ES2553702T3 - Composiciones hemostáticas - Google Patents

Abstract

Composición hemostática que comprende gelatina reticulada en forma particulada adecuada para su uso en la hemostasia, estando presente la composición en forma de una pasta que contiene entre un 15,0 y un 19,5% (p/p) de gelatina reticulada, preferentemente entre un 16,0 y un 19,5% (p/p), entre un 16,5 y un 19,5% (p/p), entre un 17,0 y un 18,5% (p/p) o entre un 17,5 y un 18,5% (p/p), de forma especialmente preferente entre un 16,5 y un 19,0% (p/p) o entre un 16,8 y un 17,8% (p/p), de forma particularmente preferente entre un 16,5 y un 17,5% (p/p), y comprendiendo la composición un potenciador de extrusión, siendo el potenciador de extrusión albúmina en una cantidad entre un 0,5 y un 5,0% (p/p).

Description

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Descripcion

Composiciones hemostaticas

CAMPO DE LA INVENCION

La presente invencion se refiere a composiciones hemostaticas y a procesos para producir dichas composiciones.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Los documentos WO98/008550A, WO2003/007845A o US 2005/284809 A1, por ejemplo, dan a conocer composiciones hemostaticas en una forma con estabilidad de almacenamiento que comprenden un material granular estable seco, biocompatible y biodegradable. Estos productos han sido aplicados con exito en la tecnica de la hemostasia. El Floseal® es un ejemplo de agente hemostatico altamente eficaz que consiste en una matriz de gelatina granular hinchada en una solucion que contiene trombina para formar una pasta fluida.

Dado que estos productos se administran a humanos, es necesario satisfacer los mas altos estandares de seguridad en cuanto a calidad, estabilidad de almacenamiento y esterilidad de los productos finales y de sus componentes. Ademas, la produccion y manipulacion deben ser lo mas practicas y eficientes posible.

Un producto exitoso en este campo (el producto Floseal® arriba mencionado) utiliza una matriz de gelatina en conjugacion con una solucion de trombina liofilizada reconstituida. La matriz de gelatina se aplica como una forma granular fluida de gelatina y trombina, con un contenido en gelatina de aproximadamente el 11 al 14,5%. Un contenido menor de gelatina resulta en un producto muy fluido con rendimiento reducido debido a las dificultades para que el producto permanezca en el punto de tratamiento, en especial bajo condiciones de altos flujossangumeos. Una concentracion mayor de partfculas de gelatina conduce a un producto diffcil de suministrar por los medios de administracion usuales, como jeringuillas o cateteres, debido a la mayor resistencia al flujo. Tambien se ha sugerido la inclusion de plastificantes en la composicion, por ejemplo polietilenglicoles, sorbitol, glicerol y similares (EP0927053B1), que puede disminuir la fuerza de extrusion, pero la inclusion de estos materiales no mejora necesariamente el rendimiento.

Un objeto de la presente invencion es proporcionar una composicion hemostatica basada en una gelatina reticulada con propiedades de adherencia y hemostaticas mejoradas en comparacion con los productos de gelatina de acuerdo con el estado actual de la tecnica, como Floseal, y metodos para producir dichas composiciones hemostaticas. Las composiciones tambien debenan porporcionarse en una forma conveniente y util, en concreto como una pasta fluida para su uso en cirugfa endoscopica y microcirugfa. Los productos deben tener una fuerza de extrusion de 40 N o menos, preferentemente menos de 35 N, de forma especialmente preferente menos de 20 N. Preferiblemente, los productos deben proporcionarse en formatos de producto que permitan una provision conveniente de composiciones hemostaticas "listas para el uso", que se puedan aplicar directamente en una lesion sin un paso de reconstitucion de larga duracion.

SUMARIO DE LA INVENCION

Asf, la presente invencion proporciona una composicion hemostatica que comprende gelatina reticulada en forma particulada adecuada para su uso en la hemostasia, estando presente la composicion en forma de una pasta que contiene entre un 15,0 y un 19,5% (p/p) de gelatina reticulada, preferentemente entre un 16,0 y un 19,5% (p/p), entre un 16,5 y un 19,5% (p/p), entre un 17,0 y un 18,5% (p/p) o entre un 17,5 y un 18,5% (p/p), de forma especialmente preferente entre un 16,5 y un 19,0% (p/p) o entre un 16,8 y un 17,8% (p/p), de forma particularmente preferente entre un 16,5 y un 17,5% (p/p), y comprendiendo la composicion un potenciador de extrusion, siendo el potenciador de extrusion albumina en una cantidad entre un 0,5 y un 5,0% (p/p).

La invencion tambien se refiere al uso de esta composicion hemostatica para el tratamiento de una lesion seleccionada de entre el grupo consistente en una herida, una hemorragia, tejido danado y/o tejido sangrante, incluyendo la administracion de una composicion hemostatica, y kits para producir una composicion hemostatica de este tipo para el tratamiento de dicha lesion.

DESCRIPCION DE REALIZACIONES ESPEdFICAS DE LA INVENCION

La presente invencion proporciona una composicion hemostatica que comprende gelatina reticulada en forma particulada adecuada para su uso en la hemostasia, estando presente la composicion en forma de una pasta que contiene entre un 15,0 y un 19,5% (p/p) de gelatina reticulada (= peso de gelatina reticulada seca por peso de la composicion final), preferentemente entre un 16,0 y un 19,5% (p/p), entre un 16,5 y un 19,5% (p/p), entre un 17,0 y un 18,5% (p/p) o entre un 17,5 y un 18,5% (p/p), de forma especialmente preferente

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entre un 16,5 y un 19,0% (p/p) o entre un 16,8 y un 17,8% (p/p), de forma particularmente preferente entre un 16,5 y un 17,5% (p/p), y comprendiendo la composicion un potenciador de extrusion, siendo el potenciador de extrusion albumina en una cantidad entre un 0,5 y un 5,0% (p/p).

En el curso de la presente invencion se ha comprobado sorprendentemente que la provision de potenciadores de extrusion, como albumina, en la cantidad apropiada, permite el uso de mayores concentraciones de gelatina, y que el uso de mayores concentraciones de gelatina mejora las propiedades hemostaticas de estos productos. Este es un efecto que no ha sido sugerido con anterioridad. Ademas, tambien resulto sorprendente que una mayor concentracion de gelatina reticulada condujera a mejores propiedades de adhesion (a diferencia de los resultados conocidos en el estado anterior de la tecnica (por ejemplo, en la Fig. 4 de WO2008/076407A2).

Para facilitar las propiedades preferentes debido a las mayores concentraciones de gelatina en la pasta de acuerdo con la presente invencion es necesario proporcionar los potenciadores de extrusion en cantidades apropiadas. Las cantidades deben ser lo suficientemente altas como para obtener el efecto de extrusion, es decir, para obtener una pasta fluida incluso con cantidades entre un 15 y un 19,5% de gelatina reticulada, de modo que la composicion hemostatica se pueda aplicar por ejemplo en microcirugfa. Por otro lado, las cantidades deben ser lo suficientemente bajas como para evitar propiedades funcionales negativas de la composicion hemostatica, por ejemplo adherencia a heridas o rendimiento hemostatico. El potenciador de extrusion de albumina (en especial seroalbumina humana) debe ser suministrado en una cantidad entre un 0,5 y un 5,0% (p/p) (= peso del potenciador de extrusion por peso de composicion final), preferentemente entre un 1,0 y un 5,0% (p/p), preferentemente entre un 2,0 y un 4,5% (p/p), de forma especialmente preferente entre un 1,5 y un 5,0% (p/p), de forma particularmente preferente aproximadamente un 1,5% (p/p).

Otra clase de potenciadores de extrusion son los fosfolfpidos, como fosfatidilcolina y fosfatidilserina, o mezclas complejas tales como lecitinas o aceites de soja.

En otra realizacion preferente, la presente invencion proporciona una composicion hemostatica que comprende gelatina reticulada en forma particulada adecuada para su uso en la hemostasia, estando presente la composicion en forma de una pasta que contiene entre un 16,0 y un 19,5% (p/p), preferentemente entre un 16,5 y un 19,5% (p/p), entre un 17,0 y un 18,5% (p/p) o entre un 17,5 y un 18,5% (p/p), de forma especialmente preferente entre un 16,5 y un 19,0% (p/p) o entre un 16,8 y un 17,8% (p/p), de forma particularmente preferente entre un 16,5 y un 17,5% (p/p), y comprendiendo la composicion el potenciador de extrusion consistente en albumina. Preferentemente, el potenciador de extrusion es seroalbumina humana.

En otra realizacion preferente, la presente invencion proporciona una composicion hemostatica gelatina reticulada en forma particulada adecuada para su uso en hemostasia, estando presente la composicion en forma de una pasta que contiene entre un 15,0 y un 19,5% (p/p) de gelatina reticulada, preferentemente entre un 16,0 y un 19,5% (p/p), entre un 16,5 y un 19,5% (p/p), entre un 17,0 y un 18,5% (p/p) o entre un 17,5 y un 18,5% (p/p), de forma especialmente preferente entre un 16,5 y un 19,0% (p/p) o entre un 16,8 y un 17,8% (p/p), en particular entre un 16,5 y un 17,5% (p/p), y comprendiendo la composicion un potenciador de extrusion en una concentracion de mas de un 0,8% (p/p), de forma preferente aproximadamente un 3,3% (p/p). El potenciador de extrusion es preferiblemente seroalbumina humana, por ejemplo en las concentraciones arriba mencionadas.

Las composiciones hemostaticas de la presente invencion tienen ventajas espedficas con respecto a las composiciones donde se utilizan cantidades menores de gelatina reticulada (entre un 13 y un 14,5%), en especial tienen una mayor eficacia in vivo. Inesperadamente, en el curso de la presente invencion se puso de manifiesto que una formulacion con una mayor concentracion de partfculas de gelatina conduce a un mayor rendimiento hemostatico tanto en metodos de ensayo ex vivo, que utilizan sangre humana total, como en experimentos preclmicos con animales. Los productos segun la presente invencion posibilitan un menor tiempo de cirugfa y una mayor rapidez de hemostasia.

Las composiciones segun la presente invencion tienen una fuerza de extrusion media (empleando el metodo de ensayo descrito en el ejemplo 1) de 40 N o menos, preferentemente menos de 35 N, de forma especialmente preferente menos de 20 N.

De acuerdo con la realizacion preferente de la presente invencion, la composicion hemostatica comprende gelatina reticulada con glutaraldehudo o gelatina reticulada con genipm ((7R,2R,6S)-2-hidroxi-9-(hidroximetil)- 3-oxabiciclo[4.3.0]nona-4,8-dieno-5-carboxilato de metilo), preferiblemente gelatina de tipo B, de forma especialmente preferente gelatina de tipo B de origen oculto.

Preferentemente, la gelatina reticulada esta presente como un material granular.

La composicion hemostatica segun la presente invencion comprende preferentemente un polfmero de gelatina que, en especial, es un polfmero de gelatina de tipo B. La gelatina de tipo B ha demostrado ser

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espedficamente ventajosa para su uso en agentes hemostaticos, ya que el tratamiento de base es altamente eficaz para generar gelatina con propiedades apropiadas y para mitigar el riesgo de infeccion viral y zoonotica. Una preparacion de gelatina espedficamente preferente se puede preparar procesando corion de bovino joven con NaOH 2N durante aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente, neutralizandolo a pH 7-8 y calentandolo a 70°C. El corion se solubiliza despues por completo a gelatina con un 3-10% (p/p), preferentemente un 7-10% (p/p), de gelatina en solucion. Esta solucion se puede moldear, secar y moler para obtener polvo de gelatina de tipo B.

Preferentemente, la gelatina tiene una fuerza Bloom de 200 a 400, en especial una gelatina de tipo B con una fuerza Bloom de 200 a 400. Bloom es un ensayo para medir la fuerza de la gelatina. El ensayo determina el peso (en gramos) que necesita una sonda (normalmente con un diametro de 1,27 cm, 0,5 pulgadas) para desviar la superficie del gel 4 mm sin romperla. El resultado se expresa en Bloom (grados). Para realizar el ensayo Bloom en gelatina, una solucion de gelatina al 6,67% se mantiene durante 17-18 horas a 10°C antes del ensayo.

La composicion hemostatica de acuerdo con la presente invencion contiene preferentemente la gelatina reticulada en forma particulada, en especial como un material granular. Este material granular se puede hinchar rapidamente cuando se expone a un fluido (es decir, el diluyente) y en esta forma hinchada puede contribuir a formar una pasta fluida que se puede aplicar a un sitio sangrante. De acuerdo con una realizacion preferente, la gelatina reticulada se proporciona a partir de una gelatina reticulada seca. Este polvo de gelatina reticulada seca se puede preparar para que se rehidrate rapidamente al entrar en contacto con un diluyente farmaceuticamente aceptable. Los granulos de gelatina, en especial en forma de un polvo de gelatina, comprenden preferentemente partfculas relativamente grandes, tambien denominadas fragmentos o subunidades, tal como se describe en los documentos WO98/08550A y WO2003/007845A. Un tamano de partfcula (mediana) preferente oscila entre 10 y 1.000 pm, preferentemente entre 200 y 800 pm, pero en muchas circunstancias se pueden utilizar tamanos de partfcula fuera de este intervalo preferente.

Normalmente, las partfculas de gelatina tienen un diametro de partfcula medio ("diametro de partfcula medio" es la mediana del tamano medido por difractometna laser; la "mediana del tamano" (o diametro de partfcula mediano en masa) es el diametro de partfcula que divide la distribucion de frecuencias por la mitad; un cincuenta por ciento de las partfculas de una preparacion dada tiene un diametro mayor y un cincuenta por ciento de las partfculas tiene un diametro menor) de 10 a 1.000 pm, preferentemente de 50 a 700 pm, de 200 a 700 pm, de 300 a 550 pm, de forma especialmente preferente de 350 a 550 pm (mediana del tamano). Aunque los terminos polvo y granular (o granulados) se utilizan a veces para diferentes clases de material independientes, el concepto "polvos" se define aqu como una subclase especial de materiales granulares. En particular, el concepto "polvos" se refiere a aquellos materiales granulares que tienen los tamanos de grano mas finos y que, por tanto, tienen una mayor tendencia a aglutinarse al fluir. Los granulos incluyen materiales granulares mas gruesos que no tienden a aglutinarse excepto cuando estan humedos.

La presente gelatina reticulada en forma particulada adecuada para su uso en la hemostasia puede incluir formas dimensionalmente isotropicas o no isotropicas. Por ejemplo, la gelatina reticulada en el kit de acuerdo con la presente invencion puede consistir en granulos o fibras; y puede estar presente en estructuras discontinuas, por ejemplo en formas en polvo.

La composicion de gelatina seca es absorbente de lfquidos. Por ejemplo, al entrar en contacto con lfquidos, por ejemplo soluciones o suspensiones acuosas (en especial un tampon o sangre), la gelatina reticulada absorbe el lfquido y presenta un grado de hinchamiento, dependiendo de la magnitud de la hidratacion. El material preferentemente absorbe entre al menos un 400%, de forma preferente aproximadamente un 500% y aproximadamente 2.000%, en especial entre aproximadamente un 500% y aproximadamente un 1.300% de agua o tampon acuoso en peso, lo que corresponde a un aumento nominal del diametro o la anchura de una partfcula o subunidad individual por ejemplo entre aproximadamente un 50% y aproximadamente un 500%, normalmente entre aproximadamente un 50% y aproximadamente un 250%. Por ejemplo, si las partfculas granulares (secas) tienen un intervalo de tamano preferente de 0,01 mm a 1,5 mm, en especial de 0,05 mm a 1 mm, la composicion totalmente hidratada (por ejemplo, despues de la administracion en una herida o despues de contacto con una solucion tampon acuosa), puede tener un intervalo de tamano de 0,05 mm a 3 mm, en especial de 0,25 mm a 1,5 mm.

Las composiciones secas tambien presentaran un considerable "hinchamiento de equilibrio" cuando se exponen a un medio de rehidratacion acuoso (= diluyente farmaceuticamente aceptable, tambien denominado medio de reconstitucion). Preferentemente, el hinchamiento oscilara entre un 400% y un 1.300%, preferentemente entre un 400% y un 1.000%, de forma especialmente preferente entre un 500% y un 1100%, de forma particularmente preferente entre un 500% y un 900%, dependiendo de su uso previsto. Este hinchamiento de equilibrio se puede controlar, por ejemplo (en caso de un polfmero reticulado) variando el grado de reticulacion, lo que a su vez se logra variando las condiciones de reticulacion, como la duracion de la exposicion a un agente reticulante, la concentracion de agente reticulante, la temperatura de reticulacion y similares. Materiales con valores de hinchamiento de equilibrio diferentes se comportan de modo diferente en

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diferentes aplicaciones. La capacidad para controlar la reticulacion y el hinchamiento de equilibrio permite optimizar las composiciones de la presente invencion para diversos usos. Ademas del hinchamiento de equilibrio, tambien es importante controlar la hidratacion del material inmediatamente antes de suministrarlo a un lugar objetivo. Evidentemente, la hidratacion y el hinchamiento de equilibrio estan mtimamente relacionados. Un material con un 0% de hidratacion no estara hinchado. Un material con un 100% de hidratacion estara en su equilibrio de contenido de agua. Las hidrataciones entre el 0% y el 100% corresponderan a un hinchamiento entre las cantidades minima y maxima. El "hinchamiento de equilibrio" se determinara restando el peso seco del polvo de hidrogel de gelatina de su peso cuando esta completamente hidratado y, en consecuencia, completamente hinchado. Despues, la diferencia se divide entre el peso seco y se multiplica por 100 para obtener la magnitud del hinchamiento. El peso seco se debena medir despues de exponer el material a una temperatura elevada durante un tiempo suficiente para eliminar esencialmente toda la humedad residual, por ejemplo durante dos horas a 120°C. La hidratacion de equilibrio del material se puede lograr sumergiendo el material seco en un diluyente farmaceuticamente aceptable, como una solucion salina acuosa, durante un penodo de tiempo suficiente para que el contenido en agua se mantenga constante, normalmente entre 18 y 24 horas, a temperatura ambiente.

La gelatina reticulada se puede suministrar en forma de una pelmula, que despues se puede moler para formar un material granular. La mayor parte de las partmulas contenidas en un el granular (por ejemplo mas de un 90% p/p) preferiblemente tienen un tamano de partmula de 10 a 1.000 pm, preferentemente de 50 a 700 pm, de 200 a 700 pm, de 300 a 550 pm, de forma especialmente preferente de 350 a 550 pm.

Preferiblemente, la forma fluida de la composicion hemostatica contiene partmulas de las que mas de un 50% (p/p) tienen un tamano de 100 a 1.000 pm, preferentemente mas de un 80% (p/p) tienen un tamano de 100 a

1.000 pm.

Ejemplos de materiales de gelatina adecuados para la reticulacion se describen, entre otros, en los ejemplos 1 y 2 del documento EP 1803417 B1 y en el ejemplo 14 de los documentos US 6.066.325 A y US 6.063.061 A. La gelatina tambien puede emplearse con ayudas de procesamiento, como PVP, PEG y/o dextrano como ayudas de rehidratacion.

En un aspecto particular de la presente invencion, las composiciones comprenden polvo de gelatina reticulada con un contenido en humedad de un 20% (p/p) o inferior, habiendo sido reticulado el polvo en presencia de una ayuda de rehidratacion, de modo que el polvo presenta una tasa de rehidratacion acuosa que es al menos un 5% mayor que la tasa de rehidratacion de un polvo similar preparado sin la ayuda de rehidratacion. De acuerdo con el documento EP 1803417 B1, la "tasa de rehidratacion" se define como la cantidad de solucion acuosa, normalmente solucion salina al 0,9% (p/p), que es absorbida por gramo de polvo (con respecto al peso seco) en un plazo de treinta segundos, expresada como g/g. La tasa de rehidratacion se mide mezclando la gelatina reticulada con la solucion salina durante 30 segundos y depositando la gelatina humeda sobre una membrana de filtro bajo vacm para eliminar la solucion acuosa libre. Despues se registra el peso de la gelatina humeda retenida en el filtro, se seca (por ejemplo 2 horas a 120°C), se registra el peso seco de la gelatina y se calcula el peso de la solucion que ha sido absorbida por gramo de gelatina seca.

Las composiciones preferentes de la presente invencion tienen una tasa de rehidratacion de al menos 3 g/g, preferentemente al menos 3,5 g/g, y con frecuencia 3,75 g/g o mas. Las tasas de rehidratacion de polvos similares preparados sin las ayudas de rehidratacion son normalmente inferiores a tres, y un aumento porcentual de la tasa de rehidratacion sera normalmente de al menos el 5%, preferentemente al menos el 10% y de forma especialmente preferente al menos el 25% o mas.

La reticulacion se puede llevar a cabo con cualquier reticulante adecuado, por ejemplo glutaraldehfdo, tal como se describe, por ejemplo, en los documentos WO98/08550A y WO2003/007845A. La reticulacion tambien se puede llevar a cabo con un reticulante no toxico, como genipm y similares.

El coste de produccion es menor en caso de un producto de gelatina reticulada con genipm segun la presente invencion que en caso de un producto de gelatina reticulada con glutaraldehfdo, ya que los costes de reactivo, energfa y tiempo son menores. La reaccion de gelatina reticulada con genipm se puede llevar a cabo en agua a pH neutro, a temperatura ambiente, durante un tiempo < 16 horas. El producto se puede limpiar mediante lavado con etanol y/o agua, que no solo es mas barato, sino que tambien, y aun mas importante, es mas seguro para el operador.

El metodo preferentemente aplica la gelatina presente en forma seca antes del paso de reticulacion.

El reticulante de tipo genipm preferente de acuerdo con la invencion es, evidentemente, genipm ((1R,2R,6S)- 2-hidroxi-9-(hidroximetil)-3-oxabiciclo[4.3.0]-nona-4,8-dieno-5-carboxilato de metilo); no obstante, tambien se pueden utilizar otros reticulantes de tipo iridoide o secoiridoide, como oleuropema. Las concentraciones

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preferentes de genipm para la reticulacion oscilan entre 0,5 y 20 mM, preferentemente entre 1 y 15 mM, en especial entre 2 y 10 mM.

De acuerdo con una realizacion preferente de la presente invencion, la gelatina reticulada con genipm se somete a un paso de extincion/oxidacion con agentes oxidantes como ^a, tBu-hidroperoxido, etc., preferentemente a un tratamiento con percarbonato de sodio, hipoclorito de sodio, agua clorada o peroxido de hidrogeno (H2O2), siendo especialmente preferente un tratamiento cono percarbonato de sodio o H2O2 y particularmente preferente un tratamiento con percarbonato.

Las concentraciones de H2O2 preferentes son del 0,5 al 20% (p/p), en especial del 1 al 15% (p/p), de forma particularmente preferente de aproximadamente el 5% (p/p). En una realizacion especialmente preferente, la concentracion de genipm oscila entre 5 y 10 mM, el tiempo de reaccion de gelatina con genipm oscila entre 3 y 10 horas, en especial 6 horas, la concentracion de H2O2 oscila entre el 3 y el 5% (p/p) y el tiempo de reaccion de la gelatina reticulada con genipm con H2O2 es de aproximadamente 20 horas.

Las concentraciones de percarbonato preferentes oscilan entre el 1 y el 10% (p/p), en especial entre el 1 y el 5% (p/p), de forma particularmente preferente entre el 1 y el 4% (p/p). En una realizacion especialmente preferente, la concentracion de genipm oscila entre 5 y 10 mM (en especial es de aproximadamente 8 nM), el tiempo de reaccion de la gelatina con genipm oscila entre 3 y 10 horas (en especial es de aproximadamente 5 horas), la concentracion de percarbonato oscila entre el 1 y el 10% (p/p), de forma especialmente preferente entre el 1 y el 4% p/p, y el tiempo de reaccion de la gelatina reticulada con genipm con percarbonato oscila entre 1 y 20 horas, preferentemente entre 1 y 5 horas (por ejemplo 1, 2 o 3 horas).

La extincion tambien se puede llevar a cabo en presencia de antioxidantes tales como ascorbato de sodio, o controlando el potencial de oxidacion del entorno de reaccion, por ejemplo llevando a cabo la extincion y/o la reaccion de genipm en una atmosfera inerte, como nitrogeno o argon.

Las condiciones de la reaccion de reticulacion preferentes incluyen la realizacion en solucion acuosa, preferentemente en solucion salina tampon fosfato (PBS)/tampon etanol, en especial a un pH de 4 a 12, preferentemente de 5,0 a 10,0, en especial de 6 a 8, o en agua desionizada u otros tampones acuosos que pueden contener entre un 0 y un 50% de un disolvente organico miscible con agua. Un ejemplo de tampon PBS contiene NaCl 137 mM, KCI 2,7 mM, Na2HPO410 mM2 H2O, KH2PO41,76 mM (pH = 7,4). Otro ejemplo de tampon PBS esNaCl 137 mM, KCI 2,7 mM, Na2HPO4 4,3 mM y KH2PO41,4 mM (pH = 7,5).

La reaccion tambien se puede llevar a cabo en un tampon acuoso que contiene hasta un 50% de un disolvente organico miscible con agua y/o ayudas de procesamiento, como PEG, PVP, manitol, percarbonato de sodio, lactato de sodio, citrato de sodio, ascorbato de sodio, etc.

Preferentemente, el paso de reticulacion se lleva a cabo a una temperatura de 4°C a 45°C, preferentemente de 15 a 45°C, en especial de 20 a 40°C.

El paso de reticulacion puede ir seguido de un paso de extincion, en especial con un agente de extincion que contiene grupos amino, preferentemente un aminoacido, en especial glicina. Con el agente de extincion, los reticulantes de tipo genipm todavfa no reaccionados se inactivan (por ejemplo por reaccion con el agente de extincion en exceso) para evitar que continue la reticulacion. La extincion tambien se puede llevar a cabo aumentando el pH de la solucion a un valor entre 8 y 14, o utilizando compuestos nucleofilos que contienen grupos amino, tiol o hidroxilo, y tambien mediante una combinacion de aumento del pH y utilizacion de compuestos nucleofilos. El paso de extincion despues de la reaccion de reticulacion de genipm-gelatina de acuerdo con la presente invencion se puede dirigir activamente para impartir el comportamiento ffsico deseado, como el hinchamiento y TEG, que son determinantes importantes de la actividad hemostatica por encima y mas alla de la reticulacion general con genipm por sf sola.

Preferentemente, la gelatina reticulada se lava despues del paso de reticulacion, preferiblemente con metanol, etanol o agua, en especial con agua desionizada. Otro paso de lavado preferente aplica un tampon acuoso que contiene hasta un 50% (v/v) de disolvente organico miscible con agua y/o una o mas ayudas de procesamiento.

De acuerdo con una realizacion preferente, la gelatina reticulada se seca. Una vez en estado seco, la composicion hemostatica es estable en almacenamiento durante un penodo de tiempo largo incluso a temperaturas elevadas, por ejemplo mas de 20°C, mas de 30°C o incluso mas de 40°C. Las condiciones de sequedad preferentes incluyen polfmeros biocompatibles reticulados que se secan hasta que tienen un contenido de humedad inferior al 15% (p/p), preferentemente inferior al10%, de forma especialmente preferente inferior al5%, en particular inferior al 1%. En otra realizacion preferente, el producto se puede suministrar en un estado hidratado o humedo, pudiendo consistir la solucion hidratante en un tampon o una solucion biocompatible. Un producto de Glu-Gel tiene tendencia a camuflarse en el tejido circundante, ya que su color ligeramente amarillo se mezcla con este. Esto hace que la evaluacion visual de la aplicacion deseada

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resulte problematica. Los productos de gelatina reticulada con genipm de acuerdo con la presente invencion presentan un color variable desde amarillo claro hasta azul oscuro o verde, segun el grado de las condiciones de la reaccion de reticulacion y los posteriores pasos de procesamiento y acabado. Esta posibilidad de ajustar el color y la capacidad para obtener el color deseado del producto acabado tienen la ventaja anadida de proporcionar a los medicos una indicacion visual de una aplicacion apropiada del producto en sitios de lesion, ya que su color lo diferencia del tejido circundante, en lugar de camuflarlo potencialmente. Esta es otra caractenstica nueva de esta invencion. Por otro lado, el color se puede eliminar para obtener un producto incoloro, dependiendo de las necesidades con respecto a los productos finales.

En una realizacion preferente, el polfmero biocompatible, por ejemplo gelatina, reticulado con un reticulante de tipo genipm, por ejemplo genipm, es un polfmero reticulado homogeneamente (uniformemente), tal como se puede comprobar por ejemplo por mediciones de fluorescencia, como se describe en el Ejemplo 3 de la presente solicitud. En una realizacion especialmente preferente, el polfmero biocompatible, como gelatina, esta presente como un polfmero biocompatible reticulado homogeneamente con genipm, como gelatina, en forma particulada.

Es preferible una composicion hemostatica de acuerdo con la presente invencion que incluye excipientes, como lubricantes, por ejemplo acido hialuronico.

En otra realizacion de la presente invencion estan excluidos los excipientes, como lubricantes, por ejemplo acido hialuronico.

El diluyente farmaceuticamente aceptable preferentemente es una solucion acuosa y puede contener una sustancia seleccionada entre el grupo consistente en NaCl, CaCl2 y acetato de sodio. Por ejemplo, un diluyente farmaceuticamente aceptable comprende agua para inyeccion y (independientemente entre sf) NaCl de 50 a 200 mM (preferentemente 150 mM), CaCl2 de 10 a 80 mM (preferentemente 40 mM) y acetato de sodio de 1 a 50 mM (preferentemente 20 mM). En otra realizacion, el diluyente farmaceuticamente aceptable comprende menos de 35 g/l de manitol, preferentemente menos de 25 g/l, de forma especialmente preferente menos de 10 g/l, y de forma particularmente preferente el diluyente farmaceuticamente aceptable esta esencialmente libre de manitol.

De acuerdo con una realizacion preferente, el diluyente farmaceuticamente aceptable comprende trombina, preferentemente de 10 a 1.000 U.I. trombina/ml, en especial de 250 a 700 U.I. trombina/ml. Preferiblemente, la composicion hemostatica en esta forma lista para el uso contiene de 10 a 100.000 Unidades Internacionales (U.I.) de trombina, de forma especialmente preferente de 100 a 10.000 U.I., en particular de 500 a 5.000 U.I. La trombina (o cualquier otro agente inductor de la coagulacion, como veneno de serpiente, un activador plaquetario, un peptido activador de receptores de trombina y un agente precipitador de fibrinogeno) se puede derivar de cualquier preparacion de trombina que sea adecuada para su uso en humanos (es decir, farmaceuticamente aceptable). Fuentes de trombina adecuadas incluyen sangre, plasma o suero humano y bovino (tambien se puede utilizar trombina de otras fuentes animales si no se preve ninguna reaccion inmunologica adversa), la trombina de origen recombinante (por ejemplo trombina recombinante humana) y la trombina humana autologa pueden ser preferibles para algunas aplicaciones.

El diluyente farmaceuticamente aceptable se utiliza en una cantidad adecuada para obtener la concentracion final deseada en la composicion lista para el uso. La preparacion de trombina puede contener otros componentes utiles, como iones, tampones, excipientes, estabilizadores, etc. Preferentemente, la preparacion de trombina contiene albumina humana como potenciador de extrusion. Las sales preferentes son NaCl y/o CaCl2, ambas utilizadas en las cantidades y concentraciones usuales aplicadas para trombina (por ejemplo del 0,5 al 1,5% de NaCl (por ejemplo el 0,9%) y/o CaCl2 de 20 a 80 mM (por ejemplo 40 mM)).

En otra realizacion, el diluyente tambien puede incluir un tampon o sistema tampon para tamponar el pH de la composicion seca reconstituida, preferentemente a un pH de 3,0 a 10,0, de forma especialmente preferente de 6,4 a 7,5, en particular a un pH de 6,9 a 7,1.

El establecimiento de cantidades apropiadas de gelatina reticulada, diluyente y potenciador de extrusion se puede realizar en el kit de acuerdo con los prerrequisitos arriba mencionados: por ejemplo, se puede proporcionar un vial con 0,736 a 0,995 g de gelatina reticulada seca (correspondientes a una proporcion del

15,0 al 19,5% (p/p) en el producto final), b) un segundo vial con 4 ml de diluyente con 60 a 240 mg de albumina y, opcionalmente, trombina en una concentracion de 500 U.I./ml y/o CaCl2 40 mM. Alternativamente se puede anadir albumina en forma liofilizada al componente de gelatina seca a) del kit. Por ejemplo, se puede proporcionar un vial con 0,573 a 0,775 g de gelatina reticulada seca (correspondientes a una proporcion del 15,0 al 19,5% (p/p) en el producto final), de los que 48 a 192 mg son albumina, b) un segundo vial con 3,2 ml de diluyente con 60 a 240 mg de albumina y, opcionalmente, trombina en una concentracion de 500 U.I./ml y/o CaCh 40 mM.

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El componente de gelatina reticulada del kit de acuerdo la presente invencion se proporciona preferentemente en forma de una composicion seca, estando presente la gelatina reticulada en forma seca.

Una composicion de gelatina reticulada esencialmente seca de acuerdo con la presente invencion tiene un contenido residual de humedad que corresponde al contenido de humedad de productos comparables disponibles, como Floseal® (el Floseal, por ejemplo, tiene una humedad de aproximadamente un 8-12% como producto seco).

La gelatina reticulada seca en forma particulada adecuada para su uso en hemostasia en el kit de acuerdo con la presente invencion es preferentemente gelatina en forma de polvo, en especial teniendo las partfculas de polvo una mediana del tamano de partfcula de 10 a 1.000 pm, preferentemente de 50 a 700 pm, de 200 a 700 pm, de 300 a 550 pm, de forma especialmente preferente de 350 a 550 pm. Por ejemplo, el documento WO98/08550A da a conocer en principio una "preparacion granular seca de gelatina reticulada" de acuerdo con la presente invencion. Preferentemente, la gelatina reticulada es un material granular estable, seco, biocompatible y biodegradable.

De acuerdo con otro aspecto, la presente invencion se refiere a una composicion hemostatica de acuerdo con la presente invencion para su uso en el tratamiento de una lesion seleccionada de entre el grupo consistente en una herida, una hemorragia, tejido danado, tejido sangrante y/o defectos oseos.

De acuerdo con otro aspecto, la presente invencion tambien proporciona un metodo para suministrar una composicion hemostatica de acuerdo con la invencion a un lugar objetivo en el cuerpo de un paciente, consistiendo dicho metodo en suministrar una composicion hemostatica producida mediante el proceso de acuerdo con la presente invencion al lugar objetivo. Aunque la composicion seca tambien se puede aplicar directamente en el lugar objetivo (y, opcionalmente, ponerla en contacto con un diluyente en el lugar objetivo, en caso necesario), es preferible poner en contacto la composicion hemostatica seca con un diluyente farmaceuticamente aceptable antes de la administracion en el lugar objetivo, para obtener una composicion hemostatica de acuerdo con la presente invencion en forma de pasta.

En este metodo se puede aplicar un kit para preparar una pasta fluida de gelatina reticulada para el tratamiento de una lesion seleccionada entre el grupo consistente en una herida, una hemorragia, tejido danado y/o tejido sangrante, incluyendo dicho kit

a) una composicion hemostatica seca que incluye gelatina reticulada en forma particulada para ser reconstituida en una pasa fluida que contiene entre un 15,0 y un 19,5% (p/p) de gelatina reticulada (= el peso de la gelatina seca con respecto al peso de la composicion final), preferentemente entre un 16,0 y un 19,5% (p/p), entre un 16,5 y un 19,5% (p/p), entre un 17,0 y un 18,5% (p/p) o entre un 17,5 y un 18,5% (p/p), de forma especialmente preferente entre un 16,5 y un 19,0% (p/p) o entre un 16,8 y un 17,8% (p/p), de forma particularmente preferente entre un 16,5 y un 17,5% (p/p), de gelatina reticulada, y

b) un diluyente farmaceuticamente aceptable para la reconstitucion de la composicion hemostatica, comprendiendo la composicion o el diluyente el potenciador de extrusion albumina en una cantidad que conduce a una concentracion de albumina en la pasta reconstituida entre un 0,5 y un 5,0% (p/p) (= peso de potenciador de extrusion por peso de composicion final), preferentemente entre un 1,0 y un 5,0% (p/p), preferiblemente entre un 2,0 y un 4,5% (p/p), de forma especialmente preferente entre un 1,5 y un 5,0% (p/p), de forma particularmente preferente aproximadamente un 1,5% (p/p).

Otro componente preferente de dicho kit (espedficamente si el kit incluye la composicion hemostatica en forma seca) es un diluyente para la reconstitucion (= medio de rehidratacion) de la composicion hemostatica. Otros componentes del kit pueden ser medios de administracion, como jeringuillas, cateteres, pinceles, etc. (si las composiciones no se suministran ya en el medio de administracion) u otros componentes necesarios para la practica (quirurgica) medica, como agujas o cateteres de repuesto, viales adicionales u otros medios de cubrimiento de heridas. Preferentemente, el kit de acuerdo con la presente invencion comprende una jeringuilla que aloja la composicion hemostatica seca y estable y una jeringuilla que contiene el diluyente (o prevista para extraer el diluyente de otro recipiente de diluyente).

En una realizacion preferente, el diluyente farmaceuticamente aceptable se suministra en un recipiente independiente. Este puede consistir preferiblemente en una jeringuilla. El diluyente en la jeringuilla se puede aplicar facilmente al recipiente final para la reconstitucion de las composiciones hemostaticas de acuerdo con la presente invencion. Si el recipiente final es tambien una jeringuilla, las dos jeringuillas se pueden disponer juntas en un envase. Por consiguiente, es preferible suministrar las composiciones hemostaticas de acuerdo con la presente invencion en una jeringuilla que esta suplementada con una jeringuilla de diluyente con un diluyente farmaceuticamente aceptable para reconstituir dicha composicion hemostatica seca y estable.

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De acuerdo con una realizacion preferente, el recipiente final contiene ademas una cantidad de un estabilizador eficaz para inhibir la modificacion del poUmero al exponerlo a la radiacion de esterilizacion, preferentemente acido ascorbico, ascorbato de sodio, otras sales de acido ascorbico, o un antioxidante.

Con dicho diluente farmaceuticamente aceptable se puede suministrar una forma lista para el uso de la presente composicion hemostatica. que se puede aplicar despues directamente al paciente. Por tanto, tambien se proporciona un metodo para suministrar una forma lista para el uso de una composicion hemostatica de acuerdo con la presente invencion, done la composicion hemostatica se suministra en una primera jeringuilla y un diluyente para reconstitucion se suministra en una segunda jeringuilla, la primera y la segunda jeringuilla estan conectadas entre sf, y el fluido se introduce en la primera jeringuilla para producir una forma fluida de la composicion hemostatica; y opcionalmente la forma fluida de la composicion hemostatica se devuelve a la segunda jeringuilla al menos una vez. Preferentemente, las preparaciones listas para el uso se presentan o suministran como hidrogeles. En principio, en la tecnica se conocen productos de este tipo, pero en un formato diferente. Por consiguiente, un metodo para suministrar una forma lista para el uso de una composicion hemostatica de acuerdo con la presente invencion, donde la composicion hemostatica se suministra en una primera jeringuilla y un diluyente para reconstitucion se suministra en una segunda jeringuilla, la primera y la segunda jeringuilla estan conectadas entre sf, y el diluyente se introduce en la primera jeringuilla para producir una forma fluida de la composicion hemostatica; y opcionalmente la forma fluida de la composicion hemostatica se devuelve a la segunda jeringuilla al menos una vez, es una realizacion preferente de la presente invencion. Este proceso (tambien designado como "arrastre") proporciona una forma adecuada lista para el uso de las composiciones de acuerdo con la presente invencion que ademas se puede preparar facil y eficientemente en poco tiempo, por ejemplo en situaciones de emergencia durante cirugfas. La forma fluida de la composicion hemostatica proporcionada por dicho metodo es espedficamente adecuada para ser utilizada en el tratamiento de una lesion seleccionada entre el grupo consistente en una herida, una hemorragia, tejido danado, tejido sangrante y/o defectos oseos.

Por motivos de estabilidad, los productos de este tipo (asf como los productos de acuerdo con la presente invencion) se suministran normalmente en forma seca en un recipiente final y se preparan en la forma lista para el uso (que normalmente es la forma de un (hidro)gel, una suspension o una solucion) inmediatamente antes de su uso, para lo que se requiere la adicion de un diluyente farmaceuticamente aceptable (= medio de rehidratacion).

De acuerdo con otro aspecto, la presente invencion se refiere a un metodo para proporcionar una forma lista para el uso de una composicion hemostatica de acuerdo con la presente invencion, donde la composicion hemostatica se suministra en una primera jeringuilla y un diluyente para reconstitucion se suministra en una segunda jeringuilla, la primera y la segunda jeringuilla estan conectadas entre sf, y el fluido se introduce en la primera jeringuilla para producir una forma fluida de la composicion hemostatica; y opcionalmente la forma fluida de la composicion hemostatica se devuelve a la segunda jeringuilla al menos una vez.

Preferentemente, la forma fluida de la composicion hemostatica de la presente invencion contiene mas de un 50% (p/p) de partfculas con un tamano de 100 a 1.000 pm, preferentemente mas de un 80% (p/p) de partfculas con un tamano de 100 a 1.000 pm.

Una vez aplicado en una herida, el polfmero reticulado hemostatico biocompatible de acuerdo con la presente invencion forma una matriz eficiente que puede formar una barrera para el flujo sangumeo. Espedficamente, las propiedades de hinchamiento del polfmero hemostatico pueden convertirlo en una barrera mecanica eficaz contra procesos de hemorragia y hemorragias reiteradas.

La presente composicion puede contener adicionalmente un componente polimerico hidrofilo (tambien denominado "componente hidrofilo reactivo" o "reticulante (polimerico) hidrofilo"), que ademas aumenta las propiedades adhesivas de la presente composicion. Este componente polimerico hidrofilo de la composicion hemostatica segun la presente invencion actua como un reticulante hidrofilo que puede reaccionar con sus grupos reactivos una vez que la composicion hemostatica ha sido aplicada a un paciente (por ejemplo en una herida de un paciente o en otro lugar en el que el paciente necesite una actividad hemostatica). Por tanto, para la presente invencion es importante que los grupos reactivos del componente polimerico hidrofilo sean reactivos despues de ser aplicados al paciente. Por ello es necesario producir la composicion hemostatica de la presente invencion de modo que los grupos reactivos del componente polimerico que debenan reaccionar una vez aplicados a una herida sean retenidos durante el proceso de produccion.

En el caso de los reticulantes polimericos hidrofilos cuyos grupos reactivos son hidrolizables es necesario evitar el contacto prematuro con agua o lfquidos acuosos antes de administrar la composicion hemostatica al paciente, en especial durante la produccion. No obstante, tambien es posible procesar el componente polimerico hidrofilo durante la produccion en un medio acuoso en condiciones de inhibicionde las reacciones de los grupos reactivos (por ejemplo, un pH bajo). Si los componentes polimericos hidrofilos se pueden fundir, los componentes polimericos hidrofilos fundidos se pueden pulverizar o imprimir sobre la matriz de gelatina reticulada. Tambien es posible mezclar una forma seca (por ejemplo un polvo) del componente polimerico

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hidrofilo con una forma seca de la gelatina reticulada. En caso necesario, despues se puede aplicar un aumento de la temperature para fundir el componente polimerico hidrofilo rociado en la gelatina reticulada con el fin de obtener un revestimiento permanente de la composicion hemostatica. Alternativamente, estos componentes polimericos hidrofilos se pueden recoger en disolventes organicos inertes (inertes frente a los grupos reactivos de los componentes polimericos hidrofilos) y aplicar sobre la matriz de gelatina reticulada. Ejemplos de estos disolventes organicos son etanol seco, acetona seca o diclorometano seco (que son inertes, por ejemplo, frente a componentes polimericos hidrofilos, como PEG sustituidos por NHS-ester). Alternativamente tambien se pueden anadir grupos nucleofilos (por ejemplo PEG-SH).

En una realizacion preferente, el componente polimerico hidrofilo es un componente polimerico hidrofilo y es un polfmero de oxido de polialquileno, preferentemente un polfmero que incluye PEG. Los grupos reactivos de este polfmero reactivo son preferentemente grupos electrofilos.

El componente hidrofilo reactivo puede ser un polfmero de oxido de polialquileno multielectrofilo, por ejemplo un PEG multielectrofilo. El componente hidrofilo reactivo puede incluir dos o mas grupos electrofilos, preferentemente un PEG que incluye dos o mas grupos reactivos seleccionados entre esteres de succinimidilo (-CON(COCH2)2), aldehfdos (-CHO) e isocianatos (-N=C=O), por ejemplo un componente tal como se da a conocer en el documento WO2008/016983 A.

Grupos electrofilos preferentes del reticulante polimerico hidrofilo de acuerdo con la presente invencion son grupos reactivos frente a los grupos amino, carboxi, tiol e hidroxi proteicos, o mezclas de los mismos.

Grupos reactivos preferentes espedficos para los grupos amino son grupos NHS-ester, grupos imidoester, grupos aldehfdo, grupos carboxi en presencia de carbodiimidas, isocianatos o THPP (acido beta- [tris(hidroximetil)fosfino] propionico), siendo especialmente preferente el pentaeritritolpoli(etilenglicol)eter tetrasuccinimidil glutarato (= pentaeritritol tetraquis[1-1'-oxo-5'-succinimidilpentanoato-2-poli- oxoetilenglicol]eter (= a NHS-PEG con peso molecular 10.000).

Grupos reactivos preferentes espedficos para grupos carboxi son grupos amino en presencia de carbodiimidas.

Grupos reactivos preferentes espedficos para grupos tiol son maleimidas o haloacetilos.

Un grupo reactivo preferente espedfico para grupos hidroxi es el grupo isocianato.

Los grupos reactivos del reticulante hidrofilo pueden ser identicos (homofuncionales) o diferentes (heterofuncionales). El componente polimerico hidrofilo puede tener dos grupos reactivos (homobifuncional o heterobifuncional) o mas (homo/heterotrifuncional o mas).

En realizaciones especiales, el material consiste en un polfmero sintetico que preferiblemente incluye PEG. El polfmero puede ser un derivado de PEG que incluye grupos laterales activos adecuados para la reticulacion y la adhesion a un tejido.

Gracias a los grupos reactivos, el polfmero reactivo hidrofilo tiene la capacidad de reticular proternas sangumeas y tambien proternas tisulares de superficie. Tambien es posible reticular la gelatina reticulada.

El oxido de polialquileno multielectrofilo puede incluir dos o mas grupos succinimidilo. El oxido de polialquileno multielectrofilo puede incluir dos o mas grupos maleimida.

Preferentemente, el oxido de polialquileno multielectrofilo es un polietilenglicol o un derivado del mismo.

En una realizacion totalmente preferente, el componente polimerico hidrofilo es pentaeritritolpoli(etilenglicol) eter tetrasuccinimidilglutarato (=COH102, tambien pentaeritritol tetraquis[1-1'-oxo-5'-succinimidilpentanoato-2- poli-oxo-etilenglicol]eter).

El componente polimerico hidrofilo es un reticulante hidrofilo. De acuerdo con una realizacion preferente, este reticulante tiene mas de dos grupos reactivos para la reticulacion ("brazos"), por ejemplo, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o mas brazos con grupos reactivos para la reticulacion. Por ejemplo, el NHS-PEG-NHS es un reticulante hidrofilo eficaz de acuerdo con la presente invencion. Sin embargo, en algunas realizaciones puede ser preferible un polfmero de 4 brazos (por ejemplo p-NP-PEG de 4 brazos) y, en base al mismo razonamiento, para las realizaciones donde resulta beneficiosa una reticulacion multirreactiva puede ser preferible un polfmero de 8 brazos (por ejemplo NHS-PEG de 8 brazos). Ademas, el reticulante hidrofilo es un polfmero, es decir, una molecula grande (macromolecula) compuesta por unidades estructurales repetidas que normalmente estan unidas por enlaces qmmicos covalentes. El componente polimerico hidrofilo debena tener un peso molecular de al menos 1.000 Da (para que sirva apropiadamente como reticulante en la composicion hemostatica de acuerdo con la presente invencion); preferentemente, el polfmero reticulante de

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acuerdo con la presente invencion tiene un peso molecular de al menos 5.000 Da, en especial al menos

8.000 Da.

En el caso de algunos reticulantes hidrofilos, la presencia de condiciones de reaccion basicas (por ejemplo en el lugar de administracion) es preferible o necesaria para el rendimiento funcional (por ejemplo, para una reaccion de reticulacion mas rapida en el lugar de administracion). Por ejemplo, en el lugar de administracion se pueden aplicar adicionalmente iones carbonato o bicarbonato (por ejemplo como un tampon con un pH de 7,6 o mas, preferentemente 8,0 o mas, en especial 8,3 o mas) (por ejemplo en forma de una solucion tampon o como una tela o compresa empapada con dicho tampon), para posibilitar un mejor rendimiento de la composicion hemostatica de acuerdo con la presente invencion o para posibilitar un uso eficiente como material hemostatico y/o adherente a la herida.

La reactividad del componente polimerico hidrofilo (que actua como reticulante, como ya se ha mencionado) en la composicion de acuerdo con la presente invencion se mantiene en la composicion. Esto significa que los grupos reactivos del reticulante todavfa no han reaccionado con la composicion hemostatica y no se han hidrolizado con agua (o al menos no en una cantidad significativa que tenga consecuencias negativas en la funcionalidad hemostatica de las presentes composiciones). Esto se puede lograr combinando la gelatina reticulada con el reticulante hidrofilo de un modo que no conduzca a la reaccion de los grupos reactivos del reticulante con el polfmero hemostatico o con agua. Normalmente, esto incluye la omision de condiciones acuosas (o humectacion), en especial humectacion sin la presencia de condiciones acidas (si los reticulantes no son reactivos bajo condiciones acidas). Esto posibilita la provision de materiales hemostaticos reactivos.

Las proporciones preferentes entre al gelatina reticuladayel componente polimerico hidrofilo en la composicion hemostatica segun la presente invencion son del 0,1 al 50% (p/p), preferiblemente del 5 al 40% (p/p).

La composicion hemostatica de acuerdo con la presente invencion puede incluir otros componentes. De acuerdo con realizaciones preferentes, las composiciones hemostaticas de la presente invencion pueden incluir adicionalmente una sustancia seleccionada de entre el grupo consistente en antifibrinolfticos, procoagulantes, activadores plaquetarios, antibioticos, vasoconstrictores, factores de crecimiento, protemas morfogeneticas oseas y analgesicos.

La presente invencion tambien se refiere a un recipiente final acabado que contiene la composicion hemostatica de acuerdo con la presente invencion. El recipiente acabado contiene la composicion hemostatica de acuerdo con la presente invencion en una forma esteril, estable en almacenamiento y comercializable. El recipiente final puede ser cualquier recipiente adecuado para alojar (y almacenar) compuestos administrables farmaceuticamente. Es posible utilizar jeringuillas, viales, tubos, etc.; no obstante, el suministro de las composiciones hemostaticas de acuerdo con la presente invencion en una jeringuilla es espedficamente preferente. Las jeringuillas han sido un medio de administracion preferente para composiciones hemostaticas tal como se da a conocer en la tecnica anterior tambien debido a las ventajas de manipulacion de las jeringuillas en la practica medica. En este caso, las composiciones se pueden aplicar preferentemente (despues de su reconstitucion) a traves de agujas espedficas de la jeringuilla o a traves de cateteres adecuados. Las composiciones hemostaticas reconstituidas (que preferentemente estan reconstituidas formando un hidrogel) tambien se pueden aplicar por otros medios diversos, por ejemplocon una espatula, una brocha, manualmente a presion, o mediante cualquier otra tecnica convencional. La administracion de la composicion hemostatica reconstituida a un paciente por medios endoscopicos (laparoscopicos) es espedficamente preferente. Normalmente, las composiciones hemostaticas reconstituidas de acuerdo con la presente invencion se aplicaran utilizando una jeringuilla o aplicador similar capaz de extrudir la composicion reconstituida a traves de un orificio, abertura, aguja, tubo u otro paso para formar una perla, capa o porcion similar de material. La rotura mecanica de las composiciones se puede llevar a cabo mediante extrusion a traves de un orificio en la jeringuilla u otro aplicador, normalmente con un tamano entre 0,01 mm y 5,0 mm, preferentemente entre 0,5 mm y 2,5 mm. No obstante, preferentemente, la composicion hemostatica se preparara inicialmente a partir de una forma seca con un tamano de partfcula deseado (que despues de la reconstitucion, en especial por hidratacion, produce subunidades del tamano requerido (por ejemplo subunidades de hidrogel)) o se rompera parcial o totalmente hasta el tamano requerido antes de una extrusion final u otro paso de aplicacion. Evidentemente, estos componentes mecanicos han de ser proporcionados en forma esteril (por dentro y por fuera) para satisfacer los requisitos de seguridad para uso humano.

La composicion hemostatica segun la presente invencion se aplica preferentemente en forma de pasta a un paciente desde un recipiente tal como se describe en el Ejemplo 1, con una fuerza de extrusion de 40 N o menos, como menos de 30 N o menos de 20 N, preferentemente en el intervalo entre 15 y 30 N.

Otro aspecto de la invencion se refiere a un metodo para proporcionar una composicion hemostatica lista para el uso que incluye poner en contacto una composicion hemostatica de acuerdo con la presente invencion.

La invencion se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos y figuras, pero sin limitarse a los mismos.

Figura 1: muestra la fuerza de extrusion media de pastas de gelatina reticulada con glutaraldehudo

que contienen un 17,5% (p/p) de gelatina reticulada con diversas concentraciones de seroalbumina humana en el componente de trombina (fuerza de extrusion necesaria para empujar producto fuera de la jeringuilla a 5 una velocidad de compresion de 250 mm/min, calculada a una distancia de 35 mm; todos los productos incubados durante 30 minutos a temperatura ambiente, rearrastre rapido poco antes de la medicion de la fuerza de extrusion). El eje X muestra la concentracion de seroalbumina humana en el componente de trombina en [g/l], el eje Y muestra la fuerza de extrusion media en [N].

Figura 2: muestra la consistencia de pastas de gelatina reticulada que contienen un 17,5% (p/p) de

10 gelatina reticulada dependiendo de la concentracion de seroalbumina humana.

Figura 3: muestra la fuerza de extrusion media de pastas de gelatina reticulada con genipm que

contienen un 17,5% (p/p) de gelatina con diversas concentraciones de seroalbumina humana en el componente de trombina. El eje X muestra la concentracion de seroalbumina humana en el componente de trombina en [g/l], el eje Y muestra la fuerza de extrusion media en [N].

15 Figura 4: muestra la evaluacion de la gravedad de la hemorragia despues de la aplicacion y

aproximacion del artfculo de ensayo.

Figuras 5-8: muestran la eficiencia hemostatica en el Modelo de Biopsia con Aguja de Hfgado Porcino

de diferentes preparaciones. El eje X muestra el tiempo despues de la aplicacion en [segundos], el eje Y muestra el porcentaje de exito hemostatico (definido como "ausencia de hemorragia" en la Figura 5 y como 20 "ausencia de hemorragia" o "rezumado" en la Figura 6).

Los sfmbolos en las Figuras 5 y 6 significan:

_____gelatina reticulada con glutaraldehfdo con 50 g/l de seroalbumina humana en la solucion de trombina

(n = 8)

-------gelatina reticulada con glutaraldehfdo con 75 g/l de seroalbumina humana en la solucion de trombina (n

25 = 8)

Los sfmbolos en las Figuras 7 y 8 significan:

_____« 17,5% (p/p) gelatina reticulada con glutaraldehfdo

-----~ 14,5% (p/p) gelatina reticulada con glutaraldehfdo

.........« 17,5% /p/p) gelatina reticulada con glutaraldehfdo mas 2,5% PEG10.000 en solucion de trombina

30 Ejemplos

Ejemplo 1: Determinacion de la Fuerza de Extrusion (FE)

Para medir las fuerzas de extrusion necesarias para extrudir el producto desde una jeringuilla se utilizo una maquina de ensayo Instron modelo 5544 equipada con una celula de carga que funciona con una velocidad de paso de 250 mm/min. Las fuerzas de extrusion necesarias se midieron durante el desplazamiento de paso 35 completo (34 mm de desviacion), que corresponde a la distancia que se mueve el embolo de jeringuilla para extrudir practicamente todo el producto de la jeringuilla. A partir de estas fuerzas se calcularon las fuerzas de extrusion medias de la siguiente manera:

Energfa total (mJ) ^

-----------5----------—------= Fuerza media (N)

Desviacion maxima (mm)

Las muestras para este ensayo se prepararon de la siguiente manera: una jeringuilla estandar de 5 ml (con 40 un cuerpo cilmdrico de diametro interior 12,2 mm) con un sistema luer lock macho (el diametro del lumen de boquilla interior en el que se une el adaptador mide 2,54 mm) se rellena con 0,704 g de masa seca de la muestra solida (aproximadamente 0,8 g teniendo en cuenta la humedad residual de aproximadamente un 12%). Como diluyente se utilizaron 3,2 ml de una solucion de trombina que contema 500 Ul/ml de trombina en cloruro de calcio 40 mM y 0, 5, 15, 25, 50 o 75 mg/ml de seroalbumina humana. El diluyente y el 45 componente solido se mezclaron conectando la jeringuilla que contema el diluyente (una jeringuilla de 5 ml estandar con un sistema luer lock hembra) y la jeringuilla que contema el componente seco, y empujando el contenido adelante y atras al menos 10 veces (esta tecnica de mezclado se denomina "arrastre"). Despues, la mezcla se incubo durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de la medicion. Despues de la incubacion, cada muestra fue sometida a "rearrastre" dos veces y la jeringuilla que contema el producto (la 50 jeringuilla que previamente contema el componente seco tal como se ha mencionado mas arriba) se conecto

con un aplicador maleable (sistema conector luer hembra, diametro interior del tubo de 2,29 mm que tiene dos alambres y una longitud total de 141,5 mm). La jeringuilla se monto en el aplicador, se dispuso en el sistema Instron y se llevo a cabo el ensayo.

Las jeringuillas y el aplicador eran comerciales como partes del producto Floseal Hemostatic Matrix de 5 Baxter.

Los resultados de una gelatina reticulada con glutaraldetndo como en Floseal estan representados en la Figura 1 y los de una gelatina reticulada con genipm tal como se describe mas abajo estan representados en la Figura 3 y tambien se muestran como la Tabla 1 y la Tabla 2 correspondientes.

La consistencia de pastas de gelatina reticulada que contienen un 17,5% (p/p) de gelatina reticulada 10 dependiendo de la concentracion de albumina se muestran en la Figura 2 (con 0, 25, 50 y 75 g/l de seroalbumina humana provista en el componente de trombina).

Tabla 1

c(albumina) [g/l] en el componente de trombina

fuerza de extrusion desv. estandar

0

40 2,4

5

38 1,5

15

30 2,6

25

25

2,2

50

19 1,5

60

19 1,0

Tabla 2

c(albumina) g/l en el componente de trombina

fuerza de extrusion desv. estandar

0

54 1,9

15

29 3,6

50

17 2,2

15

Preparacion de Gelatina Reticulada con Genip^n^. un colageno derivado de bovino se proceso mediante tratamiento alcalino y a continuacion se lavo con agua de proceso desionizada (APD) para eliminar sales residuales. La gelatina se extrajo por tratamiento termico y se seco en laminas. Las laminas se molieron para obtener un polvo con el fin de procesarlo utilizando genipm como agente reticulante.

20 A una solucion de 20 l de una solucion de genipm 10 mM en APD se le anadio 1 kg de granulos de gelatina. La reaccion se llevo a cabo con pH neutro (7,2) en un tanque con cubierta de temperatura controlada a 23°C. La mezcla se llevo a cabo durante 6 horas y la solucion se dreno, reteniendo los solidos dentro de unamalla, y se lavo a fondo con APD para eliminar el genipm residual. El material se resuspendio en una solucion de H2O2 al 5% durante 20 horas. El material se lavo a fondo con APD para eliminar el H2O2. Los solidos se

25 secaron previamente sobre papel de filtro bajo vacm y despues se secaron en horno durante 2,5 dfas. La

matriz seca se molio para obtener un polvo, que se introdujo en jeringuillas de plastico individuales antes de exponerlo a radiacion gamma.

Ejemplo 2: Determinacion de la Eficiencia Hemostatica

Materiales y Metodos:

30 Modelo Animal

Para este modelo se lleva a cabo una laparotoirna media, seguida de electrocauterizacion para detener la hemorragia de la incision quirurgica. El tngado queda expuesto y se afsla un lobulo. Despues se utiliza una biopsia con aguja de 10 mm de diametro para crear una serie de 2 lesiones de espesor no completo con una profundidad de aproximadamente 5 mm, con el tejido de nucleo retirado. Se lleva a cabo una evaluacion

35 previa al tratamiento de la lesion, que incluye la recogida de la sangre que fluye de cada lesion durante 10

segundos con una gasa previamente pesada.

Los artmulos de ensayo se aleatorizan y se presentan al cirujano, que es ciego con respecto al tratamiento de las muestras. Aproximadamente 1,0 ml del artmulo de ensayo asignado se aplica topicamente a una lesion. Para ayudar a aproximar los artmulos de ensayo a las lesiones designadas se utiliza una gasa humedecida 40 con solucion salina, y se pone en marcha el cronometro. La gasa de aproximacion humedecida con solucion salina se retira despues de 30 segundos.

El grado de hemorragia se evalua a los 30, 60, 90, 120, 300 y 600 segundos despues de la aplicacion de los artmulos de ensayo a las lesiones designadas conforme a las representaciones de la Figura 3 (calificacion de la hemorragia: 0: sin hemorragia (producto saturado con sangre); 1: rezumado (sangre fuera del producto pero sin gotas de sangre); 2: muy suave (gotas de sangre sobre el producto; 3: suave (flujo de de gotas de 5 sangre); 4: moderada (flujo de una pequena cantidad de chorros de sangre); 5: grave (flujo de una gran cantidad de chorros de sangre)).

El producto saturado con sangre pero sin hemorragia activa se califica como "0" (cero). Para irrigar los artmulos de ensayo en exceso apartados de las lesiones despues de los 300 segundos de evaluacion se utiliza solucion salina. El procedimiento se repite y se lleva a cabo en multiples lobulos hepaticos. Un solo 10 cirujano crea, trata y realiza las evaluaciones de observacion.

Smtesis de Artfculos de Ensayo

Los artfculos de ensayo para la evaluacion in vivo en el modelo de tngado porcino se realizaron preparando pastas de gelatina reticulada (en concentraciones de un 14,5% y un 17,5% con 25 o 50 g/l de seroalbumina humana en la solucion de trombina (con o sin un 2,5% de PEG adicional)).

15 Los resultados estan representados en las Figuras 5 a 8, mostrando un rendimiento mejorado con un 17,5% de gelatina y menos eficacia en presencia de plastificantes (PEG).

Ejemplo 3:

Se formularon muestras de gelatina de acuerdo con el prospecto de Floseal con un par de excepciones clave. En primer lugar, se utilizo cloruro de sodio en lugar de cloruro de calcio y la gelatina se formulo con un 125% 20 de solidos en lugar de un 100%. Las formulaciones de gelatina/trombina se dejaron reposar durante 25 minutos y despues se desecho 1 ml de la preparacion. El otro ml de material se aplico al sistema de hemostasia topica (SHT). El aparato de SHT se cebo previamente con plasma pobre en plaquetas.

El SHT es un aparato disenado para simular una herida sangrante. La herida artificial es un orificio cilmdrico en un sustrato de silicona. La superficie del cilindro de silicona estaba revestida con una capa de fibrinogeno. 25 Una bomba de jeringuilla expulsaba el fluido de coagulacion (sangre total, plasma, etc.), en este caso plasma pobre en plaquetas, mientras que se registraba la contrapresion. En este experimento, el plasma flma a una velocidad fija de 0,25 ml/min a traves de un orificio pequeno en el centro del fondo de la herida cilmdrica. El plasma en exceso se absorbio con gas inmediatamente antes de la aplicacion de la matriz hemostatica. Cuando el plasma continuo fluyendo, se aplico 1 ml de la matriz hemostatica a la herida cilmdrica. Esta se 30 cubrio inmediatamente con gasa humeda y se aplico una presion fija. Despues de 30 segundos se retiro el peso y el plasma continuo fluyendo durante 8-10 minutos, momento en el que el flujo se interrumpio y el coagulo se retiro a una camara de humedad, donde permanecio durante mas de 2 horas. Al final de las dos horas, el coagulo se monto sobre un Vibratome a 8°C, donde se seccionaron del coagulo placas con un espesor de aproximadamente 500 pm. Estas secciones se sumergieron en un tampon de PBS. Las placas se 35 guardaron en un refrigerador a 5°C mientras no fueron utilizadas. La placa se coloco sobre un cubreobjetos y se tomaron imagenes con un microscopio confocal Nikon A1R que ejecuta el software NIS-Elements Advanced Research v3.22.00 Build 710. Para reunir micrograffas se utilizo un objetivo Plan Fluor 10x con luz de excitacion laser a 488 nm y una ventana de recogida de emision de 500-550 nm. Simultaneamente se recogio una imagen de luz transmitida utilizando un detector de luz transmitida. Con estos parametros de 40 toma de imagenes se utilizo una puntada automatica realizada por el software para generar mapas macroscopicos de muestras. Las areas mas pequenas de las muestras tambien se caracterizaron recogiendo pilas z de imagenes 3D con un espesor de placa optica de 5,125 pm. El mapa confocal compuesto se utilizo para identificar los granulos de gelatina localizados en la superficie y que habfan sido seccionados. Esto era importante para posicionar la medicion de elasticidad en el microscopio de fuerzas atomicas (MFA). La placa 45 de coagulo se monto en un MFA Veeco Multimode. El Multimode se equipo con un controlador Nanoscope V y un escaner piezoelectrico JV. Las mediciones de fuerza se realizaron con una pluma de MFA Novascan que soportaba una esfera de poliestireno de 4,5 pm. La constante de la fuerza de la pluma se determino en 0,779 N/m mediante el metodo de sintoma termica. La pluma se posiciono por encima del centro del granulo de gelatina, y despues se realizo una serie de 16 x 16 mediciones de fuerza. Cada curva de fuerza implicaba 50 mover el granulo de gelatina hasta ponerlo en contacto con la esfera de poliestireno, y continuar moviendo el granulo hacia arriba hasta que la desviacion de la pluma alcanzo un valor de activacion prefijado de 2 voltios, momento en el que la gelatina se retrajo una distancia de 1,00 micras del lugar de activacion.

Discusion

Los datos de fluorescencia muestran que la gelatina reticulada con glutaraldehfdo no esta reticulada 55 uniformemente. En su lugar, la densidad de reticulacion parece mayor alrededor de los bordes de los granulos, estando la parte central del granulo considerablemente menos reticulada que los bordes. Por el contrario, la gelatina reticulada con genipm parece reticulada uniformemente (homogeneamente) por todo el

granulo. No hay ningun efecto de borde esencial en la intensidad de fluorescencia. La intensidad de fluorescencia de los materiales reticulados con genipm y glutaraldehndo no se puede comparar directamente, debido a las diferencias de fluorescencia potenciales atribuidas a los propios reticulantes. Sin embargo, la medicion del modulo elastico medido por MFA muestra que la gelatina reticulada con genipm es mas ngida 5 que la gelatina reticulada con glutaraldehfdo, que parece ser mas blanda (mas flexible).

Claims (14)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   Reivindicaciones

   1. Composicion hemostatica que comprende gelatina reticulada en forma particulada adecuada para su uso en la hemostasia, estando presente la composicion en forma de una pasta que contiene entre un 15,0 y un 19,5% (p/p) de gelatina reticulada, preferentemente entre un 16,0 y un 19,5% (p/p), entre un 16,5 y un 19,5% (p/p), entre un 17,0 y un 18,5% (p/p) o entre un 17,5 y un 18,5% (p/p), de forma especialmente preferente entre un 16,5 y un 19,0% (p/p) o entre un 16,8 y un 17,8% (p/p), de forma particularmente preferente entre un 16,5 y un 17,5% (p/p), y comprendiendo la composicion un potenciador de extrusion, siendo el potenciador de extrusion albumina en una cantidad entre un 0,5 y un 5,0% (p/p).
2. 2. Composicion hemostatica segun la reivindicacion 1, caracterizada porque el potenciador de extrusion es albumina en una cantidad entre un 1,0 y un 5,0% (p/p), preferentemente entre un 2,0 y un 4,5% (p/p), de forma especialmente preferente entre un 1,5 y un 5,0% (p/p), en particular aproximadamente un 1,5% (p/p).
3. 3. Composicion hemostatica segun la reivindicacion 1 o 2, caracterizada porque la gelatina reticulada es gelatina reticulada con glutaraldehudo o gelatina reticulada con genipm.
4. 4. Composicion hemostatica segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la gelatina reticulada es gelatina de tipo B.
5. 5. Composicion hemostatica segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la gelatina reticulada esta presente como un material granular.
6. 6. Composicion hemostatica segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5,caracterizada porquela gelatina reticulada tiene un tamano de partfcula de 100 a 1.000 pm, preferentemente de 200 a 800 pm, de forma totalmente preferente de 350 a 550 pm.
7. 7. Composicion hemostatica segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque contiene trombina, preferentemente de 10 a 1.000 U.I. de trombina/ml, en especial de 250 a 700 U.I. de trombina/ml.
8. 8. Composicion hemostatica segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para su uso en el tratamiento de una lesion seleccionada entre el grupo consistente en una herida, una hemorragia, tejido danado, tejido sangrante y/o defectos oseos.
9. 9. Kit para preparar una pasta fluida de gelatina reticulada para el tratamiento de una lesion seleccionada entre el grupo consistente en una herida, una hemorragia, tejido danado y/o tejido sangrante, que comprende

   a) una composicion hemostatica seca que incluye gelatina reticulada en forma particulada para ser reconstituida en una pasta fluida que contiene entre un 15,0 y un 19,5% (p/p) de gelatina reticulada, preferentemente entre un 16,0 y un 19,5% (p/p), entre un 16,5 y un 19,5% (p/p), entre un 17,0 y un 18,5% (p/p) o entre un 17,5 y un 18,5% (p/p), de forma especialmente preferente entre un 16,5 y un 19,0% (p/p) o entre un 16,8 y un 17,8% (p/p), de forma particularmente preferente entre un 16,5 y un 17,5% (p/p), y

   b) un diluyente farmaceuticamente aceptable para la reconstitucion de la composicion hemostatica, comprendiendo la composicion o el diluyente albumina en una cantidad que conduce a una concentracion de albumina en la pasta reconstituida entre un 0,5 y un 5,0% (p/p), preferentemente entre un 1,0 y un 5,0% (p/p), preferiblemente entre un 2,0 y un 4,5% (p/p), de forma especialmente preferente entre un 1,5 y un 5,0% (p/p), de forma particularmente preferente aproximadamente un 1,5% (p/p).
10. 10. Kit segun la reivindicacion 9, caracterizado porque el diluyente farmaceuticamente aceptable comprende un tampon o sistema tampon, preferentemente con un pH de 3,0 a 10,0.
11. 11. Kit segun la reivindicacion 9 o 10, caracterizada porque el diluyente farmaceuticamente aceptable comprende trombina, preferentemente de 10 a 1.000 U.I. de trombina/ml, en especial de 250 a 700 U.I. de trombina/ml.
12. 12. Kit segun cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizada porque el diluyente farmaceuticamente aceptable contiene una sustancia seleccionada entre el grupo consistente en NaCl, CaCl2 y acetato de sodio.
13. 13. Metodo para proporcionar una forma lista para el uso de una composicion hemostatica segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la composicion hemostatica se suministra en una primera jeringuilla y un diluyente para reconstitucion se suministra en una segunda jeringuilla, la primera y la segunda jeringuilla estan conectadas entre sf, y el fluido se introduce en la

    5 primera jeringuilla para producir una forma fluida de la composicion hemostatica; y opcionalmente la

    forma fluida de la composicion hemostatica se devuelve a la segunda jeringuilla al menos una vez.
14. 14. Metodo segun la reivindicacion 13, caracterizado porque la forma fluida de la composicion hemostatica contiene partfculas de las cuales mas de un 50% (p/p) tienen un tamano de 100 a 1.000 pm, preferentemente mas de un 80% (p/p) tienen un tamano de 100 a 1.000 pm.

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