ES2929354T3 - Lactobacillus plantarum CJLP17 con eficacia antiviral e inmunomoduladora y composición que comprende el mismo - Google Patents

Lactobacillus plantarum CJLP17 con eficacia antiviral e inmunomoduladora y composición que comprende el mismo Download PDF

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Abstract

La presente solicitud se refiere a una nueva cepa de Lactobacillus plantarum CJLP17 que tiene actividades de resistencia a los ácidos, resistencia a la bilis y refuerzo de la inmunidad, y una composición que comprende las mismas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Lactobacillus plantarum CJLP17 con eficacia antiviral e inmunomoduladora y composición que comprende el mismo Campo Técnico
La presente descripción se refiere a una cepa de Lactobacillus plantarum CJLP17 que tiene resistencia a los ácidos, resistencia a la bilis y una actividad inmunopotenciadora. Específicamente, la presente descripción se refiere a una composición, un aditivo de piensos y un alimento funcional, que incluyen la cepa de Lactobacillus plantarum CJLP17 y un cultivo de la misma.
Antecedentes de la Técnica
En la industria ganadera actual, el ganado muere debido a enfermedades virales altamente contagiosas, y esto a menudo genera daños económicos a las granjas. En particular, en la industria porcina, las enfermedades infecciosas provocadas por virus y gérmenes, tales como las cuatro principales enfermedades crónicas debilitantes (es decir, el complejo de enfermedades respiratorias porcinas, el síndrome multisistémico después del destete, el síndrome reproductivo y respiratorio porcino y la diarrea epidémica porcina), han provocado enormes pérdidas económicas. Entre ellos, la diarrea epidémica porcina es una enfermedad digestiva porcina provocada por la infección del virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV), miembro de la familia de los coronavirus. El virus prolifera en las vellosidades del intestino delgado y del intestino grueso y provoca enteritis aguda, vómitos y diarrea acuosa en cerdos de todas las edades, especialmente en lechones. En particular, el daño es grave principalmente en invierno, de noviembre a abril, y se sabe que la tasa de mortalidad de los lechones antes del destete dentro de la primera semana de vida es de aproximadamente el 50 %, y en casos graves, la tasa de mortalidad puede alcanzar casi el 100 % por deshidratación extrema.
El virus PED se reconoció por primera vez en Europa en 1971 (Oldham J., Letter to the Editor. Pig Farming, 1972, 10:72-73), y el PEDV CV777 de tipo G1a se detectó y aisló en Bélgica en 1976 (Pensaert MB y otros, A new coronavirus-like particle associated with diarrhea in swine. Arch Virol., 1978, 58:243-247). El virus se propagó por toda Europa en la década de 1980 y se produjeron brotes en países de Asia oriental, que incluyeron China, Corea, Japón, Taiwán, etc., en la década de 1990. Además, el PEDV de tipo G2b, que es más virulento que el tipo G1a, surgió por primera vez en China en 2010. Este nuevo tipo de PEDV se ha propagado a América del Norte (Estados Unidos y Canadá), así como también al Sudeste Asiático y Europa, provocando graves daños (Song D. y otros, Porcine epidemic diarrhoea virus: a comprehensive review of molecular epidemiology, diagnosis, and vaccines, Virus Genes, 2012, 44:167-175). En 2013, el daño se estimó en unos 2,2 billones de wones debido a la pérdida de productividad en la industria porcina de los Estados Unidos. En Corea, se informa que los brotes de PEDV ocurren anualmente en el 20 % al 40 % de las granjas porcinas, lo que provoca la muerte del 6 % del total de cerdos. También se informa que la tasa de infección de los vehículos que entran y salen de los mataderos alcanza aproximadamente el 60 % (Instituto Económico Rural de Corea, Asociación Veterinaria Porcina de Corea).
Hasta ahora, la única forma de prevenir fundamentalmente el virus PED de tipo G2b ha sido la esterilización completa. Muchas granjas usan un método de infección artificial o una inoculación de la vacuna PEDV de tipo G1a existente para prevenir el daño provocado por enfermedades virales, pero existe una limitación en la prevención de la infección por PEDV de tipo G2b. Para superar tales problemas, se está desarrollando activamente el desarrollo de agentes para la prevención y el tratamiento del virus PED (vacunas, etc.) y el tratamiento (IgY, aceite esencial, ácido orgánico, probióticos, etc.). En particular, recientemente se ha estudiado un método para potenciar la inmunidad mediante el uso de un material funcional que estimula el sistema inmunológico in vivo mientras tiene un efecto antiviral.
La inmunidad generalmente se divide en inmunidad innata e inmunidad adaptativa. La inmunidad innata es un sistema que defiende instantáneamente la infección por patógenos desde la primera línea y actúa directamente sobre los invasores (antígenos) o induce inmunidad adaptativa. La inmunidad adaptativa es un sistema más complejo y preciso que reconoce y elimina a los invasores, o actúa como una memoria para los invasores correspondientes, lo que proporciona de este modo funciones inmunitarias más permanentes en comparación con la inmunidad innata. Las células dendríticas (DC), los macrófagos y los linfocitos citolíticos naturales, que son células presentadoras de antígenos relacionadas con la inmunidad innata, desempeñan directamente funciones inmunitarias innatas y poseen receptores que ayudan en la activación de varios tipos de linfocitos T, que secretan de este modo citocinas. La inmunidad adaptativa es un sistema de defensa secundario frente a los antígenos que han entrado en el organismo, y es una respuesta inmunitaria específica llevada a cabo por los linfocitos B y los linfocitos T. Las respuestas inmunitarias controladas por linfocitos T activados por antígeno incluyen una respuesta de linfocitos T citotóxicos, una respuesta de linfocitos T auxiliares, etc. Los linfocitos T CD4 vírgenes, que actúan como precursores de estos linfocitos T, secretan interleucina-12 (IL-12) e inducen una respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL) que erradica los patógenos intracelulares, o secretan interleucina-4 (IL-4) y, por lo tanto, inducen una respuesta que erradica específicamente los patógenos extracelulares (secreción de anticuerpos de los linfocitos B). Además, las células inmunitarias enumeradas anteriormente responden de manera adecuada a los invasores que han entrado en el cuerpo a través de un proceso elaborado y complejo, mediante la secreción de TGF-beta (factor de crecimiento transformante beta) para suprimir las respuestas inmunitarias excesivas, tal como una reacción inflamatoria, estimular la producción de anticuerpos mediante la transformación de linfocitos B en células plasmáticas en respuesta a la secreción de TGF-beta e interleucina-6 (IL-6), o inducir una respuesta inmunitaria (Th17) para erradicar falsa autoinmunidad y patógenos extracelulares.
Sirichokchatchawan W. y otros, (2017; en "Probiotics and antimicrobial proteins" 10(2)383-390) describe cepas bacterianas aisladas de las heces de cerdos infectados con el virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV). Dos de las tres cepas de Lactobacillus plantarum probadas en vivo pudieron reducir las infecciones por PEDV in vitro. Descripción
Problema Técnico
En estas circunstancias, los presentes inventores han completado la presente descripción mediante el aislamiento y la identificación de un nuevo microorganismo capaz de activar el sistema inmunológico mientras exhibe una actividad inhibidora contra el virus mencionado anteriormente y la confirmación de su actividad.
Solución Técnica
Es un objetivo de la presente descripción proporcionar una cepa de Lactobacillus plantarum CJLP17 registrada con el núm. de registro KCCM12249P, que tiene resistencia a los ácidos, resistencia a la bilis y una actividad inmunopotenciadora.
Es otro objetivo de la presente descripción proporcionar una composición que incluya la cepa de Lactobacillus plantarum CJLP17 o un cultivo de la misma.
Es otro objetivo más de la presente descripción proporcionar un aditivo de piensos que incluya la cepa de Lactobacillus plantarum CJLP17 o un cultivo de la misma.
Es aún otro objetivo de la presente descripción proporcionar un alimento funcional que incluya la cepa de Lactobacillus plantarum CJLP17 o un cultivo de la misma.
Efectos Ventajosos
La cepa de Lactobacillus plantarum CJLP17 de la presente descripción tiene excelente resistencia a los ácidos y resistencia a la bilis y, por lo tanto, puede proporcionarse como un probiótico. La cepa CJLP17 activa las células inmunitarias in vivo y, por lo tanto, permite la regulación de las funciones inmunitarias y, en particular, exhibe una excelente actividad inhibidora contra el virus de la diarrea epidémica porcina. Además, puede encontrarse que cuando al ganado se le administra por vía oral la cepa de Lactobacillus plantarum CJLP17 de la presente descripción, no solo reduce significativamente la tasa de incidencia de diarreas a través del efecto inmunomodulador, sino que también muestra un efecto de mejora de la ganancia diaria promedio (ADG). En consecuencia, la presente descripción puede proporcionar una nueva cepa de Lactobacillus plantarum CJLP17 que tiene una actividad antiviral contra PEDv , una actividad inmunopotenciadora y un efecto de mejora de la ganancia diaria promedio y reducir la tasa de incidencia de diarreas en el ganado y, por lo tanto, la cepa puede ser eficazmente usada para una composición farmacéutica, una composición de alimentos o una composición de piensos.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra una imagen de microscopio electrónico de CJLP17.
La Figura 2 muestra una imagen de una placa de agar sangre que confirma la actividad hemolítica de la cepa. La Figura 3 es un gráfico que confirma la citotoxicidad de CJLP17.
La Figura 4 es un gráfico que muestra los resultados de medición de la secreción de IL-12 después de cultivar esplenocitos (indicados como Spin en el gráfico) y células mononucleares de sangre periférica (indicadas como PBMC en el gráfico) de cerdos.
La Figura 5 es un gráfico que muestra los resultados de medición de la secreción de IL-10 después de cultivar esplenocitos (indicados como Spin en el gráfico) y células mononucleares de sangre periférica (indicadas como PBMC en el gráfico) de cerdos.
La Figura 6 es un gráfico que muestra un aumento (pg/ml) en comparación con un control negativo mediante la medición de la secreción de TGF-beta después de cultivar ganglios linfáticos mesentéricos (indicados como mLN en el gráfico) y células de placas de Peyer (indicadas como PP en el gráfico).
La Figura 7 muestra imágenes de microscopio que ilustran el efecto inhibidor contra la infección por el virus PED por el Lactobacillus plantarum CJLP17.
La Figura 8 es un gráfico que muestra el efecto de la administración oral de CJLP17 sobre el valor medio de ADG en lechones destetados.
La Figura 9 es un gráfico que muestra el efecto de la administración oral de CJLP17 sobre la tasa de incidencia de diarreas en lechones destetados.
Mejor modo de llevar a cabo la invención
A continuación, la presente descripción se describirá con más detalle.
En un aspecto de la presente descripción para superar los objetivos anteriores, se proporciona una cepa de Lactobacillus plantarum CJLP17 registrada con el núm. de registro KCCM12249P, que tiene resistencia a los ácidos, resistencia a la bilis y una actividad inmunopotenciadora.
Como se usa en la presente descripción, el término "Lactobacillus" se refiere a un microorganismo que pertenece al género de los bacilos Gram positivos aerobios o anaerobios facultativos ampliamente distribuidos en la naturaleza. Los microorganismos que pertenecen al género Lactobacillus incluyen Lactobacillus plantarum, etc. Los presentes inventores proporcionan una nueva cepa que pertenece a Lactobacillus plantarum, que se registró con el núm. de registro KCCM12249P. Esto corresponde a una cepa probiótica, es inofensiva para el cuerpo humano y puede usarse sin efectos secundarios.
Como se usa en la presente descripción, el término "probióticos" se refiere a bacterias vivas que ingresan al cuerpo y brindan un beneficio saludable. La mayoría de los probióticos conocidos hasta ahora se han consumido a través de productos lácteos fermentados elaborados a partir de bacterias del ácido láctico tales como Lactobacillus. En los últimos años, sin embargo, los probióticos están disponibles en el mercado en forma de leche fermentada, gránulos, polvo, etc., que contienen algunas cepas tales como Bifidobacterium y Enterococcus, además de Lactobacillus. Como se usa en la presente descripción, el término "resistencia a los ácidos" se refiere a la propiedad de resistir una alta acidez. Si los probióticos son resistentes a los ácidos, puede evitarse que se degraden o se dañen incluso cuando se exponen a fuertes condiciones ácidas en el estómago, mediante el consumo por administración oral. Como se usa en la presente descripción, el término "resistencia a la bilis" se refiere a la resistencia a las enzimas digestivas en la bilis. La bilis se produce en el hígado y se almacena en la vesícula biliar, y es un líquido marrón verdoso alcalino débil que ayuda a la digestión de la grasa en el duodeno del intestino delgado y contiene varias enzimas que ayudan a la digestión y la absorción al emulsionar la grasa. La bilis es una de las principales causas de reducción del efecto de la administración de probióticos ya que actúa sobre los probióticos ingeridos a través de la administración oral.
Específicamente, la cepa de Lactobacillus plantarum CJLP17 de la presente descripción se obtuvo por aislamiento de heces y calostro de cerdas y lechones en granjas domésticas donde se había producido el virus de la diarrea epidémica porcina. Las características morfológicas de la cepa de la presente descripción son que la cepa es un bacilo Gram positivo y está representada por la secuencia de nucleótidos de ADNr 16s de la SEQ ID NO: 1. Se analizó la secuencia de nucleótidos y se encontró que era aproximadamente un 99 % homóloga con Lactobacillus plantarum. En consecuencia, los presentes inventores registraron la nueva cepa aislada de Lactobacillus plantarum CJLP17 en el Centro de Cultivo de Microorganismos de Corea el 13 de abril de 2018, con el núm. de registro KCCM12249P.
Para mantener estable la cepa de Lactobacillus plantarum CJLP17 de la presente descripción durante un largo período de tiempo, la cepa puede almacenarse mediante la disolución de las células en una solución de almacenamiento preparada al mezclar una determinada cantidad de glicerol en agua a -70 °C, o puede liofilizarse al suspender las células en leche descremada al 10 % esterilizada, pero no se limita a ello.
El Lactobacillus plantarum CJLP17 puede tener una actividad antibacteriana frente a microorganismos patógenos. Como se usa en la presente descripción, el término "antibacteriano" se refiere a la actividad de prevenir o tratar la infección de bacterias al inhibir el crecimiento o la proliferación de bacterias, que incluyen los microorganismos patógenos.
Como se usa en la presente descripción, el "microorganismo patógeno" se refiere a un microorganismo que provoca una enfermedad al ser un parásito del cuerpo humano. El término "patogenicidad" se refiere a la capacidad de un patógeno para infectar a un huésped y provocar una enfermedad, y puede referirse colectivamente a la permeabilidad, la proliferación y la productividad de toxinas de bacterias o levaduras. Los ejemplos del microorganismo patógeno pueden incluir al menos un microorganismo patógeno que se selecciona del grupo que consiste en E. coli, E. coli enterotoxigénica, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium y Vibrio parahaemolyticus, pero no se limita a ello.
La cepa de Lactobacillus plantarum CJLP17 de la presente descripción tiene una actividad antibacteriana contra microorganismos patógenos, pero no todos los microorganismos comunes pertenecientes al género Lactobacillus tienen una actividad antibacteriana contra microorganismos patógenos.
La cepa de Lactobacillus plantarum CJLP17 de la presente descripción puede no exhibir una actividad hemolítica contra los glóbulos rojos. La hemólisis se refiere a la destrucción de los glóbulos rojos y la liberación de hemoglobina al área circundante, y es una acción por la cual los glóbulos rojos se hemolizan por enzimas producidas por bacterias dañinas in vivo. Por lo tanto, el CJLP17 se reconoce como un microorganismo estable que no provoca hemólisis en los vasos sanguíneos incluso si se administra in vivo.
Además, la cepa de Lactobacillus plantarum CJLP17 de la presente descripción puede tener una resistencia débil o no tener resistencia a los antibióticos. Los antibióticos pueden ser específicamente, pero no se limitan a, ampicilina, clindamicina, gentamicina, kanamicina, eritromicina, ampicilina/sulbactam, cloranfenicol o estreptomicina. En consecuencia, incluso cuando el CJLP17 se usa en productos farmacéuticos, alimentos funcionales saludables, aditivos de piensos, etc., no tiene resistencia a los antibióticos y, por lo tanto, la probabilidad de provocar efectos farmacológicos relacionados o problemas ambientales es baja.
La cepa de Lactobacillus plantarum CJLP17 puede potenciar la activación de las células inmunitarias para aumentar la secreción de citocinas o puede administrarse in vivo para promover la función inmunitaria.
Como se usa en la presente descripción, el término "células inmunitarias" se refiere a todas las células que desempeñan un papel en la función inmunitaria in vivo y pueden dividirse en gran medida en linfocitos T y linfocitos B. Las células inmunitarias pueden incluir, pero no se limitan a, linfocitos Th1 o Th2. La cepa de Lactobacillus plantarum CJLP17 de la presente descripción puede tener una actividad de estimulación de células inmunitarias, lo que aumenta de este modo la secreción de citocinas tales como IL-12, IL-10 y/o TGF-beta.
En las enfermedades virales, que suelen presentar una alta tasa de mortalidad, la necrosis de las propias células o tejidos a causa del virus puede dar lugar a una infección secundaria y septicemia inducida por otras cepas, a una enfermedad inflamatoria provocada por una respuesta inmunitaria sobreactivada o a una reducción del apetito y la deshidratación. Por lo tanto, cuando la eficacia antiviral (relacionada con Th1 y Th2), que suprime la infección viral, y la respuesta inmunitaria (Th2, antiinflamatoria), que regula la infección secundaria y la respuesta de inflamación excesiva, se potencian simultáneamente, puede lograrse un efecto eficaz de prevención y tratamiento para enfermedades virales. Como tal, no se conoce en la técnica una cepa que potencie simultáneamente Th1 y Th2 con respecto a proporcionar un efecto inmunopotenciador a través de probióticos, y los presentes inventores han identificado recientemente tal cepa.
Tal como se usa en la presente descripción, el término "citocina" se refiere a una glicoproteína usada como una sustancia señal para controlar y estimular un sistema de defensa corporal y puede ser, por ejemplo, IL-12, IL-10 o TGF-beta, pero no se limita a ello.
La cepa puede promover el crecimiento del ganado o reducir la tasa de incidencia de diarreas cuando se administra al ganado por vía oral.
La cepa puede tener una actividad antiviral contra el virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV).
El virus de la diarrea epidémica porcina es un coronavirus que infecta los enterocitos de los cerdos y provoca una diarrea epidémica porcina que induce diarrea grave y deshidratación. Cuando se trata la cepa de Lactobacillus plantarum CJLP17 de la presente descripción o un cultivo de la misma, la actividad y la infección de PEDV pueden suprimirse notablemente. Por lo tanto, la composición que incluye la cepa de Lactobacillus plantarum CJLP17 o un cultivo de la misma puede usarse como una composición antiviral contra PEDV, o una composición farmacéutica para prevenir o tratar la diarrea epidémica porcina, una composición de alimentos funcionales saludables, un cuasifármaco o un composición de piensos para prevenir o mejorar la diarrea epidémica porcina.
En otro aspecto de la presente descripción, se proporciona una composición que incluye la cepa de Lactobacillus plantarum CJLP17, un cultivo de la misma, un concentrado de la misma o una forma seca de la misma. Pueden encontrarse más detalles sobre la cepa al hacer referencia a la descripción anterior.
La cepa recién aislada de la presente descripción puede cultivarse mediante un método convencional para cultivar cepas de Lactobacillus. Como medio, puede usarse un medio natural o un medio sintético. Como fuente de carbono del medio pueden usarse, por ejemplo, glucosa, sacarosa, dextrina, glicerol, almidón, etc. Como fuente de nitrógeno, pueden usarse peptona, extractos de carne, extractos de levadura, levaduras secas, soja, sales de amonio, nitrato y otros compuestos orgánicos o inorgánicos que contienen nitrógeno, pero la fuente de nitrógeno no se limita a ello. Como sales inorgánicas incluidas en el medio, pueden usarse magnesio, manganeso, calcio, hierro, potasio, etc., pero las sales inorgánicas no se limitan a ello. Pueden añadirse al medio aminoácidos, vitaminas, ácidos nucleicos y compuestos relacionados además de la fuente de carbono, la fuente de nitrógeno y los componentes de las sales inorgánicas. La cepa recién aislada de la presente descripción puede cultivarse durante 12 horas a 4 días en un intervalo de temperatura de 20 °C a 40 °C.
Específicamente, el caldo de cultivo de la cepa recién aislada puede ser un caldo de cultivo crudo que contiene células, o también pueden ser células de las que se extrae un sobrenadante de cultivo, o células concentradas. La composición del caldo de cultivo puede contener adicionalmente no solo los componentes requeridos para el cultivo convencional de Lactobacillus, sino también componentes que actúan sinérgicamente para el crecimiento de Lactobacillus, y las composiciones de los mismos pueden ser fácilmente seleccionadas por los expertos en la técnica.
Además, la cepa puede estar en estado líquido o seco, y el método de secado puede incluir, pero no se limita a, secado al aire, secado natural, secado por pulverización y secado por congelación.
En la composición, la concentración de la cepa de Lactobacillus plantarum CJLP17 puede ser de 103 CFU/ml a 108 CFU/ml, de 104 CFU/ml a 108 CFU/ml, de 105 CFU/ml a 108 CFU/ml, de 106 CFU/ml a 108 107 CFU/ml, de 104 CFU/ml a 107 CFU/ml, de 105 CFU/ml a 107 CFU/ml, de 106 CFU/ml a 107 CFU/ml, pero no se limita a ello.
La composición puede incluir además un crioprotector o un excipiente. Más específicamente, la composición puede incluir además al menos un crioprotector que se selecciona del grupo que consiste en glicerol, trehalosa, maltodextrina, leche descremada en polvo y almidón; y/o al menos un excipiente que se selecciona del grupo que consiste en glucosa, dextrina y leche descremada. El crioprotector de la presente descripción puede estar contenido en una cantidad de 0,01 % a 20 % en peso o de 0,01 % a 10 % en peso con respecto al peso total de la composición. Específicamente, con respecto al peso total de la composición, el glicerol puede estar contenido en una cantidad de 5 % a 20 % en peso, la trehalosa puede estar contenida en una cantidad de 2 % a 10 % en peso, la maltodextrina puede estar contenida en una cantidad de 2 % a 10 % en peso, la leche descremada en polvo puede estar contenida en una cantidad de 0,5 % a 2 % en peso, y el almidón puede estar contenido en una cantidad de 0,1
% a 1 % en peso en la composición. Además, el excipiente puede estar contenido en una cantidad de 75 % a 95 % en peso o de 85 % a 95 % en peso con respecto al peso total de la composición.
Además, el método para preparar una composición que incluye la cepa de Lactobacillus plantarum CJLP17, un cultivo de la misma, un concentrado de la misma o una forma seca de la misma puede incluir una etapa de mezcla de un aditivo con la cepa de Lactobacillus plantarum CJLP17, un cultivo de la misma, un concentrado de la misma, o una forma seca de la misma. El aditivo puede ser el crioprotector o excipiente descrito anteriormente.
En otro aspecto más, se proporciona una preparación probiótica que incluye la cepa recién aislada de la presente descripción o un cultivo de la misma como un ingrediente activo.
Los probióticos se fijan en las paredes del tracto digestivo en los intestinos para prevenir el establecimiento de bacterias dañinas e inhibir la proliferación de virus. Además, las enzimas digestivas beneficiosas producidas por los probióticos promueven el crecimiento al facilitar la absorción y la utilización de nutrientes.
La composición puede seleccionarse del grupo que consiste en alimentos, alimentos funcionales, piensos, aditivos de piensos, composiciones cosméticas, composiciones farmacéuticas y cuasifármacos.
La composición que incluye la cepa de Lactobacillus plantarum CJLP17 o un cultivo de la misma puede tener una actividad antibacteriana frente a microorganismos patógenos. La cepa, el microorganismo patógeno, y la actividad antibacteriana son los descritos anteriormente.
Específicamente, el microorganismo patógeno puede ser al menos uno que se selecciona del grupo que consiste en
E. coli, E. coli enterotoxigénica, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium y Vibrio parahaemolyticus.
La composición que incluye la cepa de Lactobacillus plantarum CJLP17 o un cultivo de la misma puede ser una composición para potenciar la inmunidad.
En otro aspecto más de la presente descripción, se proporciona un aditivo de piensos o una composición de piensos, que incluye la cepa de Lactobacillus plantarum CJLP17 o un cultivo de la misma.
La cepa de Lactobacillus plantarum CJLP17 anterior es como se describe anteriormente. Específicamente, la cepa de Lactobacillus plantarum CJLP17 de la presente descripción puede añadirse a un aditivo de piensos o una composición de piensos que incluye el aditivo de piensos con el fin de proporcionar una actividad antibacteriana, promover el crecimiento, reducir la tasa de incidencia de diarreas e inhibir la actividad viral.
Tal como se usa en la presente descripción, el término "aditivo de piensos" se refiere a las sustancias añadidas a un pienso con el fin de proporcionar varios efectos, tales como complementar los nutrientes y prevenir la pérdida de peso, promover la digestibilidad de la celulosa en el pienso, mejorar la calidad de la leche, prevenir trastornos reproductivos y mejorar las tasas de embarazo, prevenir el estrés por altas temperaturas durante la temporada de verano, etc. El aditivo de piensos de la presente descripción pertenece a un pienso complementario de acuerdo con la Ley de control de piensos para ganado y peces, y puede incluir además preparaciones minerales tales como hidrógeno carbonato de sodio, bentonita, óxido de magnesio, minerales complejos y minerales traza, que incluyen zinc, cobre, cobalto, selenio, etc.; preparaciones de vitaminas tales como caroteno, vitamina E, vitamina A, vitamina D, vitamina E, ácido nicotínico, complejo vitamínico B, etc.; preparaciones protectoras de aminoácidos tales como metionina, lisina, etc.; preparaciones protectoras de ácidos grasos tales como calcio de ácidos grasos, etc.; y bacterias vivas y preparaciones de levadura tales como probióticos (bacterias del ácido láctico), cultivo de levadura, producto fermentado con hongos, etc.
Como se usa en la presente descripción, el término "pienso" se refiere a cualquier dieta natural o artificial, una sola comida, etc., o un componente de una sola comida, que un animal come, ingiere y digiere o que es adecuado para comer, ingerir, y la digestión. El pienso que incluye la composición para prevenir o tratar enfermedades metabólicas de acuerdo con la presente descripción como un ingrediente activo puede prepararse en diversas formas de pienso conocidas en la técnica, y puede incluir preferentemente un pienso concentrado, un pienso crudo y/o un pienso de especialidad.
Los sujetos por criar pueden incluir cualquier organismo que pueda ingerir el pienso de la presente descripción, y pueden incluir cerdos para los fines de la presente descripción.
El contenido de la cepa de Lactobacillus plantarum CJLP17 en la composición de piensos de acuerdo con la presente descripción puede controlarse apropiadamente en dependencia del tipo y edad del ganado que va a aplicarse, formas de aplicación, efectos deseados, etc., y puede usarse, por ejemplo, en una cantidad de 0,01 % a 20 % en peso, pero no se limita a ello.
Para la administración, la composición de piensos de la presente descripción puede incluir además una mezcla de uno o más de un ácido orgánico tales como ácido cítrico, ácido fumárico, ácido adípico, ácido láctico, etc.; un fosfato tales como fosfato de potasio, fosfato de sodio, polifosfato, etc.; y un antioxidante natural tales como polifenol, catequina, tocoferol, vitamina C, extracto de té verde, quitosano, ácido tánico, etc. Si es necesario, pueden añadirse otros aditivos convencionales tales como un agente antigripal, un amortiguador, un agente bacteriostático, etc. Además, puede añadirse adicionalmente un diluyente, un agente dispersante, un tensioactivo, un aglutinante o un lubricante para formular la composición en una preparación inyectable tales como una solución acuosa, una suspensión, una emulsión, etc., una cápsula, un gránulo, o un comprimido.
Además, la composición de piensos de la presente descripción puede usarse junto con un complemento nutritivo, un acelerador del crecimiento, un acelerador de la digestión-absorción y un agente profiláctico, además de varios auxiliares tales como aminoácidos, sales inorgánicas, vitaminas, antioxidantes, agentes antifúngicos, agentes antibacterianos, etc., como componentes auxiliares, y los ingredientes principales que incluyen piensos con proteínas vegetales tales como trigo, cebada, maíz, etc., pulverizados o triturados, alimentos con proteínas animales tales como harina de sangre, harina de carne, harina de pescado, etc., grasa animal y grasa vegetal.
Cuando la composición de piensos de la presente descripción se usa como un aditivo de piensos, la composición de piensos puede añadirse tal cual o puede usarse junto con otros componentes, o puede usarse apropiadamente de acuerdo con un método convencional. La composición de piensos puede prepararse en la forma de administración de una formulación de liberación inmediata o de liberación sostenida, en combinación con un portador no tóxico farmacéuticamente aceptable. El portador comestible puede ser almidón de maíz, lactosa, sacarosa o propilenglicol. Un portador sólido puede estar en la forma de administración de comprimidos, polvos, trociscos, etc., y un portador líquido puede estar en la forma de administración de jarabes, suspensiones líquidas, emulsiones, soluciones, etc. Además, el agente de administración puede incluir un conservante, un lubricante, un acelerador de soluciones o un estabilizador, y también puede incluir otros agentes para mejorar otras enfermedades inflamatorias y sustancias útiles para la prevención de virus.
La composición de pienso de acuerdo con la presente descripción puede mezclarse en una cantidad de aproximadamente 10 g a 500 g, específicamente de 10 g a 100 g por 1 kg, con respecto al peso seco del pienso para ganado. Después de estar completamente mezclada, la composición de piensos puede proporcionarse como un puré, o puede someterse adicionalmente a un proceso de granulación, extensificación o extrusión, pero no se limita a ello.
En otro aspecto adicional de la presente descripción, se proporciona una composición de alimentos o alimento funcional, que incluye la cepa de Lactobacillus plantarum CJLP17 o un cultivo de la misma.
Específicamente, la composición de la presente descripción puede añadirse a una composición de alimentos con el fin de proporcionar una actividad antibacteriana, promover el crecimiento, promover la inmunidad, reducir la tasa de incidencia de diarreas e inhibir la actividad viral. La cepa de Lactobacillus plantarum CJLP17 es como se ha descrito anteriormente. La composición de alimentos puede incluir un portador citológicamente aceptable.
La composición de alimentos de la presente descripción incluye todas las formas de alimentos funcionales, complementos nutricionales, alimentos saludables y aditivos de alimentos, y estos tipos de composición de alimentos pueden prepararse en diversas formas de acuerdo con métodos convencionales.
Cuando la cepa de Lactobacillus plantarum CJLP17 se usa como aditivo de alimentos, la cepa de Lactobacillus plantarum CJLP17 puede añadirse tal cual o usarse en combinación con otros alimentos o ingredientes de alimentos, o puede usarse apropiadamente de acuerdo con un método convencional. La cantidad de ingredientes activos mixtos puede determinarse apropiadamente en dependencia del propósito de uso (prevención, salud o tratamiento terapéutico). Por lo general, en el momento de preparar un alimento o bebida, se añade la cepa de Lactobacillus plantarum CJLP17 en una cantidad de 0,0001 % a 1 % en peso, específicamente de 0,001 % a 0,1 % en peso con respecto a una composición de materia prima que incluye la cepa de Lactobacillus plantarum CJLP17. Sin embargo, en el caso de la administración a largo plazo con fines de salud e higiene o con el fin de controlar la salud, la cantidad puede ser inferior al intervalo descrito anteriormente.
No existe una limitación particular sobre el tipo de alimento. Los ejemplos de alimentos a los que puede añadirse el material anterior incluyen carnes, salchichas, panes, chocolates, dulces, refrigerios, confituras, pizzas, fideos instantáneos, otros fideos, gomas, productos lácteos, que incluyen helados, varios tipos de sopa, bebidas, tés, bebidas, bebidas alcohólicas, complejos vitamínicos, etc., y se incluyen todos los alimentos funcionales saludables en el sentido corriente.
La composición de bebida saludable de la presente descripción puede contener además, como componentes adicionales, varios agentes aromatizantes o carbohidratos naturales, como en las bebidas convencionales. Los carbohidratos naturales antes mencionados pueden incluir monosacáridos tales como glucosa, fructosa, etc.; disacáridos tales como maltosa, sacarosa, etc.; polisacáridos tales como dextrina, ciclodextrina, etc.; y alcoholes de azúcar tales como xilitol, sorbitol, eritritol, etc. Pueden usarse como el agente edulcorante agentes edulcorantes naturales tales como taumatina, un extracto de stevia, etc.; y agentes edulcorantes sintéticos tales como sacarina, aspartamo, etc. Una relación de los componentes adicionales puede estar en un intervalo de 0,01 a 0,04 partes en peso, específicamente de 0,02 a 0,03 partes en peso con respecto a 100 partes en peso de la composición de la presente descripción.
Además de los componentes antes mencionados, la composición de la presente descripción puede contener diversos complementos nutricionales, vitaminas, electrolitos, agentes saborizantes, agentes colorantes, ácido péctico y sales del mismo, ácido algínico y sales del mismo, ácidos orgánicos, agentes espesantes coloidales protectores, agentes de control de pH, agentes estabilizadores, conservantes, glicerina, alcoholes, agentes carbonatados usados en bebidas carbonatadas, etc. La relación de dichos aditivos no es importante, pero generalmente se elige en un intervalo de 0,01 a 0,1 partes en peso con respecto a 100 partes en peso de la composición de la presente descripción. Además, la composición de la presente descripción puede contener pulpa para preparar un jugo de fruta natural, una bebida de jugo de fruta o una bebida vegetal. La relación de tal pulpa no es importante, pero generalmente se elige en un intervalo de 0,01 a 10 partes en peso con respecto a 100 partes en peso de la composición de la presente descripción. Tales componentes pueden usarse solos o en combinación. La composición de la presente descripción, que incluye la cepa de Lactobacillus plantarum CJLP17, un cultivo de la misma, un concentrado de la misma, o una forma seca de la misma, puede administrarse a un sujeto. Mediante la administración anterior, la composición puede exhibir los efectos de la composición para el objetivo de la presente descripción (es decir, una actividad antibacteriana contra microorganismos patógenos, una actividad inmunopotenciadora, etc.).
El sujeto puede incluir animales que excluyen o incluyen seres humanos. Los animales pueden incluir no solo seres humanos sino también todos los animales que necesitan ejercer los efectos de la composición mencionados anteriormente. Específicamente, los animales pueden ser mamíferos tales como vacas, caballos, ovejas, cerdos, cabras, camellos, antílopes, perros, gatos, etc. Como otro ejemplo, los animales pueden ser mascotas.
La dosificación para la administración no está limitada, pero la composición puede administrarse en una cantidad de 106 CFU/día o más, 107 CFU/día o más, 108 CFU/día o más, 109 CFU/día o más, o 1010 CFU/día o más con respecto a la cepa de Lactobacillus plantarum CJLP17.
Modo de llevar a cabo la invención
A continuación, la presente descripción se describirá con más detalle mediante ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos son solo con fines ilustrativos, y el alcance de la descripción no pretende limitarse por estos ejemplos. Ejemplo 1: Aislamiento y selección de cepas
1-1. Recolección de muestras y aislamiento de cepas
Se recogieron muestras de heces y calostro de cerdas y lechones de las granjas domésticas donde se habían producido brotes crónicos de PEDV. Las muestras así recogidas se sometieron a diluciones en serie, se untaron en un medio BHI y MRS sólido y se incubaron a 37 °C durante 48 horas. Las cepas aisladas de cada muestra se aislaron puramente al transferirlas a un medio nuevo, y las cepas puramente aisladas e incubadas se almacenaron en un medio nutritivo complementado con glicerol al 20 % a -70 °C o menos. Como resultado, se recogieron un total de 1552 cepas y se seleccionaron las cepas que tenían una excelente actividad antiviral a través de los siguientes ejemplos.
1-2. Evaluación de la resistencia a los ácidos y resistencia a la bilis de las cepas
Para seleccionar las cepas que pueden usarse como probióticos, se evaluaron la resistencia a los ácidos y la resistencia a la bilis de las cepas recogidas.
Se preparó un medio de jugo gástrico artificial para la evaluación de la resistencia a los ácidos. Más específicamente, el medio de jugo gástrico artificial se preparó mediante la adición de pepsina a un medio MRS líquido para ajustar el pH a 2,5, seguido de esterilización.
Las cepas del Ejemplo 1-1 se sometieron a un cultivo estático en medio MRS líquido a 37 °C durante 18 horas después del segundo subcultivo. El 1 % de las cepas incubadas previamente se inoculó en el medio de jugo gástrico artificial y se sometió a un cultivo estático a 37 °C, y el caldo de cultivo se muestreó a las 0 horas y a las 3 horas. El caldo de cultivo muestreado se diluyó en serie y se untó en un medio MRS sólido y se incubó a 37 °C durante 48 horas para medir el recuento de células viables.
Se preparó un medio de bilis artificial para la evaluación de la resistencia a la bilis. Más específicamente, el medio de bilis artificial se preparó mediante la adición de hiel de buey al 0,5 % (es decir, bilis de buey) a un medio MRS líquido, seguido de esterilización.
Las cepas del Ejemplo 1-1 se sometieron a un cultivo estático en medio MRS líquido a 37 °C durante 18 horas después del segundo subcultivo. El 1 % de las cepas incubadas previamente se inoculó en el medio de bilis artificial y se sometió a un cultivo estático a 37 °C, y el caldo de cultivo se muestreó a las 0 horas y a las 24 horas. El caldo de cultivo muestreado se diluyó en serie y se untó en un medio MRS sólido y se incubó a 37 °C durante 48 horas para medir el recuento de células viables.
A través de las evaluaciones anteriores, se seleccionó CJLP17, que era la cepa que tenía la mayor resistencia a los ácidos y la resistencia a la bilis. La cepa seleccionada de este modo se identificó como Lactobacillus plantarum como se confirma a través de los siguientes ejemplos. Para comparar la resistencia a los ácidos y la resistencia a la bilis de la cepa CJLP17 con las de las cepas conocidas convencionalmente, se evaluó la resistencia a los ácidos y la resistencia a la bilis de la cepa estándar de Lactobacillus plantarum (KCCM12116) obtenida del Centro de Cultura de Microorganismos de Corea de la misma manera que en el método anterior.
[T l 11 Ev l i n l r i n i l i ni : F ml
Figure imgf000009_0001
[T l 21 Ev l i n l r i n i l ili ni : F ml
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De acuerdo con las Tablas 1 y 2 anteriores, disminuyó el número de células de la cepa estándar de Lactobacillus plantarum (KCCM12116) en el medio de jugo gástrico artificial y en el medio de bilis artificial. Como resultado, puede verse que no todos los Lactobacillus plantarum comúnmente conocidos tienen resistencia a los ácidos y resistencia a la bilis.
Mientras tanto, el número de células de la cepa de Lactobacillus plantarum CJLP17 en realidad aumentó en ambos medios, lo que indica que la cepa tiene una excelente resistencia a los ácidos y resistencia a la bilis.
1-3: Investigación de las características morfológicas y bioquímicas de la cepa
Para la identificación de la cepa CJLP17, se investigaron principalmente las características morfológicas y bioquímicas de la cepa. En cuanto a las características morfológicas, la cepa era Gram positiva como resultado de la tinción de Gram, y se encontró que era bacillus según lo confirmado por microscopía electrónica (Figura 1). Para analizar las características bioquímicas se analizaron los patrones de fermentación de azúcares de la cepa con el sistema API 50CHL (biomerieux Vitek, Inc., Francia) (Tabla 3).
[Tabla 3] Análisis de patrones de fermentación de azúcares de la cepa aislada
Figure imgf000010_0001
1-4. Identificación de la cepa
Para identificar con mayor precisión la cepa, se realizó un método filogenético molecular basado en la secuencia de ADN. El análisis de la secuencia se realizó de la siguiente manera: el gen del ADNr 16s se amplificó mediante el uso de una mezcla previa de PCR (Bioneer, Corea) y los cebadores universales 27F (5' AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3') y 1492R (5' GGTTACCTTGTTACGACTT 3'). En el momento de la amplificación del gen, el volumen total de la solución de reacción se ajustó a 20 pl, y la reacción se realizó a 94 °C durante 1 minuto, a 56 °C durante 1 minuto y a 72 °C durante 1 minuto, y este ciclo se repitió 30 veces en total para analizar la secuencia de ADN amplificada. La secuencia de nucleótidos de ADNr 16s analizada de la cepa aislada está representada por la SEQ ID NO: 1.
Como resultado del análisis, se identificó a CJLP17 como un microorganismo con una homología de un 99 % con Lactobacillus plantarum. Por lo tanto, la cepa aislada se denominó "Lactobacillus plantarum CJLP17" y el microorganismo recién identificado se registró como Lactobacillus plantarum CJLP17 en el Centro de Cultivo de Microorganismos de Corea el 13 de abril de 2018, con el núm. de registro KCCM12249P.
Ejemplo 2: Análisis de las características de la actividad antibacteriana de CJLP17
Se prepararon E. coli, E. coli enterotoxigénica, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium y Vibrio parahaemolyticus como microorganismos patógenos, y se evaluó la actividad antibacteriana de CJLP17 contra estos microorganismos patógenos.
La cepa CJLP17 se inoculó en un medio MRS líquido y se sometió a un cultivo estático a 37 °C durante 24 horas. Entre los microorganismos patógenos, E. coli, E. coli enterotoxigénica, Salmonella typhimurium y Staphylococcus aureus se inocularon en un medio BHI líquido y se incubaron a 37 °C durante 18 horas a 200 rpm, y Vibrio parahaemolyticus se inoculó en un medio LB líquido complementado con NaCl al 3 % y se incubó a 30 °C durante 18 horas a 200 rpm.
Se tomaron alícuotas de 10 pl del caldo de cultivo de CJLP17 en un medio MRS sólido y se secó, que luego se incubó previamente a 37 °C durante 18 horas. El 1 % del caldo de cultivo de los microorganismos patógenos se inoculó de forma independiente en 10 ml de un medio BHI sólido, y luego el resultante se vertió en el medio MRS sólido, en el que se cultivó previamente CJLP17, y se dejó reposar hasta su completa solidificación. Luego, se midió el tamaño del anillo formado al incubar a 37 °C durante 24 horas. A medida que aumentaba el tamaño del anillo, se encontró que la actividad antibacteriana era alta. Para comparar la actividad antibacteriana, se evaluó la actividad antibacteriana de la cepa estándar de Lactobacillus plantarum (KCCM12116) de la misma manera que en el método anterior.
T l 41
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Como resultado de medir el tamaño del anillo por el método anterior, como se muestra en la Tabla 4, se confirmó que CJLP17 exhibía una actividad antibacteriana superior contra todos los microorganismos patógenos, en comparación con la cepa estándar de Lactobacillus plantarum.
Ejemplo 3: Evaluación de la estabilidad de la cepa
3-1. Confirmación de la actividad hemolítica de las cepas
La p-hemólisis es un fenómeno en el que los fosfolípidos suministrados por los glóbulos rojos se hidrolizan por enzimas de fosfolípidos producidas por bacterias dañinas, lo que da como resultado la hemólisis de los glóbulos rojos. Para determinar la actividad hemolítica de la cepa CJLP17 se usaron placas de agar sangre (agar sangre de carnero al 5 %, Hanilkomed, Corea). La cepa se sembró en estrías en las placas de agar sangre preparadas y se incubó a 37 °C durante 24 horas para confirmar la hemólisis.
Como resultado, como se muestra en la Figura 2, se confirmó que la cepa de Lactobacillus plantarum CJLP17 no presentaba actividad hemolítica.
3-2. Evaluación de la susceptibilidad a los antibióticos
La cepa CJLP17 se inoculó en un medio MRS líquido y se sometió a un cultivo estático a 37 °C durante 24 horas. Las bacterias cultivadas de este modo se empaparon en bastoncillos de algodón esterilizados y se untaron en un medio Mueller Hinton II sólido (Difco), y luego se colocaron discos de antibiótico en el medio y se incubaron a 37 °C durante 24 horas. Se usaron discos de ampicilina, clindamicina, gentamicina, kanamicina, eritromicina, ampicilina/sulbactam, cloranfenicol y estreptomicina (Oxoid, Reino Unido) como discos de antibióticos para la prueba de antibióticos.
Como resultado de la prueba de susceptibilidad a los antibióticos de la cepa CJLP17, se identificó que la cepa CJLP17 no era resistente a los antibióticos anteriores (Tabla 5). Por lo tanto, se podría encontrar que incluso si la cepa CJLP17 se usa en productos farmacéuticos, alimentos funcionales saludables, aditivos de piensos, etc., los problemas que pueden surgir con respecto a la resistencia y los problemas ambientales son menos probables de ocurrir, si se considera que no tienen resistencia a los antibióticos.
T l 1 Inhi i i n l r imi n ri n r n l ni i i
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Ejemplo 4: Evaluación de la citotoxicidad
Para investigar el efecto de la cepa sobre la supervivencia de las células, se llevó a cabo el ensayo MTS mediante el uso de (3-(4,5-dimetil-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio, (promega, Estados Unidos) para evaluar el nivel de citotoxicidad en células IPEC-J2 (células de epitelio intestinal de cerdo). Cada célula se incubó en una placa de cultivo celular de 96 pocillos y se trató con CJLP17 a diferentes concentraciones de 103 CFU/pocillo a 108 CFU/pocillo. Después de 24 horas, la solución de MTS se añadió al caldo de cultivo celular, las células se incubaron durante 2 horas y se calculó la tasa de supervivencia celular (%) mediante la medición de la absorbancia a 490 nm con un lector de microplacas.
Como resultado, como se muestra en la Figura 3, cuando las células se trataron a seis concentraciones diferentes, se confirmó que apenas se observaba muerte celular a concentraciones de 107 CFU/ml o inferiores, y las células mostraban una tasa de supervivencia de aproximadamente el 80 % a una concentración de 108 CFU /ml. Por lo tanto, pudo confirmarse que CJLP17 no mostró sustancialmente citotoxicidad a concentraciones de 107 CFU/ml o inferiores.
Ejemplo 5: Evaluación de la actividad inmunopotenciadora
Para confirmar el efecto inmunopotenciador de la cepa CJLP17, se incubaron células IPEC-J2 en medio DMEM/F-12 (medio de Eagle modificado por Dulbecco: mezcla de nutrientes F-12). Además, los linfocitos de los ganglios linfáticos mesentéricos (mLN), las células mononucleares de sangre periférica (PBMC), las células de las placas de Peyer y los esplenocitos (Spin) se recogieron de lechones destetados de 21 días de edad y se obtuvieron células inmunitarias de cada tejido y suero por el siguiente método.
Para obtener células inmunitarias de los esplenocitos y los linfocitos en los ganglios linfáticos mesentéricos, el tejido picado se pulverizó mediante el uso de un émbolo de una jeringa y un filtro celular de 70 micrómetros (BD Falcon), y luego las células se lavaron mediante el uso de un medio RPMI- 1640 (Roswell Park Memorial Institute-1640, Gibco BRL, Grand Island, NY, Estados Unidos). Los RBC restantes (glóbulos rojos) se eliminaron mediante el uso de un amortiguador de lisis de RBC (eBioscience, Estados Unidos) antes de la última etapa de lavado. Las células inmunitarias recogidas después de la última etapa de lavado se tiñeron con azul tripano y se contaron con un hemocitómetro para su uso.
Para obtener células de las placas de Peyer, los tejidos correspondientes se aislaron del intestino delgado, y luego se cortaron y se pulverizaron con una tijera quirúrgica. Posteriormente, las células se hicieron reaccionar en medio RPMI-1640 (pH 7,2) que contenía Dnasa I (Roche, Alemania), Dispasa II (Sigma Aldrich, Estados Unidos), antibióticos, FBS y ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico 15 mM (HEPES) durante 1 hora para obtener células individuales. Posteriormente, las células inmunitarias se obtuvieron de la misma manera que se ha descrito anteriormente.
La sangre recogida se mezcló con PBS en una relación de 1:1 y se centrifugó en un Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare Life Sciences, NJ, Estados Unidos) para separar la capa de agregación de WBC (glóbulos blancos) y las células mononucleares de sangre periférica se obtuvieron de la capa separada.
Para evaluar el efecto inmunopotenciador, la cepa CJLP17 se mezcló con cada tipo de células inmunitarias obtenidas mediante el uso del método anterior en una relación de 10:1, y la mezcla se incubó a 37 °C en una incubadora de células que contenía 5 % de CO2 durante 20 horas. Una vez finalizada la incubación, las células se centrifugaron y se evaluó el efecto inmunoactivador del sobrenadante del cultivo mediante el uso de un ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) de citocinas. Más específicamente, se realizó el ELISA (R&D Systems, Estados Unidos) para IL-12 (interleucina-12), que activa un mecanismo inmunitario relacionado con Th1 (T auxiliar 1) que defiende frente a factores invasivos externos (patógeno). Para evaluar las respuestas inmunitarias de Th1 y Th2 en la inmunidad sistémica, se usaron esplenocitos y monocitos de sangre periférica para IL-12 e IL-10, y para medir con mayor precisión la respuesta antiinflamatoria en el intestino, se realizó una prueba ELISA de TGF-beta mediante el uso de células de las placas de Peyer y linfocitos mesentéricos.
Los gráficos que muestran los resultados de la medición de IL-12, IL-10 y TGF-beta se muestran en las Figuras 4 a 6, respectivamente. En cada gráfico, el control se usó como un control negativo sin tratamiento de cepa.
Como resultado, como se muestra en las Figuras 4 a 6, se confirmó que la cepa CJLP17 mostró la actividad de aumentar la secreción de IL-12, IL-10 y TGF-beta al estimular las células inmunitarias. Por lo tanto, puede verse que la cepa CJLP17 presenta el efecto de potenciar simultáneamente el mecanismo inmunitario de Th1 y el mecanismo inmunitario de Th2.
Ejemplo 6: Efecto inhibidor contra la infección viral
Para medir el efecto inhibidor de la cepa CJLP17 contra la infección viral, se preparó el virus de la diarrea epidémica porcina (cepa PEDV, SM98 o KPEDV9). Específicamente, el virus proliferó en células Vero (CCL-81, células epiteliales renales originadas en Chlorocebus), y se usaron MEM (medio esencial mínimo de Eagle, Gibco BRL, Grand Island, NY, Estados Unidos), FBS al 10 % inactivado con calor (suero bovino fetal, v/v) y penicilina/estreptomicina al 1 % (v/v) como el medio para cultivar las células Vero. Las células Vero se incubaron como una monocapa, se lavaron dos veces con el medio y luego se eliminaron todas las soluciones. El virus se

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una cepa de Lactobacillus plantarum CJLP17 registrada con el núm. de registro KCCM12249P, que tiene resistencia a los ácidos, resistencia a la bilis y una actividad inmunopotenciadora.
2. La cepa de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la cepa tiene una actividad antibacteriana contra microorganismos patógenos.
3. La cepa de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el microorganismo patógeno es al menos uno que se selecciona del grupo que consiste en E. coli, E. coli enterotoxigénica, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium y Vibrio parahaemolyticus.
4. La cepa de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la cepa aumenta la secreción de citocinas al promover la activación de células inmunitarias.
5. La cepa de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la citocina es IL-12, IL-10 o TGF-beta.
6. La cepa de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la cepa tiene una actividad antiviral contra el virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV).
7. La cepa de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso en un método para promover el crecimiento del ganado o reducir la tasa de incidencia de diarreas cuando se administra al ganado por vía oral.
8. Una composición que comprende la cepa de Lactobacillus plantarum CJLP17 de acuerdo con la reivindicación 1 o un cultivo de la misma.
9. La composición de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la composición comprende además un crioprotector o un excipiente.
10. La composición de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el crioprotector es al menos uno que se selecciona del grupo que consiste en glicerol, trehalosa, maltodextrina, leche descremada en polvo y almidón, y el excipiente es al menos uno que se selecciona del grupo que consiste en glucosa, dextrina y leche descremada.
11. La composición de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la composición tiene una actividad antibacteriana contra microorganismos patógenos.
12. La composición de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el microorganismo patógeno es al menos uno que se selecciona del grupo que consiste en E. coli, E. coli enterotoxigénica, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium y Vibrio parahaemolyticus.
13. La composición de acuerdo con la reivindicación 8 para su uso en un método para potenciar la inmunidad.
14. Un aditivo de piensos que comprende la cepa de Lactobacillus plantarum CJLP17 de acuerdo con la reivindicación 1 o un cultivo de la misma.
15. Un alimento funcional que comprende la cepa de Lactobacillus plantarum CJLP17 de acuerdo con la reivindicación 1 o un cultivo de la misma.
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