CN1769424A - 一种芽孢杆菌菌株及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种芽孢杆菌菌株，该芽孢杆菌菌株是地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的菌株，保藏菌株名称为：地衣芽孢杆菌ZJUEL31410，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2005年06月23日，保藏号：CGMCC 1397。该芽孢杆菌菌株用于生产弹性蛋白酶，此弹性蛋白酶用于动物肉类的嫩化、或用于对蚕蛹或丝素的水解。
Description
技术领域
本发明涉及一种芽孢杆菌菌株，以及该菌株的用途。
背景技术
弹性蛋白酶是一种以分解不溶性弹性蛋白为特征的广谱蛋白水解酶，具有极大的经济价值和应用价值。近年来，弹性蛋白酶主要用于医药、食品和日用化工等工业之中。弹性蛋白酶主要用作治疗高血脂、防止动脉硬化，改善脂质蛋白代谢等作用。
我国是蚕丝生产大国，蚕蛹是蚕丝工业的主要副产品，每生产1吨生丝即可得到约1吨干蛹。由于干蛹具有丰富的营养成分，具有较高的保健价值，分离提取后可用于食品、医药等行业，具有极高的经济价值。但是，有关蚕蛹的利用并不能很好得到解决，多数处于初级加工，产品质量较次。而采用酶工程技术水解蚕蛹，可以直接用于食品、化妆品的生产，将会产生明显的经济效益。
弹性蛋白酶与其它蛋白酶功能的显著区别是对弹性蛋白具有专一性，并且在多种底物共存时，优先水解弹性蛋白，真正起到使肉类嫩化又不改变风味和口味的作用；而不是单纯对食用蛋白加以非选择性部分消化，是理想的肉类嫩化剂。同时弹性蛋白酶还能降解许多动植物蛋白，特别是能处理一些难以食用的如韧带、大动脉血管、筋腱等蛋白副产品的特点，可以用来进行农产品的深加工。
弹性蛋白酶还是一种良好的日用化工原料，主要用于保健化妆品的生产之中。弹性蛋白酶添加到化妆品中能改善皮肤的代谢功能，是一种新型的美容化妆品加工原料，具有良好的美容保健作用。
目前，我国弹性蛋白酶的主要来源是利用猪胰腺、脏提取，由于脏器资源的限制，因此弹性蛋白酶十分紧缺，供不应求，国内外产品价格昂贵，仅限于药品和极少量化妆品，因而导致弹性蛋白酶在其它领域的应用举步不前，特别是弹性蛋白酶在肉类嫩化上和老龄肉的改造上的应用研究严重不足，严重影响弹性蛋白酶的研究开发与应用。由此可见，利用微生物发酵法工业化、规模化地生产弹性蛋白酶有着广阔的应用发展前景。
目前也利用微生物生产弹性蛋白酶，但是现有的弹性蛋白酶产生菌存在着明显的毒性和安全性问题，而且产酶水平普遍偏低，对产酶菌的发酵特性、营养特性和发酵成本并未进行***的研究。因此探索其它新型、安全的弹性蛋白酶产生菌显得很有必要，具有极大的研究和开发价值。
发明内容
针对现有技术中存在的不足之处，本发明提供一种芽孢杆菌菌株及该菌株用于生产弹性蛋白酶的用途。
本发明为达到以上目的，是通过这样的技术方案来实现的：提供一种芽孢杆菌菌株，该芽孢杆菌菌株是地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的菌株，保藏菌株名称为：地衣芽孢杆菌ZJUEL31410，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2005年06月23日，保藏号：CGMCC 1397。
该地衣芽孢杆菌菌株ZJUEL31410为芽孢杆菌属，地衣芽孢杆菌种，在LB培养基上生长，形成的菌落特征为不规则状，菌落灰白色，美蓝淡染色中原生质没有不着色颗粒；细胞杆状，形成芽孢，芽孢椭圆或柱状，芽孢中生或近中生，细胞能运动，有鞭毛、无荚膜。该地衣芽孢杆菌菌株(ZJUEL31410)革兰氏反应阳性，接触酶阳性，兼性厌氧，在7％的NaCl中能生长，石蕊牛奶不产酸，VP阳性，生长最高温度50～55℃，最低温度15℃，卵磷脂酶阴性，能水解淀粉，还原硝酸盐为亚硝酸盐，能利用柠檬酸盐、丙酸盐，酪素水解阳性，酪氨酸分解阴性，葡萄糖发酵产酸。
本发明还提供了上述芽孢杆菌菌株的用途：该芽孢杆菌菌株用于生产弹性蛋白酶。
上述弹性蛋白酶可用于动物肉类的嫩化，也可用于对蚕蛹或丝素的水解。
本发明的芽孢杆菌菌株ZJUEL31410，在弹性蛋白选择性培养基上能产生明显的水解圈。该菌株既可以在葡萄糖、酪蛋白合成培养基上生长，也可以在麸皮和豆饼粉水解物粗料培养基上生长，但两种培养基中都需要添加生长因子——玉米提取粉，其主要代谢产物为弹性蛋白酶。代谢产物-弹性蛋白酶作为牛肉等老龄肉的嫩化是非常有效的，显示着很好的应用潜力和市场应用价值。同时该菌株生产的产物可以用于丝素蛋白的水解生产小分子肽，具有极好的应用价值。该代谢产物弹性蛋白酶进行急性安全毒性试验发现，其代谢产物是无毒的，作为食品级添加剂是安全的。
本发明的芽孢杆菌菌株ZJUEL31410产酶水平较高，酶活要显著高于同类国内外报道的产酶水平；而且产酶周期短，所用发酵基质简单。本发明采用统计优化方法对上述芽孢杆菌菌株的产酶培养条件进行了***优化，从而获得适合工业化生产的最佳培养条件和技术参数。本发明采用粗料培养基作为发酵原料，并获得了其培养基的组成，为弹性蛋白酶的大规模化生产降低生产成本提供依据。本发明开展了弹性蛋白酶在牛肉类嫩化和丝素蛋白水解中的应用，为弹性蛋白酶替代传统的嫩肉剂提供了实验依据和应用基础。本发明的芽孢杆菌菌株及其代谢产物——弹性蛋白酶，不产生有害物质，能安全地作为食品级添加剂。
具体实施方式
1、菌种的分离及鉴定
1.1菌种筛选
从杭州市肉类联合有限公司土壤和污水中采取土样和污水100多份，采用增殖培养基富集培养，稀释涂布于牛肉膏蛋白胨平板形成单菌落，然后挑取近2000个单菌落于弹性蛋白选择性平板上，将这两菌株分别编号为EL-3和EL-29。对EL-3号菌株进行进一步的分离和筛选，EL-3号菌株24h复筛酶活达到60U/mL；经过平板上3次自然分离，其酶活达100U/ml。
1.1.1筛选所用培养基及其培养方法：
平板及斜面培养基(g/L)：牛肉膏4.0，蛋白胨6.0，酵母膏2.0，NaCl 5.0，琼脂20.0，pH 7.0。
增殖培养基(g/L)：弹性蛋白5.0，酵母膏0.1，葡萄糖1.0，K2HPO2 1.0，KH2PO4 5.0，MgSO4·7H2O 0.1，pH 7.0。
初筛弹性蛋白选择性培养基(g/L)：弹性蛋白8.0，葡萄糖1.0，酵母膏1.0，K2HPO2 1.0，KH2PO4 0.5，MgSO4·7H2O 0.1，琼脂20，pH 7.0。
种子斜面及平板培养：37℃培养24h。
复筛发酵培养：发酵培养基20mL盛于250mL三角瓶中，接种后在旋转式摇床上32～37℃，转速180r/min，发酵培养24h。
发酵条件研究：发酵培养基20mL盛于250mL三角瓶中，按5％的接种量接种子培养基后在旋转式摇床上32～37℃，180r/min培养24h。
1.1.2胞外弹性蛋白酶产生菌的筛选分离方法：
采集到的样品先经增殖培养基培养48h后，稀释涂布于牛肉膏平板形成单菌落，再点种于弹性蛋白选择性培养基上进行初筛。选择细菌水解弹性蛋白所形成的透明圈直径与菌径之比较大的菌落进行摇瓶发酵复筛，测定发酵液弹性蛋白酶活力。
1.2该微生物的特征描述和鉴定结果
该菌株在牛肉膏蛋白胨酵母膏平板上生长良好，EL-3菌的形态特征为杆状。细胞杆状，形成芽孢，芽孢椭圆或柱状，芽孢中生或近中生，细胞能运动，有鞭毛、无荚膜，平板中生长菌落不规则状，菌落灰白色，美蓝淡染色中原生质没有不着色颗粒。革兰氏反应阳性，接触酶阳性，兼性厌氧，在7％的NaCl中能生长，石蕊牛奶不产酸，VP阳性，生长最高温度50-55℃，最低温度15℃，卵磷脂酶阴性，能水解淀粉，还原硝酸盐为亚硝酸盐，能利用柠檬酸盐、丙酸盐，酪素水解阳性，酪氨酸分解阴性，葡萄糖发酵产酸。经过理化和形态学鉴定，其与地衣芽孢杆菌具有98％的相似性，为了进一步验证其鉴定结果的可靠度，采用了分子生物学手段进行分子上的鉴定。提取基因组DNA，经过16SrRNA基因测序分析，其G+C％为55％，属芽孢杆菌属的G+C％含量范围内，接着采用进化树比对其序列与枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌的16SrRNA基因序列相似性(100％相似性)，综合其形态特征、生理生化特征和16SrRNA特征，可以鉴定为地衣芽孢杆菌，并命名为地衣芽孢杆菌ZJUEL31410(Bacillus licheniformis ZJUEL31410)。这是目前还未见报道和发明的产弹性蛋白酶新微生物资源。
对该酶的性质进行了初步研究，发现酶的酸碱特性、温度特性以及激活或抑制特性都与以前报道的弹性蛋白酶不一致，最适作用温度和pH分别为50℃、7.4；酶在30℃到50℃间热稳定性良好，而在60℃以上酶活受到极大的影响；该酶在中性偏碱性的环境下稳定性很高；EDTA和Al3+、Cu2+、Zn2+则严重抑制弹性蛋白酶活性，而Fe3+在试验的浓度下对酶反而有激活作用。
1.3新微生物的命名和保藏情况
命名为地衣芽孢杆菌ZJUEL31410(Bacillus licheniformis ZJUEL31410)保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2005年06月23日，保藏号：CGMCC 1397。
2.该微生物的培养方法或繁殖方法
该地衣芽孢杆菌产生弹性蛋白酶的种子培养方法和发酵培养方法见下所示，首先采用种子培养基进行增殖培养，随后接入发酵培养基中在一定条件下培养一定时间后测定其酶活。产酶发酵培养基可以采用葡萄糖、酪蛋白为发酵基质，也可以采用粗料麸皮、豆饼粉水解物为发酵原料，但其发酵过程中都需要添加一定量的玉米提取粉为生长因子
2.1种子培养方法：
培养基(g/L)：牛肉膏4.0，蛋白胨6.0，酵母膏2.0，氯化钠5.0，pH7.5
培养方法：接种量为4％，发酵温度为37℃，转速为200r/min，培养到对数生长期16-18h接入发酵培养基中进行培养。
2.2摇瓶发酵培养方法：
培养基(g/L)：葡萄糖74.0，酪蛋白11.30，玉米提取粉6.16，磷酸氢二钾2.06，硫酸镁0.34，pH7.5。
培养方法：接种量为4％，发酵温度为37℃，转速为220r/min，发酵培养24-30小时后下停止发酵，分析其弹性蛋白酶活性。
产酶促进剂：4％吐温-80能显著提高弹性蛋白酶活。
2.3发酵罐培养方法：
发酵罐培养基组成(g/L)：葡萄糖74.0，酪蛋白11.30，玉米提取粉6.16，磷酸氢二钾2.06，硫酸镁0.34，pH7.5。
培养方法：种子接种量为4％(种子培养时间为16-18h)，5-L罐装液系数为0.6，发酵过程中控制搅拌转速为300rpm，通风量为1L/min，发酵温度为37℃，发酵过程中pH自然。
产酶促进剂：4.6％的吐温80能极大提高弹性蛋白酶活。
2.4实施例
2.4.1摇瓶发酵培养实施例1：
在250ml摇瓶中装入25ml发酵培养基，种子接种量4％，种龄16-18小时，发酵温度37℃，摇床转速为200rpm，发酵培养基参见上述，在不同时间取样测定其酶活变化。摇瓶发酵培养不同时间产酶结果的具体数值如表1所示：
表1 摇瓶发酵培养不同时间产酶结果1
| 发酵时间(h) | 弹性蛋白酶(U/ml) | 生物量(g/L) |
| 06 | 017 | 02.3 |
| 12 | 83 | 4.6 |
| 18 | 258 | 7.8 |
| 24 | 317 | 7.5 |
| 30 | 402 | 7.2 |
| 36 | 382 | 7.1 |
| 40 | 368 | 7.2 |
| 48 | 375 | 7.8 |
| 54 | 412 | 8.3 |
| 60 | 408 | 6.7 |
| 72 | 401 | 5 |
2.4.2粗料摇瓶发酵培养实施例2：
在此实施例中培养基组成采用农副产品为原料进行发酵培养，其具体的摇瓶发酵培养实施案例见下所述。摇瓶发酵以粗料为基质的发酵结果的具体数值如表2所示，其结果可以看出，采用粗料为发酵基质能获得较高的产酶水平，可以达到采用葡萄糖、酪蛋白为发酵基质的产酶水平约70％，同时能显著降低发酵原料成本。
种子培养方法：250ml三角瓶装种子培养基20ml，接斜面活化后的种子一环，37℃培养18h。
发酵培养基成分如下(g/100mL)：3.42％麸皮、9.4％豆饼粉碱解液(ml/100mL)、0.1％玉米提取物、0.2％磷酸氢二钾、0.02％硫酸镁。
发酵培养方法：发酵培养基25ml盛于250ml三角瓶中，按5％的接种量接种后在旋转式摇床上37℃，转速200rpm。发酵48小时后获得的最大弹性蛋白酶活为269U/ml。
表2 摇瓶发酵以粗料为基质的发酵结果
| 发酵时间(h) | 弹性蛋白酶活(U/ml) |
| 0 | 0 |
| 6 | 3 |
| 12 | 36 |
| 18 | 155 |
| 24 | 176 |
| 30 | 245 |
| 36 | 256 |
| 42 | 260 |
| 48 | 269 |
| 54 | 250 |
| 64 | 202 |
2.4.3 5-L发酵罐发酵培养实施例3：
种子培养方法：250ml三角瓶装种子培养基20ml，接斜面活化后的种子一环，37℃培养18h。5-L发酵罐发酵培养产酶结果的具体数值如表3所示。
罐发酵方法：德国B.Braun公司制造生产的Biostat.B型5L自控式发酵罐。分批培养：装液系数为0.6，接种量5％。搅拌转速500rpm，通气量1L/min，培养温度37℃，装液系数0.6。其试验结果见下表3所示，其发酵酶活在30小时达到接近400U/ml。
表3 5-L发酵罐发酵培养产酶结果
| 发酵时间/h | 弹性蛋白酶活(U/ml) | 生物量(g/L) |
| 0 | 0 | 0 |
| 6 | 3 | 3.2 |
| 12 | 98 | 6.5 |
| 18 | 257 | 8.4 |
| 24 | 370 | 8.9 |
| 30 | 373 | 7.5 |
| 36 | 293 | 6.8 |
| 42 | 268 | 6.8 |
| 48 | 241 | 7.3 |
3.该微生物的具体用途和效果
3.1牛肉嫩化中的应用效果评价
肌肉相对裂解指数是代表肉类嫩化中很重要的一个指标。探讨了弹性蛋白酶组、木瓜蛋白酶组和空白对照组对牛肉嫩化的应用和效果比较。研究结果见下表4和表5，结果发现，不同的酶处理下，肉的肌纤维结构发生了明显的变化，尤其是肌纤维组织的降解程度有着明显的差别，其中木瓜蛋白酶处理后肌肉纤维组织降解的尤为剧烈，而弹性蛋白酶处理后肌肉组织发生了适度的分解；通过感官评定和嫩度的测定结果可以看出，两种酶处理后，其感官和嫩度与对照相比都发生了明显的变化，而木瓜蛋白酶在处理牛肉4小时后，放置4℃下贮藏48小时后已经失去了原有的肌肉结构和形态，出现了明显的苦味；弹性蛋白酶处理后并没有发生明显的分解，但嫩度和口感与对照相比都是非常突出的，而且持水性能明显优于对照，对照在冰箱放置48小时后出现严重的失水收缩现象。
表4不同处理后牛肉肌纤维在贮藏过程中相对裂解指数的变化
| 时间(h) | 空白对照组(RFI，％) | 木瓜蛋白酶组(RFI，％) | 弹性蛋白酶组(RFI，％) |
| 0 | 100 | 100 | 100 |
| 24 | 111 | 200 | 230 |
| 48 | 140 | 230 | 245 |
| 72 | 138 | 240 | 240 |
表5牛肉酶液处理后的外观分析结果(处理3h)
| 酶类 | 肌肉纤维层结构 | 硬度 | 处理液 |
| 空白对照组 | 肌层清晰可见 | 手指压较硬 | 出现明显血水色 |
| 木瓜蛋白酶组(1％) | 表层软化，纤维层开始断裂 | 较软 | 处理液较浑浊 |
| 木瓜蛋白酶组(0.1％) | 表层部分软化 | 软 | 无 |
| 弹性蛋白酶组 | 表层开始软化，但未出现明显断裂 | 较软 | 无 |
弹性蛋白酶和木瓜蛋白酶处理后对牛肉相对嫩度的影响比较结果见表6所示，从表中结果可以看出，弹性蛋白酶作为一种安全的肉类嫩化剂与传统工业中使用的木瓜蛋白酶相比，具有一定的优越性和可替代性，能作为一种良好的嫩化剂应用到实际肉类嫩化和动物废弃物的利用上。同时通过SEF扫描电镜观察可以看出，弹性蛋白酶嫩化后的牛肉肌肉组织得到明显的裂解，但裂解程度并不是很严重，没有破坏肌肉组织的正常结构。
表6弹性蛋白酶处理后牛肉嫩度与其它酶处理结果的比较
| 时间(h) | 对照(RH％) | 1％木瓜蛋白酶(RH％) | 0.1％木瓜蛋白酶(RH％) | 弹性蛋白酶(RH％) |
| 0 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 24 | 100 | 50 | 72 | 78 |
| 48 | 98 | 38 | 65 | 70 |
| 72 | 96 | 20 | 50 | 68 |
| 96 | 95 | 16 | 37 | 59 |
3.2弹性蛋白酶水解丝素蛋白的应用
丝素蛋白含有18种人体必需的氨基酸，其中Gly、Ala、Ser和Tyr为主，人体必需氨基酸含量较高。丝素蛋白不溶于水，但是经过物理或化学或酶处理后得到可溶性丝素肽和复合氨基酸。动物实验结果表明，处理后的丝素蛋白极易被人体吸收，消化率大大提高。其消化率见表7。弹性蛋白酶在水解丝素蛋白方面具有独特的优势，根据实际过程可以控制合适的水解度，从而得到适宜分子量范围的产品如生产复合氨基酸、功能性活性肽等。
实施过程中通过比较粗弹性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶以及碱性蛋白酶多丝素蛋白的水解能力发现，在试验条件下发现弹性蛋白酶水解丝素能力最强，结果见表。接着研究了酶-底物比对弹性蛋白酶水解丝素蛋白的影响，研究发现弹性蛋白酶水解丝素蛋白的最适作用温度为45-55℃，最适作用pH是9.0。该弹性蛋白酶催化水解丝素的反应在酶-底物比、50℃和pH是9.0条件下，反应4小时后的水解度为15.8％，高水解度丝素肽的相对分子量主要分布在1000以下，主要组分的相对分子量为565、134，二者所占的比分别为7.60％和81.80％。弹性蛋白酶为丝素的水解或废弃蚕蛹的利用提供了有效的工具酶。
表7丝素蛋白和酶解后丝素肽的消化率比较
| 原料 | 消化率(％) |
| 丝素蛋白粉 | 27.6 |
| 丝素蛋白溶液 | 47.4 |
| 丝素肽(相对分子量约4000) | 70.0 |
| 丝素肽(相对分子量约200) | 91.0 |
4、安全性研究
该菌株发酵生产的产物及其菌液经过浙江省疾病预防控制中心检测为经小鼠口服急性无毒，半致死剂量为10g/kg以上，食品上应用是安全的。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (6)
1、一种芽孢杆菌菌株，其特征是：该芽孢杆菌菌株是地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)的菌株，保藏菌株名称为：地衣芽孢杆菌ZJUEL31410，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2005年06月23日，保藏号：CGMCC 1397。
2、根据权利要求1所述的芽孢杆菌菌株，其特征是：所述地衣芽孢杆菌菌株ZJUEL31410为芽孢杆菌属，地衣芽孢杆菌种，在LB培养基上生长，形成的菌落特征为不规则状，菌落灰白色，美蓝淡染色中原生质没有不着色颗粒；细胞杆状，形成芽孢，芽孢椭圆或柱状，芽孢中生或近中生，细胞能运动，有鞭毛、无荚膜。
3、根据权利要求2所述的芽孢杆菌菌株，其特征是：所述地衣芽孢杆菌菌株ZJUEL31410革兰氏反应阳性，接触酶阳性，兼性厌氧，在7％的NaCl中能生长，石蕊牛奶不产酸，VP阳性，生长最高温度50～55℃，最低温度15℃，卵磷脂酶阴性，能水解淀粉，还原硝酸盐为亚硝酸盐，能利用柠檬酸盐、丙酸盐，酪素水解阳性，酪氨酸分解阴性，葡萄糖发酵产酸。
4、如权利要求1～3所述的芽孢杆菌菌株的用途：该芽孢杆菌菌株用于生产弹性蛋白酶。
5、根据权利要求4所述的芽孢杆菌菌株的用途，其特征是：所述弹性蛋白酶用于动物肉类的嫩化。
6、根据权利要求4所述的芽孢杆菌菌株的用途，其特征是：所述弹性蛋白酶用于对蚕蛹或丝素的水解。
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