BR112013001107B1

BR112013001107B1 - Métodos e composições incluindo bactéria formadora de esporos para aumento da saúde dos animais

Info

Publication number: BR112013001107B1
Application number: BR112013001107-6A
Authority: BR
Inventors: Ross Wolfenden; Neil R. Pumford; Marion Morgan; Anita Menconi; Guillermo Tellez; Amanda Wolfenden; Srichaitanya Shivaramaiah; Billy Hargis
Original assignee: The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas
Priority date: 2010-07-16
Filing date: 2011-07-18
Publication date: 2022-01-25
Also published as: EP2593187A4; WO2012009712A3; BR112013001107A2; EP2593187A2; US20130136695A1; WO2012009712A2; US9005601B2

Abstract

MÉTODOS E COMPOSIÇÕES INCLUINDO BACTÉRIA FORMADORA DE ESPOROS PARA AUMENTO DA SAÚDE DOS ANIMAIS. Métodos, composições e isolados bacterianos para melhoria da saúde gastrointestinal de animais e em particular de aves de criação são fornecidos pelo presente. Os métodos incluem a administração de uma bactéria formadora de esdósporo para um animal. As bactérias são selecionadas para habilidade de redução de crescimento e presença de patógenos bacterianos, tais como Salmonella, Clostridium, e Campylobacter, no trato gastrointestinal do animal. As bactérias também são selecionadas para habilidade de melhorar ao menos um parâmetro de produção no animal.

Description

REFERÊNCIAS ÀS APLICAÇÕES RELACIONADAS

[001] Este pedido de patente reivindica o benefício de prioridade dos N° de Pedido de Patente Provisional dos Estados Unidos 61/365,188, registrado em 16 de julho de 2010, o qual é incorporado pelo presente por meio da referência em sua totalidade.

DECLARAÇÃO A RESPEITO DA PESQUISA PATROCINADA FEDERALMENTE

[002] Esta invenção foi feita com apoio do governo dos Estados Unidos conferido pelo número de concessão 2010-34211-20961 do Departamento de Consórcio de Segurança Alimentar Agrícola dos Estados Unidos. Os Estados Unidos possuem determinados direitos nesta invenção.

CAMPO DA INVENÇÃO

[003] A presente invenção diz respeito aos métodos em geral para melhorar a saúde dos animais agrícolas. Em particular, a presente invenção diz respeito a isolados bacterianos, formulações probióticas as quais englobam os isolados bacterianos, formulações probióticas as quais englobam os isolados e métodos de seleção e de uso de formulações de probióticos para melhorar a saúde das avez de criação.

HISTÓRICO DA INVENÇÃO

[004] O uso de antibióticos em animais agrícolas, em particular, na produção de aves de criação, está vindo sob pressão de crescimento de ambos, os consumidores e agências reguladoras do governo. Isso tem criado uma necessidade por alternativas de antibióticos eficazes. O uso de probióticos eficazes ou microbianos para inclusão direta (DFM) em animais agrícolas pode ser uma alternativa em potencial. Atualmente, há dois subconjuntos gerais de bactérias usados em aplicações de DMF ou probióticos: Bactéria ácida láctica e Bacillus spp.

[005] Enquanto alguns isolados são provados como eficazes, as bactérias ácidas lácticas possuem a desvantagem de que elas devem ser aplicadas através da água potável. lsso é porque estes dois tipos de organismos geralmente não são tolerantes ao calor necessário para aglomerar muitas dietas de alimentação animal. Além disso, uma vez que esses produtos devem ser aplicados através da água, o fazendeiro individual é responsável pela aplicação do produto. Isso frequentemente conduz a questões de conformidade com recomendações de administração adequadas levando à aplicação imprópria e eficácia reduzida desses produtos.

RESUMO DA INVENÇÃO

[006] Métodos para melhoria da saúde do trato gastrointestinal em animais, isolados bacterianos e formulações de probióticos os quais englobam esses isolados são aqui estabelecidos. Os isolados bacterianos são Bacillus spp. Selecionados a partir de fontes ambientais que são capazes de melhorar a saúde aves de criação. Esse isolados foram selecionados para as habilidades de 1) reduzir a Salmonella ou outra bactéria de origem alimentar patogênica para humanos 2) melhorar os parâmetros de produção em operações de aves de criação comerciais, ou 3) reduzir patógenos bacterianos entéricos de aves de criação. Nenhum produto DFM Bacillus conhecido, isolado Bacillus, ou combinação de isolados Bacillus é capaz de realizar todas as três tarefas.

[007] Por um lado, métodos para melhoria da saúde do trato gastrointestinal em animais são providenciados. Os métodos incluem a administração de uma bactéria formadora de esdósporo para um animal. As bactérias formadoras de esdósporo são capazes de reduzir o número ou o crescimento de patógenos bacterianos no trato gastrointestinal do animal. Além disso, a administração da bactéria formada de esdósporo para o animal melhora ao menos um parâmetro de produção animal.

[008] Por outro Iado, isolados bacterianos selecionados usando métodos divulgados pelo presente são fornecidos e incluem Bacillus subtilis AM0904 (NRR1 Número de Depósito B-50914), Bacillus subtilis AM0911 (NRRL Número de Depósito B-50915), Bacillus subtilis NP122 (NRRL Número de Depósito B-50910), Bacillus subtilis NP119B (NRRL Número de Depósito B-50909), B. licheniformis B1 (NRRL Número de Depósito B-50907), B. subtilis B2 (NRRL Número de Depósito B-50908), B. licheniformis RW25 (NRRL Número de Depósito B-50911), B. licheniformis RW32 (NRRL Número de Depósito B-50912), e B. licheniformis RW41 (NRRL Número de Depósito B-50913).

[009] Por outro Iado, ainda, as combinações multi-isoladas e composições de probióticos dos isolados bacterianos divulgados são fornecidos pelo presente. Em uma forma de realização, uma combinação de B. subtilis (um ou mias isolados distintos ou estirpes) e/ou B. lincheniformis (ao menos um isolado) é fornecida. Os isolados bacterianos e formulações de probióticos fornecidas pelo presente progridem sobre a tecnologia atual, pois eles aumentam o desempenho das aves de criação comerciais, diminuem os patógenos bacterianos comuns de dentro do intestino das aves de criação comerciais, e reduzem as bactérias associadas à doenã de origem alimentar, tais como Salmonella, de dentro do intestino das aves de criação comerciais.

[010] Em outro aspecto, a alimentação animal que engloba as composições de probióticos ou isolados bacterianos divulgados é fornecida pelo presente. A alimentação pode incluir 104 e 10’ cfu/gm de alimentação pronta.

[011] Ainda em outro aspecto, métodos para melhoria da saúde de aves de criação são providenciados. Os métodos incluem a administração da formulação de probióticos ou ração animal descrita pelo presente para um animal. A saúde gastrointestinal do animal pode ser melhorada através do método.

[012] Ainda em outro aspecto, métodos de estirpes bacterianas de seleção para uso em formulações probióticas são providenciados. Os métodos incluem selecionar estirpes bacterianas facultativas capazes de formar esporos, selecionar estirpes bacterianas capazes de reduzir o crescimento de bactérias patogênicas tais como Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Campylobacter jejuni ou Clostridium perfringens em culturas mistas in vitro ou no trato gastrointestinal de animais, selecionando estirpes bacterianas capazes de melhorar a taxa de crescimento de aves de criação comerciais, reduzindo a severidade da enterite necrótica e/ou que persiste no trato gastrointestinal e que remove qualquer estirpes bacterianas selecionadas não consideradas GRAS (Geralmente Reconhecidas como Segura) através da Food and Drug Administration (FDA), não elegíveis para inclusão na alimentação animal através da Associação Americana Oficial de Controle de Alimentos (AAFCO) ou capazes de hemólises de células vermelhas sanguíneas de ovelhas. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[013] Uma compreensão mais completa da presente invenção pode ser derivada através da referência à descrição detalhada e reinvindicações quando consideradas em conexão com as Figuras.

[014] Figura 1 é um diagrama da porção in vitro dos procedimentos de seleção de isolados usados para isolar e selecionar isolados DFM/ candidatos à probióticos.

[015] Figura 2 é um diagrama da porção in vivo dos procedimentos de seleção de isolados usados para isolar e selecionar isolados DFM/candidatos à probióticos.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[016] Métodos, composições e isolados bacterianos para melhoria da saúde gastrointestinal de aves de criação são divulgados. As composições incluem formulações de probióticos ou Microbianos para Inclusão Direta (DFM) e produtos de alimentação animal. Métodos de administração para melhorar a saúde animal e reduzir a contaminação da cadeia de alimentos humanos para estirpes bacterianas específicas isoladas úteis nos métodos também são divulgados. Os métodos e composições fornecidos pelo presente também produzem grande consistência de produção dentro do grupo de animais.

[017] Métodos para melhora da saúde do trato gastrointestinal em animais incluem a administração de uma bactéria formadora de esdósporo para um animal. As bactérias podem ser administradas como esdósporo, porém podem não ser. As bactérias formadoras de esporos são capazes de reduzir o número ou o crescimento de patógenos bacterianos no trato gastrointestinal do animal. O número de patógenos bacterianos dentro do trato gastrointestinal é reduzido em animais administrando as bactérias formadoras de esporos quando comparadas ao controle de animais não administrando as bactérias. Os patógenos bacterianos referem-se às bactérias capazes de causar doenças, como, morbidez ou mortalidade, tanto em animais sendo administradas as bactérias quanto em humanos. Bactérias patogênicas também incluem aquelas bactérias capazes de causar doenças de origem alimentar em humanos.

[018] As bactérias formadoras de esdósporo podem ser quaisquer bactérias capazes de esporulação tais como aquelas do gênero Bacillus, em particular Bacillus subtilis ou Bacillus licheniformis. As bactérias formadoras de esdósporo são adequadamente não patogênicas, isto é, elas não são capazes de causar morbidez ou mortalidade nos animais que estão sendo tratados. Adequadamente as bactérias são anaeróbias facultativas e capazes de reproduzir e/ou persistir dentro do trato intestinal do animal. Devidamente, as bactérias são Geralmente Reconhecidas como Seguras (GRAS) pelos Estados Unidos Food and Drug Aministration (FDA) e aceitável para inclusão em uma dieta animal ou água pela Associação Americana Oficial de Controle de Alimentos (AAFCO). Devidamente as bactérias formadoras de esdósporo não são capazes de causar hemólise quando incubadas com ou cultivadas sobre meios que contêm células vermelhas sanguíneas. Devidamente as bactérias formadoras de esdósporo são capazes de reduzir o crescimento de pelo menos uma bactéria patogênica.

[019] Administração das bactérias melhora a saúde gastrointestinal do animal. A saúde gastrointestinal inclui a prevenção de doença do trato gastrointestinal por ele mesmo, tais como enterite necrótica dos intestinos, ou carga bacteriana patogênica dos intestinos, ceco ou intestino delgado e aumento nos parâmetros de produção para animais tratados quando comparados aos controles. Os parâmetros de produção incluem, porém não se limitam à média de ganho de peso diário, taxa de conversão de ração, consistência de crescimento entre um grupo de animais, habilidade de reproduzir e cuidar de crias saudáveus, habilidade de produzir ovos e leite e a quantidade e qualidade de tal produção.

[020] De acordo com um aspecto, uma composição exemplar ou formulação pode incluir uma ou mais batérias capazes de formar esporos. As bactérias capazes de formar esporos incluem bactérias do gênero Bacillus. Isolados bacterianso B. subtilis e B. lincheniformis específicos são divulgados pelo presente, porém outras bactérias formadoras de esdósporo adequadas para uso nos métodos e composição divulgados pelo presente podem ser isoladas e selecionadas através daqueles com habilidade no usando métodos de seleção descritos abaixo e nos Exemplos. Por exemplo, uma composição pode incluir uma formulação contendo um ou dois isolados de B. subtilis e/ou um ou dois isolados de B. licheniformis, onde cada isolado é selecionado independentemente para desempenhar um papel específico e/ou função. A combinação destes isolados podem ser combinados com uma ração agrícola (ração de aves especificamente) e usada ultimamente para melhorar a saúde produtividade de animais agrícolas (por exemplo, gado e/ou aves de criação). Por exemplo, os isolados e/ou as formulações de isolados combinados podem reduzie as bactérias patogênicas em particular, em bactérias associadas às doenças de origem alimentar, que causam a contaminação de ovos ou carne, podem reduzir patógenos do intestino nas aves de criação, e aumentar o ganho de peso ou produção de ovos de aves de criação.

[021] Especificamente, os isolados podem diminuir a ocorrência ou carga ao mesmo da Salmonella, Campylobacter e Clostridium. Através da redução de C. perfringens no trato gastrointestinal dos animais agrícolas e através de outras reações benéficas dos isolados com os animais agrícolas, a ocorrência de enterite necrótica é reduzida. Além disso, essas bactérias diminuem a taxa de mortalidade dos animais agrícolas, e a média de ganho de peso diária dos animais agrícolas é aumentada. No caso das aves de criação, um nível reduzido de Salmonella dentro do trato gastrointestinal pode levar a uma contaminação de carcaça menor como também reduzir a probabilidade de ovos contaminados com Salmonella.

[022] Como descrito nos exemplos abaixo, os isolados bacterianos foram selecionados por sua habilidade de formar esdósporo e tais como são resistentes a temperaturas extremas. As bactérias selecionadas são anaeróbias facultativas e não são hemoliticas. As bactérias são capazes de inibir ou reduzir o crescimento de ambas as bactérias gram-negativas e gram-positivas tais como Salmonella, Clostridium e Campylobacte. A habilidade de reduzir o crescimento bacteriano patogênico permite ás bactérias selecionadas a reduzir a enterite necrótica nas aves de criação. As bactérias selecionadas também são capazes de aumentar a taxa de crescimento e saúde gastrointestinal das aves de criação comerciais e são capazes de persistir e colonizar no trato gastrointestinal das aves de criação. Os isolados são todos considerados como GRAS (Geralmente Reconhecidos como Seguros) pela FDA e são elegíveis para inclusão na alimentação animal através da AAFCO. Além disso, esses isolados particulares são capazes de passar toda sua vida dentro do trato gastrointestinal de animais agrícolas, especificamente em aves de criação.

[023] Os isolados bacterianos identificados nos Exemplos e capazes de serem usados em formulações de probióticos ou em alimentação animal para uso em métodos descritos aqui são os seguintes Bacillus subtilis AM0904 (NRRL Número de Depósito B- 50914), Bacillus subtilis AM0911 (NRRL Número de Depósito B-50915), Bacillus subtilis NP122 (NRRL Número de Depósito B-50910), Bacillus subtilis NP119B (NRRL Número de Depósito B-50909), B. Licheniformis B1 (NRRL Número de Depósito B-509907), B. subtilis B2 (NRRL Número de Depósito B-50908), B. licheniformis RW25 (NRRL Número de Depósito B-50911), B.licheniformis RW32 (NRRL Número de Depósito B-50912), e B. licheniformis RW41 (NRRL Número de Depósito B-50913). Osisolados bacterianos foram depositados no Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), 1815 North University Street, Peoria, IL 61604, Estados Unidos, sob os números de acesso identificados acima. Os isolados bacterianos designados como “Bacillus subtilis AM0904”, “Bacillus subtilis AM0911”, “Bacillus subtilis NP122”, “Bacillus subtilis NP119B”, “B.lincheniformis B1”, “B. lincheniformis B2”, “B. lincheniformis RW25”, “B. licheniformis RW32” e “B. licheniformis RW41” foram enviados pela Federal Express para o NRRL por Ross Wolfenden, da Universidade de Arkansas, em 6 de março de 2014.

[024] O esporo, ou inerte, forma sobrevivente do Bacillus spp não produz quaisquer efeitos conhecidos os quais possam reduzir os patógenos bacterianos no trato gastrointestinal ou ter outros efeitos benéficos no animal. Em contraste, a forma vegetativa das bactérias pode produzir efeitos. Portanto, a reativação e germinação dos esporos após a administração provavelmente é importante para a melhoria da saúde gastrointestinal de aves de criação. A habilidade dos produtos probióticos de Bacillus para geminar dentro do intestino das aves de criação comerciais não foi investigada de forma adequada. Os isolados bacterianos descritos no presente também foram selecionados por suas habilidades em reativar, germinar e colonizar ou persistir dentro dos animais após a administração de esporos das bactérias para animais.

[025] As formulações de probióticos as quais englobam ao menos um dos isolados bacterianos providos pelo presente também são dispostas. A formulação de probióticos pode incluir uma combinação dos isolados bacterianos aqui dispostos ou pode incluir isolados bacterianos outros além daqueles aqui dispostos. Adequadamente, as bactérias usadas são capazes de formar esporos, são capazes de reduzir as cargas bacterianas patogênicas no trato gastrointestinal e são capazes de aumentar ao menos um parâmetro de produção. Por exemplo, a formulação de probióticos pode incluir ao menos uma estirpe Bacillus sutilis e/ou ao menos uma estirpe Bacillus lincheniformis. Em outros exemplos, a formulação de probióticos pode incluir duas ou mais estirpes Bacillus subtilis ou duas ou mais estirpes Bacillus licheniformis. Os isolados bacterianos podem ser usados em qualquer combinação nas formulações de probióticos. Por exemplo, uma combinação de NP122 e B2 pode ser usada. Alternativamente, NP122 e B2 podem ser usados em combinação com AM0904 ou AM0911. Qualquer outra combinação possível dos isolados bacterianos aqui providos podem também ser feitos. A razão de um isolado para outro em uma combinação de uma formulação de probióticos pode variar dentro de uma ampla faixa. Adequadamente a razão de isolados bacterianos é entre 0.1:1 e 10:1, de forma adequada entre 0.5:1 e 5:1, de forma mais adequada 1:1 para 3:1, de forma mais adequada é entre 1:1 e 2:1. Em uma forma de realização da razão de NP122 para B2 para AM0904 foi 5.5:1. As razões são baseadas nas unidades de formação de colônia (ufc) dos esporos bacterianos após a reativação.

[026] A formulação de probióticos é capaz de melhorar a saúde dos animais após a administração nos animais. Em particular, a formulação de probióticos ou ração animal que englobam a formulação de probióticos é capaz de melhorar a saúde gastrointestinal das aves de criação. lsso pode incluir a redução de incidência ou severidade da enterite necrótica (por ao menos 10%, 15% ou até 20% quando comparado ao controle e mortalidade pode ser prevenido), redução da carga bacteriana nos intestinos do animal, especificamente com relação aos níveis de, ao menos, da Salmonella, Campylobacter ou Clostridium perfringens no trato gastrointestinal das aves de criação (ao menos 50% diminui em recuperação, de forma adequada ao menos 60%, 70%, 80%, 90% ou até mais de uma diminuição na recuperação quando comparado ao controle), e aumento do ganho de peso médio diário de um animal (adequadamente ao menos um aumento de 3% ao menos um aumento de 5%, 7%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60% ou até maior em ganho de peso quando comparado ao controle (meio como ganho médio de peso diário)). A taxa de conversão de alimentação também pode ser aumentada se comparada ao controle. Por exemplo, a taxa de conversão de alimentação pode ser aumentada para 2%, 3%, 5%, 7%, 10% ou mais.

[027] Administração da formulação de probióticos também pode reduzir o nível ou número de patógenos bacterianos de origem alimentar em potencial dos humanos no trato gastrointestinal das aves de criação comerciais. Em particular o nível de Salmonella e Campylobacter spp no trato gastrointestinal de animais administrados com a formulação de probióticos pode ser reduzido quando comparado ao controle de animais não administrados com bactérias formadoras de esporos ou probióticos. Tal redução em carga patogênica humana em potencial no trato gastrointestinal das aves de criação irá limitar a oportunidade de contaminar a cadeia alimentar humana também durante a preparação de carne para consumo humano ou através da contaminação de ovos ou leite.

[028] Esses isolados, formulações de probióticos as quais englobam os isolados ou ração animal as quais englobam os isolados ou combinações dos mesmos podem ser administrados em animais oralmente. A administração oral inclui, porém não limita a, fornecimento em alimentação, água, através de gavagem oral ou spray aerossol. De forma adequada o animal é uma ave de criação, de forma adequada uma galinha ou peru. Caso fornecido em uma alimentação animal, a alimentação pode incluir entre 104 e 10’ cfu de bactérias/gm de alimentação pronta. De forma adequada a alimentação inclui entre 10’ e 5 x 107 cfu bactérias/gm alimentação. A formulação de probióticos pode ser adicionada à alimentação durante a produção, após a produção através do fornecedor ou pela pessoa que alimenta os animais, somente antes de fornecer a alimentação aos animais. As bactérias formadoras de esporos usadas nos métodos e composições descritas pelo presente são particularmente adequadas, pois elas são capazes de sobreviver (como esporos) em condições de pressão e calor do processo de produção de produto de alimentação de granulados secos.

[029] Esses isolados ou combinações de isolados para inclusão nos métodos e incluindo aqueles isolados selecionados e descritos nos Exemplos são selecionados para inclusão em dietas de animais agrícolas para o aumento da saúde gastrointestinal total, melhoria no desempenho de produção, e redução de patógenos bacterianos entéricos de importância para ambos a saúde animal e segurança de alimentos humanos. Esses isolados sozinhos ou em combinação podem ser adicionados às dietas das aves de criação a uma taxa de aproximadamente 104 a 10’ (1.1x107 nos Exemplos) esporos por grama de alimentação acabada para uma taxa de inclusão ótima, caso as bactérias ou composições probióticas sejam administradas de forma contínua. Uma taxa de inclusão maior pode ser necessária caso os esporos das bactérias ou composições são providas de forma intermitente. Durante a administração apesar de a alimentação ser a rota primária de administração, os esporos desses isolados podem também ser administrados através da água potável, por meio de course spray, spray aerossol, ou através de outros meios pelos quais os animais agrícolas podem ingerir esses isolados ou combinação de isolados.

[030] Métodos de isolamento de estirpes de bactérias para inclusão em formulações de probióticos também são fornecidas pelo presente e são representadas nas Figuras 1 e 2. Os métodos incluem ambos os testes in vitro e in vivo para selecionar bactérias de uma fonte e podem ser completas em qualquer ordem. Fontes de isolados bacterianos em potencial incluem fezes animais, amostras de solo ou meio ambiente, estoques de laboratório ou bactérias de tecidos e depósitos de fornecimento de células tais como Coleção de Cultura Tipo Americana (ATCC). As bactérias podem então ser isoladas e selecionadas através da seleção de estirpes bacterianas anaeróbicas facultativas capazes de formar esporos; capazes de reduzir o crescimento de ou eliminar Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Campylobacter jejuni e/ou Clostridium perfringens, capazes de melhorara taxa de crescimento de aves de criação comerciais; capazes de reduzir a severidade da enterite necrótica; capazes de persistir no trato gastrointestinal das aves de criação. Os métodos também incluem a remoção de estirpes bacterianas não consideradas GRAS pela FDA, não elegíveis para inclusão na ração animal pela AAFCO ou aqueles capazes de hemólise. As estirpes bacterianas que seguem esses critérios podem então ser incluídas nas formulações de probióticos.

[031] A presente invenção apresenta isolados exemplares, composições, e métodos para melhorar a saúde do trato gastrointestinal nos animais. Será entendido que a descrição é de realizações exemplares desta invenção, e que a invenção não está limitada às formas específicas mostradas. Várias modificações podem ser feitas na construção e disposição dos elementos apresentados pelo presente sem sair do escopo da invenção. Por exemplo, os vários componentes podem ser suados em várias combinações além daquelas ilustradas nas realizações exemplares, e os vários passos podem ser conduzidos em ordens diferentes. Estas e outras mudanças ou modificações pretendem ser incluídas dentro do escopo da presente invenção.

Exemplo

[032] Amostras ambientais ou amostras fecais das aves de criação foram coletadas usando suabe de algodão estéril e colocadas em um tubo estéril de borossilicato para transporte. Um resumo dos testes in vitro usados para selecionar isolados bacterianos é apresentado na Figura 1. Os suabes também foram imersos em 50% de etanol ou aquecidos a 10°C por 15 minutos antes de serem usados para inocular o Àgar tríptico de soja (TSA) e Spizizen potato agar (SPA) para selecionar Bacillus spp. Após a incubação por 24h e 72h respectivamente a 37°C, as culturas resultantes foram revestidas com um ágar TSA contendo novobiocina (NO) a 25 pg/ml e 106 cfu/ml Salmonella enterica serovar Enteritidis fago tipo 13A (SE) obtida originalmente dos Estados Unidos. Departamento do Laboratório de Serviços Veterinários Nacionais Agrícolas. Após a incubação, aquelas colônias as quais produziram zonas de inibição nos revestimentos SE foram selecionadas para isolação. As colônias selecionadas foram pasteurizadas em 50% de etanol por 30 minutos então isoladas sobre o mesmo meio a partir do qual elas foram selecionadas e incubadas por também 24h (TSA) ou 72h (SPA) a 37°C. A habilidade dos isolados de inibir o crescimento de SE foi confirmado usando um segundo revestimento SE. Aqueles isolados com habilidade in vitro confirmada para inibir o crescimento de SE foram ampliados e selecionados para demais análises.

[033] As placas TSA contendo sangue de ovelha foram inoculadas com os isolados e incubadas por 24h a 37°C. As placas foram então avaliadas e marcadas por nível de hemólise. Todos os isolados causando hemólise alfa ou beta não foram mais avaliadas. Semelhantemente, os demais testes de qualquer isolado cuja morfologia de colônia foi consistente com aquele do grupo B. cereus (B. cereus, B. mycoides, B. thurigensis, e B. anthrasis) foram descontinuados. Aquelas isolados com a maior atividade antimicrobiana in vitro (anti-SE) foram identificados usando o kit de teste bioMerieux AP150 CHB.

[034] Os isolados Bacillus identificados usando os métodos acima foram selecionados para atividade inibitória micro bacteriana in vitro para Clostridium perfringens (CP) e Campylobacter jejuni. Um método de revestimento semelhante como descrito acima foi usado, porém os revestimentos foram incubados de forma anaeróbica e NO não foi adicionado ao meio de revestimento.

[035] Em um esforço para cultivar números altos de esporos viáveis, um meio de fermentação de estado sólido foi usado. Somente isolados os quais foram capazes de crescer e esporular mais que 1x101 de esporos por grama foram selecionados para outra avaliação. Três amostras de cada uma das culturas candidatas esporuladas foram diluidas 1:9 em 0.9°/ de salina estéril. Amostras duplicadas foram sujeitas à temperatura ambiente por 30 minutos ou 100°C por 10 minutos para avaliar a estabilidade do calor dos esporos candidatos. Seguindo os tratamentos de calor, as soluções de esporos foram diluidas, semeadas e incubadas durante a noite a 37°C em placas TSA para determinação de unidade de formação de colônia. Somente isolados cujos esporos perderam menos que 1 log1 unidade após o tratamento térmico foram também avaliados.

[036] Isolados os quais passaram por teste in vitro foram avaliados usando uma série de testes in vivo ilustrados na Figura 2. Esses isolados foram selecionados para outras análises e experimentos in vivo com perus e pintos devido ao desempenho dos mesmos nos testes in vitro. Uma dieta inicial de soja-milho livre de antibiótico para peru, produzida pela Universidade de Arkansas Departamento de Ciências Avícolas (Fayetteville, AR 72701) e formulada para cumprir ou superar os requisitos do Conselho de Pesquisa Nacional para nutrientes críticos de perus jovens e pintos foi usada como dieta basal para estes experimentos. Esporos dos isolados candidatos foram adicionados à dieta basal a uma concentração de aproximadamente 10® cfu/gm de alimentação de misturados com um agitador rotativo por 15 minutos para distribuir esporos ao longo da alimentação.

[037] Frangos/pintos de engorda comerciais e perus comerciais foram obtidos em dia de ninhada e oralmente alimentados por gavagem com Salmonella typhimurium (ST) a uma dose de aproximadamente 105cfu/pinto. Eles foram então repartidos em grupo de forma aleatória: controle negativo (dieta basal) ou um grupo alimentado de dieta basal contendo esporos de um ou mais isolados candidatos (n=20/grupo). Os perus e pintos foram então marcados, pesados, e colocados nos galinheiros fechados apropriados pelo tratamento. Os perus e pintos tiveram pinho fresco fatiado como material para leito e livre acesso para alimentação e água durante a duração do experimento. Na conclusão do experimento, no ou próximo ao dia 10, os pintos e perus foram pesados. As amígdalas foram removidas de forma asséptica e colocadas em Caldo Tetrationato. Os cecos foram homogeneizados e diluidos 1:4 por peso com salina estéril. As contas viáveis totais de ST foram determinadas através de diluições de placas em placas BGA com NO (25pg/mL) e ácido nalidíxico (NA; 20pg/mL) após 24h de incubação a 37°C. As placas foram examinadas pela presença de colônias típicas desta estirpe de SP em meio BGA. Isolados os quais produzem ganhos de peso corporal maiores que o controle e levam a uma recuperação de diminuição de ST foram selecionados para outro teste, enquanto isolados sem sucesso foram descartados.

[038] Isolados bem-sucedidos do teste acima foram novamente incorporados em uma ração de aves de criação como descrito acima. Esporos dos isolados candidatos foram adicionados à dieta basal e misturados com um agitador rotativo por 15 minutos para distribuir esporos ao longo da alimentação. Pintos de corte comerciais foram obtidos em dia de ninhada e alimentados oralmente por gavagem com Salmonella typhimurium (ST). Eles foram então repartidos em grupo de forma aleatória: Controle negativo (dieta basal) ou um grupo alimentado de dieta basal contendo esporos de um ou mais isolados. Os pintos foram então marcados, pesados, e colocados nos galinheiros fechados apropriados pelo tratamento (n=20/grupo). Os pintos tiveram pinho fresco fatiado como material para leito e livre acesso para alimentação e água durante a duração do experimento. A aproximadamente 3 semanas de idade todos os pintos foram pesados então alimentados por gavagem com Eimeria máxima (EM). Nos dias 3-5 após o desafio com EM todos os pintos foram desafiados com Clostridium perfringens. Em ou próximo a 4 semanas de idade todos os pintos foram pesados e os intestinos dos pintos foram atribuídos a uma marcação subjetiva para lesões de enterite necrótica como descrito anteriormente (Doenças Aviárias 51(4):834-839 (2007)). Isolados os quais reduziramsignificantemente (p<0.5) a severidade de enterite necrótica foi mantida para avaliação adicional.

[039] Em um teste subsequente, todos os isolados com êxito foram avaliados por suas habilidades em persistir dentro do trato gastrointestinal de avez de criação comerciais. Pintos de corte comerciais foram obtidos no dia de ninhada então separados em grupos de forma aleatória. Esses pintos foram colocados por grupo em unidades isoladoras. Os pintos foram alimentados uma ração de frango padrão a qual tinha sido esterilizada por calor previamente. Em ou próximo ao dia 7, os grupos individuais (n=20) de pintos de corte foram alimentados por gavagem de forma oral com aproximadamente 10° cfu dos isolados candidatos ou salina estéril (como controle negativo). A persistência dos isolados candidatos foi avaliada pela enumeração de ingestão de aves individuais na maior parte dos experimentos. Muitos dos isolados testados caíram em números de forma acentuada tal que através de 72 horas após gavagem, cfu com menos de 1x103 cfu/Gm ingestão foram enumerados, declinando de forma semelhante para um tempo de passagem esperado do intestino de aproximadamente 46 horas, indicando que estes isolados não estavam reproduzindo dentro do trato intestinal. No entanto, alguns isolados foram redescobertos a níveis maiores que 1x10’ cfu/gm a 96 horas de pós gavagem. Tais isolados foram selecionados para avaliação adicional. Isolados os quais persistiram por mais tempo que sua meia-vida esperada foram selecionados para continuar a avaliação.

[040] Usando os processos de seleção um total de nove isolados foi encontrado a serem úteis potencialmente, sozinhos ou em combinação com outros isolados, como um probiótico ou DFM para uso em aves de criação comerciais. Estes noves isolados incluem estirpes de Bacillus subtillis AM0904 (NRRL Número de Depósito B-50914), AM0911 (NRRL Número de Depósito B-50915), NP122 (NRRL Número de Depósito B-50910), e NP119B (NRRL Número de Depósito B-50909) e B. lichenlformis estirpes para incluir B1 (NRRL Número de Depósito B-50907), B2 (NRRL Número de Depósito B- 50908), RW25 (NRRL Número de Depósito B-50911), RW32 (NRRL Número de Depósito B-50912), e RW41 (NRRL Número de Depósito B- 50913).

[041] Em uma série de testes finais, os isolados forem testados novamente não como isolados individuais, porém em combinação de 2 a 3 isolados. Estas combinações estavam sujeitas aos testes in vivo supracitados e avaliados usando os mesmos parâmetros acima, como também quando comparadas ao desempenho dos isolados individuais nesses mesmos testes. Os isolados de melhor desempenho de combinações de isolados foram usados também em teste de campo de foram consideradas como candidatos em potencial para inclusão em um produto final.

[042] Combinações dos isolados listados acima podem incluir, porém não limitarem a, seguinte: NP122, AM0904 e B2. Esta combinação foi mostrada como eficaz quando administrada na razão de 5:5:1 para isolados NP122, B2 e AM0904 respectivamente.

[043] Quando administrado na alimentação esta combinação foi mostrada como eficaz para produzir uma redução significante (p<0.05) de infecção de Salmonella (50-90% diminuição em recuperação), mortalidade de enterite necrótica e lesões (22% em controles para 0% em tratados), e melhorando o ganho de peso corporal durante os períodos de desafio por mais de 50% quando administrada a uma taxa de 5x10°:5x106:1x106: esporos por grama de alimentação pronta para isolados NP122, B2 e AM0904, respectivamente.

Claims

1. Formulação de probióticos, caracterizada por compreender um isolado bacteriano selecionado do grupo Bacillus subtilis AM0904 (Número de depósito NRRL B-50914), Bacillus subtilis AM0911 (Número de depósito NRRL B-50915), Bacillus subtilis NP122 (Número de depósito NRRL B-50910), Bacillus subtilis NP119B (Número de depósito NRRL B-50909), B. licheniformis B1 (Número de depósito NRRL B-50907), B. subtilis B2 (Número de depósito B-50908), B. licheniformis RW25 (Número de depósito NRRL B-50911), B. licheniformis RW32 (Número de depósito NRRL B-50912) e B. licheniformis RW41 (Número de depósito NRRL B-50913), em que a formulação compreende pelo menos um isolado de Bacillus subtilis e pelo menos um isolado de Bacillus licheniformis, ou pelo menos dois isolados de Bacillus subtilis.

2. Formulação de probióticos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo isolado bacteriano ser capaz de melhorar a saúde do trato gastrointestinal em aves de criação.

3. Formulação de probióticos, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pela melhoria na saúde do trato gastrointestinal englobar pelo menos uma dentre a redução em potencial de patógenos bacterianos de origem alimentar de humanos a partir do trato gastrointestinal de aves de criação comerciais, a redução de pelo menos um dentre Salmonella, Campylobacter ou Clostridium perfringens no trato gastrointestinal de aves de criação, ou o aumento de ganho de peso diário das aves de criação.

4. Formulação de probióticos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela razão de um isolado Bacillus subtilis e um isolado de Bacillus licheniformis, ou dois isolados Bacillus subtilis ser entre 0,5:1 e 3:1 unidades formadoras de colônias (UFC).

5. Formulação de probióticos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelos isolados de Bacillus subtilis compreenderem NP122, AM0904 ou B2.

6. Formulação de probióticos, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelos isolados de Bacillus subtilis NP122, B2 e AM0904 estarem presentes em uma proporção de 5:5:1 unidades formadoras de colônias (UFC).

7. Formulação de probióticos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela formulação ser configurada para ser administrada através de um substrato de ração de animal agrícola.

8. Ração animal compreendendo a formulação de probióticos da reivindicação 1, caracterizada pela alimentação compreender entre 104 e 109 esporos/grama de alimentação pronta.

9. Formulação de probióticos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo isolado bacteriano ser capaz de reduzir a severidade da enterite necrótica em aves de criação e em que os isolados bacterianos não são capazes de hemólise.