TWI687224B

TWI687224B - 反芻動物之***炎之預防或治療劑

Info

Publication number: TWI687224B
Application number: TW103117429A
Authority: TW
Inventors: 蘆田延久; 今林寬和; 麻生久
Original assignee: 日商朝日可爾必思健康股份有限公司
Priority date: 2013-05-17
Filing date: 2014-05-16
Publication date: 2020-03-11
Also published as: NZ715248A; US20160120919A1; JP6415430B2; US10251918B2; BR112015028692A8; AU2014266266B2; EP3031464A1; BR112015028692B1; CN105358166B; WO2014185516A1; EP3031464A4; JPWO2014185516A1; EP3031464B1; TW201524512A; JP2018165272A; AU2014266266A1; CN105358166A

Abstract

本發明係關於一種用於預防或治療反芻動物、尤其是乳牛之***炎之物質或方法，具體而言，本發明提供一種反芻動物之***炎之預防或治療劑、飼料添加物、飼料、或醫藥組合物，該預防或治療劑、飼料添加物、飼料、或醫藥組合物之特徵在於：包含具有以下性質之桿菌屬細菌作為有效成分，即，可於牛體內增加或維持CD11c⁺CD172a⁺血中樹狀細胞閘2。

Description

反芻動物之***炎之預防或治療劑

本發明係關於一種用於預防或治療牛等反芻動物之***炎之預防或治療劑、飼料添加物、飼料或醫藥組合物，該預防或治療劑、飼料添加物、飼料或醫藥組合物之特徵在於：包含具有特定之性質之桿菌屬(Bacillus)細菌作為有效成分。

***炎為乳腺組織之炎症，其原因之多數係由金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鏈球菌、綠膿桿菌等細菌之感染所引起。尤其是牛之***炎如下所述般對乳農(Dairy farmer)而言成為重大之問題。

***炎大致分為臨床型***炎與潛在性***炎(亦稱為非臨床型***炎)。臨床型***炎可確認到***紅腫、發熱、伴有疼痛，或於乳汁中混入異物等肉眼可見之異常，與此相對，潛在性***炎無法觀察到如臨床型***炎之異常而於乳腺產生炎症。關於發生比率，潛在性***炎遠多於臨床型***炎，據稱擠乳牛之約25~50%罹患此症。

關於牛之***炎之發病，現狀為於發病前預防***炎、或作為發生了***炎之牛之治療未能採取充分之對策，而成為乳業產業中之較大之課題。於日本之2009年度家畜共濟統計中報告之疾病病類別事故頭數中，約141萬頭之30%為泌尿系疾病(Urinary disease)，其9成左右為***炎。又，死廢病類別事故頭數中亦有約16萬頭之9%為泌尿系疾病，因此僅於2009年度，***炎發病上升至約42萬頭，廢棄頭數上升至1.5萬頭。進而，於發生了***炎之情形時，乳質或乳量降低，故而經濟損失不可估量。因此，雖利用投予抗生素進行治療，但現狀為未痊癒之情況亦較多，且無隔離以外之方法。即便進行抗生素投藥而痊癒，亦無法進行投藥中之乳之出貨，據稱於日本由***炎所引起之經濟損失以估算計約為1千億日元。又，除直接之經濟損失以外，***炎感染牛之治療所耗費之勞動負擔或醫藥費亦不可忽視。進而，考慮有如下等次要之不良影響：發生過一次***炎之乳牛於其以後之生產後之哺乳期內發生***炎之概率非常高，或發生過***炎之乳牛之發情延遲。因此，於乳業產業中，除要求***炎之預防或有效之治療方法以外，***炎之預防或復發抑制技術之確立成為當務之急。

迄今為止，為了預防或治療牛等反芻動物之***炎，業界提出了各種提案。該等經提案之預防劑或治療劑之中，尤其報告有若干為了預防或治療***炎而利用微生物之例。

例如，專利文獻1中，揭示有一種牛之***炎之預防或治療用組合物，其特徵在於：含有由屬於短梗黴屬(Aureobasidium)之微生物之培養物獲得之培養組合物作為有效成分。

專利文獻2中，揭示有一種家畜***炎預防治療組合物，其特徵在於：以麵包酵母活菌或其含有物作為有效成分。

作為其他例，關於對乳牛之活菌劑之使用，例如Natokin-L(乳酸菌及枯草菌)、宮入菌粉末(酪酸菌)、百飼益(Bio-Three)(乳酸菌、糖化菌及酪酸菌)、Bovactin(乳酸菌及酪酸菌)可用於預防及治療單純性下痢(非專利文獻1)。該文獻之表2中，記載有***炎之發生率藉由使用活菌劑而減少，但未表明該活菌劑為何種物質。附帶提及，該文獻之表1中所列舉之活菌劑之中，現狀之對乳牛之活菌劑投予係80~90%使用「百飼益」，因此推測表2中所使用之活菌劑或許為「百飼益」。又，包含Bio-Top(枯草菌)之活菌劑除鼓脹症(bloat)之產生銳減、食慾增加及毛皮光澤等效果以外，亦知有排出沙氏桿菌(Salmonella)之牛之頭數減少等效果(非專利文獻2)。

進而，由與該申請案為相同申請人所教導，使用枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)之活菌體作為反芻動物之飼料利用效率改善劑(專利文獻3)。該文獻中之利用效率改善為消化吸收效率之改善，藉此乳牛之乳量或乳質亦得以改善。又，由與該申請案為相同申請人亦教導有將枯草芽胞桿菌C-3102株與維生素、礦物質、胺基酸等混合而成之飼料添加物(專利文獻4)。進而，於專利文獻5中記載有將枯草芽胞桿菌用於降低反芻動物等動物之腸內之病原性細菌之增殖。然而，於專利文獻3、4及5中，未記載枯草芽胞桿菌對牛之***炎之預防或治療有用。

[先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]日本專利特開2012-126657號公報

[專利文獻2]日本專利特開2001-224317號公報

[專利文獻3]國際公開2011/115306號

[專利文獻4]日本專利特開昭64-86842號公報

[專利文獻5]日本專利特表2012-502920號公報

[非專利文獻]

[非專利文獻1]齊藤康倫，臨床獸醫，2010. Sep., Vol. 28, No. 9

[非專利文獻2]日產資訊，第34號，2006年8月，日產合成工業股份有限公司

如上述背景技術中所述，於乳業產業中強烈要求牛之***炎之預防或有效之治療方法。

因此，本發明之目的在於提供一種用於預防及/或治療牛之***炎之劑或醫藥組合物或方法。

本發明者等人此次發現，特定之桿菌屬細菌藉由向牛、尤其是乳牛之供給(或者投予或攝取)而發揮***炎預防效果，進而提高發病後之***炎之治療效果。

因此，本發明包含以下之特徵。

[1]一種反芻動物之***炎之預防或治療劑，其特徵在於：包含具有下述(1)之性質之桿菌屬細菌作為有效成分， (1)可於牛體內增加或維持CD11c⁺CD172a⁺血中樹狀細胞閘2。

[2]如[1]之預防或治療劑，其中上述桿菌屬細菌進而具有下述(2)之性質： (2)於將枯草芽胞桿菌C-3102株(國際寄存編號FERM BP-1096)之雙歧桿菌增殖活性設為1時，其雙歧桿菌增殖活性高於0.8。

[3]如[1]或[2]之預防或治療劑，其中上述桿菌屬細菌具有下述(3)之性質： (3)於將枯草芽胞桿菌C-3102株(國際寄存編號FERM BP-1096)之蛋白酶活性及澱粉酶活性均設為1時，其蛋白酶活性及澱粉酶活性高於0.7。

[4]如[1]至[3]中任一項之預防或治療劑，其中上述桿菌屬細菌具有下述(4)之性質： (4)於以1×10⁵個以上/天/頭之用量對牛進行經口投予時，可預防或治療***炎。

[5]如[1]至[4]中任一項之預防或治療劑，其中上述反芻動物為牛。

[6]如[4]至[5]中任一項之預防或治療劑，其中上述性質(4)中之上述經口投予係於牛之分娩1個月前至分娩後3個月之期間進行。

[7]如[1]至[6]中任一項之預防或治療劑，其中上述桿菌屬細菌為枯草芽胞桿菌細菌。

[8]如[7]之預防或治療劑，其中上述枯草芽胞桿菌細菌為枯草芽胞桿菌C-3102株(國際寄存編號FERM BP-1096)、或具有上述性質(1)、上述性質(1)及(2)、上述性質(1)及(3)、上述性質(1)~(3)、上述性質(1)及(4)、上述性質(1)、(3)及(4)、或上述性質(1)~(4)之C-3102株之變異株。

[9]一種用於預防或治療反芻動物之***炎之飼料添加物，其特徵在於：包含如上述[1]至[8]中任一項之預防或治療劑作為有效成分。

[10]如[9]之飼料添加物，其進而包含***炎治療用抗生素。

[11]一種反芻動物之***炎之預防或治療效果經強化之飼料，其特徵在於：包含用於預防或治療反芻動物之***炎之有效量的如[9]或[10]之飼料添加物。

[12]一種用以於反芻動物用之飼料中強化反芻動物之***炎之預防或治療效果之方法，其特徵在於包括如下步驟：將用於預防或治療反芻動物之***炎之有效量的如[9]或[10]之飼料添加物添加至反芻動物用之飼料中。

[13]一種用於預防或治療反芻動物之***炎之醫藥組合物，其特徵在於：包含具有下述(1)之性質之作為有效成分之桿菌屬細菌及製藥上可容許之載體， (1)可於牛體內增加或維持CD11c⁺CD172a⁺血中樹狀細胞閘2。

[14]如[13]之用於預防或治療之醫藥組合物，其中上述桿菌屬細菌進而具有下述(2)之性質： (2)於將枯草芽胞桿菌C-3102株(國際寄存編號FERM BP-1096)之雙歧桿菌增殖活性設為1時，其雙歧桿菌增殖活性高於0.8。

[15]如[13]或[14]之用於預防或治療之醫藥組合物，其中上述桿菌屬細菌具有下述(3)之性質： (3)於將枯草芽胞桿菌C-3102株(國際寄存編號FERM BP-1096)之蛋白酶活性及澱粉酶活性均設為1時，其蛋白酶活性及澱粉酶活性高於0.7。

[16]如[13]至[15]中任一項之用於預防或治療之醫藥組合物，其中上述桿菌屬細菌具有下述(4)之性質： (4)於以1×10⁵個以上/天/頭之用量對牛進行經口投予時，可預防或治療***炎。

[17]如[13]至[16]中任一項之醫藥組合物，其中上述反芻動物為牛。

[18]如[13]至[17]中任一項之醫藥組合物，其中上述牛為正常乳牛、存在***炎發病之可能性之乳牛、***炎發病中之乳牛、或存在***炎發病史之乳牛。

[19]如[16]至[18]中任一項之醫藥組合物，其中上述性質(4)中之上述經口投予係於牛之分娩1個月前至分娩後3個月之期間進行。

[20]如[13]至[19]中任一項之醫藥組合物，其中上述桿菌屬細菌為枯草芽胞桿菌細菌。

[21]如[20]之醫藥組合物，其中上述枯草芽胞桿菌細菌為枯草芽胞桿菌C-3102株(國際寄存編號FERM BP-1096)、或具有上述性質(1)、上述性質(1)及(2)、上述性質(1)及(3)、上述性質(1)~(3)、上述性質(1)及(4)、上述性質(1)、(3)及(4)、或上述性質(1)~(4)之C-3102株之變異株。

[22]如[13]至[21]中任一項之醫藥組合物，其進而含有***炎治療用抗生素。

[23]一種對反芻動物預防或治療***炎之方法，其包括如下步驟：將如[1]至[8]中任一項之預防或治療劑、如[9]或[10]之飼料添加物、如[11]之飼料、或如[13]至[22]中任一項之醫藥組合物向需要其之反芻動物投予或供給。

[24]如[23]之方法，其進而包括視需要投予***炎治療用抗生素之步驟。

本發明提供一種於反芻動物、較佳為牛、更佳為乳牛之***炎之預防或治療方面具有預防及治療效果較高之特定性質之桿菌屬細菌。已知，具有***炎既往史之乳牛即便於藉由抗生素治療而改善症狀後，其後每次經歷生產時發生***炎之概率亦非常高，本發明之預防或治療劑藉由自分娩約1個月前起進行經口投予或供給而發揮如下意料之外之有效性，即，可有效地抑制其後之***炎之發病，多數情況下可成為完全不發病之狀態。

1‧‧‧血中樹狀細胞閘

2‧‧‧血中樹狀細胞閘

3‧‧‧血中樹狀細胞閘

關於圖1，該圖係表示本發明中用作有效成分之枯草芽胞桿菌細菌與改善***炎之效果之相關性、且證明牛之CD11c⁺CD172a⁺血中樹狀細胞閘2之增加的圖。A係模式性地表示第1象限(右上)之閘1內檢測到之CD11c陽性CD172a陽性之血中樹狀細胞閘2(於***炎改善之情形時，CD172a及CD11c之表現強度均增高)及閘3(與閘2細胞相比，CD172a之表現強度較低)的大致位置或範圍。B係表示慢性***炎牛(對照)之CD11c⁺CD172a⁺血中樹狀細胞之雙色流式細胞儀分析(dual color flow cytometric analysis)結果，C係表示被投予本發明之預防、治療劑之試驗區之乳牛(牛編號23：分娩第9天(左)及牛編號15：分娩第8天(右))之CD11c⁺CD172a⁺血中樹狀細胞的雙色流式細胞儀分析結果。D係表示未投予枯草芽胞桿菌細菌之對照乳牛(牛編號94：分娩第 8天(左)及牛編號902：分娩第10天(右))之CD11c⁺CD172a⁺血中樹狀細胞之雙色流式細胞儀分析結果。

以下，更詳細地說明本發明。

1.預防或治療劑

本發明提供一種反芻動物之***炎之預防或治療劑，其包含具有以下所說明之特定性質之桿菌屬細菌、較佳為枯草芽胞桿菌細菌作為有效成分。

以下，對***炎、桿菌屬細菌及預防劑進行說明。

[1]***炎

本說明書中所使用之***炎為反芻動物、較佳為牛、進而較佳為乳牛之***炎，該疾病包括臨床型***炎與潛在性***炎(亦稱為非臨床型***炎)。如上述背景技術之項中所說明，臨床型***炎可確認到***紅腫、發熱、伴有疼痛、或於乳汁中混入異物等肉眼可見之異常，與此相對，潛在性***炎無法觀察到如臨床型***炎之異常而於乳腺產生炎症。關於發生比率，潛在性***炎遠多於臨床型***炎，據稱擠乳牛之約25~50%罹患此症。臨床型***炎容易藉由利用抗生素進行投藥治療而痊癒，但另一方面，潛在性***炎具有難治性且無有效之治療法，故而僅存在採取感染動物之隔離等對策之方法。

尤其是發生了上述***炎、特別是潛在性***炎之乳牛會引起乳泌量或乳質之降低，且於使用抗生素等化學療法劑之情形時，無法將乳出貨，故而經濟損失較大。

本發明之預防或治療劑不僅對臨床型***炎，而且對潛在性***炎亦有效。由於對預防及治療潛在性***炎有效之療法迄今為止尚無報告，故而本發明之預防或治療劑等在乳畜業(乳業)產業方面較為重要。

本說明書中所使用之「反芻動物」包括牛、山羊、羊等家畜動物。尤佳為分泌生產乳汁之反芻動物、例如牛、山羊等。較佳之牛為乳牛(例如，好斯坦(holstein)種、娟姍(Jersey)種、更賽(Guernsey)種、愛爾夏(Ayrshire)種、凱瑞(Kerry)種、乳用短角牛(Dairy Shorthorn)種、丹麥紅牛(Red Danish)種、塞門特(Simmental)種等)、尤其是正常乳牛、存在***炎發病之可能性之乳牛、***炎發病中之乳牛、或存在***炎發病史之乳牛。本發明之預防劑尤其對正常乳牛、存在***炎發病之可能性之乳牛或存在***炎發病史之正常乳牛有效，且可對***炎發病中之乳牛用作治療劑。

[2]桿菌屬細菌

本發明之預防或治療劑將具有下述性質(1)及視情況之(2)之桿菌屬細菌作為有效成分，(1)可於牛體內增加或維持CD11c⁺CD172a⁺血中樹狀細胞閘2，(2)於將枯草芽胞桿菌C-3102株(國際寄存編號FERM BP-1096)之雙歧桿菌增殖活性設為1時，其雙歧桿菌增殖活性高於0.8。

具有上述(1)及視情況之(2)之性質之桿菌屬細菌均可用作本發明之預防或治療劑之有效成分。

關於上述性質(1)，CD11c⁺CD172a⁺血中樹狀細胞為抗原呈現細胞(antigen presenting cell)，且為於血液中移動而進行局部免疫調節之CD11c陽性及CD172a陽性之細胞。該細胞可藉由使用人淋巴細胞分離液(Lympholyte-H)之比重離心(2300rpm，30分鐘)自末梢血回收淋巴球群體，進而分離單核球、B細胞及T細胞，然後藉由使用磁珠(Magnetic bead)結合抗CD11c抗體及磁珠結合抗CD172a抗體與MACS(Magnetic Activated Cell Sorting，磁性激活細胞分選)分離管柱之磁性分離細胞系統(MACS法)，分離為CD11c陽性及CD172a陽性之細胞，進而藉由雙色流式細胞測量術分析CD11c⁺CD172a⁺血中樹狀細胞。由於發現如下見解：CD11c⁺CD172a⁺血中樹狀細胞包含圖1A之第1象限之閘1內所示之2個特徵性細胞群體(閘2及閘3)，且該等細胞群體之中尤其是閘2藉由投予本發明之枯草芽胞桿菌細菌，於發生***炎或未恢復之牛體內減少，於已恢復或未發病之牛體內增加，因此首次發現CD11c⁺CD172a⁺血中樹狀細胞與***炎有無發病或是否恢復存在相關性。

根據上述見解，考慮於***炎之發病風險較高之時期(分娩後3個月以內之時期，尤其是分娩後約1個月以內)，於暴露於導致***炎之細菌等之情形時，增加CD11c⁺CD172a⁺血中樹狀細胞閘2，藉此預防***炎。即，藉由本發明之預防、治療劑，投予對象之CD11c⁺CD172a⁺血中樹狀細胞閘2根據環境(例如，對細菌之接觸、毒殺之狀況等)而增加。相反而言，正發生***炎之牛未能提高該期間之CD11c⁺CD172a⁺血中樹狀細胞閘2。即，所謂作為本說明書中之枯草芽胞桿菌等桿菌屬細菌之性質之一之「可增加或維持CD11c⁺CD172a⁺血中樹狀細胞閘2」，意指使對象動物之血中之總樹狀細胞中之CD11c⁺CD172a⁺樹狀細胞閘2的比率較上述***炎之發病風險較高之時期之***炎發病時的比率增加，或將其維持為較高，藉此創造適於預防***炎之發病之免疫環境。

關於上述性質(2)，本發明中可使用之枯草芽胞桿菌又具有如下特徵：於將枯草芽胞桿菌C-3102株(國際寄存編號FERM BP-1096)之雙歧桿菌增殖活性設為1時，其雙歧桿菌增殖活性高於0.8，較佳為高於0.9，進而較佳為1以上。雙歧桿菌增殖活性具有與免疫能力增強關聯之一面，迄今為止尚未報告與樹狀細胞增殖活性之關聯，但若具有相對於枯草芽胞桿菌C-3102株之雙歧桿菌增殖活性為同等(80%左右)以上之能力，則可期待藉由樹狀細胞增殖活性而具有***炎之預防或治療效果。

本發明中可使用之桿菌屬細菌可進而具有以下之(3)及/或(4)之性質：(3)於將枯草芽胞桿菌C-3102株(國際寄存編號FERM BP-1096)之蛋白酶活性及澱粉酶活性均設為1時，其蛋白酶活性及澱粉酶活性高於0.7，(4)於以1×10⁵個以上/天/頭之用量對牛進行經口投予時，可預防或治療***炎。

關於上述性質(3)，本發明中可使用之桿菌屬細菌具有以下特徵：於以1×10⁶個以上/天/頭、較佳為1×10⁷個以上/天/頭、更佳為1×10⁸個以上/天/頭、進而較佳為1×10⁹個以上/天/頭、最佳為6×10⁹個以上/天/頭之用量對牛進行經口投予之情形時，可預防或改善***炎。此處，上述用量為每頭動物1天所攝取之桿菌屬細菌之活菌細胞數，動物之攝取可分成1次~複數次、例如2~4次進行。又，經口投予通常係於牛之分娩1個月前至分娩後3個月之期間進行，可藉由將末梢血中之CD11c⁺CD172a⁺血中樹狀細胞、尤其是圖1所示之閘2之增加作為指標，或根據基於獸醫之診斷意見之判定，而確認有無自***炎恢復、改善。

關於上述性質(4)，可具有如下性質：於將枯草芽胞桿菌C-3102株(國際寄存編號FERM BP-1096)之蛋白酶活性及澱粉酶活性均設為1時，其蛋白酶活性及澱粉酶活性高於0.7，較佳為高於0.8，進而較佳為高於0.9，最佳為1以上。蛋白酶活性及澱粉酶活性例如可藉由如下述實施例中所記載之方法進行測定。作為活菌劑而為人所知之桿菌屬細菌之中，枯草芽胞桿菌、例如枯草芽胞桿菌C-3102株具有較高之蛋白酶活性及澱粉酶活性(參照下述表3)。

作為具有上述性質(1)及視情況之(2)之桿菌屬細菌，可列舉：枯草芽胞桿菌細菌、地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformis)細菌、解澱粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)細菌等，具體而言，例如可例示：枯草芽胞桿菌C-3102株(國際寄存編號FERM BP-1096)、具有上述性質(1)、上述性質(1)及(2)、上述性質(1)及(3)、上述性質(1)~(3)、上述性質(1)及(4)、上述性質(1)、(3)及(4)、或上述性質(1)~(4)之該C-3102株之變異株、枯草芽胞桿菌模式菌株等。較佳之桿菌屬細菌為上述枯草芽胞桿菌C-3102株及上述該C-3102株之變異株。

枯草芽胞桿菌C-3102菌株係於1985年12月25日向日本茨城縣築波市東1丁目1番地1築波中心中央第6(郵編305-8566)[寄存時，日本茨城縣築波郡谷田部町東1丁目1番地3(郵編305)]之獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物寄存中心以寄存編號微工研菌寄第8584號進行國內寄存，於1986年6月28日，於同一機構以寄存編號FERM BP-1096(移交時，微工研條寄第1096號)移交至國際寄存處(日本專利特開昭62-232343號公報)。又，該C-3102菌株係由本申請人以「可速必寧(Calsporin)」(註冊商標)之商品名進行銷售。

枯草芽胞桿菌C-3102株之變異株例如可藉由如下方法而獲得：藉由紫外線、X射線等高能量線之照射下之培養、及亞硝基胍、N-乙基-N-亞硝基脲、亞硝基胺等誘突變性物質(mutagenic substance)之存在下之培養而人工地誘導突變，將變異株菌落單離，進而，將例如該變異株之rDNA(Ribosomal Deoxyribonucleic Acid，核糖體脫氧核糖核酸)(通常用於菌分類)之鹼基序列與C-3102株之序列進行比較，藉此進行其為突變株之檢定，以及確認具有上述性質(1)、上述性質(1)及(2)、上述性質(1)及(3)、上述性質(1)~(3)、上述性質(1)及(4)、上述性質(1)、(3)及(4)、或上述性質(1)~(4)。

本發明中可使用之桿菌屬細菌可直接使用其培養物，視需要可藉由離心分離、過濾等分離方法將菌體成分分離或濃縮後，藉由例如冷凍乾燥、真空熱乾燥、噴霧乾燥等乾燥法製成乾燥體而獲得。枯草芽胞桿菌可於本領域業者所慣用之培養條件下進行培養。

用於培養枯草芽胞桿菌之培養基至少包含碳源、氮源及無機鹽。

碳源例如可列舉：山梨醇、葡萄糖、澱粉、糊精、環糊精、直鏈澱粉、支鏈澱粉(amylopectin)、聚三葡萄糖(pullulan)、寡糖、甘油、麥芽汁等糖類。該等碳源可以1種或2種以上之混合物使用。

氮源可列舉：肉汁、麥芽萃取物、酵母萃取物、蛋白腖、聚蛋白腖、蛋白質水解物、大豆粉末、乳酪蛋白、胺基酸類、玉米浸液等有機氮化合物，及/或氨、硝酸銨、硫酸銨、氯化銨等銨鹽、硝酸鈉等硝酸鹽、脲等無機氮化合物等。氮源亦可單獨或以2種以上之混合物使用。

無機鹽例如可使用鎂、錳、鈣、鈉、鉀、銅、鐵及鋅等之磷酸鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽及乙酸鹽等。

作為培養基，可使用市售之培養基或營養培養液。

培養可於公知之培養條件下進行。培養溫度通常為20~45℃，較佳為35~42℃，又，適於培養之培養基之pH值通常為6.0~9.0，較佳為6.5~8.5，但並不限定於該等範圍。

[3]預防或治療劑

本發明之預防或治療劑含有具有上述性質(1)、上述性質(1)及(2)、上述性質(1)及(3)、上述性質(1)~(3)、上述性質(1)及(4)、上述性質(1)、(3)及(4)、或上述性質(1)~(4)之桿菌屬細菌(活菌體)、較佳為枯草芽胞桿菌細菌、更佳為枯草芽胞桿菌C-3102株或其變異株作為有效成分。

上述預防劑中之桿菌屬細菌之含量以乾燥菌體計，通常為0.001~95.0重量%，例如為0.1~40重量%，於預防劑中，該細菌例如可含有1×10⁵~6×10⁹個或其以上。

預防或治療劑為經口投予或供給用，且為固體、半固體或液體之形態，於固體之情形時，為粉末、顆粒、丸劑、小丸劑(Pellet)、錠劑、膠囊等形態，於半固體之情形時，為凝膠等形態，於液體之情形時，為懸浮液等形態。該預防或治療劑中，除作為有效成分之菌體以外，可含有用於配製成劑型之例如載體(例如賦形劑、稀釋劑等)、及視情況之添加劑。

作為載體，例如可列舉：乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纖維素、澱粉、磷酸二鈣、純化水、明膠、瓊脂、海藻酸鈉、鹿角菜膠等。

添加劑包含結合劑、崩解劑、潤滑劑、填充劑、滑劑、界面活性劑、抗氧化劑、防黴菌劑、增黏劑等，但並不限定於以上者。

作為結合劑，例如可列舉：澱粉乙醇酸鈉、黃芪膠(Tragacanth gum)、***膠(acacia)、聚乙烯吡咯啶酮、玉米澱粉、明膠、粉末纖維素、微晶纖維素、山梨醇、澱粉、聚乙烯吡咯啶酮、乙烯基吡咯啶酮與乙烯基衍生物之共聚物、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素等。

作為崩解劑，例如可列舉：玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、乙醇酸鈉澱粉、羧甲基纖維素鈉、羧甲基纖維素鈣、交聯羧甲基纖維素鈉、交聯聚維酮(crospovidone)、聚乙烯吡咯啶酮、甲基纖維素、微晶纖維素、經低級烷基取代之羥丙基纖維素、α化澱粉、海藻酸鈉等。

作為潤滑劑，例如可列舉：硬脂酸鎂、硬脂酸、聚乙二醇、滑石、二氧化矽等。

作為滑劑，例如可列舉：二氧化矽、滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鋅、硬脂基反丁烯二酸鈉、硬脂酸鎂等。

作為界面活性劑，例如可列舉：月桂基硫酸鈉、聚山梨糖醇酯80等。

作為其他成分，可列舉：胺基酸類、維生素類、礦物質、色素(蝦紅素、斑螫黃素(canthaxanthin)等)、酵素類(例如澱粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶、脂肪酶等)等。

預防或治療劑中之載體及添加劑之合計含量係自100%中減去有效成分(乾燥菌體)之含有率(%)而得之量。

本發明之預防或治療劑可用於對反芻動物、較佳為牛、更佳為乳牛預防***炎，又，視情況可用於治療。

關於***炎預防，例如可藉由如下方法而進行：對於妊娠中之乳牛等牛，於至少分娩前1個月前至分娩後3個月之期間，將具有上述性質之枯草芽胞桿菌細菌等桿菌屬細菌以每天1×10⁵~6×10⁹個或其以上之量向乳牛經口投予或供給。於投予或供給之情形時，1天可分成1~數次、例如早與晚之2次，以總量計每天投予該菌1×10⁵~6×10⁹個或其以上，或者可將上述用量之該預防劑混合於飼料或飲料等中而供給。例如若供給可速必寧(註冊商標)，則可每天將可速必寧粉末40g(1.5×10⁸CFU)例如早20g與晚20g調配於飼料中而供給。關於乳牛等牛，尤其是供給乾草等粗飼料或濃縮飼料(Concentrated feed)作為餌食之情況較多，較佳為混合於該等餌食中。關於投予對象之牛，藉由向過去具有***炎發病經歷之牛投予或供給，而可顯著地抑制預測***炎會發病之牛之***炎發病。

2.飼料添加物及飼料

本發明進而提供一種含有上述預防或治療劑之飼料添加物。

本發明之飼料添加物可藉由如下方法而製造：以含有用於預防反芻動物之***炎之有效量之方面所定義之枯草芽胞桿菌細菌等桿菌屬細菌的方式，將上述預防或治療劑與構成飼料添加物之經認可之其他任意成分混合。此處，枯草芽胞桿菌細菌等桿菌屬細菌之有效量係動物每天可攝取1×10⁵~6×10⁹個或其以上之該細菌之量。

飼料添加物通常為用於向動物飼料賦予所需之功能之物質，於本發明之情形時，該功能係預防或治療或者抑制、減輕反芻動物、尤其是牛、進而較佳為乳牛之***炎者。

飼料添加物中可進而含有***炎治療用之抗生素。例如，於「家畜共濟藥效別藥價基準表2011年度版」中，作為抗生素，可列舉：對作為***炎之原因菌而為人所知之金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鏈球菌、綠膿桿菌等菌有效之頭黴素(Cepham)系抗生素、青黴素系抗生素、巨環內酯(Macrolide)系抗生素等抗生素、例如紅黴素、土黴素鹽酸鹽、雙氯青黴素鈉(Dicloxacillin sodium)、頭孢唑啉(Cefazolin)、頭孢呋辛鈉(Cefuroxime sodium)、乙氧萘青黴素鈉(nafcillin sodium)、苄基青黴素普魯卡因(Benzylpenicillin Procaine)、硫酸二氫鏈黴素(Dihydrostreptomycin Sulfate)、硫酸康黴素(kanamycin sulfate)、頭孢匹林鈉(Cephapirin sodium)、甘草酸單銨、頭孢洛寧(Cephalonium)等抗生素之1種或複數種之混合物。

於飼料添加物中，除有效成分以外，可含有用於形成劑之例如載體(賦形劑或稀釋劑)、添加劑等。載體或添加劑係用於製造本發明之上述預防或治療劑之上述所例示者。飼料添加物可具有固體、半固體或液體之任一形態，較佳為固體形態，例如可製造成粉末、顆粒、丸劑、小丸劑、錠劑、膠囊等形狀。

本發明進而提供一種用以於反芻動物用之飼料中強化反芻動物之***炎之預防或治療效果之方法，其包括將用於預防或治療***炎之有效量之上述飼料添加物添加至反芻動物用之飼料中的步驟。

先前，為了治療牛等之***炎，而使用「家畜共濟藥效別藥價基準表」(日本動物用醫藥品協會)中所揭示之***炎治療劑，且使用抗生素作為主要治療劑，但未涉及防止復發。本發明之上述預防或治療劑、或含有其之飼料添加物係可對抗生素治療進行補充者。

由於本發明之預防、治療劑之如上所述之特殊特徵，又，本發明亦關於一種反芻動物之***炎之預防或治療效果經強化之飼料，其特徵在於：包含用於預防或治療反芻動物之***炎之有效量之上述飼料添加物。

本發明之飼料與公知之飼料不同，其特徵在於：含有用於預防反芻動物之***炎之有效量之上述枯草芽胞桿菌細菌等桿菌屬細菌。關於本案提出申請前之公知之飼料，未認識到枯草芽胞桿菌細菌等桿菌屬細菌具有反芻動物之***炎之預防(或治療)作用或者效果，故而未作為***炎之預防用(或者治療用)而進行銷售。

飼料包括以纖維質為中心之粗飼料(例如青草、乾牧草、青貯稻稈等)與包含大量澱粉、蛋白質之濃縮飼料(亦稱為調配飼料)(例如玉米、大豆、米糠、麥麩、大麥、高粱等穀類，大豆油餅、菜籽油餅、棉籽油餅等植物油餅等)，適當調配該等而向牛等反芻動物供給。除此以外，可添加維生素類(維生素A、D3、E、B1、B2、B6、B12、C、K3、肌醇、生物素、泛酸、煙酸、膽鹼、葉酸等)、胺基酸類、食鹽、其他礦物質類、等。關於飼料成分，例如亦可使用日本標準飼料成分表(獨立行政法人農業、食品產業技術綜合研究機構編)中所記載者。

飼料較佳為以動物每天可攝取1×10⁵~6×10⁹個或其以上之細菌之量包含上述枯草芽胞桿菌細菌，故而可以成為上述菌體量之方式將本發明之飼料添加物調配於飼料中。

3.用於預防或治療***炎之醫藥組合物及方法

本發明進而提供一種用於預防或治療反芻動物之***炎之醫藥組合物，其包含作為有效成分之枯草芽胞桿菌細菌等桿菌屬細菌及製藥上可容許之載體，該作為有效成分之枯草芽胞桿菌細菌等桿菌屬細菌具有上述性質(1)、上述性質(1)及(2)、上述性質(1)及(3)、上述性質 (1)~(3)、上述性質(1)及(4)、上述性質(1)、(3)及(4)、或上述性質(1)~(4)。

作為有效成分之枯草芽胞桿菌細菌等桿菌屬細菌與作為上述預防或治療劑之有效成分之細菌相同，具有上述性質(1)及視情況之性質(2)，即，作為性質(1)，可增加乳牛等牛之血中樹狀細胞中之CD11c⁺CD172a⁺細胞閘2；以及作為視情況之性質(2)，於將枯草芽胞桿菌C-3102株(國際寄存編號FERM BP-1096)之雙歧桿菌增殖活性設為1時，其雙歧桿菌增殖活性高於0.8，較佳為高於0.9，更佳為1以上，若為具有該等性質之枯草芽胞桿菌細菌等桿菌屬細菌，則可用作本發明之醫藥組合物之有效成分。

枯草芽胞桿菌細菌等桿菌屬細菌除上述性質(1)及視情況之上述性質(2)以外，亦可進而具有上述性質(3)及/或上述性質(4)，作為上述性質(3)，於將枯草芽胞桿菌C-3102株(國際寄存編號FERM BP-1096)之蛋白酶活性及澱粉酶活性均設為1時，其蛋白酶活性及澱粉酶活性高於0.7、較佳為高於0.8、更佳為高於0.9、最佳為1以上；作為上述性質(4)，於以1×10⁵~6×10⁹個或其以上/天/頭之用量對牛進行經口投予時，可預防或治療***炎。

於本發明中，牛例如為正常乳牛、存在***炎發病之可能性之乳牛、存在***炎發病史之乳牛、或***炎發病中之乳牛。若為上述乳牛，則可藉由本發明之組合物而進行預防或治療。進而，若為實際中正發生***炎之牛，則為了治療、或者抑制、減輕或改善***炎，可使用本發明之組合物。

作為上述桿菌屬細菌之例，可列舉：枯草芽胞桿菌C-3102株(國際寄存編號FERM BP-1096)、具有上述性質之該C-3102株之變異體、枯草芽胞桿菌模式菌株等，只要為具有上述性質(1)、上述性質(1)及(2)、上述性質(1)及(3)、上述性質(1)~(3)、上述性質(1)及(4)、上述性質(1)、(3)及(4)、或上述性質(1)~(4)之桿菌屬株，則均為本發明中可使用之細菌。

關於本發明之醫藥組合物中之枯草芽胞桿菌細菌等桿菌屬細菌之含量，以該細菌計，例如可含有1×10⁵~6×10⁹個或其以上。較佳為以每天1×10⁵~6×10⁹個或其以上之用量向動物投予或使動物攝取，故而可將該組合物分成1次至複數次(例如2次~4次)進行經口投予或供給。

於醫藥組合物中，視情況可含有***炎治療劑(抗生素等)。作為***炎治療劑，可使用「家畜共濟藥效別藥價基準表」(日本動物用醫藥品協會)中所揭示之***炎治療劑，尤其可列舉：對作為***炎之原因菌而為人所知之金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鏈球菌、綠膿桿菌等菌有效之頭黴素系抗生素、青黴素系抗生素、巨環內酯系抗生素等抗生素、例如上述所例示之抗生素。

本發明之醫藥組合物為固體、半固體或液體之形態，於固體之情形時，為粉末、顆粒、丸劑、小丸劑、錠劑、膠囊等形態，於半固體之情形時，為凝膠等形態，於液體之情形時，為懸浮液等形態。於該預防劑中，除作為有效成分之菌體以外，可含有用於配製成劑型之例如製藥上可容許之載體(例如賦形劑、稀釋劑等)、及視情況之添加劑。

添加劑可含有結合劑、崩解劑、潤滑劑、填充劑、滑劑、界面活性劑、抗氧化劑、防黴菌劑、增黏劑等，但並不限定於以上者。添加劑可自如下者中適當選擇而含有於組合物中。

作為結合劑，例如可列舉：澱粉乙醇酸鈉、黃芪膠、*** 膠、聚乙烯吡咯啶酮、玉米澱粉、明膠、粉末纖維素、微晶纖維素、山梨醇、澱粉、聚乙烯吡咯啶酮、乙烯基吡咯啶酮與乙烯基衍生物之共聚物、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素等。

作為崩解劑，例如可列舉：玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、乙醇酸鈉澱粉、羧甲基纖維素鈉、羧甲基纖維素鈣、交聯羧甲基纖維素鈉、交聯聚維酮、聚乙烯吡咯啶酮、甲基纖維素、微晶纖維素、經低級烷基取代之羥丙基纖維素、α化澱粉、海藻酸鈉等。

作為其他成分，可列舉：胺基酸類、維生素類、礦物質、色素(蝦紅素、斑螫黃素等)、酵素類(例如澱粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶、脂肪酶等)等。

本發明進而提供一種對反芻動物預防或治療***炎之方法，其包括如下步驟：將上述預防或治療劑、飼料添加物、飼料或醫藥組合物向需要其之反芻動物經口投予或供給。

關於***炎之預防或治療，較佳為向妊娠中之乳牛等反芻動物於至少分娩前1個月前至分娩後3個月之期間，以每天1×10⁵~1×10⁶個或者其以上/天/頭、較佳為1×10⁷個以上/天/頭、更佳為1×10⁸個以上/天/頭、進而較佳為1×10⁹個以上/天/頭、最佳為6×10⁹個以上之用量投予枯草芽胞桿菌細菌等桿菌屬細菌。關於投予形態，只要如上所述1天分成1~數次，以總量計投予每天之上述用量之該活菌即可。於醫藥組合物之投予時，可將該組合物混合於飼料、飲料等飲食中而供給。關於乳牛等牛，尤其是供給乾草或濃縮飼料作為餌食之情況較多，較佳為混合於該等餌食中。關於投予對象之牛、尤其是乳牛，為正常乳牛、存在***炎發病之可能性之乳牛、或存在***炎發病史之乳牛，對於上述乳牛可顯著地抑制***炎發病，又，可對***炎發病中之乳牛治療或者減輕***炎。

又，對於確認發生***炎之牛，若需要可藉由與一直以來可用於治療之抗生素(上述)併用而提高痊癒率，又，可縮短痊癒之時間。可藉由靜脈內投予、肌內投予、經口投予等方法，向發生了***炎之牛投予對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鏈球菌、綠膿桿菌等原因菌有效之抗生素，另一方面，可於抗生素之投予之前、中或後，向動物投予本發明之醫藥組合物。

上述預防或治療劑、飼料添加物、或醫藥組合物較佳為混合於動物之飼料或飲料等中而向動物投予或供給。

又，關於用量，較佳為以成為每天1×10⁵~1×10⁶個或者其以上/天/頭、較佳為1×10⁷個以上/天/頭、更佳為1×10⁸個以上/天/頭、進而較佳為1×10⁹個以上/天/頭、最佳為6×10⁹個以上之活菌用量之方式向動物投予或供給。

[實施例]

以下列舉實施例，一面參照實施例，一面更詳細地說明本發明，但本發明之技術範圍並不受該等實施例限制。

[實施例1] <乳牛中之***炎之處置>

對於下述表1所示之存在***炎發病史之試驗區的上一乳期之乳牛(牛編號23及15)，將可速必寧(註冊商標；Calpis股份有限公司，日本)(有效成分：枯草芽胞桿菌C-3102株(FERM BP-1096)1×10¹⁰個/g)以每天6×10⁹個以上之活菌用量混合於餌食中，而於分娩前1個月前至分娩後3個月之期間進行供給。關於餌食，泌乳期係供給酪農家族MAX(Dairy Family Max)(北日本組合飼料，日本)、Astro Liner(維生素劑：雪印，日本)、壓片玉米、粗飼料(梯牧草、燕麥、馬齒玉米青貯料(Dent corn silage)、苜蓿乾草塊(Alfalfa hay cube)，乾乳期係供給乾乳期用飼料(Transpro：雪印，日本)及粗飼料(梯牧草、燕麥)。另一方面，關於相同之表1所示之存在***炎發病史之對照區(牛編號94及902)，於飼料中未添加可速必寧。

已知，於上一乳期具有***炎發病經歷之乳牛於本期中***炎發病風險亦較高。所謂上一乳期，係指上次之分娩後至本期之分娩前1個月之期間，本實驗中所使用者均係於上一乳期中具有1~3次***炎發病經歷之乳牛，且為接受利用抗生素之投藥6~23次之牛。

將結果示於表1。試驗區(牛編號15及23)均：(1)無***炎之發病、(2)未進行抗生素之投藥、(3)於樹狀細胞分析中顯示如下結果：於試驗期間中，CD11c⁺CD172a⁺血中樹狀細胞閘2相對於總樹狀細胞之比率之增減較少，且與對照區相比維持為較高。與此相對，對照區(牛編號94及902)均發生***炎，且接受利用抗生素之治療，於樹狀細胞分析中，亦存在CD11c⁺CD172a⁺血中樹狀細胞閘2之比率暫時或長期低於試驗區之傾向。此處，將CD11c⁺CD172a⁺血中樹狀細胞閘2之測定結果示於圖1(C、D)及表2。於試驗區中，與對照區相比，CD11c⁺CD172a⁺血中樹狀細胞閘2相對於總樹狀細胞之比率於分娩後8~10天內明確增大。其表示，於分娩後之罹患***炎之風險較高之時期(尤其是分娩後8~10天)暴露於導致***炎之細菌等之情形時，試驗區具有可對抗細菌之免疫能力。即，關於CD11c⁺CD172a⁺血中樹狀細胞閘2相對於總樹狀細胞之增減較少、且視需要增高之情況，可認為係藉由枯草芽胞桿菌C-3102株之投予而使防禦***炎之發病之血液中之免疫能力增加或得以維持。於試驗期間中，試驗區未見***炎之發病，與此相對，對照區發生1次或2次***炎，並實施了抗生素治療。分娩後7天前後(最容易引起***炎之時期)之試驗區中的CD11c⁺CD172a⁺血中樹狀細胞閘2之增多成為表示本發明之預防、治療劑(有效成分：枯草芽胞桿菌C-3102株)對預防***炎而有效地起作用之指標。

表2中，個體No.94於血液採取期間1與2之間及2與3之間發生各為1次計2次***炎。又，個體No.902於期間2與3之間發生1次***炎。於本結果中，個體No.902於分娩後8~10天因壓力等影響，可見CD11c⁺CD172a⁺血中樹狀細胞閘2之比率減少之減少，而被認為發生了***炎。又，個體No.94自分娩前起CD11c⁺CD172a⁺血中樹狀細胞閘2之比率較低，其後，(即便暴露於細菌)CD11c⁺CD172a⁺血中樹狀細胞閘2之比率亦未充分地上升，而被認為發生了***炎。另一方面，進行了枯草芽胞桿菌C-3102株投予之個體(個體No.23及15)雖與個體No.94同樣地，分娩前之CD11c⁺CD172a⁺血中樹狀細胞閘2之比率較低，但於分娩後8~10天內可見CD11c⁺CD172a⁺血中樹狀細胞閘2之比率之上升，***炎之發病亦得以抑制。

[實施例2] <對***炎之預防或治療有效之枯草芽胞桿菌之特徵描述>

目前，已知有大量牛用之活菌劑，但具體地顯示***炎預防或治療效果者尚不為人所知。此次，將實際銷售之活菌劑中之各菌株與作為本發明之對象菌之枯草芽胞桿菌C-3102株菌的雙歧桿菌增殖活性、蛋白酶活性及澱粉酶活性進行比較。

(1)關於菌株

關於經製備之桿菌菌株，包含菌落之形狀之差異，對下述表3所示之枯草芽胞桿菌(B.subtilis)8菌株、地衣芽胞桿菌(B.licheniformis)1菌株、桿菌屬(Bacillus sp.)2菌株進行製備。

(2)各菌體之芽胞懸浮液之製備

將各菌株塗佈於TS(Tryptone Soya，胰蛋白腖大豆)瓊脂培養基上並於37℃下培養一晚。以刮勺刮取形成於培養基上之全部菌落，並使之懸浮於加熱至80℃之殺菌水中。將其以3,000rpm於室溫下進行10分鐘離心分離，於去除上清液後使之再懸浮於加熱至80℃之殺菌水中。進行2次該操作後，將懸浮於5ml之殺菌水中者設為各菌株之芽胞懸浮液。

(3)分泌蛋白酶活性之測定

使用1%酪蛋白鈉TS瓊脂培養基(1%酪蛋白鈉(和光純藥工業，日本)、3%BBL胰化酪蛋白大豆培養基(Trypticase SoyBroth)、2%瓊脂(agar))，將各菌株之芽胞懸浮液(約1×10⁴CFU/ml)1μl滴於該培養基中。其後，於37℃下進行48小時培養，測定藉由菌落周邊之酪蛋白之分解產生之暈圈的大小。暈圈之大小係測定自菌落之邊緣至暈圈之邊緣的距離。實驗進行3次，對各菌株算出3次測定值之平均值與各次之相對於C-3102株I型之比活性值的平均值。

(4)澱粉酶活性之測定

使用1%澱粉TS瓊脂培養基(1%澱粉(和光純藥工業，日本)、3%BBL胰化酪蛋白大豆培養基，2%瓊脂)，將各菌株之芽胞懸浮液(約1×10⁴CFU/ml)1μl滴於該培養基中。於37℃下進行48小時培養後，於培養基上滴加盧戈爾溶液(Lugol's solution stabilized(Merck))2ml，將未分解之澱粉染色，藉此測定於菌落周邊產生之暈圈之大小。暈圈之大小係測定菌落之邊緣至暈圈之邊緣的距離。實驗進行3次，對各菌株算出3次測定值之平均值與各次之相對於C-3102株I型之比活性值的平均值。

(5)雙歧桿菌增殖活性

以參考文獻(Kouya T.et al.,J Biosci.Bioeng.2007；103：464-471)中所記載之方法為參考，以如下方式進行。於TS軟瓊脂培養基(瓊脂0.75%)上鋪上纖維素混合酯過濾器(直徑90mm，孔徑0.2μm(ADVANTEC))，於過濾器上接種芽胞懸浮液(約1×10⁹CFU/ml)50μl，於37℃下進行24小時培養。培養後，剝離過濾器而回收培養基，轉移至50ml之離心管中，以8,000rpm進行15分鐘離心分離。利用 0.22μm之纖維素混合酯過濾器(ADVANTEC)過濾所獲得之上清液，使濾液60μl滲入至紙盤(paper disk)(直徑10mm，較厚(ADVANTEC))中，該紙盤係置於灌注有青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)CP2238之TPY瓊脂培養基(3%葡萄糖(glucose)、0.4%胰化酪蛋白腖(Trypticase peptone)、0.15%朊間質蛋白腖(Proteose peptone)No.3、0.25%酵母萃取物(Yeast extract)、0.2%K₂HPO₄、0.3%KH₂PO₄、0.025%MgCl₂．6H₂O、0.025%L-半胱胺酸(L-cystein)、0.0005%FeSO₄．7H₂O、1.5%瓊脂)上。將其於放入有3個AnaeroPack(安寧包)(三菱瓦斯化學)之厭氧罐(Anaerobic jar)內以37℃進行18小時厭氧培養，測定於紙盤周邊產生之雙歧桿菌增殖圓之直徑。實驗進行2次，對各菌株算出2次測定值之平均值與各次之相對於C-3102株I型之比活性值的平均值。

(6)結果

將進行了試驗之菌之測定結果示於表3。

由表3確認到，枯草芽胞桿菌C-3102株與其他菌相比，於所有性質方面具有平均較高之活性。該等性質顯示提高牛之消化道內之生存性，進而推測，藉由提高消化道內之雙歧桿菌增殖而對提高血中之樹狀細胞做出貢獻。其結果為，即便於乳牛於乳頭等處負傷之情形時，亦可抑制細菌感染，又，即便感染了細菌，亦可藉由抑制向***乳槽部、乳管、乳腺感染而預防***炎。進而推測，藉由提高特定之樹狀細胞，亦有效地對發生了***炎之乳牛之治療發揮作用。

實際中，枯草芽胞桿菌C-3102株如實施例1所示，可對實際之乳牛獲得***炎預防或治療效果，只要為以本菌株為基準，與其類似或具有同等高之上述活性之枯草芽胞桿菌，則可期待具有使樹狀細胞閘2增加或維持之能力，而可期待與C-3102株同等之效果。

[實施例3] <***炎發病乳牛之治療>

對於存在***炎發病史之泌乳期之乳牛，於泌乳期間中發生***炎時，將可速必寧(註冊商標；Calpis股份有限公司)(有效成分：枯草芽胞桿菌C-3102株(FERM BP-1096)1×10¹⁰個/g)以每天6×10⁹個以上之活菌用量混合於餌食中，而於發病後供給一定時間(數天~1週)。關於餌食，泌乳期係供給酪農家族MAX(北日本組合飼料，日本)、Astro Liner(維生素劑：雪印)、壓片玉米、粗飼料(梯牧草、燕麥、馬齒玉米青貯料、苜蓿乾草塊)，乾乳期係供給乾乳期用飼料(Transpro：雪印，日本)及粗飼料(梯牧草、燕麥)。

[產業上之可利用性]

藉由本發明，可預防或治療反芻動物、尤其是乳牛等牛之***炎之發病，故而認為可大幅改善乳業產業中由乳牛之***炎發病所引起之經濟損失，產業上之有用性極高。

[寄存菌]

「枯草芽胞桿菌C-3102菌株」係於1985年12月25日向日本茨城縣築波市東1丁目1番地1築波中心中央第6(郵編305-8566)[寄存時，日本茨城縣築波郡谷田部町東1丁目1番地3(郵編305)]之獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物寄存中心以寄存編號微工研菌寄第8584號進行國內寄存，於1986年6月28日，於同一機構以寄存編號FERM BP-1096(移交時，微工研條寄第1096號)移交至國際寄存處。該寄存菌目前係於獨立行政法人製品評價技術基盤機構之NITE專利生物寄存中心(NITE-IPOD)(日本千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8 120號室(郵編292-0818)進行保管。

又，「枯草芽胞桿菌C-3102菌株」係於2012年11月14日於臺灣之財團法人食品工業發展研究所專利生物材料寄存處以「枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis C-3102」之名稱且以寄存編號「BCRC910568」進行寄存。

【生物材料寄存】 國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】

財團法人食品工業發展研究所；101年11月14日；BCRC 910568

國外寄存資訊【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】

1‧‧‧血中樹狀細胞閘

2‧‧‧血中樹狀細胞閘

3‧‧‧血中樹狀細胞閘

Claims

一種枯草芽胞桿菌細菌的用途，其係用於製造預防或治療牛之***炎之製劑，該枯草芽胞桿菌細菌係枯草芽胞桿菌C-3102株(國際寄存編號FERM BP-1096或臺灣寄存編號BCRC910568)，且以1×10⁹個以上/天/頭之用量對牛進行經口投予。
如請求項1之用途，其中上述經口投予係於牛之分娩1個月前至分娩後3個月之期間進行。
一種如請求項1或2之枯草芽胞桿菌細菌之用途，其係用以製造用於預防或治療牛之***炎之飼料添加物。
如請求項3之用途，其中上述飼料添加物進而包含***炎治療用抗生素。
一種包含用於預防或治療牛之***炎之有效量的如請求項1或2之枯草芽胞桿菌細菌之飼料添加物的用途，其係用以製造用於強化牛之***炎之預防或治療效果之飼料。
一種枯草芽胞桿菌細菌及製藥上可容許之載體的用途，其係用以製造用於預防或治療牛之***炎之醫藥組合物，該醫藥組合物中作為有效成分之枯草芽胞桿菌細菌係枯草芽胞桿菌C-3102株(國際寄存編號FERM BP-1096或臺灣寄存編號BCRC910568)，且以1×10⁹個以上/天/頭之用量對牛進行經口投予。
如請求項6之用途，其中上述牛為正常乳牛、存在***炎發病之可能性之乳牛、***炎發病中之乳牛、或存在***炎發病史之乳牛。
如請求項6或7之用途，其中上述性質中之上述經口投予係於牛之分娩1個月前至分娩後3個月之期間進行。
如請求項6之用途，其進而含有***炎治療用抗生素。