ES2567296T3 - Procedimiento para usar una cepa de Bacillus subtilis para potenciar la salud animal - Google Patents

Procedimiento para usar una cepa de Bacillus subtilis para potenciar la salud animal Download PDF

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ES2567296T3 ES14163676.1T ES14163676T ES2567296T3 ES 2567296 T3 ES2567296 T3 ES 2567296T3 ES 14163676 T ES14163676 T ES 14163676T ES 2567296 T3 ES2567296 T3 ES 2567296T3
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Abstract

Una composición que comprende Bacillus subtilis QST713 (número de acceso NRRL: B21661) o un mutante de Bacillus subtilis QST713, en donde el mutante tiene todas las características identificativas de Bacillus subtilis QST173, en donde el mutante tiene una identidad de secuencia de ADN para Bacillus subtilis QST713 de al menos un 95 % para usar en un procedimiento de potenciar la salud de un animal distinto de insecto y distinto de ser humano, en el que el animal distinto de insecto y distinto de ser humano es un animal acuático.

Description

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Organismo
Enfermedad y/o animal afectado
Erysipelothrix rhusiopathiae
erisipela (cerdos)
El mantenimiento de la microflora intestinal sana y en particular, la reducción de una o más de las bacterias perjudiciales descritas anteriormente, también provoca una reducción en la diseminación de patógenos a través de las heces del animal. Las cantidades de patógenos se pueden determinar por varios procedimientos conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo el análisis de patógenos liberados en las heces del animal o el sacrificio de los animales durante los estudios y el análisis de las poblaciones de bacterias (beneficiosas y patógenas) en su intestino.
La composición de la presente invención también se puede usar para restablecer el equilibrio intestinal normal después de la administración de cantidades terapéuticas de antibióticos inhibiendo el crecimiento de bacterias patógenas y/o incrementando o manteniendo el crecimiento de bacterias beneficiosas. El término "cantidad terapéutica" se refiere a una cantidad suficiente para mejorar o invertir un estado de enfermedad en un animal.
El incremento en la productividad obtenido a través de los procedimientos divulgados en el contexto de la presente invención se refiere a cualquiera de los siguientes: producción de más huevos, leche o carne o de mayor calidad, o incremento en la producción de crías destetadas.
Los procedimientos de la presente invención se pueden aplicar a animales, tales como animales acuáticos y crustáceos, tales como camarón, pero excluyendo insectos y seres humanos.
En un aspecto, las composiciones de la presente invención son aditivos de pienso que se añaden al pienso del animal objeto antes de su alimentación. En dicho caso, las composiciones se pueden formular con un vehículo, tal como carbonato de calcio o proteína de suero, como se describe anteriormente. En un aspecto de la invención, dicho vehículo es higrófobo.
En otro aspecto, las composiciones que comprenden Bacillus subtilis QST713, sus mutantes, preparaciones libres de células de QST713 y sus mutantes y metabolitos de QST713 y sus mutantes se pueden formular en combinación con ingredientes de pienso necesarios para promover y mantener el crecimiento de un animal. Dichos ingredientes de pienso pueden incluir uno o más de los siguientes: proteína, carbohidrato, grasas, vitaminas, minerales, coccidiostáticos, productos a base de ácidos y/o medicamentos, tales como antibióticos. En algunos modos de realización, también estarán presentes vehículos, tales como los descritos anteriormente. Las proteínas y carbohidratos necesarios para promover y mantener el crecimiento se denominarán proteína de pienso y carbohidrato de pienso para distinguirlos de cualquier proteína y/o carbohidrato residual que pueda permanecer del proceso de fermentación bacteriana.
En otro aspecto, las composiciones de la presente invención que comprenden Bacillus subtilis QST713, sus mutantes, preparaciones libres de células de QST713 y sus mutantes y metabolitos de QST713 y sus mutantes pueden incluir además otros probióticos, tales como otras especies y cepas de Bacillus que se dan como pienso a los animales para potenciar la salud animal o para mejorar la condición física general del animal. Las cepas ejemplares incluyen Bacillus subtilis PB6 (como se describe en la patente de los EE. UU. N.º: 7.247.299 y depositada con el n.º de acceso ATCC PTA-6737), que se vende por Kemin con la marca comercial CLOSTAT® o Bacillus subtilis C-3102 (como se describe en la patente de los EE. UU. N.º: 4.919.936 y depositada como FERM BP-1096 con el Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, en Japón), vendida por Calpis como CALSPORIN®, o una mezcla de esporas de Bacillus licheniformis y Bacillus subtilis vendida por Chr. Hansen con la marca comercial BIOPLUS2B®, Bacillus coagulans, incluyendo las cepas descritas en la patente de los EE. UU. N.º: 6.849.256, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus pumilus, Bacillus laterosporus y Bacillus alevi. En las composiciones de la presente invención también se pueden usar otros probióticos distintos de Bacillus, tales como Saccharomyces cerevisiae. Si dichos otros probióticos no se formulan como parte de las composiciones de la presente invención, se pueden administrar con (al mismo tiempo o bien en momentos diferentes) las composiciones de la presente invención.
En otro aspecto, las composiciones de la presente invención pueden incluir o se pueden administrar con (al mismo tiempo o bien en momentos diferentes) enzimas que ayudan en la digestión del pienso, tal como amilasa, glucanasa, glucoamilasa, celulasa, xilanasa, glucanasa, amilasa y pectinasa; inmunomoduladores, tales como anticuerpos, citocinas, plasma secado por pulverización; interleucinas, interferones; y/u oligosacáridos, tales como fructooligosacáridos, mananoligosacáridos, galactooligosacáridos, inulina, inulina enriquecida con oligofructosa, tagatosa y polidextrosa.
En modos de realización en los que las composiciones comprenden QST713 o sus mutantes, las bacterias se deben añadir al pienso y se deben dar a los animales en una cantidad que sea eficaz para potenciar la salud de los animales. En un modo de realización, se puede añadir a una tasa de inclusión de desde aproximadamente 1 x 104 UFC Bacillus subtilis por gramo de pienso a aproximadamente 1 x 1010 Bacillus subtilis por gramo de pienso. En otro modo de realización se debe administrar de aproximadamente 1 x 105 UFC Bacillus subtilis por gramo de pienso a aproximadamente 1 x 109 Bacillus subtilis por gramo de pienso. Aún en otro se deben administrar de aproximadamente 1 x 105 UFC Bacillus subtilis por gramo de pienso a aproximadamente 1 x 109 Bacillus subtilis por gramo de pienso. Aún en otro se deben administrar de aproximadamente 1 x 106 UFC Bacillus subtilis por gramo de pienso a
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Género
Especie/ATCC Medio de crecimiento Condiciones para crecimiento
Clostridia
Cepa aislada ambiental de Perfringens Igual que antes Igual que antes
Listeria
monocytogenes ATCC 19116 Caldo de infusión de cerebro-corazón Durante la noche a 37 ºC
Listeria
monocytogenes ATCC 19111 Igual que antes Igual que antes
Listeria
seeligeri ATCC 35968 Igual que antes Igual que antes
Listeria
welshimeri ATCC 35897 Igual que antes Igual que antes
Salmonella
enterica ATCC 10398 Caldo con triptona y soja Igual que antes
Salmonella
arizonae ATCC 13314 Igual que antes Igual que antes
Salmonella
bongori ATCC 43975 Igual que antes Igual que antes
En los experimentos de Kirby-Bauer, se sumergieron 2 mm de discos de papel de filtro estéril en sobrenadante de QST713 y se secaron al aire en condiciones estériles. A continuación, se colocaron estos discos sobre césped del patógeno objetivo, se incubaron durante la noche y se midieron las zonas de inhibición. Se observaron las zonas de inhibición para los objetivos Clostridia y Listeria.
En la técnica de MIC, se inocularon pocillos de placas de microlitro con 75 µl de cada patógeno objetivo, se diluyeron hasta 1 x 105. La preparación libre de células descrita anteriormente se añadió a cada pocillo a diluciones finales de 1:2, 1:10 y 1:50. Las placas se incubaron durante la noche a 37 ºC y OD600 y se leyeron con un lector de microvaloración Wallach. La preparación libre de células (con tratamiento térmico y sin tratamiento térmico) era significativamente eficaz frente a los objetivos Clostridia y Listeria e inhibió el crecimiento de Salmonella y E. coli, aunque no se observaron zonas de inhibición para estos dos últimos patógenos sobre placas de Kirby-Bauer. Los datos para Clostridia, Listeria y Salmonella se muestran en las figuras 1-6.
Ejemplo 2 -Estudios in vitro de la eficacia de QST713 frente a varias bacterias
Se sometió a prueba una formulación en polvo de Bacillus subtilis QST713 para determinar la eficacia frente a varias cepas aisladas ambientales de las siguientes bacterias: Clostridium perfringens, Escherichia coli, Samonella enteritidis, Campylobacter jejuni y Listeria monocytogenes. Se preparó esta formulación en polvo fermentando Bacillus subtilis QST713, concentrando el caldo de fermentación y secando, como se describe anteriormente en la Descripción detallada de la invención. Tenía un 14,6 % de caldo concentrado, seco y 85,4 % de productos inertes de formulación (elegidos de las posibilidades descritas anteriormente) y contenía como mínimo aproximadamente 7,3 x 109 UFC Bacillus subtilis/gramo y como máximo aproximadamente 1x 1010 UFC Bacillus subtilis/gramo. Esta formulación se denominará Composición 1. Se prepararon soluciones madre de la composición 1 añadiendo 0,2 gramos del polvo formulado a 1,8 ml de agua destilada estéril, de modo que la solución contenía aproximadamente 1x10 UFC Bacillus subtilis por ml. Se sembraron los organismos de prueba para agar con triptano y soja con sangre de oveja al 5 % con hasta cuatro organismos sembrados para una placa de agar individual cada uno en una línea individual que biseca la placa de agar. Se dejó que los organismos se secaran durante la noche. A continuación, se sembraron las placas inoculadas con la suspensión de QST713 formulada descrita anteriormente, que se cultivó perpendicular a los organismos de prueba. Se incubaron las cepas aisladas Clostridium perfringens y Campylobacter jejuni en una atmósfera de gas Campy (10 % CO2, 5 % O2, 8 % N2) a 41 ± 2 C durante la noche. Las otras cepas aisladas, que son aerobias, se incubaron en 36±2 durante la noche sin gas Campy. La QST713 provocó la inhibición de varios de las cepas aisladas de Clostridium perfringens, Salmonella enteritidis, Campylobacter jejuni y Listeria monocytogenes, aunque no provocó la inhibición de E. coli. Además, en algunos casos, el Bacillus subtilis QST713 mostró un crecimiento excesivo competitivo agresivo de las bacterias patógenas. Los resultados se resumen en la tabla a continuación. Se midieron las zonas de inhibición informadas en la tabla, desde el borde del crecimiento de Bacillus hasta el comienzo del crecimiento del organismo de prueba. Además, las fotografías de las placas de Clostridium perfringens y Campylobacter jejuni se muestran en las figuras 7 y 8, respectivamente.
Tabla 3
Nombre del cultivo
ID cepa aislada Atmósfera y temperatura Zona de inhibición (mm) Comentarios
Clostridium perfringens
CL-2 Gas Campy, 41 ºC 0 Ligera inhibición del crecimiento aunque en ninguna zona, aglomeración de Bacillus
Nombre del cultivo
ID cepa aislada Atmósfera y temperatura Zona de inhibición (mm) Comentarios
CL-3
3
CL-14
0 Aglomeración de Bacillus
CL-15
0 Aglomeración de Bacillus
Escherichia coli O157
EC-80 Aerobio, 36 ºC 0
EC-81
0
EC-82
0
Salmonella enteritidis
SE27 Aerobio, 36 ºC 0
SE28
2
SE29
1
SE03
1
SE09
1
SE22
0
Campylobacter jejuni
Cj-1 Gas Campy, 41 ºC 1 Aglomeración de Bacillus
Cj-2
0 Ligera inhibición del crecimiento aunque en ninguna zona, aglomeración de Bacillus
NCj1
0 Aglomeración de Bacillus
NCj2
1
Listeria monocytogenes
LM1 Aerobio, 36 ºC 2
Ejemplo 3 -Estudios in vivo de QST713 en pollos parrilleros
Se añadió la composición 1 a las dietas de iniciación y finalización de los pollos parrilleros y se observaron la ganancia de peso y la eficacia del pienso. Se separaron aleatoriamente 252 pollos parrilleros Jumbo Cornish Cross en cuatro 5 grupos y se les dio una de las dietas enumeradas a continuación.
•
Dieta basal solo -control
•
Dieta basal + 0,05 % de CALSPORIN® (0,5 g/kg; 106 UFC/g) (designada como CS en la tabla a continuación)
• Dieta basal + 0,05 % de Composición 1 (0,5 g/kg; 106 UFC/g) (designada como Comp. 1-10 en la tabla a 10 continuación)
• Dieta basal + 0,0005 % de Composición 1 (0,5 mg/kg; 103 UFC/g) (designada como Comp. 1-103 en la tabla a continuación)
La dieta basal consistía en la siguiente dieta de iniciación durante los días 1-22 y la siguiente dieta de finalización durante los días 22-42.
15 Tabla 4 -Composición de ingredientes de las dietas basales de iniciación (de 1 a 21) y finalización (d 22 a 42) para los pollos parrilleros
Ingrediente %
Iniciador Finalización
Maíz
45,6 49,2
Harina de soja (48 % CP)
23,5 16,8
Granos secos de destilería
5,0 5,0
Harina de gluten de maíz
2,0 4,0
Harina de pescado
1,0 2,5
Harina de alfalfa
- 0,5
Vitamina, mineral, otro
22,9 22,0
Los resultados a continuación en la tabla 5 muestran que la composición 1 mejoró la ganancia de peso de las aves al nivel de 106 UFC/g. Se mejoró la eficacia del pienso durante el periodo de los días 21-42 y para el periodo de crecimiento global (1-42 días). En el gráfico a continuación, ADG se refiere al promedio de ganancia diaria, ADFI se refiere al promedio de la ingesta de pienso diaria.
Tabla 5 -Efecto del tratamiento dietético sobre el rendimiento de pollos parrilleros
Tratamiento
Apartado
Control CS Comp. 1-106 Comp. 1-103
Peso corporal, g
d 1
40,5 ± 0,43 40,0 ± 0,40 40,8 ± 0,43 40,7 ± 0,43
d 21
861,8 ± 22,3 815,6 ± 20,3 880,0 ± 22,3 842,3 ± 22,3
d 42
2494,4 ± 66,7 2469,0 ± 60,9 2617,0 ± 66,7 2460,3 ± 66,7
ADG, g
d 1-21
39,8 ± 0,89 37,7 ± 0,81 39,8 ± 0,89 38,9 ± 0,89
d 21-42
77,9 ± 3,18 77,5 ± 2,90 82,5 ± 3,18 78,3 ± 3,18
d 1-42
58,4 ± 1,46 57,8 ± 1,33 61,3 ± 1,46 57,9 ± 1,46
ADFI, g
d 1-21
57,3 ± 1,15 55,9 ± 1,05 59,4 ± 1,15 57,6 ± 1,15
d 21-42
156,6 ± 3,56 158,3 ± 3,25 155,3 ± 3,56 158,7 ± 3,56
d 1-42
105,2 ± 2,30 104,9 ± 2,10 106,6 ± 2,30 106,7 ± 2,30
Ganancia:Pienso, g/g
d 1-21
0,69 ± 0,015 0,67 ± 0,014 0,66 ± 0,015 0,67 ± 0,015
d 21-42
0,50 ± 0,024 0,50 ± 0,022 0,52 ± 0,024 0,49 ± 0,024
d 1-42
0,50 ± 0,022 0,51 ± 0,020 0,52 ± -0,022 0,48 ± 0,022
Mortalidad, n
1,2 ± 0,51 1,2 ± 0,46 1,4 ± 0,51 1,4 ± 0,51
Ejemplo 4 -Estabilidad de QST713 en el procedimiento de granulado de pienso
Para determinar la estabilidad de Bacillus subtilis QST713 durante el procedimiento de granulado de pienso, se
10 prepararon pellas de pienso que contenían la composición 1 y se sometieron a prueba las muestras a varias temperaturas. El pienso de control contenía los ingredientes mostrados en la tabla 6, mientras que el pienso experimental se complementó con un 8 % de la composición 1.
Tabla 6
Ingrediente % Maíz 68,94 Harina de soja 20,40
Harina de pescado 5,50 Monocalcio Fosfato 0,51
Caliza 0,58 Sal 0,33 DL-metionina 0,31 L-lisina 98 % 0,18
Vit/Min ave de corral Premezcla 0,25 Aceite de soja 3,00
TOTAL 100,000
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Se mezclaron los ingredientes en un mezclador Foberg a temperatura ambiente y a continuación se calentaron a varias temperaturas objetivo a las que se mantuvieron durante aproximadamente 30 s antes del granulado a aproximadamente 907,2 kg/h (2000 lbs/hora) a través de un troquel de pellas de 5/32" x 1 ¼i" (39,7 mm x 31,75 mm). Se tomaron diez muestras de diez lugares diferentes en todo el mezclador. Se tomaron muestras de las pellas a las temperaturas objetivo de 65 ºC, 75 ºC, 80 ºC y 85 ºC dentro del mismo lote de 340,2 kg (750 lbs).
Se diluyeron las muestras del mezclador y se dejó que se asentaran cinco minutos hasta su total humectación. Se remojaron las muestras de pellas durante 30 minutos en tampón fosfato para recuperar las células de QST713. Se plaquearon las muestras diluidas para determinar las unidades formadoras de colonias. Las unidades formadoras de colonias disminuyeron de forma insignificante del mezclador a los estados de granulado, como se muestra en la tabla 7, a continuación.
Tabla 7
Material
UFC/g
8 % Bacillus Mezclador 1
1,98E+09
8 % Bacillus Mezclador 2
1,62E+09
8 % Bacillus Mezclador 3
1,62E+09
8 % Bacillus Mezclador 4
1,42E+09
8 % Bacillus Mezclador 5
1,73E+09
8 % Bacillus Mezclador 6
1,64E+09
8 % Bacillus Mezclador 7
1,63E+09
8 % Bacillus Mezclador 8
1,44E+09
8 % Bacillus Mezclador 9
1,72E+09
8 % Bacillus Mezclador 10
1,64E+09
8 % Bacillus Pellas 85 ºC
1,56E+09
8 % Bacillus Pellas 80 ºC
1,71E+09
8 % Bacillus Pellas 75 ºC
1,73E+09
8 % Bacillus Pellas 65 ºC
1,09E+09
Ejemplo 5 -Estudios in vivo de QST713 en cerdos
Se realizó un ensayo usando QST713 en forma de pella de pienso usando 750 cerdos en un marco de lechones destetados. Se añadió la composición 1 al pienso antes de su granulado por procedimientos estándar. Los estudios de UFC de QST713 antes y después del procedimiento de granulado estándar fueron consistentes con los resultados obtenidos en el ejemplo 4, anterior y mostraron que las UFC de QST713 no disminuyeron drásticamente después del granulado.
El peso inicial aproximado/cerdo fue de 4,5 kg (10 lbs) y el objetivo era que los cerdos crecieran hasta aproximadamente 18,1 kg (40 lbs). Un tratamiento de control que consistía en una dieta estándar sin ningún antibiótico ni Bacillus se le dio a aproximadamente 250 cerdos. Otros 250 cerdos recibieron la dieta estándar más 1x106 UFC Bacillus subtilis QST713 por g de pienso. A un tercer grupo de 250 cerdos se le dio 1x107 UFC Bacillus subtilis QST713 por gramo de pienso. El número de cerdos eliminados selectivamente en el tercer grupo se redujo significativamente en comparación con el grupo de control. La práctica de eliminación selectiva implica retirar de la alimentación en la que se dan los productos terapéuticos a los cerdos menos sanos o de tamaño insuficiente o sacrificarlos.
Ejemplo 6 -Estudios in vivo de QST713 en aves de corral
Se realizó un ensayo usando la Composición 1 como aditivo de pienso usando pollos parrilleros con 50 aves por corral con lecho de paja y 6 corrales por tratamiento. Se añadió la composición 1 a pienso estándar para aves de corral (que no contiene otros probióticos o antibióticos) a una tasa de 91 gramos de composición 1 por tonelada de pienso (aproximadamente 6,64 x 1011 UFC/tonelada). Uno de los grupos de control y el grupo de aves administrado con pienso con la composición 1 se expusieron a Clostridium perfringens los días 19, 20 y 21 del estudio. Se registró el
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peso en todo el estudio y se muestra en la tabla 8, a continuación. Se determinó la eficacia de pienso y se informó como proporción de conversión de pienso en la tabla 9, a continuación. Se ajustó la tasa de conversión de pienso con los pesos de las aves muertas y retiradas. El día 22 del estudio, cinco aves de cada corral se seleccionaron, se sacrificaron, se pesaron y se examinaron para determinar el grado de presencia de lesiones por enteritis necrótica (NE). La puntuación de NE se basó en una escala de puntuación de 0 a 3, siendo 0 normal y siendo 3 el más grave. En las tablas 8 y 9, las medias dentro de las columnas con superíndices diferentes son significativamente diferentes (P<0,05). El EEM es el error estándar de LSMEANS.
Tabla 8. Efectos del tratamiento dietético sobre las ganancias de peso de pollos parrilleros en un modelo de exposición a Clostridium perfringens en corrales de lecho de paja.
Promedio de peso (kg) Promedio de ganancia de peso (kg)
Tratamientos Días 0 a 21 Días 0 a 42 Días 21 a 42 Día 0
Control (NC)
0,044 0,515A 1,892A 1,377A
Control expuesto
0,044 0,469B 1,704B 1,235B
(CP)
Composición 1 (CP)
0,044 0,496AB 1,838A 1,342AB
EEM
0,000 0,011 0,041 0,037
Pr>F
0,3712 0,0415 0,0049 0,0083
Tabla 9. Efectos del tratamiento dietético sobre la conversión de pienso y las lesiones por enteritis necrótica de pollos parrilleros en un modelo de exposición a Clostridium perfringens en corrales de lecho de paja.
Proporción de conversión de pienso (proporción pienso a ganancia)
Tratamientos
Días 0 a 21 Días 0 a 42 Días 21 a 42 Puntuación de lesión
por enteritis necrótica
Control (NC)
1,723B 1,943B 2,055B 0,17c
Control expuesto (CP)
1,893A 2,051A 2,183A 1,30A
Composición 1, CP
1,765B 1,964B 2,128^ 0,77B
EEM4
0,026 0,021 0,040 0,17
Pr>F
0,0003 0,0010 0,0490 0,0009
Ejemplo 7 -Uso de la composición 2 para varios estudios
Se realizaron ensayos para someter a prueba la mejora en el rendimiento del crecimiento usando una segunda formulación de Bacillus subtilis QST713. Esta formulación en polvo se prepara fermentando, concentrando el caldo de fermentación, secándolo y lavándolo por medio de un procedimiento de diafiltración para retirar el medio de fermentación residual y metabolitos, todo como se describe anteriormente, de modo que la composición esté comprendida esencialmente de células -principalmente esporas y algunas células vegetativas. Esta composición contiene un 14,6 % de cultivo concentrado, secado, lavado y un 85,4 % de productos inertes de formulación (elegidos de las posibilidades descritas anteriormente en la Descripción detallada de la invención) y aproximadamente 1,0 x 10 UFC Bacillus subtilis/gramo y se denominará en el presente documento Composición 2. La composición 2 está sustituida por la composición 1 en los ensayos descritos en los ejemplos 3-6 y se espera que los resultados sean los mismos que los logrados con la composición 1.
Ejemplo 8 -Viabilidad de las esporas de QST713 en agua de mar
Se sometió a prueba la composición 1 para determinar la viabilidad en agua de mar y NaCl. Se preparó agua de mar artificial en tres concentraciones; 10 ppt, 30 ppt, 50 ppt; 4 tubos de 25 ml por concentración. Se preparó un caldo de nutrientes con tres concentraciones de NaCl; 1 %, 3 % y 5 %; 4 tubos de 25 ml por concentración. Se esterilizaron tanto el agua de mar como los caldos de nutrientes en autoclave antes de la inoculación. Se preparó una suspensión de la composición 1 disolviendo 0,5 g en 10 ml de agua DI. Se inocularon alícuotas (0,5 ml) de la suspensión en cada una de las tres concentraciones de agua de mar y cultivo. Se estimó que los tubos contenían >107 ufc/ml (ufc=unidad formadora de colonias). Se prepararon frascos de dilución de un 1 % de caldo de nutrientes y un 1 % de NaCl (99 ml por frasco) y se esterilizaron con autoclave. Se preparó agar de nutrientes de acuerdo con las indicaciones del fabricante; se prepararon placas de 15x100 mm para la prueba de recuento de placas, una placa por prueba más controles no inoculados.
Se incubaron los tubos a 28 ºC en una incubadora con agitación, usando 125 rpm, durante 14 días. Se tomaron
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