NO341463B1 - Nye glykolipidaduvanssammensetninger - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår sammensetninger av glykolipidadjuvanser, fremgangsmåter for deres anvendelse og deres fremstilling. De nye sammensetningene ifølge oppfinnelsen er stabile i lang tid uten flokkulering. De er særlig anvendelige ved levering av forskjellige medisiner, som inkluderer vaksiner.

Vaksiner blir typisk anvendt for å beskytte mennesker og veterinære dyr ovenfor infeksj onssykdommer forårsaket av bakterier, virus og parasittorgani smer. Antigenene anvendt i vaksiner kan være et hvilket som helst av et antall midler, men består typisk av avlivede patogene organismer, patogene organismer som er i live, men modifisert eller attenuert, proteiner, rekombinante proteiner eller fragmenter derav. Uansett antigenkilden, er det ofte nødvendig å tilsette en adj uvan s for å øke vertens immunrespons for antigenet.

Adjuvanser blir anvendt for å oppnå til formål : de setter ned frigivel seshastigheten til antigenene fra injeksjonssetet og de stimulerer immunsystemet.

Den første adjuvansen rapportert i litteraturen var Freunds Complete Adjuvans (FCA). FCA inneholder en vann-i-oljeemulsjon og ekstrakter fra mykob aktene. Mykobakterieekstraktene tilveiebringer immunostimulerende molekyler i en uren form. Vann-i-olje emulsjonen virker med å danne en depoteffekt hvor antigenene blir frigitt langsomt. Uheldigvis er FCA dårlig tolerert og kan forårsake ukontrollert inflammasjon. Siden funnet av FCA for over 80 år siden har forsøk blitt gjort for å redusere de uønskede bivirkningene ved adjuvanser.

Glykolipidanaloger som innbefatter en ny klasse av forbindelser som har adjuvansegenskaper er nå kjent. US-patent nr. 4,855,283 (heretter ‘283) beskriver syntesen av glykolipidanaloger, som inkluderer N-glykosylamider, N-glykosylureaforbindelser, N-glykosylkarbamater, og spesifikt: N-(2-deoksy-2-L-leucylamino-P-D-glukopyranosyl)-N-oktadecyl dodekanami dacetat (kjent som Bay R1005, O Lockhoff, Angew. Chem. Int. Ed, En gl. (1991) 30:1611-1620). Forbindelsene beskrevet i ‘283 patentet er særlig for anvendelse som adjuvanser. Tilsvarende beskriver US-patent nr. 6.290.971 og Lockhoff et al. (Angewandte Chemie 30(12): 1611-1620, 1991) glykolipidadjuvanser. Ingen av US 4.855.283, US 6.290.971 eller Lockhoff et al. foreslår bruk av molart overskudd av svak syre for å fremstille stabil løsning av glykolipidadjuvanssalter .

Glykolipidadjuvansformuleringer må være enkle å fremstille og stabile når de lagres i lengere tidsperioder uten å vise flokkulering av lipidkomponenten. Ikke-acetatformene av glykolipidamidene eller glykosylamidene er svært uløselige og flokkulerer typisk ut av løsning etter lagring enten ved romtemperatur eller lavere temperaturer.

Løsningene og adjuvansene som innbefatter glykosylamider tilveiebrakt her viser liten flokkulering og er relativt stabile. De er enkle å fremstille og kan fremstilles på kommersiell skala. De flytende glykolipidadjuvansformuleringene kan anvendes som et fortynningsmiddel for å rehydrere et lyofilisert antigenpreparat. Fremgangsmåter for å teste stabiliteten av disse formuleringene i sann tid og gjennom akselererte stabilitetsprotokoller er også tilveiebrakt.

Omfanget av foreliggende oppfinnelse er definert av kravene og ytterligere informasjon som ikke faller innenfor kravene er kun gitt til informasjon.

Foreliggende oppfinnelse innbefatter en sammensetning og fremgangsmåte for å lage eller fremstille både Glykosylamidforråds-løsning og Glykolipidadjuvans-løsning.

Glykosylamidforråds-løsning fremstilles ved å løse opp et glykolipid med Formel 1 i en alkohol og kombinere denne med en passende mengde av en svak syre pluss en “ikkeionisk” surfaktant. Den svake syren tilsettes til gl y koli pi dalkoh olløsni ngen, i mol art overskudd av svak syre med referanse til glykolipidet. I en utførelsesform er glykolipidet N-(2-deoksy-2-L-leucylamino-P-D-gulukopyranosyl)-N-oktadecyldodekanoylamidhydroacetat. I en utførelsesform er alkoholen etanol. I en utførelsesform er den svake syren eddiksyre. I en utførelsesform er de ikke-ioniske surfaktantene forskjellige sorbitaner (Span®) eller polyoksyetylensorbitaner (Tween®) særlig monolauratsorbitanene (Span 20®) og monolauratpolyoksyetylensorbitanene (Tween 20®). Glykolipid adj uvans-løsningen fremstilles ved å introdusere en passende mengde Glykosylamidforråds-løsning til en “passende buffer.” pH til de endelig stabile Glykolipidadjuvans-løsningene beskrevet her bør være mellom ca. 6 og ca. 8. En slutt-pH på mellom ca. 6 til ca. 7 er foretrukket. En slutt-pH på mellom ca. 6,3 til ca. 6,4 er beskrevet. Høye saltkonsentrasj oner av Gly kolipidadj uvans, de over 30 mM NaCl, bør unngås.

Disse to løsningene er eksemplifisert mer i detalj som følger:

Glykosylamidforråds-løsningen er en sammensetning som innbefatter:

a) et glykolipid med Formel I;

hvori Formel I er

hvori

R<1>er hydrogen, eller metet alkylradikal som har opp til 20 karbonatomer; X er -CH2-, -O- eller -NH-;

R<2>er hydrogen, eller et metet alkylradikal som har opp til 20 karbonatomer; R<J>, R<4>, og R<5>er uavhengig hydrogen, -S04<2->, -P04<2->, -COC1-10alkyl;

R<6>er L-alanyl, L-alfa-aminobutyl, L-arginyl, L-asparginyl, L-aspartyl, L-cysteinyl, L-glutamyl, L-glycyl, L-histidyl, L-hydroksypropyl, L-isoleucyl, L-leucyl, L-lysyl, L-metionyl, L-ornitinyl, L-fenylalanyl, L-prolyl, L-seryl, L-treonyl, L-tyrosyl, L-tryptofanyl, og L- val yl eller deres D-isomerer; i en saltform, hvor saltformen er avledet fra en svak syre;

b) en alkohol hvori alkoholen er HO-C1-3alkyl;

c) en svak syre, hvori 1) den svake syren er i molart overskudd med referanse til glykolipidinnholdet, og 2) er en hvilken som helst syre som har en pKa verdi på mellom ca. 1,0 og ca. 9,5 ved anvendelse av standard tabeller eller verdi er; og d) en ikke-ionisk surfaktant, hvor den ikke-ioniske surfaktanten er et middel som reduserer overflatespenningen til materialet den er løst opp i og har en komponent som er hydrofob og en annen komponent som er hydrofil.

Glykolipidadj uvans-løsningen er en sammensetning som innbefater:

a) en Glykosylamideforråds-løsning; og

b) en passende buffer, hvor bufferen er en som er passende for veterinær eller medisinsk anvendelse og kan oppretholde en relativt konstant pH i en vandig løsning på mellom ca. 6,0 og ca. 8,0.

Med mindre annet er angit, har følgende begreper anvendt i beskrivelsen og kravene betydningen git nedenfor.

Begrepet “alkohol” refererer til en forbindelse med formel: HO-C1-3alkyl. Den kan være metanol, etanol eller propanol i en hvilken som helst form, slik som n-propanol eller iso-propanol. Etanol er foretrukket.

Begrepet “alkyl” refererer til både retkjedede og forgrenede metede hydrokarbonbestanddeler.

Begrepet “glykolipider” refererer til forbindelser med Formel I nedenfor. Disse forbindelsene er beskrevet i US-patent 6.290.971 og US-patent Nr. 4.855.283, meddelt 8. august 1989. Både US-patent 6.290.971 og US-patent nr. 4.855.283 er herved innbefattet ved referanse i sin helhet. Et glykolipid beskrevet spesielt her, når det er i acetat form har varemerkenavnet Bay RI 005® og det kjemiske navnet “N- (2-deoksy-2-L-leucylamino-β-D-glukopyranosyl)-N-oktadecyldodekanamidacetaf" Amidformen av denne forbindelse har varemerkenavnet Bay 15-1583® og det kjemiske navnet “N-(2-deoksy-2-L-leucylamino-β-D-glukopyranosyl)-N-oktadecyldodekanamid."

Glykolipidene med Formel I er:

Formel I

hvori

R<1>er hydrogen eller mettet alkylradikal som har opp til 20 karbonatomer;

X er -CH2-, -O- eller -NH-;

R<2>er hydrogen eller mettet alkylradikal som har opp til 20 karbonatomer;

R<3>, R<4>og R<5>er uavhengig hydrogen, -S04<2->, -P04<2->eller -COC1-10alkyl;

R<6>er L-alanyl, L-alfa-aminobutyl, L-arginyl, L-asparginyl, L-aspartyl, L-cysteinyl, L-glutamyl, L-glycyl, L-histidyl, L-hydroksypropyl, L-isoleucyl, L-leucyl, L-lysyl, L-metionyl, L-omitinyl, L-fenylalanyl, L-prolyl, L-seryl, L-treonyl, L-tyrosyl, L-tryptofanyl, og L-valyl eller deres D-isomerer;

eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

En annen spesifikk utførelsesform beskriver glykolipidene med Formel 1 hvori:

R<1>er hydrogen eller mettet C12-18alkyl;

R<2>er hydrogen eller mettet C7-11alkyl;

X er -CH2;

R<4>og R<5>er uavhengig hydrogen;

R<6>er valgt fra L-leucyl.

Variablene for Formel I er separate og uavhengig og alle kombinasjoner av variabler er heri beskrevet og omfattet av kravene.

I en annen utførelsesform er glykolipidene de som er beskrevet med Formel 11(a):

Formel 11(a)

I en annen utførelsesform er glykolipidene de som er beskrevet med Formel 11(b):

Formel 11(b)

I en annen utførelsesform har glykolipidene strukturen med Formel TTT:

Formel ΙΠ

En forbindelse med Formel ΙΠ kan eksistere i enten amidform eller acetatform. Amidformen av denne forbindelsen har varemerkenavnet Bay 15-1583®. Acetatformen har varemerkenavnet Bay RI 005®.

Glykolipidene med Formel I kan fremstilles ved anvendelse av følgende fremgangsmåter, tatt fra US-patent nr. 4.855.283.

Som det fremgår av Formel 1, er forbindelsene ifølge oppfinnelsen basert på en substituert 2-amino-2-deoksyheksose. Disse sukrene er alltid N-glykosidisk bundet via C-l, det anomere karbon atomet, til acylamido, karbamido eller alkoksykarbonylamidogruppen

med de ovenfor nevnte betydningene for R<1>, R<2>og X.

2-aminogruppen til aminosukrene i forbindelsene ifølge oppfinnelsen, med formel I, er am i disk bundet til en α-aminosyre eller et a-aminosyrederivat.

Aminosyrer er de naturlig L-aminosyrene slike som glycin, sarkosin, hippurinsyre, alanin, valin, leucin, isoleucin, serin, treonin, cystein, metionin, omitin, citrullin, arginin, aspartansyre, asparagin, glutamsyre, glutamin, f enyl alanin, tyrosin, prolin, tryptofan og histidin. Også beskrevet er D-aminosyrer, slike som D-alanin eller amino karboksyl syrer, slike som alfa-aminosmørsyre, a-aminovalerinsyre, a-aminokapronsyre eller α-aminoheptansyre, både i D- og L-formen, som virker som substituenter på amino sukkeret.

Fremgangsmåtene for fremstilling av forbindelsene med Formel I er også tilveiebrakt. Disse omfatter et 2-amino-2-deoksyglykopyranosederivat (Formel IV) som utgangsmateriale, som er beskyttet på aminogruppen,

hvori R<10>representerer en beskyttende gruppe for beskyttelse av aminogrupper, som er kjent fra syntese av peptider og kan, hvis hensiktsmessig, bli selektivt eliminert.

Eksempler på egnede beskyttende grupper er acylgrupper, slik som trifluoracetyl eller trikloracetyl, o-nitrofenylsulfenyl, 2,4 -dinitrof enyl sulfenyl eller eventuelt substituerte lavere alkoksykarbonylgrupper slike som metoksykarb ony 1 , t-butyl oksykarb ony 1 , b enzyl oksykarb onyl , p-metoksybenzyloksykarbonyl eller 2,2,2-trikloretyloksykarbonyl grupper. Egnede N-beskyttede amino-heksosederivater er kjente. For eksempel M. Bergmann og L. Zervas, Ber. 64, 975 (1931); D. Horton, J. Org. Chem. 29, 1776 (1964); P. H. Gross og R. W. Jeanloz, J. Org. Chem. 32, 2759 (1967); M. L. Wolfram og H. B. Bhat, J. Org. Chem. 32, 1821 (1967); generell: J. F. W. McOmie (redaktør). Prot. Groups. Org. Chem., Plenum Press (1973); Geiger i "The Peptides" Vol. 3, s. 1-99, (1981) Academic Press; og Litteratur sitert deri). Foretrukne aminobeskyttende grupper for fremstilling av forbindelsene med Formel I er BOC gruppen (tert. Butyl oksykarb onyl) eller Z gruppen (b enzyl oksykarb onyl) .

De blokkerte aminosukkerderivatene (IV) omsettes, i et første reaksjonstrinn, med aminer (Formel V),

H2N-R<1>(V)

hvori R<1>har den ovenfor nevnte betydningen, for å gi glykosylaminer (Formel VI)

Glykosylaminfremstillinger av denne typen er kjent i prinsippet (ELLIS, ’’Advances in Carbohydrate Chemistry 10, 95 (1955)) og er spesifikt beskrevet i DE-OS (tysk publi sert søknad) Nr. 3.213.650,

I det andre reaksjonstrinnet blir glykosylaminene (VI) omsatt enten med egnede karboksyl syrederivater (Formel VII), slik som karb oksy 1 hali der, eller karboksylsyre anhydrider,

R<11>-CO-CH2-R<4>(VII)

R<2>har den ovenfor nevnte betydningen, og R<11>representerer halogen slik som, for eksempel, klor, eller representerer -O-CO-R<2>med den ovenfor nevnte betydningen for R<2>, eller representerer -O-CO-O-lavere alkyl. På denne måten blir glykosylamider (Formel VIII)

hvori R<1>og R<2>har de ovenfor nevnte betydningene, og R<10>er den samme som R<6>og X representerer -CH2-, oppnådd. Betingelsene for N-acyleringer av denne typen er indikert i DE-OS (tysk publisert søknad) Nr. 3.213.650.

I en foretrukket utførelsesform blir glykosylaminene med Formel VI omsatt med en til to ekvivalenter av et karbonylklorid (Formel VII) eller med en til to ekvivalenter av et blandet anhydrid som har blitt oppnådd fra den relevante karboksyl syren R<2>— CH2— C02H og etylklorformat eller isobutylklorformat, under nærvær av en organisk hjelpebase, ved fremgangsmåter kjente fra litteraturen, for å gi glykosylamidet med Formel VIII med X=-CH-,

Denne utføres i organiske eller vandig-organiske løsemidler ved mellom 0°C og 50°C, hvis passende under nærvær av en uorganisk eller organisk base. Egnede fortynningsmidler er alkoholer, slik som metanol, etanol, 1 -propanol eller 2-propanol, eller etere, slik som di etyl eter, tetrahydrofuran eller 1,4-dioksan, eller halogen erte hydrokarboner, slike som dikl orm etan, tri kl orm etan eller 1,2-dikloretan eller N,N-dimetylformamid.

Når glykosylaminene (VI) som oppnås i det første trinnet omsettes med halogenomaursyreestere (IX)

R<12>-C0-0-R<2>(IX)

R<12>representerer halogen slik som, for eksempel, klor eller brom, og R<2>har den ovenfor nevnte betydningen, da blir glykosylkarbamater (VIII) oppnådd, X i Formel VEI representerer oksygen.

I en utførelsesform blir glykosylaminene med Formel VIII omsatt med en til to ekvivalenter av en klorkarbonsyreester IX for å gi glykosylkarbamatet. Dette blir foretrukket utført i organiske eller vandig-organiske løsemidler ved temperaturer på mellom 0°C og 50°C, men særlig foretrukket ved romtemperatur. Egnede løsemidler er alkoholer, etere, halogenerte hydrokarboner eller dimetylformamid, slik det er nevnt ovenfor.

Når glykosylaminer (VI) som oppnås i det første trinnet omsettes med en til to ekvivalenter av et organisk isocyanat (Formel X)

R<2>-NCO (X)

med R<2>som har den ovenfor nevnte betydningen, blir glykosylureaforbindelser med Formel VIII oppnådd, og X er -NH-. Denne acyl eri ngsreaksj on en blir, som de ovenfor nevnte reaksjonene, foretrukket utført i organiske løsemidler, med reaksj onstemperaturer på mellom -20°C og 60°C, foretrukket mellom 0°C og 25°C. Egnede løsemidler er de ovenfor nevnte alkoholene, eterne, halogenerte hydrokarboner eller dimetylformamid.

Glykosylamidene (Formel VIII, X=-CH2-), glykosylkarbamatene (Formel VIII, X=-0-) eller glykosyl ureaforbindel sene (Formel VIII, X=-NH-) oppnådd på denne måten isoleres i form av krystallinske eller amorfe faste stoffer ved i og for seg kjente fremgangsmåter, og, hvis nødvendig, blir de renset ved standardfremgangsmåter slike som rekrystallisasjon, kromatografi, ekstraksjon etc.

I mange tilfeller er det også fordelaktig å utføre, parallelt med eller i stedet for de ovenfor nevnte rensetrinnene, en kjemisk derivatisering som fører til et derivat av glykosylamidene, -karbamatene og -ureaforbindelsene med Formel VHI, som har gode krystalliseringsegenskaper. Kjemiske derivatiseringer av denne typen er, i tilfellet glykosylamidene, glykosylkarbamatene og glykosylureaforbindel sene ifølge foreliggende oppfinnelse, for eksempel forestringsreaksj oner på hydroksyl gruppene til sukkerresiduene. Eksempler på egnede estergrupper er acetyl, benzoyl eller pnitrob enzoyl grupper.

For fremstilling av tri-O-acylderivatene av glykosylamidene, glykosylureaforbindel sene eller glykosylkarbamatene, blir de korresponderende tri ol ene (Formel VHI) omsatt med acyleringsmidler under nærvær av uorganiske eller organiske hjelpebaser. Egnede acyleringsmidler er syreklorider, slike som acetylklorid, benzoylklorid eller p-nitrobenzylklorid, eller anhydrider, slik som, for eksempel, eddiksyreanhy dri d . Dette resulterer i dannelsen av estere med Formel XI

med R<1>, R<2>, R<10>og X som har betydningene nevnt ovenfor, og

R<13>representerer acetyl, benzoyl eller p-nitrobenzoyl.

O-acyl eringsreaksj onene blir foretrukket utført i inerte organiske løsemidler. De som kan anvendes er halogenerte hydrokarboner, slik som diklormetan, triklormetan eller 1,2-dikloretan, etere, slik som tetrahydrofuran, eller 1,4-dioksan, estere, slik som etyl acetat og amider, slike som dimetylformamid.

Det er også mulig for organiske baser alene, slik som trietylamin eller pyridin, å anvendes som egnede løsemidler. Basene som kan anvendes er alle basene som anvendes innen organisk kjemi for O-acyleringer. Foretrukket blir trietylamin, pyridin eller blandingen pyri din/4-dimetyl aminopyridin anvendt. Triesteme (Formel XI) kan lett krystalliseres fra organiske løsemidler. Særlig foretrukket for krystalliseringen er polare løsemidler, slike som kortkjedede alkoholer, dvs. metanol, etanol , n-propanol eller isopropanol. Andre løsemidler egnede for krystalliseringen av triesteme (Formel XI) er blandinger av organiske løsemidler med polare uorganiske eller organiske løsemidler, for eksempel tetrahydrofuran-metanol, tetrahydrofuran-vann, etanol -vann og isopropanol -vann. Triesteme (Formel XI) som har blitt renset ved enkel eller, hvis hensiktsmessig, multippel rekrystallisering blir returnert til tri ol ene (Formel VIII) ved hydrolyse eller transforestring av de tre O-acetyl gruppene. Et antall typer av esterspaltinger er kjente innen organisk kjemi. For fremstilling av tri ol ene (Formel VIII) fra triesteme (Formel XI) kan det nevnes transforestringen av acylgruppene under nærvær av metanol og katalytiske mengder av natri ummetanol at, som er kjent som ZEMPLEN hydrolyse i organisk kjemi.

Det tredje reaksjonstrinnet i fremstillingen av forbindelsene med Formel I ifølge oppfinnelsen innbefatter den selektive spal tingen av den beskyttende gruppen til 2-aminogruppen på sukkeret i forbindelsene med Formel VIII. I denne reaksjonen har særlig forsiktighet blitt utvist slik at det ikke forekommer simultan eliminering av 1-amido eller 1-karbamido eller 1 -(alkoksykarbonylamido) gruppen på sukkeret i forbindelsene med Formel VIII

Benzyloksykarbonylgruppen, som foretrukket anvendes, på C-2 til aminoheksanene kan kvantitativt og selektivt spaltes, med retensjon av 1-amido, 1-karbamido eller 1-alkoksykarbonylamidogruppen, under hydrogenolysebetingelser. Denne hydrogenolysen gir glykosylamider, glykosylureaforbindelser eller glykosylkarbamater med en fri 2-aminogruppe på sukkeret med følgende strukturformel (ΧΠ)

med de ovenfor nevnte betydningene for R<1>, R<2>og X,

Eksempler på egnede katalysatorer for hydrogenolysen er edelmetaller slike som platina eller palladium som adsorberes på aktivt kull. Palladium/kull (5% eller 10%) blir foretrukket anvendt, hydrogenolysen kan utføres under atmosfæretrykk eller hevet trykk i et egnet trykkar. Inerte løsemidler er egnet for hydrogeneringen, slike som, for eksempel, alkoholer slik som metanol, etanol eller propanol, etere slike som tetrahydrofuran eller 1,4-dioksan, eller karboksylsyrer slike som eddiksyre eller blandinger derav. Hvis hensiktsmessig, blir løsemidlet blandet med vann eller fortynnede syrer slik som saltsyre eller svovelsyre. Selvfølgelig, når slike syrer tilsettes, blir 2-amino-2-deoksyglykosylamider,-karbamater og-ureaforbindel ser med Formel ΧΠ oppnådd som ammoniumsaltene av disse syrene. De t-b utyl oksy karb onylb esky ttende grupper, som på samme måte foretrukket anvendes i forbindelser med Formel VI II, kan spaltes ved fremgangsmåter kjente fra litteraturen ved anvendelse av mineralsyrer slik som saltsyre eller svovelsyre. I dette tilfellet blir også 2-amino-2-deoksy-glykosylamidene, -karbamatene og-ureaforbindel sene med Formel XII selektivt oppnådd som ammoniumsaltene av syrene som anvendes for spal tingen.

Det fjerde reaksjonstrinnet for syntesen av forbindelsene med Formel I, ifølge oppfinnelsen, innbefatter binding av ami nogl y kosyl ami dene, amidene, -karbamatene eller -ureaforbindel sene med Formel XII, eller deres salter, med et egnet aminosyrederivat. Egnede aminosyrederivater er N-blokkerte aminosyrer (Formel ΧΙII)

hvor R' har betydningen nevnt ovenfor,

R<8>representerer hydrogen eller metyl, og

R<14>representerer en beskyttende gruppe som vanligvis anvendes innen peptidsyntese og kan selektivt elimineres igjen mens peptidbindingen opprettholdes.

De beskyttende gruppene for aminogruppen med Formel ΧΠΙ som foretrukket anvendes er de ovenfor nevnte, og b enzyl oksy karb onyl - eller t-butyloksykarbonylgruppene er særlig foretrukket. Bindingen mellom 2-amino-2-deoksy-glykosylamidet, -karbamatet eller -ureaforbindelsen med Formel XII og et aminosyrederivat med Formel XTTT kan utføres ved vanlige fremgangsmåter innen peptidsyntese (E, Wunsch et al. : ’’Synthese von Peptiden” (Syntese av peptider) i: ’’Methoden der Org. Chernie<^>(Fremgangsmåter innen org. kjemi) (Houben-Weyl) (E. Muller, Editor), Vol XV/I og XV/2, 4. utgave, publisert av Thieme, Stuttgart (1974).

Eksempler på vanlige fremgangsmåter er kondensasjonen av aminogruppen i forbindelsen med Formel XII med et aminosyrederivat med Formel XTTT under nærvær av vannfjemende midler, for eksempel dicykloheksylkarbodiimid eller diisopropylkarbodiimid.

kondensasjonen av forbindelsene med Formel ΧΠ med de med Formel XTTT kan også utføres når karboksylgruppen er aktivert. En mulig aktivert karboksylgruppe er, for eksempel, et syreanhydrid, foretrukket et blandet anhydrid, slik som et acetat av syren, eller et amid av syren, slik som et imidazolid eller en aktivert ester. Eksempler på de aktiverte esterne er cyanometylestere, pentaklorfenylestere og N-hydroksyftalimidestere. Aktiverte estere kan også oppnås fra syren (Formel ΧΙΠ) og N-hydroksysuccinimidet eller 1 -h y droksybenzotiazolet under nærvær av et vannfjemende middel, slik som karbodiimid. Derivatene av aminosyrene er kjente og kan fremstilles på en kjent måte. Kondensasjonen av aminoforbindelsen med Formel XII med de eventuelt aktiverte karboksylforbindelsene med Formel XIII tilveiebringer peptidoglykolipider med Formel XIV,

med de ovenfor nevnte

I et siste fremgangsmåtetrinn for fremstilling av forbindelsene med Formel I blir den beskyttende gruppe R<14>i forbinde) sene med Formel XIV eliminert. Forsiktighet bør utvises i dette trinnet slik at de andre amid-, uretan- eller ureagruppene tilstede i forbindelsene med Formel XIV ikke blir spaltet. De beskyttende gruppene R<14>som foretrukket anvendes i forbindelsene med Formel XIV, N-karb ob enzoksygruppen og N-tert.-butyloksykarbonylgruppen, kan elimineres mens amid-, uretan- eller ureagruppen beholdes. Karbobenzoksygruppen kan selektivt elimineres ved hydrogenolyse under nærvær av et edelmetall slik som, for eksempel, palladium på kull, i et egnet løsemiddel slik som etanol , metanol, iseddiksyre eller tetrahydrofuran. Løsemidlene kan anvendes som det rene løsemidlet eller kombinert med et annet eller med vann. Reaksjonen kan utføres under enten atmosfæretrykk eller under hevet trykk. Tert.-butyl oksykarb onylgrupp en R<14>i forbindelsene med Formel XIV kan elimineres ved acidolytiske prosesser. Eksempler på egnede betingelser er anvendelsen av hydrogen klorid i egnede løsemidler slike som, for eksempel, iseddiksyre, di etyl eter, dioksan eller etyl acetat, ved romtemperatur. Fremgangsmåter av denne typen for spalting av t-butyl karbamatene er i prinsippet kjent, peptidoglykosylamidene, -karbamatene og -ureaforbindelsene med Formel I som oppnås på denne måten, isoleres i form av krystallinske eller amorfe faste stoffer, ved i og for seg kjente fremgangsmåter og blir, hvis nødvending, renset ved standard metoder, slike som rekrystallisering, kromatografi, ekstraksjon etc.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen, med Formel I, kan også fremstilles ved en andre synteserute med tilsvarende gode resultater. Denne andre synteseruten er forskjellig fra den første, som er beskrevet ovenfor, ved at sekvensen med å binde syntonene aminosukkeraminosyre, amin R1-NH2 og karboksyl syre R<2>-CH2-C02-H, eller karbonsyre derivatet R2-0-C0— halogen, eller R<2>-NCO, med de ovenfor nevnte betydningene av R<1>og R<2>, er forskjellig. I denne andre ruten blir egnede 2-N-(aminoacyl)aminosukre med Formel XV

med de ovenfor nevnte betydningene for R<7>og R<8>, og hvori R<14>representerer en amino beskyttende gruppe kjent innen peptidkjemi, foretrukket b enzy 1 oksykarb ony 1 eller tbutyloksykarbonylgruppen, anvendt som utgangskomponenten. Forbindelsene med Formel XV som således oppnås, blir deretter kondensert med aminoforbindelser med Formel ΙΠ for å gi glykosylaminer med den generelle formel XVI

hvor R<1>, R<7>, R<8>og R<14>har betydninger i henhold til Formel I og definisjonen av R<6>.

Alle fremgangsm åtene beskrevet ovenfor for fremstilling av forbindelsene med den generelle Formel VI kan anvendes for fremstilling av forbindelsene med generell Formel XVI. Forbindelsene med Formel XVI blir deretter omsatt enten med de ovenfor nevnte karb oksyl syrederi vatene (Formel VII) eller med halogenomaursyreestere (Formel IX) eller med organiske isocyanater (Formel X) for å gi 2-(aminoacyl)-aminoglykosylamidene med Formel XIV (med X=-CH2— ), eller -karbamatene med Formel XIV (med X=-0-), eller -ureaforbindelsene med Formel XIV (med X=-NH-). Disse acyleringsreaksj on ene blir generelt utført ved fremgangsmåtene beskrevet ovenfor for omsetning av glykosylaminer med karb oksyl syre eller karbonsyrederivater.

Intermediatene (Formel XIV) som oppnås på denne måten kan renses ved de ovenfor nevnte fysiske rensemetodene. Imidlertid er det foretrukket å omdanne forbindelsene med Formel XIV, ved fremgangsm åtene med O-acylering beskrevet ovenfor, til tri-O-acetatene eller tri-O-benzoatene med generell Formel XVII

hvor betydningene for variablene er i overen sstemm el se med Formel 1.

Disse forbindelser kan lett krystalliseres, foretrukket fra polare løsemidler slike som metanol eller etanol, og således renses. De rensede krystallinske derivatene med Formel XVII blir deretter omdannet til tri ol ene med Formel XIV ved de ovenfor nevnte fremgangsmåtene for esterhydrolyse, som er omfattende anvendt særlig innen sukkerkjemi. Den endelige elimineringen av de beskyttende gruppene i aminosyren i forbindelsene med Formel XIV har allerede blitt beskrevet ovenfor for fremstilling av forbindelsene med Formel I. Oppfinnelsen angår også salter av forbindelsene med Formel I. Disse er primært de ikke-toksiske saltene som er vanlig å anvende innen farmasi, for eksempel klorider, acetater og laktater, eller inerte salter av forbindelsene med Formel I.

Begrepet “svak syre” betyr en hvilken som helst syre som har en pKa (-log av Ka) verdien på mellom ca. 1,0 og ca. 9,5 ved anvendelse av standard tabeller eller verdi er. Uten ønske om å begrense oppfinnelsen, er følgende eksempler på svake syrer beskrevet med navn, formel og tilnærmet pKa. Eddiksyre, H(C2H302) (pKa 4,76); askorbinsyre (1), H2(C6H606) (pKa 4,10); acetylsalicylsyre, H^CgO^, (pKa 3,5); butansyre H(C4H702) (pKa 4,83); karbonsyre, H2C03, (pKa 4,83 form 1); krom syre, HCr04<'>(pKa 6,49 form 2); sitronsyre, H3(C6H507), (pKa 3,14 form 1); sitron syre, H2C6H507<">, (pKa 4,77 form 2); sitronsyre, (HC6H507)<“>, (pKa 6,39 form 3); maursyre, H(CH02), (pKa 3,75); fumarsyre, H4(C404) (pKa 3,03); heptansyre, H(C7H1302), (pKa 4,89); heksansyre, H(C6H1102), (pKa 4,84); flus syre, HF, ( pKa 3,20); isocitrat, H8(C607) (pKa 3,29); melkesyre, H(C3H5O3), (pKa 3,08); maleinsyre, H4(C404) (pKa 1,83); nikotinsyre, H5(C6N02) (pKa 3,39); oksalsyre, H2(C204), (pKa 1,23 form 1); oksalsyre, (HC204)<'>, (pKa 4,19 form 2); pentansyre, H(C5H9O2), (pKa 4,84); fosforsyre, H3P04, (pKa 2,16 form 1); propansyre, H(C3H502), (pKa 4,86); pyrodruesyre, H4(C303) (pKa 2,39); ravsyre H6(C4O4) (pKa 4,19). Eventuelle kombinasjoner av disse syrene er også eksemplifisert.

Eddiksyre er foretrukket. Acetylsalicylsyre, sitronsyre, maursyre, fumarsyre, flussyre, isocitrat, maleinsyre, nikotinsyre, fosforsyre, pyrodruesyre, ravsyre og trikloreddiksyre er mer vanlige svake syrer som er omfattet individuelt, i kombinasjon og som et utvalg.

Begrepet “ikke-ionisk surfaktant” betyr en surfaktant som er en substans som reduserer overflatespenningen til materialet den er løst opp i og ikke-ionisk betyr at den har en polar gruppe som ikke er elektrisk ladet. Begrepet amfifilisk surfaktant betyr en surfaktant hvor en del av surfaktantmolekylet er hydrofobt og en del er hydrofil.

Egnede surfaktanter vil både være ikke-ioniske og amfifiliske og akseptable for veterinær eller medisinsk anvendelse. Om en bestemt ikke-ionisk surfaktant er akseptabel eller ikke for medisinsk eller veterinær anvendelse, kan lett bestemmes av fagmannen. Det er mange egnede ikke-ioniske surfaktanter som kan anvendes med oppfinnelsen og et antall eksempler er tilveiebrakt nedenfor,

To godt kjente typer av ikke-ioniske surfaktanter er omfattet her. Disse er kjente som sorbitaner, vanligvis solgt under Span® varemerket, og polyoksyetylensorbitaner, vanligvis solgt under Tween® varemerket, spesifikt omfattet her er følgende:

Sorbitanmonolaurat (Span 20®), Sorbitanmonopalmitat (Span 40®), Sorbitanmonostearat (Span 60®), Sorbitantristearat (Span 65®), Sorbitanmonooleat (Span 80®), Sorbitantrioleat (Span 85®), Polyoksyetylensorbitanmonolaurat (Tween 20®), Polyoksyetylensorbitanmonopalmitat (Tween 40®), Polyoksyetylensorbitanmonostearat (Tween 60®), Polyoksyetylensorbitanmonooleat (Tween 80) og Polyoksyetylensorbitan trio) eat (Tween 85). Disse beskrivelsene er ment å inkludere varemerkenavningredi ensene, eller ekvivalente ingredienser, slik det er listet i leveringskataloger for disse surfaktantene. Surfaktantene kan anvendes individuelt eller i en hvilken som helst kombinasjon.

Sorbitanmonolaurat (Span 20®), Polyoksyetylensorbitanmonolaurat (Tween 20®), Sorbitanmonooleat (Span 80®), Sorbitantrioleat (Span 85®), Polyoksyetylensorbitanmonooleat (Tween 80), Polyoksyetylensorbitantrioleat (Tween 85) er særlig beskrevet.

Begrepet “egnet buffer” betyr en buffer som er egnet for veterinær eller medisinsk anvendelse og kan opprettholde en relativt konstant pH i en vandig løsning på mellom ca, 6 og ca. 8. Fosfatbuffere er en utførelsesform beskrevet her. fosfatbuffere kan fremstilles ved en spesifikk pH innenfor et bredt område ved å blande monobasiske og dib a si ske salte av natriumfosfat og/eller kaliumfosfat ved forskjellige andeler. Fremstillingen og anvendelsen av forskjellige natrium- og kaliumbuffere er godt kjente for fagmannen.

Andre eksempler på buffere er følgende:

2-(N-morfolino) etansulfonsyre (også kjent som MES);

3-(N-morfolino) propansulfonsyre (også kjent som MOPS);

n-[tris (hydroksymetyl)]-2-aminoetansulfonsyre (også kjent som TES);

4-(2-hydroksyetyl)piperazin- 1 -etansulfonsyre (også kjent som HEPES);

[tris (hydroksymetyl) metyljglycin (også kjent som TRIS).

Del I. Fremstilling av løsninger

De nye formuleringene beskrevet her er 1) Glykosylamidforråds-løsninger og 2) Glykolipidadjuvans-løsninger.

1) En Glykosylamideforråds-løsning fremstilles ved å løse opp et glykolipid i en alkohol og kombinere passende mengder av en svak syre. Den svake syren tilsettes til glykolipidalkoholløsningen, i mol art overskudd av den svake syre med referanse til glykolipidet. En ikke- ionisk surfaktant tilsettes til glykoli pi dalkoholsyreblandingen for å danne en Glykosylamidforråds-løsning. Glykolipidet som er eksemplifisert er N-(2-deoksy-2-L-leucylamino-β-D-glukopyranosyl)-N-oktadecyldodekanoylamidacetat. Alkoholen som er eksemplifisert er etanol. Den svake syren som er eksemplifisert er eddiksyre. De ikke-ioniske surfaktantene er slik det er beskrevet ovenfor.

Fremstilling av Glykosylamidforrådsløsninger. Svak syre tilsettes til en alkoholløsning som inneholder et glykolipid. Den svake syren tilsettes i molart overskudd med referanse til glykolipidinnholdet. Svaksyrekom ponenten bør tilsettes fra 1,25 til 5 ganger av mengden av glykolipidet, i mol are ekvivalenter i forhold til glykolipidet. I visse utførelsesformer er følgende relative mengder av syre anbefalt. Den svake syren bør være 2,0 ganger, 2,5 ganger, 2,7 ganger, 3,0 ganger og 5,0 ganger, og mest foretrukket 2,7 ganger så mange mol av syre som mol av glykolipid.

En ikke- ionisk surfaktant tilsettes til alkoholglykolipidblandingen ovenfor, enten før eller etter den svake syren er tilsatt, for å danne den endelige Glykosylamidforrådsløsningen.

Under nærværet av den svake syren blir glykosylamidet omdannet til acetatformen av glykolipidet. Glykolipidene med Formel I er ikke fullt løselige når de enkelt introduseres direkte til de bufrede vandige løsningene. Løsningen som typisk oppnås fra å løse opp et glykolipid med Formel I i en bufret vandig løsning er en melkeaktig blanding. Tidligere forskere har forsøkt å gjøre slike løsninger av blandinger homogene ved lydbehandling av den melkeaktige løsning. Imidlertid fører lydbehandling ikke til at løsningen holder seg homogen i løpet av lagring. Den kjemiske tilnærmingen til å suspendere disse forbindelsene resulterer i en fullt løselig, tilnærmet optisk klar løsning, av vandig bufret glykolipid, ved passende pH. Når svak syre tilsettes i overskudd s mengde sammenlignet med glykolipidet, fører det til at alt glykolipidet omdannes til løselig form, og dens reversering tilbake til en ikke-løselige formen hindres.

Den svake syren omdanner glykolipidet til et farmasøytisk akseptabelt salt. Foretrukne salter er ikke-toksiske salter, som vanligvis anvendes innen farmasøytiske og biologiske fremstillinger. For eksempel blir klorider, acetater, laktater og inerte salter av forbindelsene med Formel I oppnådd med de svake syrene beskrevet heri.

Alkoholene som anvendes for å løse opp glykolipidet kan være metanol, etanol, en hvilken som helst isomer form av propanol eller en hvilken som helst kombinasjon derav. Den resulterende glykolipidalkoholløsningen vil være optisk klar. En hvilken som helst kjemisk reaksjon som kan omdanne acetatformen av glykolipidet tilbake til ikke-acetatformen vil forårsake flokkulering av glykolipidene i den vandige løsningen. Når flokkuleringen av glykolipid finner sted, kommer noen av glykolipidmolekylene ut av løsningen som tynne flak, som faller til bunnen av beholderen. Den initielle konsentreringen av den svake syren i Glykosylamidforråds-løsningen av glykolipid og alkohol bestemmer om det vil være noen flokkulering av glykolipid. Den svake syren bør være i mol art overskudd med referanse til glykolipidet for å unngå flokkulering,

2) Glykolipidadjuvans-løsninger fremstilles ved å introdusere en passende mengde av Glykosylamidforråds-løsningen til en “egnet buffer.” pH til de endelige stabile Glykolipidadjuvans-løsningene beskrevet her bør være mellom ca. 6 og ca. 8. En sluttpH på mellom ca. 6 til ca. 7 er foretrukket. En slutt-pH på mellom ca. 6,3 til ca. 6,4 er beskrevet.

Glykosylamidforråds-løsningen inneholder overskudd syre slik at den bør bufres for anvendelse som en adjuvans. For eksempel kan en fosfatbuffer fremstilles ved en spesifikk pH innenfor et bredt område ved å blande monobasiske og dibasiske salter av natriumfosfat eller kaliumfosfat ved forskjellige andeler. Hvis en fosfatbuffer anvendes, kan den fremstilles ved ca. 20mM, og denne har en pH på ca. 7.8. Når Glykosylamidforråds-løsningen tilsettes til bufferen, blir pH’en til bufferen redusert. En fosfatbufret løsning ved pH 7,8 resulterer i en endelig Glykolipidadjuvans-løsning med en pH på ca. 6,4. Slutt-pH justeringer kan gjøres, men er typisk ikke nødvendig.

Glykosylamidforråds-løsningen som inneholder svak syre og et glykolipid har en svært lav pH. Det kan være nødvendig å heve pH-verdien til et akseptabelt nivå. En sterk base bør unngås for dette formålet på grunn av at tilsetning av en sterk base kan omdanne saltformen av glykolipidet tilbake til ikke-saltformen, som resulterer i presipitasjon (flokkulering) av ikke-saltformen i det vandige miljøet. Imidlertid, hvis en sterk base er ønskelig, bør kun små mengder anvendes. For eksempel er det anbefalt at ikke mer enn 100 mM NaOH anvendes, mens 4,0 mM eller mindre er optimalt.

Bufringsløsningen kan eventuelt inkluderer noe NaCl, men det er ikke påkrevd. NaClkonsentrasjoner kan variere fra ca. 1 til ca. 50 mM. Lavere mengder NaCl er foretrukket i forhold til større mengder. Eksempler her har enten ikke NaCl eller 15 mM NaCl. 100 mM NaCl er ikke egnet idet flokkulering finner sted. Ingen flokkulering forventes med N aCl-kon sentrasj oner på 15 mM eller mindre. Ingen flokkulering forventes med NaCl konsentrasjoner på 30 mM eller mindre. Ingen flokkulering forventes når NaClkonsentrasjoner er på 50 mM eller mindre.

Del Π. Karakterisering av Glykolipidadjuvansløsning

Stabiliteten til Glykolipidadjuvans-løsningen ved lagring kan overvåkes ved enkel visuell observasjon eller ved passende analytiske instrumenter. Glykolipidmolekyler danner miceller når de er i vandig løsning og det er mulig å bestemme størrelsen til micellene presist med et laserdiffraktometer. En slik måling kan anvendes for å bestemme om det er flokkulering av glykolipidmolekyler.

En alternativ tilnærming til sanntids stabil itetsmåling er å utføre akselerert stabilitetstesting. Med akselerert stabilitetstesting blir adjuvansløsningen utsatt for en temperatur på ca. 37°C i ca. syv dager, fulgt av inkubering ved ca. 4°C i ca. to dager under konstant risting. Inkuberingen ved ca. 37°C i ca. syv dager representerer lagring ved ca. 4°C i en periode på ca. et år. Inkuberingen ved ca, 4°C i ca. to dager med konstant risting representerer stressbetingelsen Glykolipidadjuvans-løsningen kan utsettes for i løpet av transport.

For å bestemme om Glykolipidadjuvans-løsningen er isoton med cytoplasm et, kan osmolariteten bestemmes. Forskjellige konsentrasjoner av natriumklorid kan tilsettes og osmolariteten til den resulterende løsningen bestemmes ved anvendelse av et osmometer. Økende konsentrasjoner av natriumklorid, i tillegg til økt osmolaritet, tenderer også til å gjøre løsningen mer turbid. Turbiditet antas å være forårsaket av aggregering av miceller til større partikler. Løsninger som er vanskelige eller umulige å filtrere ved anvendelse av et 0,2 pm filter er generelt ikke akseptable for kommersiell anvendelse på grunn av at terminal filtrering ofte anvendes for å sikre at adjuvansløsningene fremstilt på kommersiell skale er sterile. En elektronmikroskopanalyse kan anvendes for å bestemme om det er en aggregering av miceller som et resultat av for mye salt,

Ytterligere ikke-glykolipidadjuvanser kan anvendes i Glykolipidadjuvans-løsningen i kombinasjon med de som er beskrevet ovenfor. Ytterligere immunostimulerende molekylene blir tilsatt til Glykolipid adjuvans-løsningen. Immunostimulerende molekyler er godt kjente i litteraturen, og de inkluderer saponiner, Quil A, dimetyldioktadecylammoniumbromid (DDA) og Carbopol.

Quil A er et renset ekstrakt fra barken av det sør-amerikanske treet Quillaja saponaria. Quil A induserer både humorale og celle-medierte responser. Quil A blir ofte anvendt med kolesterol på grunn av at kolesterol eliminerer mindre ønskelige bivirkninger når den tilsettes i passende andeler. Kolesterol danner uløselige komplekser med Quil A som danner helikslignende strukturer slik at kolesterolet binder med Quil A, som således eksponerer molekylets sukkerenheter som hjelper til med å stimulere immunresponsen.

Dimetyldioktadecylammoniumbromid, DDA, er en kationisk surfaktant med 18 karbonalkylkjeder. Den er et amfifilisk kvatemært amin. Direkte interaksjon mellom DDA og antigen er nødvendig for å oppnå en optimal immunrespons, på grunn av at DDA fungerer som en bærer av antigen gj ennom direkte binding av antigenet ved olj e/vanngrenseflaten. Den stimulerer både de humorale og de celle-medierte immunresponser.

Karbopol er et annet anvendelig immunostimulerende molekyl som kan anvendes ifølge oppfinnelsen. Den er en akrylsyrehomopolymer som er tverrbundet med polyalkenyleter.

Del III. Anvendelser av Glykolipidadjuvansløsning.

Glykolipidadjuvans-løsningen, i en farmasøytisk akseptabel saltform, kan blandes med et antigen. Vanlige antigener inkluderer: mikrobielle patogene proteiner, glykoproteiner, lipoproteiner, peptider, glykopeptider, lipopeptider, toksoider, karbohydrater og tumorspesifikke antigener. Antigenene kan avledes fra et antall kilder. Antigener fra mikrobielle patogener inkluderer sykdomsforårsakende bakterier, virus og parasittorganismer. Blandinger av to eller flere antigener kan anvendes. Antigenet kan være avlivet, naturlig attenuert, modifisert i live eller et proteinekstrakt, rekombinant produsert protein, et kjemisk syntetisert peptid eller noe annet som stimulerer en immunrespons. Peptidanti genet kan eksistere som et fritt peptid eller konjugert til glykolipidet eller konjugert til en annen kjent B-celle eller T-celleepitoper.

Den stabile Glykolipidadj uvans-løsningen kan kombineres med ytterligere adjuvanser eller komponenter som er kjent for å adjuvansegenskaper. Ytterligere adjuvanser som kan kombineres med Glykolipidadj uvans-løsningen inkluderer polymerer, naturlig forekommende terpenoidforbindelser i deres urene eller delvis rensede form, amfifilisk kvaternært amin, derivater av b akteri ecel 1 eveggm ateri al er og syntetiske analoger av bakteriecellevegg eller DNA-komponenter. Glykolipidadjuvans-løsningen kan anvendes med eller kombineres med et eller flere midler slike som antibiotiske midler eller forskjellige antigener. Bakterielle eller vi rale antigener kan enten være avlivet eller modifisert i live. Avlivede vi rale antigener fremstilles ved å dyrke virus i vevskultur og inaktivere virusene ved kjemisk behandling. Noen virus kan dyrkes i embroynerte egg. Det avlivede virale antigenet kan tilsettes til løsning som inneholder Glykolipid adjuvans-løsning, og den resulterende løsningen kan anvendes for å vaksiner dyrene for å oppnå beskyttelse ovenfor de virale infeksjonene,

I en utførelsesform ifølge oppfinnelsen kan Glykolipidadj uvans-løsningen anvendes som et fortynningsmiddel for modifiserte levende viral antigener. Virale patogener kan attenueres i deres virulens enten ved å passere dem i vevskultur i flere generasjoner eller gjennom spesifikke manipuleringer av det virale genomet. Slike attenuerte stammer av virus kan dyrkes til svært høye titervolumer i vevskultur og kan anvendes som vaksine antigener. Attenuerte virale stammer blir referert til som modifiserte levende virale antigener. Mens disse stammene er mindre virulente, er de fremdeles svært immunogene når de anvendes som antigen i vaksinen og gir beskyttelse overfor infeksjon av virulente stammer. Dersom Glykolipidadjuvans-løsningen anvendes som et fortynningsmiddel for modifiserte levende virale antigener, bør Glykolipidadjuvans-løsningen testes for å forsikre om at den ikke har noen virisidal effekt på det bestemte viruset av interesse.

De virisidale egenskapene til Glykolipidadjuvans-løsningen på modifiserte levende virale antigene kan bestemmes i et in vitro eksperiment. Lyofili serie virale antigener rehydreres med Glykolipidadjuvans-løsningen eller med vann. De resulterende virus løsningene plasseres på et monolag av tillatte celler. Titervolumet av det virale antigenet bestemmes ved hjelp av å telle antallet pl akk dannet på monolaget. Forskjellen i det virale titervolumet oppnådd mellom prøvene rehydrert med vann og Glykolipidadj uvans-løsningen kan anvendes for å bestemme den virisidale effekten, hvis noen, av Glykolipidadj uvans-løsningen på eventuelle levende virus.

Modifiserte levende vi rale antigener kan lyofiliseres og bli tilveiebrakt som lyofiliserte kaker i et kommersielt vaksinepreparat. Generelt blir disse lyofiliserte kakene av modifiserte levende virale antigener rehydrert med en fortynnet løsning og anvendt for parenteral vaksinasjon. Eksempler på fortynningsmidler inkluderer en vannløsning som inneholder fosfatbufret saltvann. Hvis den fortynnede løsningen inneholder et kjent immunostimulerende molekyl, kan effektiviteten av vaksinasjon med de modifiserte levende virale antigenene forbedres. I en utførelsesform ifølge oppfinnelsen blir Glykolipidadj uvans-løsningen anvendt som en fortynnet løsning.

EKSEMPLER

Eksempel 1. Fremstilling av en uløselig glykosylamidsammensetning med lik konsentrasjoner av Bay 15-5831® og eddiksyre.

Tabell 1. En sammensetning ikke egnet for kommersiell anvendelse

Bay 15-5831® er registrert av the Bayer Company, og er varemerkenavnet for N-(2-deoksy-2-L-leucylamino-β-D-gulukopyranosyl)-N-oktadecyldodekanoylamid. Når denne forbindelsen anvendes for fremstilling av en adjuvansløsning ved anvendelse av sammensetni ngene beskrevet i Tabell 1, ovenfor, hvor eddiksyren anvendes i lik molar konsentrasjon med glykolipidet, og glykolipidet er i sin fri baseform, er glykolipidet uløselig og flokkulerer.

Eksempel 2. En løselig Gly kosylamidforråds-1 øsning ved anvendelse av de samme komponenter som Eksempel 1, men med en økning i eddiksyrekonsentrasj onen relativt til konsentrasjonen av glykolipid, resulterer i en løselig Glykosylamidforråds-løsning.

Tabell 2. Sammensetning av en Glykosylamidforråds-løsning

Here ble 60% etanol (v/v) anvendt, og molforholdet mellom eddiksyre og glykolipid er 2,0. 200-kvalitet etanol en i Eksempel 1 ble erstattet 60% etanol vann. Den resulterende Glykosylamidforråds-løsningen var optisk klar og det var ingen sedimentering på bunnen av beholderen. Denne Glykosylamidforråds-løsningen ble tilsatt til forskjellige buffere for å fremstille en Glykolipidadjuvans-løsning i Eksempel 3, nedenfor.

Eksempel 3. Fremstilling av Glykolipidadjuvans-løsninger. Fosfatbufferløsninger ved forskjellige pH ble fremstilt. En 2 M forrådsløsning av monobasisk natriumfosfatløsning ble fremstilt ved å løse opp 138 g NaH2P04 H2O salt i 250 mL DI vann i et beger og bringe sluttvolumet til 500 mL. Tilsvarende ble en 2M forrådsløsning av dibasisk natriumfosfatløsning fremstilt ved å løse opp 142 g NaH2P04 i 300 mL DI vann i et beger og bringe sluttvolumet til 500 mL. Begge forråd sløsningene ble sterilfiltrert ved anvendelse av et 0,2 mikronfilter.

Tabell 3. Sammensetningene i 1M forrådsløsning av natriumfosfatbufferløsning ved forskjellige pH.

Forskjellige volumer av 2M forrådsløsning av monobasisk natriumfosfat og dibasiske natriumfosfatløsninger slik det er vist i Tabell 3 ble fremstilt, deretter ble 1M forrådsløsning av natriumfosfatbufferløsninger oppnådd ved forskjellige pH-nivåer. 1M fosfat bufferløsningene ble deretter fortynnet 5 0X for å gi 20 mM fosfatbuffere.

Glykolipidadjuvans-løsninger ble fremstilt ved anvendelse av disse forrådbuffere og Glykosylamidforråds-løsningene fra Eksempel 2.

Til 96 mL av hver av disse 20 mM fosfatløsningene ble 5 mL Gl ykosylami dforrådsløsning som fremstilt i Eksempel 2 tilsatt. Den resulterende Glykolipidadjuvansløsningen inneholdt 12,5 mM eddiksyre og 6,33 mM glykolipid. glykolipidet er nå i acetatformen.

Eksempel 4. Signifikans av slutt-pH på Glykolipidadjuvansløsningen.

I et annet sett av eksperimenter ble signifikansen av slutt-pH til forskjellige løsninger testet for å evaluere hvordan pH påvirker flokkulering. En 20 mM fosfatbuffer ble fremstilt ved en initiell pH på 7,8. Tabell 4 viser glykoli pi dadj uvan sen fremstilt ved anvendelse av glykosylamidet fremstilt i henhold til Eksempel 1, hvor glykolipid og eddiksyre ble anvendt i ekvimolare konsentrasjoner. Bemerk at slutt-pH falt ikke veldig mye (Tabell 4), som indikerer effektiviteten til bufferen. NaCl-konsentrasj oner varierer. De optimale tetthetsavlesninger (O.D.) ved 600 nm, i Tabell 4, ble sammenlignet med tilsvarende avlesninger i Tabell 5, hvor Glykolipidadjuvans-løsningene ble fremstilt med Glykosylamidforråds-løsninger som inneholder to ganger det molare forholdet mellom eddiksyre og glykolipid, som fremstilt i Eksempel 2. Ved anvendelse av den største konsentrasjonen eller mengden av eddiksyre resulterer dette i minimal flokkulering. Flokkuleringen var høyere i den ikke-filtrerte prøven enn i de filtrerte prøvene. Videre, med økende NaCl-konsentrasj on, var det en økning i flokkulering og til og med presipitasjon. Glykolipidadj uvans-løsningen beskrevet i Tabell 5 ble fremstilt med en fosfatbuffer som har en initiell pH på 8,0; slutt-pH av Glykolipidadjuvansløsningen var mellom 6,8 og 7,0. En ytterligere reduksjon i slutt-pH til Glykolipidadjuvansløsningen kan resultere i en Glykolipidadjuvans-løsning med mindre turbiditet og ingen flokkulering.

Tabell 4 . Fremstilling av glykosylamidsammensetninger som inneholder ekvimolar mengde av eddiksyre og glykolipider. (Se Eksempel 1.)

Tabell 5. Fremstilling av Glykolipidadjuvans-løsning ved anvendelse av Glykosylamidforråds-løsning som inneholder to ganger den molare mengden av eddiksyre i forhold til glykolipid. (Se Eksempel 2.)

En optisk tetthet (O.D.) på mindre enn 0, 1 representerer en gjennomsiktig løsning. En optisk tetthet på mellom 0,1 og 0,5 er homogen med svak turbiditet, en optisk tetthet på 0,5 til 1,0 har noe turbiditet, en optisk tetthet på 1,0 til 1,5 anses turbid. En optisk tetthet over 1,5 er turbid og vil trolig ikke kunne filtreres ved anvendelse av et 0,2 mikron filter. Sistnevnte vil generelt anses som ikke kommersielt egnet.

Eksempel 5. Titrering av glykolipidadjuvans med eddiksyre for å vise at flokkulering kan reverseres. For å bestemme om tilsetning av økende mengde eddiksyre til glykolipidadjuvansen for å vise at flokkulering vil reversere flokkuleringen, ble en glykolipidadjuvans slik det er beskrevet i Eksempel 1 fremstilt. Denne glykolipidadjuvansen viste flokkulering selv under fravær av noe NaCl. En økende konsentrasjon eddiksyre ble tilsatt til denne flokkulerte glykolipidadjuvansblandingen. Eddiksyren ble fortynnet 16,6 ganger med vann for å gi en arbeidsløsningkonsentrasj on på 1 Molar. Deretter ble 15 μΐ av denne 1M løsningen tilsatt til 15 ml glykolipidadj uvansblanding for å øke eddiksyrekonsentrasj onen med 1 mM. Med økende konsentrasjon av eddiksyre ble pH til glykolipidadjuvansen redusert og flokkulatene løst opp. Imidlertid holdt glykolipidadjuvansen seg noe turbid. Denne observasjonen bekrefter at økende eddiksyrekonsentrasj on omdanner den frie basen av Bay 15-5381 til en acetatform, som er mer løselig i vandig løsning.

Tabell 7. Titrering av glykolipidadj uvans med eddiksyre

Eksempel 6. Fremstilling av en andre stabil Glykolipidadjuvans-løsning med og uten NaCl. Etter etablering av viktigheten av en økning i mengden av eddiksyre for å opprettholde stabiliteten til glykolipidløsningene, ble det bestemt å anvende sammensetningen vist i Tabell 8 for først å fremstille en Glykosylamidforråds-løsning og deretter anvende denne for fremstilling av en annen Glykolipidadjuvans-løsning, både med og uten NaCl. Denne Glykosylamidforråds-løsningen er tilsvarende løsningen i Eksempel 2, med 4 ganger totalvolumet og relativt større mengder av eddiksyre og Tween 20.

Tabell 8. Sammensetning av en Glykosylamidforråds-løsning

Tre forskjellige Glykolipidadj uvans-løsninger med forskjellige konsentrasjoner av NaCl ble fremstilt ved anvendelse av fosfatbufferen fra Eksempel 3 og Glykosylamid forråds-løsningen fremstilt som i Tabell 8.

Som formuleringen i Eksempel 4, Tabell 5, ble Glykolipidadj uvans-løsningen fremstilt som inneholder 0 mM, 15 mM og lOOmM NaCl. 0 mM og 15 mM NaCl løsningene kan filtreres gjennom et 0,2-mikron filter. Glykolipidadjuvans-løsningen som inneholder 100 mM NaCl kan ikke filtreres gjennom et 0,2-mikron filter.

Tabell 9. Fremstilling av stabile Glykolipidadj uvans-løsni nger med og uten NaCl

20 mL av hver av Glykolipidadj uvans-løsningene ble plassert i 30 ml glassbeholdere og inkubert ved romtemperatur og ved 4°C. Visuelle observasj oner ble gj ort ved j evne intervaller. Initielt var Glykolipidadjuvans-løsningen med 0 mM NaCl optisk klar. Glykolipidadjuvans-løsningen som inneholder 15 mM NaCl var svakt turbid og hadde en O.D. på 0,073 ved 600 nm. Glykolipidadjuvans-løsningen som inneholder 100 mM NaCl var turbid og hadde en O.D. på 0,439 ved 600 nm. Tabell 9. Ingen av disse Glykolipidadj uvans-løsningene viste noe tegn på flokkulering både ved romtemperatur og ved 4°C. Disse Glykolipidadj uvans-løsningene ble observert i en periode på et år uten forandring i utseende.

Eksempel 7, Titrering av en stabil Glykolipidadj uvans-løsning med NaOH

Initielt ble en optisk klar og stabil Glykolipidadj uvans-løsning fremstilt uten NaOH, For å etablere at elimineringen eller anvendelsen av en minimal mengde NaOH var essensiell for å hindre flokkulering, var det nødvendig å vise at en gradvis tilsetning av NaOH ville indusere flokkulering i en ellers stabil glykolipidblanding. Passende volumer av 1 N NaOH ble tilsatt til 15 niL Glykolipidadjuvans-løsning uten noe tilsatt NaCl, slik det ble fremstilt i Tabell 10, nedenfor. NaOH ble økt gradvis fra 1 mM til 12 mM. (Tabell 10). Glykolipidadjuvans-løsningen som anvendes i dette eksperimentet ble fremstilt ved anvendelse av Glykosylamidforråds-løsningen beskrevet i Eksempel 6. Med økende konsentrasjon av NaOH i Glykolipidadjuvans-løsningen, økte pH til formuleringen gradvis sammen med tilsynekomst av flokkulering.

Tabell 10. Titrering av en stabil Glykolipidadjuvans-løsning med NaOH

Eksempel 8. Kvantifisering av glykolipidkomponenten ved anvendelse av HPLC Følgende metodologi ble anvendt i HPLC-analysen av Bay 15-5831®. HPLC-parametrene beskrevet i Tabell 11 ble anvendt.

Tabell 11. Sammendrag av parametere anvendt i HPLC-fremgangsmåte for kvantifisering av Bay 15-5381

Tabell 12. Standarder av Bay 15-5831®

Standarder i området 0,10 til 1,03 mM ble fremstilt og injisert på en HPLC. Et sammendrag av standardene er vist i Tabell 12. Prøvene ble varmet opp til romtemperatur og invertert 5 ganger før anvendelse. Iml av prøven ble til satt til 6 ml metanol i en 10 ml volum etrisk kolbe. Prøver ble deretter lydbehandlet i 10 minutter og deretter fortynnet til volum og blandet. Lineær regresjon ble utført på standarder med topparealer plottet mot konsentrasjon. Prøvene ble deretter beregnet mot kurven.

Eksempel 9. Tretti (30) liter skalaproduksjon. En 30 Liter batch med Glykolipid adjuvans-løsning med en sammensetning slik det er beskrevet i Eksempel 6 ble fremstilt. Denne batchen inneholdt 15 mMNaCl.

Ved anvendelse av denne 30 L fremstillingen ble fem forskjellige underløsninger fremstilt med økende konsentrasjon av NaOH. NaOH-konsentrasj onen økte fra 0 mM til ImM, 2 mM, 4 mM, 8 mM og 12mM. Prøven for hver NaOH-konsentrasj on ble tatt ut som alikvot for pH-måling og visuell observasjon. Med økende mengder NaOH økte pH til glykolipidadjuvansen sammen med økende flokkulering. Flokkuleringen startet å komme til syne ved 2 mM NaOH-konsentrasj on ved romtemperatur, og ved 4°C startet flokkuleringen å komme til syne ved 4 mM NaOH.

Tabell 13. Karakterisering av 30-L batch glykolipidadjuvans med økende konsentrasjon av NaOH

Mengden av Bay 15-5381 i alle de seks prøvene vist i Tabell 13 ble kvantifisert ved anvendelse av HPLC-metoden beskrevet i Eksempel 8. Prøvene med varierende pH viste samme konsentrasjon av Bay 15-5381 som viser at adj uvanskomponenten ikke brytes ned i løpet av pH-økningen med tilsetning av NaOH og ledsagende flokkulering.

Eksempel 10. Stabiliseringsevalueringer ved anvendelse av akselerert stresstesting. Dette eksempelet beskriver fremgangsmåtene og resultatene av akselerert stresstesting på Glykolipidadjuvans-løsningen. Tre batcher av Glykolipidadjuvans-løsninger slik det er beskrevet i Eksempel 6 ble fremstilt på 500 L skalaen. Alle tre batchene hadde 15 mM NaCl og inneholdt ikke NaOH. Glykolipidadjuvans-løsningene fra disse tre 500 L batcher ble anvendt for å studere stabiliteten til glykolipidet ved anvendelse av en akselerert stabilitetstesting.

For akselerert stresstesting ble Glykolipidadjuvans-løsningen ristet i syv dager ved 37°C, fulgt av risting ved 4°C i to dager. De syv dagene med risting ved 37°C representerer aldring ved 4°C i et år. Ristingen ved 4°C i to dager representerer stress i løpet av transport.

Et sett av Glykolipidadjuvans-løsning ble holdt statisk ved 37°C i 7 dager, deretter ristet ved 100 opm ved 4°C i ytterligere 2 dager. Ved fire tidspunkter, dvs. T=0, 3, 7 og 9 dager, ble observasjon og fotobilde avlest. Ved 2 tidspunkter dvs, T=0 og 9 dager ble Refraktiv Indeks og parti kkel størrel seanaly se deretter utført.

Det andre settet av Glykolipidadjuvans-løsning ble ristet ved 100 opm ved 37°C i 7 dager; deretter ristet ved 100 opm ved 4°C i ytterligere 2 dager. Ved fire tidspunkter, dvs. T=0, 3, 7 og 9 dager, ble observasjon og fotobilde avlest. Ved 2 tidspunkter, dvs. . T=0 og 9 dager, ble Refraktiv Indeks og partikkelstørrelseanalyse deretter utført.

Det tredje settet av Glykolipidadjuvans-løsning var statisk ved 4°C i 9 dager som kontroll. Ved fire tidspunkter, dvs. T=0, 3, 7, og 9 dager, ble observasjon og fotobilde avlest. Ved 2 tidspunkter, dvs. T=0 og 9 dager, ble Refraktiv Indeks og partikkelstørrelseanalyse deretter utført.

Det var ingen forandring i partikkelstørrelse som resultat av stresstesting. Alle prøvene opprettholdt undermikronpartikkel størrel se slik det ble observert i prøvene umiddelbart etter at de var fremstilt. Videre viste en HPLC -måling av Bay 15-5831® komponent i prøvene holdt ved 4°C eller gjort til gjenstand for stress ved 37°C i 7 dager ikke noen forandring i mengden Bay 15-5831®.

Tabell 15. Kvantifisering av Bay 15-5831® etter stresstesting

I Tabell 15 ble prøvene holdt ved 4°C i syv dager, mens testprøvene ble ristet ved 37°C i syv dager. Prøvene ristet ved 37°C i syv dager har konsentrasjoner tilsvarende de som ble lagret ved 4°C.

Eksempel 11. Virisidal testing av Glykolipidadjuvans-løsningen

Virisidal testing ble utført på Glykolipidadjuvans-løsningen fremstilt på en 3 OL skala slik det er beskrevet ovenfor i Eksempel 9. Denne Glykolipidadjuvans-løsningen inneholdt 15 mM NaCl og ikke NaOH.

Glykolipidadjuvansen ble testet for dens egnethet for anvendelse som et fortynningsmiddel med modifiserte levende virus. Modifiserte levende viral antigener ble fremstilt som frysetørkede plugger. Etter rehydrering av disse pluggene med passende Glykolipidadj uvans-løsning, ble det bekreftet at Glykolipidadjuvansløsningen som ble anvendt, avlivet ikke de modifiserte levende virusene. Glykolipid adj uvans-løsni ngen ble testet mot tre bovine viral e antigener: Bovine Respiratorisk Syncital virus (BRSV), Para-influensa Virus 3 (PI3), og Infeksjons Bovine Rhinotrachetis (IBR) virus.

Vi rale plugger ble rehydrert ved anvendelse av Glykolipidadjuvans-løsningen, Etter inkubering ved romtemperatur (RT) i 1 time ble prøvene tilsatt plater på et monolag av en tillatt cellelinje med en seriefortynning. Ved å telle antallet virale plugger som synes på monolaget, ble 50% vevskultur infektiv dose per ml (TCID50/ml) verdien oppnådd for hvert viral t antigen rehydrert med sterilt vann eller Glykolipidadj uvans-løsning. 1 denne undersøkelsen ble en reduksjon i titervolum på 0,7 etter rehydrering med test Glykolipidadjuvans-løsningen behandlet som virisidal.

Resultatene er angitt i Tabell 16. Glykolipidadjuvans-løsningen viste ikke noen virisidal efekt på disse tre bovinevirusene.

Tabell 16. Virisidal undersøkelse for Glykolipidadjuvans-løsning

Dette eksempelet viser at Glykolipidadj uvans-løsningen kan anvendes i en kommersiell formulering av en Dyrehel sevaksine . Rispoval® inneholder tre forskjellige bovinevirale sykdommer ved anvendelse av 3 modifiserte levende virale antigener. Disse bovinevirale antigenene er modifisert levende bovine herpes vims, modifiserte levende bovine respiratorisk synctial virus og modifisert levende parainfluensa vims 3. Disse virale antigenene produseres som en lyofilisert kake og Glykolipidadjuvansløsningen fremstilt ifølge oppfinnelsen kan anvendes som fortynningsløsning for disse antigenene. Glykolipidet som anvendes var N-(2-deoksy-2-L-leucylamino-β-D-glukopyranosyl)-N-oktadecyldodekanamidacetat.

Eksemplene er angitt for å illustrere oppfinnelsen. De skal ikke tas som begrensning av omfanget av oppfinnelsen. Mange forandringer, variasjoner, modifikasjoner og andre anvendelser og applikasj oner av oppfinne! sen vil være nærliggende for fagmannen .

Claims (1)

1. P aten tk rav 1 Sammensetning, k a r a k t e r i s e r t v e d at den innbefatter a) et glykolipid med formel I: hvori formel I er

   hvori R<1>og R<2>er uavhengig hydrogen, eller et mettet alkylradikal som har opp til 20 karbonatomer; X er -CH2-, -O- eller -NH-; R<3>, R<4>og R<5>er uavhengig hydrogen, -S04<2->, -PO4<2->, -COC1-10alkyl; R<6>er L-alanyl, L-alfa-aminobutyl, L-arginyl, L-asparginyl, L-aspartyl , L-cysteinyl, L-glutamyl, L-glycyl, L-histidyl, L-hy droksypropyl , L-isoleucyl, L-leucyl, L-lysyl, L-metionyl, L-omitinyl, L-fenylalanyl, L-prolyl, L-seryl, L-treonyl, L-tyrosyl, L-tryptofanyl, og L-valyl eller deres D-isomerer; i en saltform, hvor saltformen er avledet fra en svak syre; b) en alkohol, hvori alkoholen er HO-CI -3alkyl; c) en svak syre, hvori den svake syren er, 1) i en mengde fra 1,25 til 5,0 ganger av mengden av glykolipidet, i molare ekvivalenter i forhold til glykolipidet, og 2) en hvilken som helst syre som har en pKa (-log av Ka) verdi på mellom 1,0 og 9,5 ved anvendelse av standard tabeller eller verdier; d) en ikke-ionisk surfaktant, hvor den ikke-ioniske surfaktanten er et middel som reduserer overflatespenningen til materialet den er løst opp i og har en komponent som er hydrofob og en annen komponent som er hydrofil. Sammensetning ifølge krav 1, k a r a k t e r i s e r t v e d at glykolipidet er en forbindelse med Formel 11(a)

   Formel 11(a) og den svake syren er valgt fra en eller en hvilken som helst kombinasjon av følgende svake syrer, eddiksyre, H(C2H3O2) (pKa 4,76); askorbinsyre(l), H2(C6H6O6) (pKa 4,10); acetylsalicylsyre, Hg(C9O4), (pKa 3,5); butan syre H(C4H702) (pKa 4,83); karbonsyre, form 1, H2CO3, (pKa 4,83); krom syre, form 2, HCr04<">’ (pKa 6,49); sitronsyre form 1, H3(C6H5O7), (pKa 3,14); sitronsyre form 2, H2C6H5O7)<‘>, (pKa 4,77); sitron syre form 3, (HC6H507)<“>, (pKa 6,39); maursyre, H(CHO2), (pKa 3,75); fumarsyre, H4(C404) (pKa 3,03); heptansyre, H(C7H13O2), (pKa 4,89); heksansyre, H(C6HnO2), (pKa 4,84); flussyre, HF, (pKa 3,20); isocitrat, H8(C6O7) (pKa 3,29); melkesyre, H(C3H5O3), (pKa 3,08); maleinsyre, H4(C4O4) (pKa 1,83); nikotinsyre, H5(C6N02)(pK3,39); oksal syre form 1, H2(C2OO), (pKa 1,23); oksalsyre form 2, (HC2O4)<">, (pKa 4,19); pentansyre, H(C5H9O2), (pKa 4,84); fosforsyre form 1, H3PO4, (pKa 2,16); propansyre, H(C3H5O2), (pKa 4,86); pyrodruesyre, H4(C3O3) (pKa 2,39); og ravsyre H6(C4O4) (pKa 4,19). 3. Sammensetning ifølge krav 2, k a r a k t e r i s e r t v e d at glykolipidet er en forbindelse med Formel 11(b)

   Formel 11(b) og den svake syren er valgt fra en eller en hvilken som helst kombinasjon av følgende svake syrer: eddiksyre, acetyl salicyl syre; sitronsyre; maursyre; fumarsyre; flussyre; isocitrat; maleinsyre; nikotinsyre; fosforsyre; pyrodruesyre; og ravsyre. 4. Sammensetning ifølge krav 3, k a r a k t e r i s e r t v e d at glykolipidet er N-(2-deoksy-2-L-leucylamino-β-D-glukopyranosyl)-N-oktadecyldodekanamidacetat, som har en struktur med Formel III:

   Formel 1Π og den svake syren er eddiksyre. 5. Sammensetning ifølge krav 2, k a r a k t e r i s e r t v e d at den svake syren er valgt fra gruppen bestående av: eddiksyre; acetylsalicylsyre; sitronsyre form 1; sitronsyre form 2; sitronsyre form 3; maursyre; fumarsyre; flussyre; isocitrat; maleinsyre; nikotinsyre; fosforsyre form 1; pyrodruesyre; og ravsyre. 6 Sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5, k a r a k t e r i s e r t v e d at nevnte svake syre er i en mengde på følgende ganger større enn den molare ekvivalenten av glykolipid; a) 1,25 ganger større, b) 2,0 ganger større, c) 2,5 ganger større, d) 2,7 ganger større, e) 3,0 ganger større, f) 5,0 ganger større, enn den molare ekvivalente mengden av glykolipidet. 7. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 1-6, k a r a k t e r i s e r t v e d at alkoholen er etylalkohol. 8 Sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 1-7, k a r a k t e r i s e r t v e d at nevnte ikke-ioniske surfaktant er valgt fra en hvilken som helst eller en kombinasjon av gruppen som består av: sorbitanmonolaurat, sorbitanm onopal mitat, sorbitanmonostearat, sorbitantristearat, sorbitanmonooleat, sorbitantrioleat, polyoksyetylensorbitanmonolaurat, polyoksyetylensorbitanmonopalmitat, polyoksyetylensorbitanmonostearat, polyoksyetylensorbitanmonooleat, polyoksyetylensorbitantrioleat, og andre sorbitaner og polyoksyetyl en sorbitaner som vanligvis anvendes i vaksiner. 9. Sammensetning ifølge krav 1, k a r a k t e r i s e r t v e d at den svake syren er eddiksyre og videre at eddiksyren er i en mengde som er 2,0 ganger større enn den molare ekvivalente mengden av glykolipidet. 10 Sammensetning ifølge krav 1, k a r a k t e r i s e r t v e d at den svake syren har en pKa (-log av Ka) verdi på mellom 1,23 og 6,49 ved anvendelse av standard tabeller eller verdier. 11 Sammensetning, k a r a k t e r i s e r t v e d at den innbefatter: a) et glykolipid med Formel I; hvori Formel 1 er

   R<1>og R<2>er uavhengig hydrogen, eller et mettet alkylradikal som har opp til 20 karbonatomer; X er -CH2-, -O- eller -NH-; R<3>, R<4>og R<5>er uavhengig hydrogen, -SO4<2->, -PO4<2->, -COC1-10alkyl; R<6>er L-alanyl, L-alfa-aminobutyl, L-arginyl, L-asparginyl, L-aspartyl, L-cysteinyl, L-glutamyl, L-glycyl, L-histidyl, L-hydroksypropyl, L-isoleucyl, L-leucyl, L-lysyl, L-metionyl, L-omitinyl, L-fenylalanyl, L-prolyl, L-seryl, L-treonyl, L-tyrosyl, L-tryptofanyl og L-valyl eller deres D-isomerer; i en saltform, hvor saltformen er avledet fra en svak syre, b) en alkohol, hvori alkoholen er HO-C1-3alkyl; c) en svak syre, hvori den svake syren er 1) i en mengde fra 1,25 til 5,0 ganger av mengden av glykolipidet, i molare ekvivalenter i forhold til glykolipidet, og 2) en hvilken som helst syre som har en pKa (-log av Ka) verdi på mellom ca. 1,0 og ca. 9,5 ved anvendelse av standard tabeller eller verdier; d) en ikke-ionisk surfaktant, hvor den ikke-ioniske surfaktant er et middel som reduserer overflatespenningen til materialet den er løst opp i og har en komponent som er hydrofob og en annen komponent som er hydrofil; og e) en vandig buffer, hvori den egnede bufferen er passende for vaksineanvendel se og kan opprettholde pH til de andre ingrediensene innenfor et pH-område på 6 til 8, med den betingelsen at ikke mer enn 50 mM NaCl anvendes. 12 Sammensetning ifølge krav 11 k a r a k t e r i s e r t v e d at pH til løsningen justeres til en relativt konstant pH i en vandig løsning på mellom 6 og 7, og bufferen er valgt fra gruppen som består av fosfatbuffere som har enten en eller begge monobasiske og dibasiske salter av natriumfosfat og/eller kaliumfosfat ved samme eller forskjellige andeler. 13. Sammensetning ifølge krav 11, k a r a k t e r i s e r t v e d at nevnte buffer er valgt fra gruppen som består av: a) 2-(N-morfolino)etansulfonsyre (også kjent som MES); b) 3-(N-morfolino)propansulfonsyre (også kjent som MOPS); c) n-[tris(hydroksymetyl]-2-aminoetansulfonsyre (også kjent som TES); d) 4-(2-hydroksyetyl)piperazin-1-etansulfonsyre (også kjent som HEPES); og e) [tris(hydroksymetyl)metyl]glycin (også TRIS); eller en hvilken som helst kombinasjon derav. 14. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 1-13, k a r a k t e r i s e r t v e d at den ytterligere innbefatter et antigen valgt fra gruppen, eller en hvilken som helst kombinasjon derav, som består av modifisert levende bovine herpesvirus, modifisert levende bovine respiratorisk syncti al virus, og modifisert levende parainfluensavirus 3. 15. Sammensetning, k a r a k t e r i s e r t v e d at den innbefatter: a) N-(2-deoksy-2-L-]eucylamino-β-D-g]ukopyranosy])-N-oktadecyldodekanamidacetat, som har en struktur med Formel III:

   Formel III b) etanol; c) eddiksyre, hvor eddiksyren er i en mengde fra 1,25 til 5,0 ganger av mengden av glykolipi det, i mol are ekvivalenter i forhold til glykolipidet; d) ikke-ionisk surfaktant, valgt fra: sorbitanmonolaurat, sorbitanmonopalmitat, sorbitanmonostearat, sorbitantristearat, sorbitanmonooleat, sorbitantrioleat, polyoksyetyl en sorbitanm onol aurat, polyoksyetyl ensorbitanmonopalmitat, polyoksyetylensorbitanmonostearat, polyoksyetylensorbitanmonooleat, polyoksyetylensorbitantrioleat, e) en vandig buffer, hvor pH til løsningen justeres til en relativt konstant pH i en vandig bufferløsning på mellom 6 og 7, og bufferen er valgt fra gruppen av: a) 2-(N-morfolino)etansulfonsyre (også kjent som MES), b) 3-(N-morfolino)propansulfonsyre (også kjent som MOPS), c) n-[tri s(hy droksymetyl ] -2-aminoetansulfonsyre (også kjent som TES), d) 4-(2-hydroksyetyl)piperazin- 1 -etansulfonsyre (også kjent som HEPES), og e) [tris(hydroksymetyl)metyl]glycin (også TRIS), eller en hvilken som helst kombinasjon derav, med den betingelsen at ikke mer enn 15 mM NaCl anvendes; og f) et antigen som i det vesentlige består av modifisert levende bovine herpesvirus, modifisert levende bovine respiratorisk synctialvirus, og modifisert levende parainfluensavirus 3. 16 Fremgangsmåte for fremstilling av en sammensetning, k a r a k t e r i s e r t v e d at den innbefatter sammenblanding av følgende: a) et glykolipi d med Formel 1; b) en alkohol, hvor alkoholen er HO-C1-3alkyl; c) en svak organisk syre, hvori den svake syren er, 1) i en mengde fra 1,25 til 5,0 ganger av mengden av glykolipidet, i molare ekvivalenter i forhold til glykolipidet; og 2) en hvilken som helst syre som har en pKa (-log av Ka) verdi på mellom 1 ,0 og 9,5 ved anvendelse av standard tabeller eller verdi er; og d) en ikke-ionisk surfaktant. Fremgangsmåte for fremstilling av en sammensetning, k a r a k t e r i s e r t v e d at den innbefatter sammenblanding av følgende: a) et glykolipid med Formel I; b) en alkohol, hvor alkoholen er HO-CI-3 alkyl; c) en svak organisk syre, hvori den svake syren er, 1) i en mengde fra 1,25 til 5,0 ganger av mengden av glykolipidet, i molare ekvivalenter i forhold til glykolipidet; og 2) en hvilken som helst syre som har en pKa (-log av Ka) verdi på mellom 0,7 og 9,5 ved anvendelse av standard tabeller eller verdi er; d) en ikke-ionisk surfaktant; og deretter tilsette e) en passende buffer.