ES2425576T3 - Composiciones coadyuvantes glucolipídicas novedosas - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende: a) un glucolípido de fórmula I; en el que la fórmula I es en la que R1 y R2 son independientemente hidrógeno o un radical alquilo saturado que tiene hasta 20 átomos de carbono; X es -CH2-, -O- o -NH-; R3, R4 y R5 son independientemente hidrógeno, -SO4 2-, -PO4 2-, -CO-alquilo C1-10; R6 es L-alanilo, L-alfa-aminobutilo, L-arginilo, L-asparginilo, L-aspartilo, L-cisteinilo, L-glutamilo, L-glicilo, L-histidilo, L-hidroxipropilo, L-isoleucilo, L-leucilo, L-lisilo, L-metionilo, L-ornitinilo, L-fenilalanilo, L-prolilo, L-serilo, L-treonilo, Ltirosilo,L-triptofanilo y L-valilo o sus isómeros D; en una forma de sal, en la que la forma de sal deriva de un ácido débil, b) un alcohol, en el que el alcohol es HO-alquilo C1-3; c) un ácido débil, en el que el ácido débil 1) está en una cantidad desde 1,25 hasta 5,0 veces la cantidad del glucolípido, en equivalentes molares alglucolípido y 2) es cualquier ácido que tenga un valor de pKa (el -log de Ka) entre 1,0 y 9,5 utilizando las tablas o valoresestándar; d) un tensioactivo no iónico, en el que el tensioactivo no iónico es un agente que reduce la tensión superficialdel material que se disuelve en él y tiene un componente que es hidrófobo y otro componente que es hidrófilo.

Description

Composiciones coadyuvantes glucolipídicas novedosas

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones de coadyuvantes glucolipídicos novedosas, a procedimientos parasu uso y a su preparación. Las nuevas composiciones de la presente invención son estables durante una largaduración sin floculación. Son particularmente útiles en el suministro de diversas medicinas, incluyendo vacunas.

Antecedentes de la invención

Las vacunas se utilizan típicamente para proteger a seres humanos y animales veterinarios de enfermedadesinfecciosas causadas por bacterias, virus y organismos parásitos. Los antígenos utilizados en vacunas pueden ser cualquier variedad de agentes, pero están compuestos típicamente por organismos patógenos muertos, organismospatógenos que están vivos pero modificados o atenuados, proteínas, proteínas recombinantes o fragmentos de lasmismas. Cualquiera que sea la fuente del antígeno, a menudo es necesario añadir un coadyuvante para potenciar larespuesta inmune del huésped al antígeno.

Los coadyuvantes se utilizan para conseguir dos objetivos: retardan la liberación de los antígenos desde el sitio deinyección y estimulan el sistema inmune.

El primer coadyuvante reseñado en la bibliografía fue el coadyuvante completo de Freund (FCA). El FCA contieneuna emulsión de agua en aceite y extractos de micobacterias. Los extractos de micobacterias proporcionanmoléculas inmunoestimulantes en forma bruta. La emulsión de agua en aceite actúa creando un efecto de depósitodonde los antígenos se liberan lentamente. Desgraciadamente el FCA es poco tolerado y puede causar inflamaciónincontrolada. Desde el descubrimiento del FCA hace 80 años se han realizado esfuerzos para reducir los efectossecundarios indeseados de los coadyuvantes.

Actualmente se conocen análogos glucolipídicos que comprenden una nueva clase de compuestos que tienenpropiedades coadyuvantes. La patente de EE.UU. N.º: 4.855.283 (en adelante en la presente memoria ‘283) da aconocer la síntesis de análogos glucolipídicos, incluyendo N-glucosilamidas, N-glucosilureas, carbamatos de Nglucosilo y específicamente: acetato de N-(2-desoxi-2-L-leucilamino-�-D-glucopiranosil)-N-octadecildodecanamida (conocido como Bay R1005, O. Lockhoff, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., (1991) 30: 1611-1620). Los compuestosdescritos en la patente ‘283 son particularmente adecuados para su uso como coadyuvantes.

Las formulaciones coadyuvantes glucolipídicas necesitan ser fáciles de fabricar y estables cuando se almacenandurante largos periodos de tiempo sin mostrar floculación del componente lipídico. Las formas no acetato de lasamidas glucolipídicas o glucosilamidas son altamente insolubles y típicamente se separan por floculación de lasolución tras almacenamiento a temperatura ambiente o inferior.

Las soluciones y coadyuvantes que comprenden glucosilamidas proporcionados aquí muestran poca floculación y son bastante estables. Son fáciles de fabricar y pueden prepararse a escala comercial. Las formulaciones coadyuvantes glucolipídicas líquidas pueden utilizarse como diluyente para rehidratar una preparación de antígeno liofilizado. Se proporcionan también procedimientos para ensayar la estabilidad de estas formulaciones a tiempo realy mediante protocolos de ensayo de estabilidad acelerada.

Sumario de la invención

El alcance de la presente invención se define por las reivindicaciones y cualquier información que no entre dentro delas reivindicaciones se proporciona solamente para información.

Esta invención comprende la composición y el procedimiento de preparación o fabricación tanto de solución madre de glucosilamida como de solución coadyuvante glucolipídica. La solución madre de glucosilamida se preparadisolviendo un glucolípido de fórmula I en un alcohol y combinando esto con una cantidad apropiada de un ácidodébil más un tensioactivo “no iónico”. El ácido débil se añade a la solución de alcohol glucolipídico en un excesomolar de ácido débil con respecto al glucolípido. En una realización, el glucolípido es hidroacetato de N-(2-desoxi-2L-leucilamino-�-D-glucopiranosil)-N-octadecildodecanoilamida. En una realización, el alcohol es etanol. En una realización, el ácido débil es ácido acético. En una realización, los tensioactivos no iónicos son diversos sorbitanos (Span®) o polioxietilensorbitanos (Tween®), en particular monolaurato de sorbitanos (Span 20®) y monolaurato depolioxietilensorbitanos (Tween 20®). La solución coadyuvante glucolipídica se prepara introduciendo una cantidadapropiada de la solución madre de glucosilamida en un “tampón adecuado”. El pH de las soluciones coadyuvantes glucolipídicas estables finales aquí descritas debe ser entre aproximadamente 6 y aproximadamente 8. Se prefiere un pH final de entre aproximadamente 6 y aproximadamente 7. Se describe un pH final de entre aproximadamente6,3 a aproximadamente 6,4. Deben evitarse concentraciones altas de sal de coadyuvante glucolipídico, aquellas que exceden de NaCl 30 mM.

Estas dos soluciones se ejemplifican con más detalle a continuación:

La solución madre de glucosilamida es una composición que comprende:

a) un glucolípido de fórmula I;

en el que la fórmula I es

en la que R1 es hidrógeno o radical alquilo saturado que tiene hasta 20 átomos de carbono; X es –CH2-, -O- o –NH-;

5 R2 es hidrógeno o radical alquilo saturado que tiene hasta 20 átomos de carbono; R3, R4 y R5 son independientemente hidrógeno, -SO42-, -PO42-, -CO-alquilo C1-10; R6 es L-alanilo, L-alfa-aminobutilo, L-arginilo, L-asparginilo, L-aspartilo, L-cisteinilo, L-glutamilo, L-glicilo, L-histidilo,

L-hidroxipropilo, L-isoleucilo, L-leucilo, L-lisilo, L-metionilo, L-ornitinilo, L-fenilalanilo, L-prolilo, L-serilo, L-treonilo, Ltirosilo, L-triptofanilo y L-valilo o sus isómeros D; en una forma de sal, en la que la forma de sal se deriva de un ácido10 débil;

b) un alcohol, en el que el alcohol es HO-alquilo C1-3; c) un ácido débil, en el que el ácido débil 1) está en exceso molar con respecto al contenido de glucolípido y 2) es cualquier ácido que tenga un valor de pKa entre aproximadamente 1,0 y aproximadamente 9,5 utilizando las tablas o valores estándar; y

15 d) un tensioactivo no iónico, en el que el tensioactivo no iónico es un agente que reduce la tensión superficial del material que se disuelve en él y tiene un componente que es hidrófobo y otro componente que es hidrófilo. La solución coadyuvante glucolipídica es una composición que comprende: a) una solución madre de glucosilamida; y b) un tampón adecuado, en el que el tampón es aquel apropiado para uso veterinario o médico y puede20 mantener un pH relativamente constante en una solución acuosa de entre aproximadamente 6,0 y aproximadamente 8,0.

Descripción detallada de la invención

A menos que se indique cósalo contrario, los siguientes términos utilizados en la memoria descriptiva y las reivindicaciones tienen los significados dados a continuación.

25 El término “alcohol” designa un compuesto de fórmula HO-alquilo C1-3. Puede ser metanol, etanol o propanol en cualquier forma, tal como n-propanol o isopropanol. Se prefiere etanol.

El término “alquilo” designa tanto restos hidrocarburo saturados de cadena lineal como ramificada.

El término “glucolípidos” designa los compuestos de fórmula I siguientes. Estos compuestos se describen en lapatente de EE.UU. 6.290.971 y la patente de EE.UU. N.º: 4.855.283, expedida el 8 de agosto de 1989. Tanto la

30 patente de EE.UU. 6.290.971 como la patente de EE.UU. N.º: 4.855.283 se incorporan a la presente como referencia en su totalidad. Un glucolípido descrito en particular aquí, cuando está en su forma acetato, tiene el nombrecomercial Bay R1005® y el nombre químico “acetato de N-(2-desoxi-2-L-leucilamino-�-D-glucopiranosil)-Noctadecildodecanamida”. La forma amida de este compuesto tiene el nombre comercial Bay 15-1583® y el nombrequímico “N-(2-desoxi-2-L-leucilamino-�-D-glucopiranosil)-N-octadecildodecanamida”.

35 Los glucolípidos de fórmula I son:

Fórmula I

en la que

R1 es hidrógeno o radical alquilo saturado que tiene hasta 20 átomos de carbono; X es –CH2-, -O- o –NH-;

R2 es hidrógeno o radical alquilo saturado que tiene hasta 20 átomos de carbono; R3, R4 y R5 son independientemente hidrógeno, -SO42-, -PO42- o –CO-alquilo C1-10; R6 es L-alanilo, L-alfa-aminobutilo, L-arginilo, L-asparginilo, L-aspartilo, L-cisteinilo, L-glutamilo, L-glicilo, L-histidilo,

5 L-hidroxipropilo, L-isoleucilo, L-leucilo, L-lisilo, L-metionilo, L-ornitinilo, L-fenilalanilo, L-prolilo, L-serilo, L-treonilo, Ltirosilo, L-triptofanilo y L-valilo o sus isómeros D; o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. Otra realización especificada describe los glucolípidos de fórmula I en la que: R1 es hidrógeno o alquilo C12-18 saturado; R2 es hidrógeno o alquilo C7-11 saturado; 10 X es –CH2; R4 y R5 son independientemente hidrógeno;

R6 es seleccionado de L-leucilo. Las variables para la fórmula I son separadas e independientes y todas las combinaciones de variables están descritas y reivindicadas en la presente memoria.

15 En otra realización, los glucolípidos son aquellos descritos por la fórmula II(a):

Fórmula II(a)

En otra realización, los glucolípidos son aquellos descritos por la fórmula II(b):

Fórmula II(b) En otra realización, los glucolípidos tienen la estructura de fórmula III:

Fórmula III

Un compuesto de fórmula III puede existir en forma amida o forma acetato. La forma amida de este compuesto tiene 5 el nombre comercial Bay 15-1583®. La forma acetato tiene el nombre comercial Bay R1005®.

Los glucolípidos de fórmula I pueden prepararse utilizando los siguientes procedimientos, tomados de la patente deEE.UU. N.º: 4.855.283.

Como puede observarse en la fórmula I, los compuestos según la invención están basados en una 2-amino-2desoxihexosa sustituida. Estos azúcares están siempre unidos N-glucosídicamente a través de C-1, el átomo de

10 carbono anomérico, al grupo acilamido, carbamido o alcoxicarbonilamido

(I)

con los significados citados anteriormente para R1, R2 y X.

El grupo 2-amino de los aminoazúcares de los compuestos según la invención, de fórmula I, está unido amídicamente a un a-aminoácido o un derivado de a-aminoácido.

15 Los aminoácidos son los L-aminoácidos naturales tales como glicina, sarcosina, ácido hipúrico, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, cisteína, metionina, ornitina, citrulina, arginina, ácido aspártico, asparagina, ácido glutámico, glutamina, fenilalanina, tirosina, prolina, triptófano e histidina. Se describen también D-aminoácidostales como D-alanina, o ácidos aminocarboxílicos tales como ácido alfa-aminobutírico, ácido a -aminovalérico, ácido a-aminocaproico o ácido a -aminoheptanoico, tanto en la forma D como L, para actuar como sustituyentes en el

20 aminoazúcar.

Se proporcionan también los procedimientos de preparación de los compuestos según la fórmula I. Esto conllevapartir de un derivado de 2-amino-2-desoxiglicopiranosa (fórmula IV) que está protegido en el grupo amino,

en la que R10 representa un grupo protector para la protección de grupos amino, que es conocido por la síntesis de25 péptidos y puede eliminarse selectivamente, cuando sea apropiado.

Son ejemplos de grupos protectores adecuados grupos acilo tales como trifluoroacetilo o tricloroacetilo, onitrofenilsulfenilo, 2,4-dinitrofenilsulfenilo o grupos alcoxicarbonilo inferior opcionalmente sustituidos tales como grupos metoxicarbonilo, terc-butiloxicarbonilo, benciloxicarbonilo, p-metoxibenciloxicarbonilo o 2,2,2tricloroetiloxicarbonilo. Se conocen derivados de aminohexosa N-protegidos adecuados. Por ejemplo, M. Bergmann

30 y L. Zervas, Ber. 64, 975 (1931); D. Horton, J. Org. Chem. 29, 1776 (1964); P.H. Gross y R.W. Jeanloz, J. Org. Chem. 32, 2759 (1967); M.L. Wolfrom y H.B. Bhat, J. Org. Chem. 32, 1821 (1967); general: J.F.W. McOmie (editor), “Prot. Groups. Org. Chem.”, Plenum Press (1973); Geiger en “The Peptides”, vol. 3, páginas 1-99 (1981) AcademicPress; y la bibliografía citada en los mismos. Los grupos protectores de amino preferidos para la preparación de loscompuestos según la fórmula I son el grupo BOC (terc-butiloxicarbonilo) o el grupo Z (benciloxicarbonilo).

35 Los derivados de aminoazúcar bloqueados (IV) se hacen reaccionar, en una primera etapa de reacción, con aminas

(fórmula V) H2N-R1 (V) en las que R1 tiene el significado dado anteriormente, proporcionando glucosilaminas (fórmula VI)

(VI)

5 Las preparaciones de glucosilamina de este tipo se conocen en principio (Ellis, Advances in Carbohydrate Chemistry 10, 95, (1955)) y se describen, específicamente, en la DE-OS (memoria descriptiva alemana publicada) N.º:

3.213.650.

En la segunda etapa de reacción, se hacen reaccionar las glucosilaminas (VI) bien con derivados de ácido carboxílico adecuados (fórmula VII) tales como haluros de carboxilo, o bien con anhídridos carboxílicos,

10 R11-CO-CH2-R4 (VII)

teniendo R2 el significado anteriormente citado y representando R11 halógeno tal como, por ejemplo, cloro, o representando –O-CO-R2, con el significado anteriormente citado para R2, o representando –O-CO-O-alquilo inferior. De este modo, se obtienen glucosilamidas (fórmula VIII)

(VIII)

15 en las que R1 y R2 tienen los significados citados anteriormente y R10 es igual que R6 y X representa –CH2-. Las condiciones para N-acilaciones de este tipo se indican en la DE-OS (memoria descriptiva alemana publicada) N.º:

3.213.650.

En una realización preferida, las glucosilaminas de fórmula VI se hacen reaccionar con uno a dos equivalentes de uncloruro de carbonilo (fórmula VII) o con uno a dos equivalentes de un anhídrido mixto que se ha obtenido a partir del

20 ácido carboxílico relevante R2-CH2-CO2H y cloroformiato de etilo o cloroformiato de isobutilo, en presencia de una base orgánica auxiliar, mediante procedimientos conocidos en la bibliografía, proporcionando la glucosilamida defórmula VIII con X=-CH2-.

Esto se lleva a cabo en disolventes orgánicos o acuosos-orgánicos entre 0 ºC y 50 ºC, cuando sea apropiado enpresencia de una base inorgánica u orgánica. Son diluyentes adecuados alcoholes, tales como metanol, etanol, 125 propanol o 2-propanol, o éteres tales como dietiléter, tetrahidrofurano o 1,4-dioxano, o hidrocarburos halogenados tales como diclorometano, triclorometano o 1,2-dicloroetano, o N,N-dimetilformamida.

Cuando las glucosilaminas (VI) que se obtienen en la primera etapa se hacen reaccionar con ésteres halogenofórmicos (IX)

R12-CO-O-R2 (IX)

30 representando R12 halógeno tal como, por ejemplo, cloro o bromo y teniendo R2 el significado anteriormente citado, entonces se obtienen carbamatos de glucosilo (VIII), representando X oxígeno en la fórmula III.

En una realización, las glucosilaminas de fórmula VIII se hacen reaccionar con uno a dos equivalentes de un ésterclorocarbónico IX, proporcionando el carbamato de glucosilo. Esto se lleva a cabo preferiblemente en disolventesorgánicos o acuosos-orgánicos a temperaturas entre 0 ºC y 50 ºC, pero de forma particularmente preferible a

35 temperatura ambiente. Son disolventes adecuados alcoholes, éteres, hidrocarburos halogenados o dimetilformamida, tal como se mencionan anteriormente.

Cuando se hacen reaccionar glucosilaminas (VI) que se obtienen en la primera etapa con uno a dos equivalentes deun isocianato orgánico (fórmula X)

R2-NCO (X) teniendo R2 el significado anteriormente citado, se obtienen glucosilureas de fórmula VIII y X es –NH-. Esta reacciónde acilación, como las reacciones anteriormente citadas, se lleva a cabo preferiblemente en disolventes orgánicos,estando las temperaturas de reacción entre –20 ºC y 60 ºC, preferiblemente entre 0 ºC y 25 ºC. Son disolventesadecuados los alcoholes, éteres, hidrocarburos halogenados o dimetilformamida anteriormente citados.

5 Las glucosilamidas (fórmula VIII, X= -CH2-), carbamatos de glucosilo (fórmula VIII, X= -O-) o glucosilureas (fórmula VIII, X= -NH-) obtenidos de este modo se aíslan en forma de sólidos cristalinos o amorfos mediante procedimientosconocidos per se y si es necesario, se purifican mediante procedimientos estándar tales como recristalización,cromatografía, extracción, etc.

En muchos casos, es también ventajoso llevar a cabo, en paralelo o en lugar de las etapas de purificación

10 anteriormente citadas, una derivatización química que conduce a un derivado de las glucosilamidas, carbamatos de glucosilo y glucosilureas de fórmula VIII que tiene buenas propiedades de cristalización. Las derivatizacionesquímicas de este tipo son, en el caso de las glucosilamidas, carbamatos de glucosilo y glucosilureas según lainvención, por ejemplo, reacciones de esterificación en los grupos hidroxilo de los residuos de azúcar. Son ejemplosde grupos éster adecuados grupos acetilo, benzoílo o p-nitrobenzoílo. Para preparar derivados de tri-O-acilo de las

15 glucosilamidas, glucosilureas o carbamatos de glucosilo, se hacen reaccionar los correspondientes trioles (fórmula VIII) con agente acilantes en presencia de bases auxiliares inorgánicas u orgánicas. Son agentes acilantes adecuados cloruros de ácido tales como cloruro de acetilo, cloruro de benzoílo o cloruro de p-nitrobencilo, oanhídridos tales como, por ejemplo, anhídrido acético. Esto da como resultado la formación de ésteres según la fórmula XI

20 (XI)

con R1, R2, R10 y X teniendo los significados dados anteriormente y

R13 representando acetilo, benzoílo o p-nitrobenzoílo.

Las reacciones de O-acilación se llevan a cabo preferiblemente en disolventes orgánicos inertes. Aquellos quepueden utilizarse son hidrocarburos halogenados tales como diclorometano, triclorometano o 1,2-dicloroetano,

25 éteres tales como tetrahidrofurano o 1,4-dioxano, ésteres tales como acetato de etilo y amidas tales como dimetilformamida.

Es también posible que estén indicadas como disolventes adecuados bases orgánicas solas tales como trietilamina

o piridina. Las bases que pueden utilizarse son todas las bases utilizadas en la química orgánica para O-acilaciones.Preferiblemente, se utilizan trietilamina, piridina o la mezcla piridina/4-dimetilaminopiridina. Los triésteres (fórmula XI)30 pueden cristalizarse fácilmente a partir de disolventes orgánicos. Se prefieren particularmente para la cristalización los disolventes polares, tales como alcoholes de cadena corta, es decir, metanol, etanol, n-propanol o isopropanol. Otros disolventes adecuados para la cristalización de los triésteres (fórmula XI) son mezclas de disolventes orgánicos con disolventes inorgánicos u orgánicos polares, por ejemplo, tetrahidrofurano-metanol, tetrahidrofuranoagua, etanol-agua e isopropanol-agua. Los triésteres (fórmula XI) que se han purificado mediante recristalización

35 única o, cuando sea apropiado, múltiple, se vuelven a transformar en trioles (fórmula VIII) mediante hidrólisis o transesterificación de los tres grupos O-acetilo. Se conocen una multiplicidad de tipos de escisión de éster en laquímica orgánica. Para la preparación de los trioles (fórmula VIII) a partir de los triésteres (fórmula XI) citados puede hacerse la transesterificación de los grupos acilo en presencia de metanol y cantidades catalíticas de metanolato desodio, que es conocido como hidrólisis ZEMPLEN en química orgánica.

40 La tercera etapa de reacción en la preparación de los compuestos de fórmula 1 según la invención comprende la escisión selectiva del grupo protector del grupo 2-amino en el azúcar en los compuestos de fórmula VIII. En esta reacción, ha de tenerse particular cuidado de que no haya ninguna eliminación simultánea del grupo 1-amido o 1carbamido o 1-(alcoxicarbonilamido) en el azúcar de los compuestos de fórmula VIII.

El grupo benciloxicarbonilo, que se utiliza preferiblemente en C-2 de los aminohexanos puede escindirse cuantitativa

45 y selectivamente, con retención del grupo 1-amido, 1-carbamido o 1-alcoxicarbonilamido, en las condiciones de hidrogenólisis. Esta hidrogenólisis proporciona las glucosilamidas, glucosilureas o carbamatos de glucosilo con ungrupo 2-amino libre en el azúcar con la siguiente fórmula estructural (XII)

(XII)

con los significados anteriormente indicados para R1, R2 y X.

Son ejemplos de catalizadores adecuados para la hidrogenólisis metales nobles tales como platino o paladio que seadsorben sobre carbono activo. Se utiliza preferiblemente paladio/carbono (al 5 % o al 10 %). La hidrogenólisis5 puede llevarse a cabo a presión atmosférica o a presión elevada en un recipiente a presión adecuado. Los disolventes inertes son adecuados para la hidrogenación tales como, por ejemplo, alcoholes tales como metanol,etanol o propanol, éteres tales como tetrahidrofurano o 1,4-dioxano, o ácidos carboxílicos tales como ácido acético,

o mezclas de los mismos. Cuando sea apropiado, se mezcla el disolvente con agua o ácidos diluidos tales comoácido clorhídrico o ácido sulfúrico. Por supuesto, cuando se añaden dichos ácidos, se obtienen las 2-amino-210 desoxiglucosilamidas, carbamatos de 2-amino-2-desoxiglucosilo y 2-amino-2-desoxiglucosilureas según la fórmula XII en forma de las sales de amonio de estos ácidos. El grupo protector terc-butiloxicarbonilo, que se prefiere utilizarigualmente en los compuestos de fórmula VIII, puede escindirse mediante procedimientos conocidos a partir de labibliografía utilizando ácidos minerales tales como ácido clorhídrico o ácido sulfúrico. En este caso también, seobtienen selectivamente las 2-amino-2-desoxiglucosilamidas, carbamatos de 2-amino-2-desoxiglucosilo y 2-amino-2

15 desoxiglucosilureas de fórmula XII en forma de las sales de amonio de los ácidos utilizados para la escisión.

La cuarta etapa de reacción para la síntesis de los compuestos de fórmula I, según la invención, comprende elligamiento de las aminoglucosilamidas, amidas, carbamatos de aminoglucosilo o aminoglucosilureas según lafórmula XII, o de sus sales, con un derivado de aminoácido adecuado. Los derivados de aminoácido adecuados son aminoácidos N-bloqueados (fórmula XIII)

20 (XIII)

con R7 teniendo el significado citado anteriormente,

R8 representando hidrógeno o metilo y

R14

representando un grupo protector que se utiliza habitualmente en síntesis peptídica y que puede eliminarseselectivamente de nuevo reteniendo el enlace peptídico.

25 Los grupos protectores para el grupo amino en la fórmula XIII que se utilizan preferiblemente son los anteriormente citados y se prefieren particularmente los grupos benciloxicarbonilo o t-butiloxicarbonilo. El ligamiento de la 2-amino2-desoxiglucosilamida, carbamato de 2-amino-2-desoxiglucosilo o 2-amino-2-desoxiglucosilurea de fórmula XII con un derivado de aminoácido de fórmula XIII puede llevarse a cabo mediante procedimientos convencionales de síntesis peptídica (E. Wunsch y cols.: Synthese von Peptiden (Synthesis of peptides) en: Methoden der Org. Chemie

30 (Methods of Org. Chemistry) (Houben-Weyl) (E. Muller, editor), vol. XV/1 y XV/2, 4ª edición, publicado por Thieme, Stutgart (1974).

Son ejemplos de procedimientos convencionales la condensación del grupo amino en el compuesto de fórmula XII con un derivado de aminoácido de fórmula XIII en presencia de agentes deshidratantes, por ejemplo, diciclohexilcarbodiimida o diisopropilcarbodiimida.

35 La condensación de los compuestos de fórmula XII con los de fórmula XIII puede llevarse a cabo también cuando se activa el grupo carboxilo. Es un grupo carboxilo activado posible, por ejemplo, un anhídrido de ácido, preferiblemente un anhídrido mixto, tal como un acetato del ácido, o una amida del ácido, tal como una imidazolida, o un éster activado. Son ejemplos de ésteres activados ésteres cianometílicos, ésteres pentaclorofenílicos y ésteres de Nhidroxiftalimida. Los ésteres activados pueden obtenerse también a partir del ácido (fórmula XIII) y N

40 hidroxisuccinimida o 1-hidroxibenzotiazol en presencia de un agente deshidratante, tal como carbodiimida. Los derivados de aminoácidos se conocen y pueden prepararse de una manera conocida. La condensación del compuesto amino de fórmula XII con los compuestos de carboxilo opcionalmente activados de fórmula XIII proporciona los peptidoglucolípidos de fórmula XIV.

(XIV)

con los significados anteriormente citados para R1, R2, R7, R8, R14 y X.

En una etapa de procedimiento final para la preparación de los compuestos según la fórmula I, se elimina el grupoprotector R14 de los compuestos de fórmula XIV. Ha de tenerse cuidado durante esta etapa de que no se escindan5 los otros grupos amida, uretano o urea presentes en los compuestos de fórmula XIV. Los grupos protectores R14 que se utilizan preferiblemente en los compuestos de fórmula XIV, el grupo N-carbobenzoxi y el grupo N-tercbutiloxicarbonilo, pueden eliminarse reteniendo el grupo amida, uretano o urea. El grupo carbobenzoxi puedeeliminarse selectivamente mediante hidrogenólisis en presencia de un metal noble tal como, por ejemplo, paladiosobre carbono, en un disolvente adecuado tal como etanol, metanol, ácido acético glacial o tetrahidrofurano. Los10 disolventes pueden utilizarse en forma del disolvente puro o combinados entre sí o con agua. La reacción puede llevarse a cabo bien a presión atmosférica o bien a presión elevada. El grupo terc-butiloxicarbonilo R14 en los compuestos de fórmula XIV puede eliminarse mediante procedimientos acidolíticos. Los ejemplos de condicionesadecuadas son el uso de cloruro de hidrógeno en disolventes adecuados tales como, por ejemplo, ácido acéticoglacial, éter dietílico, dioxano o acetato de etilo, a temperatura ambiente. Los procedimientos de este tipo para la

15 escisión de los carbamatos de terc-butilo se conocen en principio. Las peptidoglucosilamidas, carbamatos de peptidoglucosilo y peptidoglucosilureas de fórmula I que se obtienen de esta manera se aíslan en forma de sólidoscristalinos o amorfos, mediante procedimientos conocidos per se y si es necesario, se purifican medianteprocedimientos estándar tales como recristalización, cromatografía, extracción, etc.

Los compuestos según la invención de fórmula I pueden prepararse también mediante una segunda ruta sintética

20 con resultados similarmente buenos. Esta segunda ruta sintética difiere de la primera, que se describe anteriormente, porque es diferente la secuencia de ligamiento de los sintones aminoácidos de aminoazúcar, aminaR1-NH2 y ácido carboxílico R2-CH2-CO2-H, o derivado de ácido carbónico R2-O-CO-halógeno, o R2-NCO, con los significados anteriormente citados de R1 y R2. En esta segunda ruta, se utilizan como componente de partida 2-N(aminoacil)aminoazúcares adecuados de fórmula XV

(XV)

con el significado anteriormente citado para R7 y R8 y en la que R14 representa un grupo protector de amino conocidoen la química de péptidos, preferiblemente el grupo benciloxicarbonilo o terc-butiloxicarbonilo. Los compuestos defórmula XV que se obtienen así se condensan después con los compuestos amino de fórmula III, proporcionando glucosilaminas de fórmula general XVI

30 (XVI)

con R1, R7, R8 y R14 teniendo significados consistentes con la fórmula I y la definición de R6.

Todos los procedimientos descritos anteriormente para la preparación de los compuestos de fórmula general VIpueden utilizarse para la preparación de los compuestos de fórmula general XVI. Se hacen reaccionar después loscompuestos de fórmula XVI con los derivados de ácido carboxílico anteriormente citados (fórmula VII) o con ésteres

halogenofórmicos (fórmula IX) o con isocianatos orgánicos (fórmula X) para dar las 2(aminoacil)aminoglucosilamidas de fórmula XIV (con X=-CH2-) o los carbamatos de 2-(aminoacil)aminoglucosilo defórmula XIV (con X=-O-) o las 2-(aminoacil)aminoglucosilureas de fórmula XIV (con X=-NH-). Estas reacciones deacilación pueden llevarse a cabo generalmente mediante los procedimientos descritos anteriormente para lareacción de glucosilaminas con derivados de ácido carboxílico o carbónico.

Los intermedios (fórmula XIV) que se obtienen de este modo pueden purificarse mediante el procedimiento depurificación física anteriormente citado. Sin embargo, es preferible convertir los compuestos de fórmula XIV, mediante los procedimientos de O-acilación descritos anteriormente, en los tri-O-acetatos o los tri-O-benzoatos defórmula general XVII

(XVII)

con significado para las variables consistente con la fórmula I.

Estos compuestos pueden cristalizarse fácilmente, preferiblemente a partir de disolventes polares tales como metanol o etanol y así purificarse. Los derivados cristalinos purificados de fórmula XVII se convierten después en lostrioles de fórmula XIV mediante los procedimientos anteriormente citados de hidrólisis de éster, que se utilizanampliamente especialmente en química de azúcares. La eliminación final de los grupos protectores en el aminoácido de los compuestos de fórmula XIV se ha descrito ya anteriormente para la preparación de los compuestos defórmula I. La invención se refiere también a sales de los compuestos de fórmula I. Estas son principalmente las salesno tóxicas que pueden utilizarse habitualmente en farmacia, por ejemplo, cloruros, acetatos y lactatos, o salesinertes de los compuestos de fórmula I.

El término “ácido débil” significa cualquier ácido que tenga un valor de pKa (el –log de la Ka) de entre aproximadamente 1,0 y aproximadamente 9,5 utilizando tablas o valores estándar. Aunque sin pretender limitar estainvención, se describen los siguientes ejemplos de ácidos débiles con nombre, fórmula y pKa aproximado. Ácidoacético, H(C2H3O2) (pKa 4,76); ácido ascórbico (1), H2(C6H6O6) (pKa 4,10); ácido acetilsalicílico, H8(C9O4) (pKa 3,5);ácido butanoico H(C4H7O2) (pKa 4,83); ácido carbónico, H2CO3 (pKa 4,83, forma 1); ácido crómico HCrO4-(pKa6,49, forma 2); ácido cítrico, H3(C6H5O7), (pKa 3,14 forma 1); ácido cítrico, H2C6H5O7-, (pKa 4,77, forma 2); ácido cítrico, (HC6H5O7)-, (pKa 6,39 forma 3); ácido fórmico, H(CHO2), (pKa 3,75); ácido fumárico, H4(C4O4) (pKa 3,03);ácido heptanoico H(C7H13O2) (pKa 4,89); ácido hexanoico H(C6H11O2) (pKa 4,84), ácido fluorhídrico, HF, (pKa 3,20); isocitrato H8(C6O7) (pKa 3,29); ácido láctico, H(C3H5O3), (pKa 3,08); ácido maleico, H4(C4O4) (pKa 1,83); ácido nicotínico, H5(C6NO2) (pKa 3,39); ácido oxálico H2(C2O4) (pKa 1,23 forma 1); ácido oxálico (HC2O4)-(pKa 4,19, forma2); ácido pentanoico, H(C5H9O2), (pKa 4,84); ácido fosfórico, H3PO4, (pKa 2,16 forma 1); ácido propanoico, H(C3H5O2), (pKa 4,86); ácido pirúvico, H4(C3O3) (pKa 2,39) y ácido succínico H6(C4O4) (pKa 4,19). Cualquier combinación de estos ácidos está también ejemplificada.

Se prefiere el ácido acético. Ácido acetilsalicílico, ácido cítrico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido fluorhídrico,isocitrato, ácido maleico, ácido nicotínico, ácido fosfórico, ácido pirúvico, ácido succínico y ácido tricloroacético sonácidos débiles más comunes que están abarcados individualmente, en combinación y en conjunto.

El término “tensioactivo no iónico” significa un tensioactivo que es una sustancia que reduce la tensión superficialdel material que se disuelve en él y no iónico significa que tiene un grupo polar que no está cargado eléctricamente. El término tensioactivo anfífilo significa un tensioactivo en el que una parte de la molécula de tensioactivo eshidrófoba y otra parte es hidrófila. Los tensioactivos adecuados serán tanto no iónicos como anfífilos y aceptablespara uso veterinario o médico. Puede determinarse fácilmente por los expertos en la técnica si un tensioactivo no iónico particular es aceptable o no para uso médico o veterinario. Hay muchos tensioactivos no iónicos adecuados que pueden utilizarse con esta invención y se proporcionan numerosos ejemplos a continuación.

Se incorporan aquí dos tipos bien conocidos de tensioactivos no iónicos. Estos se conocen como sorbitanos,habitualmente comercializados con la marca comercial Span® y polioxietilensorbitanos, habitualmente comercializados con la marca comercial Tween®. Se incorporan específicamente aquí los siguientes:

monolaurato de sorbitán (Span 20®), monopalmitato de sorbitán (Span 40®), monoestearato de sorbitán (Span60®), triestearato de sorbitán (Span 65®), monooleato de sorbitán (Span 80®), trioleato de sorbitán (Span 85®),monolaurato de polioxietilensorbitán (Tween 20®), monopalmitato de polioxietilensorbitán (Tween 40®),monoestearato de polioxietilensorbitán (Tween 60®), monooleato de polioxietilensorbitán (Tween 80) y trioletato de polioxietilensorbitán (Tween 85). Se pretende que estas descripciones incluyan los ingredientes del nombre comercial, o ingredientes equivalentes, como se enumeran en los catálogos de suministro para estos tensioactivos.Los tensioactivos pueden utilizarse individualmente o en cualquier combinación. Se describen particularmentemonolaurato de sorbitán (Span 20®), monolaurato de polioxietilensorbitán (Tween 20®), monooleato de sorbitán(Span 80®), trioleato de sorbitán (Span 85®), monooleato de polioxietilensorbitán (Tween 80), trioleato de polioxietilensorbitán (Tween 85).

El término “tampón adecuado” significa un tampón que es adecuado para uso veterinario o médico y puedemantener un pH relativamente constante en una solución acuosa de entre aproximadamente 6 y aproximadamente

8. Los tampones fosfato son una realización descrita aquí. Los tampones fosfato pueden prepararse a un pHespecífico en un amplio intervalo mediante el mezclado de sales monobásicas y dibásicas de fosfato de sodio y/ofosfato de potasio en diferentes proporciones. La preparación y uso de diversos tampones de sodio y potasio seconocen bien por un experto en la técnica.

Son otros ejemplos de tampones los siguientes:

ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (también conocido como MES);

ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (también conocido como MOPS);

ácido N-[tris(hidroximetil)]-2-aminoetanosulfónico (también conocido como TES);

ácido 4-(2-hidroxietil)piperazin-1-etanosulfónico (también conocido como HEPES);

[tris(hidroximetil)metil]glicina (también conocida como TRIS).

Parte I. Preparación de las soluciones

Las nuevas formulaciones dadas a conocer aquí son: 1) soluciones madre de glucosilamida y 2) soluciones coadyuvantes glucolipídicas.

1) Se prepara una solución madre de glucosilamida disolviendo un glucolípido en un alcohol y combinandocantidades apropiadas de un ácido débil. Se añade el ácido débil a la solución de glucolípido-alcohol en excesomolar del ácido débil con respecto al glucolípido. Se añade un tensioactivo no iónico a la mezcla de glucolípidoalcohol-ácido, para crear una solución madre de glucosilamida. El glucolípido ejemplificado es acetato de N-(2desoxi-2-L-leucilamino-�-D-glucopiranosil)-N-octadecildodecanoilamida. El alcohol ejemplificado es etanol. El ácidodébil ejemplificado es ácido acético. Los tensioactivos no iónicos son como se describen anteriormente.

Preparación de soluciones madre de glucosilamida. Se añade ácido débil a una solución alcohólica que contieneun glucolípido. Se añade el ácido débil en exceso molar con respecto al contenido de glucolípido. El componenteácido débil debería añadirse de 1,25 a 5 veces la cantidad de glucolípido, en equivalentes molares del glucolípido.En ciertas realizaciones se recomiendan las siguientes cantidades relativas de ácido. El ácido débil debería ser 2,0veces, 2,5 veces, 2,7 veces, 3,0 veces y 5,0 veces y lo más preferiblemente es 2,7 veces tantos moles de ácidocomo moles de glucolípido.

Se añade un tensioactivo no iónico a la mezcla de alcohol-glucolípido anterior, bien antes o bien después de añadirel ácido débil, creando la solución madre de glucosilamida final.

En presencia del ácido débil, la glucosilamida se convierte en la forma acetato del glucolípido. Los glucolípidos defórmula I no son totalmente solubles cuando simplemente se introducen directamente en soluciones acuosas tamponadas. La solución obtenida típicamente de disolver un glucolípido de fórmula I en una solución acuosatamponada es una mezcla lechosa. Investigadores anteriores han intentado homogeneizar tales soluciones demezclas mediante sonicación de la solución lechosa. Sin embargo, la sonicación no asegura que la soluciónpermanecerá homogénea durante el almacenamiento. El enfoque químico para suspender estos compuestos dacomo resultado una solución totalmente soluble, casi ópticamente transparente de glucolípido tamponado acuoso apH apropiado. Cuando se añade ácido débil en cantidad en exceso comparada con el glucolípido, se asegura que todo el glucolípido se convierte en forma soluble y se evita su reversión de vuelta a la forma no soluble.

El ácido débil convierte el glucolípido en una sal farmacéuticamente aceptable. Las sales preferidas son sales notóxicas, que se utilizan habitualmente en preparaciones farmacéuticas y biológicas. Por ejemplo, se obtienencloruros, acetatos, lactatos y sales inertes de los compuestos de fórmula I con los ácidos débiles descritos en lapresente memoria.

Los alcoholes utilizados para disolver el glucolípido pueden ser metanol, etanol, cualquier forma isomérica depropanol o cualquier combinación de los mismos. La solución de glucolípido-alcohol resultante será ópticamentetransparente. Cualquier reacción química que pudiera convertir la forma acetato de glucolípido de vuelta a la formano acetato causaría floculación de los glucolípidos dentro de la solución acuosa. Cuando ocurre la floculación deglucolípido, las moléculas de glucolípido salen de la solución en forma de copos finos, asentándose en el fondo delrecipiente. La concentración inicial de ácido débil en la solución madre de glucosilamida de glucolípido y alcohol determina si habrá alguna floculación de glucolípido. El ácido débil debería estar en exceso molar con respecto alglucolípido para evitar la floculación.

2) Las soluciones coadyuvantes glucolipídicas se preparan introduciendo una cantidad apropiada de la solución madre de glucosilamida en un “tampón adecuado”. El pH de las soluciones coadyuvantes glucolipídicasestables finales aquí descritas debería estar entre aproximadamente 6 y aproximadamente 8. Se prefiere un pH final de entre aproximadamente 6 y aproximadamente 7. Se describe un pH final de entre aproximadamente 6,3 y aproximadamente 6,4.

La solución madre de glucosilamida contiene ácido en exceso de modo que debería tamponarse para usar comoun coadyuvante. Por ejemplo, puede prepararse un tampón fosfato a un pH específico en un amplio intervalomediante mezclado de sales monobásicas y dibásicas de fosfato de sodio o fosfato de potasio en diferentes proporciones. Si se utiliza un tampón fosfato se puede preparar aproximadamente a 20 mM y este tiene un pH de aproximadamente 7,8. Cuando se añade la solución madre de glucosilamida al tampón, se reduce el pH deltampón. Una solución tamponada con fosfato a pH 7,8 da como resultado una solución coadyuvante glucolipídica final con un pH de aproximadamente 6,4. Pueden hacerse ajustes finales al pH, pero típicamente no son necesarios.

La solución madre de glucosilamida que contiene ácido débil y un glucolípido tiene un pH muy bajo. Puede ser necesario elevar el pH a un nivel aceptable. Debería evitarse una base fuerte para este fin, debido a que la adiciónde una base fuerte puede convertir la forma de sal del glucolípido de vuelta a la forma no salina, dando comoresultado la precipitación (floculación) de la forma no salina en el entorno acuoso. Sin embargo, si se desea unabase fuerte, solamente deberían utilizarse pequeñas cantidades. Por ejemplo, se recomienda no utilizar NaOH másde 100 mM, aunque 4,0 mM o menos es óptimo.

La solución de tamponación puede incluir opcionalmente algo de NaCl, pero no es necesario. Las concentracionesde NaCl pueden estar en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 mM. Se prefieren cantidadesmenores de NaCl frente a cantidades mayores. Los ejemplos aquí no tienen nada de NaCl o tienen NaCl 15 mM.NaCl 100 mM no es adecuado ya que ocurre floculación. No se espera floculación con concentraciones de NaCl 15mM o menores. No se espera floculación con concentraciones de NaCl 30 mM o menores. No se espera floculacióncon concentraciones de NaCl 50 mM o menores.

Parte II. Caracterización de la solución coadyuvante glucolipídica

Puede controlarse la estabilidad de la solución coadyuvante glucolipídica durante almacenamiento mediante simple observación visual o utilizando instrumentos analíticos apropiados. Las moléculas glucolipídicas formanmicelas cuando están en solución acuosa y es posible determinar precisamente el tamaño de las micelas con undifractómetro láser. Dicha medida puede utilizarse para determinar si hay floculación de las moléculas glucolipídicas.

Un enfoque alternativo para medida de la estabilidad a tiempo real es realizar ensayos de estabilidad acelerada. Conensayos de estabilidad acelerada, se somete la solución coadyuvante a una temperatura de aproximadamente 37 ºCdurante aproximadamente 7 días, seguido de incubación a aproximadamente 4 ºC durante aproximadamente 2 díascon agitación constante. La incubación aproximadamente a 37 ºC durante aproximadamente 7 días representa elalmacenamiento aproximadamente a 4 ºC durante un periodo de aproximadamente 1 año. La incubaciónaproximadamente a 4 ºC durante aproximadamente 2 días con agitación constante representa la condición de estrésa la que la solución coadyuvante glucolipídica podría enfrentarse durante el transporte.

Para determinar si la solución coadyuvante glucolipídica es isotónica con el citoplasma, puede determinarse laosmolaridad. Pueden añadirse diferentes concentraciones de cloruro de sodio y determinarse la osmolaridad de lasolución resultante utilizando un osmómetro. Aumentar las concentraciones de cloruro de sodio, además de aumentar la osmolaridad, tiende también a hacer a la solución más turbia. La turbidez se cree que está causada porla agregación de micelas en partículas mayores. Las soluciones que son difíciles o imposibles de filtrar utilizando unfiltro de 0,2 !m generalmente no son aceptables para uso comercial porque a menudo se utiliza filtraci

ón terminal para asegurar la esterilidad de las soluciones coadyuvantes preparadas a escala comercial. Puede utilizarse unanálisis de microscopía electrónica para determinar si hay agregación de micelas como resultado de demasiada sal.

Pueden utilizarse coadyuvantes no glucolípidos adicionales en la solución coadyuvante glucolipídica en combinación con los descritos anteriormente. En otra realización de la invención se añaden moléculas inmunoestimulantes adicionales a la solución coadyuvante glucolipídica. Las moléculas inmunoestimulantes se conocen bien en la técnica, e incluyen saponinas, Quil A, bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDA) y Carbopol.

Quil A es un extracto purificado de la corteza del árbol sudamericano Quillaja saponaria. Quil A induce tanto respuestas humorales como respuestas mediadas por células. A menudo, se utiliza Quil A con colesterol porque el colesterol elimina los efectos secundarios menos deseables cuando se añade en las proporciones apropiadas. Elcolesterol forma complejos insolubles con Quil A que forman estructuras de tipo hélice a medida que el colesterol seune a Quil A, exponiendo así las unidades de azúcar de la molécula que ayudan a estimular la respuesta inmune.

El bromuro de dimetildioctadecilamonio, DDA, es un tensioactivo catiónico con cadenas alquilo de 18 carbonos. Esuna amina cuaternaria anfífila. La interacción directa de DDA y antígeno es necesaria para obtener una respuesta inmune óptima, porque el DDA actúa como vehículo del antígeno mediante la unión directa del antígeno a lainterfase aceite/agua. Estimula tanto las respuestas inmunes humoral como las mediadas por células.

El Carbopol es otra molécula inmunoestimulante útil que puede utilizarse con esta invención. Es un homopolímerode ácido acrílico que está reticulado con éter polialquenílico.

Parte III. Uso de la solución coadyuvante glucolipídica

La solución coadyuvante glucolipídica, en una forma de sal farmacéuticamente aceptable, puede mezclarse conun antígeno. Los antígenos convenientes incluyen: proteínas patógenas microbianas, glucoproteínas, lipoproteínas,péptidos, glicopéptidos, lipopéptidos, toxoides, carbohidratos y antígenos específicos de tumor. Los antígenospueden derivar de una diversidad de fuentes. Los antígenos de patógenos microbianos incluyen bacterias, virus y organismos parásitos que causan enfermedades. Pueden emplearse mezclas de dos o más antígenos. El antígeno puede estar muerto, naturalmente atenuado, vivo modificado o ser un extracto de proteína, proteína producidarecombinantemente, un péptido sintetizado químicamente o cualquier otra cosa que estimule una respuesta inmune.El antígeno peptídico puede existir en forma de un péptido libre o conjugado con el glucolípido o conjugado con otrosepítopes de células B o células T conocidos.

La solución coadyuvante glucolipídica estable puede combinarse con coadyuvantes o componentes que seconocen por tener propiedades coadyuvantes adicionales. Los coadyuvantes adicionales que pueden combinarsecon la solución coadyuvante glucolipídica incluyen polímeros, compuestos terpenoides de origen natural en suforma bruta o parcialmente purificada, amina cuaternaria anfífila, derivados de materiales de pared celular bacteriana y análogos sintéticos de pared celular bacteriana o componentes de ADN. La solución coadyuvante glucolipídicapuede utilizarse con o combinarse con uno o más agentes tales como antibióticos o antígenos diferentes. Los 12

antígenos bacterianos o virales pueden estar muertos o vivos modificados. Los antígenos virales muertos sepreparan haciendo crecer virus en cultivo de tejido e inactivando los virus mediante tratamientos químicos. Algunos virus pueden hacerse crecer en huevos con embrión. El antígeno viral muerto puede añadirse a una solución quecontiene solución coadyuvante glucolipídica y la solución resultante puede utilizarse para vacunar a los animales

5 para conseguir protección contra las infecciones virales.

En una realización de esta invención, la solución coadyuvante glucolipídica puede utilizarse como diluyente paraantígenos virales vivos modificados. Los patógenos virales pueden atenuarse en su virulencia pasándolos a cultivode tejido durante varias generaciones o mediante manipulaciones específicas del genoma viral. Dichas cepasatenuadas de virus pueden hacerse crecer hasta muy altos títulos en cultivo de tejido y pueden utilizarse como

10 antígenos de vacuna. Las cepas virales atenuadas se designan como antígenos virales vivos modificados. Aunque estas cepas son menos virulentas, son aún altamente inmunogénicas cuando se utilizan como antígenos en lavacuna y ofrecen protección contra la infección por cepas virulentas. En caso de utilizar la solución coadyuvante glucolipídica como diluyente para antígenos virales vivos modificados, la solución coadyuvante glucolipídicadebería ensayarse para asegurar que no tiene efecto viricida sobre el virus particular de interés.

15 La propiedad viricida de la solución coadyuvante glucolipídica sobre antígenos virales vivos modificados puede determinarse en un experimento in vitro. Se rehidratan antígenos virales liofilizados con la solución coadyuvante glucolipídica o con agua. Se siembran las soluciones virales resultantes sobre una monocapa de células permisivas. Se determina el título del antígeno viral mediante el recuento del número de placas formadas sobre lamonocapa. La diferencia en los títulos virales obtenidos entre las muestras rehidratadas con agua y la solución

20 coadyuvante glucolipídica puede utilizarse para determinar el efecto viricida, si lo hubiera, de la solución coadyuvante glucolipídica sobre cualquier virus vivo.

Los antígenos virales vivos modificados pueden liofilizarse y proporcionarse en forma de tortas liofilizadas en una preparación de vacuna comercial. En general, estas tortas liofilizadas de antígenos virales vivos modificados serehidratan con una solución diluyente y se utilizan para vacunación parenteral. Los ejemplos de diluyentes incluyen

25 una solución de agua que contiene solución salina tamponada con fosfato. Si la solución diluyente contiene una molécula inmunoestimulante conocida, puede mejorarse la eficacia de la vacunación con los antígenos virales vivosmodificados. En una realización de la presente invención, se utiliza la solución coadyuvante glucolipídica como solución diluyente.

Ejemplos

30 Ejemplo 1. Preparación de una composición de glucosilamida insoluble con igual concentración de Bay 15-5831® y ácido acético.

Tabla 1. Una composición no adecuada para uso comercial.

Reactivo

Cantidad (200 ml)

Etanol (100 %)

176,1 ml

Tween 20

4,0 ml

Ácido acético glacial

1,5 ml

Bay 15-5831®

18,4 g

Bay 15-5831®, registrado en la compañía Bayer, es el nombre comercial

de N-(2-desoxi-2-L-leucilamino-�-Dglucopiranosil)-N-octadecildodecanoil-amida. Cuando se utiliza este compuesto preparando una solución

35 coadyuvante utilizando las composiciones descritas en la tabla 1 anterior, en la que se utiliza el ácido acético en igual concentración molar que el glucolípido y el glucolípido está en su forma de base libre, el glucolípido esinsoluble y flocula.

Ejemplo 2. Una solución madre de glucosilamida soluble utilizando los mismos componentes que en el ejemplo 1, pero con un aumento de la concentración de ácido acético respecto a la concentración de glucolípido, da como

40 resultado una solución madre de glucosilamida soluble.

Tabla 2. Composición de una solución madre de glucosilamida.

Reactivo

Cantidad (50 ml)

Etanol (60 % v/v)

44,64 ml

Tween 20

1,12 ml

Ácido acético glacial

0,68 ml

Bay 15-5831®

3,49 g

En este caso se utilizó etanol al 60 % (v/v) y la relación molar de ácido acético a glucolípido es de 2,0. Se remplazóel etanol anhidro del ejemplo 1 por etanol al 60 % en agua. La solución madre de glucosilamida resultante era 45 ópticamente transparente y no había sedimentación en el fondo del recipiente. Se añade esta solución madre de

glucosilamida a diversos tampones, preparando la solución coadyuvante glucolipídica del ejemplo 3 siguiente.

Ejemplo 3. Preparación de soluciones coadyuvantes glucolipídicas. Se prepararon soluciones de tampón fosfatoa diferentes pH. Se preparó una solución madre 2 M de fosfato de sodio monobásico disolviendo 138 g de salNaH2PO4·H2O en 250 ml de agua DI en un vaso de precipitados y completando un volumen final de 500 ml. Deforma similar, se preparó una solución madre 2 M de fosfato de sodio dibásico disolviendo 142 g de NaH2PO4 en 300 ml de agua DI en un vaso de precipitados y completando un volumen final de 500 ml. Ambas soluciones madre seesterilizaron por filtración utilizando un filtro de 0,2 !m.

Tabla 3. Composiciones de solución madre 1 M de tampón fosfato de sodio a diferentes pH.

pH calculado

Solución de Na2HPO4 (ml) Solución de NaH2PO4·H2O (ml) Volumen total de solución madre 2 M (ml) Agua estéril DIañadida (ml) Volumen total de solución madre 1 M (ml)

6,0

87,7 12,3 100 100 200

6,5

68,5 31,5 100 100 200

7,0

39,0 61,0 100 100 200

7,5

16,0 84,0 100 100 200

7,8

8,5 91,5 100 100 200

10 Se prepararon diferentes volúmenes de soluciones madre 2 M de fosfato de sodio monobásico y fosfato de sodio dibásico como se muestra en la Tabla 3, después se obtuvieron soluciones madre 1 M de tampón fosfato de sodio a diferentes niveles de pH. Se diluyeron después las soluciones tampón fosfato 1 M 50 x consiguiendo tamponesfosfato 20 mM.

Se prepararon soluciones coadyuvantes glucolipídicas utilizando estos tampones madre y las soluciones madre 15 de glucosilamida del ejemplo 2.

Se añadieron 5 ml de solución madre de glucosilamida preparada como en el ejemplo 2 a 96 ml de cada una de estas soluciones de fosfato 20 mM. La solución coadyuvante glucolipídica resultante contenía ácido acético 12,5 mM y glucolípido 6,33 mM. El glucolípido está ahora en forma acetato.

Ejemplo 4. Significación del pH final de la solución coadyuvante glucolipídica.

20 En otro conjunto de experimentos, se ensayó la significación del pH final de diversas soluciones evaluando cómo afecta el pH a la floculación. Se preparó un tampón fosfato 20 mM a un pH inicial de 7,8. La Tabla 4 muestra el coadyuvante glucolípido preparado utilizando la glucosilamida preparada como en el ejemplo 1, en el queglucolípido y ácido acético se utilizaron a iguales concentraciones molares. Nota: el pH final no cayó mucho (Tabla 4), indicando la efectividad del tampón. Las concentraciones de NaCl variaron. Se compararon las lecturas de

25 densidad óptica (D.O.) a 600 nm en la Tabla 4 con lecturas similares en la Tabla 5, en la que las soluciones coadyuvantes glucolipídicas se prepararon con soluciones madre de glucosilamida que contenían dos veces la relación molar de ácido acético a glucolípido, preparadas como en el ejemplo 2. Utilizar la concentración o cantidad de ácido acético mayor da como resultado una floculación mínima. La floculación era mayor en la muestra no filtradaque en las muestras filtradas. Además, al aumentar la concentración de NaCl, hay un aumento de la floculación e

30 incluso precipitación. Se preparó la solución coadyuvante glucolipídica descrita en la Tabla 5 con un tampón fosfato que tiene un pH inicial de 8,0; el pH final de la solución coadyuvante glucolipídica era entre 6,8 y 7,0. Unareducción adicional del pH final de la solución coadyuvante glucolipídica puede dar como resultado una solucióncoadyuvante glucolipídica con menos turbidez y sin floculación.

Tabla 4. Preparación de composiciones de glucosilamida que contienen una cantidad equimolar de ácido acético y35 glucolípidos (véase el ejemplo 1).

Concentración de NaCl (mM)

Volumen de tampón (ml) Volumen de composiciones madre glucolipídicas (ml) pHfinal D.O. a 600 nm

0

480 25 7,42 1,693

15

480 25 7,39 1,873

100

480 25 7,33 2,742

Tabla 5. Preparación de solución coadyuvante glucolipídica utilizando solución madre de glucosilamida quecontiene dos veces la cantidad molar de ácido acético que de glucolípido (véase el ejemplo 2).

Concentración de NaCl (mM)

Volumen de tampón (ml) Volumen de solución madre de glucosilamida (ml) pH final D.O. a 600 nm

0

480 25 6,93 0,146

15

480 25 6,88 0,487

100

480 25 6,84 2,826

Una densidad óptica (D.O.) menor de 0,1 representa una solución translúcida. Una densidad óptica de entre 0,1 y 0,5 es homogénea con ligera turbidez, una densidad óptica de 0,5 a 1,0 tiene cierta turbidez, una densidad óptica de5 1,0 a 1,5 se considera turbia. Una densidad óptica superior a 1,5 es turbia y no es probable que sea filtrable utilizando un filtro de 0,2 !m. La última generalmente no se consideraría comercialmente adecuada.

Ejemplo 5. Titulación de coadyuvante glucolipídico con ácido acético mostrando que la floculación puede revertirse.Determinando si añadir cantidades crecientes de ácido acético al coadyuvante glucolipídico que muestra floculaciónrevertiría la floculación, se preparó un coadyuvante glucolipídico como se describe en el ejemplo 1. Este

10 coadyuvante glucolipídico mostró floculación incluso en ausencia de NaCl. Se añadió una concentración creciente de ácido acético a esta mezcla coadyuvante glucolipídica floculada. Se diluyó el ácido acético 16,6 veces con agua,consiguiendo una concentración de la solución de trabajo 1 M. Después, se añadieron 15!l de esta solución 1 M a15 ml de mezcla coadyuvante glucolipídica aumentando la concentración de ácido acético en 1 mM. Al aumentar laconcentración de ácido acético, se reducía el pH del coadyuvante glucolipídico y se disolvían los flóculos. Sin

15 embargo, el coadyuvante glucolipídico permanecía algo turbio. Esta observación confirma que aumentar la concentración de ácido acético convierte la base libre de Bay 15-5381 en una forma acetato, que es más soluble ensolución acuosa.

Tabla 7. Titulación de coadyuvante glucolipídico con ácido acético.

Volumen de coadyuvante glucolipídico

Volumen de ácido acético 1 N añadido pH de la solución

15 ml

0 7,25

15 ml

15 !l (1 mM) 7,21

15 ml

30 !l (2 mM) 7,10

15 ml

60 !l (4 mM) 6,97

15 ml

150 !l (10 mM) 6,44

15 ml

750 !l (50 mM) 4,57

20 Ejemplo 6. Preparación de una segunda solución coadyuvante glucolipídica estable con y sin NaCl. Después de establecer la importancia de un aumento de la cantidad de ácido acético en el mantenimiento de la estabilidad de lassoluciones glucolipídicas, se decidió utilizar la composición mostrada en la Tabla 8 preparando en primer lugar una solución madre de glucosilamida y utilizar después esta preparando otra solución coadyuvante glucolipídica con y sin NaCl. Esta solución madre de glucosilamida es similar a la solución del ejemplo 2, con 4 veces el volumen

25 total y cantidades relativamente mayores de ácido acético y Tween 20.

Tabla 8. Composición de una solución madre de glucosilamida.

Reactivo

Cantidad (200 ml)

Etanol al 60 % (v/v)

179 ml

Tween 20

4,0 ml

Ácido acético

3,0 ml

Bay 15-5381

13,96 g

Se prepararon tres soluciones coadyuvantes glucolipídicas diferentes con concentraciones variables de NaCl utilizando el tampón fosfato del ejemplo 3 y la solución madre de glucosilamida preparada como en la Tabla 8.

30 Como la formulación del ejemplo 4, Tabla 5, se preparó una solución coadyuvante glucolipídica que contenía NaCl 0 mM, 15 mM y 100 mM. Las soluciones de NaCl 0 mM y 15 mM pudieron filtrarse a través de un filtro de 0,2!m. La solución coadyuvante glucolipídica que contenía NaCl 100 mM no pudo filtrarse a través de un filtro de 0,2!m.

Tabla 9. Preparación de soluciones coadyuvantes glucolipídicas estables con y sin NaCl.

Concentración de cloruro de sodio (mM)

Volumen de tampón (ml) Volumen de solución madre de glucosilamida (ml) pHfinal D.O. a 600 nm

0

465 35 6,39 0,039

15

465 35 6,37 0,073

100

465 35 6,29 0,439

Se dispusieron 20 ml de cada una de las soluciones coadyuvantes glucolipídicas en viales de vidrio de 30 ml y seincubaron a temperatura ambiente y a 4 ºC. Se hicieron observaciones visuales a intervalos regulares. Inicialmente,5 la solución coadyuvante glucolipídica con NaCl 0 mM era ópticamente transparente. La solución coadyuvante glucolipídica que contenía NaCl 15 mM era ligeramente turbia y tenía una D.O. de 0,073 a 600 nm. La solución coadyuvante glucolipídica que contenía NaCl 100 mM era turbia y tenía una D.O. de 0,439 a 600 nm. Tabla 9. Ninguna de estas soluciones coadyuvantes glucolipídicas mostró ningún signo de floculación tanto a temperatura ambiente como a 4 ºC. Se observaron estas soluciones coadyuvantes glucolipídicas durante un periodo de un año

10 sin cambios de apariencia.

Ejemplo 7. Titulación de una solución coadyuvante glucolipídica estable con NaOH

Se obtuvo inicialmente una solución coadyuvante glucolipídica ópticamente transparente y estable sin NaOH.Estableciendo que la eliminación o uso de una cantidad mínima de NaOH era esencial evitando la floculación, esnecesario mostrar que una adición gradual de NaOH induciría la floculación en una mezcla glucolipídica que de lo15 contrario sería estable. Se añadieron volúmenes apropiados de NaOH 1 N a 15 ml de solución coadyuvante glucolipídica sin NaCl añadido, como se prepara en la Tabla 10 a continuación. Se aumentó gradualmente el NaOHdesde 1 mM a 12 mM (Tabla 10). Se preparó la solución coadyuvante glucolipídica utilizada en este experimento utilizando la solución madre de glucosilamida descrita en el ejemplo 6. Al aumentar la concentración de NaOH en la solución coadyuvante glucolipídica, aumentó gradualmente el pH de la formulación junto con la aparición de

20 floculación.

Tabla 10. Titulación de una solución coadyuvante glucolipídica estable con NaOH.

Volumen de coadyuvante glucolipídico

Volumen de NaOH 1 N añadido (mM) pH de la solución

15 ml

0 6,21

15 ml

15 !l (1 mM) 6,38

15 ml

30 !l (2 mM) 6,48

15 ml

60 !l (4 mM) 6,68

15 ml

150 !l (10 mM) 7,11

15 ml

750 !l (50 mM) 12,17

Ejemplo 8. Cuantificación del componente glucolipídico utilizando HPLC

Se utilizó la siguiente metodología en el análisis por HPLC de Bay 15-5831®. Se utilizaron los parámetros de HPLC25 descritos en la Tabla 11.

Tabla 11. Sumario de los parámetros utilizados en el procedimiento de HPLC cuantificando Bay 15-5381.

Parámetro

Detalles

Columna

Hamilton PRP-1, 7 !m, 250 x 4,6 mm

Flujo

1,5 ml/min

Volumen de inyección

10 !l

Longitud de onda del detector

210 nm

Fase móvil A

Ácido perclórico al 0,4 %, v:v

Fase móvil B

Acetonitrilo

Gradiente

0 min 40 % de A/60 % de B 15 min 30 % de A/70 % de B 20 min 30 % de A/70 % de B 35 min 10 % de A/90 % de B

50 min 10 % de A/90 % de B 51 min 40 % de A

Tiempo de funcionamiento

65 min

Tiempo de retención de Bay 15-5381

Aproximadamente 25 minutos

Tabla 12. Patrones de Bay 15-5831®

Patrón

Concentración

1

0,103 mM

2

0,206 mM

3

0,412 mM

4

0,618 mM

5

0,824 mM

6

1,03 mM

5 Se prepararon patrones en el intervalo de 0,10 a 1,03 mM y se inyectaron en una HPLC. Se muestra en la Tabla 12 un sumario de los patrones. Se calentaron las muestras a temperatura ambiente y se invirtieron 5 veces antes deluso. Se añadió 1 ml de muestra a 6 ml de metanol en un matraz volumétrico de 10 ml. Se sometieron después asonicación las muestras durante 10 minutos y después se diluyeron al volumen y se mezclaron. Se realizó una regresión lineal de los patrones con áreas de pico representadas frente a concentración. Se calcularon después las

10 muestras frente a la curva.

Ejemplo 9. Producción a escala de treinta (30) litros. Se preparó un lote de 30 l de solución coadyuvante glucolipídica con una composición como se describe en el ejemplo 6. Este lote contenía NaCl 15 mM.

Utilizando esta preparación de 30 l, se prepararon cinco subsoluciones diferentes con concentración creciente deNaOH. La concentración de NaOH aumentó de 0 mM a 1 mM, 2 mM, 4 mM, 8 mM y 12 mM. Se tomaron alícuotas

15 de la muestra para cada concentración de NaOH para medida del pH y observación visual. Al aumentar las concentraciones de NaOH, aumentó el pH del coadyuvante glucolipídico, junto con una floculación aumentada. Lafloculación empezó a aparecer a una concentración de NaOH 2 mM a temperatura ambiente y a 4 ºC la floculaciónempezó a aparecer a NaOH 4 mM.

Tabla 13. Características del coadyuvante glucolipídico de lote de 30 l con concentración creciente de NaOH

N.º de muestra

Descripción Concentración medida (mM) D.O. a 600 nm pH

Muestra 1 de 30 l

NaCl 15 mM, NaOH 0 mM 6,21 0,218 6,42

Muestra 2 de 30 l

NaCl 15 mM, NaOH 1 mM 6,3 0,137 6,52

Muestra 3 de 30 l

NaCl 15 mM, NaOH 2 mM 6,24 0,137 6,59

Muestra 4 de 30 l

NaCl 15 mM, NaOH 4 mM 6,17 0,15 6,80

Muestra 5 de 30 l

NaCl 15 mM, NaOH 8 mM 6,26 0,129 7,06

Muestra 6 de 30 l

NaCl 15 mM, NaOH 12 mM 6,15 0,062 7,54

Se cuantificó la cantidad de Bay 15-5381 en todas las seis muestras mostradas en la Tabla 13 utilizando elprocedimiento de HPLC descrito en el ejemplo 8. Las muestras con pH variable mostraron la misma concentración5 de Bay 15-5381, sugiriendo que el componente coadyuvante no se degrada durante el aumento de pH con la adición de NaOH y floculación acompañante.

Ejemplo 10. Evaluaciones de estabilidad utilizando ensayos de estrés acelerado. Este ejemplo describe los procedimientos y resultados de ensayo de estrés acelerado sobre solución coadyuvante glucolipídica. Se prepararon tres lotes de soluciones coadyuvantes glucolipídicas como se describe en el ejemplo 6 a escala de

10 500 l. Los tres lotes tenían NaCl 15 mM y no contenían NaOH. Se utilizaron las soluciones coadyuvantes glucolipídicas de estos tres lotes de 500 l estudiando la estabilidad del glucolípido utilizando un ensayo de estabilidad acelerada.

Para ensayo de estrés acelerado, se sometió la solución coadyuvante glucolipídica a agitación durante 7 días a 37ºC, seguido de agitación a 4 ºC durante 2 días. Los 7 días de agitación a 37 ºC representan una maduración a 4 ºC

15 durante un año. La agitación a 4 ºC durante 2 días representa el estrés durante el transporte.

Se mantuvo estático un conjunto de solución coadyuvante glucolipídica a 37 ºC durante 7 días, después se agitó a100 rpm a 4 ºC durante 2 días adicionales. En cuatro puntos temporales, concretamente, T= 0, 3, 7 y 9 días, seregistraron la observación y foto. En dos puntos temporales, concretamente, T= 0 y 9 días, se realizaron despuésanálisis del índice de refracción y del tamaño de partícula.

20 Se agitó el segundo conjunto de solución coadyuvante glucolipídica a 100 rpm a 37 ºC durante 7 días, después se agitó a 100 rpm a 4 ºC durante 2 días adicionales. En cuatro puntos temporales, concretamente T= 0, 3, 7 y 9 días, se registraron la observación y foto. En dos puntos temporales, concretamente, T= 0 y 9 días, se realizaron despuésanálisis del índice de refracción y del tamaño de partícula.

El tercer conjunto de solución coadyuvante glucolipídica estuvo estático a 4 ºC durante 9 días como control. En

25 cuatro puntos temporales, concretamente, T= 0, 3, 7 y 9 días, se registraron la observación y foto. En dos puntos temporales, concretamente, T= 0 y 9 días, se realizaron después análisis del índice de refracción y del tamaño departícula.

No hubo cambios en el tamaño de partícula como resultado del ensayo de estrés. Todas las muestras mantuvieronlos tamaños de partícula submicrométricos observados en las muestras inmediatamente después que se

30 prepararon. Además, una medida de HPLC del componente Bay 15-5831® en las muestras mantenidas a 4 ºC o sometidas a estrés a 37 ºC durante siete días no mostró ningún cambio en la cantidad de Bay 15-5831®.

Tabla 15. Cuantificación de Bay 15-5831® después de ensayo de estrés

Número de lote de la solución coadyuvante glucolipídica y tratamiento

Concentración medida (mM)

Lote 1- 4 ºC

6,23

Lote 1- Agitación a 37 ºC

6,29

Lote 2- 4 ºC

6,32

Lote 2- Agitación a 37 ºC

6,30

Lote 3- 4 ºC

6,28

Lote 3- Agitación a 37 ºC

6,29

En la Tabla 15, se mantuvieron las muestras control a 4 ºC durante siete días, mientras se agitaban las muestras de35 ensayo a 37 ºC durante siete días. Las muestras agitadas a 37 ºC durante siete días tienen concentraciones similares a las almacenadas a 4 ºC.

Ejemplo 11. Ensayo viricida de la solución coadyuvante glucolipídica 18

Se realizó el ensayo viricida en la solución coadyuvante glucolipídica preparada a escala de 30L como se describe anteriormente en el ejemplo 9. Esta solución coadyuvante glucolipídica contenía NaCl 15 mM y no NaOH.

Se ensayó la idoneidad del coadyuvante glucolipídico para uso como diluyente con virus vivos modificados. Se preparan antígenos virales vivos modificados en forma de bloques liofilizados. Tras rehidratación de estos bloques

5 con solución coadyuvante glucolipídica adecuada, se confirmó que la solución coadyuvante glucolipídica utilizada no mata los virus vivos modificados. Se ensayó la solución coadyuvante glucolipídica frente a tres antígenosvirales bovinos: virus sincitial respiratorio bovino (BRSV), virus paragripal tipo 3 (PI3) y virus de rinotraqueitisinfecciosa bovina (IBR).

Se rehidrataron los bloques virales utilizando la solución coadyuvante glucolipídica. Después de incubación a

10 temperatura ambiente (TA) durante 1 hora, se sembraron las muestras sobre una monocapa de una línea celular permisiva con una dilución en serie. Contando el número de bloques virales que aparecen sobre la monocapa, seobtuvo el valor del 50 % de la dosis infecciosa en cultivo de tejido por ml (TCID50/ml) para cada antígeno viralrehidratado con agua estéril o solución coadyuvante glucolipídica. En este ensayo, se trató como viricida una reducción del título de 0,7 después de rehidratar con la solución coadyuvante glucolipídica de ensayo.

15 Se presentan los resultados en la Tabla 16. La solución coadyuvante glucolipídica no mostró ningún efecto viricida sobre estos tres virus bovinos.

Tabla 16. Ensayo viricida para la solución coadyuvante glucolipídica

Virus

Título original Título final con coadyuvante glucolipídico Título final con agua estéril Pérdida de título

tsIBR

7,3 ± 0,5 7,08 7,49 0,42

051404

tsPI3 052604

7,6 ± 0,5 7,74 7,49 -0,25

BRSV 081103

6,4 ± 0,5 6,57 6,82 0,25

Este ejemplo muestra que la solución coadyuvante glucolipídica puede utilizarse en una formulación comercial de

20 una vacuna para salud animal. Rispoval® contiene tres enfermedades virales bovinas diferentes utilizando 3 antígenos virales vivos modificados. Estos antígenos virales bovinos son herpesvirus bovino vivo modificado, virus sincitial respiratorio bovino vivo modificado y virus de parainfluenza 3 vivo modificado. Estos antígenos virales seproducen en forma de tortas liofilizadas y la solución coadyuvante glucolipídica producida mediante esta invenciónpuede utilizarse como solución diluyente para estos antígenos. El glucolípido utilizado era acetato de N-(2-desoxi-2

25 L-leucilamino-�-D-glucopiranosil)-N-octadecildodecanamida.

Los ejemplos se presentan para ilustrar la invención. No debe considerarse que limitan el ámbito de la invención. Resultarán evidentes para los expertos en la técnica muchos cambios, variaciones, modificaciones y otros usos y aplicaciones de la presente invención.

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Una composición que comprende:

   a)

   un glucolípido de fórmula I; en el que la fórmula I es

   5 en la que R1 y R2 son independientemente hidrógeno o un radical alquilo saturado que tiene hasta 20 átomos de carbono; X es –CH2-, -O- o –NH-; R3, R4 y R5 son independientemente hidrógeno, -SO42-, -PO42-, -CO-alquilo C1-10; R6 es L-alanilo, L-alfa-aminobutilo, L-arginilo, L-asparginilo, L-aspartilo, L-cisteinilo, L-glutamilo, L-glicilo, L-histidilo,

   10 L-hidroxipropilo, L-isoleucilo, L-leucilo, L-lisilo, L-metionilo, L-ornitinilo, L-fenilalanilo, L-prolilo, L-serilo, L-treonilo, Ltirosilo, L-triptofanilo y L-valilo o sus isómeros D; en una forma de sal, en la que la forma de sal deriva de un ácidodébil,

   b) un alcohol, en el que el alcohol es HO-alquilo C1-3; c) un ácido débil, en el que el ácido débil

   15 1) está en una cantidad desde 1,25 hasta 5,0 veces la cantidad del glucolípido, en equivalentes molares al glucolípido y 2) es cualquier ácido que tenga un valor de pKa (el –log de Ka) entre 1,0 y 9,5 utilizando las tablas o valores

   estándar; d) un tensioactivo no iónico, en el que el tensioactivo no iónico es un agente que reduce la tensión superficial 20 del material que se disuelve en él y tiene un componente que es hidrófobo y otro componente que es hidrófilo.
2. 2. Una composición de la reivindicación 1 en la que el glucolípido es un compuesto de fórmula II(a)

   Fórmula II(a)

   y el ácido débil es seleccionado de uno o cualquier combinación de los siguientes ácidos débiles: ácido acético,

   25 H(C2H3O2) (pKa 4,76); ácido ascórbico (1), H2(C6H6O6) (pKa 4,10); ácido acetilsalicílico, H8(C9O4) (pKa 3,5); ácido butanoico H(C4H7O2) (pKa 4,83); ácido carbónico, forma 1, H2CO3, (pKa 4,83); ácido crómico, forma 2, HCrO4-(pKa6,49); ácido cítrico, forma 1, H3(C6H5O7), (pKa 3,14); ácido cítrico, forma 2, (H2C6H5O7)-, (pKa 4,77); ácido cítrico, forma 3, (HC6H5O7)=, (pKa 6,39); ácido fórmico, H(CHO2), (pKa 3,75); ácido fumárico, H4(C4O4) (pKa 3,03); ácido heptanoico, H(C7H13O2), (pKa 4,89); ácido hexanoico, H(C6H11O2), (pKa 4,84); ácido fluorhídrico, HF, (pKa 3,20);

   30 isocitrato, H8(C6O7) (pKa 3,29); ácido láctico, H(C3H5O3), (pKa 3,08); ácido maleico, H4(C4O4) (pKa 1,83); ácido nicotínico, H5(C6NO2) (pKa 3,39); ácido oxálico, forma 1, H2(C2O4), (pKa 1,23); ácido oxálico, forma 2, (HC2O4)-, (pKa 4,19); ácido pentanoico, H(C5H9O2), (pKa 4,84); ácido fosfórico, forma 1, H3PO4, (pKa 2,16); ácido propanoico, H(C3H5O2), (pKa 4,86); ácido pirúvico, H4(C3O3) (pKa 2,39); y ácido succínico H6(C4O4) (pKa 4,19).
3. 3. Una composición de la reivindicación 2, en la que el glucolípido es un compuesto de fórmula II(b)

   Fórmula II(b)

   y el ácido débil es seleccionado de uno o de cualquier combinación de los siguientes ácidos débiles: ácido acético;ácido acetilsalicílico; ácido cítrico; ácido fórmico; ácido fumárico; ácido fluorhídrico; isocitrato; ácido maleico; ácido nicotínico; ácido fosfórico; ácido pirúvico; y ácido succínico.
4. 4. Una composición de la reivindicación 3, en la que el glucolípido es acetato de N-(2-desoxi-2-L-leucilamino�-D-glucopiranosil)-N-octadecildodecanamida, que tiene una estructura de fórmula III:

   Fórmula III 10 y el ácido débil es ácido acético.
5. 5. Una composición de la reivindicación 2, en la que el ácido débil es seleccionado del grupo que consiste en:ácido acético; ácido acetilsalicílico; ácido cítrico, forma 1; ácido cítrico, forma 2; ácido cítrico, forma 3; ácido fórmico; ácido fumárico; ácido fluorhídrico; isocitrato; ácido maleico; ácido nicotínico; ácido fosfórico, forma 1; ácido pirúvico y ácido succínico.

   15 6. Una composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que dicho ácido débil está en una cantidad que es las siguientes veces mayor que el equivalente molar del glucolípido; a) 1,25 veces mayor, b) 2,0 veces mayor, c) 2,5 veces mayor, 20 d) 2,7 veces mayor, e) 3,0 veces mayor,

   f) 5,0 veces mayor, que la cantidad equivalente molar del glucolípido.
6. 7. Una composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que el alcohol es alcohol etílico.

   25 8. Una composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que dicho tensioactivo no iónico es seleccionado de uno cualquiera o de una combinación del grupo que consiste en: monolaurato de sorbitán,monopalmitato de sorbitán, monoestearato de sorbitán, triestearato de sorbitán, monooleato de sorbitán, trioleato desorbitán, monolaurato de polioxietilensorbitán, monopalmitato de polioxietilensorbitán, monoestearato de polioxietilensorbitán, monooleato de polioxietilensorbitán, trioleato de polioxietilensorbitán y otros sorbitanos y

   30 polioxietilensorbitanos utilizados habitualmente en vacunas.
7. 9. Una composición de la reivindicación 1, en la que el ácido débil es ácido acético y adicionalmente en la que el ácido acético está en una cantidad que es 2,0 veces mayor que la cantidad equivalente molar del glucolípido.
8. 10. Una composición de la reivindicación 1, en la que el ácido débil tiene un valor de pKa (el –log de Ka) entre1,23 y 6,49 usando tablas o valores estándar. 35 11. Una composición que comprende:

   a) un glucolípido de fórmula I; en el que la fórmula I es 21

   en la que R1 y R2 son independientemente hidrógeno, o un radical alquilo saturado que tiene hasta 20 átomos de carbono; X es –CH2-, -O- o –NH-; R3, R4 y R5 son independientemente hidrógeno, -SO42-, -PO42-, -CO-alquilo C1-10; R6 es L-alanilo, L-alfa-aminobutilo, L-arginilo, L-asparginilo, L-aspartilo, L-cisteinilo, L-glutamilo, L-glicilo, L-histidilo,

   L-hidroxipropilo, L-isoleucilo, L-leucilo, L-lisilo, L-metionilo, L-ornitinilo, L-fenilalanilo, L-prolilo, L-serilo, L-treonilo, Ltirosilo, L-triptofanilo y L-valilo o sus isómeros D; en una forma de sal, en la que la forma de sal deriva de un ácidodébil;

   b) un alcohol, en el que el alcohol es HO-alquilo C1-3; c) un ácido débil, en el que el ácido débil 1) está en una cantidad desde 1,25 hasta 5,0 veces la cantidad del glucolípido, en equivalentes molares al

   glucolípido y

   2) es cualquier ácido que tenga un valor de pKa (el –log de Ka) entre 1,0 y 9,5 utilizando las tablas o valores estándar; d) un tensioactivo no iónico, en el que el tensioactivo no iónico es un agente que reduce la tensión superficial

   del material que se disuelve en él y tiene un componente que es hidrófobo y otro componente que es hidrófilo; y e) un tampón acuoso, en la que el tampón adecuado es adecuado para uso en vacuna y puede mantener elpH de los demás ingredientes dentro de un intervalo de pH de 6 a 8, con la condición de que no se utilice NaCl másde 50 mM.

9. 12.

   Una composición de la reivindicación 11, en la que el pH de la solución es ajustado a un pH relativamenteconstante en una solución acuosa de entre 6 y 7 y el tampón es seleccionado del grupo que consiste en tamponesfosfato que tienen cualquiera o ambas de las sales monobásicas y dibásicas de fosfato de sodio y/o fosfato depotasio en la misma o en diferentes proporciones.

10. 13.

    Una composición de la reivindicación 11, en la que dicho tampón es seleccionado del grupo de: a) ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (también conocido como MES); b) ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (también conocido como MOPS); c) ácido N-[tris(hidroximetil)]-2-aminoetanosulfónico (también conocido como TES); d) ácido 4-(2-hidroxietil)piperazin-1-etanosulfónico (también conocido como HEPES); y e) [tris(hidroximetil)metil]glicina (también conocida como TRIS);

    o cualquier combinación de los mismos.

11. 14.

    Una composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-13 que comprende adicionalmente un antígeno seleccionado del grupo, o cualquier combinación de los mismos, que consiste en herpesvirus bovino vivomodificado, virus sincitial respiratorio bovino vivo modificado y virus paragripal tipo 3 vivo modificado.

12. 15.

    Una composición que comprende:

    a) acetato de N-(2-desoxi-2-L-leucilamino-�-D-glucopiranosil)-N-octadecildodecanamida, que tiene una estructura de fórmula III:

    Fórmula III

    b) etanol;

    c) ácido acético, en la que el ácido acético está en una cantidad de 1,25 a 5,0 veces la cantidad delglucolípido, en equivalentes molares al glucolípido; d) tensioactivo no iónico seleccionado de: monolaurato de sorbitán, monopalmitato de sorbitán, monoestearato

    de sorbitán, triestearato de sorbitán, monooleato de sorbitán, trioleato de sorbitán, monolaurato de polioxietilensorbitán, monopalmitato de polioxietilensorbitán, monoestearato de polioxietilensorbitán, monooleato depolioxietilensorbitán, trioleato de polioxietilensorbitán;

    e) un tampón acuoso en el que el pH de la solución es ajustado a un pH relativamente constante en una solución tamponada acuosa de entre 6 y 7, y el tampón se selecciona del grupo de: a) ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (también conocido como MES); b) ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (también conocido como MOPS); c) ácido N-[tris(hidroximetil)]-2-aminoetanosulfónico (también conocido como TES); d) ácido 4-(2-hidroxietil)piperazin-1-etanosulfónico (también conocido como HEPES); y e) [tris(hidroximetil)metil]glicina (también TRIS);

    o cualquier combinación de los mismos; con la condición de que no se utilice NaCl más de 15 mM y: f) un antígeno que consiste esencialmente en herpesvirus bovino vivo modificado, virus sincitial respiratorio

    bovino vivo modificado y virus paragripal tipo 3 vivo modificado.
13. 16. Un procedimiento de preparación de una composición, que comprende mezclar conjuntamente lo siguiente: a) un glucolípido de fórmula I; b) un alcohol, en el que el alcohol es HO-alquilo C1-3; c) un ácido débil orgánico, en el que el ácido débil 1) está en una cantidad desde 1,25 hasta 5,0 veces la cantidad del glucolípido, en equivalentes molares al

    glucolípido; y

    2) es cualquier ácido que tenga un valor de pKa (el –log de Ka) entre 1 y 9,5 utilizando las tablas o valores estándar; y d) un tensioactivo no iónico.
14. 17. Un procedimiento de preparación de una composición, que comprende mezclar conjuntamente lo siguiente: a) un glucolípido de fórmula I; b) un alcohol, en el que el alcohol es HO-alquilo C1-3; c) un ácido débil orgánico, en el que el ácido débil 1) está en una cantidad desde 1,25 hasta 5,0 veces la cantidad del glucolípido, en equivalentes molares al

    glucolípido; y

    2) es cualquier ácido que tenga un valor de pKa (el –log de Ka) entre 0,7 y 9,5 utilizando las tablas o valores estándar; d) un tensioactivo no iónico; y añadir después e) un tampón adecuado.