CN102250863B - 基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶及其制备方法和该弹性蛋白酶的医药用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶及其制备方法和该弹性蛋白酶的医药用途，属于基因工程领域。本发明利用人中性粒细胞裂解液，取含有基因组DNA的上清液，扩增获得中性粒细胞弹性蛋白酶的基因片段ELA2，连接克隆质粒转化大肠杆菌，构建弹性蛋白酶的PET-28a-ELA2表达质粒，在大肠杆菌中表达弹性蛋白酶，收集菌体，超声裂解菌液，镍柱洗脱后获得纯化的弹性蛋白酶。这样设计的本发明，利用弹性蛋白酶的表达基因，获得足量稳定的基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶，为临床检测和试验研究提供弹性蛋白酶原料，并为制备弹性蛋白酶高效抗体提供特异性抗原。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体是一种基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶及其制备方法和该弹性蛋白酶的医药用途。
背景技术
弹性蛋白酶（elastase）是炎症过程中由分叶核中性粒细胞（neutrophil granulocyte）分泌的一种蛋白酶，检测弹性蛋白酶的含量能帮助诊断***及其他附性腺器官细菌性感染的状况。
弹性蛋白酶作为丝氨酸蛋白家族的一个亚科，可以作用于弹性蛋白。人体内目前有6个基因可表达结构和功能相似的弹性蛋白酶。中性粒细胞分泌的弹性蛋白酶具有降解外源蛋白的功能，已有研究表明弹性蛋白酶可降解大肠杆菌的外膜蛋白A（ompA），外膜蛋白A 一般认为是沙门氏菌等细菌的毒力因子，所以，弹性蛋白酶的水解功能在抗外部感染途径中发挥一定的作用。
弹性蛋白酶共有267个氨基酸，如图1所示，对弹性蛋白酶的功能域进行分析，发现：第7-22个氨基酸表达一段具有透膜功能的蛋白，第29-242个氨基酸表达具有丝氨酸蛋白酶活性的功能蛋白，如图1所示。
人中性粒细胞弹性蛋白酶(human neutrophil elastase，HNE) 在机体各种炎症反应、组织损伤重构（如肺炎）、成人呼吸窘迫综合征、肺纤维化、急（慢）性肺损伤、肺水肿、动脉粥样硬化、硬皮病等病理过程中起重要作用，并且具有阻止病毒、细菌的侵入及癌细胞转移的功能。
弹性蛋白酶作为***炎鉴别诊断的指标 依照美国国立卫生研究所标准，***液白细胞计数被认为是诊断***炎的主要指标，检测弹性蛋白酶可能对区别***炎引起的炎症性骨盆疼痛症和由泌尿生殖器植物神经紊乱引起的非炎症性骨盆疼痛有帮助。
以人中性粒细胞弹性蛋白酶为抗原，制备相应的抗体，用于诊断***及其他附性腺器官细菌性感染，检测弹性蛋白酶的含量。但是，从人体获得中性粒细胞弹性蛋白酶的来源受限，远不能满足临床和试验检测的需要。
发明内容
本发明就是为了解决以人中性粒细胞弹性蛋白酶为抗原制备特异性抗体来源受限的问题，提供一种基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶及其制备方法和该弹性蛋白酶的医药用途。
本发明是按照以下技术方案设计的。
一种基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶，用BamHI和HindIII酶切构建弹性蛋白酶的表达质粒PET-28a-ELA2，如图2所示；该弹性蛋白酶的核酸序列如SEQUENCE LISTING所示。
所述基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶，该弹性蛋白酶具有天然人中性粒细胞弹性蛋白酶的免疫原性。
所述基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶的制备方法，其人中性粒细胞的裂解液，取含有基因组DNA的上清液，用PCR方法扩增，获得中性粒细胞弹性蛋白酶的基因片段ELA2，构建克隆质粒后转化大肠杆菌TOP10的感受态细胞，提取质粒DNA，构建弹性蛋白酶的PET-28a-ELA2表达质粒，并在大肠杆菌中的表达弹性蛋白酶，收集菌体，超声裂解菌液，镍柱洗脱纯化后获得弹性蛋白酶。
所述重组人中性粒细胞弹性蛋白酶的制备方法，其PCR方法扩增引物：
Primer1: 5’- agctgcgcgg aggccacttc-3’
Primer2: 5’-gga gccgt cacca aggctca-3’。
所述基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶的制备方法，其PCR扩增的条件为：94℃变性50秒，55℃退火1分钟，72度延伸3分钟，共循环30次，最后72度保温10分钟。
所述基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶的制备方法，其重组质粒PET-28a-ELA2在大肠杆菌中表达，将含有重组质粒PET-28a-ELA2的大肠杆菌接种在含卡那霉素的10ml LB培养基中，37℃培养过夜；将所得菌液接种到含卡那霉素的1000ml LB培养基中，在37℃培养约4h，使其A650 OD值到0.6-0.8时，向菌液中加入异丙基硫化半乳糖苷，使其终浓度为0.5mM，继续培养6-8小时；收集菌体后制备超声裂解菌液。
所述基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶的制备方法，其纯化弹性蛋白酶是将是将超声裂解菌液在12,000转/分，4℃离心10min后，将沉淀悬浮于由8M尿素、10mM Tris，pH8.0制备的基础缓冲液30ml中；12,000转/分，4℃离心10min，取上清液，使用300mM的NaCl的洗脱浓度获得纯化的基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶。
所述基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶作为特异性抗体的抗原，在制备高效抗体临床诊断试剂中的应用。
这样设计的本发明，利用弹性蛋白酶的表达基因，获得足量稳定的基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶，为临床检测和试验研究弹性蛋白酶提供原料，为制备高效抗体提供特异性抗原。
附图说明
图1是弹性蛋白酶类胰蛋白酶的丝氨酸蛋白酶功能域（Tryp-_SPc）图；
图2是PET-28a-ELA2质粒图；
图3是表达的弹性蛋白酶SDS-PAGE电泳图；
图4是纯化的弹性蛋白酶SDS-PAGE电泳图；
图5是纯化的弹性蛋白酶具有天然人中性粒细胞弹性蛋白酶免疫原性的western-blot图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明进行详细的说明。
一. 人中性粒细胞弹性蛋白酶的基因获得
1.使用人中性粒细胞的裂解液1ml，离心，12,000转/分，5分钟，取含有基因组DNA的上清液为模板，进行PCR扩增。
使用一对引物是：
Primer1: 5’- agctgcgcgg aggccacttc-3’
Primer2: 5’-gga gccgt cacca aggctca-3’
2.以基因组DNA为模板，PCR扩增的条件为：
94℃变性50秒
55℃退火1分钟
72度延伸3分钟，
共循环30次，最后72度保温10分钟。
3.PCR产物经1%琼脂糖电泳确证得到目标基因后，用酚氯仿抽提回收。
二.构建人中性粒细胞弹性蛋白酶基因的克隆质粒
1.将PCR产物用胶回收纯化；
2.将A-T克隆载体（如pUCm-T载体等）和PCR产物连接，连接反应体系如下：
| T克隆载体 | 1μl |
| 5×连接缓冲 | 2μl |
| T4 DNA连接酶 | 1μl |
| PCR产物 | 4μl |
| H2O | 2μl |
以上混合物在16℃连接12h；
3.将连接的产物转化大肠杆菌TOP10的感受态细胞，涂布含有氨苄青霉素的LB平板，挑起阳性的转化子，用碱裂解的方法小量提取质粒DNA，将质粒DNA进行测序。将测序结果的DNA序列和基因库（genebank）发表的序列进行基因同源性比较，确定克隆DNA序列的正确，如SEQUENCE LISTING所示。
三.表达质粒PET-28a-ELA的构建：
1.将上述克隆载体中人中性粒细胞弹性蛋白酶的基因片段用限制性内切酶BamHI和HindIII切下，经1%的琼脂糖电泳后，切胶回收弹性蛋白酶片段；
2.将上述弹性蛋白酶片段与PET-28a连接，连接体系如下：
| PET-28a载体 | 1μl |
| 5×连接缓冲 | 2μl |
| T4 DNA连接酶 | 1μl |
| 弹性蛋白酶片段 | 5μl |
| H2O | 1μl |
以上混合物在16℃连接12h；
3.将连接的产物转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞，涂布含有卡那霉素的LB平板，挑起的转化子，用碱裂解的方法小量提取质粒DNA；
4.用BamHI和HindIII酶切质粒DNA，确定克隆DNA片段的正确，如图2所示，图中：Kan：卡那霉素抗性编码序列位置；lacI：lacI基因序列位置。
四.在大肠杆菌中的表达
1.将含有重组质粒PET-28a-ELA2的大肠杆菌接种含卡那霉素的10ml LB培养基中，37℃培养过夜；
2.将上述菌液接种到含卡那霉素的1000ml LB培养基中，在37℃培养约4h，使其A650 OD值到0.6-0.8时，向菌液中加入异丙基硫化半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度为0.5mM，继续培养6-8小时；
3.收集菌体，10,000转/分，4℃，10分钟，去上清收集沉淀；
4.上述菌体沉淀用pH8.0的PBS缓冲液洗一次，离心后，再用pH8.0的PBS缓冲液悬浮沉淀；
5.加入PMSF（苯甲基磺酰氟）后超声裂解菌液，并取样品用SDS-PAGE进行分析, 见图3，箭头所指为目标蛋白，得到分子量约28.6Kda的弹性蛋白酶。
五.弹性蛋白酶的分离和纯化
1.将超声裂解菌液，在12,000转/分，4℃离心10min，将沉淀悬浮于30ml基础缓冲液（8M尿素，10mM Tris，pH8.0）；
2.12,000转/分，4℃离心10min，取上清；
3.上清液经镍柱亲和结合后，用100、200、400mM的NaCl进行洗脱；
4.各组分经过SDS-PAGE分析后，找出最适合的洗脱浓度；
5.使用300mM的NaCl的洗脱浓度纯化目标弹性蛋白酶，如图4所示，箭头所指为目标蛋白，获得基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶。图中蛋白质Marker分子量（kDa）：72，56，33，25，16,11。
六.弹性蛋白酶的免疫原性及应用
将上述纯化的弹性蛋白酶上样5ug进行SDS-PAGE电泳，使用美国市售的US-BIO公司的中性粒细胞弹性蛋白酶单抗作为结合抗体，进行western-blot实验，见图5，箭头所指为目标蛋白。结果表明，本发明获得的弹性蛋白酶可以和弹性蛋白酶的单抗有非常好的特异性结合。实验结果表明，按照本发明方法制备的弹性蛋白酶和天然提取的弹性蛋白酶具有相似的免疫原性，可替代成本较高的天然弹性蛋白酶作为制备高效抗体的抗原。本法发明获得的弹性蛋白酶和特异性高效抗体可应用于临床诊断试剂的研发领域。因此，基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶在制备弹性蛋白酶特异性抗体、作为体外诊断试剂盒的原料有应用前景。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津金斯坦生物科技有限公司
<120> 基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶及其制备方法和该弹性蛋白酶的医药用途
<130> DNA
<160> 1
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 3956
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<220>
<221> 1
<222> (1)..(3956)
<223>
<400> 1
gcacggaggg gcagagaccc cggagcccca gccccaccat gaccctcggc cgccgactcg 60
cgtgtctttt cctcgcctgt gtcctgccgg ccttgctgct ggggggtgag tttttgagtc 120
caacctcccg ctgctccctc tgtcccgggt tctgttccca cctctccata gagggcccca 180
ccagtgtggg tccctcatcc tcacagggga ggtgccagct gggacaagga gaccagaaga 240
gactgaggtt ctgagcggtg aagccaccac caggagccca gagttggggt ttgaaaaccg 300
gggagggggg gggggtcgca ggtcgccctc tgggttcaag tccaggtctg tctgtgcctt 360
ggaggggcac cgtggggagg tccctttgcc tctccgtgcc tcagtttcct catctgaaca 420
acaggggtgc gaacggcccc gatcccgtgg gttcccggtg ggggatcccg tgggttcccg 480
gtgggggatc ccgtgggttc ctggtggggg atccagaggc cccgtggccg ggaggggaca 540
ggctccttgg caggcactca gcacccgcac ccggtgtgtc cccaggcacc gcgctggcct 600
cggagattgt ggggggccgg cgagcgcggc cccacgcgtg gcccttcatg gtgtccctgc 660
agctgcgcgg aggccacttc tgcggcgcca ccctgattgc gcccaacttc gtcatgtcgg 720
ccgcgcactg cgtggcgaat gtgtgagtag ccgggagtgt gcgcgcccgg ctcggacccc 780
gcgtcccggt ctgtgaggtg ggtgggggga ggccggggcc ggggctgctg gcgggggggg 840
gtccgtccag ggcccgcggg gcccctcgag caccttcgcc ctcaggcccg tcgccggatg 900
gggacgacaa ggcgcggctg agccccgacc cccggggccg cccctgagcc ccgcctctcc 960
ctccccggca gaaacgtccg cgcggtgcgg gtggtcctgg gagcccataa cctctcgcgg 1020
cgggagccca cccggcaggt gttcgccgtg cagcgcatct tcgaaaacgg ctacgacccc 1080
gtaaacttgc tcaacgacat cgtgattctc caggtgccgc cgggcggggc ggggggcgca 1140
ggggcggagg ccagaggcct ggggagggtg gaggctgcga cggaggggcg cgtcggggcc 1200
gctcgtgggg acctggggtg gcatcgtggg ctgggtggtc ccctctccgc gcctcggtct 1260
gcacctctgt gaaacgggaa aatacccgcc atgggccgtt gaggggttaa atgagatcct 1320
gcagggaggc cccgatctgc tgtcaatcaa caaacttact gagaagggag gccccgatct 1380
gttgtcaatc aacaaactta ctgagaaggg aggccccgat ctgttgtcaa tcaacaaact 1440
tactgagaag ggaggccccg atctgctgtc aatcaacaaa cttactgaga agggaggccc 1500
cgatctgttg tcaatcaaca aacttactga gaagggaggc cccgatctgc tgtcaatcaa 1560
caaacttact gagaagggag gccccgatct gttgtcaatc aacaaactta ctgagaaggg 1620
aggccccgat ctgctgtcaa tcaacaaact tactgagaag ggaggccccg atctgttgtc 1680
aatcaacaaa cttactgaga agggaggccc cgatctgctg tcaatcaaca aacttactga 1740
gattctttgt gtctctccat tcaccagtcc tgtggcccag ggcaggggcc gcctctgtct 1800
ttgggaaaag gggcaaaagt ccccaccttt ccacccctgt ccgcggcttg cagttctggt 1860
tatttcctgg gcgccgggcc ccgtggctca ggcctgtcat cccagcactt tgggaggctg 1920
aggcgggtgg atcacgaggt caggtgttcg agaccagcct gagcaacata gtgaaacccc 1980
gtctctacta aaatacaaaa aaaaaaaatt agccgagtgt ggttgtgggt gcctgtaatg 2040
ccaactactc aggaggctga ggaaggagaa tcgcttgaac cccggaggcg gagattgcag 2100
tgagctgaga tcacaccact gcactccagc ctgggtctca aaaaaaaaaa aaaagattcc 2160
tccctgggaa gggttagagg gagagtttcc ttgtcactaa gttttctcat agctctcacc 2220
cagtgcagtg gcgcgatcgc agctcactac agcctccatc tcctgggctc aagccaccct 2280
ctcagcttgg aatggggggt agctggaacc acaggtgcca ccacgtgggt ccaccacgtc 2340
tggctaatat atatatatac acacacacat acatatatta taaataataa atatatattt 2400
tatttaaata aaatatataa tatttataat tattttataa ttataataat atttatataa 2460
ttataaatat catttataat tataatattt attattttat aaaataataa atataaaata 2520
tataaaaata tttttataaa ataataaaaa tatatatata cacacatata tatatatttt 2580
ttgagacaag tctcgctctg tcgcccaggc tggagcgcag tggcacaatc tcagctcact 2640
gcaacctccg cctcccaggt tcaagcgatt ctcctgcctc agcctcccag gtagctggga 2700
ctacaggcgc ccgccaccac gcctggctaa tttttggtat tgttagtaga gacggggttt 2760
aaccatgtta gccaggatgg tcttgatctc ctgacctttt gattggccca cctcagcctc 2820
ccaaaatgct gggattatag gcgtgagcca ccgcacctgg caattttttt ttattatttt 2880
tgtagacatg gggctttgcc acattgccca ggctggtctt gaatgcctgg cctcaagtga 2940
tcctcctgcc tcgccctccc aaagtgctgg gcttacaagc atgagccacc gcgcccggct 3000
gtagtttttt tgttaactga gcacctactg cttcctgcac tcaagccaca tccagggaca 3060
acctccaacg ccctgagcct tggtgacggc tcccactcta cagatgggga aaccgaggct 3120
tgccttgggg agcagagtgt ggggtgggta tcctgccctg caggatccca gaaccacagt 3180
ggaacctgag atggggaaac tgaggcccgg agaggggagg gtcatcatca ctgccccgtg 3240
tgacgcgctg acgatctgtc cccaccgcca cagctcaacg ggtcggccac catcaacgcc 3300
aacgtgcagg tggcccagct gccggctcag ggacgccgcc tgggcaacgg ggtgcagtgc 3360
ctggccatgg gctggggcct tctgggcagg aaccgtggga tcgccagcgt cctgcaggag 3420
ctcaacgtga cggtggtgac gtccctctgc cgtcgcagca acgtctgcac tctcgtgagg 3480
ggccggcagg ccggcgtctg tttcgtacgt gccctgggtg tccctctgct ccccacccgc 3540
tcccagcccg gactgcagca acaggcaccg tggctagacc ctaggaggga cttcccaacc 3600
ctgacaggcg gcgggcaggt gggcagggcc tcgcagtcca gcttccccac cttgtctgcc 3660
tccacagggg gactccggca gccccttggt ctgcaacggg ctaatccacg gaattgcctc 3720
cttcgtccgg ggaggctgcg cctcagggct ctaccccgat gcctttgccc cggtggcaca 3780
gtttgtaaac tggatcgact ctatcatcca acgctccgag gacaacccct gtccccaccc 3840
ccgggacccg gacccggcca gcaggaccca ctgagaaggg ctgcccgggt cacctcagct 3900
gcccacaccc acactctcca gcatctggca caataaacat tctctgtttt gtagaa 3956
Claims (6)
1.一种基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶的制备方法，其特征在于：人中性粒细胞的裂解液，取含有基因组DNA的上清液，用PCR方法扩增，获得中性粒细胞弹性蛋白酶的基因片段ELA2，构建克隆质粒后转化大肠杆菌TOP10的感受态细胞，提取质粒DNA，构建弹性蛋白酶的pET-28a-ELA2表达质粒，并在大肠杆菌中表达弹性蛋白酶，收集菌体，超声裂解菌液，镍柱洗脱纯化后获得弹性蛋白酶；
所述PCR方法扩增的引物：
Primer1: 5’- agctgcgcgg aggccacttc-3’
Primer2: 5’-gga gccgt cacca aggctca-3’。
2.根据权利要求1所述基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶的制备方法，其特征在于：PCR扩增的条件为：94℃变性50秒，55℃退火1分钟，72度延伸3分钟，共循环30次，最后72度保温10分钟。
3.根据权利要求1所述基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶的制备方法，其特征在于：重组质粒pET-28a-ELA2在大肠杆菌中表达，是含有重组质粒pET-28a-ELA2的大肠杆菌接种在含卡那霉素的10ml LB培养基中，37℃培养过夜；将所得菌液接种到含卡那霉素的1000ml LB培养基中，在37℃培养4h，使其A650 OD值到0.6-0.8时，向菌液中加入异丙基硫化半乳糖苷，使其终浓度为0.5mM，继续培养6-8小时；收集菌体后制备超声裂解菌液。
4.根据权利要求1所述基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶的制备方法，其特征在于：纯化弹性蛋白酶是将超声裂解菌液在12,000转/分，4℃离心10min后，将沉淀悬浮于由8M尿素、10mM Tris，pH8.0制备的基础缓冲液30ml中；12,000转/分，4℃离心10min，取上清液，使用300mM的NaCl的洗脱浓度获得纯化的基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶。
5.根据权利要求1所述基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶的制备方法，其特征在于：该弹性蛋白酶的核酸序列如SEQUENCE LISTING序列1所示。
6.根据权利要求1所述基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶的制备方法，其特征在于：该弹性蛋白酶具有天然人中性粒细胞弹性蛋白酶的免疫原性。
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