en SEC ID N°: 2 y 3; (e) la composicion esta libre de protemas bacterianas; (f) la composicion esta sustancialmente libre de protemas bacterianas; (g) la composicion esta libre de protemas de mairnfero distintas de dicha protema elastasa madura; (h) la composicion esta sustancialmente libre de protemas de mai^ero distintas de dicha protema elastasa madura; (i) la composicion esta libre o sustancialmente libre de una, dos, tres o las cuatro protemas que consisten en SEC ID N°: 85, 86, 94 y 95; (j) la composicion esta libre o sustancialmente libre de una, dos o las tres protemas que consisten en SEC ID N°: 106, 107 y 108; (k) la composicion contiene niveles farmaceuticamente aceptables de endotoxinas (por ejemplo, 10 UE/mg de elastasa o menos, o 5 UE/mg de elastasa o menos); (1) la protema elastasa madura en la composicion se caracteriza por una actividad espedfica de 1 a 40 U/mg de protema o cualquier otro intervalo de actividad espedfica desvelado en el presente documento; (m) la actividad de tripsina en dicha composicion se corresponde con menos de 4 ng por 1 mg de protema elastasa madura o cualquier otro intervalo de actividad de tripsina desvelado en el presente documento; (n) la composicion comprende polisorbato-80; (o) la composicion comprende dextrano; (p) la composicion comprende iones sodio, iones potasio, iones fosfato, iones cloruro y polisorbato-80; (q) la composicion comprende iones sodio, iones potasio, iones fosfato, iones cloruro y dextrano; (r) la composicion comprende iones sodio, iones potasio, iones fosfato, iones cloruro, polisorbato-80 y dextrano; (s) la protema elastasa madura en dicha composicion muestra una cantidad de estabilidad desvelada en el presente documento, por ejemplo, mantiene del 60% al 100% su actividad espedfica despues de al menos una semana de almacenamiento a 4 °C, despues de al menos un mes de almacenamiento a 4 °C, despues de al menos dos meses de almacenamiento a 4 °C, despues de al menos tres meses de almacenamiento a 4 °C, o despues de al menos seis meses de almacenamiento a 4 °C; y (t) la composicion comprende una dosificacion unitaria de 0,0033 mg a 200 mg de dicha protema elastasa madura, o cualquier otra dosificacion unitaria de protema elastasa madura desvelada en el presente documento.
En ciertos aspectos, la composicion se caracteriza por al menos tres caractensticas, al menos cuatro caractensticas
0 cinco caractensticas independientemente seleccionadas de los siguientes grupos (i) a (v):
(i) (a), (b) o (m)
(ii) (e) o (f)
(iii) (g) o (h)
(iv) (k)
(v) (1)
En realizaciones espedficas, dos de dichas al menos tres o al menos dichas cuatro caractensticas estan seleccionadas de los grupos (i) y (iv) o (v). En otras realizaciones, tres de al menos dichas cuatro caractensticas estan seleccionadas de los grupos (i), (iv) y (v).
En realizaciones espedficas, la presente invencion proporciona una composicion, que incluye pero no se limita a, una composicion farmaceutica, formulacion de elastasa o dosificacion unitaria, que comprende (i) una cantidad terapeuticamente eficaz de elastasa tipo I humana que esta libre de tripsina y (ii) un vehmulo farmaceuticamente aceptable. Alternativamente, la presente invencion proporciona una composicion que comprende (i) una cantidad terapeuticamente eficaz de elastasa tipo I humana que esta sustancialmente libre de tripsina y (ii) un vehmulo farmaceuticamente aceptable. En las realizaciones espedficas, la elastasa tipo I humana y/o la composicion comprende menos de 5 ng/ml de actividad de tripsina, menos de 4 ng/ml de actividad de tripsina, menos de 3 ng/ml de actividad de tripsina, menos de 2 ng/ml de actividad de tripsina, o menos de 1,56 ng/ml de actividad de tripsina. En los ejemplos anteriores, los ng/ml de actividad de tripsina pueden ensayarse en una composicion de elastasa tipo
1 humana lfquida o preparacion que contiene 1 mg/ml de protema elastasa tipo I humana. Asf, las actividades de tripsina tambien pueden describirse en terminos de miligramos de protema elastasa, por ejemplo, menos de 3 ng de actividad de tripsina/mg de protema elastasa, menos de 1,56 ng de actividad de tripsina/mg de protema elastasa, etc. La presente invencion proporciona ademas una composicion que comprende (i) una cantidad terapeuticamente eficaz de elastasa tipo I humana y (ii) un vehmulo farmaceuticamente aceptable, en el que la composicion comprende menos de 5 ng de actividad de tripsina por mg de elastasa, menos de 4 ng de actividad de tripsina por mg de elastasa, menos de 3 ng de actividad de tripsina por mg de elastasa, menos de 2 ng de actividad de tripsina por mg de elastasa, o menos de 1,56 ng de actividad de tripsina por mg de elastasa.
La presente invencion proporciona ademas procedimientos de mejora de la calidad de protemas elastasas maduras producidas por procedimientos de activacion de tripsina (por ejemplo, los procedimientos de la realizacion 145 en la Seccion 8 mas adelante), que comprenden purificar la protema elastasa madura sobre una columna de resina Macro-Prep High S. Se encontro por los presentes inventores que las protemas elastasas maduras purificadas sobre una columna de resina Macro-Prep High S dan composiciones de elastasa con niveles de actividad de tripsina correspondientes a 20-25 ng de actividad de tripsina/mg de protema elastasa, con respecto a la purificacion sobre una columna Poros (poli(estireno-divinilbenceno)) que da composiciones de elastasa con niveles de actividad de
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tripsina correspondientes a aproximadamente 1000 ng de actividad de tripsina/mg de protema elastasa. La presente invencion proporciona ademas composiciones de elastasa que comprenden protemas elastasas maduras producidas purificando protemas elastasas activadas por tripsina sobre una columna de resina Macro-Prep High S. La columna de resina Macro-Prep High S esta disponible de Biorad (Hercules, CA), segun el cual una columna de metacrilato ngida soporta con poco encogimiento e hinchamiento. Pueden usarse otras columnas de intercambio cationico similares de la misma clase y/o con el mismo tamano de perla (aproximadamente 50 pm), tal como pueden usarse adecuadamente otras columnas de metacrilato.
Otros aspectos de la presente invencion se refieren a composiciones que incluyen, pero no se limitan a, composiciones farmaceuticas, formulaciones de elastasa o dosificaciones unitarias, que comprenden elastasa pancreatica tipo I porcina. En las realizaciones espedficas, la presente invencion proporciona una composicion que comprende (i) una cantidad terapeuticamente eficaz de elastasa pancreatica tipo I porcina que esta libre de tripsina y
(ii) un vehmulo farmaceuticamente aceptable. Alternativamente, la presente invencion proporciona una composicion que comprende (i) una cantidad terapeuticamente eficaz de elastasa pancreatica tipo I porcina que esta sustancialmente libre de tripsina y (ii) un vehmulo farmaceuticamente aceptable. En las realizaciones espedficas, la elastasa pancreatica tipo I porcina y/o la composicion comprende menos de 100 ng/ml de actividad de tripsina, menos de 75 ng/ml de actividad de tripsina, menos de 50 ng/ml de actividad de tripsina, menos de 25 ng/ml de actividad de tripsina, menos de 15 ng/ml de actividad de tripsina, menos de 10 ng/ml de actividad de tripsina, menos de 5 ng/ml de actividad de tripsina, menos de 4 ng/ml de actividad de tripsina, menos de 3 ng/ml de actividad de tripsina, menos de 2 ng/ml de actividad de tripsina, o menos de 1,56 ng/ml de actividad de tripsina. En los ejemplos anteriores, los ng/ml de actividad de tripsina pueden ensayarse en una composicion de elastasa pancreatica tipo I porcina lfquida o preparacion que contiene 1 mg/ml de elastasa pancreatica tipo I porcina. Asf, las actividades de tripsina tambien pueden describirse en terminos de miligramos de protema elastasa, por ejemplo, menos de 25 ng de actividad de tripsina/mg de protema elastasa, menos de 5 ng de actividad de tripsina/mg de protema elastasa, etc. La presente invencion proporciona ademas una composicion que comprende (i) una cantidad terapeuticamente eficaz de elastasa tipo I porcina y (ii) un vehmulo farmaceuticamente aceptable, en la que la composicion comprende menos de 100 ng de actividad de tripsina por mg de elastasa, menos de 75 ng de actividad de tripsina por mg de elastasa, menos de 50 ng de actividad de tripsina por mg de elastasa, menos de 25 ng de actividad de tripsina por mg de elastasa, menos de 15 ng de actividad de tripsina por mg de elastasa, menos de 10 ng de actividad de tripsina por mg de elastasa, menos de 5 ng de actividad de tripsina por mg de elastasa, menos de 4 ng de actividad de tripsina por mg de elastasa, menos de 3 ng de actividad de tripsina por mg de elastasa, menos de 2 ng de actividad de tripsina por mg de elastasa, o menos de 1,56 ng de actividad de tripsina por mg de elastasa.
En otras realizaciones, la presente invencion proporciona composiciones de protemas elastasas, tales como protemas elastasas maduras que incluyen, pero no se limitan a, composiciones farmaceuticas, formulaciones de elastasa o dosificaciones unitarias, que estan libres de variantes del extremo N correspondientes a una, dos, tres o las cuatro de SEC ID N°: 70, 71, 104, 105. En ciertas realizaciones, la presente invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende (i) una cantidad terapeuticamente eficaz de elastasa tipo I humana madura (ii) un vehmulo farmaceuticamente aceptable, composicion farmaceutica que esta libre de cualquier protema con SEC ID N°: 70, 71, 104, 105.
En otras realizaciones, la presente invencion proporciona una composicion que incluye, pero no se limita a, una composicion farmaceutica, una formulacion de elastasa o dosificacion unitaria, que comprende (i) una cantidad terapeuticamente eficaz de elastasa tipo I humana que esta libre o sustancialmente libre de protemas de variante que contienen aminoacidos adicionales espedficos sobre el extremo N de la protema elastasa madura (SEC ID N°: 37, 38, 70, 71, 94, 95, 104, 105) y (ii) un vehmulo farmaceuticamente aceptable. En otras realizaciones, la presente invencion proporciona una composicion que comprende (i) una cantidad terapeuticamente eficaz de elastasa tipo I humana que esta libre o sustancialmente libre de protemas de variante que carecen de aminoacidos del extremo N de la protema elastasa madura (SEC ID N°: 2, 3, 37, 38, 70, 71, 85, 86, 94, 95, 104, 105, 106, 107, 108) y (ii) un vehmulo farmaceuticamente aceptable. En las realizaciones espedficas, la elastasa tipo I humana y/o la composicion comprende menos del 25% de variantes del extremo N, menos del 20% de variantes del extremo N, menos del 15% de variantes del extremo N, menos del 10% de variantes del extremo N, menos del 5% de variantes del extremo N, menos del 4% de variantes del extremo N, menos del 3% de variantes del extremo N, menos del 2% de variantes del extremo N, menos del 1% de variantes del extremo N, menos del 0,5% de variantes del extremo N, 0% de variantes del extremo N, o comprende variantes del extremo N en una cantidad que oscila entre dos cualesquiera de los porcentajes anteriores (por ejemplo, 2%-25% de variantes del extremo N, 0,5%-10% de variantes del extremo N, 5%-15% de variantes del extremo N, 0%-2% de variantes del extremo N, etc.). Como se usa en el presente documento, el termino “menos del X% de variantes del extremo N” se refiere a la cantidad de variantes del extremo N como un porcentaje de protema elastasa total.
En otras realizaciones, la presente invencion proporciona una composicion que incluye, pero no se limita a, una composicion farmaceutica, una formulacion de elastasa o dosificacion unitaria, que comprende (i) una cantidad terapeuticamente eficaz de elastasa tipo I humana madura (ii) un vehmulo farmaceuticamente aceptable, composicion farmaceutica que esta sustancialmente libre de protemas bacterianas y/o esta sustancialmente libre de protemas de mairnfero distintas de dicha elastasa tipo I humana madura. En las realizaciones espedficas, la elastasa tipo I humana y/o la composicion comprende menos del 25% de protemas bacterianas y/o protemas de
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mairnfero distintas de dicha elastasa tipo I humana madura, menos del 20% de protemas bacterianas y/o protemas de mai^ero distintas de dicha elastasa tipo I humana madura, menos del 15% de protemas bacterianas y/o protemas de mai^ero distintas de dicha elastasa tipo I humana madura, menos del 10% de protemas bacterianas y/o protemas de mai^ero distintas de dicha elastasa tipo I humana madura, menos del 5% de protemas bacterianas
y/o protemas de mai^ero distintas de dicha elastasa tipo I humana madura, menos del 4% de protemas bacterianas
y/o protemas de mai^ero distintas de dicha elastasa tipo I humana madura, menos del 3% de protemas bacterianas
y/o protemas de mai^ero distintas de dicha elastasa tipo I humana madura, menos del 2% de protemas bacterianas
y/o protemas de mai^ero distintas de dicha elastasa tipo I humana madura, menos del 1% de protemas bacterianas
y/o protemas de mai^ero distintas de dicha elastasa tipo I humana madura, menos del 0,5% de protemas bacterianas y/o protemas de mai^ero distintas de dicha elastasa tipo I humana madura, 0% de protemas bacterianas y/o protemas de mai^ero distintas de dicha elastasa tipo I humana madura, o comprende protemas bacterianas y/o protemas de mai^ero distintas de dicha elastasa tipo I humana madura en una cantidad que oscila entre dos cualesquiera de los porcentajes anteriores (por ejemplo, 2%-25% de protemas bacterianas y/o protemas de mai^ero distintas de dicha elastasa tipo I humana madura, 0,5%-10% de protemas bacterianas y/o protemas de mai^ero distintas de dicha elastasa tipo I humana madura, 5%-15% de protemas bacterianas y/o protemas de mai^ero distintas de dicha elastasa tipo I humana madura, 0%-2% de protemas bacterianas y/o protemas de mai^ero distintas de dicha elastasa tipo I humana madura, etc.). Como se usa en el presente documento, el termino “menos del X% de protemas bacterianas y/o protemas de mai^ero distintas de dicha elastasa tipo I humana madura” se refiere a la cantidad de tales protemas como un porcentaje de protema total en una preparacion de elastasa o en dicha composicion. En ciertas realizaciones, la elastasa representa al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99%, al menos el 99,5% o al menos el 99,8% de la protema total en tales composiciones o preparaciones.
En el presente documento tambien se desvelan procedimientos para el tratamiento y prevencion de enfermedades de conductos biologicos, que comprenden la administracion de composiciones (por ejemplo, composiciones farmaceuticas, formulaciones de elastasa o dosificaciones unitarias) que comprenden una elastasa tipo I humana madura purificada de la invencion a un paciente en necesidad del mismo.
Adicionalmente se proporcionan vectores que comprenden acidos nucleicos que codifican cualquiera de las protemas elastasas de la invencion (“acidos nucleicos de la invencion”), celulas huesped manipuladas para expresar los acidos nucleicos de la invencion. En las realizaciones espedficas, los vectores comprenden ademas una secuencia de nucleotidos que regula la expresion de la protema elastasa. Por ejemplo, la secuencia de nucleotidos que codifica la protema de la invencion puede estar operativamente ligada a un promotor inducible por metanol. Otros promotores adecuados se ejemplifican en la Seccion 5.3 mas adelante.
En una realizacion espedfica, la presente invencion proporciona un vector que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un marco de lectura abierto, comprendiendo el marco de lectura abierto un peptido senal de factor a de levadura o un peptido senal de elastasa tipo I (por ejemplo, peptido senal de elastasa porcina) operativamente ligado a una secuencia de proprotema elastasa tipo I humana. Opcionalmente, el vector comprende ademas un promotor inducible por metanol operativamente ligado al marco de lectura abierto.
Tambien se proporcionan celulas huesped que comprenden los acidos nucleicos y vectores de la invencion. En ciertas realizaciones, el vector o acido nucleico esta integrado en el genoma de la celula huesped; en otras realizaciones, el vector o acido nucleico es extracromosomico. Una celula huesped preferida es una celula de Pichia pastoris. Otras celulas huesped adecuadas se ejemplifican en la Seccion 5.3 mas adelante.
En una realizacion espedfica, la presente invencion proporciona una celula huesped de Pichia pastoris geneticamente manipulada para codificar un marco de lectura abierto que comprende un peptido senal de factor a de levadura o un peptido senal de elastasa porcina operativamente ligado a una secuencia de proenzima elastasa tipo I humana. Opcionalmente, el marco de lectura abierto esta bajo el control de un promotor inducible por metanol.
La presente invencion proporciona ademas procedimientos para producir una protema elastasa inmadura o madura de la invencion que comprende cultivar una celula huesped manipulada para expresar un acido nucleico de la invencion en condiciones en las que se produce la protema proelastasa. En ciertas realizaciones tambien se produce la protema elastasa madura.
Condiciones de cultivo preferidas para producir la proelastasa y protema maduras de la invencion, particularmente para la celula huesped Pichia pastoris, incluyen un periodo de crecimiento a un pH bajo. Normalmente, el pH bajo es 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, o cualquier intervalo entre cualquier par de los valores anteriores. En las realizaciones espedficas, el pH bajo es un pH que oscila de 2,0 a 6,0, de 2,0 a 5,0, de 3,0 a 6,0, de 3,0 a 5,0, de 4,0 a 6,0, o de 3,0 a 4,0. Al final del periodo de cultivo, el pH del cultivo puede elevarse, preferentemente a un pH de 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 11,0 o un pH que oscila entre dos cualesquiera de los valores anteriores con el fin de separar o eliminar la secuencia de activacion de la protema elastasa madura. En las realizaciones espedficas, el pH del cultivo se eleva a un pH que oscila de 7,5 a 10,0 o 8,0 a 9,0 y lo mas preferentemente a un pH de 8,0.
Si la expresion de una protema proelastasa de la invencion esta bajo el control de un promotor inducible por
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metanol, las condiciones para producir una protema elastasa inmadura o madura de la invencion tambien pueden comprender un periodo de induccion por metanol.
Los procedimientos de produccion de elastasa de la invencion pueden comprender ademas la etapa de recuperar la protema expresada por la celula huesped. En ciertos casos, la protema recuperada es una proelastasa que comprende la secuencia de activacion. En otros casos, la protema recuperada es una elastasa madura que carece de la secuencia de activacion. Bajo ciertas condiciones se recuperan tanto protemas proelastasas como elastasas maduras.
Preferentemente, particularmente cuando se desee evadir la auto-activacion de una proelastasa auto-activada, las condiciones de cultivo para la expresion de proelastasa pueden comprender un periodo de crecimiento e induccion a pH bajo. Normalmente, el pH bajo es 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5 o 6,0, o cualquier intervalo entre cualquier par de los valores anteriores. En las realizaciones espedficas, el pH bajo es un pH que oscila de 2,0 a 3,0, de 4,0 a 5,0, de 5,0 a 6,0, o de 6,0 a 7,0. En las realizaciones particulares, el pH oscila de 4,0 a 6,0 y es lo mas preferentemente un pH de 5,5.
Preferentemente, particularmente cuando se desee evadir la auto-activacion de una proelastasa auto-activada, las condiciones de cultivo para la expresion de proelastasa comprenden un periodo de crecimiento e induccion en citrato de sodio, succinato de sodio o acetato sodico. En las realizaciones espedficas se usa una concentracion de 5-50 mM, 7,5-100 mM, 10-15 mM, 50-200 mM, 75-175 mM, 100-150 mM, 75-125 mM, o de cualquier intervalo cuyos ftmites superior e inferior esten seleccionados de cualquiera de los valores anteriores (por ejemplo, 50-75 mM, 75100 mM, etc.). En una realizacion preferida, la concentracion de citrato de sodio, succinato de sodio o acetato sodico es 90-110 mM y lo mas preferentemente es 100 mM.
Adicionalmente, particularmente cuando se desee evadir la auto-activacion de una proelastasa auto-activada o auto- degradacion por elastasa madura, las condiciones de cultivo para la expresion de una protema elastasa inmadura pueden comprender un periodo de crecimiento e induccion en el extremo inferior del intervalo de temperatura adecuado para la celula huesped en cuestion. Por ejemplo, si la celula huesped es una celula huesped de Pichia pastoris, el intervalo preferido es aproximadamente 22-28 °C. En una realizacion espedfica, la celula huesped de Pichia pastoris se cultiva a 28 °C.
Adicionalmente, particularmente cuando se desee evadir la degradacion de protema por proteasas de celula huesped, las condiciones de cultivo para la expresion de una protema elastasa inmadura pueden comprender un periodo de crecimiento e induccion en el extremo inferior del intervalo de temperatura adecuado para la celula huesped en cuestion. Por ejemplo, si la celula huesped es una celula huesped de Pichia pastoris, el intervalo preferido es aproximadamente 22-28 °C. En una realizacion espedfica, la celula huesped de Pichia pastoris se cultiva a 28 °C.
La activacion de una protema proelastasa auto-activada de la invencion puede iniciarse mediante la adicion de elastasa extrmseca en una pequena cantidad (catalftica). En ciertas realizaciones, una cantidad catalftica de elastasa extrmseca representa menos del 10%, menos del 5%, menos del 2%, menos del 1%, menos del 0,5% o menos del 0,1%, en tanto una base molar como de peso molecular, de la elastasa en la muestra a la que se anade la elastasa catalftica.
Alternativamente o simultaneamente, la proelastasa auto-activada puede someterse a pH 7 - 11 (lo mas preferentemente pH 8), tras lo cual el peptido de activacion de proelastasa auto-activada se elimina sin requerir tripsina y produciendo elastasa activa madura. En las realizaciones espedficas se anade base Tris a una concentracion de 50-200 mM, 75-175 mM, 100-150 mM, 75-125 mM, o cualquier intervalo cuyos ftmites superior e inferior esten seleccionados de cualquiera de los valores anteriores (por ejemplo, 50-75 mM, 75-100 mM, etc.) durante la etapa de activacion. En una realizacion preferida, la base Tris se anade a una concentracion 90-110 mM, lo mas preferentemente 100 mM. El pH de la base Tris es preferentemente 7-11; en las realizaciones espedficas, la base Tris esta a un pH de 7,0-11,0, 7-9, 7,5 a 9,5, 7,5 a 10, 8-10, 8-9, o cualquier intervalo cuyos ftmites superior e inferior esten seleccionados de cualquiera de los valores anteriores. En una realizacion preferida, la base Tris esta a un pH de 7,5-8,5, lo mas preferentemente 8,0.
La expresion de una secuencia de elastasa inmadura puede dar en algunos casos una mezcla de protemas proelastasas y protemas elastasas maduras, ademas de protemas elastasas de variante del extremo N. Asf, la presente invencion proporciona una composicion que comprende al menos dos de (1) una protema proelastasa, (2) una protema elastasa madura, y (3) protemas elastasas de variante del extremo N.
Una vez se ha producido una elastasa madura, puede liofilizarse, por ejemplo, para formulaciones farmaceuticas. En una realizacion a modo de ejemplo, la presente invencion proporciona procedimientos de aislamiento de una elastasa tipo I madura liofilizada que comprende las etapas:
(a) cultivar una celula huesped, tal como una celula huesped de Pichia pastoris, manipulada para expresar
una molecula de acido nucleico que codifica un marco de lectura abierto de preproelastasa en condiciones
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en las que el marco de lectura abierto se expresa, en los que, en una realizacion espedfica, dicho marco de lectura abierto comprende secuencias de nucleotidos que codifican, en una direccion de 5' a 3' (i) un peptido senal, por ejemplo, un peptido senal operable en Pichia pastoris; (ii) una secuencia de activacion que comprende una secuencia de reconocimiento de elastasa; y (iii) la secuencia de protema elastasa tipo I madura, produciendo asf una protema proelastasa;
(b) someter la protema proelastasa a condiciones de autoactivacion, produciendo asf una elastasa tipo I madura, en los que las condiciones de autoactivacion incluyen, una o una combinacion de las siguientes:
(i) cambiar el pH de una disolucion (que puede ser un sobrenadante de cultivo celular) que contiene la protema proelastasa, por ejemplo, a un pH de 6,5-11, preferentemente 8-9;
(ii) purificar la protema proelastasa, por ejemplo, por cromatograffa de intercambio ionico, y someter la disolucion a amplia conversion para eliminar variantes del extremo N, produciendo asf elastasa tipo I humana madura;
(iii) concentrar la protema proelastasa (por ejemplo, 2 veces, 3 veces, 5 veces, 8 veces, 10 veces,
12 veces, o un intervalo en el que los ffmites superior e inferior esten seleccionados
independientemente de los anteriores niveles de concentraciones);
(iv) someter la protema proelastasa a elevada temperatura (por ejemplo, 29 °C, 30 °C, 32 °C, 35 °C, 40 °C, 45 °C, o 40 °C, o un intervalo en el que los ffmites superior e inferior esten seleccionados independientemente de las temperaturas anteriores);
(v) purificar la protema proelastasa (por ejemplo, usando resina Macro-Prep High S) de un
sobrenadante de cultivo celular e incubar una disolucion que comprende la protema proelastasa purificada a temperatura ambiente (por ejemplo, 22 °C a 26 °C) durante un periodo de al menos un dfa (por ejemplo, un dfa, dos dfas, tres dfas, cuatro dfas, cinco dfas o seis dfas, un intervalo de dfas en el que los ffmites superior e inferior esten seleccionados independientemente de los valores anteriores) (esto esta influido por la presencia de citrato/acetato, concentracion,
temperatura y pH en la disolucion, y puede determinarse facilmente por un experto en la materia);
(c) opcionalmente, purificar la elastasa tipo I humana madura, por ejemplo, etapa de cromatograffa de intercambio ionico para cromatograffa de pulimento; y
(d) liofilizar la elastasa tipo I madura, aislando asf una elastasa tipo I humana madura liofilizada. La elastasa tipo I madura es preferentemente una elastasa tipo I humana. En ciertos aspectos, la elastasa tipo I madura liofilizada tiene preferentemente mas del 95% de pureza; en las realizaciones espedficas, la elastasa tipo I madura liofilizada tiene mas del 98% o mas del 99% de pureza.
La protemas elastasas maduras de la invencion pueden formularse en composiciones farmaceuticas. Asf, en
realizaciones a modo de ejemplo, la presente invencion proporciona un procedimiento de generacion de una
composicion farmaceutica que comprende una elastasa tipo I humana madura, comprendiendo dicho procedimiento (i) aislar una elastasa tipo I humana madura liofilizada segun los procedimientos descritos anteriormente; y (ii) reconstituir la elastasa tipo I humana madura liofilizada en un vehmulo farmaceuticamente aceptable. Las elastasas tipo I humanas maduras de la invencion tienen preferentemente una actividad espedfica superior a 1, superior a 5, superior a 10, superior a 20, superior a 25, o superior a 30 U/mg de protema, como se ha determinado midiendo la tasa de hidrolisis del sustrato de peptidos pequenos N-succinil-Ala-Ala-Ala-p-Nitroanilida (SLAP), que se cataliza mediante la adicion de elastasa. Una unidad de actividad se define como la cantidad de elastasa que cataliza la hidrolisis de 1 micromol de sustrato por minuto a 30 °C y la actividad espedfica se define como actividad por mg de protema elastasa (U/mg). Preferentemente, una elastasa tipo I humana madura de la invencion tiene una actividad espedfica dentro de un intervalo en el que el ffmite inferior es 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15 o 20 U/mg de protema y en el que el ffmite superior es, independientemente, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 o 50 U/mg de protema. En realizaciones a modo de ejemplo, la actividad espedfica esta en el intervalo de 1-40 U/mg de protema, 1-5 U/mg de protema, 2-10 U/mg de protema, 4-15 U/mg de protema, 5-30 U/mg de protema, 10-20 U/mg de protema, 20-40 U/mg de protema, o cualquier intervalo cuyos ffmites superior e inferior esten seleccionados de cualquiera de los valores anteriores (por ejemplo, 1-10 U/mg, 5-40 U/mg, etcj.
Las composiciones farmaceuticas de la invencion son preferentemente estables. En las realizaciones espedficas, una composicion farmaceutica (por ejemplo, una composicion farmaceutica preparada por liofilizacion y reconstitucion como se ha descrito anteriormente) mantiene al menos el 50%, mas preferentemente al menos el 60%, y lo mas preferentemente al menos el 70% de su actividad espedfica despues de una semana de almacenamiento a 4 °C. En las realizaciones espedficas, la composicion farmaceutica mantiene al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85% o al menos el 95% de su actividad espedfica despues de reconstitucion y una semana de almacenamiento a 4 °C.
La presente invencion tambien proporciona protemas que comprenden una secuencia de aminoacidos de proprotema elastasa tipo I que contiene una secuencia de dominio de escision de elastasa. Otros dominios de escision que pueden usarse en la presente invencion son cualquiera de las secuencias descritas por la secuencia de dominio de escision consenso (SEC ID N°: 74) Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 en la que Xaa1=P5, Xaa2=P4, Xaa3=P3, Xaa4=P2, Xaa5=P1, Xaa6=P'1, Xaa7=P'2 y Xaa8=P'3, en la que:
- Xaa1 es glutamato, histidina, prolina, glicina, asparagina, lisina o alanina u, opcionalmente, un analogo de
los mismos;
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- Xaa2 es treonina, alanina, prolina o histidina u, opcionalmente, un analogo de las mismas;
- Xaa3 es alanina, leucina, isoleucina, metionina, lisina, asparagina o valina u, opcionalmente, un analogo de
las mismas, pero preferentemente no es glicina o prolina;
- Xaa4 es prolina, alanina, leucina, isoleucina, glicina, valina o treonina u, opcionalmente, un analogo de las mismas;
- Xaa5 es alanina, leucina, valina, isoleucina o serina, pero no glicina, tirosina, fenilalanina, prolina, arginina, glutamato o lisina u, opcionalmente, un analogo de las mismas;
- Xaa6 es alanina, leucina, valina, isoleucina o serina u, opcionalmente, un analogo de las mismas;
- Xaa7 es glicina, alanina o valina u, opcionalmente, un analogo de las mismas; y
- Xaa8 es valina, treonina, fenilalanina, tirosina o triptofano u, opcionalmente, un analogo de las mismas.
La presente invencion tambien proporciona un procedimiento de aislamiento de una elastasa tipo I humana madura que comprende: (a) cultivar, bajo condiciones de cultivo, una celula huesped que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una proprotema que comprende (i) una secuencia de activacion que comprende una secuencia de reconocimiento de tripsina operativamente ligada a (ii) la secuencia de aminoacidos de una protema que tiene actividad de elastasa bajo dichas condiciones de cultivo, en el que dichas condiciones de cultivo comprenden un periodo de crecimiento o induccion a pH de 2 a 6; (b) recuperar la proprotema expresada; (c) poner en contacto la protema recuperada con una cantidad catalttica de tripsina bajo condiciones de pH en las que la tripsina es activa; y (d) aislar elastasa tipo I humana madura. En este procedimiento, la elastasa tipo I humana madura puede consistir esencialmente en SEC ID N°: 1, 4, 5, 84 u 87. En ciertas realizaciones, las condiciones pueden comprender (a) un periodo de crecimiento o induccion a pH de 4 a 6; (b) un periodo de crecimiento o induccion a 22 °C a 28 °C; o (c) concentraciones de citrato de sodio, succinato de sodio o acetato sodico de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 200 mM o una concentracion de citrato de sodio es 90 mM a aproximadamente 110 mM en los medios de cultivo de dichas celulas huesped.
Debe observarse que los artmulos indefinidos “un”, “una” y el artmulo definidos “el” y “la” se usan en la presente solicitud, como es comun en las solicitudes de patente, para indicar uno o mas, a menos que el contexto dicte claramente de otro modo. Ademas, el termino “o” se usa en la presente solicitud, como es comun en las solicitudes de patente, para indicar el disyuntivo “o” o the conjuntivo “y”.
Cualquier discusion de documentos, actos, materiales, dispositivos, artmulos o similares que se han incluido en esta memoria descriptiva es unicamente con el fin de proporcionar un contexto para la presente invencion. No debe tomarse como una admision de que cualquiera o todas de estas materias formen parte de la base de la tecnica anterior o fueran conocimiento general comun en el campo relevante a la presente invencion como existio en cualquier parte antes de la fecha de prioridad de la presente solicitud.
Las caractensticas y ventajas de la invencion seran adicionalmente evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada de realizaciones de la misma.
4. BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
Figuras 1A-1B: La Figura 1A muestra la secuencia de ELA-1.2A humana sintetica (es decir, recombinante). La secuencia de elastasa-1 humana recombinante (es decir, elastasa tipo 1 humana pancreatica) contiene una region codificantes de 750 pares de bases. Estan subrayados sitios de enzimas de restriccion seleccionados. Las sustituciones de base estan en texto en negrita doblemente subrayado y los codones que las contienen estan doblemente subrayados. Los codones de terminacion estan recuadrados. La secuencia de propeptidos esta en cursiva. La region codificante produce una protema de 250 aminoacidos. Despues de la escision del propeptido de 10 aminoacidos, la enzima natural resultante tiene 240 aminoacidos. La Figura 1B muestra la region de fusion traduccional de pPROT324. Se representa la fusion traduccional entre el vector y la region codificante de ELA-1. La amplificacion por PCR de la secuencia de ELA-1 proporciono la incorporacion de los dominios de escision senal Kex2 y STE13 para dar un producto secretado con un extremo N esperado del primer aminoacido (texto en negrita) de la secuencia de activacion (en cursiva).
Figura 2: Un esquema del extremo N al extremo C de los componentes de nucleo (solapantes) de las protemas elastasas de la invencion, en el que los componentes numerados representan: (1) secuencia senal (rayas verticales); (2) secuencia de propeptido/espaciador opcional (ladrillos); (3) propeptido de elastasa (rayas diagonales, sin sombrear y patron de diamante combinados); (4) peptido de activacion (sin sombrear y patron de diamante combinados); (5) secuencia de reconocimiento (patron de diamante); (6) dominio de escision (sin sombrear, patron de diamante y la porcion izquierda de las rayas horizontales); (7) sitio de escision (sin sombrear, patron de diamante y la porcion izquierda de las rayas horizontales); (8) protema preproelastasa (esquema entero); (9) protema proelastasa (rayas diagonales, sin sombrear, patron de diamante y rayas horizontales combinados); y (10) protema elastasa madura (rayas horizontales). La tabla muestra las designaciones de aminoacido de la region en el esquema que atraviesa la flecha. No esta dibujado a escala. La nomenclatura es solo para fines de referencia y no pretende connotar una funcion, actividad o mecanismo particular.
Figura 3. Diagrama del vector pPROT24-V. “Secrecion de factor a” se refiere a un casete que contiene el peptido y
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propeptido senal de factor a de levadura, seguido de un sitio Kex2 y repeticiones de STE13.
Figura 4: Analisis de SDS-PAGE de fracciones de la cromatograffa de captura de un cultivo 201-24-266-VU que contiene pro-PRT-201 activada por tripsina. Los numeros de carril se corresponden con los numeros de fracciones. Las fracciones 6-18 consisten principalmente en proenzima glucosilada (banda superior) y proenzima no glucosilada (banda inferior). Las fracciones 19-35 consisten principalmente en proenzima no glucosilada. M = marcadores de peso molecular. FT = flujo continuo de la columna.
Figuras 5A-5F: La Figura 5A es una tabla de datos de la proprotema auto-activada. Las secuencias de propeptidos se enumeran en la primera columna. La SDS-PAGE de sobrenadantes despues de 1, 2 y 3 dfas de induccion (carriles 1, 2 y 3, respectivamente) se muestra en la segunda columna. Los rendimientos de proprotema relativa basados en SDS-PAGE se enumeran en la tercera columna. Las estabilidades relativas de la proprotema durante 3 dfas de induccion basada en SDS-PAGE se enumeran en la cuarta columna. Las proprotemas con las secuencias de propeptidos 42 y 48 se clasifican como que tienen baja estabilidad debido a la presencia de protema madura durante la induccion (observada despues de 1, 2 y 3 dfas para la variante 42 y despues de 2 y 3 dfas para la variante 48). Las velocidades de conversion relativas de las proprotemas como se ha determinado por tiempo para lograr la maxima velocidad de reaccion de SLAP se enumeran en la quinta columna. Los porcentajes estimados de protema convertida que comprendio las variantes del extremo N de la protema elastasa madura se enumeran en la sexta columna. Las Figuras 5B-5F muestran datos de velocidades de conversion para las secuencias de propeptidos 24, 42, 48, 49 y 55, respectivamente.
Figura 6. Esquema de clonacion de pPROT55M3-V. pPROT55M3-V se manipulo por ligacion in vitro de dos casetes de expresion adicionales al esqueleto del vector pPROT55-V de 4,3 kb, dando un total de tres casetes de expresion en tandem. El fragmento del casete de expresion de 2,3 kb se libero de pPROT55-V con una digestion con restriccion con Bglll y BamHT y se purifico, seguido de ligacion de dos copias del casete de expresion a pPROT55-V linealizado con BamHl.
Figura 7: Optimizacion en matraz de agitacion del clon 201-55M3-006-VU. Se preparo medio de induccion convencional, BKME, y se complemento con citrato de sodio para lograr concentraciones finales de citrato de sodio 0, 12,5, 25 y 50 mM, pH 5,5. El medio se uso para resuspender sedimentos de celulas en fase de crecimiento usando una relacion de 1 g de peso de celulas humedas a 10 ml de medio de induccion. Las suspensiones de celulas o 25 ml de cada una se dispusieron en un matraz sin deflector de 250 ml y se incubaron a 22 °C o 25 °C durante 3 dfas con agitacion a 275 rpm. Se anadio metanol dos veces al dfa a una concentracion final del 0,5% en volumen. Se tomaron almuotas de sobrenadante durante el periodo de 3 dfas y se analizaron para la expresion de protemas por SDS-PAGE y tincion con Coomassie. El panel A muestra las muestras inducidas a 22 °C y el panel B muestra las muestras inducidas a 25 °C. En ambos paneles, los carriles 1-3 son sobrenadantes despues de 1, 2 y 3 dfas de induccion, respectivamente, que contienen 0% de citrato de sodio; los carriles 4-6 son similares, excepto con 12,5% de citrato de sodio; los carriles 7-9 son similares, excepto con 25% de citrato de sodio; y los carriles 10-12 son similares, excepto con citrato de sodio 50 mM.
Figura 8. Analisis de SDS-PAGE de sobrenadantes de fermentacion de 201-55-001-VU y 201-55M3-003-VU. Carriles 1, 2: sobrenadante de 201-55-001-VU; carriles 3, 4: sobrenadante de 201-55M3-003-VU; carril 5: vacfo; carril 6: marcadores de peso molecular.
Figura 9. Analisis de SDS-PAGE de fracciones de cromatograffa de captura de la proprotema pPROT55M3-V. Se mezclaron un total de 30 microlitros de cada fraccion de elucion con 10 microlitros de 4X tampon de carga de muestra Laemmli complementado con beta-mercaptoetanol. Las protemas se sometieron a electroforesis sobre un gel al 8-16% de gradiente lineal, seguido de tincion con Coomassie. Se observaron dos formas predominantes de PRT-201: la proprotema (fracciones 15-43) y se convirtio espontaneamente en PRT-201 madura (fracciones 15-44). Los numeros de carril se corresponden con numeros de fraccion. M, marcador de peso molecular. BC, antes de la muestra de la columna (pre-carga).
Figura 10: Analisis de HIC-HPLC de conversion de proprotema purificada. pro-PRT-201-55M3-003-VU purificada se sometio a conversion a 26 °C. El grafico muestra cantidades relativas de PRT-201 madura (longitud completa) y de variantes del extremo N producidas durante la conversion.
Figura 11: Analisis de HIC-HPLC de de conversion de proprotema en sobrenadante de fermentacion efectuado por filtracion de flujo tangencial. Se sometio sobrenadante de fermentacion de 201-55M3-003-VU clarificado a filtracion de flujo tangencial con Tris 100 mM, pH 8,0, usando diafiltracion de volumen constante a temperatura ambiente con membranas de celulosa regenerada. El grafico muestra cantidades relativas de proprotema, PRT-201 madura (longitud completa) y de variantes del extremo N presentes en diversos momentos de tiempo durante la conversion.
Figuras 12. Analisis de SDS-PAGE de fracciones de cromatograffa de captura de conversion de pPROT55M3-V. Se mezclaron un total de 30 microlitros de cada fraccion de elucion con 10 microlitros de 4X tampon de carga de muestra Laemmli complementado con beta-mercaptoetanol. Las protemas se sometieron a electroforesis sobre un gel al 8-16% de gradiente lineal, seguido de tincion con Coomassie. Se observaron dos formas predominantes de
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PRT-201: la forma madura glucosilada (fracciones 35-70) y la forma madura no glucosilada (fracciones 75-160). Los numeros de carril se corresponden con los numeros de fraccion. M, marcador de peso molecular. BC, muestra antes de la columna (pre-carga).
Figura 13: Dependencia de la concentracion de la conversion de pro. pro-PRT-201 purificada del clon 201-55M3- 003-VU (pro-PRT-201-55M3-003-VU) se sometio a conversion a concentraciones de 0,2, 1,0, 1,6 y 1,8 mg/ml. Las reacciones de conversion se monitorizaron por HIC-HPLC en tiempo real hasta que la proprotema fue < 1% de la protema total. El grafico muestra las cantidades relativas de pRT-201 madura (longitud completa) (barras sin sombrear) y de variantes del extremo N (barras rellenas diagonales) producidas durante las conversiones.
Figura 14. Secuencia de ADN de elastasa pancreatica porcina tipo 1 sintetica (es decir, recombinante). La secuencia recombinante contiene una region codificante de 750 pares de bases. Los sitios de restriccion Sacll y Xbal como se han subrayado se incorporaron para facilitar la clonacion. Los codones de terminacion estan recuadrados. La secuencia de pro-peptidos esta en tipo negrita.
Figura 15. Secuencia de aminoacidos de elastasa pancreatica tipo I porcina sintetica (es decir, recombinante). La region de pro-peptido esta en tipo negrita mientras que el sitio de escision de tripsina esta recuadrado. Despues de la escision del pro-peptido de 10 aminoacidos, la enzima madura resultante tiene 240 aminoacidos.
Figura 16. Esquema de clonacion de elastasa pancreatica tipo I porcina en el vector PV-1. Despues de la smtesis de la region codificante de la proprotema elastasa pancreatica tipo I porcina, se clono en el vector pUC de Blue Heron. Ademas de amplificar la secuencia codificante de elastasa pancreatica tipo I porcina, se uso PCR para incorporar sitios de restriccion XhoI y SacII para clonacion en el vector PV-1. El producto de PCR se digirio, se purifico en gel y se ligo con el vector PV-1 digerido con XhoI y SacII, produciendo asf un vector de expresion PROT101-24-V que codifica proprotema elastasa pancreatica tipo I porcina activada con tripsina.
Figura 17. Analisis de expresion de los clones pPROT101-42-V auto-activados y pPROT101-24-V activados con tripsina durante la induccion por metanol por SDS-PAGE. Sobrenadantes de matraz de agitacion despues de 1 dfa de induccion se analizaron sobre un gel al 8-16% de gradiente, seguido de tincion con tincion con Coomassie. Los carriles 1-10 contienen sobrenadantes de diez clones diferentes transformados con pPROT101-42-V. Los carriles 11-12 contienen sobrenadantes de dos clones diferentes transformados con pPROT101-24-V. M, marcadores de peso molecular.
Figura 18. Analisis de expresion de los clones pPROT101-49-V y pPROT101-55L-V auto-activados durante la induccion por metanol por SDS-PAGE. Sobrenadantes de matraz de agitacion despues de 1 y 2 dfas de induccion se analizaron sobre un gel al 8-16% de gradiente, seguido de tincion con Coomassie. Los carriles 1-2 contienen sobrenadantes de un clon de pPROT101-49-V despues de 1 y 2 dfas de induccion, respectivamente. Los carriles 3-4 contienen sobrenadantes de un clon de pPROT101-55L-V despues de 1 y 2 dfas de induccion, respectivamente. M, marcadores de peso molecular.
Figura 19. Activacion del transcurso de tiempo de protemas pPROT101-49-V y pPROT101-55L-V por ensayo de conversion a pequena escala como se ha determinado por actividad de elastasa SLAP. Las barras de error representan ± DE de la media (n=4).
Figura 20. Analisis de SDS-PAGE de sobrenadantes de pPROT101-49-V y pPROT101-55L-V antes y despues del ensayo de conversion a pequena escala. Antes de la electroforesis, las muestras se mezclaron con acido cftrico, el agente reductor TCEP y tampon de muestra LDS (Invitrogen, CA). Las muestras se calentaron a 70 °C durante 10 minutos. Carriles 1-2: sobrenadante del ensayo pre-y post-conversion de pPROT101-49-V, respectivamente; carriles 3-4: sobrenadante del ensayo pre- y post-conversion de pPROT101-55L-V, respectivamente. M, marcadores de peso molecular.
Figura 21. Curva patron de TrypZean.
Figura 22. Una vista lateral, parcialmente en seccion, de una realizacion del dispositivo medico descrito en la Seccion 5.9.
Figura 23. Una vista similar a la de la Figura 22 que ilustra el movimiento de los actuadores del dispositivo medico.
Figura 24. Una vista en seccion desde un extremo en el plano de la lmea 2-2 en la Figura 22.
Figura 25. Una vista en seccion desde un extremo en el plano de la lmea 3-3 en la Figura 22.
Figura 26. Un diagrama de la trayectoria de fluido del dispositivo medico de la Figura 22, que se extiende desde los
conos de Luer pasando por los conductos de administracion de fluido al deposito y luego a los penetradores de tejido.
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Figura 27. Una vista lateral, parcialmente en seccion, de una segunda realizacion del dispositivo medico de la presente invencion que muestra los actuadores en sus configuraciones restringidas.
Figura 28. Una vista similar a la Figura 27, pero que muestra los actuadores en sus configuraciones restringidas.
Figura 29. Una vista desde un extremo en perspectiva del montaje a lo largo de la lmea 3’-3’ de la Figura 27.
Figura 30. Una vista desde un extremo en perspectiva del montaje a lo largo de la lmea 4’-4’ de la Figura 29 que muestra los penetradores de tejido.
Figura 31. Una vista lateral que muestra el detalle del extremo proximal del dispositivo, mostrado a la derecha en las Figuras 27 y 28.
Figura 32. Una vista parcial del exterior del dispositivo medico de la Figura 22 en su posicion restringida.
5. DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
La presente invencion se refiere a procedimientos para la expresion recombinante y la produccion de protemas elastasas biologicamente activas maduras. La presente invencion proporciona novedosos procedimientos eficaces de preparacion de protemas elastasas recombinantes cultivando celulas huesped, que incluyen la celula huesped preferida, Pichia pastoris, que comprende acidos nucleicos que codifican protemas proelastasas y protemas preproelastasas. Tambien se proporciona el uso de las protemas recombinantes para fabricar composiciones farmaceuticas para el tratamiento y la prevencion de enfermedades de conductos biologicos (incluyendo arterias o venas).
En ciertos aspectos, la presente invencion se refiere a protemas proelastasas auto-activadas recombinantes y acidos nucleicos, celulas huesped y procedimientos de fabricacion relacionados. Tales protemas proelastasas auto- activadas se manipulan para contener un sitio de reconocimiento de elastasa inmediatamente en el extremo N para el primer residuo de la protema elastasa madura. Bajo condiciones de cultivo especificadas, tales como aquellas descritas en la Seccion 6 mas adelante, es posible reducir la auto-activacion hasta que se desee la activacion. Tambien es posible reducir la auto-activacion hasta que la proelastasa se elimine del cultivo celular.
La presente invencion proporciona procedimientos de expresion y purificacion eficaces para producir protemas elastasas de calidad farmaceutica. La presente invencion tambien proporciona procedimientos para tratar o prevenir enfermedades de conductos biologicos usando las protemas elastasas de la invencion.
La descripcion en la Seccion 5 en el presente documento es aplicable a las realizaciones de la Seccion 8. Asf, por ejemplo, una referencia a una protema elastasa de la invencion incluye, pero no se limita a, una referencia a una protema elastasa segun una cualquiera de las realizaciones 1-39 y 68-69, o una protema elastasa obtenida u obtenible mediante el procedimiento de una cualquiera de las realizaciones 89-224, 261 a 276 y 347 a 373. Asimismo, una referencia a un acido nucleico de la invencion se refiere, entre otras cosas, a un acido nucleico segun una cualquiera de las realizaciones 40-67; referencia a un vector se refiere, entre otras cosas, a referencia a un vector segun una cualquiera de las realizaciones 70-72; referencia a una celula se refiere, entre otras cosas, a una celula segun una cualquiera de las realizaciones 73-87, referencia a un sobrenadante de cultivo celular se refiere, entre otras cosas, a un sobrenadante de cultivo celular segun la realizacion 88; referencia a composiciones, tales como composiciones farmaceuticas, formulaciones de elastasa y dosificaciones unitarias, incluye, por ejemplo, aquellas ejemplificadas en las realizaciones 277-314, 346, 386 y 415-420, o aquellas obtenidas u obtenibles mediante el procedimiento de una cualquiera de las realizaciones 261-276 y 374-385; y referencias a procedimientos terapeuticos tambien incluyen una referencia a procedimientos terapeuticos segun una cualquiera de las realizaciones 387-414; y referencia a un kit incluye una referencia a, entre otras cosas, una referencia a un kit de las realizaciones 421-425 de la Seccion 8.
5.1 PROTEINAS ELASTASAS
La presente invencion se refiere, entre otras cosas, a procedimientos para la expresion y produccion recombinante de protemas elastasas biologicamente activas maduras. Las protemas elastasas se expresan generalmente como preproprotemas, que contienen, entre otras secuencias, un peptido senal, un peptido de activacion y una porcion madura con actividad biologica. Secuencias de protemas elastasas maduras adecuadas se describen en la Seccion
5.1.1 mas adelante. Secuencias de peptidos de activacion adecuadas se describen en la Seccion 5.1.2 mas adelante. Secuencias senal adecuadas se describen en la Seccion 5.1.3 mas adelante.
Por consiguiente, en ciertos aspectos, las protemas elastasas de la invencion son protemas preproelastasas. La eliminacion de la secuencia senal de las preproprotemas tras la secrecion generalmente da una proprotema inactiva que contiene un peptido de activacion y una protema madura. La frases “secuencia de activacion” y “peptido de activacion” se usan indistintamente en el presente documento. Asf, en otros aspectos, las protemas elastasas de la invencion son protemas proelastasas que comprenden un peptido de activacion que esta operativamente ligado a
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una protema elastasa madura. En una realizacion a modo de ejemplo, un peptido de activacion o secuencia de una elastasa pancreatica tipo I humana natural comprende los 10 primeros aminoacidos del extremo N de la proprotema elastasa tipo I humana (SEC ID N°: 22). En ciertas realizaciones, el peptido de activacion es un peptido de SEC ID N°: 80. Los peptidos de activacion o secuencias utiles en la practica de la presente invencion tambien incluyen, pero no se limitan a, SEC ID N°: 23, 72 y 73. Todavfa otras secuencias de activacion utiles en la practica de la presente invencion pueden obtenerse a partir de los residuos 1-10 del extremo N de SEC ID N°: 64-69 y 98-103.
La eliminacion del peptido de activacion de la secuencia de proelastasa genera una protema elastasa madura. La etapa por la que el peptido de activacion se elimina de la secuencia de proelastasa/se separa de la secuencia de elastasa madura para generar una protema elastasa madura se denomina en el presente documento una etapa de activacion. Asf, en todavfa otros aspectos, las protemas elastasas de la invencion son protemas elastasas maduras.
Los residuos de aminoacidos que comprenden el extremo C (es decir, extremo carboxi) del peptido de activacion y el extremo N (es decir, extremo amino) de la protema madura que rodean el enlace de escision se representan en la Figura 2 y tambien se identifican en el presente documento del siguiente modo. Primero, los residuos localizados en el extremo C del peptido de activacion se designan PX,...P5, P4, P3, P2 y P1 en la que P1 es el residuo del extremo C del peptido de activacion. Los residuos localizados en el extremo N de la protema madura se designan P1 ’, P2’, P3’,...PX’ en la que P1’ es el residuo del extremo N de aminoacido de la protema madura. El enlace escindible que se escinde por proteolisis (denominado el “enlace de escision” en la Figura 2) es el enlace peptfdico entre el residuo P1 del peptido de activacion y el residuo P1’ de la protema madura.
La region que atraviesa 4 aminoacidos del extremo C del peptido de activacion (residuos P4 a P1) hasta los 4 primeros aminoacidos del extremo N de la protema madura (residuos P1’ a P4’) se denomina en el presente documento el “sitio de escision”.
La region que atraviesa aproximadamente 5 aminoacidos del extremo C del peptido de activacion (es decir, residuos P5 a P1) hasta aproximadamente los 3 primeros aminoacidos del extremo N de la protema madura (es decir, residuos P1’ a P3’) se denomina en el presente documento el “dominio de escision”. Ejemplos de dominios de escision que pueden usarse en el contexto de la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, SEC ID N°: 42, 43, 48, 49, 52, 53, 54 o 55. Otros dominios de escision que pueden usarse en la presente invencion son cualesquiera de las secuencias descritas por la secuencia del dominio de escision consenso Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 en la que Xaa1=P5, Xaa2=P4, Xaa3=P3, Xaa4=P2, Xaa5=P1, Xaa6=P1’, Xaa7=P2’ y Xaa8=P3’, en la que:
- Xaa1 es glutamato, histidina, prolina, glicina, asparagina, lisina o alanina u, opcionalmente, un analogo de los mismos;
- Xaa2 es treonina, alanina, prolina o histidina u, opcionalmente, un analogo de las mismas;
- Xaa3 es alanina, leucina, isoleucina, metionina, lisina, asparagina o valina u, opcionalmente, un analogo de
las mismas, pero preferentemente no es glicina o prolina;
- Xaa4 es prolina, alanina, leucina, isoleucina, glicina, valina o treonina u, opcionalmente, un analogo de las mismas;
- Xaa5 es alanina, leucina, valina, isoleucina o serina, pero no glicina, tirosina, fenilalanina, prolina, arginina, glutamato o lisina u, opcionalmente, un analogo de las mismas;
- Xaa6 es alanina, leucina, valina, isoleucina o serina u, opcionalmente, un analogo de las mismas;
- Xaa7 es glicina, alanina o valina u, opcionalmente, un analogo de las mismas; y
- Xaa8 es valina, treonina, fenilalanina, tirosina o triptofano u, opcionalmente, un analogo de las mismas.
La region de tres aminoacidos que atraviesa los residuos P3, P2, y P1 del peptido de activacion se denomina en el presente documento un “sitio de reconocimiento de elastasa”. Ejemplos de sitios de reconocimiento que pueden usarse en el contexto de la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, SEC ID N°: 14-16 y 18-21. Otros sitios de reconocimiento contemplados por la presente invencion incluyen cualquier sitio de reconocimiento descrito por los sitios de reconocimiento consenso de SEC ID N°: 11, 12, 13 o 93. La secuencia de reconocimiento de elastasa consenso 1 de SEC ID N°: 11 se representa por la secuencia de peptidos Xaa1 Xaa2 Xaa3 en la que Xaa1=P3, Xaa2=P2, Xaa3=P1, en la que:
- Xaa1 es alanina, leucina, isoleucina, metionina, lisina, asparagina o valina u, opcionalmente, un analogo de las mismas, pero preferentemente no es glicina o prolina;
- Xaa2 es prolina, alanina, leucina, isoleucina, glicina, valina o treonina u, opcionalmente, un analogo de las mismas;
- Xaa3 es alanina, leucina, valina, isoleucina o serina u, opcionalmente, un analogo de las mismas, pero preferentemente no es glicina, tirosina, fenilalanina, prolina, arginina, glutamato, o lisina.
La secuencia de reconocimiento de elastasa consenso 2 de SEC ID N°: 12 se representa por la secuencia Xaa1 Pro Xaa2, en la que:
- Xaa1 es alanina, leucina, isoleucina, metionina, lisina o valina u, opcionalmente, un analogo de las mismas,
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pero preferentemente no es glicina o prolina;
- Pro es prolina u, opcionalmente, un analogo de la misma;
- Xaa2 es alanina, leucina, valina, isoleucina o serina u, opcionalmente, un analogo de las mismas, pero preferentemente no es glicina, tirosina, fenilalanina, prolina, arginina, glutamato o lisina.
La secuencia de reconocimiento de elastasa consenso 3 de SEC ID N°: 13 se representa por la secuencia de peptidos Xaai Xaa2 Xaa3, en la que Xaai=P3, Xaa2=P2, Xaa3=P1, en la que Xaai es asparagina o alanina u, opcionalmente, un analogo de las mismas; en la que Xaa2 es prolina o alanina u, opcionalmente, un analogo de las mismas, y en la que Xaa3 es alanina, leucina o valina u, opcionalmente, un analogo de las mismas.
La secuencia de reconocimiento de elastasa consenso 4 de SEC ID N°: 93 se representa por la secuencia Xaa1 Pro Xaa2, en la que:
- Xaa1 es alanina, leucina, isoleucina, metionina, lisina, asparagina o valina u, opcionalmente, un analogo de las mismas, pero preferentemente no es glicina o prolina;
- Pro es prolina u, opcionalmente, un analogo de la misma;
- Xaa2 es alanina, leucina, valina, isoleucina o serina u, opcionalmente, un analogo de las mismas, pero preferentemente no es glicina, tirosina, fenilalanina, prolina, arginina, glutamato o lisina.
Referencia a una secuencia como “secuencia de escision”, “dominio de escision”, “secuencia de activacion”, “secuencia de reconocimiento de elastasa”, etc., es unicamente para facilidad de referencia y no pretende implicar ninguna funcion de la secuencia o mecanismo por el que la secuencia sea reconocida o procesada.
Las protemas de la invencion estan generalmente compuestas de aminoacidos y pueden incluir ademas uno o mas (por ejemplo, hasta 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12 o 15) analogos de aminoacido. Generalmente, como se usa en el presente documento, un aminoacido se refiere a un L-estereoisomero que se produce naturalmente. Un analogo de aminoacido se refiere a un D-estereoisomero, un aminoacido qmmicamente modificado u otro aminoacido no natural. Por ejemplo, aminoacidos no naturales incluyen, pero no se limitan a, acido azetidincarboxflico, acido 2- aminoadfpico, acido 3-aminoadfpico, p-alanina, acido aminopropionico, acido 2-aminobutmco, acido 4-aminobutmco, acido 6-aminocaproico, acido 2-aminoheptanoico, acido 2-aminoisobutmco, acido 3-aminoisobutmco, acido 2- aminopimelico, terc-butilglicina, acido 2,4-diaminoisobutmco, desmosina, acido 2,2’-diaminopimelico, acido 2,3- diaminopropionico, N-etilglicina, N-etilasparagina, homoprolina, hidroxilisina, alohidroxilisina, 3-hidroxiprolina, 4- hidroxiprolina, isodesmosina, alo-isoleucina, N-metilalanina, N-metilglicina, N-metilisoleucina, N-metilpentilglicina, N- metilvalina, naftalanina, norvalina, norleucina, ornitina, pentilglicina, acido pipecolico y tioprolina. Un aminoacido qmmicamente modificado incluye un aminoacido que esta qmmicamente bloqueado, reversiblemente o irreversiblemente, y/o modificado en uno o mas de sus grupos laterales, atomos de carbono a, grupo amino terminal o grupo acido carboxflico terminal. Una modificacion qmmica incluye anadir restos qmmicos, crear nuevos enlaces y eliminar restos qmmicos. Ejemplos de aminoacidos qmmicamente modificados incluyen, por ejemplo, sulfoxido de metionina, metioninasulfona, S-(carboximetil)-cistema, sulfoxido de S-(carboximetil)-cistema y S-(carboximetil)- cistemasulfona. Modificaciones en grupos laterales de aminoacidos incluyen acilacion de grupos £-amino de lisina, N-alquilacion de arginina, histidina o lisina, alquilacion de grupos acido carboxflico glutamico o aspartico, y desamidacion de glutamina o asparagina. Modificaciones del extremo amino incluyen las modificaciones de des- amino, N-alquilo inferior, N-di-alquilo inferior y N-acilo. Modificaciones del grupo carboxi terminal incluyen las modificaciones de amida, alquil inferior-amida, dialquilamida y ester de alquilo inferior. Un alquilo inferior es un alquilo C1-C4. Ademas, uno o mas grupos laterales, o grupos terminales, pueden protegerse por grupos protectores conocidos para el qmmico de protemas habitual en la tecnica. El carbono a de un aminoacido puede estar mono- o di-metilado.
Las protemas de la invencion pueden modificarse o derivatizarse, tal como modificarse por fosforilacion o glucosilacion, o derivatizarse por conjugacion, por ejemplo, con un lfpido u otra protema (por ejemplo, para la eleccion de diana o estabilizacion), o similares.
La presente invencion frecuentemente se refiere a una protema elastasa “aislada” o “purificada”. Una protema elastasa aislada es una que se elimina de su medio celular. Una protema elastasa purificada esta sustancialmente libre de material celular u otras protemas contaminantes de la fuente de celulas o de tejido de la que se deriva la protema elastasa, o sustancialmente libre de precursores qmmicos u otros productos qmmicos cuando se sintetiza qmmicamente. La expresion “sustancialmente libre de material celular” incluye preparaciones de protema elastasa en las que la protema se separa de componentes celulares de las celulas de las que se produce recombinantemente. Asf, protema elastasa que esta sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de protema elastasa que tienen menos de aproximadamente el 30%, 20%, 10% o 5% (en peso seco) de protema heterologa (tambien denominada en el presente documento “protema contaminante”). Si la protema elastasa se produce mediante un procedimiento en el que es secretada en medio de cultivo, tambien esta preferentemente sustancialmente libre del medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente el 20%, 10% o el 5% del volumen de la preparacion de protema elastasa.
En ciertas realizaciones, una elastasa aislada o purificada esta adicionalmente libre o sustancialmente libre de ADN
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celular. En las realizaciones especfficas, el ADN genomico de celula huesped esta presente en una cantidad de menos de 10 picogramos, menos de 5 picogramos, menos de 3 picogramos, menos de 2 picogramos, o menos de 1 picogramo de ADN por miligramo de protema elastasa en una preparacion de protema elastasa aislada o purificada, o en una composicion que comprende protema elastasa aislada o purificada. En una realizacion, el ADN de celula huesped es aDn de Pichia pastoris.
Secuencias de protemas elastasas utiles se proporcionan en la Tabla 1. En una realizacion espedfica, la invencion proporciona una protema proelastasa (que incluye, pero no se limita a, una protema de una cualquiera de SEC ID N°: 6-9, 64-69, 88-91 y 98-103) que comprende (i) una secuencia de activacion que comprende una secuencia de reconocimiento de elastasa operativamente ligada a (ii) la secuencia de aminoacidos de una protema que tiene actividad de elastasa tipo I. Se conocen varios polimorfismos de elastasa tipo I humana. Cualquier combinacion de polimorfismos se contempla en las secuencias de protemas proelastasas de la presente invencion, que incluyen, pero no se limitan a, las combinaciones de polimorfismos expuestas en la Tabla 2. La protema comprende opcionalmente ademas una secuencia senal operativamente ligada a dicha secuencia de activacion. En ciertas realizaciones espedficas, la secuencia senal es operable en Pichia pastoris, tal como un peptido senal de factor a de levadura, ejemplificado por la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 34. Peptido senal alternativo que contiene secuencias se ejemplifican en SEC ID N°: 50 y 96 (que contienen un peptido senal, un propeptido de no elastasa y una secuencia de espaciador) y SEC ID N°: 51 y 97 (que contiene el peptido senal y un propeptido de no elastasa). En otras realizaciones espedficas, la secuencia senal es una secuencia senal de la secrecion de mairnfero, tal como una secuencia senal de elastasa porcina. Preferentemente, la secuencia de reconocimiento de elastasa es una secuencia de reconocimiento de elastasa tipo I, lo mas preferentemente una secuencia de reconocimiento de elastasa tipo I humana.
La presente invencion engloba adicionalmente variantes de las protemas elastasas de la invencion. Las variantes pueden contener sustituciones de aminoacidos en uno o mas residuos de aminoacidos no esenciales predichos. Preferentemente, una variante incluye no mas de 15, no mas de 12, no mas de 10, no mas de 9, no mas de 8, no mas de 7, no mas de 6, no mas de 5, no mas de 4, no mas de 3, no mas de 2 o no mas de 1 sustitucion de aminoacidos conservativa con respecto a una elastasa madura que se produce naturalmente y/o no mas de 5, no mas de 4, no mas de 3, o no mas de 2 sustituciones de aminoacidos no conservativas, o no mas de 1 sustitucion de aminoacidos no conservativa, con respecto a una elastasa madura que se produce naturalmente.
En realizaciones espedficas, la variante tiene no mas de 10 o mas preferentemente no mas de cinco sustituciones de aminoacidos conservativas con respecto a una elastasa madura, una proelastasa o una preproelastasa de la invencion, tal como con respecto a una elastasa madura de SEC ID N°: o SEC ID N°: 84 o una protema proelastasa de SEC ID N°: 6-9, 64-69, 88-91 y 98-103. Las secuencias de aminoacidos de SEC ID N°: 1 y 84 contienen una o mas posiciones correspondientes a posibles polimorfismos en la secuencia de elastasa madura, en las posiciones 44 (W o R); 59 (M o V); 220 (V o L); y 243 (Q o R) (las posiciones se refieren a preproprotema). Asf, la invencion engloba protemas elastasas maduras con cualquier combinacion de los cuatro polimorfismos identificados en SEC ID N°: 84. Cada una de tales combinaciones se explica brevemente en la Tabla 3 anterior. La secuencia de SEC ID N°: 88-91 y 98-103 contiene adicionalmente un posible polimorfismo en la secuencia de propeptidos, en la posicion 10 (Q o H). Asf, la invencion engloba secuencias de preproelastasa y proelastasa que contienen cualquier combinacion de los cinco polimorfismos identificados en SEC ID N°: 88-91 y 98-103. Cada una de tales combinaciones se explica brevemente en la Tabla 2 anterior.
Una “sustitucion de aminoacidos conservativa” es una en la que el residuo de aminoacido se sustituye con un residuo de aminoacido que tiene una cadena lateral similar. Familias de residuos de aminoacidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la materia. Estas familias incluyen aminoacidos con cadenas laterales basicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acidas (por ejemplo, acido aspartico, acido glutamico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cistema), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromaticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano).
Las protemas elastasas de variante de la invencion pueden incluir sustituciones de aminoacidos con analogos de aminoacidos, ademas de aminoacidos, como se describen en el presente documento.
En realizaciones espedficas, la protema de la invencion comprende o consiste esencialmente en una variante de una elastasa tipo I humana madura, por ejemplo, una variante que es al menos aproximadamente el 75%, 85%, 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% identica a las proprotemas elastasas o protemas elastasas maduras enumeradas en la Tabla 1, tal como, pero no se limitan a, las proprotemas elastasas de SEC ID N°: 6-9, 64-69, 8891 y 98-103, y retienen actividad de elastasa cuando se expresan para producir una protema elastasa madura de SEC ID N°: 1, 4, 5, 84 o 87.
Para determinar la identidad en porcentaje de dos secuencias de aminoacidos o de dos acidos nucleicos, las secuencias estan alineadas para fines de comparacion optimos (por ejemplo, pueden introducirse huecos en la secuencia de una primera secuencia de aminoacidos o de acidos nucleicos para alineamiento optimo con una
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segunda secuencia de aminoacidos o acidos nucleicos). Entonces se comparan los residuos de aminoacidos o nucleotidos en posiciones de aminoacidos o posiciones de nucleotidos correspondientes. Si una posicion en la primera secuencia esta ocupada por el mismo residuo de aminoacido o nucleotido que la posicion correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moleculas son identicas en esa posicion. La identidad en porcentaje entre las dos secuencias es una funcion del numero de posiciones identicas compartidas por las secuencias (% de identidad = (n° de posiciones identicas/n° total de posiciones solapantes) x 100). En una realizacion, las dos secuencias son de la misma longitud. En otras realizaciones, las dos secuencias se diferencian en longitud por no mas del 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% o el 10% de la longitud de la mas larga de las dos secuencias.
La determinacion de la identidad en porcentaje entre dos secuencias puede llevarse a cabo usando un algoritmo matematico. Un ejemplo no limitante preferido de un algoritmo matematico utilizado para la comparacion de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Un algoritmo tal se incorpora en los programas NBLAST y XBLaSt de Altschul y col. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. Las busquedas de nucleotidos con BLAST pueden realizarse con el programa NBLAST, puntuacion = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleotidos homologas a moleculas de acidos nucleicos de la invencion. Las busquedas de protemas con BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST, puntuacion = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoacidos homologas a moleculas de protema de la invencion. Para obtener alineamientos con huecos para fines de comparacion puede utilizarse BLAST con huecos como se describen en Altschul y col. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Alternativamente, PSI-Blast puede usarse para realizar una busqueda iterativa que detecta relaciones distantes entre moleculas (Idem). Si se utilizan los programas BLAST, BLAST con huecos y PSI-Blast, pueden usarse los parametros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Vease
http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Otro ejemplo no limitante preferido de un algoritmo matematico utilizado para la comparacion de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, CABIOS (1989). Un algoritmo tal se incorpora en el programa ALIGN (version 2.0) que es parte del paquete de software de alineamiento de secuencias CGC. Si se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoacidos, puede usarse una tabla de residuos de peso PAM120, una penalizacion por longitud de hueco de 12 y una penalizacion por hueco de 4. Algoritmos adicionales para el analisis de secuencias se conocen en la tecnica e incluyen ADVANCE y ADAM como se describe en Torellis y Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5; y FASTA descrito en Pearson y Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad Sci. 85:2444-8. Dentro de FASTA, ktup es una opcion de control que fija la sensibilidad y velocidad de la busqueda. Si ktup=2, se encuentran regiones similares en las dos secuencias que se comparan buscando en pares de residuos alineados; si ktup=1, se examinan aminoacidos alineados individuales. ktup puede fijarse a 2 o 1 para secuencias de protema, o de 1 a 6 para secuencias de ADN. El valor por defecto si ktup no se especifica es 2 para protemas y 6 para ADN. Para otra descripcion de parametros de FASTA vease
http://bioweb.pastaur.fr/docs/man/man/fasta.1.htm1#sect2.
La identidad en porcentaje entre dos secuencias puede determinarse usando tecnicas similares a aquellas descritas anteriormente, con o sin permitir huecos. En el calculo de la identidad en porcentaje normalmente se cuentan emparejamientos exactos.
Las protemas elastasas de la invencion pueden presentar modificaciones post-traduccionales, que incluyen, pero no se limitan a, glucosilaciones (por ejemplo, glucosilaciones ligadas en N o ligadas en O), miristilaciones, palmitilaciones, acetilaciones y fosforilaciones (por ejemplo, serina/treonina o tirosina). En una realizacion, las protemas elastasas de la invencion presentan niveles reducidos de glucosilacion ligada en O y/o glucosilacion ligada en N con respecto a protemas elastasas endogenamente expresadas. En otra realizacion, las protemas elastasas de la invencion no presentan glucosilacion ligada en O o glucosilacion ligada en N.
5.1.1. LA SECUENCIA DE ELASTASA MADURA
Las secuencias de elastasa madura de la presente invencion son preferentemente secuencias de elastasa de mairnfero, lo mas preferentemente secuencias de elastasa humana. En otras realizaciones, las secuencias de elastasa de mai^ero madura son de otros mai^eras tales como raton, rata, cerdo, vaca o caballo.
En los procedimientos y composiciones de la invencion, la secuencia de elastasa madura empleada es preferentemente la de una elastasa pancreatica tipo I, que preferencialmente escinde secuencias de protema hidrofobas, preferible sobre el lado carboxi de residuos hidrofobos pequenos tales como alanina. Ejemplos de elastasas pancreaticas tipo I incluyen la enzima elastasa I humana (numero de acceso de NCBI NP_001962) que se expresa en piel y la enzima elastasa pancreatica porcina I (numero de acceso de NCBI CAA27670) que se expresa en el pancreas. SEC ID N°: y SEC ID N°: 84 son ejemplos de secuencias de elastasa tipo I humana madura.
Alternativamente puede usarse una elastasa tipo II que puede escindir secuencias de protema hidrofoba, preferentemente sobre el lado carboxi de residuos de aminoacidos hidrofobos de medios a largos. Ejemplos de elastasas tipo II incluyen la enzima elastasa IIA humana (numero de acceso de NCBI NP254275) y la enzima elastasa porcina II (numero de acceso de NCBI A26823), que son ambas expresadas en el pancreas.
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Tambien se engloban variantes de una protema elastasa madura de la invencion. Las variantes incluyen protemas que comprenden secuencias de aminoacidos suficientemente identicas a o derivadas de la secuencia de aminoacidos de la protema elastasa madura de la invencion y presentan actividad de elastasa biologica. Una porcion biologicamente activa de una protema elastasa madura de la invencion puede ser una protema que tiene, por ejemplo, al menos 150, 160, 175, 180, 185, 190, 200, 210, 220, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238 o 239 aminoacidos de longitud. Ademas, otras porciones biologicamente activas, en las que otras regiones de la protema estan delecionadas, pueden prepararse por tecnicas recombinantes y evaluarse para una o mas de las actividades funcionales de la forma nativa de una protema elastasa madura de la invencion.
Ademas, las protemas elastasas maduras que comprenden cualquier combinacion de los cuatro polimorfismos de elastasa tipo I humana se representan por SEC ID N°: 84. Posibles combinaciones se exponen en la Tabla 3 anterior.
5.1.2. SECUENCIAS DE ACTIVACION DE PROELASTASA
La secuencia de activacion de elastasa es cualquier secuencia cuya eliminacion de una protema proelastasa produzca una protema elastasa madura biologicamente activa.
Las secuencias de activacion generalmente contienen sitios de reconocimiento de proteasa adyacentes a donde las proprotemas se escinden para producir protemas biologicamente activas maduras. Una secuencia de activacion puede manipularse para anadir un sitio de reconocimiento de proteasa o elastasa, o puede manipularse para sustituir un sitio de reconocimiento de proteasa existente con otro sitio de reconocimiento de proteasa. Los peptidos de activacion o secuencias utiles en la practica de la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, SEC ID N°: 23, 72 y 73. Todavfa otras secuencias de activacion utiles en la practica de la presente invencion pueden obtenerse a partir de los residuos 1-10 del extremo N de SEC ID N°: 64-68. En aspectos preferidos, la secuencia de activacion de proelastasa se manipula para contener una secuencia de reconocimiento para una elastasa tipo I o tipo II. Lo mas preferentemente, la secuencia de reconocimiento de elastasa es reconocida por la elastasa madura con la que esta operativamente ligada. Asf, en las realizaciones referidas a elastasa tipo II, la secuencia de reconocimiento es lo mas preferentemente una secuencia de reconocimiento de elastasa tipo II. En cambio, en las realizaciones dirigidas a una elastasa tipo I, la secuencia de reconocimiento es lo mas preferentemente una secuencia de reconocimiento de elastasa tipo I. En una realizacion preferida, la secuencia de reconocimiento es una secuencia de reconocimiento de elastasa tipo I humana. Las secuencias de reconocimiento tipo I a modo de ejemplo incluyen la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 14-16 y 18-21. Otros sitios de reconocimiento contemplados por la presente invencion incluyen cualquier sitio de reconocimiento descrito por los sitios de reconocimiento consenso de SEC ID N°: 11, 12 o 13.
5.1.3. SECUENCIAS SENAL
Las protemas proelastasas de la invencion pueden contener adicionalmente una secuencia senal que aumenta la secrecion de protema proelastasa en el medio de cultivo de la celula huesped en el que se expresa.
La secuencia senal nativa de la protema elastasa puede usarse particularmente para la expresion en una celula huesped de mairnfero. En otras realizaciones, la secuencia senal nativa de una protema elastasa de la invencion puede eliminarse y sustituirse con una secuencia senal de otra protema, tal como la secuencia senal de elastasa tipo I porcina, la secuencia senal de elastasa tipo I humana o la secuencia senal de factor a de levadura. En ciertas realizaciones espedficas, el peptido senal de factor a de levadura puede comprender ademas (1) una propeptido de factor a de levadura o (2) un propeptido de factor a de levadura y secuencia de espaciador, cada uno se ejemplifica respectivamente por la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 50 y 96 o SEC ID N°: 51 y 97. Alternativamente, la secuencia secretora de gp67 de la protema de la envuelta del baculovirus puede usarse como secuencia senal heterologa (Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel y col., eds., John Wiley & Sons, 1992)). Otros ejemplos de secuencias senal heterologas eucariotas incluyen las secuencias secretoras de melitina y fosfatasa alcalina placentaria humana (Stratagene; La Jolla, California). En otro ejemplo mas, secuencias senal heterologas procariotas utiles incluyen la senal secretora phoA (Sambrook y col., arriba) y la senal secretora de protema A (Pharmacia Biotech; Piscataway, Nueva Jersey).
5.2 ACIDOS NUCLEICOS DE ELASTASA
Un aspecto de la invencion se refiere a moleculas de acido nucleico recombinantes que codifican una protema elastasa recombinante de la invencion. Como se usa en el presente documento, el termino “molecula de acido nucleico” esta previsto que incluya moleculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genomico) y moleculas de ARN (por ejemplo, ARNm) y analogos del ADN o ARN generados usando analogos de nucleotido. La molecula de acido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferentemente es ADN bicatenario.
La presente invencion se refiere a acidos nucleicos que codifican las protemas elastasas de la invencion. Asf, en ciertas realizaciones, la presente invencion proporciona una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una protema proelastasa (que incluye, pero no se limita a, una protema de
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una cualquiera de SEC ID N°: 6-9, 64-69, 88-91 o 98-103) que comprende (i) una secuencia de activacion que comprende una secuencia de reconocimiento de elastasa operativamente ligada a (ii) la secuencia de aminoacidos de una protema que tiene actividad de elastasa tipo I. En otras realizaciones, la presente invencion tambien proporciona una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una protema que comprende (i) una secuencia senal operable en Pichia pastoris operativamente ligada a (ii) una secuencia de activacion (que incluye, pero no se limita a, una secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 23, 72 o 73) que comprende una secuencia de reconocimiento de proteasa que a su vez esta operativamente ligada a (iii) la secuencia de aminoacidos de una elastasa tipo I humana madura.
Puede purificarse un acido nucleico de la invencion. Una molecula de acido nucleico “purificada”, tal como una molecula de ADNc, puede estar sustancialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo cuando se produce por tecnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores qmmicos u otros productos qmmicos cuando se sintetiza qmmicamente.
En los casos en los que la molecula de acido nucleico sea una molecula de ADNc o ARN, por ejemplo, ARNm, tales moleculas pueden incluir una “cola” de poli A o, alternativamente, pueden carecer de tal cola en 3’.
Una molecula de acido nucleico de la invencion puede amplificarse usando ADNc, ARNm o ADN genomico como molde y cebadores de oligonucleotidos apropiados segun tecnicas de amplificacion por PCR convencionales. El acido nucleico asf amplificado puede clonarse en un vector apropiado y caracterizarse por analisis de secuencias de ADN. Ademas, los oligonucleotidos correspondientes a toda o una parte de una molecula de acido nucleico de la invencion pueden prepararse por tecnicas sinteticas convencionales, por ejemplo, usando un sintetizador de ADN automatizado.
5.3 VECTORES DE EXPRESION RECOMBINANTES Y CELULAS HUESPED
Adicionalmente se proporcionan vectores que comprenden cualquiera de los acidos nucleicos de la invencion o celulas huesped manipuladas para expresar los acidos nucleicos de la invencion. En las realizaciones espedficas, los vectores comprenden una secuencia de nucleotidos que regula la expresion de la protema codificada por el acido nucleico de la invencion. Por ejemplo, la secuencia de nucleotidos que codifica la protema de la invencion puede estar operativamente ligada a un promotor inducible por metanol.
Tambien se proporcionan celulas huesped que comprenden los acidos nucleicos y vectores de la invencion. En ciertas realizaciones, el vector o acido nucleico esta integrado en el genoma de la celula huesped; en otras realizaciones, el vector o acido nucleico es extracromosomico. Una celula huesped preferida es una celula de Pichia pastoris.
Como se usa en el presente documento, el termino “vector” se refiere a una molecula de acido nucleico que puede transportar otro acido nucleico con el que se ha ligado. Un tipo de vector es un “plasmido”, que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales en el genoma viral. Ciertos vectores pueden replicarse autonomamente en una celula huesped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicacion bacteriano y vectores de mairnfero episomicos). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mai^ero no episomicos) se integran en el genoma de una celula huesped tras la introduccion en la celula huesped, y asf se replican junto con el genoma del huesped. Ademas, ciertos vectores, vectores de expresion, pueden dirigir la expresion de secuencias codificantes con las que estan operativamente ligados. En general, vectores de expresion de utilidad en tecnicas de ADN recombinante estan frecuentemente en forma de plasmidos (vectores).
Los vectores de expresion recombinantes de la invencion comprenden secuencia de nucleotidos que codifica una elastasa madura, una proelastasa o una preproelastasa de la invencion en una forma adecuada para la expresion en una celula huesped. Esto significa que los vectores de expresion recombinantes incluyen una o mas secuencias reguladoras, seleccionadas basandose en las celulas huesped que van a usarse para la expresion, que esta operativamente ligada a la secuencia de acidos nucleicos a expresar. Dentro de un vector de expresion recombinante, “operativamente ligado” pretende significar que la secuencia de nucleotidos de interes esta ligada a la(s) secuencia(s) reguladora(s) de un modo que permita la expresion de la secuencia de nucleotidos (por ejemplo, en un sistema de transcripcion/traduccion in vitro o en una celula huesped cuando el vector se introduce en la celula huesped). El termino “secuencia reguladora” esta previsto que incluya promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresion (por ejemplo, senales de poliadenilacion). Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego, Ca, 1990). Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresion constitutiva de una secuencia de nucleotidos en muchos tipos de celulas huesped y aquellas que dirigen la expresion de la secuencia de nucleotidos solo en ciertas celulas huesped (por ejemplo, secuencias reguladoras espedficas de tejido). Se apreciara por aquellos expertos en la materia que el diseno del vector de expresion puede depender de factores tales como la eleccion de la celula huesped a transformar, el nivel de expresion de la protema elastasa deseada, etc. Los vectores de expresion de la invencion pueden introducirse en celulas huesped para asf producir protemas elastasas
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codificadas por acidos nucleicos como se describe en el presente documento.
Los vectores de expresion recombinantes de la invencion pueden disenarse para la expresion de una protema elastasa de la invencion en procariotas (por ejemplo, E. coli) o celulas eucariotas (por ejemplo, celulas de insecto (usando vectores de expresion en baculovirus), celulas de levadura o celulas de mairnfero). Celulas huesped adecuadas se tratan adicionalmente en Goeddel, arriba. Alternativamente, el vector de expresion recombinante puede transcribirse y traducirse in vitro, por ejemplo, usando secuencias reguladoras del promotor T7 y T7 polimerasa.
La expresion de protemas en procariotas es casi siempre llevada a cabo en E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresion de tanto protemas de fusion como de no fusion. Los vectores de fusion anaden varios aminoacidos a una protema codificada en su interior, normalmente al extremo amino de la protema recombinante. Tales vectores de fusion normalmente sirven a tres fines: 1) para aumentar la expresion de la protema elastasa recombinante; 2) para aumentar la solubilidad de la protema elastasa recombinante; y 3) para ayudar en la purificacion de la protema elastasa recombinante actuando de ligando en purificacion por afinidad. Frecuentemente, en vectores de expresion de fusion, un dominio de escision proteolttica se introduce en la union del resto de fusion y la protema recombinante para permitir la separacion de la protema recombinante del resto de fusion posterior a la purificacion de la protema de fusion. Asf, el resto de fusion y el dominio de escision proteolftica pueden juntos servir de secuencia de activacion, que incluye un sitio de reconocimiento de proteasa, para la expresion recombinante de una protema elastasa. Enzimas que pueden activar tales protemas de fusion, y sus secuencias de reconocimiento relacionadas, incluyen factor Xa, trombina y enterocinasa. Vectores de expresion de fusion tfpicos incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc.; Smith y Johnson, 1988, Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fusionan glutation S-transferasa (GST), protema de union a maltosa E, o protema A, respectivamente, con la protema recombinante diana.
Ejemplos de vectores de expresion en E. coli de no fusion inducibles adecuados incluyen pTrc (Amann y col., 1988, Gene 69:301-315) y pET-11d (Studier y col., 1990, Gene Expression: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California, 185:60-89). La expresion genica diana del vector pTrc se basa en la transcripcion de ARN polimerasa huesped de un promotor de fusion tnbrido de trp-lac. La expresion genica diana del vector pET-11d se basa en la transcripcion de un promotor de fusion de T7 gn10-lac mediado por una ARN polimerasa viral coexpresada (T7 gn1). Esta polimerasa viral se suministra por cepas huesped BL21(DE3) o HMS174(DE3) de un profago X residente que aloja un gen T7 gn1 bajo el control transcripcional del promotor lacUV 5.
Una estrategia para maximizar la expresion de protemas elastasas recombinantes en E. coli es expresar la protema en una bacteria huesped con una capacidad alterada para escindir proteoltticamente la protema recombinante (Gottesman, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California 185:119-129). Otra estrategia es alterar la secuencia de acidos nucleicos del acido nucleico a insertar en un vector de expresion de manera que los codones individuales para cada aminoacido sean aquellos preferencialmente utilizados en E. coli (Wada y col., 1992, Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). Tal alteracion de secuencias de acidos nucleicos de la invencion puede llevarse a cabo por tecnicas de smtesis de ADN convencionales.
En otra realizacion, el vector de expresion es un vector de expresion de levadura. Ejemplos de vectores para la expresion en levadura S. cerevisiae o P. pastoris incluyen pYepSec1 (Baldari y col., 1987, EMBO J. 6:229-234), pMFa (Kurjan y Herskowitz, 1982, Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz y col., 1987, Gene 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) y pPicZ (Invitrogen Corp, San Diego, CA). Para la expresion en levadura se usa preferentemente un promotor inducible por metanol. En el presente documento tambien se contempla la alteracion de la secuencia de acidos nucleicos del acido nucleico a insertar en un vector de expresion de manera que los codones individuales para cada aminoacido sean aquellos preferencialmente utilizados en P. pastoris. Mas espedficamente, los codones de SEC ID N°: 33 o SEC ID N°: 81 pueden sustituirse con codones que se utilizan preferencialmente en P. pastoris.
Alternativamente, el vector de expresion es un vector de expresion de baculovirus. Los vectores de baculovirus disponibles para la expresion de protemas en celulas de insecto cultivadas (por ejemplo, celulas Sf 9) incluyen las series pAc (Smith y col., 1983, Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) y las series pVL (Lucklow y Summers, 1989, Virology 170:31-39). Otra estrategia es alterar la secuencia de acidos nucleicos del acido nucleico a insertar en un vector de expresion de manera que los codones individuales para cada aminoacido sean aquellos preferencialmente utilizados en celulas de insecto.
En otra realizacion mas, una protema elastasa se expresa en celulas de mam^era usando un vector de expresion de mam^era. Ejemplos de vectores de expresion de mamffero incluyen pCDM8 (Seed, 1987, Nature 329(6142):840-2) y pMT2PC (Kaufman y col., 1987, EMBo J. 6:187-195). Cuando se usa en celulas de mam^era, las funciones de control del vector de expresion se proporcionan frecuentemente por elementos reguladores virales. Por ejemplo, promotores comunmente usados se derivan de polioma, adenovirus 2, citomegalovirus y virus simio 40. Para otros sistemas de expresion adecuados para tanto celulas procariotas como eucariotas veanse los Capftulos 16 y 17 de
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Sambrooky col., arriba.
En otra realizacion, el vector de expresion de mairnfero recombinante puede dirigir la expresion del acido nucleico preferencialmente en un tipo de celula particular (por ejemplo, se usan elementos reguladores espedficos de tejido para expresar el acido nucleico). Los elementos reguladores espedficos de tejido se conocen en la tecnica. Ejemplos no limitantes de promotores espedficos de tejido adecuados incluyen el promotor de albumina (espedfico de hfgado; Pinkert y col., 1987, Genes Dev. 1:268-277), promotores espedficos de linfoide (Calame y Eaton, 1988, Adv. Immunol. 43:235-275), en particular promotores de receptores de linfocitos T (Winoto y Baltimore, 1989, EMBO J. 8:729-733) e inmunoglobulinas (Banerji y col., 1983, Cell 33:729-740; Queen y Baltimore, 1983, Celula 33:741748), promotores espedficos de neurona (por ejemplo, el promotor de neurofilamento; Byrne y Ruddle, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477), promotores espedficos de pancreas (Edlund y col., 1985, Science 230:912916) y promotores espedficos de las glandulas mamarias (por ejemplo, promotor de suero de la leche; la patente de EE.UU. n° 4.873.316 y la publicacion de solicitud europea n° EP264166). Tambien estan englobados promotores regulados por el desarrollo, por ejemplo, los promotores hox de raton (Kessel y Gruss, 1990, Science 249:374-379) y el promotor de la fetoprotema beta (Campes y Tilghman, 1989, Genes Dev. 3:537-546).
En ciertos aspectos de la invencion, la expresion de una protema de la invencion puede aumentarse aumentando la dosificacion del gen correspondiente, por ejemplo, por el uso de un vector de expresion de alta copia o amplificacion genica. La amplificacion genica puede lograrse en celulas CHO deficientes en dihidrofolato reductasa (“dhfr”) por cotransfeccion del gen de interes con el gen dhfr y exposicion a medio selectivo con concentraciones crecientes escalonadas de metrotrexato. Vease, por ejemplo, Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, Unidad 16.14 (John Wiley & Sons, Nueva York, 1996). Un procedimiento alternativo para aumentar el numero de copias de genes es multimerizar un casete de expresion (por ejemplo, promotor con secuencia codificante) que codifica la protema elastasa de interes en un vector antes de introducir el vector en la celula huesped. Procedimientos y vectores para conseguir la multimerizacion de casetes de expresion se conocen en sistemas de levadura y de celulas huesped de mai^ero (vease, por ejemplo, Monaco, Methods in Biotechnology 8: Animal Cell Biotechnology, en las pag. 39-348 (Humana Press, 1999); Vassileva y col., 2001, Protein Expression and Purification 21:71-80; Mansur y col., 2005, Biotechnology Letter 27(5):339-45. Ademas, estan comercialmente disponibles kits para la expresion genica de multiples copias. Por ejemplo, puede obtenerse un kit de expresion de Pichia de multiples copias de Invitrogen (Carlsbad, California). La multimerizacion de un casete de expresion se ejemplifica en el Ejemplo 6, mas adelante.
Por consiguiente, otros aspectos de la invencion se refieren a celulas huesped en las que se ha introducido un vector de expresion recombinante de la invencion. Los terminos “celula huesped” y “celula huesped recombinante” se usan indistintamente en el presente documento. Se entiende que tales terminos se refieren no solo a la celula objeto particular, sino a la progenie o posible progenie de una celula tal. Debido a que pueden producirse ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido tanto a mutacion como a influencias medioambientales, tal progenie puede, en realidad, no ser identica a la celula parental, pero todavfa se incluye dentro del alcance del termino como se usa en el presente documento.
Una celula huesped puede ser cualquier celula procariota (por ejemplo, E. coli) o eucariota (por ejemplo, celulas de insecto, levadura o celulas de mai^ero).
El ADN de vector puede introducirse en celulas procariotas o eucariotas mediante tecnicas de transformacion o transfeccion convencionales. Como se usa en el presente documento, los terminos “transformacion” y “transfeccion” pretenden referirse a una variedad de tecnicas reconocidas en la tecnica para introducir acido nucleico extrano en una celula huesped, que incluyen co-precipitacion con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfeccion mediada por DEAE-dextrano, lipofeccion o electroporacion. Procedimientos adecuados para transformar o transfectar celulas huesped pueden encontrarse en Sambrook y col. (arriba), y otros manuales de laboratorio.
Para transfeccion estable de celulas de mai^ero se sabe que, dependiendo del vector de expresion y la tecnica de transfeccion usada, solo una pequena fraccion de celulas puede integrar el ADN extrano en su genoma. Con el fin de identificar y seleccionar estos integrantes, una secuencia codificante para un marcador de seleccion (por ejemplo, para resistencia a antibioticos) se introduce generalmente en las celulas huesped junto con el marco de lectura abierto de interes. Marcadores de seleccion preferidos incluyen aquellos que confieren resistencia a farmacos, tales como G418, higromicina, Zeocin y metrotrexato. Celulas establemente transfectadas con el acido nucleico introducido pueden identificarse por seleccion de farmacos (por ejemplo, celulas que han incorporado la secuencia codificante del marcador de seleccion sobreviviran, mientras que las otras celulas moriran).
En otra realizacion, las caractensticas de expresion de una secuencia codificante de elastasa endogena dentro de una celula, lmea celular o microorganismo pueden modificarse insertando un elemento regulador de ADN heterologo a la secuencia codificante de elastasa en el genoma de una celula, lmea celular estable o microorganismo clonado de forma que el elemento regulador insertado este operativamente ligado con el gen endogeno.
Una secuencia heterologa, que contiene un elemento regulador, puede insertarse en una lmea celular estable o microorganismo clonado, de forma que se ligue operativamente con y active la expresion de un gen de elastasa
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endogeno, usando tecnicas tales como recombinacion de homologos dirigida, que son muy conocidas para aquellos expertos en la materia, y se describen, por ejemplo, en Chappel, patente de EE.UU. n° 5.272.071; publicacion PCT n°. WO 91/06667, publicada el 16 de mayo de 1991. La secuencia heterologa puede incluir adicionalmente los peptidos senal, secuencias de escision y/o secuencias de activacion de la presente invencion.
5.4 PROCEDIMIENTOS DE FABRICACION DE PROTEINAS ELASTASAS MADURAS
Una celula huesped de la invencion, tal como una celula huesped procariota o eucariota en cultivo, puede usarse para producir una protema elastasa de la invencion. Por consiguiente, la invencion proporciona ademas procedimientos para producir una protema elastasa de la invencion usando las celulas huesped de la invencion. En una realizacion, el procedimiento comprende cultivar la celula huesped de invencion (en la que un vector de expresion recombinante que codifica una protema elastasa de la invencion se ha introducido) en un medio adecuado de forma que se produzca la protema elastasa. En otra realizacion, el procedimiento comprende ademas aislar la protema elastasa del medio o la celula huesped.
La presente invencion proporciona ademas procedimientos para producir las protemas elastasas inmaduras de la invencion que comprenden cultivar una celula huesped manipulada para expresar un acido nucleico de la invencion en condiciones en las que se produce la protema proelastasa. En ciertas realizaciones tambien se produce la protema preproelastasa. La presente invencion proporciona ademas procedimientos para producir protemas elastasas maduras de la invencion que comprenden cultivar una celula huesped manipulada para expresar un acido nucleico de la invencion en condiciones en las que se produce una protema proelastasa y someter la protema proelastasa a condiciones de activacion de forma que se produzca la protema elastasa madura.
Condiciones de cultivo preferidas para producir las protemas inmaduras y maduras de la invencion, particularmente para la celula huesped Pichia pastoris, incluyen un periodo de crecimiento a un pH bajo. En las realizaciones espedficas, el pH bajo es un pH de 2-6, un pH de 2-5, un pH de 3-6, un pH de 3-5, un pH de 4-6, un pH de 3-4 o cualquier intervalo cuyos lfmites superior e inferior esten seleccionados de cualquiera de los valores anteriores. Al final del periodo de cultivo, el pH del cultivo puede elevarse, preferentemente a un pH de 7-11, lo mas preferentemente a un pH de 8.
Si la expresion de una protema proelastasa de la invencion esta bajo el control de un promotor inducible por metanol, condiciones para producir una protema elastasa inmadura o madura de la invencion tambien pueden comprender un periodo de induccion por metanol.
Los procedimientos de produccion de elastasa de la invencion pueden comprender ademas la etapa de recuperar la protema expresada por la celula huesped. En ciertos casos, la protema recuperada es una proelastasa, que contiene la secuencia de activacion. En otros casos, la protema recuperada es una elastasa madura que carece de la secuencia de activacion. Bajo ciertas condiciones se producen tanto las protemas proelastasas como elastasas maduras. En otros casos se produce la preproelastasa.
Preferentemente, particularmente cuando se desee evitar la auto-activacion de una proelastasa auto-activada, condiciones de cultivo para la expresion de proelastasa comprenden un periodo de crecimiento en citrato de sodio, succinato de sodio o acetato sodico. En las realizaciones espedficas se usa una concentracion de aproximadamente 5-50 mM, 7,5-100 Mm, 10-150 mM, 50-200 mM, 75-175 mM, 100-150 mM, 75-125 mM, o de cualquier intervalo cuyos lfmites superior e inferior esten seleccionados de cualquiera de los valores anteriores. En una realizacion preferida, la concentracion de citrato de sodio, succinato de sodio o acetato sodico es 90-110 mM, lo mas preferentemente 100 mM.
Adicionalmente, particularmente cuando se desee eludir la degradacion de protema, condiciones de cultivo para la de expresion de proelastasa comprenden un periodo de crecimiento e induccion en el extremo inferior del intervalo de temperatura adecuado para la celula huesped en cuestion. Por ejemplo, si la celula huesped es una celula huesped de Pichia pastoris, el intervalo preferido es aproximadamente 22-28 °C. En las realizaciones espedficas, la celula huesped de Pichia pastoris se cultiva a una temperatura de aproximadamente 28 °C. El crecimiento e induccion no necesita realizarse a la misma temperatura; por ejemplo, en una realizacion en la que se utiliza Pichia pastoris como celula huesped, el crecimiento puede realizarse a 28 °C, mientras que la induccion puede realizarse a 22 °C.
La activacion de una protema proelastasa auto-activada de la invencion puede iniciarse mediante la adicion de elastasa extrmseca en una pequena cantidad (catalftica). Alternativamente o simultaneamente, la activacion de una protema proelastasa auto-activada de la invencion puede iniciarse elevando el pH de la disolucion que contiene la protema proelastasa auto-activada. El pH es preferentemente 7-11; en las realizaciones espedficas, la disolucion esta a un pH de 7-10, 7-9, 8-10, 8-9, o cualquier intervalo cuyos lfmites superior e inferior esten seleccionados de cualquiera de los valores anteriores. En una realizacion preferida, el pH de la disolucion 7-9, lo mas preferentemente 8.
En realizaciones espedficas, la proelastasa auto-activada puede someterse a base Tris, durante la etapa de
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activacion. En las realizaciones espedficas, la base Tris se anade a una concentracion de 5-50 mM, 7,5-100 Mm, 10-150 mM, 50-200 mM, 75-175 mM, 100-150 mM, 75-125 mM, o de cualquier intervalo cuyos lfmites superior e inferior esten seleccionados de cualquiera de los valores anteriores. En una realizacion preferida, la base Tris se anade a una concentracion 90-110 mM, lo mas preferentemente 100 mM. El pH de la base Tris es preferentemente 7-11; en las realizaciones espedficas, la base Tris esta a un pH de 7-10, 7-9, 8-10, 8-9, o cualquier intervalo cuyos lfmites superior e inferior esten seleccionados de cualquiera de los valores anteriores. En una realizacion preferida, la base Tris esta a un pH de 7-9, lo mas preferentemente 8.
En ciertos aspectos de la invencion, la temperatura para la autoactivacion de elastasa es temperatura ambiente, por ejemplo, una temperatura que oscila de 22 °C a 26 °C. En ciertas realizaciones, la etapa de activacion de elastasa se realiza preferentemente con la proelastasa a una baja concentracion inicial, por ejemplo, 0,1-0,3 mg/ml, para la precision optima de la reaccion de escision y formacion minima de variantes del extremo N.
En ciertas realizaciones de la invencion no se requiere la adicion de cantidades cataltticas de elastasa para convertir la proelastasa auto-activada en elastasa madura, ya que la proelastasa puede experimentar autoproteolisis. En ciertas realizaciones, la tasa de autoproteolisis es independiente de la concentracion. Sin procurar limitar por teona, se cree que la autoproteolisis independiente de la concentracion de ciertas protemas proelastasas auto-activadas esta mediada mediante un procedimiento intramolecular en el que la molecula de proelastasa se escinde a sf misma mediante una reaccion intramolecular. Sin embargo, en otras realizaciones, la activacion de la proelastasa auto- activada depende de la concentracion. Sin procurar limitar por teona, se cree que la autoproteolisis dependiente de la concentracion de ciertas protemas proelastasas auto-activadas esta mediada mediante una reaccion intermolecular en la que la proelastasa se escinde por otra proelastasa y/o por una elastasa madura. En otras realizaciones mas, ciertas proprotemas elastasas auto-activadas muestran una combinacion de activacion dependiente de la concentracion e independiente de la concentracion. En aquellos casos en los que la auto- activacion sea dependiente de la concentracion, la proprotema puede mantenerse en una forma mas diluida para reducir la activacion, si se desea. La activacion de proprotemas elastasas que comprenden el dominio de escision de propeptido de elastasa de SEC ID N°: 55 que incluye, pero no se limitan a, la proprotema de SEC ID N°: 69, puede controlarse manteniendo tales proprotemas en una forma diluida.
Tambien se reconoce que ciertas variantes de secuencias del extremo N no deseadas de elastasa madura pueden acumularse en el transcurso de la produccion de protemas elastasas maduras de la presente invencion. Mas espedficamente, las protemas proelastasas que contienen el dominio de escision del propeptido de elastasa de SEC ID N°: 42 que incluyen la proprotema de SEC ID N°: 6 pueden dar variantes de secuencia del extremo N en las que la escision se ha producido en el enlace peptfdico que esta en el extremo C para cualquiera de los residuos en las posiciones P3 o P2. Sin embargo, la aparicion de tales variantes del extremo N no deseables puede reducirse colocando ciertos aminoacidos en ciertas localizaciones en la secuencia de activacion. Por ejemplo, si una prolina esta presente en la posicion P2, la produccion de variantes del extremo N con uno o dos aminoacidos del extremo N adicionales se reduce o elimina. Por tanto, la eliminacion de la necesidad de tripsina para la activacion reduce o elimina la produccion de la variante que carece de nueve residuos del extremo N. Adicionalmente, la aparicion de variantes del extremo N no deseables puede reducirse o eliminarse realizando la reaccion de activacion bajo ciertas condiciones.
Mas espedficamente, en ciertas realizaciones, las condiciones de activacion incluyen una etapa de “amplia conversion” durante la que variantes del extremo N producidas durante la porcion inicial de la reaccion de conversion se degradan posteriormente selectivamente. Las cantidades relativas de especies de protema durante la “amplia conversion” pueden monitorizarse en tiempo real por HIC-HPLC. La degradacion selectiva de variantes del extremo N no deseadas aumenta la proporcion PRT-201 madura de longitud completa en la reaccion de conversion y reduce la proporcion de variantes del extremo N. Para protemas proelastasas que contienen el dominio de escision del propeptido de elastasa de SEC ID N°: 55, la etapa de amplia conversion se realiza durante 4 a 8 horas, y preferentemente aproximadamente 6 h. Para otras protemas proelastasas, la etapa de amplia conversion puede aumentarse o disminuirse, dependiendo de la proporcion de variantes del extremo N con respecto a elastasa madura (longitud completa) inmediatamente despues de que se haya convertido toda la proelastasa. Si la conversion se produce en medios complejos, tales como caldo de fermentacion, el periodo de una amplia conversion puede aumentarse debido a la competicion en el sitio activo de elastasa madura por otras protemas y peptidos en disolucion. Alternativamente, una mezcla de elastasa madura y elastasa de variante del extremo N puede recuperarse de los medios complejos antes de la etapa de amplia conversion, reduciendo asf la competicion por el sitio activo y el tiempo requerido para eliminar las especies de variante del extremo N.
Como se ha mencionado anteriormente, durante una reaccion de conversion para pro-PRT-201-55M3-003-VU, hay una reaccion secundaria que conduce a la produccion de variantes del extremo N. En el caso espedfico de pro-PRT- 201-55M3-003-VU, estas variantes del extremo N han perdido las dos primeras valinas y tienen poca o ninguna actividad de elastasa. Para otras pro-protemas mutantes se producen variantes del extremo N adicionales, algunas con adiciones y otras con diferentes deleciones. Se ha desarrollado una etapa de eliminacion del extremo N que reduce las variantes del extremo N a un intervalo del 0-2%. El desarrollo de esta etapa de eliminacion se desarrollo de una variedad de experimentos y observaciones. Como se ha mencionado previamente, durante la optimizacion de experimentos de condiciones de conversion con pro-PRT-201-42, se observo que reacciones de amplias
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conversiones frecuentemente condujeron a un porcentaje muy bajo de variantes del extremo N. Posteriormente se determino que las reacciones de conversion prolongadas permitieron que PRT-201 madura degradara selectivamente variantes del extremo N. El descubrimiento de la capacidad de PRT-201 para degradar selectivamente variantes del extremo N bajo ciertas condiciones tuvo un enorme beneficio ayudando a producir un producto de PRT-201 mas purificado con menos variantes del extremo N. Esta etapa de eliminacion de variantes del extremo N se implemento en un procedimiento de produccion a gran escala estableciendo condiciones que permitinan que la pro-PRT-201 se convirtiera en PRT-201 madura y luego permitinan que la PRT-201 degradara las variantes del extremo N.
Un ejemplo representativo de una etapa tal se muestra en la Figura 10 como se monitorizo en tiempo real por HIC- HPLC. A aproximadamente 50 minutos, el 100% de pro-PRT-201-SSM3 se habfa convertido completamente en aproximadamente el 86% de PRT-201 madura y el 14% de variantes del extremo N. Se amplio la reaccion de conversion que permitio que PRT-201 madura degradara selectivamente las variantes del extremo N produciendo una disminucion de variantes del 14% al 2%. Con incubaciones prolongadas, las variantes del extremo N pueden degradarse selectivamente a un nivel indetectable. Si el nivel de variante del extremo N es suficientemente bajo, la actividad de PRT-201 se suprime con citrato de sodio y ajuste del pH de reaccion a 5,0.
Una vez se ha obtenido elastasa madura purificada, la enzima activa puede llevarse a una disolucion en la que la protema elastasa es relativamente inactiva y disponerse en un tampon para las posteriores etapas de purificacion por cromatograffa en columna, por ejemplo, por cromatograffa de intercambio cationico. En general, la protema elastasa puede disponerse en citrato de sodio a una concentracion de aproximadamente 5 a 25 mM y un pH de aproximadamente 2 a 5. En una realizacion espedfica, la elastasa se dispone en citrato de sodio 20 mM, pH 5. Las fracciones eluidas se analizan entonces opcionalmente por uno, mas de uno, o todos los siguientes procedimientos: (1) espectrofotometna a A280 para determinar la concentracion, (2) SDS-PAGE para evaluar la pureza, (3) ensayo de actividad, por ejemplo, ensayo de SLAP, para evaluar la actividad de elastasa espedfica, y (4) HIC-HPLC para detectar elastasa madura y variantes del extremo N, y se reunen fracciones con caractensticas adecuadas (por ejemplo, actividad espedfica aceptable, niveles aceptablemente bajos (preferentemente ausencia) de glucoformas detectables, y niveles aceptablemente bajos (preferentemente ausencia) de variantes del extremo N detectables).
Una vez se ha obtenido elastasa madura purificada, la enzima activa puede llevarse a una disolucion adecuada para liofilizacion. En general, la protema elastasa puede ponerse en un tampon de 1 X solucion salina tamponada con fosfato (“PBS”) (cloruro sodico 137 mM, fosfato de sodio 10 mM, fosfato de potasio 2,7 mM a pH 7,4) antes de la liofilizacion. En ciertas realizaciones, la protema elastasa puede ponerse en un tampon de 0,1 X PBS (cloruro sodico 13,7 mM, fosfato de sodio 1,0 mM, fosfato de potasio 0,27 mM a pH 7,4) antes de la liofilizacion.
La expresion de una secuencia de proelastasa puede dar en algunos casos una mezcla de protemas proelastasas y elastasas maduras. Asf, la presente invencion proporciona una composicion que comprende tanto una protema proelastasa como una protema elastasa madura.
5.5 COMPOSICIONES FARMACEUTICAS
Las protemas elastasas maduras de la invencion pueden incorporarse en composiciones farmaceuticas adecuadas para administracion. Tales composiciones normalmente comprenden la protema elastasa y componentes farmaceuticamente inertes, por ejemplo, un vehmulo farmaceuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, esta previsto que el termino “vehmulo farmaceuticamente aceptable” incluya todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y que retrasan la absorcion, y similares, compatibles con la administracion farmaceutica. Tambien se contemplan como componentes farmaceuticamente inertes excipientes, vehmulos, cargas, aglutinantes, disgregantes, disolventes, agentes solubilizantes y colorantes convencionales. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmaceuticamente activas es muy conocido en la tecnica. Excepto en tanto que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con una protema elastasa madura, se contempla el uso del mismo en las composiciones. Tambien pueden incorporarse compuestos activos suplementarios en las composiciones.
Por consiguiente, ciertos aspectos de la presente invencion se refieren a composiciones farmaceuticas. En las realizaciones espedficas, la presente invencion proporciona una composicion que comprende (i) una cantidad terapeuticamente eficaz de una elastasa tipo I humana madura y (ii) un veldculo farmaceuticamente aceptable. La elastasa tipo I humana madura que puede usarse en la composicion incluye, pero no se limita a, las protemas de SEC ID N°: 1, 4, 5, 84, 87. La elastasa tipo I humana madura puede contener cualquiera de las combinaciones de polimorfismos expuestas en la Tabla 3 anterior.
En otras realizaciones, la presente invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende (i) una cantidad terapeuticamente eficaz de elastasa tipo I humana madura, (ii) un vehmulo farmaceuticamente aceptable, composicion farmaceutica que esta libre de tripsina, o fragmentos de tripsina. En otras realizaciones, la composicion farmaceutica esta sustancialmente libre de tripsina o fragmentos de tripsina. Como se usa en el presente documento, el termino “libre de tripsina” se refiere a una composicion en la que la tripsina no se usa en ninguna porcion del procedimiento de produccion. Como se usa en el presente documento, el termino “sustancialmente libre
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de tripsina” se refiere a una composicion en la que la tripsina esta presente a un porcentaje final (es decir, peso de tripsina/peso de la composicion total) de no mas de aproximadamente el 0,0025% o mas preferentemente, menos del aproximadamente el 0,001% en una base en peso/peso. Como se usa en el presente documento, el termino “libre de” tripsina se refiere a una composicion en la que la variante es indetectable, por ejemplo, por medio de un ensayo enzimatico o ELISA.
En ciertos aspectos, una composicion de la invencion tiene menos actividad de tripsina que el equivalente de 3 ng/ml de tripsina como se mide por un ensayo de BENZ, preferentemente menos actividad de tripsina que el equivalente de 2,5 ng/ml de tripsina como se mide por un ensayo de BENZ, e incluso mas preferentemente menos actividad de tripsina que el equivalente de 2 ng/ml de tripsina como se mide por un ensayo de BENZ. En una realizacion espedfica, la presente invencion proporciona una composicion que comprende una cantidad terapeuticamente eficaz de protema elastasa en la que la actividad de tripsina es el equivalente de menos de 1,6 ng/ml de tripsina como se mide por un ensayo de BENZ. Ejemplos de composiciones de elastasa con menos actividad de tripsina que el equivalente de 1,6 ng/ml de tripsina como se mide por un ensayo de BENZ se proporcionan en el Ejemplo 8 mas adelante. En ciertas realizaciones, los ng/ml de actividad de tripsina pueden ensayarse en una composicion de elastasa tipo I humana lfquida o preparacion que contiene 1 mg/ml de protema elastasa tipo I humana. Asf, las actividades de tripsina tambien pueden describirse en terminos de miligramos de protema elastasa, por ejemplo, menos de 3 ng de actividad de tripsina/mg de protema elastasa, menos de 1,56 ng de actividad de tripsina/mg de protema elastasa, etc.
La presente invencion proporciona ademas composiciones farmaceuticas que estan tanto libres como sustancialmente libres de variantes del extremo N no deseables de elastasa madura. Variantes del extremo N no deseables incluyen, pero no se limitan a, variantes producidas por escision en el enlace peptfdico que es el extremo C con respecto a cualquiera de los residuos en las posiciones P5, P4, P3, P2, P’1, P’2, P’3, P’4, P’6 y/o P’9. Ciertas variantes del extremo N no deseables se producen por activacion de tripsina; otras se producen por autoactivacion de secuencias de proelastasa que no contienen secuencias de activacion optimizadas.
En ciertas realizaciones, la composicion farmaceutica esta libre o sustancialmente libre de una, mas de una o todas las variantes del extremo N de elastasa madura que incluyen, pero no se limitan a, SEC ID N°: 2, 3, 37, 38, 70, 71, 85, 86, 94, 95, 104, 105, 106, 107, 108. En ciertas realizaciones, la presente invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende (i) una cantidad terapeuticamente eficaz de elastasa tipo I humana madura, (ii) un vehmulo farmaceuticamente aceptable, composicion farmaceutica que esta libre o sustancialmente libre de cualquier protema con SEC ID N°: 2, 3, 37, 38, 70, 71, 85, 86, 94, 95, 104, 105, 106, 107 o 108. En otras realizaciones, la composicion farmaceutica esta sustancialmente libre de variantes del extremo N de elastasa madura que incluyen, pero no se limitan a, SEC ID N°: 2, 3, 37, 38, 70, 71, 85, 86, 94, 95, 104, 105, 106, 107 o 108. Como se usa en el presente documento, el termino “libre de” una variante particular se refiere a una composicion en la que la variante es indetectable, por ejemplo, por medio de ensayo de HPLC de intercambio cationico, ensayo de HPLC de interaccion hidrofoba o espectrometna de masas combinada con cromatograffa de lfquidos. Como se usa en el presente documento, el termino “sustancialmente libre” se refiere a una composicion en la que la variante del extremo N esta presente a un porcentaje final (es decir, peso de la variante del extremo N/peso de la composicion total) de al menos menos de aproximadamente el 0,5%. En ciertas realizaciones preferidas, la composicion que esta sustancialmente libre de variante del extremo N es una composicion en la que la concentracion de variante del extremo N es menos de aproximadamente el 0,1% o menos de aproximadamente el 0,01 % o, mas preferentemente, incluso menos de aproximadamente el 0,001% en una base en peso/peso. En ciertos aspectos, la presencia de variantes del extremo N se detecta por medio de ensayo de HPLC de intercambio cationico, ensayo de HPLC de interaccion hidrofoba o espectrometna de masas combinada con cromatograffa de lfquidos.
En ciertas realizaciones espedficas, una composicion farmaceutica que esta libre de variantes del extremo N de SEC ID N°: 70, 71, 104 y 105 se produce por activacion de una proelastasa que no contiene una arginina en la posicion P1 y/o una alanina en la posicion P2.
En otras realizaciones, la presente invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende (i) una cantidad terapeuticamente eficaz de elastasa tipo I humana madura, (ii) un vehmulo farmaceuticamente aceptable, composicion farmaceutica que esta sustancialmente libre de protemas bacterianas y/o esta sustancialmente libre de protemas de mairnfero distintas de dicha elastasa tipo I humana madura. Como se usa en el presente documento, la expresion “sustancialmente libre de protemas de nam^ero” o “sustancialmente libre de protemas bacterianas” se refiere a una composicion en la que tales protemas estan presentes a un porcentaje final (es decir, peso de protemas de mam^era (distintas de elastasa y, opcionalmente, una protema portadora tal como albumina) o protemas bacterianas/peso de composicion total) de al menos menos de aproximadamente el 0,5%. En ciertas realizaciones preferidas, la composicion que esta sustancialmente libre de tales protemas es una composicion en la que la concentracion de la protema no deseable es menos de aproximadamente el 0,1% o menos de aproximadamente el 0,01%, o, mas preferentemente, incluso menos de aproximadamente el 0,001% en una base en peso/peso.
En ciertos aspectos, una composicion farmaceutica que esta “libre de protemas de mam^fero” (distintas de elastasa) contiene elastasa que se produce a partir de una lmea celular recombinante que no es una celula de mam^era y en
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la que ninguna protema con una secuencia de mairnfero o sustancialmente una secuencia de mairnfero esta presente en cualquier porcion del procedimiento de produccion. En ciertos aspectos, una composicion farmaceutica que esta “libre de protemas bacterianas” contiene elastasa que se produce a partir de una lmea celular recombinante que no es una celula bacteriana y en la que ninguna protema con una secuencia bacteriana o sustancialmente una secuencia bacteriana esta presente en cualquier porcion del procedimiento de produccion.
Las elastasas tipo I humanas maduras (incluyendo variantes) de la invencion estan lo mas preferentemente purificadas para su uso en composiciones farmaceuticas. En las realizaciones espedficas, las elastasas tienen al menos el 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% de pureza. En otras realizaciones espedficas, las elastasas tienen hasta el 98%, 98,5%, 99%, 99,2%, 99,5% o el 99,8% de pureza.
Para formular en composiciones farmaceuticas, las elastasas tipo I humanas maduras de la invencion tienen preferentemente una actividad espedfica de mas de mas de 1, mas de 5, mas de 10, mas de 20, mas de 25 o mas de 30 U/mg de protema, como se ha determinado midiendo la tasa de hidrolisis del sustrato de peptidos pequenos N-succinil-Ala-Ala-Ala-p-Nitroanilida (SLAP), que se cataliza mediante la adicion de elastasa. Una unidad de actividad se define como la cantidad de elastasa que cataliza la hidrolisis de 1 micromol de sustrato por minuto a 30 °C y la actividad espedfica se define como actividad por mg de protema elastasa (U/mg). Preferentemente, una composicion farmaceutica comprende una elastasa tipo I humana madura que tiene una actividad espedfica dentro de un intervalo en el que el lfmite inferior es 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15 o 20 U/mg de protema y en el que el lfmite superior es, independientemente, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 o 50 U/mg de protema. En realizaciones a modo de ejemplo, la actividad espedfica esta en el intervalo de 1-40 U/mg de protema, 1-5 U/mg de protema, 2-10 U/mg de protema, 4-15 U/mg de protema, 5-30 U/mg de protema, 10-20 U/mg de protema, 20-40 U/mg de protema, o cualquier intervalo cuyos lfmites superior e inferior esten seleccionados de cualquiera de los valores anteriores.
Las composiciones farmaceuticas de la invencion son preferentemente estables. En realizaciones espedficas, una composicion farmaceutica (por ejemplo, una composicion farmaceutica preparada por liofilizacion anteriormente) mantiene al menos el 50%, mas preferentemente al menos el 60%, y lo mas preferentemente al menos el 70% de su actividad espedfica despues de una semana, mas preferentemente despues de un mes, todavfa mas preferentemente despues de 3 meses, y lo mas preferentemente despues de 6 meses de almacenamiento a 4 °C. En las realizaciones espedficas, la composicion farmaceutica mantiene al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90% o al menos el 95% de su actividad espedfica despues de una semana, mas preferentemente despues de un mes, todavfa mas preferentemente despues de 3 meses, y lo mas preferentemente despues de 6 meses de almacenamiento a 4 °C.
Una composicion farmaceutica de la invencion se formula para ser compatible con su via de administracion prevista. Los procedimientos para administrar elastasas para tratar o prevenir enfermedades de conductos biologicos se describen en los documentos WO 2001/21574; WO 2004/073504; y WO 2006/036804. La via de administracion mas preferida es parenteral, por ejemplo, administracion directa a la pared del vaso, que incluye administracion local a la superficie adventicia externa de vasos quirurgicamente expuestos y administracion local a la pared de vasos usando un cateter de administracion de farmaco. Las disoluciones o suspensiones usadas para administracion parenteral pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente esteril tal como agua para inyeccion, solucion salina, solucion salina tamponada con fosfato, azucares tales como sacarosa o dextranos, aceites no volatiles, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol, polisorbato-80 (tambien conocido como Tween-80), u otros disolventes sinteticos; agentes antibacterianos tales como metilparabenos; antioxidantes tales como acido ascorbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como acido etilendiaminatetraacetico; tampones tales como fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro sodico o dextrosa. El pH puede ajustarse con acidos o bases, tales como acido clorlddrico o hidroxido sodico. La preparacion parenteral puede encerrarse en ampollas, jeringuillas desechables o viales de dosis unica o multiples dosis hechos de vidrio o plastico. La preparacion parenteral tambien puede encerrarse en un cateter de administracion de farmaco. En todos los casos, la composicion debe ser esteril.
En realizaciones espedficas, una composicion farmaceutica de la invencion es una formulacion lfquida que comprende uno o mas de los siguientes excipientes: dextrosa (por ejemplo, 2-10% en peso/volumen); lactosa (por ejemplo, 2-10% en peso/volumen); manitol (por ejemplo, 2-10% en peso/volumen); sacarosa (por ejemplo, 2-10% en peso/volumen); trehalosa (por ejemplo, 2-10% en peso/volumen); acido ascorbico (por ejemplo, 2-10 mM); cloruro de calcio (por ejemplo, 4-20 mM); dextrano-70 (por ejemplo, 2-10% en peso/volumen); poloxamero 188 (por ejemplo, 0,2-1% en peso/volumen); polisorbato-80 (por ejemplo, 0,001-5% en peso/volumen, mas preferentemente 0,1-5%); glicerina (por ejemplo, 0,2-5% en peso/volumen); arginina (por ejemplo, 2-10% en peso/volumen); glicina (por ejemplo, 2-10% en peso/volumen); dextrano-44 (por ejemplo, 2-10% en peso/volumen); y dextrano-18 (por ejemplo, 2-10% en peso/volumen). En ciertas realizaciones, la concentracion, individualmente o en el agregado, de dextrosa, lactosa, manitol, sacarosa, trehalosa, dextrano-70, glicerina, arginina, glicina, dextrano-44 o dextrano-18 esta dentro de un intervalo en el que el lfmite inferior es el 2,5, 4, 5 o el 7% en peso/volumen y en el que el lfmite superior es, independientemente, el 4, 5, 6, 8 o el 10% en peso/volumen.
Una formulacion lfquida puede prepararse anadiendo agua a una formulacion seca que contiene una protema elastasa madura, uno o mas tampones reactivos y/o uno o mas excipientes. La formulacion seca puede prepararse liofilizando una disolucion que comprende protema elastasa madura, uno o mas reactivos tampon, y/o uno o mas
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excipientes.
Una formulacion Ifquida puede prepararse, por ejemplo, reconstituyendo protemas elastasas liofilizadas de la invencion con agua esterilizada o una disolucion de tampon. Ejemplos de una disolucion de tampon incluyen disoluciones esteriles de solucion salina o solucion salina tamponada con fosfato. En una realizacion espedfica, despues de la reconstitucion de una formulacion seca que comprende protema elastasa madura a la concentracion de protema deseada, la disolucion contiene aproximadamente cloruro sodico 137 mM, fosfato de potasio 2,7 mM, fosfato de sodio 10 mM (una concentracion de solucion salina tamponada con fosfato que se considera 1X) y el pH de la disolucion es aproximadamente 7,4. En ciertos aspectos, la formulacion seca que comprende protema elastasa madura tambien contiene iones sodio, cloruro y fosfato en cantidades de forma que solo se necesite agua para la reconstitucion.
Una formulacion lfquida tambien puede prepararse, por ejemplo, reconstituyendo protemas elastasas liofilizadas con una disolucion de tampon que contiene uno o mas excipientes. Ejemplos de excipientes incluyen polisorbato-80 y dextrano. En una realizacion espedfica, despues de la reconstitucion de una formulacion seca que comprende protema elastasa madura a la concentracion deseada de protema, la disolucion resultante contiene aproximadamente cloruro sodico 137 mM, fosfato de potasio 2,7 mM, fosfato de sodio 10 mM, 0,01% de polisorbato- 80, y el pH de la disolucion es aproximadamente 7,4. El uno o mas excipientes pueden mezclarse con la protema elastasa madura antes de la liofilizacion o despues de la liofilizacion, pero antes de la reconstitucion. Asf, en ciertos aspectos, la formulacion seca que comprende protema elastasa madura tambien contiene excipientes tales como polisorbato-80 o dextrano.
En ciertos aspectos, la presente invencion proporciona una formulacion lfquida que comprende: 0,001-50 mg/ml de protema elastasa madura en una disolucion de cloruro sodico 137 mM, fosfato de potasio 2,7 mM, fosfato de sodio 10 mM y que comprende 5-10%, mas preferentemente 6-9%, de un excipiente seleccionado de dextrosa, lactosa, manitol, sacarosa, trehalosa, dextrano-70, glicerina, arginina, glicina, dextrano-44 o dextrano-18.
En una realizacion espedfica, la presente invencion proporciona una formulacion lfquida que comprende: 0,001-50 mg/ml de protema elastasa madura en una disolucion de cloruro sodico 137 mM, fosfato de potasio 2,7 mM, fosfato de sodio 10 mM con un pH de 7,4.
En otra realizacion espedfica, la presente invencion proporciona una formulacion lfquida que comprende: 0,001-50 mg/ml de protema elastasa madura en una disolucion de cloruro sodico 137 mM, fosfato de potasio 2,7 mM, fosfato de sodio 10 mM y que comprende 0,01% de polisorbato-80, con un pH de 7,4.
En otra realizacion espedfica, la presente invencion proporciona una formulacion lfquida que comprende: 0,001-50 mg/ml de protema elastasa madura en una disolucion de cloruro sodico 137 mM, fosfato de potasio 2,7 mM, fosfato de sodio 10 mM y que comprende 0,01% de polisorbato-80 y 8% de dextrano-18, con un pH de 7,4.
En otra realizacion espedfica, la presente invencion proporciona una formulacion lfquida que comprende: 0,001-50 mg/ml de protema elastasa madura en una disolucion de cloruro sodico 137 mM, fosfato de potasio 2,7 mM, fosfato de sodio 10 mM y que comprende 8% de dextrano-18, con un pH de 7,4.
Las formulaciones lfquidas de la invencion preferentemente contienen una concentracion final de protemas elastasas maduras dentro de un intervalo en el que el lfmite inferior es 0,1, 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 15 o 20 mg/ml y en el que el lfmite superior es, independientemente, 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000 o 1500 mg/ml.
En ciertos aspectos, la presente invencion proporciona una formulacion lfquida que comprende: 0,0001-500 mg/ml (mas preferentemente 1-100 mg/ml, y todavfa mas preferentemente 0,5-20 mg/ml) de protema elastasa madura en una disolucion de 0,5X PBS-1,5X PBS (mas preferentemente 1X PBS), comprendiendo la disolucion 5-10% (mas preferentemente 6-9%) de un excipiente seleccionado de dextrosa, lactosa, manitol, sacarosa, trehalosa, dextrano- 70, glicerina, arginina, glicina, dextrano-44 o dextrano-18 y que tiene un pH de 6,5 - 8,5. En una realizacion espedfica, la formulacion lfquida comprende 0,5 mg/ml de protema elastasa madura y 8% de dextrano-18 8 en 1X PBS, pH 7,4. En una realizacion espedfica, la formulacion lfquida comprende 5 mg/ml de protema elastasa madura y 8% de dextrano-18 en 1X PBS, pH 7,4.
Una formulacion lfquida de la invencion tiene preferentemente una osmolalidad dentro de un intervalo en el que el lfmite inferior es 100, 125, 150, 175, 200, 250 o 275 mOsm/kg y en el que el lfmite superior es, independientemente, 500, 450, 400, 350, 325, 300, 275 o 250 mOsm/kg. En realizaciones espedficas, la osmolaridad de una formulacion lfquida de la invencion preferentemente tiene una osmolalidad de aproximadamente 125 a 500 mOsm/kg, mas preferentemente de aproximadamente 275 a 325 mOsm/kg, por ejemplo, como se mide por el procedimiento de depresion del punto de congelacion.
Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales, tales como composiciones que pueden prepararse en las formulaciones lfquidas de la invencion, en forma unitaria de dosificacion para facilidad de la administracion y uniformidad de la dosificacion. La forma unitaria de dosificacion como se usa en el presente
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documento se refiere a unidades ffsicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto que va a tratarse; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de protema elastasa madura calculada para producir el efecto terapeutico deseado en asociacion con el vehmulo farmaceutico requerido.
Como se define en el presente documento, una cantidad terapeuticamente eficaz de protema elastasa madura (es decir, una dosificacion eficaz) oscila de aproximadamente 0,0033 mg - 200 mg. Para vasos con menor diametro y paredes mas delgadas, tales como aquellas en una fistula arteriovenosa radiocefalica, se prefieren dosis mas pequenas (tales como de 0,0033 mg - 2,0 mg). Para vasos con mayor diametro y paredes mas gruesas tales como arterias femorales se prefieren mayores dosis (tales como 2,05 - 100 mg).
En ciertas realizaciones, las composiciones farmaceuticas pueden incluirse en un recipiente, envase, dispensador o cateter. En otras realizaciones mas, las composiciones farmaceuticas pueden incluirse en un recipiente, envase, dispensador o cateter junto con instrucciones para administracion. Las instrucciones para administracion pueden incluirse en forma impresa tanto dentro de como sobre un recipiente, envase, dispensador o cateter. Alternativamente, las instrucciones para administracion pueden incluirse tanto dentro de como sobre un recipiente, envase, dispensador o cateter en forma de una referencia a otro documento impreso o accesible por internet que proporciona las instrucciones.
En ciertas realizaciones, las composiciones farmaceuticas pueden incluirse en un recipiente, envase o dispensador. En otras realizaciones mas, las composiciones farmaceuticas pueden incluirse en un recipiente, envase o dispensador junto con instrucciones para administracion. Las instrucciones para administracion pueden incluirse en forma impresa tanto dentro de como sobre un recipiente, envase o dispensador. Alternativamente, las instrucciones para administracion pueden incluirse tanto dentro de como sobre un recipiente, envase o dispensador en forma de una referencia a otro documento impreso o accesible por internet que proporciona las instrucciones.
La invencion incluye procedimientos para preparar composiciones farmaceuticas. Una vez se produce una elastasa madura segun la invencion, puede liofilizarse y guardarse hasta que se reconstituya en una formulacion farmaceutica adecuada para administracion. En una realizacion a modo de ejemplo, la presente invencion proporciona un procedimiento de aislamiento de una elastasa tipo I humana madura liofilizada que comprende: (a) cultivar una celula huesped, tal como una celula huesped de Pichia pastoris, manipulada para expresar una molecula de acido nucleico que codifica un marco de lectura abierto de preproelastasa en condiciones en las que el marco de lectura abierto se expresa, en el que dicho marco de lectura abierto comprende secuencias de nucleotidos que codifican en una direccion de 5’ a 3’, (i) un peptido senal operable en Pichia pastoris; (ii) una secuencia de activacion que comprende una secuencia de reconocimiento de elastasa; y (iii) la secuencia de protema elastasa tipo I madura, produciendo asf una protema proelastasa; (b) someter la protema proelastasa a condiciones de autoactivacion, produciendo asf una elastasa tipo I madura, en el que las condiciones de autoactivacion incluyen, por ejemplo: (i) cambiar el pH de una disolucion que contiene la protema proelastasa, por ejemplo, a un pH de 6,5-11, preferentemente 8-9; o (ii) purificar la protema proelastasa, por ejemplo, por cromatograffa de intercambio ionico, y someter la disolucion a amplia conversion para eliminar variantes del extremo N, produciendo asf elastasa tipo I humana madura; (c) opcionalmente, purificar la elastasa tipo I humana madura, por ejemplo, etapa de cromatograffa de intercambio ionico para cromatograffa de pulimento; y (d) liofilizar la elastasa tipo I madura, aislando asf una elastasa tipo I humana madura liofilizada. La elastasa tipo I madura es preferentemente una elastasa tipo I humana. En ciertos aspectos, la elastasa tipo I madura liofilizada tiene preferentemente mas del 95% de pureza; en las realizaciones espedficas, la elastasa tipo I madura liofilizada tiene mas del 98% o mas del 99% de pureza.
La protemas elastasas maduras de la invencion pueden formularse en composiciones farmaceuticas. Asf, en una realizacion a modo de ejemplo, la presente invencion proporciona un procedimiento de generacion de una composicion farmaceutica que comprende una elastasa tipo I humana madura, comprendiendo dicho procedimiento (i) aislar una elastasa tipo I humana madura liofilizada segun los procedimientos descritos anteriormente (por ejemplo, en la Seccion 5.4); y (ii) reconstituir la elastasa tipo I humana madura liofilizada en un vehmulo farmaceuticamente aceptable.
5.6 DOSIS EFICAZ
La presente invencion generalmente proporciona el beneficio de administracion parenteral, preferentemente local, de protemas elastasas recombinantes, solas o en combinacion con otros agentes, para tratar o prevenir enfermedad en conductos biologicos.
En ciertas realizaciones, como una alternativa a la administracion parenteral, puede usarse la administracion por via oral de agentes para tratar o prevenir enfermedad en conductos biologicos.
La toxicidad y eficacia terapeutica de las protemas elastasas utilizadas en la practica de los procedimientos de la invencion puede determinarse mediante procedimientos farmaceuticos convencionales en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50% de la poblacion) y la DE50 (la dosis terapeuticamente eficaz en el 50% de la poblacion). La relacion de dosis entre efectos toxicos y terapeuticos es el mdice terapeutico y puede expresarse como la relacion DL50/DE50. Tal informacion puede usarse
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para determinar con mas exactitud dosis utiles en seres humanos.
5.7 PROCEDIMIENTOS DE ADMINISTRACION
La invencion se refiere a composiciones farmaceuticas que comprenden novedosas protemas elastasas y procedimientos de uso de las mismas para prevenir o tratar enfermedad en conductos biologicos. Tales composiciones farmaceuticas pueden formularse de un modo convencional como se describe en la Seccion 5.5 anterior.
La composiciones de elastasa de la presente invencion pueden administrarse al segmento deseado del conducto biologico que esta tratandose por un dispositivo conocido para un experto en la materia por ser aceptable para la administracion de disoluciones a la pared de una arteria o vena, por ejemplo, una jeringuilla, un cateter de administracion de farmaco, una aguja de administracion de farmaco, un polfmero de administracion de farmaco implantado, tal como una preparacion de hoja o microesfera, un cateter implantable o una protesis endovascular recubierta de polfmero, preferentemente una protesis endovascular autoexpansora.
En ciertas realizaciones, la administracion al segmento deseado puede guiarse por visualizacion directa, ultrasonidos, TAC, orientacion fluoroscopica, RMN u orientacion endoscopica.
En ciertos aspectos de la presente invencion, la administracion de una elastasa a un conducto biologico comprende aplicar una formulacion lfquida de elastasa directamente a la superficie adventicia externa de una arteria o vena quirurgicamente expuesta. En aspectos espedficos de la presente invencion, la administracion se realiza con una jeringuilla.
En ciertos aspectos de la presente invencion, la administracion de una elastasa a un conducto biologico comprende localizar un aparato de administracion en estrecha proximidad al segmento del conducto biologico que va a tratarse. En algunas realizaciones, durante la administracion de la protema elastasa por un aparato de administracion, una parte del aparato de administracion puede insertarse en la pared del conducto biologico. En algunas realizaciones, la luz del conducto biologico puede presurizarse mientras que la protema elastasa se administra al segmento presurizado del conducto biologico. En algunas realizaciones, la luz del conducto biologico se presuriza por accion mecanica. En algunas realizaciones, la luz del conducto biologico se presuriza con un cateter con globo. En algunas realizaciones, la presion se aplica a la pared interna del conducto biologico por un miembro autoexpansor que es parte de un cateter o dispositivo. En algunas realizaciones, la protema elastasa se administra y la presurizacion se realiza por el mismo dispositivo. En algunas realizaciones, el conducto biologico esta quirurgicamente expuesto y la protema elastasa se administra a la luz o se aplica a la superficie externa del conducto biologico in vivo. En las realizaciones que implican administracion luminal, la circulacion sangumea a traves del vaso puede detenerse con una pinza o para permitir que la elastasa se ponga en contacto con la pared del vaso durante periodos de tiempo prolongados y para prevenir la inhibicion de la elastasa por suero. En algunas realizaciones, el conducto biologico se extrae quirurgicamente y la elastasa se administra a la superficie luminal y/o a la superficie externa del conducto in vitro. El conducto tratado puede entonces, en ciertas realizaciones, devolverse al cuerpo.
En otros aspectos de la presente invencion, la administracion de una elastasa a un conducto biologico implica el uso de una formulacion de polfmero que se coloca como protesis endovascular dentro del vaso que va a tratarse, una pinza o tira aplicada a la superficie externa del conducto biologico, o una envoltura sobre o alrededor del vaso que va a tratarse, u otros dispositivo en, alrededor de o proximos al vaso que va a tratarse.
En todavfa otros aspectos de la presente invencion, una elastasa se inyecta percutaneamente en una region de tejido con el fin de dilatar las arterias y/o vena dentro de esa region, que incluye arterias colaterales. En otros aspectos, una elastasa se inyecta percutaneamente directamente en la pared de una arteria o vena o en los tejidos de alrededor con el fin de dilatar un segmento espedfico del vaso. En las realizaciones que tienen como objetivo el tratamiento de vasos del corazon, una protema elastasa puede tanto administrarse percutaneamente al espacio pericardico como aplicarse directamente a vasos coronarios quirurgicamente expuestos.
Los dispositivos medicos que pueden usarse para administrar las protemas elastasas de la invencion a vasos sangumeos se describen en la Seccion 5.9 mas adelante.
5.8 KITS
La presente invencion proporciona kits para poner en practica los procedimientos de la presente invencion. Un kit “terapeutico” de la invencion comprende en uno o mas recipientes uno o mas de los agentes descritos en el presente documento como utiles para tratar o prevenir enfermedad en conductos biologicos, opcionalmente junto con cualquier agente que facilite su administracion. Un kit alternativo de la invencion, el kit de “fabricacion”, comprende en uno o mas recipientes uno o mas de los agentes descritos en el presente documento como utiles para la preparacion de protemas elastasas recombinantes.
El kit terapeutico de la invencion puede comprender opcionalmente componentes adicionales utiles para realizar los
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procedimientos de la invencion. A modo de ejemplo, el kit terapeutico puede comprender vehmulos farmaceuticos utiles para formular los agentes de la invencion. El kit terapeutico tambien puede comprender un dispositivo o un componente de un dispositivo para realizar los procedimientos terapeuticos de la invencion, por ejemplo, una jeringuilla o aguja. Tambien se contempla la inclusion de dispositivos tales como cateteres para inyeccion intramural o perivascular o cateteres para inyeccion intraluminal en los kits terapeuticos. En ciertas realizaciones, los agentes de la invencion pueden proporcionarse en forma de dosis unitaria. Ademas, o alternativamente, los kits de la invencion pueden proporcionar un material de instrucciones que describe el cumplimiento de uno o mas procedimientos de la invencion, o un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricacion, uso o venta de productos farmaceuticos o productos biologicos, aviso que refleja la autorizacion por la agencia de fabricacion, uso o venta para administracion humana. Los materiales de instruccion pueden incluirse en forma impresa tanto dentro de como sobre uno o mas recipientes del kit. Alternativamente, los materiales de instruccion pueden incluirse tanto dentro de como sobre uno o mas recipientes del kit en forma de una referencia a otro documento impreso o accesible por internet que proporciona los materiales de instruccion.
En realizaciones espedficas, un kit de la invencion comprende un dispositivo medico como se describe en la Seccion 5.9 mas adelante.
El kit de fabricacion de la invencion puede comprender opcionalmente componentes adicionales utiles para realizar los procedimientos de la invencion.
5.9 DISPOSITIVOS MEDICOS UTILES PARA LA ADMINISTRACION DE PROTEINAS ELASTASAS
En el presente documento se proporcionan dispositivos medicos que pueden usarse para administrar las protemas elastasas de la presente invencion a un conducto biologico, tal como una arteria o vena. Tales dispositivos se describen mas adelante y en la solicitud provisional n° 61/025.084, presentada el 31 de enero de 2008, la solicitud provisional n° 61/025.463, presentada el 1 de febrero de 2008, y la solicitud provisional n° 61/075.710, presentada el 25 de junio de 2008.
Las protemas elastasas de la presente invencion tambien pueden administrarse a conductos biologicos mediante cateteres convencionales.
En una realizacion, un dispositivo medico util para administracion de protemas elastasas tiene un eje longitudinal central, y comprende uno o mas activadores, en el que el uno o mas activadores pueden existir en una configuracion restringida en la que una longitud de dicho uno o mas activadores esta orientada sustancialmente paralela al eje longitudinal de dicho dispositivo medico y una configuracion sin restringir en la que al menos una parte de la longitud de dicho uno o mas activadores esta orientada sustancialmente no paralela al eje longitudinal central del dispositivo. Despues de colocar el dispositivo en un sitio diana adyacente a la pared de un conducto biologico, uno o mas activadores (y si se desea, todos los activadores) pueden liberarse de una configuracion restringida y se permite que adopten una configuracion sin restringir, haciendo asf contacto con la pared del conducto biologico. El uno o mas activadores pueden ser de cualquier forma, y en las realizaciones preferidas, el movimiento del uno o mas activadores de la configuracion restringida a la configuracion sin restringir se produce tras la liberacion de una fuerza limitante por el cirujano del dispositivo, pero sin la contribucion por el cirujano de cualquier fuerza deformante al dispositivo o el tejido diana.
En una primera realizacion espedfica, mostrada en la Figura 22, el dispositivo es un cateter 10 de administracion de lfquido que comprende uno o mas activadores que estan formados como un par de chavetas 12, 14 alargadas, cuyas regiones intermedias son moviles entre una configuracion restringida que esta orientada sustancialmente paralela al eje 15 longitudinal central del montaje de cateter y una configuracion sin restringir en la que al menos una parte del par de chavetas esta orientada sustancialmente no paralela a dicho eje longitudinal central (veanse las porciones izquierda I y derecha D de las longitudes de chaveta en la Figura 23). La una o mas chavetas 12, 14 pueden construirse como bandas o alambres alargados que tienen cada uno extremos proximales y distales opuestos. En una realizacion preferida, las chavetas tienen superficies 24, 26 interiores enfrentadas planas y superficies 28, 30 exteriores orientadas opuestas planas. En esta realizacion, las chavetas 12, 14 pueden convertirse entre posiciones restringidas y posiciones sin restringir, como se muestra respectivamente en las Figuras 22 y 23. En una realizacion, el par de chavetas esta posicionado espalda contra espalda en sus configuraciones restringidas como se muestra en la Figura 22.
El cateter 10 comprende ademas uno o mas penetradores 16, 18 de tejido asegurados a una o mas superficies de la una o mas chavetas 12, 14, un componente 20 del cateter central que tiene una longitud alargada y un componente 22 del cateter exterior que puede proteger el penetrador o penetradores de tejido durante el movimiento del cateter dentro del conducto biologico.
Los penetradores 16, 18 de tejido pueden construirse de cualquier material adecuado. Ejemplos preferidos de tales materiales incluyen, pero no se limitan a, mquel, aluminio, acero y aleaciones de los mismos. En una realizacion espedfica, los penetradores de tejido se construyen de nitinol.
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El componente 20 del cateter central y el componente 22 del cateter exterior pueden construirse de materiales normalmente empleados en la construccion de cateteres. Ejemplos de tales materiales incluyen, pero no se limitan a, silicona, poliuretano, nailon, Dacron y PEBAX™.
Los activadores estan preferentemente construidos de un material resistente flexible. En una realizacion preferida, el material resistente flexible puede restringirse tras la aplicacion de una fuerza limitante, por ejemplo, cuando los activadores estan en la configuracion restringida, y adoptar su forma original sin restringir cuando la fuerza limitante se elimina, por ejemplo, cuando los activadores estan en la configuracion sin restringir. Puede usarse cualquier material resistente flexible tal, que incluye, pero no se limita a, acero quirurgico, aluminio, polipropileno, materiales olefrnicos, poliuretano y otros materiales de caucho o plastico sinteticos. El uno o mas activadores estan construidos lo mas preferentemente de un material con memoria de forma. Ejemplos de tales materiales con memoria de forma incluyen, pero no se limitan a, aleaciones de cobre-cinc-aluminio-mquel, aleaciones de cobre-aluminio-mquel y aleaciones de mquel-titanio (NiTi). En una realizacion preferida, el material con memoria de forma es nitinol. En una realizacion preferida, cuando el par de chavetas asume la configuracion sin restringir, las propiedades de memoria de forma del material a partir del cual se forma cada chaveta hacen que las chavetas, sin la aplicacion de ninguna fuerza deformante externa, se inclinen radialmente separandose en un unico plano como se muestra en la Figura 23.
Una o mas de las chavetas (y preferentemente cada una de las chavetas) tiene un conducto 32, 34 de administracion de fluido flexible que se extiende a lo largo de la longitud de la chaveta, o dentro de la chaveta, como se muestra en la Figura 24. A medida que las chavetas 12, 14 se mueven de sus configuraciones restringidas rectas a sus configuraciones sin restringir inclinadas, los conductos 32, 34 de administracion de fluido tambien se mueven de configuraciones rectas a configuraciones inclinadas. En una realizacion, los conductos 32, 34 de administracion de fluido son conductos tubulares separados que estan asegurados a lo largo de las longitudes del par de chavetas 12, 14. En otra realizacion, los conductos de administracion de fluido son conductos formados en o dentro del material de las chavetas.
Una o mas de las chavetas (y preferentemente cada una de las chavetas 12,14) tambien se forma con una via 36, 38 de cremallera que se extiende a lo largo de una longitud de la chaveta (Figura 24). Las vfas 36, 38 de cremallera estan formadas de tanto el mismo material que las chavetas 12, 14 como de un material que se flexiona con las chavetas 12, 14.
Uno o mas de los penetradores 16, 18 de tejido esta asegurado a las superficies 28, 30 exteriores del par de chavetas 12, 14 (Figura 24). Los penetradores 16, 18 de tejido estan conectados a y se comunican con los conductos 32, 34 de administracion de fluido que se extienden a lo largo de las longitudes de las chavetas 12, 14. Los penetradores 16, 18 de tejido estan posicionados para sobresalir sustancialmente perpendiculares de las superficies 28, 30 exteriores de las chavetas 12, 14. Los penetradores 16, 18 de tejido tienen perforaciones interiores huecas que se comunican con los conductos 32, 34 de administracion de fluido de las chavetas. Los extremos distales de los penetradores de tejido tienen puertos de administracion de fluido que se comunican con las perforaciones interiores de los penetradores de tejido.
El dispositivo permite la administracion de fluidos en o traves de una o mas capas distintas de una pared de un conducto biologico, por ejemplo, una pared vascular. La pared vascular comprende numerosas estructuras y capas, que incluyen la capa endotelial y la capa de membrana basal (conjuntamente la capa de la mtima), la lamina elastica interna, la capa media y la capa adventicia. Estas capas estan dispuestas de forma que el endotelio se exponga a la luz del vaso y la membrana basal, la lamina elastica interna, la media y la adventicia estan cada una sucesivamente dispuestas en capas sobre el endotelio, como se describe en la publicacion de solicitud de EE.UU. n° 2006/0189941A1. Con los dispositivos medicos de la presente invencion, la profundidad a la que los penetradores 16, 18 de tejido pueden penetrar se determina por la longitud de cada penetrador 16, 18 de tejido. Por ejemplo, si la capa diana es la capa adventicia, se usan penetradores 16, 18 de tejido que tienen una longitud definida suficiente para la penetracion a la profundidad de la capa adventicia con utilizacion del dispositivo. Asimismo, si la capa diana es la capa media, se usan penetradores 16, 18 de tejido que tienen una longitud definida suficiente para la penetracion a la profundidad de la capa media con utilizacion del dispositivo.
En realizaciones espedficas, la longitud de los penetradores 16, 18 de tejido puede oscilar de aproximadamente 0,3 mm a aproximadamente 5 mm para aplicaciones vasculares, o hasta aproximadamente 20 mm o incluso 30 mm para aplicaciones que implican otros espacios biologicos o conductos, por ejemplo, en aplicaciones colonicas. Los penetradores 16, 18 de tejido tienen preferentemente un diametro de aproximadamente 0,2 mm (33 de calibre) a aproximadamente 3,4 mm (10 de calibre), mas preferentemente 0,2 mm a 1,3 mm (aproximadamente 33 a 21 de calibre). Las puntas distales de los penetradores de tejido pueden tener un bisel estandar, un bisel corto o un bisel corto real. En una realizacion alternativa, los penetradores de tejido unidos a una chaveta cualquiera no son de longitudes identicas, pero pueden configurarse de forma que sus extremos distales se alineen de manera que sean equidistantes de la pared del conducto biologico cuando el dispositivo medico esta en la posicion sin restringir, por ejemplo, durante uso.
El componente 20 del cateter central tiene una longitud alargada con extremos proximales y distales opuestos, mostrado a la izquierda y derecha respectivamente en la Figura 22. En una realizacion, el componente 20 del cateter
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central tiene una superficie exterior cilmdrica que se extiende a lo largo de su longitud alargada. Los extremos proximales de las chavetas 12, 14 estan unidos, por ejemplo, soldados o pegados, al extremo distal del componente 20 del cateter central, mientras que los extremos distales de las chavetas 12, 14 estan unidos, por ejemplo, soldados o pegados, a una punta 40 grna del cateter. La punta 40 tiene una superficie exterior suave que se disena para moverse facilmente en el conducto biologico. Una perforacion 48 de alambre grna se extiende a lo largo de la longitud del cateter 20 central y la punta 40. La perforacion de alambre grna esta dimensionada para recibir un alambre grna en ajuste deslizante a traves de la perforacion.
Un par de luces 44, 46 de administracion de fluido se extienden a traves del interior del componente 20 del cateter central durante la longitud entera del componente de cateter (Figura 25). En el extremo distal del componente 20 del cateter central el par de luces 44, 46 de administracion de fluido se comunica con el par de conductos 32, 34 de administracion de fluido que se extienden a lo largo de las longitudes de las chavetas 12, 14 hacia los penetradores 16, 18 de tejido. Una perforacion 48 de alambre grna tambien se extiende a traves del interior del componente 20 del cateter central desde el extremo proximal al extremo distal del componente del cateter central (Figura 25). El extremo proximal del componente 20 del cateter central esta provisto de un par de conos 50, 52 de Luer (Figura 22). En una realizacion, cada uno de los conos 50, 52 de Luer se comunica con una de las luces 44, 46 de administracion de fluido que se extienden a traves de la longitud del cateter central. Cada cono 50, 52 de Luer se disena para conectarse con una fuente de administracion de fluido para comunicar un fluido a traves de cada cono 50, 52 de Luer, luego mediante cada luz 44, 46 de administracion de fluido que se extiende a traves del componente 20 del cateter central, luego a traves de cada conducto 32, 34 de administracion de fluido que se extiende a lo largo de las longitudes del par de chavetas 12, 14, y luego a traves de los penetradores 16, 18 de tejido asegurados a cada una del par de chavetas. En otra realizacion, cada cono 50, 52 de Luer se comunica independientemente con ambas luces 44, 46 de administracion de fluido que se extienden a traves de la longitud del componente del cateter central. En esta configuracion, un primer fluido puede administrarse a traves de un primer cono de Luer a ambos penetradores 16, 18 de tejido y un segundo fluido puede administrarse a traves de un segundo cono de Luer a ambos penetradores 16, 18 de tejido. La administracion de fluido a ambos penetradores de tejido de cada cono de Luer puede lograrse por un conducto independiente que se extiende de cada cono de Luer a un deposito 61 comun distal como se muestra en la Figura 32. Este deposito se comunica con ambos penetradores 16, 18 de tejido. Alternativamente, en otra realizacion, el dispositivo medico de la presente invencion comprende solo un unico cono de Luer conectado a una unica luz de administracion que se extiende a traves del cateter central, que entonces esta unido a un deposito comun distal, que permite la administracion de un unico fluido a ambos penetradores 16, 18 de tejido.
El componente 22 del cateter exterior tiene una configuracion tubular que rodea el par de chavetas 12, 14 y la mayona del cateter 20 central (Figura 22). El componente 22 del cateter tiene una longitud alargada que se extiende entre los extremos proximales y distales opuestos del componente de cateter mostrado a la izquierda y derecha, respectivamente en la Figura 22. El extremo distal del componente de cateter esta dimensionado para ajustarse en un ajuste seguro con la punta 40 grna, en la que la superficie exterior de la punta 40 se fusiona con la superficie exterior del componente 22 del cateter cuando el extremo distal del componente de cateter se engancha con la punta. La configuracion tubular del componente 22 del cateter esta dimensionada de manera que una superficie interior del componente 22 del cateter se separe hacia afuera de la pluralidad de penetradores 16, 18 de tejido sobre el par de chavetas 12, 14 en las posiciones restringidas del par de chavetas. El extremo proximal del cateter 20 central se extiende mas alla del extremo proximal del componente 22 del cateter cuando el extremo distal del componente de cateter se engancha con la punta 40 grna del cateter.
Se proporciona una conexion 54 mecanica entre el extremo proximal del componente 22 del cateter exterior y el extremo proximal del componente 20 del cateter central que permite que el componente del cateter exterior se mueva hacia atras a lo largo de las longitudes del par de chavetas 12, 14 y el componente 20 del cateter central haciendo que el extremo distal del componente 22 del cateter exterior se separe de la punta 40 grna y pase sobre el par de chavetas 12, 14, y hacia delante sobre la longitud del componente 20 del cateter central y sobre las longitudes del par de chavetas 12, 14 para enganchar el extremo distal del componente 22 del cateter exterior con la punta 40 (Figura 22). La conexion 54 mecanica podna proporcionarse por un asa o boton que desliza manualmente el componente 22 del cateter exterior sobre el componente 20 del cateter central. La conexion 54 tambien podna proporcionarse por una rueda selectora o mecanismo activador. Ademas, la conexion 54 podna proveerse de un indicador audible o tactil (tal como que haga clic) del movimiento gradual del componente 22 del cateter exterior con respecto al componente 20 del cateter central.
En una realizacion, el componente 22 del cateter exterior esta provisto de un unico recorrido 56 de cremallera que se extiende a lo largo de la longitud entera de un lado del componente 22 del cateter exterior sobre la superficie interior del componente de cateter exterior (Figura 24). El recorrido 56 de cremallera en el interior del componente 22 del cateter exterior se engancha en un ajuste deslizante con las vfas 36, 38 de cremallera a un lado de cada una de las chavetas 12, 14. Avanzando el componente 22 del cateter exterior hacia delante a lo largo de las longitudes del componente 20 del cateter central y el par de chavetas 12, 14 hacia la punta 40 grna del montaje de cateter se provoca que el recorrido 56 de cremallera del componente de cateter exterior se deslice a lo largo de las vfas 36, 38 del par de chavetas 12, 14. Esto mueve el par de chavetas 12, 14 de su configuracion sin restringir inclinada, mostrada en la Figura 23, hacia su configuracion restringida espalda contra espalda mostrada en la Figura 22. El
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enganche de las vfas 36, 38 de la chaveta en el recorrido 56 de cremallera del componente 22 del cateter exterior sujeta el par de chavetas 12, 14 en sus posiciones relativas espalda contra espalda mostradas en la Figura 22. Con el componente 22 del cateter exterior avanzado sobre el componente 20 del cateter central y el par de chavetas 12, 14 hacia donde el extremo distal del componente 22 del cateter exterior se engancha con la punta 40 grna, los penetradores 16, 18 de tejido se cubren y el montaje de cateter de la presente invencion puede moverse con seguridad hacia adelante o hacia atras en un conducto biologico. El componente 22 del cateter exterior cubre los penetradores 16, 18 de tejido que sobresalen del par de chavetas 12, 14 y el enganche del componente 22 del cateter exterior con la punta 40 grna distal provee al montaje de cateter de una superficie exterior suave que facilita la insercion del montaje de cateter en y a traves de un conducto biologico tal como un vaso sangumeo. En otra realizacion, el componente 22 del cateter exterior esta provisto de dos recorridos de cremallera a 180 grados entre sf que se extienden a lo largo de la longitud entera del componente 22 del cateter exterior sobre la superficie interior y las chavetas tienen vfas en ambos lados.
Se usa un alambre 58 grna con el montaje de cateter (Figura 22). El alambre 58 grna se extiende a traves de la perforacion 48 de alambre grna del componente del cateter central, a lo largo de las chavetas 12, 14, y a traves de la salida 42 de la punta grna. En ciertas realizaciones, el alambre 58 grna tiene un nucleo solido, por ejemplo, acero inoxidable o nitinol superelastico. El alambre grna puede construirse de material radiopaco, tanto en su totalidad como en sus porciones distales (por ejemplo, el mas distal 1 mm a 25 mm o el mas distal 3 mm a 10 mm). El alambre 58 grna puede recubrirse opcionalmente con un recubrimiento medicamente inerte tal como TEFLON®.
En uso de este dispositivo, el alambre 58 grna se posiciona en el conducto biologico mediante procedimientos muy conocidos en la tecnica. El alambre 58 grna se extiende desde el conducto biologico, a traves de la salida 42 del alambre grna en la punta 40 del montaje, a traves del cateter 22 de proteccion exterior, pasados los penetradores 16, 18 de tejido, y a traves de la perforacion de alambre 48 grna del cateter 20 central. En otras realizaciones, el montaje de cateter es un montaje de cateter de intercambio rapido, en el que la luz del alambre grna esta presente en el extremo distal de la punta 40 grna del cateter, pero no se extiende a traves de toda la longitud entera del dispositivo medico.
Despues de posicionar el alambre grna, el dispositivo se hace avanzar en el conducto biologico a lo largo del alambre 58 grna previamente posicionado. Uno o mas marcadores radiopacos pueden proporcionarse opcionalmente sobre el dispositivo para monitorizar la posicion del dispositivo en el conducto biologico. Cualquier material que prevenga el paso de radiacion electromagnetica se considera radiopaco y podna usarse. Materiales radiopacos preferidos incluyen, pero no se limitan a, platino, oro o plata. El material radiopaco puede recubrirse sobre la superficie de toda o una parte de la punta 40, sobre toda o parte de las chavetas 12, 14 u otros activadores, sobre el alambre 58 grna, o sobre alguna combinacion de las estructuras anteriores. Alternativamente, un anillo de material radiopaco puede unirse a la punta 40. El dispositivo puede proveerse opcionalmente de obtencion de imagenes a bordo, tal como ultrasonidos intravascular o tomograffa de coherencia optica. La punta del dispositivo puede proveerse opcionalmente de optica que se usa para determinar la posicion del dispositivo o caractensticas del conducto biologico de alrededor.
Cuando el dispositivo esta en su posicion deseada en el conducto biologico, el cirujano usa la conexion 54 mecanica para retirar el componente 22 del cateter exterior hacia atras lejos de la punta 40 grna. En una realizacion preferida, a medida que el componente 22 del cateter exterior se extrae de encima de los penetradores 16, 18 de tejido, el recorrido 56 de cremallera del componente 22 del cateter exterior se extrae sobre las vfas 36, 38 del par de chavetas 12, 14. Este movimiento libera el par de chavetas 12, 14 de su configuracion restringida, espalda contra espalda, mostrada en la Figura 22, y permite que el material con memoria de forma de las chavetas 12, 14 adopte sus configuraciones inclinadas sin restringir mostradas en la Figura 23. A medida que las chavetas 12, 14 se mueven a sus configuraciones inclinadas sin restringir, las chavetas se ponen en contacto con la superficie interna de la(s) pared(es) del conducto biologico y los penetradores 16, 18 de tejido sobre las superficies 28, 30 exteriores de las chavetas 12, 14 se presionan sobre la superficie interior del conducto biologico en la posicion del dispositivo.
Despues de que los penetradores 16, 18 de tejido hayan entrado en la capa deseada de la pared de un conducto biologico, puede administrarse un fluido a traves de las luces 44, 46 de administracion de fluido en el componente 20 del cateter central, a traves de los conductos 32, 34 de administracion de fluido sobre el par de chavetas 12, 14 y a traves de los penetradores 16, 18 de tejido. Cuando se completa la administracion de fluido, el cirujano usa la conexion 54 mecanica para mover el componente 22 del cateter exterior (que tambien puede denominarse un componente protector) hacia delante sobre el componente 20 del cateter central y sobre el par de chavetas 12, 14 hacia la punta 40 grna. A medida que el componente 22 del cateter exterior se mueve hacia delante sobre el par de chavetas 12, 14, el recorrido 56 de cremallera sobre el interior del componente 22 del cateter exterior pasa sobre las vfas 36, 38 en el par de chavetas 12, 14, haciendo que las chavetas 12, 14 se muevan de nuevo de su configuracion inclinada sin restringir a su configuracion restringida. Cuando el componente 22 del cateter exterior ha avanzado en su totalidad sobre el par chavetas 12, 14 y se engancha de nuevo con la punta 40 grna, el recorrido 56 de cremallera en el componente 22 del cateter exterior contiene las chavetas 12, 14 en su configuracion restringida. El dispositivo puede entonces volver a posicionarse para liberacion en otra localizacion en el conducto biologico u otro conducto biologico, o sacarse del cuerpo.
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La forma y longitud de las chavetas 12, 14 estan seleccionadas de forma que diversas realizaciones del dispositivo puedan usarse en espacios biologicos o conductos de diversos tamanos o diametros. En ciertas realizaciones, las chavetas pueden ser planas o redondeadas. Las chavetas planas tienen preferentemente una anchura que oscila de aproximadamente 0,2 mm a aproximadamente 20 mm, una altura que oscila de aproximadamente 0,2 mm a aproximadamente 5 mm y una longitud que oscila de aproximadamente 10 mm a aproximadamente 200 mm, dependiendo de la aplicacion particular. Las chavetas redondeadas tienen preferentemente un diametro que oscila de aproximadamente 0,2 mm a aproximadamente 20 mm y una longitud que oscila de aproximadamente 10 mm a aproximadamente 200 mm, dependiendo de la aplicacion particular. En las realizaciones espedficas, las chavetas planas tienen 3,5 mm a 5 mm, 5 mm a 10 mm, 10 mm a 15 mm, 15 mm a 20 mm de anchura, o cualquier intervalo en su interior (por ejemplo, 3,5 mm a 10 mm); 3,5 mm a 5 mm, 5 mm a 10 mm, 10 mm a 15 mm, 15 mm a 20 mm en altura, o cualquier intervalo en su interior (por ejemplo, 3,5 mm a 10 mm); y 10 mm a 20 mm, 20 mm a 40 mm, 40 mm a 80 mm, 80 mm a 120 mm, 120 mm a 150 mm o 150 a 200 mm de longitud, o cualquier intervalo en su interior (por ejemplo, 10 mm a 40 mm), o cualquier permutacion de lo anterior (por ejemplo, una anchura de 5 mm a 10 mm, una altura o 3,5 a 5 mm, y una longitud de 20 a 40 mm). En otras realizaciones, las chavetas redondeadas tienen 3,5 mm a 5 mm, 5 mm a 10 mm, 10 mm a 15 mm, 15 mm a 20 mm de diametro, o cualquier intervalo en su interior (por ejemplo, 3,5 mm a 10 mm) y 10 mm a 20 mm, 20 mm a 40 mm, 40 mm a 80 mm, 80 mm a 120 mm, 120 mm a 150 mm o 150 a 200 mm de longitud, o cualquier intervalo en su interior (por ejemplo, 10 mm a 40 mm), o cualquier permutacion de lo anterior (por ejemplo, un diametro de 5 mm a 10 mm y una longitud de 20 a 40 mm).
En una segunda realizacion espedfica, mostrada en la Figura 27, el dispositivo de la presente invencion es un cateter 110 de administracion de lfquido que comprende un componente 112 del cateter central que tiene una longitud alargada con un eje 113 longitudinal, uno o mas (y preferentemente dos) activadores resistentes flexibles que, en esta realizacion espedfica, se forman como tubos 114, 116 de presentacion del penetrador de tejido que se extienden desde la porcion distal del componente 112 del cateter central. Al menos una parte de los tubos 114, 116 de presentacion de tejido son moviles entre una configuracion restringida que esta orientada sustancialmente paralela al eje 113 longitudinal central del montaje de cateter y una configuracion sin restringir que esta orientada sustancialmente no paralela al eje 113 longitudinal central del cateter.
El cateter comprende ademas uno o mas (y preferentemente dos) penetradores 118, 120 de tejido alargados flexibles que se extienden a traves de los dos tubos 114, 116 de presentacion del penetrador de tejido y un tubo 122 de utilizacion exterior que se extiende sobre porciones de las longitudes del componente 112 del cateter central, los tubos 114, 116 de presentacion del penetrador de tejido y la via 132 intermedia.
El componente 112 del cateter central y el tubo 122 de utilizacion exterior pueden construirse de cualquier material adecuado para construir cateteres. Ejemplos de tales materiales incluyen, pero no se limitan a, silicona, poliuretano, nailon, Dacron y PEBAX™.
Los penetradores 118, 120 de tejido se conectan con conos 166, 168 respectivos (Figura 31). Uno o mas del par de penetradores 118, 120 de tejido tiene preferentemente un diametro de aproximadamente 0,2 mm (33 de calibre) a aproximadamente 3,4 mm (10 de calibre), mas preferentemente 0,8 mm a 1,3 mm (aproximadamente 18 a 21 de calibre). Uno o mas del par de penetradores de tejido puede tener un bisel convencional, un bisel corto o un bisel corto real. El par de penetradores 118, 120 de tejido estan preferentemente construidos de materiales que permiten que los penetradores de tejido se flexionen a lo largo de sus longitudes. Ejemplos de tales materiales incluyen, pero no se limitan a, mquel, aluminio, acero y aleaciones de los mismos. En una realizacion espedfica, los penetradores de tejido se construyen de nitinol. La longitud completa de los penetradores 118, 120 de tejido puede construirse de un unico material, o los extremos distales (por ejemplo, el distal 1 mm al distal 20 mm), que incluyen las puntas 156, 158, de los penetradores 118, 120 de tejido, pueden construirse de un material y conectarse a los conos 166, 168 respectivos mediante un tubo construido de un material diferente, por ejemplo, plastico.
Uno o mas del par de tubos 114, 116 de presentacion del penetrador de tejido esta preferentemente construido de un material resistente flexible. Tal material resistente flexible puede deformarse, por ejemplo, cuando los tubos 114, 116 de presentacion del penetrador de tejido estan en la configuracion restringida recta de la Figura 27, pero vuelve a su forma original cuando se retira la fuerza de deformacion, por ejemplo, cuando los tubos 114, 116 de presentacion del penetrador de tejido estan en la configuracion sin restringir curva mostrada en la Figura 28. Puede usarse cualquier material resistente flexible tal, que incluye, pero no se limita a, acero quirurgico, aluminio, polipropileno, materiales olefrnicos, poliuretano y otros materiales de caucho o plastico sinteticos. El par de tubos 114, 116 de presentacion del penetrador de tejido esta construido lo mas preferentemente de un material con memoria de forma. Ejemplos de tales materiales con memoria de forma incluyen, pero no se limitan a, aleaciones de cobre-cinc-aluminio-mquel, aleaciones de cobre-aluminio-mquel y aleaciones de mquel-titanio (NiTi). En una realizacion preferida, el material con memoria de forma es nitinol.
El componente 112 del cateter central tiene un longitud alargada flexible con extremos proximal 124 y distal 126 opuestos (Figura 27). El extremo 126 distal del componente del cateter central esta formado como una punta grna que tiene una configuracion de forma exterior que guiara el extremo 126 distal a traves de un conducto biologico. Una perforacion de alambre grna 128 dentro de la via 132 intermedia se extiende a traves del centro 112 del cateter central desde el extremo 124 proximal hasta el extremo 126 distal. La perforacion 128 del alambre grna recibe un
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alambre 130 grna alargado flexible para movimiento deslizante de la perforacion 128 sobre el alambre (Figura 29). El alambre 130 grna se usa para guiar el montaje de cateter a traves de un conducto biologico. En ciertas realizaciones, el alambre 130 grna tiene un nucleo solido, por ejemplo, acero inoxidable o nitinol superelastico. El alambre grna puede construirse opcionalmente de material radiopaco, tanto en su totalidad como en sus porciones distales (por ejemplo, la mas distal 1 mm a 25 mm o la mas distal 1 mm a 3 mm). El alambre 130 grna puede recubrirse opcionalmente con un recubrimiento medicamente inerte tal como TEFLON@. En otras realizaciones, el montaje de cateter es un montaje de cateter de intercambio rapido en el que un alambre grna se posiciona sobre el extremo distal de la punta 126 grna y se extiende a partir del mismo.
Una via 132 intermedia estrecha que rodea la perforacion 128 del alambre grna se extiende desde la punta grna del extremo 126 distal del cateter hacia el extremo 124 proximal del cateter. La via 132 intermedia conecta la punta 126 grna con una porcion 138 base del componente del cateter central.
La porcion 138 base del componente del cateter central tiene una superficie exterior cilmdrica que se extiende a lo largo de la longitud entera de la porcion base. La porcion 138 base se extiende a lo largo de la mayona de la longitud total del componente 112 del cateter central. Como se muestra en la Figura 29, la perforacion 128 de alambre grna se extiende a traves del centro de la porcion 138 base del componente del cateter central. Ademas, un par de luces 140, 142 de penetrador de tejido tambien se extienden a traves de la longitud de la porcion 138 base del componente del cateter central junto a la perforacion 128 de alambre grna. En el extremo 124 proximal del componente del cateter central, un par de puertos 144, 146 comunican el par de luces 140, 142 con el exterior del componente 112 del cateter central (Figura 27).
En una realizacion alternativa, el dispositivo medico de la Figura 27 tambien puede comprender un unico activador resistente flexible que se forma como tubo de presentacion del penetrador de tejido, un unico penetrador de tejido alargado flexible que se extiende a traves del tubo de presentacion del penetrador de tejido y conecta con un cono, y un tubo de utilizacion exterior que se extiende sobre porciones de las longitudes del componente del cateter central, el tubo de presentacion del penetrador de tejido y la via intermedia.
El par de primer y segundo tubos 114, 116 de presentacion del penetrador de tejido sobresalen de la porcion 138 base del componente de cateter central hacia el extremo 126 distal del cateter. Cada uno de los tubos de presentacion del penetrador de tejido esta formado como un tubo alargado estrecho que tiene un extremo proximal que esta asegurado a la porcion 138 base del componente del cateter central, y un extremo 148, 150 distal opuesto. Cada uno del primer y segundo tubos 114, 116 de presentacion del penetrador de tejido tiene una perforacion 152, 154 interior que se comunica con la primera luz 140 del penetrador de tejido y segunda luz 142 del penetrador de tejido respectiva en la porcion 138 base del componente del cateter central.
Como se muestra en las Figuras 29 y 30, las configuraciones exteriores de los tubos 114, 116 de presentacion del penetrador de tejido coinciden con la via 132 intermedia de manera que las longitudes de los tubos 114, 116 de presentacion del penetrador de tejido puedan posicionarse lado a lado sobre lados opuestos de la via 132 intermedia. Los extremos 148, 150 distales del tubo del penetrador de tejido pueden formarse como superficies de la punta grna que tambien facilitan el paso del cateter a traves de un sistema vascular. Los extremos 148, 150 distales del tubo del penetrador de tejido son preferentemente mas largos en diametro que los tubos 114, 116 de presentacion del penetrador de tejido. En una realizacion espedfica, las puntas 148, 150 distales del tubo del penetrador de tejido son puntas redondeadas y bulbosas. Tales puntas son atraumaticas y los tubos no perforaran involuntariamente la pared de un conducto biologico. Las puntas 148, 150 se exponen y no se extienden hacia afuera mas alla del diametro de la punta 126 grna.
Cada uno de los tubos 114, 116 del penetrador de tejido esta preferentemente construido de un material con memoria de forma, tal como nitinol. Los tubos 114, 116 se forman con configuraciones sin restringir curvas, mostradas en la Figura 28. Los tubos 114, 116 se mueven a las configuraciones sin restringir curvas mostradas en la Figura 28 cuando no se aplica fuerza limitante contra los tubos. Con el fin de que los tubos 114, 116 de presentacion se encuentren en configuraciones restringidas rectas a lo largo de la via 132 intermedia, debe aplicarse una fuerza limitante a los tubos para mantenerlos en sus posiciones restringidas rectas mostradas en la Figura 27. Como cada uno de los tubos 114, 116 se mueve de su configuracion restringida recta mostrada en la Figura 28 a su configuracion sin restringir curva mostrada en la Figura 28, las perforaciones 152, 154 del penetrador de tejido que se extienden a traves de los tubos tambien se mueven de configuraciones rectas a configuraciones curvas.
El par de penetradores 118, 120 de tejido, desde sus puntas distales hasta los conos 166, 168, tienen longitudes que son ligeramente mas largas que las longitudes combinadas de las luces 140, 142 del penetrador de tejido que se extienden a traves de la porcion 138 base del cateter central y las perforaciones 152, 154 de penetrador de tejido que se extienden a traves de los tubos 114, 116 de presentacion del penetrador de tejido. Las puntas 156, 158 de los penetradores 118, 120 de tejido estan posicionadas adyacentes a los extremos 148, 150 distales de los tubos 114, 116 de presentacion del penetrador de tejido y estan posicionadas dentro de los orificios 152, 154 de los tubos en la configuracion restringida de la Figura 27. Los extremos proximales opuestos de los penetradores 118, 120 de tejido sobresalen a traves de los puertos 144, 146 112 laterales del cateter central. El par de penetradores 118, 120 de tejido estan dimensionados para deslizarse facilmente a traves de las luces 140, 142 del penetrador de tejido del
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componente 112 del cateter central y las perforaciones 152, 154 del penetrador de tejido de los tubos 114, 116 de presentacion del penetrador de tejido. Los puertos 144, 146 laterales del componente 112 del cateter central estan preferentemente a angulos de 20° a 90° con respecto al extremo 124 proximal del cateter central, lo mas preferentemente a angulos de 30° a 60° con respecto al extremo 124 proximal del cateter central.
Un par de movimientos manuales del cirujano a los controladores 162, 164 de movimiento lineal pueden conectarse a los extremos proximales de los penetradores 118, 120 de tejido y pueden asegurarse a los puertos 144, 146 del cateter central (Figura 31). Los controladores 162, 164 pueden construirse para convertir movimiento del cirujano en movimiento lineal controlado de los penetradores 118, 120 de tejido a traves de las luces 140, 142 del penetrador de tejido del cateter central y a traves de las perforaciones 152, 154 del tubo de presentacion del penetrador de tejido. En una realizacion, hay controladores 162, 164 giratorios que pueden moverse manualmente en una direccion, de forma que las puntas 156, 158 de inyeccion del penetrador de tejido en los extremos distales del penetrador de tejido puedan posicionarse de forma ajustable para extender una longitud deseada fuera de las perforaciones 152, 154 de tubos del penetrador de tejido en los extremos 148, 150 distales de tubos del penetrador de tejido. Girando los controladores en la direccion opuesta, los penetradores 118, 120 de tejido pueden retirarse en las perforaciones 152, 154 de tubos del penetrador de tejido. Cada uno de los movimientos del cirujano a los controladores 162, 164 de movimiento lineal puede proveerse de un cono 166, 168 que se comunica con la perforacion interior que se extiende a traves de los penetradores 118, 120 de tejido y puede usarse para conectar una jeringuilla o tubo que contiene una disolucion de un agente de diagnostico o terapeutico.
El tubo 122 de utilizacion exterior tiene una longitud tubular que rodea el cateter 112 central, los tubos 114, 116 de presentacion del penetrador de tejido y la via 132 intermedia. El tubo 122 de utilizacion puede estar montado sobre el componente 112 del cateter central y el par de tubos 114, 116 de presentacion del penetrador de tejido para el movimiento de deslizamiento a una posicion directa del tubo 122 de utilizacion en la que un extremo 172 distal abierto del tubo de utilizacion esta posicionado adyacente a los extremos 148, 150 distales de los tubos 114, 116 de presentacion del penetrador de tejido como se muestra en la Figura 27, y una posicion trasera del tubo 122 de utilizacion en el que el extremo 172 distal del tubo esta posicionado adyacente a la conexion de los tubos 114, 116 de presentacion del penetrador de tejido con el componente 112 del cateter central como se muestra en la Figura 28. El extremo 174 proximal opuesto del tubo 122 de utilizacion puede proveerse de una conexion 176 mecanica al cateter 112 central. La conexion 176 mecanica permite que el tubo 122 de utilizacion se mueva entre sus posiciones delantera y trasera con respecto al cateter 112 central y los tubos 114, 116 de presentacion del penetrador de tejido (Figuras 27 y 28). Una conexion tal podna proporcionarse por una rueda selectora, una conexion de deslizamiento, un boton de accionamiento o pulsador, o alguna otra conexion que sea manualmente operable para hacer que el tubo 122 de utilizacion se mueva con respecto al cateter 112 central y los tubos 114, 116 de presentacion. Cuando el tubo 122 de utilizacion se mueve a su posicion delantera mostrada en la Figura 27, el extremo 172 distal del tubo pasa sobre las longitudes de los tubos 114, 116 de presentacion del penetrador de tejido y mueve los tubos de presentacion a sus posiciones restringidas que se extienden a lo largo de los lados opuestos de la via 132 intermedia del cateter central. Cuando el tubo 122 de utilizacion se mueve a su posicion trasera mostrada en la Figura 28, el extremo 172 distal del tubo de utilizacion se retira sobre la longitud de los tubos 114, 116 de presentacion del penetrador de tejido y gradualmente permite que los tubos 114, 116 de presentacion liberen su energfa restringida y se muevan a sus configuraciones sin restringir curvas mostradas en la Figura 28.
En uso del cateter 110, el tubo 122 de utilizacion esta en la posicion delantera mostrada en la Figura 27. El alambre 130 grna esta posicionado en un conducto biologico (tal como una arteria o vena) de una manera conocida. El cateter se hace avanzar entonces en el conducto biologico sobre el alambre grna. El alambre 130 grna se extiende desde el conducto biologico, y entra en el extremo 126 distal del componente del cateter central a traves de la luz 128 del alambre grna. El alambre 130 pasa a traves de la longitud 112 del cateter central y sale en el extremo proximal del componente del cateter central adyacente a los puertos 144, 146 de cateter, en los que el alambre 130 grna puede manipularse manualmente.
El cateter 110 puede avanzarse a traves del conducto biologico y puede guiarse por el alambre 130 grna. Opcionalmente pueden proporcionarse marcadores radiopacos sobre el montaje para monitorizar la posicion del montaje en el conducto biologico. Cualquier material que prevenga el paso de radiacion electromagnetica se considera radiopaco y puede usarse. Materiales radiopacos utiles incluyen, pero no se limitan a, platino, oro o plata. El material radiopaco puede recubrirse sobre la superficie de toda o una parte de la punta 126, sobre todo o parte de los tubos 114, 116 de presentacion, sobre todo o parte de los penetradores 118, 120 de tejido, sobre el alambre 130 grna, o sobre cualquier combinacion de las estructuras anteriores. Alternativamente, un anillo de material radiopaco puede unirse a la punta 126. El montaje puede proveerse opcionalmente de obtencion de imagenes a bordo, tales como ultrasonidos intravascular o tomograffa de coherencia optica. La punta del montaje puede opcionalmente proveerse de optica que es util para determinar la posicion del montaje o las caractensticas del conducto biologico de alrededor. Cuando el montaje esta en una posicion deseada, el tubo 122 de utilizacion exterior puede moverse de su posicion delantera mostrada en la Figura 27 hacia su posicion trasera mostrada en la Figura 28 por manipulacion manual de la mecanica 176 de conexion.
A medida que el tubo 122 de utilizacion se saca de sobre el par de tubos 114, 116 de presentacion del penetrador de tejido, la energfa restringida de los tubos 114, 116 de presentacion del penetrador de tejido se libera y los tubos se
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mueven hacia sus configuraciones curvas sin restringir mostradas en la Figura 28. Este movimiento posiciona las perforaciones 152, 154 del penetrador de tejido en los extremos 148, 150 distales de los tubos del penetrador de tejido contra las superficies interiores del conducto biologico en el que se ha insertado el montaje 110.
El movimiento del cirujano a los controladores 162, 164 de movimiento lineal puede entonces operarse manualmente para extender los extremos 156, 158 distales del penetrador de tejido desde las perforaciones del penetrador 152, 154 de tejido en los extremos 148, 150 distales de los tubos de presentacion del penetrador de tejido. Puede proporcionarse un calibre en cada uno de los movimientos del cirujano a los controladores 162, 164 de movimiento lineal que proporciona una indicacion visual del grado de proyeccion de las puntas 156, 158 del penetrador de tejido desde los extremos 148, 150 de los tubos del penetrador de tejido a medida que giran los controladores 162, 164. Los controladores tambien podnan proporcionar un sonido audible o sensacion tactil tal como hacer clic para indicar etapas de distancia gradual de los movimientos del penetrador de tejido. Esto utiliza las puntas 156, 158 del penetrador de tejido una distancia deseada en las paredes del conducto biologico.
En una tercera realizacion espedfica, un dispositivo medico de la presente invencion es un cateter de administracion de lfquido que comprende uno o mas penetradores de tejido construidos de un material resistente flexible. En ciertos aspectos, el dispositivo medico de la presente invencion tiene un eje longitudinal central, y comprende uno o mas penetradores de tejido, en el que el uno o mas penetradores de tejido pueden existir en una configuracion restringida en la que una longitud de dicho uno o mas penetradores de tejido esta orientada sustancialmente paralela al eje longitudinal de dicho dispositivo medico y una configuracion sin restringir en la que al menos una parte de la longitud de dicho uno o mas penetradores de tejido esta orientada sustancialmente no paralela al eje longitudinal central del dispositivo. Despues de posicionarse el dispositivo en un sitio diana adyacente a la pared de un conducto biologico, uno o mas penetradores de tejido (y si se desea, todos los penetradores de tejido) pueden liberarse de una configuracion restringida y permitirse que adopten una configuracion sin restringir, haciendo asf contacto con la pared del conducto biologico. El uno o mas penetradores de tejido pueden ser de cualquier forma, y en las realizaciones preferidas, el movimiento de uno o mas penetradores de tejido de la configuracion restringida a la configuracion sin restringir se produce tras la liberacion de una fuerza por el cirujano del dispositivo, pero sin la contribucion por el cirujano de cualquier fuerza deformante al dispositivo o el tejido diana.
En una realizacion preferida, los penetradores de tejido se construyen de material resistente flexible que puede restringirse tras la aplicacion de una fuerza limitante, por ejemplo, cuando los penetradores de tejido estan en la configuracion restringida, y adoptan su forma sin restringir original cuando la fuerza limitante se elimina, por ejemplo, cuando los penetradores de tejido estan en la configuracion sin restringir. Puede usarse cualquier material resistente flexible tal, que incluye, pero no se limita a, acero quirurgico, aluminio, polipropileno, materiales olefrnicos, poliuretano y otros materiales de caucho o plastico sinteticos. El uno o mas penetradores de tejido estan construidos lo mas preferentemente de un material con memoria de forma. Ejemplos de tales materiales con memoria de forma incluyen, pero no se limitan a, aleaciones de cobre-cinc-aluminio-mquel, aleaciones de cobre-aluminio-mquel y aleaciones de mquel-titanio (NiTi). En una realizacion preferida, el material con memoria de forma es nitinol. En una realizacion preferida, cuando los penetradores de tejido asumen la configuracion sin restringir, las propiedades de memoria de forma del material del que se forma cada penetrador de tejido hacen que los penetradores de tejido, sin la aplicacion de ninguna fuerza deformante externa, se muevan de una posicion sustancialmente paralela al eje longitudinal del dispositivo medico a una posicion sustancialmente perpendicular al eje longitudinal del dispositivo medico.
En una realizacion preferida, los penetradores de tejido se mantienen en la configuracion restringida por un componente de cateter exterior que tiene una configuracion tubular que rodea los penetradores de tejido. Se proporciona una conexion mecanica entre el componente de cateter exterior y el componente del cateter central al que estan unidos los penetradores de tejido. La conexion mecanica permite que el componente de cateter exterior se mueva hacia atras a lo largo de la longitud del componente del cateter central, destapandose asf los restringidos uno o mas penetradores de tejido y permitiendo que el uno o mas penetradores de tejido asuman una configuracion sin restringir en la que hacen contacto con el sitio de administracion diana. Un experto habitual en la materia apreciana que esta realizacion espedfica puede adaptarse facilmente para incorporar marcadores radiopacos para facilitar el posicionamiento del dispositivo o caractensticas de rapido intercambio para facilitar el uso del dispositivo.
El dispositivo medico de la presente invencion, en sus diversas realizaciones, permite la administracion de fluidos a distintas capas de una pared vascular. La pared vascular consiste en numerosas estructuras y capas, estructuras y capas, que incluyen la capa endotelial y la capa de la membrana basal (conjuntamente la capa de la mtima), la lamina elastica interna, la capa media y la capa adventicia. Estas capas estan dispuestas de forma que el endotelio se exponga a la luz del vaso y la membrana basal, la mtima, la lamina elastica interna, la media y la adventicia estan cada uno sucesivamente dispuestas en capas sobre el endotelio, como se describe en la publicacion de solicitud de EE.UU. n° 2006/0189941A1. Con los dispositivos medicos de la presente invencion, la profundidad a la que las puntas 156, 158 del penetrador de tejido pueden penetrar en el tejido diana puede controlarse girando los controladores 162, 164. Por ejemplo, si la capa diana es la capa adventicia, la energfa restringida de los tubos 114, 116 se libera, los tubos adoptan sus configuraciones curvas sin restringir mostradas en la Figura 28 y las puntas 156, 158 del penetrador de tejido se hacen avanzar con los controladores a una longitud suficiente para la penetracion a la profundidad de la capa adventicia. Asimismo, si la capa diana es la capa media, la energfa restringida de los tubos
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114, 116 se libera, los tubos adoptan sus configuraciones curvas sin restringir mostradas en la Figura 28 y las puntas 156, 158 del penetrador de tejido se hacen avanzar con los controladores a una longitud suficiente para la penetracion a la profundidad de la capa media.
Con los penetradores de tejido incorporados en la capa deseada de la pared del conducto biologico, un fluido puede entonces administrate a traves de los penetradores 118, 120 de tejido. Cuando se completa la administracion de fluido, los controladores 162, 164 pueden manipulate para retirar las puntas 156, 158 del penetrador de tejido de nuevo a las perforaciones 152, 154 interiores de los tubos 114, 116 de presentacion del penetrador de tejido. El tubo 122 de utilizacion puede entonces moverse a su posicion delantera en la que el extremo 172 distal del tubo de utilizacion mueve los tubos 114, 116 de presentacion del penetrador de tejido de nuevo a sus posiciones restringidas mostradas en la Figura 27. Cuando el tubo 122 de utilizacion se ha movido a su posicion delantera completa mostrada en la Figura 27, el montaje puede entonces volver a posicionarse o sacarse del cuerpo.
El dispositivo medico de la presente invencion tambien permite la administracion de fluidos a depositos de placa sobre el interior de la pared del conducto biologico o dentro de la pared del conducto biologico.
El dispositivo medico de la presente invencion tambien permite la administracion de fluidos a espacios extracelulares o tejidos localizados fuera de la pared externa del conducto biologico (por ejemplo, a la superficie exterior de un vaso sangumeo o un musculo posicionado contra la superficie exterior del vaso tal como miocardio).
Una caractenstica ventajosa de los dispositivos de la presente invencion es que los activadores, en virtud de su diseno, hacen contacto con menos de la circunferencia completa de la pared interna de un conducto biologico tras su utilizacion allf En las realizaciones preferidas, los activadores hacen contacto con menos del 100% de la circunferencia de la pared interna de un conducto biologico en el que se utilizan. Mas preferentemente, los activadores hacen contacto con menos del 75%, 50% o el 25% de la circunferencia de la pared interna de un conducto biologico en el que se utilizan. Lo mas preferentemente, los activadores hacen contacto con menos del 10%, 5%, 2,5%, 1%, 0,5% o el 0,1% de la circunferencia de la pared interna de un conducto biologico en el que se utilizan.
Los dispositivos pueden usarse para administrar fluidos que comprenden una variedad de agentes terapeuticos y/o de diagnostico a una pared de un conducto biologico. Los agentes terapeuticos incluyen, pero no se limitan a, protemas, productos qmmicos, moleculas pequenas, celulas y acidos nucleicos. Un agente terapeutico administrado por el dispositivo puede tanto comprender una micropartfcula como una nanopartfcula, estar complejado con una micropartfcula o una nanopartfcula, o unirse a una micropartfcula o una nanopartfcula. Los agentes de protema incluyen elastasas, agentes antiproliferativos y agentes que inhiben vasoespasmo. Se contempla espedficamente el uso de los dispositivos para la administracion de una elastasa. Varias solicitudes de patente publicadas (documentos WO 2001/21574; WO 2004/073504; y WO 2006/036804) ensenan que la elastasa, sola y en combinacion con otros agentes, es beneficiosa en el tratamiento de enfermedades de conductos biologicos, que incluyen obstruccion de conductos biologicos y vasoespasmo. Los agentes de diagnostico incluyen, pero no se limitan a, agentes de contraste, micropartfculas, nanopartfculas u otros agentes de obtencion de imagenes.
Con el dispositivo puede ponerse en practica una variedad de procedimientos de administracion de fluido. En ciertas aplicaciones pueden administrarse distintos fluidos a traves de cada penetrador de tejido del dispositivo tanto simultaneamente como secuencialmente. En otras aplicaciones, el mismo puede administrarse a traves de ambos penetradores de tejido tanto simultaneamente como secuencialmente. Tambien se contemplan realizaciones y/o procedimientos en los que un primer fluido se administra a traves de ambos penetradores de tejido, seguido de la administracion de un segundo fluido a traves de ambos penetradores de tejido.
Tambien se contemplan espedficamente procedimientos de uso de los dispositivos para administrar fluidos en o a traves de una pared de un conducto biologico. Estos procedimientos comprenden las etapas de introducir el dispositivo en el conducto biologico, hacer avanzar el dispositivo a un sitio diana dentro del conducto, liberar los activadores de sus posiciones restringidas, opcionalmente hacer avanzar los penetradores de tejido a traves de luces en los activadores para que penetren a una profundidad deseada en la pared de un conducto biologico, administrar al menos un fluido en o a traves de la pared, devolver opcionalmente de nuevo los penetradores de tejido a las luces de los activadores, retirar los activadores a su posicion restringida, volver a colocar el dispositivo en el mismo conducto o un conducto diferente para la administracion de fluido adicional si asf se desea y sacar el dispositivo del conducto.
6. EJEMPLOS
Esta seccion describe procedimientos de produccion de elastasa tipo I recombinante para uso clmico, por ejemplo, como agente para agrandar el diametro de vasos sangumeos y asf la luz de los vasos sangumeos. La elastasa pancreatica tipo I humana muestra el 89% de identidad de aminoacidos a lo largo de la longitud entera de la elastasa pancreatica tipo I porcina, con conservacion completa de la “tnada catalttica” y residuos determinantes de la especificidad por sustrato. La elastasa tipo I porcina se sintetiza inicialmente como una enzima enzimaticamente inactiva que se activa por tripsina para dar la enzima madura que contiene cuatro enlaces disulfuro internos y sin
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glucosilacion (veanse Shotton, 1970, Methods Enzymol 19:113-140, Elastase; y Hartley y Shotton, 1971, Biochem. J. 124(2): 289-299, Pancreatic Elastase. The Enzymes 3:323-373 y referencias en su interior).
Los ejemplos mas adelante demuestran el desarrollo de expresion eficaz y expandible de elastasa tipo I porcina y humana recombinante y esquemas de purificacion adecuados para la fabricacion por cGMP de estas enzimas para estudios no clmicos y clmicos, y uso farmaceutico comercial. A la elastasa porcina madura se le ha dado el nombre PRT-102. A la elastasa tipo I humana madura se le ha dado el nombre PRT-201.
6.1 TERMINOLOGIA Y ABREVIATURAS
Como se usa en el presente documento, los terminos PRT-101, PRT-102, PRT-201 y pro-PRT-201 deben significar lo siguiente:
PRT-101: elastasa pancreatica porcina. A menos que se indique lo contrario, la elastasa porcina pancreatica empleada en los ejemplos es elastasa pancreatica porcina altamente purificada comprada de Elastine Products Company, Inc, Owensville, MO, n° de catalogo EC134.
PRT-102: elastasa pancreatica porcina tipo I recombinante madura. Debe observarse que los vectores con la designacion “pPROT101-XXX” codifican pRt-102.
PRT-201: elastasa pancreatica humana tipo I recombinante madura.
pro-PRT-201: forma de proenzima de elastasa pancreatica tipo I humana recombinante que contiene una secuencia de propeptidos.
Las siguientes abreviaturas se usan en la Seccion 6 de la solicitud:
BKGY:
medio complejo de glicerol tamponado
BKME:
medio complejo de metanol tamponado
CHO:
ovario de hamster chino
E. coli:
Escherichia coli
ELA-1:
elastasa pancreatica tipo I
HEK:
rinon embrionario humano
hELA-1:
ELA-1 humana
HIC:
cromatograffa de interaccion hidrofoba
MBP:
protema de union a maltosa
pELA-1:
ELA-1 porcina
P. pastoris:
Pichia pastoris
PCR:
reaccion en cadena de la polimerasa
PMSF:
fluoruro de fenilmetilsulfonilo
RP:
fase inversa
S. cerevisiae:
Saccharomyces cerevisiae
SDS-PAGE:
electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida
SEC:
cromatograffa de exclusion por tamano
USP:
Farmacopea de los Estados Unidos
YPDS:
medio de extracto de levadura-peptona-dextrosa-sorbitol
6.2 EJEMPLO 1: SINTESIS DE ADN DE ELASTASA
La secuencia codificante de elastasa-1 humana se obtuvo de la patente de EE.UU. n° 5.162.205 (Takiguichi y col., 1992). Se hicieron varios cambios de secuencia para facilitar la clonacion en los vectores de expresion (Figura 1A). Los cambios de base se encontraron dentro de la degeneracion del codigo genetico, de manera que no se cambiaron residuos de aminoacidos. Un segundo codon de terminacion se anadio inmediatamente despues del codon de terminacion nativo para minimizar la posible ultralectura de ribosomas.
La secuencia codificante modificada se sintetizo por Blue Heron Biotechnology (Bothell, WA) usando una tecnica de “oligo largo” de no PCR bajo licencia de Amgen (Thousand Oaks, CA). El ADN recombinante, llamado ELA-1.2A (SEC ID N°: 81), se clono en el vector pUC de Blue Heron, un derivado de pUC119, y el plasmido resultante se llamo pPROT1. pPROT1 se secuencio en ambas cadenas para confirmar la secuencia correcta. Los datos de secuenciacion de alta calidad con amplio solapamiento en ambas cadenas permitio asignaciones de bases ineqrnvocas a lo largo de la secuencia entera, que se cubrio por un mmimo de cuatro reacciones de secuenciacion con al menos una reaccion para cada hebra.
6.3 EJEMPLO 2: EXPRESION DE PRT-201 EN E. COLI
Se intentaron una variedad de estrategias de expresion en un esfuerzo por obtener elastasa humana soluble y enzimaticamente activa en E. coli.
Un conjunto de vectores de expresion de E. coli comprendidos en fusiones en marco de la elastasa pancreatica tipo I humana (ELA-1) con el extremo carboxi de una protema de union a maltosa (MBP) que a su vez se fusiono con un
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peptido secretor del extremo N. Tanto las secuencias codificantes de ELA-1 madura humana como de proenzima se clonaron como fusiones del extremo C en marco con la secuencia codificante de MBP del plasmido pMAL-p2G (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) para dar tanto pPROT3 (ELA-1 madura) como pPROT5 (proenzima ELA-1). La construccion de pPROT3 se efectuo obteniendo primero por mutagenesis por PCR una ELA-1 humana madura de 6,6 kb que codificaba el fragmento con un sitio SnaBI en el codon de valina del extremo N de ELA-1 humana madura y un sitio Hindlll localizado 3’ con respecto a los codones de terminacion de ELA-1 madura. Esta mutagenesis por PCR usa un molde de pPROT1 que comprende la secuencia codificante de ELA-1.2A (SEC ID N°: 81) y dos cebadores de oligonucleotidos (5’ ATC TAC GTA GTC GGA GGG ACT GAG GCC, SEC ID N°: 75; y 5’ gtc gac aag ctt atc agt tgg agg cga t, SEC ID N°: 76). El fragmento de PCR de 6,6 kb resultante se aislo, se digirio con SnaBI y HindIII y posteriormente se clono en el vector pMAL-p2G digerido con XmaI/Hind 111 para dar pPROT3. La construccion de pPROT3 se efectuo clonando el fragmento ScaI/Hind 111 de PPROT1 y ligandolo en el vector pMAL p2G que se habfa digerido con SnaBI y HindIII. La fusion resultante enlaza operablemente el extremo N de la region codificante de la proenzima ELA-1 humana con el extremo C de MBP de pMAL-p2G en pPROT5. El dominio de escision de tripsina de la proprotema ELA-1 humana se preserva en pPROT5.
La cepa TB 1 de E. coli se transformo con pPROT3 y pPROT5 y posteriormente se indujo con IPTG para determinar si podna producirse tanto la protema de fusion como ELA-1 humana enzimaticamente activa. En el caso de pPROT3, toda la protema de fusion MBP-ELA-1 producida fue insoluble. No se detecto protema de fusion MBP-ELA- 1 soluble o enzimaticamente activa en el material periplasmico obtenido por choque osmotico de E. coli que contiene pPROT3 inducida. En el caso de pPROT5, bajos niveles de protema MBP-proELA-1 recombinante soluble podnan detectarse en el material periplasmico obtenido por choque osmotico de E. coli que contiene pPROT5 inducida a traves del uso de SDS-PAGE y tincion con Coomassie o por uso de anticuerpos anti-MBP en una transferencia Western (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA). La protema MBP-proELA-1 recombinante soluble podna digerirse con tripsina para dar tanto MBP como ELA-1 humana madura. ELA-1 humana madura obtenida de inducciones de pPROT5 se ensayo posteriormente para actividad de elastasa con sustrato de peptido de SLAP. La actividad de elastasa se observo en extractos periplasmicos de pPROT5. Esta actividad enzimatica de elastasa dependfa de la activacion de tripsina (es decir, no se observo actividad en ausencia de tripsina y la cantidad de actividad es elevada, aumentando el periodo de tiempo de activacion de tripsina). Ademas, la actividad de elastasa dependfa de pPROT5 en nada menos que no se observo actividad en los extractos de control del vector pMAL-p2G tratados en paralelo con tripsina. Finalmente, la actividad de elastasa de pPROT5 se inhibio por PMSF (un inhibidor de serina proteasa conocido).
La protema de fusion MBP-proELA-1 recombinante se purifico posteriormente y se escindio con tripsina para obtener una ELA-1 humana madura derivada de pPROT5 enzimaticamente activa. La protema de fusion se purifico primero sobre cromatograffa de afinidad por amilosa, seguido de elucion con maltosa. La MBP-proELA-1 purificada se trato entonces con tripsina inmovilizada. Siguiendo la etapa de activacion de tripsina, la MBP-proELA-1 escindida se purifico por cromatograffa cationica en SP Sepharose. Sin embargo, experimentos posteriores con ELA-1 humana madura derivada de pPROT5 purificada por afinidad indicaron que solo podffan obtenerse cantidades muy limitadas de elastasa soluble y enzimaticamente activa a partir de E. coli que contiene pPROT5. Ademas, la actividad espedfica de ELA-1 humana madura derivada de pPROT5 purificada por afinidad fue muy baja, oscilando de 0,27 a 0,38 U/mg (U = micromol de sustrato SLAP hidrolizado por min).
Tambien se siguio una estrategia alternativa de obtencion de ELA-1 soluble y enzimaticamente activa en E. coli. En resumen, se construyo el vector pPROT8 que codifica una fusion de protemas que comprende los 8 primeros residuos de aminoacidos de la subunidad alfa de lacZ de E. coli mas 5 aminoacidos de residuos codificados por el poli ligador, seguido de la proenzima del extremo N de ELA-1 humana. Este vector se construyo ligando un fragmento de BamHI/NcoI que contiene la secuencia codificante humana de ELA-1 a partir de pPROT1 (es decir, un vector que contiene la secuencia de ELA-1.2A; SEC ID N°: 81) en pUC de pBlueHeron (Blue Heron Biotechnology, Bothell, WA, EE.UU.) que se digirio con BamHI/NcoI.
La cepa EC100 de E. coli (EPICENTRE Biotechnologies, Madison, WI) se transformo con pPROT8 y posteriormente se indujo con IPTG para determinar si podna producirse tanto la protema de fusion como ELA-1 humana enzimaticamente activa. En el caso de celulas transformadas con EC100, toda la protema de fusion LacZ-proELA-1 derivada de pPROT8 producida fue insoluble (es decir, se encontro en cuerpos de inclusion). Una cepa de E. coli que contiene mutaciones en los genes trxB y gor (la cepa Origami™, Takara Mirus Bio, Inc., Madison, WI) se transformo posteriormente con pPROT8, ya que se sabe que las cepas de E. coli con mutaciones en estas secuencias codificantes promueven la recuperacion de protemas recombinantes solubles y enzimaticamente activas. Aunque alguna protema de fusion LacZ-proELA-1 derivada de pPROT8 soluble en la cepa de E. coli trxB / gor se recupero tras la induccion con IPTG, no podna convertirse en ELA-1 humana enzimaticamente activa con tripsina.
6.4 EJEMPLO 3: EXPRESION de PRT-201 EN LINEAS CELULARES DE MAMIFERO
Se intentaron varias estrategias de expresion en un esfuerzo por obtener elastasa pancreatica tipo I humana soluble y enzimaticamente activa (ELA-1) en lmeas celulares de mairnfero. El vector de expresion de mairnfero de alta copia pcDNA3.1 (Invitrogen) que contiene el promotor del CMV se uso como esqueleto para dos vectores de expresion de elastasa ELA-1 humana, pPROT30 y pPROT31. Para construir pPROT30, la secuencia de proenzima ELA-1
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humana se amplifico por PCR y se fusiono con una secuencia senal de elastasa pancreatica porcina incorporada en el cebador de PCR directo. Usando sitios de restriccion incorporados en los cebadores de PCR, el producto de PCR se digirio y se ligo usando los sitios de restriccion correspondientes en el vector pcDNA3.1. pPROT31 se construyo de un modo similar, excepto que se uso la secuencia codificante de ELA-1 humana madura en lugar de la secuencia codificante de proenzima en un intento de expresion directa de la enzima madura. E. coli se transformo con las reacciones de ligacion y los clones se seleccionaron por seleccion de minipreparaciones. Se selecciono un clon para cada vector de expresion basandose en patrones de digestion con restriccion esperados para el inserto correcto. El ADN de plasmido se preparo para cada clon y las secuencias codificantes del vector de expresion se confirmaron por secuenciacion de ADN.
Las lmeas celulares de mairnfero CHO, COS, HEK293 y HEK293T se transfectaron transitoriamente por separado con pPROT30 y pPROT31. Despues de varios dfas, los sobrenadantes de cultivo celular se recogieron y se analizaron para expresion de proprotema de ELA-1 humana (pPROT30) o de protema madura (pPROT31) por transferencia Western. Un anticuerpo policlonal anti-elastasa pancreatica porcina reacciono de forma cruzada con una banda del peso molecular esperado para la proprotema de ELA-1 humana en sobrenadantes de pPROT30 y para la protema de ELA-1 humana madura en sobrenadantes de pPROT31.
Los sobrenadantes de pPROT30 y pPROT31 se analizaron para actividad de elastasa por ensayo de SLAP. Para pPROT30, los sobrenadantes se trataron primero con tripsina para convertir la proenzima en PRT-201 madura. No se detecto actividad de elastasa en ninguno de los sobrenadantes para cualquier vector usando el ensayo de SLAP.
6.5 EJEMPLO 4: EXPRESION DE PRT-201 ACTIVADA POR TRIPSINA EN P. PASTORIS
El vector para la expresion secretada de P. pastoris, PV-1, se sintetizo por Blue Heron y se uso para clonar primero la secuencia codificante de ELA-1 humana natural. El vector PV-1 se diseno por simple clonacion, seleccion y expresion de alto nivel de la protema recombinante. El vector contiene el gen de resistencia Zeocin™ para la eleccion directa de integrantes de multiples copias. La fusion del extremo N del propeptido de elastasa con una secuencia tipo apareamiento a de levadura que comprende las secuencias senal de secrecion de levadura, de propeptido y de espaciador como se muestra en la Figura 1B permite la secrecion de la protema expresada en los medios de cultivo. La proprotema elastasa secretada puede separarse facilmente del sedimento de celulas, una primera etapa sustancial hacia la purificacion. Adicionalmente, la forma de proenzima de ELA-1 humana que contiene el sitio de escision de tripsina se selecciono para la expresion para prevenir que expresara directamente la enzima activada madura que puede conducir a plegamiento erroneo de protemas o toxicidad a las celulas que expresan la enzima recombinante.
La clonacion de la construccion de expresion pPROT24-V para dirigir la expresion de la proenzima ELA-1 se llevo a cabo del siguiente modo. La region codificante de ELA-1 humana (SEC ID N°: 81) se amplifico a partir de ELA-1 de pUC de Blue Heron por PCR (Expand High Fidelity PCR System, Roche, Indianapolis, IN). El cebador directo 20F incorporo un sitio Xhol (5’-ggctcgagaaaagagaggctgaagctactcaggaccttccggaaaccaatgcccgg-3; SEC ID N°: 35). El cebador 24R incorporo un sitio SacII (5’-gggccgcggcttatcagttggaggcgatgacat-3’; SEC ID N°: 36). El producto de PCR resultante se purifico en gel y se clono en pCR2.1-TOPO (Invitrogen). La secuencia codificante de ELA-1 se aislo usando XhoI y SacII, se purifico en gel y se clono en el vector PV-1 en aquellos sitios para dar pPROT24-V (Figura 3).
El producto ligado en pPROT24-V se amplifico en la cepa TOP10 de E. coli. La mezcla de celulas se sembro en placa sobre placas de LB de baja sal complementadas con 25 microgramos/ml de Zeocin. Se preparo plasmido de ADN (Qiagen, Valencia, CA) y el inserto de ELA-1 humana se identifico por digestion con restriccion. La secuencia codificante de pPROT24 se verifico por secuenciacion de ambas hebras de ADN Maxiprep purificado con multiples reacciones de solapamiento. Los datos de secuenciacion de alta calidad permitieron las asignaciones de bases ineqrnvocas y confirmaron la correcta secuencia codificante. Se prepararon disoluciones madre en glicerol de pPROT24-V/TOP 10 y se guardaron a -80 °C.
La cepa de P. pastoris NRRL Y-11430 natural obtenida del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA, Peoria, IL, EE.UU.) se uso para la transformacion. Se linealizo ADN de plasmido de pPROT24-V con SacI y la digestion completa se confirmo ejecutando una pequena alrouota de la reaccion sobre un gel de agarosa. Se uso electroporacion para transformar P. pastoris con aDn de plasmido de pPROT24-V. Se sembraron mezclas de celulas sobre placas de YPDS que conteman 100 microgramos/ml de Zeocin. Despues de tres dfas, las colonias empezaron a formarse y se seleccionaron durante varios dfas mas para volver a extenderse sobre placas nuevas.
En general, los transformantes resistentes a farmaco se seleccionaron para la expresion en un matraz con deflectores de 1 l. Se uso una unica colonia para inocular 200 ml de medio BKGY. La composicion de la disolucion de BKGY fue la siguiente: 10 g/l de glicerol, 13,4 g/l de base de nitrogeno de levadura con sulfato de amonio y sin aminoacidos (Invitrogen), 20 g/l de peptona de soja, 10 g/l de extracto de levadura, 0,4 mg/l de biotina en tampon fosfato de potasio 0,1 M (pH 5,0). El cultivo se cultivo durante dos dfas a 28 °C con agitacion a 275 rpm. Los cultivos se sedimentaron por centrifugacion a 650xg durante 10 min a temperatura ambiente. Los sedimentos de celulas se resuspendieron con medio de induccion de BKME, pH 5,0, resuspendiendo los sedimentos a una relacion de 1 g de
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celulas humedas con respecto a 5 ml de medio de induccion. Una suspension de celulas de 50 ml se coloco en un matraz sin deflector de 500 ml para obtener una relacion 1:10 de suspension de celulas con respecto a volumen de matraz. Las celulas se incubaron a 22 °C con agitacion a 275 rpm durante 1-3 dfas. El metanol en el medio de induccion se repuso a una concentracion final del 0,5% dos veces al dfa durante el transcurso de la induccion.
Para seleccionar para la expresion, se tomaron almuotas de 1 ml, se transfirieron a tubos Microfuge de 1,5 ml y se centrifugaron durante 5 min a 20.000 x g en una microcentnfuga. Los sobrenadantes se transfirieron a tubos nuevos y se guardaron a -80 °C. Para el analisis de SDS-PAGE, las almuotas de sobrenadante se descongelaron y se mezclaron con 4X tampon Laemmli complementado al 5% en volumen con el agente reductor beta-mercaptoetanol. Las muestras se hirvieron durante 5 min, se centrifugaron suavemente y se cargaron sobre un gel pre-colado de Tris-HCl al 8-16% de gradiente en un sistema de electroforesis Criterion (Bio-Rad). Despues de la electroforesis, el gel se tino con Coomassie y se analizo para la expresion de la proenzima ELA-1 humana. El clon 201-24-266-VU se selecciono como un clon de alto rendimiento para la posterior evaluacion. Se preparo un banco de celulas de desarrollo que consiste en disolucion madre en glicerol de 201-24-266-VU y se guardo a -80 °C.
Para la produccion de ampliacion a escala de proenzima ELA-1 humana usando el clon 201-24-266-VU se realizaron multiples ejecuciones de produccion que generalmente siguieron los procedimientos descritos mas adelante. Si procede, se anotan las variaciones ejecucion a ejecucion en los procedimientos.
Para el cultivo celular, una serie de matraces de agitacion con deflectores de 2 l (normalmente que oscilan de 20 a 40 matraces) que contienen 500 ml de medio de crecimiento BKGY se inocularon con 250 microlitros de disolucion madre en glicerol de 201-24-266-VU descongelada. Los cultivos se cultivaron a 28 °C durante 2 dfas en una estufa de incubacion con agitacion a 250 - 300 rpm. Despues de 2 dfas, las celulas se sedimentaron por centrifugacion y el sobrenadante se desecho. Las celulas se resuspendieron en medio de induccion BKME, pH 5,0, a una relacion de 1 g de peso de celulas con respecto a 5 ml de medio. Se dispuso un volumen de 200-400 ml de suspension de celulas en matraces sin deflectores de 2 l y se cultivaron durante 3 dfas en una estufa de incubacion con agitacion (250-300 rpm) a 22 °C. El metanol en los medios se repuso al 0,5% en volumen dos veces al dfa durante el transcurso de la induccion. Al final de la induccion, los cultivos de los matraces de agitacion se centrifugaron para sedimentar las celulas. El sobrenadante se elimino y se filtro inmediatamente a temperatura ambiente a traves de una membrana de polietersulfona de 0,22 um usando unidades de filtracion a vacfo de 1 l para eliminar cualquier residuo celular restante. El filtrado se almaceno a 2-8 °C durante hasta 1,5 meses. Basandose en el analisis de HIC-HPLC, el rendimiento de la proenzima ELA-1 humana a partir del clon pro-PRT-201-24-266-VU en el sobrenadante clarificado fue normalmente 200 a 250 mg/l.
La captura de pro-PRT-201-24-266-VU del sobrenadante se efectuo del siguiente modo. Primero, el sobrenadante de multiples rondas de cultivos en matraz de agitacion (normalmente 4 a 10 rondas) se combino (normalmente 8 a 25 l totales), se diluyo 8 veces con agua y se ajusto a pH 5,0 con HCl 1 M. El sobrenadante diluido se cargo entonces sobre una columna de captura de intercambio ionico Macro-Prep High S de 2 l de volumen de lecho equilibrada a 2-8 °C a una tasa de 100 ml/min (velocidad de flujo lineal 76 cm/h). El programa de cromatograffa comprendio las siguientes etapas: 1. Lavar la columna con 10 l (5 volumenes de columna [VC]) de Tampon A (citrato de sodio 20 mM, pH 5,0) a 100 ml/min (76 cm/h); 2. Lavar la columna con 4 l (2 VC) de una mezcla de 90% de Tampon A y 10% de Tampon B (cloruro sodico 500 mM; citrato de sodio 20 mM, pH 5,0) para una composicion de tampon final de cloruro sodico 50 mM; citrato de sodio 20 mM, pH 5,0 a 100 ml/min (76 cm/h); 3. Lavar la columna con 6 l (3 VC) de una mezcla de 80% de Tampon A y 20% de Tampon B para una composicion de tampon final de cloruro sodico 100 mM; citrato de sodio 20 mM, pH 5,0 a 100 ml/min (76 cm/h); 4. Lavar la columna con 6 l (3 VC) de un gradiente lineal, a partir de 75% de Tampon A y 25% de Tampon B a 68% de Tampon A y 32% de Tampon B, a 100 ml/min (153 cm/h); 5. Eluir con un gradiente lineal de 30 l (15 VC) a partir de 68% de Tampon A y 32% de Tampon B a 0% de Tampon A y 100% de Tampon B, a 100 ml/min (76 cm/h). El eluato se recogio en fracciones de 500 - 1000 ml cada una.
Normalmente, se observaron dos especies de protema predominantes por SDS-PAGE, seguido de tincion con Coomassie: la proenzima ELA-1 humana glucosilada y la proenzima ELA-1 humana no glucosilada, como se ha determinado por analisis de EM/CL posterior, eluyendo normalmente en cloruro sodico aproximadamente 320 mM, mostrado en la Figura 4. En algunas ejecuciones de produccion, una protema ligeramente mas pequena que la proenzima ELA-1 humana se observo como una especie secundaria. El posterior analisis de Em/CL de estas fracciones mostro que la mayona de la protema no fue proenzima de longitud completa, sino que en su lugar carecfa de varios aminoacidos en el extremo N. Estas variantes del extremo N se purificaron y se sometieron a analisis de actividad de elastasa, que revelo que teman menor actividad de elastasa que la PRT-201 de longitud completa. Las variantes del extremo N podnan producirse a partir de la proenzima ELA-1 humana que presenta un bajo nivel de actividad de elastasa durante el cultivo celular y operaciones de cromatograffa de captura y tanto escindiendose a sf mismas a traves de una reaccion intramolecular como escindiendo otra molecula de proenzima ELA-1 humana a traves de una reaccion intermolecular. Condiciones de escision inferiores a las optimas durante estas operaciones podnan conducir a un alto nivel de escision erronea de la proenzima (denominado algunas veces conversion espontanea o sin controlar), produciendo principalmente variantes del extremo N, en vez de PRT-201 de longitud completa intacta.
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Despues de la inspeccion de los resultados de SDS-PAGE, un subconjunto de fracciones se reunio para obtener pro-PRT-201 no glucosilada purificada para posterior procesamiento. Las fracciones que contienen proenzima glucosilada o PRT-201 de longitud completa y/o variantes del extremo N (que co-migran sobre SDS-PAGE) normalmente se excluyeron del conjunto. La pro-PRT-201 reunida se guardo normalmente en un vaso de precipitados de plastico de 5 la 2-8 °C durante varias horas hasta toda la noche antes de la conversion de proenzima a enzima madura.
La conversion de pro-PRT-201 a PRT-201 madura por tripsina inmovilizada se efectuo del siguiente modo. Las fracciones de pro-PRT-201 reunidas se dializaron en fosfato de sodio 20 mM, pH 5,0, durante la noche a 2-8 °C. Esta etapa proporciona la eliminacion de citrato, que inhibe la tripsina. Tras la dialisis, la pro-PRT-201 se paso sobre una columna de tripsina recombinante (TrypZean) inmovilizada a perlas de agarosa pre-equilibrada con fosfato de sodio 20 mM, pH 5,0. Normalmente, el tiempo de contacto entre pro-PRT-201 y TrypZean inmovilizado fue entre 3,5 y 5 min. El material de post-conversion resultante se analizo por SDS-PAGE para confirmar la conversion y posteriormente se cargo sobre una columna de pulimento Macro-Prep High S. La columna se lavo secuencialmente con 5 VC de citrato de sodio 20 mM, pH 5,0; 2 VC de citrato de sodio 20 mM, cloruro sodico 50 mM, pH 5,0; y 3 VC de citrato de sodio 20 mM, cloruro sodico 100 mM, pH 5,0. La columna se lavo adicionalmente con un gradiente lineal de cloruro sodico 125 mM a cloruro sodico 160 mM en citrato de sodio 20 mM, pH 5,0. La PRT-201 se eluyo en un gradiente lineal de cloruro sodico 165 mM a 500 mM en citrato de sodio 20 mM, pH 5,0 y se recogio en fracciones. Las fracciones se analizaron para protema por SDS-PAGE, seguido de tincion con Coomassie y para actividad de elastasa por ensayo de SLAP. Normalmente se reunieron las fracciones que tienen una actividad espedfica del 90% o mas de la de la fraccion con la mayor actividad espedfica. En posteriores analisis de EM/CL se encontro que las fracciones de elucion tardfa que teman menor actividad espedfica estaban enriquecidas en variantes del extremo N de PRT-201.
Las fracciones reunidas con alta actividad espedfica se diafiltraron en tampon de formulacion compuesto por 0,1X PBS (cloruro sodico 13,7 mM, fosfato de sodio 1 mM, fosfato de potasio 0,27 mM) a pH 5,0. Despues de la concentracion de PRT-201 a 1 mg/ml, el pH se ajusto a 7,4. Entonces, la disolucion se tomo en almuotas en viales de suero de vidrio con un tapon de elastomero y se liofilizaron. La liofilizacion se realizo normalmente con un ciclo de secado primario a -30 a -50 °C y un ciclo de secado secundario a -15 °C. Despues de la liofilizacion, los viales se taparon a vado y se cerraron por plegado con un sello de aluminio. Entonces, los viales se guardaron normalmente a 2-8 °C o -80 °C.
Para evaluar la estabilidad de PRT-201 liofilizada en viales, dos lotes que se fabricaron en medicamento GMP esteril se han puesto en una programa de estabilidad. El programa de estabilidad consiste en el almacenamiento del farmaco a -15 °C y extraccion periodica de un subconjunto de viales para probar por los siguientes procedimientos analfticos que indican estabilidad (las especificaciones estan entre parentesis): aspecto de material liofilizado (polvo de blanco a blanquecino), aspecto despues de la reconstitucion (disolucion incolora clara libre de partfculas), actividad espedfica por ensayo de SLAP (25-45 U/mg), pureza por RP-HPLC (pureza total: no menos del 93%; impureza individual: no mas del 2%), pureza por SDS-PAGe reducida (no menos del 93%), pureza por SDS-PAGE no reducida (no menos del 93%), inyecciones de materia particulada (conforme a la USP), agregados por SEC- HPLC (no mas del 3%), contenido por vial (4,5 - 5,5 mg), pH (6,5-8,5), humedad (no supera el 5%) y esterilidad (conforme a la USP). Hasta la fecha, ambos lotes han cumplido las especificaciones indicadas en todos los momentos de tiempo probados (lote C0807117 hasta 12 meses y lote C1007132 hasta 9 meses). Estos resultados indican que PRT-201 es estable durante al menos 12 meses cuando se guardo liofilizada en viales a -15 °C.
El uso de citrato de sodio, pH 5,0, durante tanto la cromatograffa de captura de pro-PRT-201 como la cromatograffa de pulimento de PRT-201 convertida se baso en los datos que muestran que el citrato de sodio inhibio la actividad de elastasa de PRT-201 purificada y, por tanto, tambien podna inhibir la actividad de elastasa de pro-PRT-201 y PRT-201 durante las operaciones de procesamiento. Tal inhibicion podna minimizar la conversion espontanea de pro-PRT-201 en variantes del extremo N y minimizar la auto-degradacion de PRT-201. En un experimento en el que el tampon de ensayo de SLAP contuvo citrato de sodio 115 mM, pH 5,0, la actividad espedfica de PRT-201 se inhibio el 91%.
Ocasionalmente, material eluido de la columna de captura de pro-PRT-201 no se sometio a conversion por tripsina como se ha descrito anteriormente, sino que en su lugar se uso para obtener preparaciones enriquecidas en diversas especies de protema. Por ejemplo, los conjuntos de fracciones que conteman principalmente pro-PRT-201 glucosilada, pro-PRT-201 no glucosilada o protemas que se producen de la conversion espontanea se prepararon a partir del eluato de la columna de captura. Normalmente, estos conjuntos de fracciones se diafiltraron en fosfato de sodio 10 mM, pH 5,0, se liofilizaron y se guardaron a -80 °C.
Se realizo un estudio para determinar el efecto del pH y la temperatura sobre la estabilidad de pro-PRT-201 purificada con el tiempo. pro-PRT-201 liofilizada se reconstituyo en fosfato de sodio 10 mM a pH que oscilan de 3,0 a 8,4, seguido de incubacion a 4 °C o 25 °C durante 7 dfas. Despues de 7 dfas, las muestras de pro-PRT-201 en condiciones de pH 4,0 - 8,0 y 25 °C mostraron un enriquecimiento en PRT-201 madura que aumento con pH creciente como se muestra por SDS-PAGE y tincion con Coomassie. Bajo las condiciones de pH 8,4 y 25 °C se observo la conversion completa de pro-PRT-201 a PRT-201 madura. Las muestras a 4 °C, de pH 4,0 a 8,4,
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mostraron de poca a ninguna conversion. A pH 3,0, no se observo conversion a tanto 4 °C como 25 °C. Se ha informado en la bibliograffa (Hartley y Shotton, 1971, Pancreatic Elastase. Enzymes 3:323-373) que la elastasa pancreatica porcina se inactiva irreversiblemente despues de almacenamiento prolongado a pH inferiores a 3,0. Asf, basandose en estos resultados de este estudio y para evitar inactivar irreversiblemente PRT-201, condiciones utiles para minimizar la conversion de pro-PRT-201 purificada son almacenamiento a 4 °C entre pH 3,0 - 4,0.
6.6 EJEMPLO 5: EXPRESION DE PRT-201 AUTO-ACTIVADA EN P. PASTORIS
Para obtener una proenzima de variante capaz de auto-activacion, eliminando asf la necesidad de activacion por tripsina, se construyo una variedad de vectores de variantes de dominios de escision de elastasa y se analizaron en cultivo a pequena escala y experimentos de conversion. Los vectores de variantes se crearon por mutagenesis por PCR dirigida a sitio del vector pPROT24-V y posteriores vectores derivados. La mutagenesis dirigida a sitio se realizo usando ADN polimerasa Pfu Turbo (Stratagene). La cepa XL10-Gold de E. coli se transformo con los plasmidos resultantes. Las mezclas de celulas transformadas se sembraron sobre placas de LB de baja sal complementadas con 25 microgramos/ml de Zeocin. Se escogieron los clones resistentes a farmaco y se preparo ADN de plasmido (Qiagen, Valencia, CA). Los clones se confirmaron para los cambios de codon esperados por secuenciacion de ambas hebras de ADN de plasmido en la region de propeptido con multiples reacciones solapantes. P. pastoris se transformo con los vectores de variante y los clones se seleccionaron como se describe en el ejemplo precedente.
Un resumen de las variantes de dominios de escision de elastasa que se crearon se proporciona en la Tabla 4 mas adelante:
Enlace Escindido
Nombre de la Secuencia de Propltido
P5 P4 P3 P2 PI P’l P’2 P’3
24
Glu Thr Asn Ala Arg Val Val Gly
40
Glu Thr ?! Ala Ala Ala Val Val Glv
41
Glu Thr Asn Ala ....Ala...: Val Gly
42
Glu Thr Asn Ala -Ala' ; Val Val Gly
43
Glu Thr Asn Ala Pm Val Val Gly
44
Glu Thr TGlv : Ala Gly . m Val Gly
45
Glu Thr vial 1 Pro Glv Val Val Gly
46
Glu Thr Ala Pro Glv Val Val Gly
47
Glu Thr Asn §;pk>? Glv Val Val Gly
48
Glu Thr Asn Pro .....A!?...... Val Val Gly
49
Glu Thr Asn Hts Ala Val Val Gly
52
Glu Thr Lys I- Pro Ala Val Val Gly
53
Glu Thr ■ His i Pro Ala Val Val Gly
54
Glu I His s Asn Pro Ala Val Val Gly
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Hi?.... Thr Asn Pro Ala Val Val Gly
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Pro Thr Pm: • Ala Val Val Gly
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Pro Thr Asn Pm Ala Val Val Gly
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His Thr His Pro Ala Val Val Gly
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Glu Thr Phe Pro •: 11 Ala Val Val Gly
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His Thr Phe Pro Ala Val Val Gly
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Gly Thr Phe Pro Ala Val Val Gly
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His. Thr Gly Pro Ala Val Val Gly
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His Thr Lys Pro Ala Val Val Gly
Tabla 4: Variantes de dominios de escision de elastasa
Para la Tabla 4 anterior, la primera columna que enumera “Nombre de secuencias de pro-peptidos” se corresponde con la SEC ID N° para el dominio de escision de elastasa indicado. Asf, 24 se corresponde con el dominio de escision de tripsina natural de SEC ID N°: 24. Los numeros 40-49, 52-63 se corresponden respectivamente con los dominios de escision de elastasa de variantes de SEC ID N°: 40-49 y 52-63.
Para cultivar los clones de variante generalmente se siguieron las condiciones de cultivo en matraz de agitacion desarrolladas para el clon 201-24-266-VU activado con tripsina descrito en el ejemplo precedente. Se probaron varios procedimientos de conversion de las proprotemas de variante secretadas en el sobrenadante de matraz de agitacion en PRT-201 madura. La primera estrategia de conversion consistio en purificar primero cromatograficamente la proenzima de variante, seguido de escision controlada en un tampon de conversion espedfico. Debido a que los cambios de aminoacidos en las proprotemas de variante produjeron solo pequenos cambios en los puntos isoelectricos teoricos en comparacion con la proenzima natural, se llevo a cabo cromatograffa
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de intercambio cationico generalmente como se describe en el ejemplo precedente. Los sobrenadantes de los cultivos de clones de variante se prepararon para cromatograffa tanto por dilucion con agua generalmente como se describe en el ejemplo precedente como por concentracion, seguido de diafiltracion del sobrenadante, usando filtracion de flujo tangencial en el tampon de carga de la columna. Despues de la purificacion cromatografica, las fracciones eluidas se analizaron por SDS-PAGE, seguido de tincion con Coomassie. El analisis en gel demostro mayores cantidades de protema madura convertida en proprotema en las fracciones en comparacion con el sobrenadante de partida, que indica que se habfa producido una cantidad considerable de conversion de proprotema espontanea. Tras la posterior purificacion, se determino por EM/CL que la protema espontaneamente convertida consistfa principalmente en variantes del extremo N que se demostro que teman poca o ninguna actividad de elastasa en el ensayo de SLAP.
La segunda estrategia de conversion consistio en convertir la proprotema de variante antes de purificar a partir del sobrenadante de cultivo, seguido de purificacion cromatografica de la enzima madura. Esta estrategia de conversion se probo primero en un ensayo a pequena escala y posteriormente se amplio la escala hasta acomodar mayores volumenes de conversion. Para la conversion a pequena escala, el sobrenadante clarificado de cultivos de clones de variante se concentro normalmente 5 veces por centrifugacion a 2-8 °C en un dispositivo de filtro ultracentnfugo. Despues de la concentracion, el concentrado se diluyo 5 veces con tampon Tris a una concentracion final de 100 mM de Tris-HCl normalmente en un intervalo de pH de 8,0 a 9,0. Las muestras se incubaron a temperatura ambiente sobre una plataforma con agitacion por balanceo. La actividad de elastasa se monitorizo por ensayo de SLAP normalmente hasta que la velocidad de la reaccion de actividad alcanzo una meseta. En algunos casos, la velocidad de reaccion aumento tan lentamente que la monitorizacion de SLAP se detuvo antes de lograrse una meseta. Las muestras convertidas se analizaron para especies de protema (por ejemplo, proprotema y PRT-201 / variantes del extremo N) por SDS-PAGE. Para ampliar a escala esta estrategia de conversion, el sobrenadante que contema proprotema de variante se concentro 10 veces usando filtracion de flujo tangencial, seguido de diafiltracion con Tris- HCl 100 mM que oscila en pH de 6,0 a 9,0. El progreso de la reaccion de conversion se monitorizo con el tiempo por analisis de HIC-HPLC en el que se cuantificaron la proprotema, PRT-201 y las especies de variante del extremo N. Generalmente hubo mayores tasas de conversion cuando el pH del tampon de diafiltracion estuvo entre 8,0 y 9,0.
Las proprotemas elastasas enumeradas en la Tabla 5 se expresaron en P. pastoris como se describe y se prueba para su capacidad para experimentar auto-conversion en ensayos de conversion a pequena escala como se describe en la segunda estrategia de conversion anteriormente. Los resultados de aquellos estudios se resumen en la Tabla 5 mas adelante:
Tabla 5: Resultados de expresion de proprotemas elastasas en P. pastoris.
Nombre de la Secuencia de Propeptido
Rendimiento del Frasco Agitador Estabilidad del Frasco Agitador Tasa de Conversion % de Variantes N- Terminales Tripsina Usada en el Procesamiento
24
Alta Alta Rapida 20% SI
40
Ninguna No Aplicable No Aplicable No Aplicable No
41
Intermedia Alta Lenta No Probada No
42
Baja Baja Intermedia 25% No
43
Intermedia Alta Lenta No Probada No
44
Intermedia-Alta Alta No Detectada Conversion No Aplicable No
45
Intermedia Alta No Detectada Conversion No Aplicable No
46
Intermedia Alta No Detectada Conversion No Aplicable No
47
Intermedia Alta No Detectada Conversion No Aplicable No
48
Intermedia Baja Rapida 15% No
49
Alta Alta Lenta 35% No
52
Intermedia Baja Rapida No Probada No
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(continuada)
Nombre de la Secuencia de Propeptido
Rendimiento del Frasco Agitador Estabilidad del Frasco Agitador Tasa de Conversion % de Variantes N- Terminales Tripsina Usada en el Procesamiento
53
Intermedia Intermedia Rapida 25% No
54
Intermedia Baja Rapida No Probada No
55
Intermedia -Alta Intermedia Rapida 15% No
56
Baja Baja No Probada No Probada No
57
Baja Baja No Probada No Probada No
58
Intermedia -Hip Intermedia Lenta No Probada No
59
Intermedia -Alta Intermedia Lenta No Probada No
60
Intermedia -Alta Alta Lenta No Probada No
61
Ninguna No Aplicable No Aplicable No Aplicable No
62
Alta Alta No Detectada Conversion No Aplicable No
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Ninguna No Aplicable No Aplicable No Aplicable No
En la Tabla 5 anterior, la primera columna que enumera “Nombre de la secuencia de pro-peptidos” se corresponds con la SEC ID N° para el dominio de escision de elastasa indicado. Asf, 24 se corresponde con el dominio de escision de elastasa activada por tripsina natural de SEC ID N°: 24. Los numeros 40-49 y 52-63 se corresponden respectivamente con los dominios de escision de elastasa de variantes de SEC ID N°: 40-49 y 52-63. La columna marcada “Rendimiento en matraz de agitacion” se corresponde con la cantidad de la proprotema correspondiente en el sobrenadante de cultivo durante 3 dfas de induccion como se ha determinado por analisis de SDS-PAGE. La columna marcada “Estabilidad en matraz de agitacion” se corresponde con la estabilidad de la proprotema correspondiente en el sobrenadante del medio de cultivo del matraz de agitacion durante 3 dfas de induccion como se ha determinado por la cantidad de PRT-201 / variantes del extremo N observadas en analisis de SDS-PAGE. La columna marcada “Velocidad de conversion” se corresponde con la velocidad relativa de conversion de proprotema para PRT-201, como se indica por el tiempo para lograr la velocidad de reaccion de SLAP maxima (rapida: menos de 60 minutos; intermedia: 60 a 120 minutos; y lenta: mas de 120 minutos). Los transcursos de tiempo de conversion de las proprotemas de variante se determinaron usando el ensayo de conversion a pequena escala descrito anteriormente y en comparacion con el transcurso de tiempo de conversion de la proprotema 24 determinado por activacion usando tripsina inmovilizada. La columna marcada “% de variantes del extremo N” se refiere al porcentaje de protema convertida que comprendio variantes del extremo N de la protema elastasa madura (es decir, variantes que comprenden escision en el extremo C del enlace para cualquier sitio distinto de P1). Para ilustrar el sistema de clasificacion relativo usado en la Tabla 5, ejemplos de SDS-PAGe, velocidad de conversion y analisis de variantes del extremo N para un subconjunto de variantes auto-activadas se muestran en la Figura 5.
Los analisis de las diversas variantes revelaron que las proprotemas elastasas que comprenden tanto el dominio de escision de elastasa de variante de SEC ID N°: 48 como de SEC ID N°: 55 proporcionaron elastasas auto-activadas con cualidades superiores que incluyen rendimientos en matraz de agitacion de intermedios a altos y bajos porcentajes de variantes tras la conversion. Mas analisis de proprotemas elastasas que comprenden tanto el dominio de escision de elastasa de variante de SEC ID N°: 48 como SEC ID N°: 55 revelaron que la auto-activacion de las proprotemas correspondientes (es decir, las proenzimas de elastasa de SEC ID N°: 64 y SEC ID N°: 69, respectivamente) produjeron solo una clase de variante del extremo N con una escision en el extremo C del enlace peptfdico para el residuo P’2. Mas analisis de proprotemas elastasas revelaron que la proprotema que comprende el dominio de escision de la elastasa de variante de SEC ID N°: 55 era mas estable que la proprotema que comprende el dominio de escision de la elastasa de variante de SEC ID N°: 48.
Experimentos iniciales para optimizar condiciones para la escision controlada de pro-PRT-201 purificada se realizaron usando la proprotema con la secuencia de pro-peptidos 42 (SEC ID N°: 6). Esta proprotema purificada se sometio a conversion en una matriz de condiciones que incluyen pH (7,7 a 8,9), composicion de tampon (citrato de
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sodio 0,4 a 10 mM), concentracion de protema (0,14 a 0,23 mg/ml) y tiempo de reaccion (5 a 24 horas). Al final del periodo de conversion, las reacciones se inactivaron anadiendo acido formico para reducir el pH a 3,0. Las cantidades relativas de especies de protema en cada reaccion se determinaron por espectrometna de masas. Basandose en estos resultados, las condiciones de conversion que produjeron el menor porcentaje de variantes del extremo N incluyeron un pH de 8,3, una composicion de tampon de Tris 100 mM y menos de 1 mM de citrato de sodio, una concentracion de protema de 0,2 mg/ml y un tiempo de reaccion de 5 a 24 horas. En este estudio solo se analizaron los puntos finales de la reaccion. Asf, los datos en tiempo real de la calidad de la conversion no se obtuvieron, y el resultado final puede haber reflejado tanto la produccion inicial de variantes del extremo N como una cantidad sustancial de tiempo para que aquellas variantes se hubieran degradado. Posteriormente se desarrollo un ensayo de HIC-HPLC para permitir monitorizar en tiempo real la reaccion de conversion. Mas estudios de optimizacion de la conversion, que incluyen aquellos usando monitorizacion de HIC-HPLC en tiempo real, se describen en el Ejemplo 6.
6.7 EJEMPLO 6: EXPRESION DE PRT-201 AUTO-ACTIVADA EN P. PASTORIS USANDO UN VECTOR DE VARIANTE DE MULTIPLES COPIAS
La integracion de multiples copias de genes recombinantes en P. pastoris se ha utilizado para aumentar la expresion de la protema deseada (vease, por ejemplo, Sreekrishna y col., 1989, Biochemistry 28:4117-4125; Clare y col., 1991, Bio/Technology 9:455-460; Romanos y col., 1991, Vaccine 9:901-906). Sin embargo, en ciertos casos, niveles de expresion obtenidos de integrantes de vector de una unica copia fueron eficaces y no se mejoro por los integrantes de vector de multiples copias (Cregg y col., 1987, Bio/Technology 5:479-485). Los eventos de integracion de plasmidos de multiples copias espontaneos se producen in vivo a una baja frecuencia en P. pastoris. Para obtener integracion genomica de multiples copias de un gen y posiblemente aumentar la expresion de protemas, puede usarse un procedimiento de ligacion in vitro para producir insertos en tandem del gen en un vector de expresion, seguido de transformacion de P. pastoris.
Para obtener un integrante de multiples copias de la variante pPROT55-V se uso un procedimiento de ligacion in vitro para construir un vector que contiene multiples copias de pPROT55-V que posteriormente se uso para transformacion de P. pastoris. Para preparar el vector de multiples copias, el vector pPROT55-V se digirio con BglII y BamHI para liberar el casete de expresion de 2,3 kb que codifica el gen pro-PRT-201, el promotor AOX1 y la secuencia de terminacion de la transcripcion AOX1. El casete de expresion se ligo entonces con una preparacion del vector pPROT55-V que se habfa linealizado con BamHI y se trato con fosfatasa alcalina intestinal bovina (New England Biolabs, MA, EE.UU.) para prevenir la auto-ligacion. La mezcla de ligacion se incubo durante la noche a 16 °C. La cepa TOP 10 de E. coli (Invitrogen, CA, EE.UU.) se transformo con la reaccion de ligacion. La mezcla de transformacion se sembro en placa sobre LB de baja sal en presencia de 25 microgramos/ml de Zeocin. Los transformantes resistentes a farmaco se recogieron y se preparo ADN de plasmido.
Para determinar el numero de casetes de expresion en los clones resultantes, el ADN de plasmido se digirio con BglII y BamHI y se analizo por electroforesis en gel de agarosa con un marcador patron de tamano de ADN. Se identifico un clon que contema una unica banda de inserto definida con el tamano de acuerdo con tres casetes de expresion de 2,3 kb y se llamo pPROT55M3-V. El mapeo de la enzima de restriccion se uso para confirmar la orientacion de una formacion de multfmero lineal de cabeza a cola para el vector pPROT55M3-V. La Figura 6 representa el esquema de clonacion de pPROT55M3-V.
La cepa NRRL Y-11430 de P. pastoris natural se uso para transformacion, que se llevo a cabo como se describe en el Ejemplo 4, excepto que el vector pPROT55M3-V se linealizo con BglII en lugar de SacI antes de la transformacion. Los transformantes resistentes a farmaco se cultivaron y se seleccionaron para la expresion de la proprotema pPROT55M3 como se describe en el Ejemplo 4.
La optimizacion de condiciones en matraz de cultivo de agitacion se realizo para minimizar la escision espontanea durante la induccion. La optimizacion en matraz de agitacion se baso en dos variables, temperatura de induccion y composicion del medio de induccion. Primero, se encontro que realizar la induccion a 22 °C en comparacion con 25 °C produjo una mayor relacion de proenzima con respecto a enzima madura en el sobrenadante de cultivo para todas las composiciones de medio probadas. Segundo, la adicion de citrato de sodio para aumentar la concentracion de tamponamiento del medio de induccion se produjo en ausencia de enzima madura espontaneamente convertida en el sobrenadante de cultivo a traves de todas las concentraciones de citrato de sodio probadas (12,5 a 50 mM). Los efectos de estas variables sobre el rendimiento de la expresion de proprotemas y la estabilidad en sobrenadante de matraz de agitacion con el tiempo se ilustran en la Figura 7.
El clon de tres copias de alta expresion 201-55M3-003-VU se selecciono para analisis de fermentacion con ampliacion a escala usando procedimientos de fermentacion establecidos para el clon 201-55-001-VU descritos del siguiente modo. La fermentacion del clon 201-55-001-VU se efectuo descongelando un vial del banco de celulas y usandolo para inocular un matraz de agitacion que contema 500 ml de medio de crecimiento BKGY a pH 5,7. El cultivo de siembra se cultivo durante 24 horas con agitacion a 28 °C hasta que el peso de celulas humedas fue de aproximadamente 40 g/l. El fermentador que contema medio de crecimiento BKGY a pH 5,7 se esterilizo en el autoclave. Despues de enfriar los medios a 28 °C se anadieron los suplementos que incluyen base de nitrogeno de
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levadura y biotina. El fermentador se inoculo a una relacion de 1:33 de cultivo de siembra con respecto a medio de crecimiento BKGY.
El procedimiento de fermentacion empezo con un lote de alimentacion de glicerol y glicerol alimentado a pH 5,7 a 28 °C. El pH se controlo por disoluciones al 10% de acido fosforico y al 30% de sulfato de amonio. El cultivo se agito de 300-1000 rpm con aireacion para controlar el oxfgeno disuelto al 40%. Despues de agotarse el lote de glicerol inicial y disolverse el oxfgeno enriquecido, que indica el agotamiento del glicerol del sistema, se alimento 50% de glicerol adicional a 131 g/h hasta que el peso de celulas humedas alcanzo preferentemente entre 200 g/l y 300 g/l. Despues de alcanzar el peso de celulas humedas 200 g/l-300 g/l, la induccion se inicio inmediatamente con un bolo de metanol de 0,025 ml por gramo de biomasa humeda. Despues del agotamiento del bolo de metanol y el aumento del oxfgeno disuelto, la induccion continuo mediante la adicion de cantidades limitantes de metanol con una tasa de alimentacion constante de 0,0034 g de metanol/g de peso de celulas humedas/h. Al empezar la alimentacion de metanol constante, el pH del caldo de fermentacion se cambio de 5,7 a 5,5 y la temperatura se cambio de 28 °C a 22 °C. La fermentacion se recogio despues de 70 horas de induccion.
Para determinar los rendimientos relativos de clones de una unica copia y de 3 copias, el clon 201-55-001-VU, que contiene un integrante genomico del vector pPROT55-V de una unica copia, se fermento en paralelo con el clon 201- 55M3-003-VU, que contiene un integrante genomico del vector pPROT55M3-V de 3 copias. Las fermentaciones se llevaron a cabo como se ha descrito anteriormente, excepto que el pH del cultivo se mantuvo a 5,7 durante toda la induccion. Los sobrenadantes recogidos de las fermentaciones de 201-55-001-VU y 201-55M3-003-VU se analizaron por SDS-PAGE en gradiente, seguido de tincion con azul coloidal (Figura 8), que mostro que la mayor expresion de proprotemas se obtuvo del clon 201-55M3-003-VU de multiples copias en comparacion con el clon 201-55-001-VU de una unica copia. Los resultados de SDS-PAGE se confirmaron con analisis de HIC-HPLC de concentracion de proprotema en los sobrenadantes de fermentacion, demostrando que el clon 201-55M3-003-VU produjo aproximadamente 600 mg/l de la proprotema secretada, mientras que el clon 201-55-001-VU produjo aproximadamente 400 mg/l. Asf, el clon 201-55M3-003-VU de multiples copias que contiene tres casetes de expresion produjo aproximadamente un 50% mas de proprotema en comparacion con el clon 201-55-001-VU de una unica copia que contiene un unico casete de expresion.
Se probaron dos estrategias de conversion usando el sobrenadante de 201-55M3-003-VU producido a partir de la fermentacion. Estas estrategias generalmente siguen las estrategias descritas para otras variantes de proprotema en el Ejemplo 5, excepto que se realizaron a mayor escala. En la primera estrategia, la proprotema se capturo del sobrenadante por cromatograffa de intercambio cationico, seguido de conversion en la protema madura y cromatograffa de pulimento. En la segunda estrategia, la proprotema se convirtio en la protema madura antes de la purificacion, seguido de captura usando cromatograffa de intercambio cationico, una amplia conversion para eliminar las variantes del extremo N, y adicionalmente cromatograffa de pulimento. Ambas estrategias tambien incluyeron una amplia etapa de incubacion en un tampon a pH 8,0 despues de la conversion para efectuar la degradacion selectiva de las variantes del extremo N.
Usando la primera estrategia, la captura de la proprotema, seguida de la conversion y purificacion por pulimento de PRT-201, se efectuaron del siguiente modo. El sobrenadante de 201-55M3-003-VU se recogio del cultivo de fermentacion y se congelo a -80 °C. Aproximadamente 7 l de sobrenadante clarificado congelado (3,5 l de la fermentacion de 201-55M3-003-VU descrita anteriormente y 3,5 l de los cultivos en matraz de agitacion 201-55M3- 003-VU preparados generalmente como se describe en Ejemplos 4 y 5) se descongelaron y se diluyeron 8 veces con agua desionizada y citrato de sodio 1 M, pH 4,3, a 2-8 °C para obtener una concentracion final de citrato de sodio 25 mM. El pH de la disolucion se ajusto a 4,7. La disolucion se cargo sobre una columna de intercambio cationico Macroprep High S de 2,3 l de lecho a 76 cm/h a 2-8 °C. La columna se lavo con 5 VC de citrato de sodio 25 mM, pH 4,7, seguido de 5 VC de cloruro sodico 160 mM, citrato de sodio 25 mM, pH 4,7. La proprotema se eluyo con 15 VC de un gradiente lineal a partir de cloruro sodico 160 mM a cloruro sodico 500 mM en citrato de sodio 25 mM, pH 4,7, a 87 ml/min (67 cm/h). El eluato se recogio en fracciones. Las fracciones se analizaron por SDS-PAGE para el contenido de protema (Figura 9). Se observo una pequena cantidad de protema espontaneamente convertida por SDS-PAGE. Las fracciones que contienen la proprotema se reunieron para posterior procesamiento. El material reunido se sometio a analisis de HIC-HPLC, que mostro que consistio en 92% de proprotema y 8% de PRT-201 madura.
Para iniciar la conversion, el material reunido se intercambio por tampon usando filtracion de flujo tangencial en cloruro sodico 100 mM, Tris 20 mM, pH 4,0, usando diafiltracion de volumen constante a 10-12 °C. La filtracion de flujo tangencial se realizo con membranas de celulosa regenerada, una presion transmembrana de 15 psi, una velocidad de flujo cruzado de 20 l/min y un flujo de 800 ml/min. Se anadieron tres diavolumenes de tampon a 2-8 °C a la misma velocidad que el flujo. Posteriormente, se anadieron tres volumenes adicionales de tampon a temperatura ambiente a la misma velocidad que el flujo para elevar la temperatura de la disolucion de conversion a la diana de 26 °C. La filtracion de flujo tangencial se uso para concentrar la disolucion de conversion a la diana de 1,5 mg/ml usando las condiciones de 15 psi de presion transmembrana, 1,2 l/min de velocidad de flujo cruzado y 76 ml/min de flujo. Sin embargo, despues de aproximadamente 2 minutos desde el inicio del procedimiento de concentracion, se observo precipitacion inesperada y se detuvo el procedimiento de concentracion. La concentracion de protema de la disolucion de conversion se determino que era 1,1 mg/ml por absorbancia de UV a 280 nm en un volumen de 570
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ml. Para minimizar la precipitacion adicional, la disolucion de conversion se diluyo a 1 mg/ml con cloruro sodico 100 mM, Tris 20 mM, pH 4,0, y se filtro a traves de una membrana de 0,22 micrometros. Se anadieron dieciseis ml de Tris 3 M, pH 9,0 a la disolucion de conversion. La disolucion de conversion se dispuso en un bano de agua a 26 °C. La reaccion de conversion se monitorizo por analisis de HIC-HPLC. Despues de 30 minutos, la HIC-HPLC mostro que la mayona de la proprotema se ha^a convertido en PRT-201 y algunas de las variantes del extremo N (Figura 10). Despues de 1 hora, la reaccion de conversion consistio en 0% de proprotema, 86% de PRT-201 de longitud completa y 14% de variantes del extremo N. El material de conversion se incubo adicionalmente durante 4 horas mas, momento en el que el analisis de HIC-HPLC mostro que el material de conversion consistio en 98% de PRT- 201 de longitud completa y 2% de variantes del extremo N.
El material de conversion se diluyo 4 veces con agua desionizada y citrato de sodio 1 M, pH 4,3, a una concentracion final de citrato de sodio 25 mM. El pH de la disolucion se ajusto a 5,0 en la preparacion para cargar sobre la columna de pulimento. La disolucion se cargo sobre una columna de intercambio cationico Macroprep High S de 600 ml de lecho a 27 ml/min (83 cm/h). La columna se lavo con 5 VC de citrato de sodio 20 mM, pH 5,0 seguido de 5 VC de cloruro sodico 160 mM, citrato de sodio 20 mM, pH 5,0. La PRT-201 se eluyo con 15 VC de un gradiente lineal a partir de cloruro sodico 160 mm a 500 mM en citrato de sodio 25 mM, pH 5,0, a 87 ml/min (67 cm/h). El eluato se recogio en fracciones. Las fracciones se analizaron por SDS-PAGE para contenido de protema y por ensayo de SLAP para actividad espedfica. Las fracciones que contienen PRT-201 con una actividad espedfica de >30 U/mg se reunieron. Las fracciones de PRT-201 reunidas se diafiltraron por filtracion de flujo tangencial en formulacion tampon (0,1X PBS, pH 5,0). El pH de PRT-201 diafiltrada se ajusto a pH 7,4 y la concentracion de protema se ajusto a 1 mg/ml por filtracion de flujo tangencial. Los viales se llenaron y se liofilizaron como se describe para PRT-201 producida a partir del clon 201-24-266-VU en el Ejemplo 4.
Usando la segunda estrategia, la conversion de proprotema seguida de purificacion de PRT-201 se efectuo del siguiente modo. Se descongelaron aproximadamente 7 l del sobrenadante clarificado congelado de la fermentacion de 201-55M3-003-VU descrita anteriormente y la reaccion de conversion se inicio por filtracion de flujo tangencial con un tampon de conversion que contema Tris 100 mM, pH 8,0, usando diafiltracion de volumen constante a temperatura ambiente con membranas de celulosa regenerada. Dos diavolumenes de Tris-HCl 100 mM, pH 8,0 fueron suficientes para cambiar el pH del concentrado de pH 5,0 a 8,0 y efectuar la conversion. Tambien se realizo un experimento ajustando directamente el pH del sobrenadante clarificado a 8,0 anadiendo una base Tris a una concentracion final de 100 mM y ajustando el pH a 8,0 con hidroxido sodico 1 N. Esto produjo la formacion de precipitados y un sobrenadante turbio, posiblemente debido a la precipitacion de ambos componentes, que eran no deseables. El procedimiento preferido de conversion usando filtracion de flujo tangencial no produjo precipitacion.
La reaccion de conversion se monitorizo por analisis de HIC-HPLC en tiempo real. Despues de la iniciacion de la conversion, la pro-PRT-201 se convirtio en PRT-201 madura lentamente durante las dos primeras horas, seguido de una aceleracion de la conversion (Figura 11). A las 4,5 horas, la reaccion de conversion consistio en aproximadamente 4% de pro-PRT-201, 75% de PRT-201 madura y 21% de variantes del extremo N. A las 6,5 horas, la reaccion de conversion consistio en aproximadamente 1% de pro-PRT-201, 83% de PRT-201 madura y 16% de variantes del extremo N. La reduccion en variantes del extremo N del 21% al 16% de 4,5 ha 6,5 h pueden ser debida a la degradacion de variantes del extremo N por PRT-201 activa de longitud completa, pero esta no se completo y no tan rapidamente como la reduccion en variantes del extremo N observada durante la conversion de pro-PRT 201 purificada. En esta segunda estrategia, prolongar la reaccion de conversion puede no eliminar completamente las variantes del extremo N debido a las protemas que compiten en el sobrenadante que compiten por el sitio activo de elastasa. Para mejorar la reaccion de conversion, el material de post-conversion se capturo y posteriormente se diafiltro en un tampon apropiado parar iniciar una amplia conversion a pH 8,0 para la degradacion selectiva de variantes del extremo N como se describe mas adelante.
La captura de PRT-201 a partir del material de conversion se efectuo del siguiente modo. El material de conversion se intercambio por tampon en citrato de sodio 20 mM, pH 5,0, y se cargo sobre una columna de cromatograffa de intercambio cationico Macro-Prep High S. La columna se lavo con 5 VC de citrato de sodio 20 mM, pH 5,0 seguido de 5 VC de citrato de sodio 20 mM, cloruro sodico 160 mM, pH 5,0. La PRT-201 se eluyo con un gradiente lineal de cloruro sodico 160 mm a 500 mM en citrato de sodio 20 mM, pH 5,0. Las fracciones se analizaron por SDS-PAGE para contenido de protema, HIC-HPLC para variantes del extremo N, absorbancia de UV a 280 nm para concentracion de protema y ensayo de SLAP para actividad de elastasa. Se detectaron dos bandas de protemas predominantes por SDS-PAGE, correspondientes a las glucoformas PRT-201 y PRT-201, como se muestra en la Figura 12. Las fracciones que contuvieron las glucoformas de PRT-201 como se ha determinado por SDS-PAGE o variantes del extremo N como se ha determinado por HIC-HPLC se excluyeron de la reunion. Las fracciones que presentaron actividad espedfica relativamente baja (menos de 30 U/mg) como se ha determinado por ensayo de SLAP tambien se excluyeron de la reunion. Las fracciones restantes que contienen PRT-201 se reunieron para procesamiento adicional. El analisis de HIC-HPLC de las fracciones reunidas revelo que este material consistio en aproximadamente 98% de PRT-201 de longitud completa y 1-2% de variantes del extremo N. El material reunido se almaceno a 2-8 °C durante 12-16 h.
Dada la observacion anterior de que parecio que las variantes del extremo N disminuyeron durante un periodo de conversion prolongado como se ha descrito anteriormente, el material de PRT-201 reunido se sometio a una amplia
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etapa de incubacion a pH 8,0. La amplia incubacion se realizo por diafiltracion y filtracion de flujo tangencial con Tris 100 mM, cloruro sodico 300 mM, pH 8,0 durante 2,5 horas a temperatura ambiente. Despues de 2,5 horas, el material de conversion consistio en 100% de PRT-201 madura como se muestra por analisis de HIC-HPLC. El material de conversion se sometio a diafiltracion y filtracion de flujo tangencial en citrato de sodio 20 mM, pH 5,0 para suprimir la actividad de elastasa y preparar para la cromatograffa en columna. El material de pRT-201 diafiltrado se almaceno durante aproximadamente 64 horas a 2-8 °C.
La purificacion cromatografica por pulimento de PRT-201 se efectuo del siguiente modo. El material de PRT-201 diafiltrado se cargo sobre una columna de intercambio cationico Macro-Prep High S y se lavo con 5 VC de Tampon C (citrato de sodio 20 mM, pH 5,0) seguido de 5 VC de cloruro sodico 160 mM, citrato de sodio 20 mM, pH 5,0. La elucion de PRT-201 se realizo con un gradiente lineal de 15 VC a partir de 68% de Tampon C y 32% de Tampon D (cloruro sodico 160 mM, citrato de sodio 25 mM, pH 5,0) a 0% de Tampon C y 100% de Tampon D (cloruro sodico 500 mM, citrato de sodio 25 mM, pH 5,0), a 50 ml/min (153 cm/h). El eluato se recogio en fracciones. La PRT-201 se eluyo como un pico simetrico a 37 mS/cm (cloruro sodico 330 mM). Las fracciones se analizaron por analisis de SDS-PAGE para contenido de protema, absorbancia de UV a 280 nm para concentracion de protema y ensayo de SLAP para actividad espedfica. Se reunieron las fracciones que conteman PRT-201 que tuvieron una actividad espedfica de 30,1-38,8 U/mg. Las fracciones de PRT-201 se diafiltraron por filtracion de flujo tangencial en tampon de formulacion (0,1X PBS, pH 5,0). El pH de PRT-201 diafiltrada se ajusto a pH 7,4 y la concentracion de protema se ajusto a 1 mg/ml por filtracion de flujo tangencial. Los viales se llenaron y se liofilizaron como se describe para PRT- 201 producida a partir del clon 201-24-266-VU en el Ejemplo 4.
Las condiciones para los procedimientos de conversion descritos anteriormente se eligieron basandose en estudios de optimizacion de la conversion que examinaron la concentracion de protema, temperatura, composicion del tampon, diavolumen y variables de pH. En el primer estudio se analizo el efecto de la concentracion de proprotema sobre la produccion de variantes del extremo N durante la conversion. La pro-PRT-201 purificada a partir del clon 201-55M3-003-VU (pro-PRT-201-55M3-003-VU) a una concentracion inicial de 0,2 mg/ml en fosfato de sodio 20 mM, pH 5,0 se tomo en almuotas y se concentro a 1,0, 1,6 y 1,8 mg/ml usando dispositivos de concentracion centnfuga como se ha determinado por absorbancia de UV a 280 nm. La conversion de la proprotema se efectuo anadiendo Tris y cloruro sodico a 100 mM a cada una de las cuatro muestras de concentracion, ajustando el pH de 5,0 a 8,0 e incubando las muestras a temperatura ambiente. La reaccion de conversion se monitorizo por HIC-HPLC en tiempo real hasta que la proprotema fue < 1% de la protema total (Figura 13). En este momento, la muestra de 0,2 mg/ml consistio en aproximadamente 8% de variantes del extremo N, mientras que las muestras de 1,0 mg/ml, 1,6 y 2,0 mg/ml consistieron en aproximadamente el 14%, 19% y el 29% de variantes del extremo N, respectivamente. El resto de la protema en cada muestra consistio en PRT-201 de longitud completa. Estos resultados demuestran que concentraciones crecientes de pro-PRT-201-55-003-VU durante la conversion conducen a la formacion de mas variantes del extremo N y menos PRT-201 de longitud completa. Otros estudios han sugerido que la conversion de pro-PRT-201-55M3-003-VU se produce a traves de reacciones tanto intramoleculares como intermoleculares. Asf, para esta proprotema de variante, es probable que las reacciones intramoleculares, que se favorecen en disoluciones de proprotema mas diluidas, den lugar a conversion mas precisa, mientras que reacciones intermoleculares, favorecidas en disoluciones de proprotema mas concentradas, produzcan conversion menos precisa, es decir, formacion de un mayor porcentaje de variantes del extremo N con respecto a PRT-201 de longitud completa.
En el segundo estudio se analizo el efecto de la temperatura sobre la produccion de variantes del extremo N durante la conversion. Se produjo pro-PRT-201 purificada del clon 201-55M3-VU (llamada pro-PRT-201-55M3-003-VU) a una concentracion de 1,6 mg/ml, se sometio a conversion como se ha descrito anteriormente a tanto 15 °C como a 26 °C. Las reacciones de conversion se monitorizaron en tiempo real por HIC-HPLC y se permitio el progreso hasta que la proprotema comprendio <1% de protema total. El tiempo requerido para alcanzar esta reduccion en proprotema fue aproximadamente 30 minutos a 26 °C y aproximadamente 90 minutos a 15 °C. En estos momentos se observo un porcentaje similar de variantes del extremo N (aproximadamente 20% de protema total) para ambas temperaturas. Asf, la mayor temperatura de 26 °C produjo una reaccion de conversion mas rapida en comparacion con la menor temperatura de 15 °C, aunque produjo un perfil de producto de reaccion esencialmente identico.
El tercer estudio examino el efecto de la composicion del tampon sobre la solubilidad de proprotemas durante la reaccion de conversion. Pro-PRT-201 purificada (pro-PRT-201-55M3-003-VU) a una concentracion de 1,0 mg/ml se sometio a conversion en las condiciones enumeradas en la Tabla 6. Las reacciones de conversion se realizaron a temperatura ambiente, excepto una que se realizo a 2 a 8 °C (composicion del tampon Tris-HCl 20 mM, cloruro sodico 100 mM, pH 4,0). Las reacciones de conversion se inspeccionaron visualmente para precipitacion. Como se observa en la Tabla 6, las composiciones de tampon que no produjeron precipitacion incluyeron Tris-HCl 100 mM, pH 8,0; Tris-HCl 100 mM, cloruro sodico 100 mM, pH 5,0; y Tris-HCl 100 mM, cloruro sodico 300 mM, pH 8,0. Las composiciones de tampon con menores concentraciones de Tris o sin cloruro sodico a menor pH (es decir, pH 5,0) presentaron precipitacion.
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Tabla 6: Efecto de la composicion del tampon sobre la precipitacion durante la conversion.
Composicion Tampon
Temperatura Precipitacion Observada Soluble (No Observada Precipitacion)
1 mM Tris-HCl, pH 5.0
Ambiente +
25 mM Tris-HCl, pH 5.0
Ambiente +
100 mM Tris-HCl, pH 5.0
Ambiente +
100 mM Tris-HCl, pH 8.0
Ambiente +
20 mM Tris-HCl,100 mM cloruro sodico, pH 4.0
2-8°C +
100 mM Tris-HCl, 100 mM cloruro sodico, pH 5.0
Ambiente +
100 mM Tris-HCl, 300 mM cloruro sodico, pH 8.0
Ambiente +
En el cuarto estudio se analizo el efecto del numero de diavolumenes de la filtracion de flujo tangencial sobre la precipitacion durante la conversion de sobrenadante que contiene proprotema (pro-PRT-201-55M3-003-VU). La disolucion usada para el intercambio de tampon fue Tris-HCI 100 mM, cloruro sodico 100 mM, pH 8,0. Adicionalmente se probo un ajuste directo del pH del sobrenadante de pH 5,0 a 8,0 sin filtracion de flujo tangencial. Como se ha observado en la Tabla 7, el ajuste directo del pH del sobrenadante produjo una gran cantidad de precipitacion. Con 1 diavolumen de intercambio se observo alguna precipitacion. No se observo precipitacion cuando se usaron 2 a 5 diavolumenes.
Tabla 7: Efecto del numero de diavolumenes sobre la precipitacion durante el intercambio de tampon.
Diavolumenes
Precipitacion Observada
0
Precipitacion mayor
1
Precipitacion menor
2
No precipitacion
3
No precipitacion
5
No precipitacion
En el quinto estudio se analizo el efecto del pH sobre la actividad de elastasa de PRT-201 madura. Este estudio se diseno para identificar un intervalo de pH util para conversion que no produjera una perdida irreversible de actividad de elastasa del producto de conversion de PRT-201 madura. Se prepararon disoluciones de 1 mg/ml de PRT-201 en Tris-HCl 20 mM, fosfato de potasio 20 mM a partir de pH 1 a 14. Las disoluciones se mantuvieron a temperatura ambiente durante 0,5, 2, 24 y 48 horas. En los momentos de tiempo indicados, las disoluciones se probaron para actividad de elastasa en el ensayo de SLAP. La actividad de elastasa fue ampliamente estable de pH 3 a 8 en todos los momentos de tiempo. A pH inferiores a 3 y superiores a 8, la actividad de elastasa se redujo en todos los momentos de tiempo, con una correlacion entre momentos de tiempo prolongados y menor actividad de elastasa. Estos resultados indicaron que una reaccion de conversion realizada fuera de un intervalo de pH de 3 a 8 podna afectar negativamente la actividad de elastasa del producto de conversion de PRT-201.
6.8 EJEMPLO 7: PRODUCCION DE ELASTASA PANCREATICA TIPO I PORCINA RECOMBINANTE AUTO- ACTIVADA
Un vector que codifica proenzima ELA-1 porcina auto-activada se expreso en P. pastoris. La ELA-1 porcina auto- activada resultante se comparo con una protema ELA-1 porcina expresada como una proprotema natural activada por tripsina.
Para construir el vector de ELA-1 porcina activada por tripsina, la region codificante de ELA-1 porcina se sintetizo por Blue Heron Biotechnology (Bothell, WA) usando una tecnica de “oligo largo” de no PCR bajo licencia de Amgen (Thousand Oaks, CA). El gen recombinante se clono en el vector pUC de Blue Heron, un derivado de pUC119. El gen de ELA-1 porcina se secuencio en ambas cadenas para confirmar la secuencia correcta. Los sitios de restriccion Sacll y Xbal se incorporaron como posibles sitios de clonacion que flanquean el gen de ELA-1 porcina como se muestra en la Figura 14. Un segundo codon de terminacion tambien se anadio inmediatamente despues del codon
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de terminacion nativo para minimizar la posible ultralectura de ribosomas. La Figura 15 muestra la secuencia de aminoacidos identica en la naturaleza de proenzima ELA-1 porcina, que contiene el sitio activado por tripsina.
La region codificante de ELA-1 porcina se amplifico por PCR usando un par de oligonucleotidos que contienen sitios de restriccion Xhol y Sacll para facilitar la clonacion. El producto de PCR se digirio con Xhol y Sacll y se purifico por electroforesis en gel de agarosa. El fragmento de eLA-1 porcina se clono en el vector PV-1 en los sitios de restriccion Xhol y Sacll. La cepa TOP 10 de E. coli se transformo con la mezcla de ligacion. La mezcla de celulas se sembro sobre placas de LB de baja sal complementado con 25 mg/ml de Zeocin. Se escogieron los clones resistentes a farmaco y se preparo ADN de plasmido (Qiagen, CA). Basandose en analisis de restriccion se identifico un clon que contema el inserto del gen de ELA-1 porcina y el vector se llamo pPROT101-24-V. La secuencia codificante de este vector se confirmo por secuenciacion de aDn. El esquema de clonacion para pPROT101-24-V se representa en la Figura 16.
Usando el vector pPROT101-24-V activado por tripsina se manipularon tres clones auto-activados diferentes cambiando el sitio de escision de tripsina en la region de pro-peptido de ELA-1 porcina a sitios de escision de elastasa. La mutagenesis dirigida a sitio se realizo generalmente como se describe en el Ejemplo 4 usando cebadores de oligonucleotidos sinteticos que contienen las mutaciones deseadas como se describe en la Tabla 8. Todas las mutaciones en la region de pro-peptido se confirmaron por secuenciacion de ADN bicatenario.
.Nombrc del Construct!)
Secuencia de Pro-peptido Secuencia Madura SEQ ID NO.
P7
P6 P5 P4 PZ P2 pi P’1 P’2 P’3
pPROT101-24-V activada por Tripsina
Phe Pro Glu Thr Asn Ala Arg Vaf Val Gly 115
pPROJI 01 -42-V auto-activada
Phe Pro Glu Thr Asn Ala : Ala 1 Val Val Gly 116
Auto-activada
Glv 117
Nombrc del couslructo
Secuencia de Pro-peptido Sccuvnciu mad lira SEQ ID NO.
r f
P6 PE P4 P3 P2 j P1 p’i P'2 P’3
pPROT101-49-V
Phe Pro Glu Thr Asn |;HiS 4 Ala ' Val Val
PPROT101-55L-V Auto-activada
£ Pro Thr Asn Val Val Gly 118
Tabla 8. Secuencias del dominio de escion de los vectores ELA-1 porcinos activados por tripsina y auto-activados. Los codones mutagenizados estan compartidos. El enlace escindido esta entre P1
yP'1
La cepa NRRL Y-11430 de P. pastoris natural se transformo y los transformantes resistentes a farmaco se cultivaron y se seleccionaron para la expresion de las proprotemas ELA-1 porcinas como se describe en el Ejemplo 3. Basandose en el analisis por sDS-PAGE y la tincion con Coomassie (vease la Figura 17 y la Figura 18), los clones de pPROT101-24-V activados por tripsina naturales tuvieron los mayores niveles de expresion en comparacion con los clones auto-activados. De los clones auto-activados, los clones de pPROT101-49-V tuvieron el mayor nivel de expresion, seguido de los clones de pPROT101-55L-V y luego los clones de pPROT101-49-V. Las proprotemas pPROT101-42-V y pPROT101-55L-V auto-activadas presentaron conversion espontanea sustancial durante la induccion, mientras que las proprotemas pPROT101-24-V activadas por tripsina y pPROT101-49-V auto-activadas mostraron mayor estabilidad en el medio de induccion.
Los estudios de la actividad de elastasa de PRT-102 producida por activacion de tripsina de protema proelastasa expresada a partir de pPROT101-24-V mostraron mayor actividad espedfica que PRT-201 como se muestra en la Tabla 9 a continuacion:
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Tabla 9: Actividad de elastasa de tres muestras diferentes de elastasa pancreatica tipo I madura porcina (activada por tripsina) con respecto a elastasa pancreatica tipo I humana madura.
Nombre de la Muestra
PRT-201 PRT-102 PRT-102 PRT-102
Actividad medida por SLAP (U/mg de protema) (Replicas)
34.6 91.8 99.4 100.7
32.9
88.3 91.3 88.6
Media de Replicas
33.6 88.5 93.5 92.9
Desviacion estandar
0.9 3.2 5.2 6.7
Se uso un experimento de conversion a pequena escala para determinar si proprotemas pPROT101-55L-V y pPROT101-49-V podnan convertirse en enzimas maduras que presentaran actividad de elastasa. Se concentraron 10 veces sobrenadantes de matraz de agitacion de pPROT101-55L-V y pPROT101-49-V con una unidad de filtro centnfugo y se diluyeron 5 veces con Tris-HCl 100 mM, pH 9,0. La conversion se dejo avanzar a temperatura ambiente y la actividad de elastasa se monitorizo con el tiempo por ensayo de SLAP. El cambio promedio en absorbancia por minuto se determino a partir de cada momento de tiempo y se informo como velocidad de reaccion no normalizada (Figura 19). La conversion de sobrenadantes de tanto pPROT101-49-V como pPROT101-55L-V produjo un aumento en la actividad de elastasa. Las muestras del momento de tiempo final de cada clon se analizaron por SDS-PAGE, seguido de tincion con Coomassie, y se compararon con muestras de pre-conversion (Figura 20). Los resultados de SDS-PAGE confirmaron que casi toda la proprotema pPROT101-49-V se convirtio en protema madura al final del ensayo de conversion. Los resultados de SDS-PAGE tambien mostraron que casi toda la pPROT101-55L-V se habfa convertido espontaneamente en protema madura antes del ensayo de conversion.
Preparaciones purificadas de proprotemas pPROT101-24-V y pPROT101-49-V y enzimas maduras se enviaron al Centro de investigaciones cienffficas para plantas Danforth, Mo, para el analisis de peso molecular intacto. Las proprotemas se purificaron por cromatograffa de intercambio cationico (Macroprep High S, Bio-Rad). Para analisis de enzimas maduras, las proprotemas de ambos clones se trataron primero para producir enzimas maduras y luego se purificaron por cromatograffa de intercambio cationico. La proprotema activada por tripsina se trato con tripsina, mientras que la proprotema auto-activada se convirtio en presencia de Tris-HCl 100 mM, pH 9,0, seguido de cromatograffa de intercambio cationico. Los picos principales obtenidos del analisis de espectrometna de masas se enumeran en la Tabla 10.
Tabla 10: Pesos moleculares esperados y observados para protemas ELA-1 porcinas.
Protema
MW Esperada MW Observada
Proprotelna pPROT101-24-V Activada por Tripsina
27068 27064
Enzima maduro pPROT101-24-V activado por Tripsina
25908 25898
Proprotelna pPROT101-49-V auto-activada
27049 27047
Enzima maduro pPROT101-49-V auto-activado
25908 25910
Los resultados de SDS-PAGE, actividad de elastasa y espectrometna de masas demostraron que las formas auto- activadas de elastasa pancreatica porcina tipo I pueden producirse manipulando la secuencia de propeptidos para sustituir el sitio de escision de tripsina con un sitio de escision de elastasa. Los niveles de expresion de estas formas auto-activadas de elastasa pancreatica porcina tipo I son inferiores a los de la forma activada por tripsina natural. De los clones autoactivados probados, aquellos con la secuencia de pro-peptidos de pPROT101-49-V mostraron el mayor nivel de expresion y la menor conversion espontanea. La conversion de los clones de pPROT101-49-V y pPROT101-55L-V produjo la produccion de protemas maduras con sustancial actividad de elastasa. Los analisis de espectrometna de masas revelaron que los pesos moleculares de proprotema pPROT101-49-V y porcina madura tipo I se correspondieron con las masas esperadas.
6.9 EJEMPLO 8: ANALISIS DE ACTIVIDAD DE TRIPSINA DE ELASTASA-1 HUMANA RECOMBINANTE MADURA POR ENSAYO DE SUSTRATO DE PEPTIDO COLORIMETRICO DE BENZ
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Se realizo un ensayo de hidrolisis colorimetrico usando el sustrato de peptidos pequenos N-benzoil-Phe-Val-Arg-p- Nitroanilida (BENZ) para determinar si protema elastasa madura purificada producida por el clon auto-activado 201- 55M3-003-VU posee actividad de tripsina. Se recuperaron tres viales de PRT-201 purificada liofilizada del clon 201- 55M3-003-VU del almacenamiento a -80 °C y se reconstituyeron con agua para obtener 1 mg/ml de PRT-201 en 0,1 X PBS, pH 7,4. Las concentraciones de protema se confirmaron midiendo absorbancia de UV a 280 nm. Se uso una disolucion madre de TrypZean (10 mg/ml) para generar una curva patron para actividad de tripsina. Se incluyo una muestra de PRT-201 activada por tripsina previamente probada como control positivo. Ademas, algunas muestras experimentales y de control se concentraron con TrypZean para determinar la recuperacion de actividad de tripsina en presencia de PRT-201. Se trato un subconjunto de las muestras concentradas y sin concentrar con inhibidor de tripsina de soja (SBTI) para determinar la capacidad de SBTI para inhibir cualquier actividad de tripsina intrmseca o concentrada. Tambien se trataron patrones de TrypZean con SBTI para confirmar la eficacia del inhibidor. Vease la Tabla 11 mas adelante para un resumen de las muestras incluidas en este estudio.
Tabla 11: Diluciones de TrypZean para la curva patron se prepararon usando el tampon de ensayo (Tris 0,1 M, pH 8,3). La curva patron para disoluciones de TrypZean se muestra en la Figura 21.
Description
No adicion Mas concentration de TrypZean (a 100 ng/mL) Mas SBTI (a 10 ug/mL) Mas concentracion de TrypZean y SBTI
PRT-201 del clon 55M3 Frasco #1
V V V V
PRT-201 del clon 55M3 Frasco #2
V V V V
PRT-201 del clon 55M3 Frasco #3
V V V V
PRT-201 del clon activado por tripsina
V V V V
Solo Tampon (0.1 M Tris, pH 8.3)
V No realizada V No realizada
TrypZean estandar, 1.56 ng/mL
V No realizada V No realizada
TrypZean estandar, 3.13 ng/mL
V No realizada V No realizada
TrypZean estandar, 6.25 ng/mL
V No realizada V No realizada
TrypZean estandar, 12.5 ng/mL
V No realizada V No realizada
Tr5ypZean estandar, 25 ng/mL
V No realizada V No realizada
TrypZean estandar, 50 ng/mL
V No realizada V No realizada
TrypZean estandar, 100 ng/mL
V No realizada V No realizada
Se preparo la disolucion de sustrato (0,4 mg/ml de N-benzoil-Phe-Val-Arg-p-Nitroanilida lote 7733 en Tris 0,1 M, pH 8,3) y se precalento a 30 °C en un bano de agua. Por triplicado, se pipetearon 100 microlitros de cada muestra en una microplaca de 96 pocillos. Usando un pipeteador multicanal, 200 microlitros de disolucion de sustrato se pipetearon en cada pocillo y la microplaca se dispuso inmediatamente en un lector de microplacas precalentado a 30 °C. El lector de microplacas registro la absorbancia a 405 nm para cada pocillo una vez por minuto durante 60 minutos.
Las muestras de PRT-201 tambien se probaron para actividad de elastasa en el ensayo de SLAP. Se preparo disolucion de sustrato de SLAP (4,5 mg/ml de SLAP en Tris 0,1 M, pH 8,3) y se precalento a 30 °C en un bano de agua. Las muestras de 1 mg/ml de PRT-201 se diluyeron 20X con agua a 0,05 mg/ml. Por triplicado, 10 microlitros
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de cada dilucion de muestra se pipetearon en una placa de 96 pocillos. Usando un pipeteador multicanal, 300 microlitros de la disolucion de sustrato de SLAP se pipetearon en cada pocillo y la microplaca se dispuso inmediatamente en un lector de microplacas precalentado a 30 °C. El lector de microplacas registro la absorbancia a 405 nm para cada pocillo una vez por minuto durante 5 minutos.
Los resultados de los ensayos de actividad de BENZ y SLAP se presentan respectivamente en las Tablas 12 y 13 a continuacion.
Tabla 12. Actividad de tripsina media, informada como concentracion de TrypZean equivalente (ng/ml). [a]
Coeficiente de regresion < 0,8.
Descripcion
No adicion Mas concentracion de TrypZean (a 100 ng/mL) Mas SBTI (a 10 ug/mL) Mas concentracion de TrypZeane y SBTI
PRT-201 del clon 55M3 Frasco #1
<1.56 [a] 118.7 <1.56 [a] <1.56 [a]
PRT-201 del clon 55M3 Frasco #2
<1.56 [a] 122.4 <1.56 [a] <1.56 [a]
PRT-201 del clon 55M3 Frasco #3
<1.56 [a] 122.8 <1.56 [a] <1.56 [a]
PRT-201 del clon activado por tripsina
8.7 130.0 <1.56 [a] <1.56 [a]
Tampon solo (0.1 M Tris, pH 8.3)
1.3 No realizada <1.56 [a] No realizada
TrypZean estandar, 1.56 ng/mL
2.7 No realizada <1.56 [a] No realizada
TrypZean estandar, 3.13 ng/mL
3.7 No realizada <1.56 [a] No realizada
TrypZean estandar, 6.25 ng/mL
6.5 No realizada <1.56 [a] No realizada
TrvpZean estandar, 12.5 ng/mL
11.2 No realizada <1.56 [a] No realizada
Tr5vpZean estandar, 25 ng/ml
23.5 No realizada <1.56 [a] No realizada
TrvpZean estandar, 50 ng/mL
49.4 No realizada <1.56 [a] No realizada
TrypZean estandar, 100 ng/mL
102.4 No realizada <1.56 [a] No realizada
Tabla 13. Actividad de SLAP media, informada como U/mg
Descripcion
No adicion
PRT-201 del clon 55M3 Frasco #1
34.9
PRT-201 del clon 55M3 Frasco #2
36.6
PRT-201 del clon 55M3 Frasco #3
35.7
PRT-201 del clon activado por tripsina
32.1
5
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El nivel de actividad de tripsina de PRT-201 del clon 201-55M3-003-VU estuvo por debajo del intervalo de la curva patron en el ensayo de actividad de tripsina (<1,56 ng/ml). Adicionalmente, los coeficientes de regresion para las reacciones de hidrolisis por triplicado fueron malos (<0,8), respaldando adicionalmente la ausencia de actividad de tripsina en esta protema elastasa madura auto-activada. A diferencia, se determino que el nivel de actividad de tripsina de la muestra activada por tripsina de control era 8,7 ng/ml.
7. LISTADO DE SECUENCIAS
SEQ ID NO.
Descripcion Tipo de Secuencia Secuencia
1
Elastasa I humana madura, Incluyendo la primera “valina” Aminoacido, Formato de una sola letra, en donde: X = V o L VVGGTEAGRNSWPSQISLQYRSGGSRYHTCGGTL IRQNWVMTAAHCVDYQKTFRWAGDHNLSQNDGT EQYVSVQKIWH PY WN SD N VAAG Y DIAILRLAQSV TLNSYVQLGVL PQ6G A1 LAN N S PC Y IT G WGKTKTN GQLAQTL QQA Y LPSVDYAtCSSSS YWG STVKNTM VCAGGDGVRSGCQG DSG GPLHCLVNGKYSXHGV TSFVSSRGCNVSRKPTVFTQVSAYISWINNVIASN
2
Elastasa I humana madura, menos primera "valina" Aminoacido, formato de una sola letra, en donde: X = V o L VGGTEAGRNSWPSQISLQYRSGGSRYHTCGGTLI RQNWVMTAAHCVDYQKTFRWAG DH NLSQN DGT EQYVSVQK 1WH PYWN S D N VAAG Y DIALLRLAGSV TLNSYVQLGVLPQ EG Al LAM NS PC YITG WG KTKTN GQ LAQTLQQA VLPS VD YAICSSS S Y WGS TVKN TM VCAGGDGVRSGCQGDSG GPLHCLVNG KYSXHGV TSFVSSRGCNVSRKPTVFTQVSAYISWINNV1ASN
3
Elastasa I humana madura, menos las primeras dos "valinas" Aminoacido, formato de una sola letra, en donde: X = V o L G GTEAG R NS W PSQ1S LQ Y RSG GSR Y H TCGG TLIR QN WVM TAA HCVO YQ KTFRWAGD HNLSQNDGTE QYVSVQK IWH PYWN SDNVAAGYDIALLRLAQSVT L N S YVQ LGVLPQEGAILANNS F*C Yl TGWG KTKTN G QLAQT LQQA YL PS VD YAICSS SS YWGSTVK N TM V CAGGDGVRSG CQ GDSGGPLHCLVNGKYSXHGVT SFVSSRGCNVS RKPTVF TQ VS AYISWINNVIASN
4
Elastasa I humana madura,con la primera "valina" sustituida por "alanina" Aminoacido, formato de una sola letra, en donde: X = V o L AVGGTEAGRNSWPSQISLQYRSGGSRYHTCGGTL IRQNWVMTAAHCVDYQKTFRWAGDHNLSQNDGT E QYVSVQK 1W H P Y WNSDN VAAG Y D1ALLR LAOS V TLNSYVQLGVLPQ EG AILANNSPCYITGWGKTKTN GQLAQTL QQA YLPS VD YA 1 CSSS S Y WG STVKNTM VCAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCLVNGKYSXHGV TSFVSSRGCNVSRKPTVFTQVSAYISWINNVIASN
5
Elastasa I humana madura (isotipo 2), incluyendo la primera "valina" Aminoacido, formato de una sola letra WGGTEAGRNSWPSQISLQYRSGGSRYHTCGGTL 1RQ N W V MTAA H CVD Y QKTFRVVAGDHNLSQNDGT EQYVSVQK 1W H P Y WN S DN VAAG Y D1ALLRLAQS V TLNSYVQLGVL PQEG Al LAN NS PC YITGWGKTKTN GQLAQTL QQAYLPS VD YA 1 CSSS S YWG STVKNTM VCAGGDGSSLWMPG
6
Proprotelna de elastasa manipulada no. 1 (variante pPROT42) Aminoacido, formato de una sola letra, en donde X = V o L TQDLPETNAAWGGTEAGRNSWPSQISLQYRSGG S R Y HTCGGTLI RQ N WVMTAAHCVDYQKTF RWAG DHNLSQNDGTEQYVSVQKIVVH P Y WNS DN V AAGY D1A LL R LAQS VTL N S Y VQLG V LPQEGAILANNSPCYI TGWGKTKTNGQ LAQTLQQA Y LPSVDYAICSSSSY WG S TVK N TM VC AGGD GV RS GCQG DSGGPLHCLV N G KYSX H G VTS FVSSRGCNVSRK PTVFTQVSA Y IS WINNVIASN
7
Proprotelna de elastasa manipulada no. 2 Aminoacido, formato de una sola letra, en donde: X = V o L TQD LP ETN AAAV GGTEAGRNSWPSQlSLQYRSGG SRYHTCGGTLI RQNWVMTAAHCVDYQKTFRWAG DHN LSQNDGTEQYVSVQKIWHPYWNS DNVAAGY D1 ALLR LAQS VTL NSYVQLGVLPQEGAILANNSPCYI TGWGKTKTNGQLAQTLQ QA Y LPSVDYAICSSSSY WG STVK NTM VC AGG DGVRSGCQGDSGGPLHCLV NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTQVSAYIS WINNVIASN
8
Proprotelna de elastasa manipulada no. 3 Aminoacido, formato de una sola letra, en donde: X = V o L TQDLPETAAAWGGTEAGRNSWPSQISLQYRSGG SRYHTCGGTLI RQNWVMTAAHCVDYQKTFRWAG DHN LSQNDGTEQWSVQKIWH PYWNS DNVAAGY DIALLRLAQSVTLNSYVQLGVLPQEGAILANN SPCY1 TGWGKTKTNGQLAQTLQQAYLPSVDYAICSSSSY WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCLV NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTQVSAYIS WINNVIASN
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Proprotelna de elastasa manipulada no. 4
Aminoacido, Formato de una sola letra, en donde:
X = V o L
TQDLPETN NAPVGGTEAG RNSWPSQISLQYRS GG
SRYHTCGGTLIRQNWVMTAAHCVDYQKTFRWAG
D H N LSQNDGTEQ YVSVQKIWHPYWN SDN VAAGY
DIALLRLAOSVTLNSYVQLGVLPQEGAILANNSPCYI
TGWGKTKTNGQLAQTLQQAYLPSVDYAICSSSSY
WG STVKNTM VCAGG DGVRSGCQG DSGG PLHCLV
NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTQVSAYIS
WINNVIASN
10
Elastasa del tipo salvaje no. 5 (producida de la secuencia de tripsina activada por pPROT24)
Aminoacido, Formato de una sola letra, en donde:
X = V o L
TQDLPETNARVVGGTEAGRNSWPSQISLQYRSGG S RYHTCGGTU RQN WVMTAAH CVDYQKTFRWAG DHNLSQNDGTEQYVSVQKIVVHPYWNSDNVAAGY DIALLRLAQSVTLNSYVQLGVLPQEGAILANNSPCYI TG WG KTKTN GQL AQTLQQA Y LPSVDYAICSSSSY WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCLV NG KY SXHGVTS FVSS RGCN VS RKPTVFTQVSAYIS WINNVIASN
Secuencia de
11
reconocimiento de elastasa de consenso 1 (Posiciones Xaai=P3, Xaa2=P2, Xaa3=P1)
Aminoacido, formato de tres letras
Xaai Xaa2 Xaa3
Xaai= alanina, leucina, isoleucina, metionina, lisina, asparagina o valina
Xaa2 = prolina, alanina, leucina, isoleucina, glicina, valina, o treonina
Xaa3 = alanina, leucina, valina, isoleucina, o serina
12
Secuencia de reconocimiento de elastasa de consenso 2 (Posiciones P3- P2-P1)
Aminoacido, formato de tres letras
Xaa1 Pro Xaa2
Xaai = alanina, leucina, isoleucina, metionina, lisina, o valina
Xaa2= alanina, leucina, valina, isoleucina, o serina
13
Secuencia de reconocimiento de elastasa de consenso 3 (Posiciones P3- P2-P1)
Aminoacido, formato de tres letras
Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa1= asparagina or alanina Xaa2 = prolina or alanina Xaa3 = alanina o leucina o valina
14
Secuencia de reconocimiento de elastasa 1 (Posiciones P3- P2-P1)
Aminoacido, formato de tres letras
Ala Ala Ala
15
Secuencia de reconocimiento de elastasa 2 (Posiciones P3- P2-P1)
Aminoacido, formato de tres letras
Asn Ala Ala
16
Secuencia de reconocimiento de elastasa 3 (Posiciones P3- P2-P1)
Aminoacido, formato de tres letras
Asn Ala Pro
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60
17
Secuencia de reconocimiento de la tripsina del tipo salvaje (pPROT24) (Posiciones P3- P2-P1) Aminoacido, formato de tres letras Asn Ala Arg
18
Secuencia de reconocimiento de elastasa 5 (Posiciones P3- P2-P1) Aminoacido, formato de tres letras Ala Pro Ala
19
Secuencia de reconocimiento de elastasa 6 (Posiciones P3- P2-P1) Aminoacido, formato de tres letras Ala Ala Pro
20
Secuencia de reconocimiento de elastasa 7 (Posiciones P3- P2-P1 de las Variantes 48 y 55) Aminoacido, formato de tres letras Asn Pro Ala
21
Secuencia de reconocimiento de elastasa 8 Aminoacido, formato de tres letras Leu Pro Ala
22
Secuencia de activacion de la elastasa humana 1 (Tipo salvaje) Aminoacido, formato de tres letras Thr Gln Asp Leu Pro Glu Thr Asn Ala Arg
23
Secuencia de activacion de la elastasa humana 2 Aminoacido, formato de tres letras Thr Gln Asp Leu Pro Glu Thr Asn Ala Ala
24
sitio de escision pro-PROT-201 Aminoacido, formato de tres letras Thr Asn Ala Arg Val Val Gly Gly
25
sitio de escision pPROT40 Aminoacido, formato de tres letras Thr Ala Ala Ala Val Val Gly Gly
26
sitio de escision pPROT41 Aminoacido, formato de tres letras Thr Asn Ala Ala Ala Val Gly Gly
27
sitio de escision pPROT42 Aminoacido, formato de tres letras Thr Asn Ala Ala Val Val Gly Gly
28
sitio de escision pPROT43 Aminoacido, formato de tres letras Thr Asn Ala Pro Val Val Gly Gly
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
29
sitio de escision pPROT44 Aminoacido, formato de tres letras Thr Gly Ala Gly Ile Val Gly Gly
30
sitio de escision pPROT45 Aminoacido, formato de tres letras Thr Val Pro Gly Val Val Gly Gly
31
sitio de escision pPROT46 Aminoacido, formato de tres letras Thr Ala Pro Gly Val Val Gly Gly
32
sitio de escision pPROT47 Aminoacido, formato de tres letras Thr Asn Pro Gly Val Val Gly Gly
33
Region codificante de una elastasa-1 humana (N° de Entrada NCBI No. N_001971) Nucleotido A C C C A GG AC CTT CCG G AAACCAAT GCCCGCGTA GTCGGAGGGACTGAGGCCGGGAGGAATTCCTG G CCCTCT CAG ATTT CCCTCCAGTACCGGTCTGG AGGTTCCCGGTAT CACACCT GTGGAGGGACCCT T AT CAGACAGAACTGG GT GATGACAGCTGCTCA C TG C GTG G ATTACCAG AAGACTTTCCGCGTGG T G G CTGG AG ACCATAAC CTG AGC C AG AATG ATG G CACTGAGCAGTACGTGAGTGT GCAGAAGAT CGT GGTGCATCCATACTGGAACAGCGATAACGTGGC TGCCGGCTATGACATCGCCCTGCTGCGCCTGGC C CAG AGCGTTACCCTCAATAGCTAT GTCCAGCTG GGTGTTCTGCCCCAGGAGGGAGCCATCCTGGCT AACAACAGTCCCTGCT AC AT CACAGGCTGGGGC AAG AC C A AG AC C AAT G GGC AGCTGG CCCAG AC C CTG CAG CAG G CTTAC CTGCCCTCTGTGGACTAC GCCAT CTGCTC C AGCTCC TCCTACTGGGGCTCC ACTGTG AAG AACACCATGGTGTGTGCTGGT GGA GATGGAGTTCGCTCTG GAT GCCAGGGTG ACT CT GGGGGCCCCCTC CATT G CTTG GT G AAT GG C AAG TATTCTGTCCATGG AG TG ACCAG CTTT G TGTC C A GCCGGGGCTGTAATGTCTCCAGGAAGCCTACAG TCTT CAC CCAGG TCTC T G CTTACAT CTCCTGGAT AAATAA T G T CAT CGCCT C C AAC TG A
34
Peptido senal del factor alfa de levadura Aminoacido, formato de tres letras Met-Arg-Phe-Pro-Ser-lte-Phe-Thr-Ala-VaMeu-Phe- Ala-Ala-Se r-Se r-Ala-Leu-A) a-Ala -Pro-Va l-As n-Thr-
35
Cebador 20F Nucleotido ggctcgagaaaagagaggctgaagctactcaggaeettccggaaac caatgcccgg
36
Cebador 24R Nucleotido gggccgcggcttatcagttggaggcgatgacat
37
Elastasa variante del sitio de escision pPROT42 P3 Aminoacido, format de una sola letra, en donde: X -V o L AAV VG GT EAG R NS WPSG1SLQ Y RSG G S R Y H T CG GTLIRQNWVMTAAHCVDYQKTFRWAGDHNLSQN DGTEQYVS VQKIVVH PYWNSDN VAAGYDIALLRLA QSVTLNSYVQLGVLPQEGAILANNSPCYITGWGKT KTN GQ LAQ TLQQAY LPSVDYAICSSSS Y WGSTVK NTMVCAGGDGVRSGCQGDSGG PLHCL VNG KYSX HGVTS FVSSRGC N VSRKPTVFTQVSAYISWIN N VIA SN
60
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
38
Elastasa variante del sitio de escision pPROT42P2 Aminoacido, formato de una sola letra, en donde: X = V o L AWGGTEAGRNSWPSQlSLQYRSGGSRYHTCGGT LIRQNWVMTAAH CVDYQKTF R V VAG D H N LSQ N DG TEQYVSVQK1WH PY WN S D N V AAG Y D1 ALL RLAQ S VTLNSYVQLG VLPQEGAILANNSPCYITG WG KTKT N GQ L AQTLQQ A Y L PS VDYA1 CSS SS YWG STVKN T MVCAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCLVNGKYSXHG VTS FVSSRGCNVSRKPTVFT QV SAY 1SW IN NVIAS N
39
Elastasa I pancreatica porcina madura (del N° de Entrada GenBank P00772.1) Aminoacido, formato de una sola letra WGGTEAQRNSWPSQISLQYRSGSSWAHTCGGTL IRQNWVMTAAHCVDRELTFRWVGEHNLNQNDGT EQYVGVQK1W H P Y WN TD DVAAG YD IALLRLAQSV TLNS YVQLGVLPRAGTI LAN NS PCYITGWG LTRTN GQLAQTLQQAYLPTVDYAICSSSSYWGSTVKNSM VCAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCLVNGQYAVHGV TSFVSRLGCNVTRKPTVFTRVSAYISWINNVIASN
40
Dominio de escision del propeptido variante de elastasa 40 Aminoacido, formato de tres letras Glu Thr Ala Ala Ala Val Val Gly
41
Dominio de escision del propeptido variante de elastasa 41 Aminoacido, formato de tres letras Glu Thr Asn Ala Ala Ala Val Gly
42
Dominio de escision del propeptido variante de elastasa 42 Aminoacido, formato de tres letras Glu Thr Asn Ala Ala Val Val Gly
43
Dominio de escision del propeptido variante de elastasa 43 Aminoacido, formato de tres letras Glu Thr Asn Ala Pro Val Val Gly
44
Dominio de escision del propeptido variante de elastasa 44 Aminoacido, formato de tres letras Glu Thr Gly Ala Gly Ile Val Gly
45
Dominio de escision del propeptido variante de elastasa 45 Aminoacido, formato de tres letras Glu Thr Val Pro Gly Val Val Gly
46
Dominio de escision del propeptido variante de elastasa 46 Aminoacido, formato de tres letras Glu Thr Ala Pro Gly Val Val Gly
47
Dominio de escision del propeptido variante de elastasa 47 Aminoacido, formato de tres letras Glu Thr Asn Pro Gly Val Val Gly
48
Dominio de escision del propeptido variante de elastasa 48 Aminoacido, formato de tres letras Glu Thr Asn Pro Ala Val Val Gly
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
49
Dominio de escision del propeptido variante de elastasa 49 Aminoacido, formato de tres letras Glu Thr Asn His Ala Val Val Gly
50
Peptido serial, propeptido y secuencia espaciadora 1 del factor de acoplamiento alfa de levadura Aminoacido, formato de tres letras Met-Arg-Phe-Pro-Ser-ile-Phe-Thr-Ala-Val-Leu-Phe- Al a-AI a-Ser-Se r-Ala- Leu-Al a-Ala-P ru-Va l-As n-Thr- Thr-Thr-Glu-Asp-Glu-Thr-Ala-Gln-lle-Pro-Ala-Glu- Ala-Val-lle-Gly-Tyr-Leu-Asp-Leu-Glu-Gly-Asp-Phe- Asp-Val-Ala-Val-Leu-Pro-Phe-Ser-Asn-Ser-Thr-Asn- Asn-Asn-G ly-Leu -L eu-Phe-1 le-As n -Thr-Th r-1 le-AI a- Ser-lle-Ala-Ala-Lys-Glu-GJu-Gly-Val-Ser-Leu-Asp- Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala
51
Peptido senal y secuencia propeptida 2 del factor de acoplamiento alfa de levadura Aminoacido, formato de tres letras Met-Arg-Pde-Pro-Ser-lle-Phe-Thr-Ala-Val-Leu-Phe- Ala-Ala-Se r-Se r-Ala-Leu - Al a-Ala -Pro-Va 1-As n-T h r- Thr-Thr-Glu-Asp-Glu-Thr-Ala-GIn-lle-Pro-Ala-Glu- Ala-Val-lle-Gly-Tyr-Leu-Asp-L.eu-Glu-Gly-Asp-Phe- As p-Va l-Ala-Va 1-Leu-Pro- Phe-Se r-As n-Ser-Thr-Asn- Asn-Asn-Gly-Leu-Leu-Phe-Ile-Asn-Thr-Thr-lle-Ala- Ser-lle-Ala-Ala-Lys-Glu-Glu-Giy-Val-Ser-Leu-Asp-
52
Dominio de escision del propeptido variante de elastasa 52 Aminoacido, formato de tres letras Glu Thr Lys Pro Ala Val Val Gly
53
Dominio de escision del propeptido variante de elastasa 53 Aminoacido, formato de tres letras Glu Thr His Pro Ala Val Val Gly
54
Dominio de escision del propeptido variante de elastasa 54 Aminoacido, formato de tres letras Glu His Asn Pro Ala Val Val Gly
55
Dominio de escision del propeptido variante de elastasa 55 Aminoacido, formato de tres letras His Thr Asn Pro Ala Val Val Gly
56
Dominio de escision del propeptido variante de elastasa 56 Aminoacido, formato de tres letras Pro Thr His Pro Ala Val Val Gly
57
Dominio de escision del propeptido variante de elastasa 57 Aminoacido, formato de tres letras Pro Thr Asn Pro Ala Val Val Gly
58
Dominio de escision del propeptido variante de elastasa 58 Aminoacido, formato de tres letras His Thr His Pro Ala Val Val Gly
10
15
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50
55
60
59
Dominio de escision del propeptido variante de elastasa 59 Aminoacido, formato de tres letras Glu Thr Phe Pro Ala Val Val Gly
60
Dominio de escision del propeptido variante de elastasa 60 Aminoacido, formato de tres letras His Thr Phe Pro Ala Val Val Gly
61
Dominio de escision del propeptido variante de elastasa 61 Aminoacido, formato de tres letras Gly Thr Phe Pro Ala Val Val Gly
62
Dominio de escision del propeptido variante de elastasa 62 Aminoacido, formato de tres letras His Thr Gly Pro Ala Val Val Gly
63
Dominio de escision del propeptido variante de elastasa 63 Aminoacido, formato de tres letras His Thr Lys Pro Ala Val Val Gly
64
Proenzima de elastasa con dominio de escision variante 48 Aminoacido, formato de una sola letra, en donde: X = V o L TQDLPETNPAWGGTEAGRNSWPSQISLQYRSGG SRYHTCGGTLIRQN WV MTAAH CV D YQ KTFRWAG DHN LSONDGTEQYVSVQKIWHPYWN S DNVAAGY DIALLRLAQSVTLNSYVQLGVLPQEGAILANNSPCYI TGWGKTKTNG QL AQ TLQQA Y LPS V DYAICSSSSY WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCQG DSGGPLH CLV NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTQVSAYIS WINNVIASN
65
Proenzima de elastasa con dominio de escision variante 49 Aminoacido, formato de una sola letra, en donde: X = V o L TQDLPETNHAWGGTEAGRNSWPSQISLQYRSGG SRYHTCGGTLIRQNWVMTAAHCVOYQKTFRWAG DHN LSQ NDGTEQYVSVQKIWHPYWN S DNVAAGY DIALLRLAQSVTLNSYVQLGVLPQEGAILANNSPCYI TGWGKTKTNGQLAQTLQ QA Y LPSVDYAICSSSSY WG STVKNTMVCAGGDGVRSGCQGDS GGPL HCLV NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTQVSAYIS WINNVIASN
66
Proenzima de elastasa con dominio de escision variante 52 Aminoacido, formato de una sola letra, en donde: X = V o L TQ D L P ETKPAWG GTE AG RNSWPSQISLQYRSGG SRYHTCGGTLI RQN WVMTAAH CVDYQKTFRWAG DHNLSQNDGTEQYVSVQKIWH pywn SDN vaagy D1ALLRLAQ S VTLN S YVQLG VL PQ EG AILAN N S PC Y1 TGWGKTKTNGQLAQTLQQAYLPSVDYAICSSSSY WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCLV NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTQVSAYIS WINNVIASN
67
Proenzima de elastasa con dominio de escision variante 53 Aminoacido, formato de una sola letra, en donde: X = V o L TQDLPETHPAWGGTEAGRNSWPSQISLQYRSGG SRYHTCGGTLI RQN WVMTAAHCVDYQKTFRWAG DHN LSQNDGTEQYVSVQKIWH PYWNSDN VAAGY DIALLRLAQSVTLN S YVQLGVLPQEGAI LANNSPCYl TGWGKTKTNG QLAQTLQ QA YLPS VDY A1C SS SS Y WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCLV NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTQVSAYIS WINNVIASN
10
15
20
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30
35
40
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50
55
60
68
Proenzima de elastasa con dominio de escision variante 54
Aminoacido, formato de una sola letra, en donde: X = V o L
TQDLPEHNPAWGGTEAGRNSWPSQISLQYRSGG SRYHTCGGTLIRQNWVMTAAHCVDYQKTFRWAG DHN LSQN DGTEQYVSVQKIVVH PYWNSDN VAAGY DIALLRLAQSVTLN S YVQLGVLPQEGAILANNSPCYI TGWGKTKTNGQLAQTLQQAYLPSVDYAICSSSSY WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCLV NGKYSXH G VTS FVSSRGCN VSRKPTVFTQVSAYIS VWNNVIASN________________________________
69
Proenzima de elastasa con dominio de escision variante 55
Aminoacido, formato de una sola letra, en donde: X = V o L
TQDLPHTNPAWGGTEAGRNSWPSQISLQYRSGG SRYHTCGGTLIRQNWVMTAAHCVDYQKTFRWAG DHN LSQNDGTEQYVSVQKIWH PYWNSDNVAAGY DIALLRLAQSVTLN SYVQLGVLPQEGAI LANNSPCYI T G WG KT KT N G QL AQ TLQQA YLP SVDYAICSSSSY WGSTVKNTMVCAGG DGVRSGCQGDSGG PLHCLV NGKYSXH G VTS FVSSRGCN VSRKPTVFTQVSAYIS WINNVIASN
ARV VG G TE AG RNSWPSQISLQYRSGGSRYHTCG
GTLIRQNWVMTAAHCVDYQKTFRWAGDHNLSQN
DGTEQYVSVQKIWHPYWNSDNVAAGYDIALLRLA
QSVTLNSYVQLGVLPQEGAILANNSPCYITGWGKT
KTNGQLAQTLQQAYLPSVDYAICSSSSYWGSWK
NTMVCAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCLVNGKYSX
HGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTQVSAYISWINNVIA
SN
70
Elastasa del tipo salvaje + variante de escision AlaArg
Aminoacido, formato de una sola letra, en donde: X = V o L
71
Elastasa del tipo salvaje + variante de escision Arg
Aminoacido, formato de una sola letra, en donde: X = V o L
RWGGTEAGRNSWPSQISLQYRSGGSRYHTCGG TLIRQ N WV MTAAH CVDYQKTF RWAG DHNLSQND GTEQYVS VQKIW H P YWN S DN VAAGY DIA LLR LAQ S VTL N S Y VQLG VL PQEGAILANNSPCYITGWGKTK TNGQLAQTLQQAYLPSVDYAICSSSSYWGSTVKNT MVCAGGDGVRSGC QG DSGGPLHCLVNGKYSXHG VTS FVSS RGCN VSRKPTVFTQVSAYISWIN NVIASN
72
Peptido de activacion de elastasa humana Variante 48
Aminoacido, formato de tres letras
Thr Gln Asp Leu Pro Glu Thr Asn Pro Ala
73
Peptido de activacion de elastasa humana Variante 55
Aminoacido, formato de tres letras
Thr Gln Asp Leu Pro His Thr Asn Pro Ala
Secuencia de
Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8
74
consenso del dominio de escision de elastasa humana; corresponde a residuos P5, P4, P3, P2, P1, P'1, P'2, yd P'3 de un dominio de escision de elastasa
Aminoacido, formato de tres letras
Xaa1 = glutamato, histidina, prolina, glicina,
asparagina, lisina, o alanina
Xaa2 = treonina, alanina, prolina o histidina
Xaa3 = alanina, leucina, isoleucina, methionine,
lisina, asparagina o valina
Xaa4 = prolina, alanina, leucina, isoleucina, glicina, valina, o treonina
Xaa5 = alanina, leucina, valina, isoleucina, o serina
Xaa6 = alanina, leucina, valina, isoleucina o serina
Xaa7 = glicina, alanina, o valina
Xaa8 = valina, treonina, phenylalanina, tyrosine, o
tryptophan
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
75
Cebador de la mutagenesis de PCR Acido nucleico ATC TAC GTA GTC GGA GGG ACT GAG GCC
76
Cebador de la mutagenesis de PCR Acido nucleico gtc gac aag ctt atc agt tgg agg cga t
77
Variante C- terminal de ELA1 Madura de Talas y otros Protelna, formato de una sola letra W GGTEAGRNSWPSQIS LQY RSGGSRYHTCGGTL IRQN WVMTAAHCVDYQKTFRWAGD HN LSQN DGT EQYVSVQKIWHPYWNSDNVAAGYDIALLRLAQSV TLNS YVQLG VLPQEGAI LAN NS PCYITGWG KTKTN GQLAQTLQQAYLPSVDYAICSSSSYWGSTVKNTM VC AG G DGVRSG CQGDSGGPPPLLG EWQVFSPW SDQLCVQPGL
78
Variantes de ELA1 maduras Protelna, formato de una sola letra, en donde: B = W o R J = M o V X = V o L Z = Q o R WGGTEAGRNSWPSQISLQYRSGGSBYHTCGGTL 1RQNWVJTAAHCVDYQKTFRWAGDHN LSQN DGT EQYVSVQKIWHPYWNSDNVAAGYDIALLRLAQSV TLNS YV QLGVLPQEGAILANNSPCYITGWGKTKTN GQLAQTLQQAY LPSVDYAICSSSSYWGSTVKNTM VCAGG DGVRSGCQGDSGGPLH CLVNGKYSXHGV TSFVSSRGCNVSRKPTVFTZVSAYISWINNVIASN
79
Variantes del peptido de activacion (tipo salvaje, escindible por tripsina) Protelna, formato de una sola letra, en donde U = Q o H TUDLPETNAR
80
Consenso de variantes del peptido de activacion Protelna, formato de tres letras Thr Xaa1 Asp Leu Pro Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa1 = glutamina o histidina Xaa2 = glutamato, histidina, prolina, glicina, asparagina, lisina, o alanina Xaa3 = treonina, alanina, prolina o histidina Xaa4 = alanina, leucina, isoleucina, metionina, lisina, asparagina o valine Xaa5= prolina, alanina, leucina, isoleucina, glicina, valina, o treonina Xaa6 = alanina, leucina, valina, isoleucina, o serina
81
Region codificante de ELA-1.2A Nucleotido ACTCAGGACCTT CCGGAAACCAATGCCCGGGTA GTCG GA G GGACT GAG G CCG G G AGG AACTC CTG GC CC TCT CAG ATTTCCCTCCAGTAC CG GTCTG G AGGTTCCTGGTATCA CACCTGTG G AG GG A C C CT TATCAG AC AG AACTGG GTGAT GACAGCTG C ACA CTGCGTGGATTACCAGAAGACTTTCCGCGTGGT GGCT GG AG AC CAT AAC CTG AG CCAGAATGATGG CACTG AG CAGTAC GTGAGT GTGCAGAAGAT CGT GGTGCATCCATACTGGAACAGCGATAACGTGGC TGCAGGCTATGACATCGCCCTGCTGCGCCTGGC CCAGAGCGTTACCCTCAATAGCTATGTCCAGCTG GGTGTTCTGC CCC AGGAG GG AG CCATCCTGGCT AAC AACAG TCCC TG CT ACATCACAGG CTGGGG C AAGACCAAGACCAATGGGCAGCTGGCCCAGACC TTGCAGCAGGCTTACCTGCCCTCTGTGGACTAT GCCATCTGCTCCAGCTCCTCCTACTGGGGCTCC ACTGT G AAG AAC AC TAT GGTGTGTGCTGGT GGA G AT GGAGTT CG CT CTGGATGT CAGG GT G ACT CT GGGGGCCCCCTCCATT GCTT G GTG AAT GG CAAG TATTCTCTTCATGGAGTGACCAGCTTTGTGTCCA G C CGGGG CTGTAAT GTCTCTAG AAAG CCTAC AG T CTT CAC ACGG GTCTCTG CTTACAT CTCCTGG AT AAATAAT G T CAT C GCC T CC AACT GAT AA
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
82
Producto de la Traduccion de ELA-1.2A (secuencia de pPROT24 activada por tripsina) Protelna, formato de una sola letra T QD LP ETN ARWGG TEAG RN S WPSQ1S LQ Y RS GG SWYHTCGGTLIRQ N WVMTAAH C V D YQ KTF R V VAG DHN LSQNDGTEQYVSVQKIVVHPYWN SDNVAAGY DIALLRLAQSVTLN SYVQ L GVLPQEGAILANNSPCYI TGWGKTKTNGQLAQTLQQAYLPSVOYAICSSSSY WG S TV KNTM VC AG G D G V RSGCQG OSG G PL H C L V NGKYSLHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTRVSAYIS WINNVIASN
83
Variantes del producto de la traduccion de ELA-1.2A (secuencia de pPROT24 activada por tripsina) Protelna, formato de una sola letra, en donde: U = Q o H B = W o R J = M o V X = V o L Z = QoR TU D L PETN AR W GG TE AG RN S WPSQ 1S LQ YRS GG SBYHTCGGTLIRQN WVJTAAH C VDY G KTFRWAG DHNLSQNDGTEQYVSVQKIWHPYWNSDNVAAGY DIALLRLAQSVTLN S YVQLG V LPQEGAILANNSPCYI TGWGKTKTNGQLAQTLQQAYLPSVDYAICSSSSY WG STVK NTM VC AG G DG VRSG COG DSGGPLHCLV NGKYSXHGVTSFVSSRGCN VSRKPTVFTZVSAY1S WINNVIASN
84
Elastasa I humana madura, incluyendo la primera "valina" Aminoacido, format de una sola letra, en donde: B = W o R J = M o V X = V o L Z = Q o R WGGTEAGRNSWPSQISLQYRSGGSBYHTCGGTL IRQNWVJTAAHCVDYQKTFRWAGDHNLSQNDGT EQYVSVQKIWFIPYWNSDNVAAGYDIALLRLAQSV TLNSYVQLGVLPQEGAILANNSPCYIT G WG KTKTN GGLAQTLQQAYLPSVDYAICSSS S Y WGSTVK NT M VCAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCLVNGKYSXHGV TSFVSSRGCNVSRKPTV FTZ VSAY1S W1NN V! AS N
85
Elastasa I humana madura, menos la primera "valina" Aminoacido, formato de una sola letra, en donde: B = W o R J = M o V X = V o L Z = Q o R VGGTEAGRNSWPSQISLQYRSGGSBYHTCGGTLI RQNWVJTAAHCVDYQKTFRVVAGDHNLSQNDGTE QYVSVQKIWH P Y WN SDN V AAG YD IALLRLAQSVT LNSYVQLGVLPQEGAILANNSPCYITGWGKTKTNG QLAQT LQ Q A YL PS VDY AICSSSSYWGSTVKNTMV CAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCLVNGKYSXHGVT SFVSSRGCNVSRKPTVFTZVSAYISWINNVIASN
86
Elastasa I humana madura, menos las primeras dos "valinas" Aminoacido, formato de una sola letra, en donde: B = W o R J = M o V X = V o L Z = Q o R GGTEAGRNSWPSQISLQYRSGGSBYHTCGGTLIR QN WVJTAAHCVDYQKTFRVVAGDHN LSQN DGTE QYVSVQKIWHPYWNSDNVAAG YD IALLRLAQSVT LN SYVQLG VLPQEGAI LAN NS PCYITGWGKTKTNG Q LAQTLQQ A YL PSVDYAICSS SS YW GSTVKNTMV CAGGDGVRS GCQGDSGGPLHCLVNGKYSXHGVT SFVSSRGCNVSRKPTVFTZVSAYISWINNVIASN
87
Elastasa I humana madura, con la primera "valina" sustituida por “alanina" Aminoacido, formato de una sola letra, en donde: B = W o R J = M o V X = V o L Z = Q o R AVGGTEAGRNSWPSQISLQYRSGGSBYHTCGGTL IRQNWVJTAAHCVDYQKTFRWAG DH N LSQN DGT EQYVSVQKIWHPYWNSDNVAAGYDIALLRLAQSV TLNSYVQLGVLPQEGAILANNSPCYITGWGKTKTN GQLAQTLQQAYLPSVDYAICSSSSYWGSTVKNTM VCAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCLVNGKYSXHGV TSFVSSRGCN VS RKPTVFTZVSAYIS WINNVIASN
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
88
Proprotelna de elastasa manipulada no. 1 (variante pPROT42) Aminoacido, formato de una sola letra, en donde: U = Q o H B = W o R J = M o V X = V o L Z = Q o R TUDLPETNAAWGGTEAGRNSWPSQISLQYRSGG SBYHTCGGTURQNWVJTAAHCVDYQKTFRWAG DHN LSQNDGTEQYVSVQKIWHPYWNS DNVAAGY DIAL LRLAQSVTLNSYVGL GVLPQEGAILANNSPCYI TGWGKTKTNGQ L AQTLQQA YL PSVDYAICSSSSY WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCLV NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTZVSAYIS WINNVIASN
89
Proprotelna de elastasa manipulada no. 2 Aminoacido, formato de una sola letra, en donde: U = Q o H B = W o R J = M o V X = V o L Z= Q o R TUDLPETNAAAVGGTEAGRNSWPSQISLQYRSGG SBYHTCGGTLIRQNWVJTAAHCVDYQKTFRVVAG DHNLSQNDGTEQYV S VQ KIVVHPYWNSDNVAAGY DIALLRL4QSVTLNSYVQLGVLPQEGAILANNSPCYI TGWGKTKTNGQLAQTLQQAYLPSVDYAICSSSSY WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCLV NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTZVSAYIS WINNVIASN
90
Proprotelna de elastasa manipulada no. 3 Aminoacido, formato de una sola letra, en donde: U = Q o H B = W o R J = M o V X = V o L Z = Q o R TUDLPETAAAWGGTEAGRNSWPSQISLQYRSGG SBYHTCGGTL IRON WVJTAAH CVDYQKTFRWAG DHN LSQNDGTEQYVSVQKIWH PYWNS DNVAAGY DIALLRLAQSVTLNSYVQLGVLPQEGAILANNSPCYI TGWGKTKTNGQLAQTLQQAYLPSVDYAICSSSSY WGSTVKNTMVCAGG DGVRSGCQG DSGGPLHCLV NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRK PTVFTZ VS AY 1S WINNVIASN
91
Proprotelna de elastasa manipulada no. 4 Aminoacido, formato de una sola letra, en donde: U = Q o H B = W o R J = M o V X = V o L Z = Q o R TU D LPETNNAPVGGTEAGRNS WPSQIS LQYRSGG SBYHTCGGTLIRQNWVJTAAHCVDYQKTFRWAG DHN LSQNDGTEQYVSVQK 1 VVH PY WNSDNVAAGY DIALLRLAQSV TLN S YVQL GVLPQEGAILANNSPCYI TGWGKTKTNGQLAQTLQQAYLPSVDYAICSSSSY WGSTVKNTMV C AG GDGVRSGCQGDSGGPLHCLV NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTZVSAYIS WINNVIASN
92
Proprotelna de elastasa manipulada no. 5 (secuencia activada por tripsina de pPROT24) Aminoacido, formato de una sola letra, en donde: U = Q o H B = W o R J = M o V X = V o L Z = Q o R TUDLPETNARWGGTEAGRNSWPSQIS LQYRSGG SBYHTCGGTLIRQN WV J T AA H C VD YQ KTFR V VAG DHN LSQN DGTEQ YVSVQK 1 VVH PYWN SDNVAAGY DIALLRLAQSVTLNSYVQL GVLPQEGAILANNSPCYI TGWGKTKTNGQLAQTLQQAYLPSVDYAICSSSSY WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCLV NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTZVSAYIS WINNVIASN
93
Secuencia de reconocimiento de elastasa de consenso 2 (Posiciones P3- P2-P1) Aminoacido, format de tres letras Xaa1 Pro Xaa2 Xaa1 = alanina, leucina, isoleucina, metionina, lisina, asparagina o valina Xaa2 = alanina, leucina, valina, isoleucina, o serina
10
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94
Elastasa variante del sitio de escision de pPROT42 P3 Aminoacido, formato de una sola letra, en donde: B = W o R J = M o V X = V o L Z = Q o R AAWGGTEAGRNSWPSQISLQYRSGGSBYHTCG GTLIRQN WVJTAAHCVDYQKTFRWAGDHN LSQN DGTEQYVSVQK1WH PYWN SDNVAAGYDIALLRLA Q S VTL N S YVQ LG V L PQE G AILAN NS PC Y1TG WG KT K TN GQ LAQTLQQAY LPSVDYAICSSSSYWGSTVK NTMVCAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCLVNGKYSX HGVTS FVSSRGC NVS RKPTVFTZVS A Y1S W1N NV1A SN
95
Elastasa variante del sitio de escision de pPROT42 P2 Aminoacido, formato de una sola letra, en donde: B = W o R J = M o V X = V o L Z = Q o R AWGGTEAGRNSWPSQ IS LQ YRSGGSBYHTCGGT LI RQN WVJTAAHCVDYQ KTFRWAGDHN LSQNDG TEQYVSVQKIWHPYWN SDNVAAGYDIALLRLAQS VTLNSYVQLGVLPGEGAILANNSPCYITGWGKTKT NGQLAQTLQQAYLPSVDYAICSSSSYWGSTVKNT MVCAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCLVNGKYSXHG VTSFVSSRGCNVSRKPTVFTZVSAYISWINNVIASN
96
Peptido senal del factor alfa de levadura, propeptido, y secuencia espaciadora Aminoacido, formato de tres letras M et-Arg- P he-P ro-S er-1 le- Ph e-T h r-Ala-Val - Leu-Phe - Ala-Ala-Ser-Ser-Ala-Leu-Ala-Ala-Pro-Val-Asn-Thr- T h r-Thr-GI u -As p-GI u -T h r-Ala-G 1 n-1 le- Pro-Ala-G 1 u * Ala-Val-lle-GI y-Tyr-Ser-Asp-L eu-G lu-GI y-As p-Phe- Asp-Val-Ala-Va 1-Leu- Pro-P he-Ser-As n-Ser-Th r-As n- Asn-Gly-Leu-Leu-Phe-lle-Asn-Thr-Thr-lle-Ala-Ser-lle- Ala-Ala-Lys-Glu-Glu-G!y-Val-Ser-Leu-Glu-Lys-Arg- Glu-Ala-Glu-Ala
97
Peptido senal del factor alfa de levadura y secuencia espaciadora Aminoacido, formato de tres letras Met-Arg-Phe-Pro-Ser-lle-Phe-Th r-Ala-Val - Leu -Phe- Ala-Ala-Ser-Ser-Ala-Leu-Ala-Ala-Pro-VaLAsn-Thr- Thr-Thr-Glu-Asp-Glu-Thr-Ala-GIn-lle- Pro-AI a-Glu- Al a-Va 1-1 le-GI y-T yr-Ser-Asp-Leu-Glu-Giy-As p-Phe- As p-Val-Ala-Va 1-Leu- Pro-Phe-Ser-As n-Ser-Th r-Asn- As n-GI y-Leu-Leu-Phe-1 le-As n-Th r-T hr-1 ie-Ala-S er-lle- Ala-Ala-Lys-Glu-Glu-Gly-Val-Ser-Leu-Glu-
98
Proenzima de elastasa con dominio de escision variante 48 Aminoacido, formato de una sola letra, en donde: U = Q o H B = W o R J = M o V X = V o L Z = Q o R TUDLPETN PAWG GTEAGRNSWPSQISLQYRSGG SBYHTCGGTLI RQN WV JTAA H C VD YQ KTFRW AG DHNLSQNDGTE Q YVSVQK1 WH PY WN S D N VAAGY Dl ALLRLAQSVTLNSYVQLGVLPQEGAI LAN NSPCYI TGWGKTKTNGQLAQ TLQQA Y L PSVDYAICSSSSY WG S TV K NTM VC AG GDGVRSGCQGDSGGPLHCLV NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVS RKPTVFTZVS AY 1S WINNVIASN
99
Proenzima de elastasa con dominio de escision variante 49 Aminoacido, formato de una sola letra, en donde: U = Q o H B = W o R J = M o V X = V o L Z = Q o R TUOLPETNHAWGGTEAGRNSWPSQISLQYRSGG SBYHTCGGTLIRQNWVJTAAHCVDYQKTFRWAG DHNLSQNDGTE Q YVSVQK 1 WH P Y WN S D N VAAGY DIALLRLAQSVTLNSYVQLGVLPQEGAILANNSPCYI TGWGKTKTNG QL AQTLQQA YL PS VDYAICSSSSY WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCLV NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTZVSAYIS WINNVIASN
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Proenzima de elastasa con dominio de escision variante 52 Aminoacido, formato de una sola letra, en donde: U = Q o H B = W o R J = M o V X = V o L Z = Q o R TUDLPETKPAVVGGTEAGRNSWPSQISLQYRSGG SBYHTCGGTLf RQN WV JT AA H C VD YQ KTFR WAG DHNISQNDGTEQYVSVQKIVVHPYWNSDNVAAGY D1A LL R LAOS VTLN S Y VQL GVLPQEGAILANNSPCYI T G WG KTKT N G QLAQTLQQA YL PSVDYAICSSSSY WGSTVKNTMVCAGGD GV RS G COG DSGGPLHCLV NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTZVSAYIS WINNVIASN
101
Proenzima de elastasa con dominio de escision variante 53 Aminoacido, formato de una sola letra, en donde: U = Q o H B = W o R J = M o V X = V o L Z = Q o R TUDLPETHPAWGGTEAGRNSWPSQISLQYRSGG SBYFITCGGTLIRQN WVJT AAH CVD YQ KTFRWAG DHN LSQNDGTEQYVSVQKtWH PYWN S DNVAAGY DIALLRLAQSVTLNSYVQL GVLPQEGAILANNSPCYI TG WG KTKTNGQLAQTLQ QAYL PS V D YAICSSSSY WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCLV NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTZVSAYIS WINNVIASN
102
Proenzima de elastasa con dominio de escision variante 54 Aminoacido, formato de una sola letra, en donde: U = Q o H B = W o R J = M o V X = V o L Z = Q o R TUDLPEHN PAWGGTEAGRN swpsgislgyrsgg SBYFITCGGTLIRQN WVJTAAH C V D YQ KTFRWAG DHN LSQNDGTEQYVSVQKIWH PYWN SDNVAAGY DIALLRLAQSVTLNSYVQLGVLPQEGAILANNSPCYI TGWG KTKTNGQLAQTLQQAYLPS VD YAI CSSSSY WGSTVKNTMVCAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCLV NGKYSXHGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTZVSAYIS WINNVIASN
103
Proenzima de elastasa con dominio de escision variante 55 Aminoacido, formato de una sola letra, en donde: U = Q o H B = W o R J = M o V X = V o L Z = Q o R TUDLPHTNPAWGGTEAGRNSWPSQISLQYRSGG S B Y H TCG GTL1 RQN WV J T AAH CVD YQ KTFRWAG DHNLSQNDGTEQYVSVQKIWHPYWNSDNVAAGY Dl ALLR LAQSVTLN SYVQLGVLPQEGA1LANNSPCY1 TGWGKTKTNGQLAQTLQQAYLPSVDYAICSSSSY WGSTVKNTMV C AG G D G V RSG CQGDS GGPLHCLV NGKYSXH GVTSFVSSRGCNVS RKPTVFTZVSAYIS WINNVIASN
104
Elastasa del tipo salvaje + variante de escision AlaArg Aminoacido, formato de una sola letra, en donde: B = W o R J = M o V X = V o L Z = Q o R ARWGGTEAGRNSWPSQISLQYRSGGSBYHTCG GTLIRQNWVJTAAHCVDYQKTFRWAGDHNLSQN DGTEQYVSVQKIWHPYWNSDNVAAGYDIALLRLA QS VTL NS YVQ LG VL PQEGAILANNSPCYITGWGKT KTN GQLAQTLQ Q AY LPSVOYAICSSS S Y WG S TVK N TM VCAG GDGVRSGCQGD SGG PLHCLVNGKYSX HGVTSFVSSRGCNVSRKPTVFTZVSAYISWINNVIA SN
105
Elastasa del tipo salvaje + variante de escision Arg Aminoacido, formato de una sola letra, en donde: B = W o R J = M o V X =V o L Z = Q o R RWGGTEAGRNSWPSQISLQYRSGGSBYHTCGGT LIRQNWVJTAAHCVDYQKTFRWAGDHNLSQNDG TEQYVS VQKIWH PYWNSDNVAAG YD IALLRLAQS VTLNSYVQLGVL PQ EGAILANNSPCYITGWGKTKT NG Q L AQT LQQAY LPSVDYAICSSSS YWG STV KN T M VCAGGDGVRS GCOGDSGGPLHCLVN GKYSXHG VTSFVSS RGCNVSRKPTVFTZVSAYIS WIN NVIASN
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Elastasa I humana madura, menos la secuencia "WGG" N terminal
Aminoacido, formato de una sola letra, en donde:
B = W o R J = M o V X = V o L Z = Q o R
TEAGRNSWPSQlSLQYRSGGSBYHTCGGTlIRQN WVJTAAH CV DYQKTFRWAGDH N LSQN DGTEQYV SVQKIWHPYWNSDNVAAGYDIALLRLAQSVTLNS YVQLGVLPQEGAILAN NSPC YITGWGKTKTNGQLA QTLQQAYLPSVDYAICSSSSY WGSTV KN TM VC AG GDGVRSGCQGDSGGPLHCLVNGKYSXHGVTSFV S SRGCNVSRKPTVFTZVSAY IS Wl NNVIASN
107
Elastasa I humana madura, menos la secuencia "WGGTE" N terminal
Aminoacido, formato de una sola letra, en donde:
B = W o R J = M o V X = V o L Z = Q o R
AGRNSWPSQISLQYRSGGSBYHTCGGTLIRQNWV
JTAAHCVDYQKTFRWAGDHNLSQNDGTEQYVSV
QKIW H P YWN S D N VAAG YDIALLRLAQSVTLNSYV
QLG V L PQ EG Al LAN N S PC YITG WG RTKTNG Q LAQT
LQQAYLPSVDYAICSSSSYWGSTVKNTMVCAGGD
GVRSGCQGOSGGPLHCLVNGKYSXHGVTSFVSS
RGCNVSRKPTVFTZVSAYISWINNVIASN
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Elastasa I humana madura, menos la secuencia "VVGGTEA GR" N terminal
Aminoacido, formato de una sola letra, en donde:
B = W o R J = M o V X = V o L Z = Q o R
NSWPSQISLGYRSGGSBYHTCGGTLIRQNWVJTA AHCVDYOKTFRWAGDHNLSQNDGTEQYVSVQKI VVHPYWNS DN V AAG Y DIALLR LAQSVTLN S Y VQ LG VLPQEGAILANNSPCYITGWGKTKTNGQLAQTLQQ AYLPSVDY Al CS S SS YWG STVK NTMVCAGGDGVR S GCQGDSGG P L H CLV NG KY SXH G VTS FVS S RGC N VS RK PTVFTZVSAYISWINNVIASN
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Secuencia de la Figura 1A
Secuencia de la Figura 1A
Acido Nucleico
Aminoacido, formato de una sola letra
GAATTCAGTACTCAG G ACCTTCCGG AAACCAATG CCCGGGTAGT CGG AGG G ACT GAG GCCG G GAGG AAC TCCTGGCCCTCT C AG ATTTCCCTCCAGTACC GGTCTGGAGGTTCCTGGTAT CACAC CTGTGGAG G G ACCCTTATC AG AC AG AACTGGGTG ATGACAG CTGCACACTGCGTGGATTAC C AGAA G A CTTT C C GCGTGGTGGCTG GAG ACC ATAAC CTGAGCCAGA AT GATGGCAC TGAG CAG TACGTGAGTGT G CAGA AGATCGTGGTGCATCCATACT G G AACAG CG ATA ACGTGGCTGCAGGCTATGACATGGCCC TGCTG C GCCTGGCCCAGAGCGTTACCCTCAATAGCTATG TCCAGCTGGGTGTTCTGCCCCAGGAGGGAGCCA TCCTGGCT AACAACAGTC CCTG CTACATCACAG G CTG G GGCAAG ACCAAG ACCAAT GG GCAGCT G G CCC AG AC CTTGCAG C AG G CTT ACCTG CCCTCTG TG G ACTATGCC AT CTGCTCCAGCTCCT CCTACTG GGGCTCCACTGTGAAGAACACTATGGTGTGTGC TGGTGGAGATGGAGTTCGCTCTG G ATGTC AGGG TGACTCTGGGGGCCCCCTCCATTGCTTGGTGAA TGG C AAGTATT CTCTT CATGGAGTGAC CAG CTTT GTG TC CAGC CG GG GCTGTAATGTC TCTAG AAAG CCTACAGTCTT C ACACGG GTCTCTGCTTACATCT CCTG GATAAATAAT GTCATCGCCT CC AA CTG ATA
AGCTTGGATCCGTCGAC_____________________
MKRILAIHQAMEGAPRVTLTSRANSISTSTHHSVLH SGAPVGGAGADGIV H RGQVSLLQGLGQLPIG LGLA P AC D VAG TWS Q D GS LLGQ NTQ L DIAIE G N ALG Q A QQGDVIACSHVIAVPVWM HHDLLHTHVLLSAI (LAQ VMVSSHHAESLLVIHAVCSCHHPVLSDKGPSTGVI PGTSRPVLEGNLRGPGVPPGLSPSDYPGIGFRKVL S_________________________________________
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Secuencia de la Figura 1B Acido Nucleico ACTATTG CC AG CATTG CTG CTAAAG AAG AAG GG GTATCTCT CG AG AAAAG AG AGG CTGAAGCT ACT CAGGACCTT CCGG AAACC AATGCCCGGGTAG T C GGGGGG
112
Secuencia de la Figura 1B Aminoacido, formato de tres letras THR ILE ALA SER ILE ALA ALA LYS GLU GLU GLY VAL SER LEU GLU LYS ARG GLU ALA GLU ALA THR GLN ASP LEU PRO GLU THR ASN ALA ARG VAL VAL GLY GLY
113
Secuencia de la Figura 13 Acido Nucleico CCGCGGAC CCAG G AC TTT CCA G AAACC AACG CC CGGGTAGTT GGAGG G ACCG AGG CTCAG AG G AA TTCTTG G C CATCTCAGATTTCC CTCCAGTACCG G T CTG G AAGTT CGTGGGCT C ACACCT GTGGAGGG ACCCTCATCAGG C AG AACT GGGTGATGA CAG CC GCTCACTGCGTGGACAG AG AGTT GACCTTCC G T GTGGTGGTTG GAG AG CACAACCT G AACC AG AAC G ATG GC AC CG AG CAGTAC GTGGGGGTG C AG AA GATCGTGGTGCAT CCCTACTG G AACACCG ACG A CGTGGCTGCAGGCTATGACATCGCCCTGCTGCG CCTG G CC CAG AGTGTAAC C CT CAAC AG CTACG T C CAG CTGGGTGTTCT GCC AAG GGCTGGGAC CAT CCTG G CTAAC AACAGTCCCT G C TA CATCACAG G GTGGGGCCTG ACCAG G ACCAAT GG G CAGC TG G C CCAG AC C CTG CAG CAGGCTTACCTGCCCACCG TGGACTACGCCATCTGCTCCAGCT CCT C G TA CT GGGGCTCCACCGTGAAGAACAGCATGGTGTGCG CCGG AG G G G ACG G AG TTCGCTCTGGATGT CAG GGTGATTCTGGGGGCCCCCTTCATTGCTTGGTG AATGGTC AGTATGCT GTCC ACG GTGTAACC AG C T TCGTGTCCCGCCTGGGCTGTAATGT CAC CAG G A AGCCCACAGTCTT CACCA GGGTCTCTGCTTACAT CTCTTG G ATAAATAAC G T C ATTGCCA GC AACTG A TAATCTAGA
114
Secuencia de la Figura 14 Aminoacido, formato de una sola letra TQDFPETNAR WGGTEAQRN SWPSQISLQYRSGS SWAHTCGGTLIRQNWVMTAAHCVDRELTFRVWG EH N LNQNDGTEQYVGVQKIVVH PYWNTDDVAAGY DIALLRLAQSVTLNSYVQLGVLPRAGTILANNSPCYI TGWGLTRTNGOLAQTLQQAYLPTVDYAICSSSSY WGSTVKNSMVCAGGDGVRSGCQGDSGGPLHCLV NGQYAVHGVTSFVSRLGCNVTRKPTVFTRVSAYIS WINNVIASN
115
Secuencia del dominio de escision de pPROT101-24- V activado por tripsina Aminoacido, formato de tres letras Phe Pro Glu Thr Asn Ala Arg Val Val Gly
116
Secuencia del dominio de escision de pPROT101-42- V auto-activado Aminoacido Phe Pro Glu Thr Asn Ala Ala Val Val Gly
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Secuencia del dominio de escision de pPROT101-49- V auto-activada Aminoacido Leu Pro His Thr Asn Pro Ala Val Val Gly
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Secuencia del dominio de escision pPROT101- 55L-V auto- activada Aminoacido Phe Pro Glu Thr Asn His Ala Val Val Gly

Claims (22)

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    1. Una protema proelastasa autoactivante que comprende (i) una secuencia de propeptidos que comprende una secuencia de peptidos de activacion de elastasa que comprende una secuencia de aminoacidos designada P10-P9- P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1, de la que los aminoacidos P3-P2-P1 estan disenados para formar una secuencia de reconocimiento de elastasa operativamente ligada a (ii) una secuencia de aminoacidos de una elastasa tipo I madura cuyos tres aminoacidos N-terminales estan designados P1'- P2'- P3', en la que
    (a) la secuencia de propeptidos no es nativa para la elastasa tipo I madura, y
    (b) cuando se somete a condiciones de autoactivacion, se produce una elastasa tipo I madura.
  2. 2. La protema proelastasa autoactivante de la reivindicacion 1, en la que:
    (a) la secuencia de reconocimiento de elastasa tiene un residuo de prolina localizado en la posicion P2;
    (b) los aminoacidos P3 a P1 consisten de la secuencia de aminoacidos de las SEC ID N°:11, SEC ID N°:12, SEC ID N°:13, SEC ID N°:18, SEC ID N°:20, SEC ID N°:21, o SEC ID N°:93;
    (c) los aminoacidos P5 a P3’ consisten de los aminoacidos de las SEC ID N°:48, SEC ID N°:49, SEC ID N°:52, SEC ID N°:53, SEC ID N°:54, SEC ID N°:55, SEC ID N°:56, SEC ID N°:57, SEC ID N°: 58, SEC ID N°: 59, o SEC ID N°:60; o
    (d) loa aminoacidos P10 a P1 consisten de la secuencia de aminoacidos de las SEC ID N°:72, SEC ID N°:73, o SEC ID N°:80.
  3. 3. La protema proelastasa autoactivante de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2 en la que:
    (a) la protema proelastasa autoactivante comprende la secuencia de aminoacidos de las SEC IS N°:66 o SEC ID N°:68;
    (b) la elastasa tipo I madura es una elastasa tipo I humana madura, que comprende opcionalmente una secuencia de aminoacidos que tiene:
    (i) al menos un 85% de identidad de secuencia, al menos un 95% de identidad de secuencia, al menos un 98% de identidad de secuencia, al menos un 99% de identidad de secuencia o un 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos de las SEC ID N° 1, SEC ID N°:78, o SEC ID N°:84;o
    (ii) no mas de 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 sustituciones de aminoacidos conservadoras en comparacion con la secuencia de aminoacidos de las SEC ID N°:1 o SEC ID N°:84 y/o no mas de 5, 4, 3, 2 o 1 sustituciones de aminoacidos no conservadoras en comparacion con la secuencia de aminoacidos de las SEC ID N°:1, SEC ID N°:78 o SEC ID N°:84; o
    (c) la elastasa tipo I madura es una elastasa tipo I porcina madura, que comprende opcionalmente una secuencia de aminoacidos que tiene:
    (i) al menos un 85% de identidad de secuencia, al menos un 95% de identidad de secuencia, al menos un 98% de identidad de secuencia, al menos un 99% de identidad de secuencia o un 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos de la SEC ID N°:39; o
    (ii) no mas de 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 sustituciones de aminoacidos conservadoras en comparacion con la secuencia de aminoacidos de la SEC ID N°:39 y/o no mas de 5, 4, 3, 2 o 1 sustituciones de aminoacidos no conservadoras en comparacion con la secuencia de aminoacidos de la SEC ID N°:39.
  4. 4. La protema proelastasa autoactivante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que:
    (a) carece de una secuencia senal;
    (b) comprende una secuencia senal, que es opcionalmente:
    (i) una secuencia senal que es operable en Pichia pastoris, que es opcionalmente una secuencia senal del factor a de levadura y/o comprende la secuencia de aminoacidos de la SEC ID N°:34; o
    (ii) una secuencia senal de secrecion mairnfera, que es opcionalmente una secuencia senal de elastasa tipo I humana o una secuencia senal de elastasa tipo 1 porcina;
    (c) comprende un propeptido del factor alfa de levadura;
    (d) comprende una o mas secuencias espaciadoras, opcionalmente en el que al menos una secuencia espaciadora es una secuencia Kex2 y/o una secuencia STE13;
    (e) carece de un residuo de metionina N-terminal; o
    (f) comprende un residuo de metionina N-terminal.
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  5. 5. Un sobrenadante de cultivo celular que comprende la protema proelastasa pancreatica tipo I autoactivante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
  6. 6. Una molecula de acido nucleico que codifica la protema proelastasa autoactivante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
  7. 7. Un vector que comprende la molecula de acido nucleico de la reivindicacion 6, opcionalmente en el que:
    (a) la secuencia que codifica la protema proelastasa autoactivante esta multimerizada;
    (b) la secuencia que codifica la protema proelastasa autoactivante utiliza codones que se utilizan preferiblemente en Pichia pastoris; o
    (c) el vector comprende un gen marcador seleccionable de resistencia a Zeocina.
  8. 8. Una celula huesped que:
    (a) esta disenada geneticamente para expresar la molecula de acido nucleico de la reivindicacion 6, opcionalmente en el que:
    (i) una copia de dicho acido nucleico esta integrada en el genoma de la celula huesped; o
    (ii) mas de una copia de dicho acido nucleico esta integrada en el genoma de la celula huesped, opcionalmente en el que 2-5 copias, 2 copias o 3 copias del acido nucleico estan integradas en el genoma de la celula huesped; o
    (b) comprende un vector de la reivindicacion 7, opcionalmente en el que:
    (i) una copia de dicho vector esta integrada en el genoma de la celula huesped; o
    (ii) mas de una copia de dicho vector esta integrada en el genoma de la celula huesped, opcionalmente en el que 2-5 copias, 2 copias o 3 copias del vector estan integradas en el genoma de la celula huesped.
  9. 9. La celula huesped de la reivindicacion 8, en la que la expresion de la protema proelastasa autoactivante esta bajo el control de un promotor inducible por metanol y/o en la que la celula huesped es una celula huesped de Pichia pastoris.
  10. 10. Un procedimiento de producir una protema elastasa autoactivante, que comprende cultivar la celula huesped de la reivindicacion 8 o la reivindicacion 9 bajo condiciones que resultan en la produccion de la protema proelastasa autoactivante y recuperar la protema proelastasa autoactivante, opcionalmente en el que:
    (a) la celula huesped se cultiva en medio complejo, que es opcionalmente medio complejo tamponado con metanol o medio complejo tamponado con glicerol; y/o
    (b) la expresion de la protema proelastasa autoactivante esta bajo control de un promotor inducible por metanol en el que las condiciones de cultivo incluyen un periodo de induccion con metanol; y/o
    (c) la celula huesped se cultiva en presencia de un compuesto de citrato, succinato o acetato, opcionalmente en el que
    (i) el compuesto de citrato, succinato o acetato es citrato de sodio, succinato de sodio o acetato de sodio, respectivamente; y/o
    (ii) al menos un compuesto de citrato, succinato o acetato esta presente en dicho cultivo a una concentracion de 5 - 50 mM, 7.5 -100 mM, 10-150 mM, 50 - 200 mM, 100 - 150 mM, 75 - 125 mM, o 90 - 110 mM; y/o
    (d) la celula huesped es una celula huesped de Pichia pastoris, y en el que las condiciones de cultivo comprenden un periodo de crecimiento o induccion:
    (i) a una temperatura de 22 -28° C; o
    (ii) a un pH de 2-6; y/o
    (e) la celula huesped se cultiva en medio complejo y el paso de recuperar la protema proelastasa autoactivante comprende recuperar el sobrenadante del cultivo de la celula huesped y comprende opcionalmente ademas recuperar la protema proelastasa autoactivante del sobrenadante.
  11. 11. El procedimiento de la reivindicacion 10, que comprende ademas someter a la protema de proelastasa autoactivante recuperada a condiciones de activacion de tal manera que se produzca la protema elastasa tipo I madura, opcionalmente en el que:
    (a) las condiciones de activacion comprenden ajustar el pH de una solucion que contiene la protema proelastasa autoactivante a un pH basico, un pH de 7-9; o un pH de 8 hasta que se produzca la protema
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    elastasa tipo I madura, y opcionalmente:
    (i) mantener el pH durante un periodo de 0,5-8 horas, 2-7 horas, o 6 horas;
    (ii) la exposicion a un pH basico se realiza a una temperatura de 22° C - 28° C o una temperatura de 26° C; y/o
    (iii) la concentracion de la protema proelastasa autoactivante en la solucion es menor de 10 mg/ml, menos de 5 mg/ml, menos de 2 mg/ml, menos de 1 mg/ml, menos de 0,5 mg/ml, menos de 0,25 mg/ml y/o al menos 0,1 mg/ml o al menos 0,2 mg/ml; y/o
    (b) las condiciones de activacion comprenden la adicion de una cantidad catalffica de elastasa a la solucion que contiene la protema proelastasa autoactivante; y/o
    (c) la autoactivacion se lleva a cabo en presencia de base Tris a una concentracion de 50-200 mM, 75-175 mM, 100-150 mM, 75-125 mM; y/o
    (d) mantener las condiciones de activacion hasta que las variantes N-terminales se reducen a un intervalo del 0-2%.
  12. 12. El procedimiento de la reivindicacion 11, en el que:
    (a) el paso de autoactivacion se realiza despues de la purificacion de la protema proelastasa autoactivante; o
    (b) el paso de autoactivacion se realiza en un sobrenadante.
  13. 13. El procedimiento de la reivindicacion 11 o la reivindicacion 12, que comprende ademas el paso de aislar la protema elastasa tipo I madura, opcionalmente en el que:
    (a) la protema elastasa tipo I madura se afsla por cromatograffa en columna, opcionalmente en el que la cromatograffa incluye cromatograffa de intercambio cationico; y/o
    (b) se eliminan las formas glicosiladas de la protema elastasa tipo I madura.
  14. 14. Un procedimiento para producir una formulacion de protema elastasa tipo I madura, comprendiendo dicho procedimiento:
    (a) someter la protema proelastasa autoactivante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 a condiciones de activacion de tal manera que se produzca protema elastasa tipo I madura;
    (b) opcionalmente, purificar la elastasa tipo I madura; y
    (c) formular la protema elastasa tipo I madura,
    produciendo de este modo una composicion farmaceutica que comprende dicha protema elastasa madura tipo I.
  15. 15. El procedimiento de la reivindicacion 14, que comprende purificar la elastasa tipo I madura a traves de cromatograffa en columna, opcionalmente cromatograffa de intercambio cationico.
  16. 16. El procedimiento de la reivindicacion 14 o la reivindicacion 15, en el que la formulacion de la protema elastasa tipo I madura comprende liofilizar dicha elastasa tipo I madura, opcionalmente comprendiendo ademas mezclas la protema elastasa tipo I madura con uno o mas ingredientes de tamponamiento antes o despues de la liofilizacion.
  17. 17. Una composicion farmaceutica que:
    (a) comprende una protema elastasa tipo I madura que tiene una actividad de 20 a 50 U/mg de protema como se cuantifica usando un ensayo de hidrolisis de N-succinil-Ala-Ala-Ala-p-Nitroanilida (SLAP) colorimetrico, en la que el lfmite superior de tripsina en dicha composicion farmaceutica es menor de 25 ng de tripsina por 1 mg de protema elastasa tipo I madura, y en la que :
    (i) la elastasa tipo I madura comprende una secuencia de aminoacidos con al menos un 85% de identidad de secuencia, al menos un 95% de identidad de secuencia, al menos un 98% de identidad de secuencia o al menos un 99% de identidad de secuencia, o comprende un 100% de identidad de secuencia, con la secuencia de aminoacidos de las SEC ID N°:1, SEC ID N°:78, o SEC ID N°:84; o
    (ii) la protema elastasa tipo I madura comprende una secuencia de aminoacidos que no tiene mas de 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 sustituciones de aminoacidos conservadoras y/o no mas de 5, 4, 3, 2 o 1 sustituciones de aminoacidos no conservadoras en comparacion con la secuencia de aminoacidos de las SEC ID N°:1, SEC ID N°:78, o SEC ID N°:84; o
    (b) comprende una protema elastasa tipo I madura que tiene una actividad de 20 a 100 U/mg de protema como se cuantifica usando un ensayo de hidrolisis de N-succinil-Ala-Ala-Ala-p-Nitroanilida (SLAP) colorimetrico, en la que el lfmite superior de tripsina en dicha composicion farmaceutica es menor de 25 ng de tripsina por 1 mg de protema elastasa tipo I madura, y opcionalmente en la que:
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    (i) la elastasa tipo I madura comprende una secuencia de aminoacidos con al menos un 85% de identidad de secuencia, al menos un 95% de identidad de secuencia, al menos un 98% de identidad de secuencia o al menos un 99% de identidad de secuencia, o comprende un 100% de identidad de secuencia, con la secuencia de aminoacidos de la SEC ID N°:39; o
    (ii) la protema elastasa tipo I madura comprende una secuencia de aminoacidos que no tiene mas de 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 sustituciones de aminoacidos conservadoras y/o no mas de 5, 4, 3, 2 o 1 sustituciones de aminoacidos no conservadoras en comparacion con la secuencia de aminoacidos de la SEC ID N°:39.
  18. 18. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 17, en la que:
    (a) el lfmite superior de actividad de tripsina en dicha composicion es menor de 4, 3, 2, o 1,56 ng por 1 mg de protema elastasa tipo I madura, opcionalmente en la que el lfmite superior de la actividad de tripsina en dicha composicion se cuantifica usando un ensayo de actividad de tripsina colorimetrico N-benzoil-Phe-Val-Arg-p- Nitroanilida (BENZ);
    (b) la composicion farmaceutica esta libre de tripsina; y/o
    (c) la composicion farmaceutica esta caracterizada por uno o mas de los siguientes:
    (i) la composicion farmaceutica esta libre de protemas bacterianas;
    (ii) la composicion farmaceutica esta libre de protemas mairnferas distintas de las de dicha protema elastasa madura;
    (iii) la cantidad de endotoxina en dicha composicion farmaceutica no excede una cantidad farmaceuticamente aceptable, no excede de 10 EU por gramo de elastasa tipo I o no excede de 5 EU por gramo de elastasa tipo I;
    (iv) la composicion farmaceutica esta en la forma de una dosificacion unitaria que comprende 0,0033 mg - 200 mg de dicha protema elastasa madura;
    (v) la composicion farmaceutica comprende polisorbato-80;
    (vi) la composicion farmaceutica comprende dextrano;
    (vii) la composicion farmaceutica comprende iones de sodio, iones de potasio, iones de fosfato, iones de cloro, y polisorbato 80;
    (viii) la composicion farmaceutica comprende iones de sodio, iones de potasio, iones de fosfato, iones de cloro, y dextrano;
    (ix) la composicion farmaceutica comprende iones de sodio, iones de potasio, iones de fosfato, iones de cloro, polisorbato 80 y dextrano;
    (x) la composicion farmaceutica comprende trehalosa;
    (xi) la composicion farmaceutica comprende manitol;
    (xii) la protema elastasa madura en la composicion farmaceutica mantiene del 60% al 100% de su actividad espedfica despues de al menos un mes de almacenamiento a 4° C, despues de al menos tres meses de almacenamiento a 4° C o despues de al menos seis meses de almacenamiento a 4° C.
  19. 19. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 17(1), que:
    (a) contiene menos del 0,5% por peso de una protema que consiste de la SEC ID N°:2 y/o menos del 0,5% por peso de una protema que consiste de la SEC ID N°:3, y esta opcionalmente libre o sustancialmente libre de una protema de la SEC ID N°:2 y una protema que consiste de la SEC ID N°:3; y/o
    (b) esta libre o sustancialmente libre de cualquier protema que consiste de las SEC ID N°:70 y 71; y opcionalmente
    (c) esta libre o sustancialmente libre de una o mas protemas que consisten de cualquiera de las SEC ID N°: 37, 38, 85, 86, 94, 95, 104, 105, 106, 107, y 108, preferiblemente libre o sustancialmente libre de cualquier protema que consiste de cualquiera de las SEC ID N°: 37, 38, 85, 86, 94, 95, 104, 105, 106, 107, o 108.
  20. 20. La composicion farmaceutica de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, que es una composicion farmaceutica liofilizada.
  21. 21. La composicion farmaceutica de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, que es una composicion lfquida, y opcionalmente:
    (a) comprende cloruro sodico;
    (b) comprende solucion salina tamponada con fosfato;
    (c) comprende un tampon de fosfato;
    (d) comprende manitol a una concentracion de 2-10% en peso por volumen o 2,5-4% en peso por volumen;
    (e) comprende polisorbato-80 a una concentracion de 0,001 - 5% en peso por volumen o de 0,01% en peso por volumen;
    (f) tiene una osmolalidad de 125 -500 mOsm/kg o 275-325 mOsm/kg; o
    (g) tiene una concentracion de elastasa tipo I madura de 0,1 mg/ml - 50 mg/ml.
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    (a) comprende 137 mM de cloruro sodico, 2,7 mM de fosfato potasico, 10 mM de fosfato sodico, tiene un pH de 7.4, opcionalmente donde:
    (i) la composicion farmaceutica comprende 0,01% de polisorbato-80 y opcionalmente donde la concentracion de protema elastasa tipo I madura en dicha composicion farmaceutica es de 0,001-50 mg/ml;
    (ii) la concentracion de protema elastasa tipo I madura en dicha composicion farmaceutica es de 0,001-50 mg/ml y la composicion farmaceutica comprende del 5-10% o del 6-9% de un excipiente seleccionado de dextrosa, lactosa, manitol, sacarosa, trehalosa, dextrano-70, glicerina, arginina, glicina, dextrano-44 o dextrano-18; o
    (iii) la concentracion de protema elastasa tipo I madura en dicha composicion farmaceutica es de 0,001-50 mg/ml y la composicion comprende ademas un 8% de dextrano-18 y opcionalmente un 0,1% de polisorbato-80; o
    (b) comprende uno o mas de dextrosa, lactosa, manitol, sacarosa, trehalosa, dextrano-70, glicerina, arginina, glicina, dextrano-44 y dextrano-18 en una concentracion agregada del 2-10% p/v, 2,5-8% p/v, o 4-6% p/v.
  22. 23. Una composicion farmaceutica como se define en cualquiera de las reivindicaciones 17 a 22 para su uso en un metodo de:
    (a) tratar o prevenir una enfermedad en conductos biologicos administrando la composicion farmaceutica a un paciente con necesidad de ello, opcionalmente donde:
    (i) la composicion farmaceutica se administra parenteralmente;
    (ii) la composicion farmaceutica se administra directamente a una pared del vaso sangumeo;
    (iii) la composicion farmaceutica se administra directamente a la superficie adventicia externa quirurgicamente expuesto; o
    (iv) la composicion farmaceutica se administra a una pared de un vaso usando un administracion de farmacos:
    (b) aumentar terapeuticamente el diametro de una arteria o vena en un sujeto humano con necesidad de ello administrando localmente la composicion farmaceutica a la pared de la arteria o vena en el sujeto humano;
    (c) prevenir el vasospasmo de una arteria o vena en un sujeto humano con necesidad de ello administrando localmente la composicion farmaceutica a la pared de la arteria o vena en el sujeto humano;
    (d) tratar una arteria o vena obstruida en un sujeto humano con necesidad de dicho tratamiento administrando localmente la composicion farmaceutica a la pared de la arteria o vena en el sujeto humano, en donde dicha administracion da lugar a la proteolisis de elastina en la pared de la arteria o vena llevando al agrandamiento del diametro de la arteria o vena;
    (e) tratar una arteria o vena conectada a un injerto de hemodialisis arteriovenosa o fistula arteriovenosa en un sujeto humano con necesidad de dicho tratamiento administrando localmente la composicion farmaceutica a la pared de la arteria o vena en el sujeto humano, en donde dicha administracion da lugar a la proteolisis de elastina en la pared de la arteria o vena llevando al agrandamiento del diametro de la arteria o vena; o
    (f) tratar una vena en un sujeto humano para su uso en hemodialisis administrando localmente la composicion farmaceutica a la pared de la vena en el sujeto humano, en donde dicha administracion da lugar a la proteolisis de elastina en la pared de la vena llevando al agrandamiento del diametro de la vena.
    de un vaso cateter de
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