ES2878475T3 - Composiciones adyuvantes liposomales - Google Patents

Abstract

Un liposoma esencialmente libre de saponina que comprende una membrana bicapa lipídica externa y un compartimento interno, comprendiendo la membrana externa: a) un compuesto de amonio cuaternario formado por cuatro cadenas de alquilo, dos de las cuales son alquilos C10-C20 y las dos restantes son alquilos C1-C4; b) un esterol seleccionado del grupo formado por β-sitosterol, estigmasterol, ergosterol, ergocalciferol y colesterol; c) un fosfolípido; y d) un glicolípido de fórmula I: **(Ver fórmula)** en el que R1 es hidrógeno o un radical alquilo saturado de hasta 20 átomos de carbono; X es -CH2-, -O- o -NH-; R2 es hidrógeno o un radical alquilo saturado o insaturado de hasta 20 átomos de carbono; R3, R4 y R5 son independientemente hidrógeno, - SO42-, -PO42-, -COC1-10 alquilo; R6 es L-alanilo, L-alfa-aminobutilo, L-arginilo, L-asparginilo, L-aspartilo, L-cisteinilo, L-glutamilo, L-glicilo, L-histidilo, L-hidroxiprolilo, L-isoleucilo, L-leucilo, L- lisilo, L-metionilo, L-ornitinilo, L-fenialilo, L-prolilo, L-serilo, L-treonilo, L-tirosilo, L-triptófano y L-valilo o sus isómeros D,

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones adyuvantes liposomales

Campo de la invención

La presente invención se encuentra en el campo de los adyuvantes para vacunas.

Antecedentes

En el ámbito de la vacunología, los antígenos se introducen en un huésped de manera que se estimule una respuesta inmunitaria contra el antígeno y, por tanto, contra el patógeno potencial. La inducción de una respuesta inmunitaria depende de muchos factores, entre los que se cree que están la composición química, las características y la configuración del antígeno, la salud y la competencia inmunitaria del huésped, y la forma de administración del antígeno.

Una respuesta inmunitaria tiene muchas facetas, algunas de las cuales son exhibidas por las células del sistema inmunitario, (por ejemplo, células dendríticas, linfocitos B, linfocitos T, macrófagos y células plasmáticas). Las células del sistema inmunitario participan en la respuesta inmunitaria mediante la interacción con antígenos u otras células del sistema inmunitario, la liberación de citocinas y la reactividad a esas citocinas. La respuesta inmunitaria adaptativa (adquirida) se divide convenientemente (pero de forma arbitraria) en dos categorías principales: la humoral y la mediada por células. El componente humoral de la respuesta inmunitaria incluye la producción de anticuerpos específicos para el antígeno. El componente celular incluye la generación de hipersensibilidad retardada y de células T efectoras citotóxicas específicas para el antígeno.

Los adyuvantes son sustancias utilizadas para potenciar una respuesta inmunitaria cuando se utilizan junto con el antígeno. El uso de un adyuvante en un protocolo de vacunación puede, por ejemplo, provocar una respuesta inmunitaria más rápida o mayor que la que se obtendría con el antígeno solo. Además, los adyuvantes pueden utilizarse para dirigir la respuesta inmunitaria a vías inmunológicas específicas y para servir como vehículo de entrega del antígeno.

Los liposomas y las formulaciones liposomales son ejemplos de adyuvantes. Típicamente, los liposomas pueden estar cargados con el antígeno o los antígenos y/o otros compuestos inmunomoduladores, o los propios liposomas pueden servir como adyuvantes independientes. Los antígenos y/u otros compuestos inmunomoduladores pueden estar encapsulados en el interior del liposoma, y/o pueden estar unidos al liposoma o incorporados a la bicapa lipídica.

Los factores que influyen en la idoneidad de un determinado liposoma como vehículo de administración en una determinada presentación del sistema siguen sin estar claros. Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de vehículos de entrega que proporcionen una eficacia mejorada. Tal entrega mejorada es particular para la administración de moléculas que estimulan y/o provocan una respuesta inmune, por ejemplo, antígenos e inmunomoduladores. La patente australiana No. AU 750379 B2 divulga una composición farmacéutica que comprende un agente inmunógeno derivado de Helicobacter y al menos un compuesto capaz de promover la inducción de una respuesta inmunitaria de tipo T helper 1 (Thl) contra Helicobacter, seleccionado entre (i) saponinas purificadas a partir de un extracto de Quillaja saponaria; (ii) lípidos catiónicos o una sal de estos últimos; a condición de que estos lípidos no se proporcionen en forma de liposomas cuando dicha composición no contenga ninguna saponina o glicolipéptido de fórmula (I); y (iii) glicolipéptidos de fórmula (I).

Sumario de la invención

La presente invención está dirigida a adyuvantes para mejorar el rendimiento de una vacuna.

Cualquier referencia en la descripción a procedimientos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia. La invención proporciona un liposoma esencialmente libre de saponina que comprende una membrana bicapa lipídica externa y un compartimento interno, la membrana externa que comprende: a) un compuesto de amonio cuaternario formado por cuatro cadenas alquílicas, dos de las cuales son alquilos C10-C20 y las dos restantes son alquilos C1-C4; b) un esterol seleccionado del grupo que consiste en psitosterol, estigmasterol, ergosterol, ergocalciferol y colesterol; c) un fosfolípido; y d) un glicolípido de Fórmula I:

en la que R1 es hidrógeno o un radical alquilo saturado que tiene hasta 20 átomos de carbono; X es -CH²-, -O- o -NH-; R2 es hidrógeno o un radical alquilo saturado o insaturado que tiene hasta 20 átomos de carbono; R3, R4 y R5 son independientemente hidrógeno, -SO⁴²-, -PO⁴²-, -COC^1-10 alquilo; R6 es L-alanilo, L-alfa-aminobutilo, L-arginilo, L-asparginilo, L-aspartilo, L-cisteinilo, L-glutamilo, L-glicilo, L-histidilo, L-hidroxiprolilo, L-isoleucilo, L-leucilo, L-lisilo, L-metionilo, L-ornitlinilo, L-fenialilo, L-prolilo, L-serilo, L-treonilo, L-tirosilo, L-triptófano y L-valilo o sus isómeros D. En ciertas realizaciones, el compuesto de amonio cuaternario es DDA, el esterol es colesterol, el fosfolípido es lecitina, y el glicolípido es N-(2-deoxi-2-L-leucilamino-p-D-glucopiranosil)-N-octadecildodecanoilamida o un acetato del mismo.

El liposoma está esencialmente libre de saponina.

En ciertas realizaciones, el liposoma comprende además un oligonucleótido inmunoestimulador seleccionado del grupo que consiste en un ribonucleótido inmunoestimulador, un oligodesoxirribonucleótido CpG y una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el liposoma no contiene oligodesoxirribonucleótido CpG.

En algunas realizaciones, el oligonucleótido inmunoestimulador se incorpora dentro del compartimento interno del liposoma. En otras realizaciones, el oligonucleótido inmunoestimulador está asociado a la superficie exterior del liposoma.

En algunas realizaciones, dicho oligonucleótido inmunoestimulador comprende uno cualquiera de las SEQ ID NO. 1­ 14.

En ciertos aspectos, la invención proporciona una formulación adyuvante que comprende los liposomas como se describe en el presente documento.

En ciertas realizaciones, la formulación adyuvante está esencialmente libre de saponina. En ciertas realizaciones, la formulación adyuvante está esencialmente libre de oligodesoxirribonucleótido CpG.

En ciertos aspectos, la invención proporciona una composición de vacuna que comprende una cantidad eficaz de un componente antigénico y una formulación adyuvante como se describe en el presente documento.

En ciertas realizaciones, la composición de la vacuna está esencialmente libre de saponina.

En ciertas realizaciones, la composición de vacuna está esencialmente libre de CpG. En ciertas realizaciones, el componente antigénico de la composición de vacuna esencialmente libre de CpG contiene un virus (-)ssRNA.

En ciertas realizaciones, el virus (-)ssRNA es un virus de la gripe. En algunas realizaciones, el virus de la gripe es un virus de la gripe porcina.

En ciertas realizaciones, el componente antigénico se incorpora dentro del compartimento interno del liposoma. El componente antigénico, en realizaciones seleccionadas adecuadas para el ganado, puede incluir virus inactivados de BVDV-1 y/o BVDV-2 (y BHV-1). En otras realizaciones, particularmente adecuadas para animales de corral, el componente antigénico incluye profilina.

Descripción detallada

Definiciones:

Los términos "alrededor de" o "aproximadamente", cuando se utilizan en relación con una variable numérica medible, se refieren al valor indicado de la variable y a todos los valores de la variable que están dentro del error experimental del valor indicado (por ejemplo, dentro del intervalo de confianza del 95% para la media) o dentro del 10% del valor indicado, lo que sea mayor, a menos que "aproximadamente" se utilice en referencia a intervalos de tiempo en semanas, donde "aproximadamente 3 semanas" es de 17 a 25 días, y aproximadamente 2 a aproximadamente 4 semanas es de 10 a 40 días.

El término "fiebre acompañante" se refiere al aumento de la temperatura del animal vacunado dentro del día siguiente a la vacunación. En el caso de los bovinos, el término se refiere a la temperatura rectal superior a 103,5 °F. El término "antígeno" en combinación con la especie se refiere a los patógenos que causan enfermedades infecciosas en dicha especie, o a los componentes de estos patógenos. Así, por ejemplo, los "antígenos bovinos" se refieren a los patógenos capaces de causar enfermedades infecciosas en los bovinos o a los componentes de estos patógenos.

El término "que consiste esencialmente en" y similares, aplicado a los liposomas y a las formulaciones adyuvantes de la presente invención, se refiere a las composiciones que no contienen agentes adyuvantes o inmunomoduladores adicionales en las cantidades en las que dicho agente ejerce efectos adyuvantes o inmunomoduladores mensurables.

Los términos "esencialmente libre de saponina", "sustancialmente libre de saponina" y similares se refieren a una composición que no contiene saponina en las cantidades en las que la saponina ejerce efectos adyuvantes o inmunomoduladores mensurables. En determinadas realizaciones, las composiciones esencialmente libres de saponina contienen saponina en una cantidad insuficiente para provocar una respuesta inmunitaria sistémica, como la fiebre. En ciertas realizaciones, las composiciones esencialmente libres de saponina no contienen saponina o contienen saponina en o por debajo del límite de detección.

Del mismo modo, los términos "esencialmente libre de desoxirribonucleótido CpG", "sustancialmente libre de desoxirribonucleótido CpG" y similares se refieren a una composición que no contiene desoxirribonucleótido CpG en las cantidades en las que el desoxirribonucleótido CpG ejerce efectos adyuvantes o inmunomoduladores mensurables. En ciertas realizaciones, las composiciones esencialmente libres de desoxirribonucleótido CpG no contienen desoxirribonucleótido CpG o contienen desoxirribonucleótido CpG en el límite de detección o por debajo de él. Los términos "esencialmente libre de desoxirribonucleótido CpG", "sustancialmente libre de desoxirribonucleótido CpG" y similares excluyen específicamente las vacunas en las que el desoxirribonucleótido CpG está presente de forma natural en el antígeno.

El término "molécula inmunoestimuladora" se refiere a una molécula que potencia una respuesta inmunitaria.

El término "liposoma" se refiere a una partícula esférica microscópica formada por una bicapa lipídica que encierra un compartimento acuoso.

El término "administración parenteral" se refiere a la introducción de una sustancia, tal como una vacuna, en el cuerpo de un sujeto a través o por medio de una vía que no incluye el tracto digestivo. La administración parenteral incluye la administración subcutánea, intramuscular, transcutánea, intradérmica, intraperitoneal, intraocular e intravenosa.

Los términos "cantidad terapéuticamente eficaz" y "cantidad eficaz" se refieren a una cantidad de un antígeno o vacuna que induciría una respuesta inmunitaria en un sujeto que recibe el antígeno o la vacuna que es adecuada para prevenir o reducir los signos o síntomas de la enfermedad, incluidos los efectos adversos para la salud o las complicaciones de la misma, causados por la infección con un patógeno, tal como un virus o una bacteria. Se puede inducir la inmunidad humoral o la inmunidad mediada por células o ambas. La inmunogenicidad y la eficacia de una vacuna en un animal pueden evaluarse, por ejemplo, indirectamente mediante la medición de los títulos de anticuerpos, ensayos de proliferación de linfocitos, ensayos ELISPOT de IFN gamma, ensayos de células T citotóxicas o directamente mediante el seguimiento de los signos y síntomas tras la exposición con la cepa de tipo salvaje. La inmunidad protectora conferida por una vacuna puede evaluarse midiendo, por ejemplo, la reducción de los signos clínicos como la mortalidad, la morbilidad, la fiebre, la viremia, el impacto en la patología clínica, el estado físico general y la salud y el rendimiento generales del sujeto. La cantidad de una vacuna que es terapéuticamente eficaz puede variar dependiendo del adyuvante particular utilizado, el antígeno particular utilizado o la condición del sujeto, y puede ser determinada por un experto en la técnica.

La invención proporciona, en parte, liposomas que contienen un compartimento interno y una membrana externa. Los liposomas pueden tener un tamaño medio de partícula entre 50 y 500 nm. En ciertas realizaciones no limitantes, el tamaño medio de las partículas de los liposomas es de 100-500 nm, o 150-450 nm, o 150-250 nm, o 300-400 nm, o 250-300 nm. En ciertas realizaciones, la membrana comprende un compuesto de amina cuaternaria, un fosfolípido, un esterol y un glicolípido. En ciertas realizaciones, el liposoma está esencialmente libre de saponina. En ciertas realizaciones, la membrana externa consiste esencialmente en o consiste en el compuesto de amina cuaternaria, el fosfolípido, el esterol y el glicolípido. En otras realizaciones, el compartimento externo del liposoma no contiene ningún oligonucleótido inmunoestimulador y/o otros compuestos inmunomoduladores. Así, en tales realizaciones, el liposoma consiste esencialmente en, o consiste en el compartimiento interno que consiste esencialmente en, o consiste en un vehículo acuoso inmunológicamente inerte, dicho compartimiento interno rodeado por la membrana externa que consiste esencialmente en, o consiste en el compuesto de amina cuaternaria, el fosfolípido, el esterol, y el glicolípido.

Los compuestos de amina cuaternaria son compuestos a base de amonio con cuatro grupos hidrocarburos. Los compuestos de amina cuaternaria están formados por cuatro cadenas de alquilo, dos de las cuales son alquilos C10-C20 y las dos restantes son alquilos C1-C4. En ciertas realizaciones, la amina cuaternaria es bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDA), cloruro u otro contraión aceptable para uso farmacéutico.

Los esteroles comparten un núcleo químico común, que es una estructura de anillo esteroide, con un grupo hidroxilo (OH), en general unido al carbono-3. La cadena de hidrocarburos del sustituyente ácido graso varía en longitud, normalmente de 16 a 20 átomos de carbono, y puede ser saturada o insaturada. Los esteroles suelen contener uno o más dobles enlaces en la estructura del anillo y también una variedad de sustituyentes unidos a los anillos. Los esteroles y sus ésteres de ácidos grasos son esencialmente insolubles en agua. En vista de estas similitudes químicas, es probable que los esteroles que comparten este núcleo químico tengan propiedades similares cuando se utilizan en las composiciones de vacunas de la presente invención. Los esteroles son bien conocidos en la técnica y pueden adquirirse comercialmente. Por ejemplo, el colesterol se divulga en el Índice Merck, 12a edición, página 369. Los esteróles adecuados incluyen, sin limitaciones, p-sitosterol, estigmasterol, ergosterol, ergocalciferol y colesterol.

Los glicolípidos adecuados son en general aquellos que activan la respuesta Th2. Los glicolípidos incluyen, sin limitaciones, aquellos comprendidos por la Fórmula I y que se describen en general en la Publicación de Patente Estadounidense 20070196384 (Ramasamy et al.).

En la estructura de la Fórmula I, R1 es hidrógeno, o un radical alquilo saturado que tiene hasta 20 átomos de carbono; X es -CH²-, -O- o -NH-; R2 es hidrógeno, o un radical alquilo saturado o insaturado que tiene hasta 20 átomos de carbono; R3, R4 y R5 son independientemente hidrógeno, -SO⁴²-, -PO⁴²-, -COC^1-10 alquilo; R6 es L-alanilo, L-alfa-aminobutilo, L-arginilo, L-asparginilo, L-aspartilo, L-cisteinilo, L-glutamilo, L-glicilo, L-histidilo, L-hidroxiprolilo, L-isoleucilo, L-leucilo, L-lisilo, L-metionilo, L-ornitinilo, L-fenialilo, L-prolilo, L-serilo, L-treonilo, L-tirosilo, L-triptófano y L-valilo o sus isómeros D.

Ejemplos de un glicolípido son, sin limitación, N-(2-deoxi-2-L-leucilamino-p-D-glucopiranosil)-N-octadecildodecanoilamida (BayR®1005, o R1005) o una sal (por ejemplo, un acetato) del mismo.

La lecitina puede obtenerse como una mezcla de fosfátidos y triglicéridos mediante el lavado con agua de los aceites vegetales crudos, y la separación y secado de las gomas hidratadas resultantes. Se puede obtener un producto refinado fraccionando la mezcla para los fosfolípidos y glicolípidos insolubles en acetona que quedan después de eliminar los triglicéridos y el aceite vegetal por lavado con acetona. Alternativamente, la lecitina puede obtenerse de diversas fuentes comerciales.

Otros fosfolípidos adecuados incluyen fosfatidilcolina, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol, fosfatidilserina, acilfosfatidiletanolamina, difosfatidiglcerol, lisofosfatidiletanolamina, lisofosfatidilcolina, ácido fosfatídico, cardiolipina y fosfatidiletanolamina. Los fosfolípidos pueden ser aislados de fuentes naturales o sintetizados convencionalmente. Los liposomas, como se describen en el presente documento, permiten proporciones flexibles de los elementos de la membrana externa. En ciertas realizaciones, las proporciones en peso del compuesto de amonio cuaternario: el esterol: el fosfolípido: el glicolípido son 1: 0,75-1,25: 1,5-2,5: 1,5-2,5, respectivamente. En ciertas realizaciones, las proporciones en peso del compuesto de amonio cuaternario: el esterol: el fosfolípido: el glicolípido son 1: 1: 2: 2. En otras realizaciones, el peso total del compuesto de amonio cuaternario y el esterol es aproximadamente la mitad (por ejemplo 40%, 45%, 50%, 55%, 60%) del peso total del glicolípido y del fosfolípido, siempre que el compuesto de amonio cuaternario comprenda al menos un 5% p/p del peso total de estos cuatro compuestos (el compuesto de amonio cuaternario, el esterol, el fosfolípido y el glicolípido), y el glicolípido sea al menos un 20% p/p del peso total de estos cuatro compuestos.

En ciertas realizaciones, el peso total del compuesto de amonio cuaternario y el esterol es de aproximadamente 10-40% (por ejemplo, aproximadamente 10%, aproximadamente 15%, aproximadamente 20%, aproximadamente 25%, aproximadamente 30%, aproximadamente 33,3%, aproximadamente 35%, aproximadamente 40%) del peso total del glicolípido y del fosfolípido, siempre que el compuesto de amonio cuaternario comprenda al menos aproximadamente 5% p/p del peso total de estos cuatro compuestos (el compuesto de amonio cuaternario, el esterol, el fosfolípido y el glicolípido), y el glicolípido sea al menos alrededor del 20% p/p del peso total de estos cuatro compuestos.

En ciertas realizaciones, una cantidad inmunológicamente eficaz de los liposomas de la presente invención puede administrarse como adyuvante. En algunas realizaciones, la invención proporciona una combinación de vacunas que comprende la cantidad inmunológicamente eficaz de la composición adyuvante, y el componente antigénico, como se describe más adelante.

El peso de la especie cliente dicta en última instancia la dosis de la composición adyuvante de la presente invención. En ciertas realizaciones, adecuadas para el ganado vacuno, los caballos y los cerdos adultos, una dosis contiene el equivalente de 1000-3000 |jg de componente de membrana externa (es decir, el peso total del compuesto de amonio cuaternario, el esterol, el fosfolípido y el glicolípido), o el equivalente de 1000-2000 jg, o el equivalente de 1000-1500 jg, o el equivalente de 1300-1800 jg, o el equivalente de 1500-2000 jg.

El peso de la composición liposomal puede no ser igual al peso del componente de membrana debido a la presencia del compartimento interno que puede contener el oligonucleótido inmunoestimulador, el componente antigénico, otros inmunomoduladores, etc. El uso de equivalentes al componente de membrana liposomal permite la dosificación uniforme. El régimen de dosificación recitado en el mismo asegura que el animal bovino reciba al menos 200 |jg del glicolípido y aproximadamente 50 |jg del compuesto de amonio cuaternario.

En ciertas realizaciones adecuadas para ovejas y cabras, una dosis contiene el equivalente de 300-1000 jg de componente de membrana externa, por ejemplo, el equivalente de 300-500 jg, o el equivalente de 400-500 jg , o el equivalente de 400-1000 jg, o el equivalente de 500-1000 jg, o el equivalente de 600-1000 jg, o el equivalente de 600-800 jg.

En ciertas realizaciones adecuadas para lechones, perros y gatos, una dosis contiene el equivalente de 100-400 jg de componente de membrana externa, o el equivalente de 100-200 jg, o el equivalente de 100-150 jg, o el equivalente de 130-180 jg, o el equivalente de 150-200 jg.

En ciertas realizaciones adecuadas para aves de corral, una dosis contiene el equivalente de 50-200 jg de componente de membrana externa, o el equivalente de 50-100 jg, o el equivalente de 50-75 jg, o el equivalente de 65-90 jg, o el equivalente de 75-100 jg, o el equivalente de 75-150 jg.

El compuesto interno del liposoma puede contener antígenos u otras moléculas inmunomoduladoras. En ciertas realizaciones, dichas moléculas inmunomoduladoras adecuadas para el compartimento interno incluyen, sin limitación, extractos de antígenos, subunidades, sintéticos, células enteras o virus.

En ciertas realizaciones, los productos farmacéuticos activos pueden ser envasados dentro de un liposoma.

Los inmunomoduladores que podrían ser envasados también incluyen, sin limitaciones, rmLT, MPLA, Alfa-Gal-Cer. Toxina del cólera, LPS, ácidos lipoteicoicos, poli I:C, flagelina, zymosan, quitina y formas de quitina modificadas, beta-glucanos, avridina, inulina y formas de inulina modificadas, anhídrido etilénico málico, plurónicos como L121 y L141, agonista CD40, agonista TLR5 así como cualquier agonista TLR, GM-CSF.

En ciertas realizaciones, los liposomas pueden llevar varias moléculas que podrían utilizarse como marcadores, incluyendo sin limitaciones, OspA, OspC, pertactina y otras.

En ciertas realizaciones, la composición adyuvante de la presente invención comprende además oligonucleótidos inmunoestimulantes, tales como, por ejemplo, oligodeoxirribonucleótidos CpG u oligorribonucleótidos inmunoestimulantes (ORNs), o quimeras de los mismos. Ejemplos adecuados no limitantes de oligodeoxirribonucleótidos CpG se ilustran en las SEQ ID NO: 1-10, ejemplos adecuados no limitantes de ORNs se proporcionan en las SEQ ID NOs 11-13, y un ejemplo adecuado no limitante de un oligonucleótido inmunoestimulador quimérico se proporciona en la SEQ ID NO: 14.

Estos oligonucleótidos inmunoestimuladores están, en algunas realizaciones, presentes en el compartimento interno del liposoma.

En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos inmunomoduladores se asocian con la superficie exterior del liposoma. La asociación puede deberse a enlaces de hidrógeno, enlaces electrostáticos, enlaces lipofílicos, fuerzas de Van der Waals y similares.

En ciertas realizaciones, el oligonucleótido inmunoestimulador cargado negativamente se asocia con la superficie exterior del liposoma debido a la interacción con el átomo de nitrógeno cuaternario cargado positivamente en el compuesto de amonio cuaternario.

Los oligodeoxirribonucleótidos CpG (también denominados desoxirribonucleótidos CpG o CpG ODN) son una clase de agentes farmacoterapéuticos descritos recientemente que se caracterizan por la presencia de un dinucleótido CG no metilado en contextos de secuencia de bases específicos (motivo CpG). (Hansel TT, Barnes PJ (eds): New Drugs for Asthma, Allergy and COPD. Prog Respir Res. Basel, Karger, 2001, vol 31, páginas 229-232, que se incorpora aquí por referencia). Estos motivos CpG no se observan en el ADN eucariota, en el que los dinucleótidos CG están suprimidos y, cuando están presentes, suelen estar metilados, pero están presentes en el ADN bacteriano al que confieren propiedades inmunoestimulantes.

En ciertas realizaciones, los adyuvantes de la presente invención utilizan un llamado oligonucleótido inmunoestimulador de clase P, más preferentemente, oligonucleótidos inmunoestimuladores de clase P modificados, incluso más preferentemente, oligonucleótidos de clase P modificados. Los oligonucleótidos inmunoestimuladores de clase P son oligodeoxirribonucleótidos CpG caracterizados por la presencia de palíndromos, en general de 6 a 20 nucleótidos de longitud. Los oligonucleótidos de la Clase P tienen la capacidad de autoensamblarse espontáneamente en concatámeros in vitro y/o in vivo. Estos oligonucleótidos son, en sentido estricto, monocatenarios, pero la presencia de palíndromos permite la formación de concámeros o posiblemente de estructuras de tallo y bucle. La longitud total de los oligonucleótidos inmunoestimuladores de clase P oscila entre 19 y 100 nucleótidos, por ejemplo, 19-30 nucleótidos, 30-40 nucleótidos, 40-50 nucleótidos, 50-60 nucleótidos, 60-70 nucleótidos, 70-80 nucleótidos, 80-90 nucleótidos, 90-100 nucleótidos.

En un aspecto de la invención, el oligonucleótido inmunoestimulador contiene un dominio de activación TLR 5' y al menos dos regiones palindrómicas, siendo una región palindrómica 5' de al menos 6 nucleótidos de longitud y conectada a una región palindrómica 3' de al menos 8 nucleótidos de longitud, ya sea directamente o a través de un espaciador.

Los oligonucleótidos inmunoestimuladores de clase P pueden modificarse según técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, la modificación J se refiere a los nucleótidos modificados con yodo. La modificación E se refiere a los nucleótidos modificados con etilo. Así, los oligonucleótidos inmunoestimulantes de clase P modificados con E son oligonucleótidos inmunoestimulantes de clase P, en los que al menos un nucleótido (preferentemente el 5') está etilado. Las modificaciones adicionales incluyen la unión de 6-nitro-benzimldazol, la O-metilación, la modificación con proynil-dU, la modificación de inosina, la unión de 2-bromovinilo (preferentemente a la uridina).

Los oligonucleótidos inmunoestimuladores de clase P también pueden contener un enlace internucleotídico modificado, incluyendo, sin limitaciones, enlaces fosfodiéster y enlaces fosforotioato. Los oligonucleótidos de la presente invención pueden ser sintetizados u obtenidos de fuentes comerciales.

Los oligonucleótidos de clase P y los oligonucleótidos de clase P modificados se divulgan además en la solicitud PCT publicada no. WO2008/068638, publicada el 12 de junio de 2008. A continuación se proporcionan ejemplos adecuados, no limitantes, de oligonucleótidos inmunoestimuladores de clase P modificados (en las SEQ ID NO: 1­ 10, "*" se refiere a un enlace fosforotioato y "_" a un enlace fosfodiéster). En las SEQ ID NO: 11-14, todos los enlaces son fosfodiéster o fosforotioato.

SEQ ID NO: 15' T*C_G*T*C_G*A*C_G*A*T*C_G*C*G*C*G*C*C*C*C*G 3'

SEQ ID NO: 25' T*C_G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*C*G*C*G*C*C*C*C*C*G 3'

SEQ ID NO: 35' ^t *C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*C*C*C*G*T 3'

SEQ ID NO: 45' JU*C_G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*C*C*C*C*G 3'

SEQ ID NO: 55' JU*C_G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*C*C*C*C*G*T 3'

SEQ ID NO: 65' JU*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*C*C*C*G*T 3'

SEQ ID NO: 75' EU*C_G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*C*G*C*G*C*C*C*C*C*G 3'

SEQ ID NO: 85' JU*C_G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*T 3'

SEQ ID NO: 95' JU*C*G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*T 3'

SEQ ID NO: 105' T*C_G*T*C_G'A*C_G*A*T*C_G*C*G*C*G*C*C*C*C*G 3'

SEQ ID NO: 115'-UUGUUGUUGUUGUU-3'

SEQ ID NO: 125'-UUAUUAUUAUUAU-3'

SEQ ID NO: 135'-AAACGCUCAGCCAAAGCAG-3'

SEQ ID NO: 145'-dTdCdGdTdCdGdTdTdTrGrUrUrGrGrGrUdTdTdT-3'

La dosis del oligonucleótido inmunoestimulador para su uso en las composiciones adyuvantes depende, en última instancia, de la especie prevista.

Por ejemplo, en ciertas realizaciones adecuadas para el ganado vacuno, las ovejas o los cerdos adultos, una dosis de la composición adyuvante de la presente invención comprendería entre aproximadamente 50 y 400 |jg (por ejemplo, 50-300, o 100-250 jg, o aproximadamente 50 a aproximadamente 100 jg para los cerdos adultos y aproximadamente 100 a aproximadamente 250 jg para el ganado vacuno) del oligonucleótido inmunoestimulador. En ciertas realizaciones adecuadas para animales de compañía o lechones, una dosis de la composición adyuvante de la presente invención comprendería entre aproximadamente 5 y 100 jg (por ejemplo, 10-80 jg, o 20-50 jg ) del oligonucleótido inmunoestimulador.

En ciertas realizaciones adecuadas para las aves de corral, una dosis de la composición adyuvante de la presente invención estaría entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 5 jg (por ejemplo, 0,5-3 jg, o 0,9-1,1 jg ) de oligonucleótido inmunoestimulador.

Los procedimientos de fabricación de liposomas son bien conocidos en la técnica. Brevemente, los componentes del liposoma se disuelven y se mezclan en un disolvente orgánico, por ejemplo, cloruro de metileno, y luego se elimina el disolvente por secado para obtener una película. La película se rehidrata posteriormente utilizando un medio acuoso (por ejemplo, agua o un tampón) que opcionalmente contiene compuestos que se van a incorporar dentro del compartimento interno de los liposomas. En diferentes realizaciones, los compuestos pueden incluir los oligonucleótidos inmunoestimuladores, otros inmunomoduladores y/o el componente antigénico.

La etapa de rehidratación es seguida por sonicación y/o extrusión para reducir el tamaño de las vesículas formadas durante la etapa de rehidratación.

Existen dos técnicas principales de sonicación: la sonicación con sonda/punta y la sonicación en baño. La sonicación con sonda/ punta tiene un elevado aporte de energía que provoca una importante generación de calor, por lo que es necesario utilizar un baño de hielo para mantener la temperatura de la dispersión liposomal con el fin de evitar la degradación de los lípidos. Alternativamente, la energía ultrasónica puede ser impartida indirectamente a la suspensión de liposomas utilizando un sonicador de baño, donde la temperatura es más fácil de controlar pero la pérdida de energía es comparativamente alta. La sonicación en general produce vesículas pequeñas (~10 nm) que se fusionan espontáneamente con el tiempo para aliviar la tensión de la alta curvatura de la membrana.

El procedimiento de extrusión consiste en hacer pasar la suspensión de liposomas a través de una membrana con un tamaño de poro definido. Este procedimiento es ventajoso porque el tamaño de poro definido favorece la homogeneidad del tamaño de las partículas dentro de la población de liposomas, aunque la extrusión por debajo de la temperatura de transición lipídica puede ser difícil debido a la rigidez de la membrana. Las suspensiones de liposomas suelen extruirse varias veces para conseguir una baja polidispersidad en el producto final.

Puede ser deseable preparar una preparación de liposomas estable al almacenamiento. En ciertas realizaciones, dicha preparación de liposomas estable al almacenamiento se crea mediante liofilización. Brevemente, la película seca descrita anteriormente, se rehidrata en un tampón acuoso que contiene un crioprotector y un lioprotector como sacarosa, trehalosa, o una combinación de los mismos. En otras realizaciones, el crioprotector y el lioprotector se añaden después de la etapa de rehidratación. La preparación rehidratada se liofiliza entonces utilizando técnicas bien conocidas en la técnica. La preparación liofilizada resultante es estable al almacenamiento. En el momento deseado, puede rehidratarse con un tampón adecuado.

Se pueden añadir inmunomoduladores adicionales, incluyendo, sin limitaciones, los oligonucleótidos inmunoestimuladores y el/los antígeno/s antes de la liofilización o en el momento de la preparación final.

En ciertas realizaciones, los antígenos se mezclan con la formulación liposomal después de que se reconstituyan los liposomas de la presente invención. En otras realizaciones, los liposomas, los inmunomoduladores adicionales y el componente antigénico se preparan y se secan juntos.

En ciertas realizaciones, compuestos inmunoestimulantes adicionales están presentes en las composiciones de la presente invención. Dichos compuestos inmunoestimulantes adicionales pueden estar presentes dentro del compartimento interno de los liposomas, y/o asociados con la superficie exterior de los liposomas, y/o independientemente de los liposomas, en las composiciones adyuvantes de la presente invención.

Ejemplos adecuados, no limitantes, de tales compuestos inmunoestimulantes adicionales incluyen, pero no se limitan a varias clases de adyuvantes tal como sales minerales, por ejemplo, alumbre, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y fosfato de calcio; agentes tensioactivos y micropartículas, por ejemplo, tensioactivos de polímeros en bloque no iónicos, virosomas, saponinas (por ejemplo, Quil A, QS-21 y GPI-0100), proteosomas, complejos inmunoestimulantes, cocleatos, piridina, vitamina A, vitamina E; productos bacterianos tal como el sistema adyuvante RIBI (Ribi Inc.), esqueleto celular de Mycobacterium phlei (Detox®), muramil dipéptidos (MDP) y tripéptidos (MTP), lípido monofosforilico A (MPLA), Bacillus Calmete-Guerin (BCG), enterotoxinas termolábiles de E. coli, toxina del cólera, dimicolato de trehalosa, citoquinas y hormonas, por ejemplo, interleucinas (IL-2, IL-2, IL-6, IL-12, IL-15, IL-18), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos, dehidroepiandrosterona, 1,25-dihidroxivitamina D3; polianiones, por ejemplo, dextrano; poliacrilatos (por ejemplo polimetilmetacrilato, CARBOPOL®934P); vehículos, por ejemplo, toxoide tetánico, toxoide diftérico, subunidad B de la toxina del cólera, enterotoxina mutante termolábil de E. coli enterotoxigénica (rmLT), proteínas de choque térmico; emulsiones de aceite en agua, por ejemplo, AMPHIGEN® (Hydronics, EE.UU.); vehículos policatiónicos (por ejemplo, DEAE Dextran o QAE Dextran), y emulsiones de agua en aceite como, por ejemplo, adyuvantes completos e incompletos de Freund.

Otros inmunomoduladores adecuados son el Alfa-Gal-Cer. LPS, ácidos lipoteicoicos, poli I:C, flagelina, zimosán, quitina y formas de quitina modificadas, beta-glucanos, avridina, inulina y formas de inulina modificadas, anhídrido etilénico-málico, plurónicos como L121 y L141, agonista CD40, agonista TLR5 así como cualquier agonista TLR. Antígenos y enfermedades

En ciertas realizaciones, la composición adyuvante liposomal de la presente invención puede combinarse con un componente antigénico formando así la composición de vacuna de la presente invención. El componente antigénico de las vacunas de la presente invención puede estar presente dentro del compartimento interno de los liposomas, y/o asociado con la superficie exterior de los liposomas, y/o independientemente de los liposomas.

En ciertas realizaciones, la composición de la vacuna está sustancialmente libre de saponina. En otras realizaciones, la composición de la vacuna está esencialmente libre de desoxirribonucleótidos CpG.

Las realizaciones en las que la composición de la vacuna está esencialmente libre de desoxirribonucleótidos CpG se prefieren si el antígeno de la vacuna contiene secuencias de virus de ssRNA completo (ya sea un virus (+)ssRNA o un virus(-)ssRNA) que son inmunoestimulantes aunque se dirigen a TLR7/8. Dichas secuencias estimuladoras de TLR 7/8 incluyen secuencias de ssRNA ricas en poliU o GU. Hell F, Hemmi H. y otros, 2004. Science 303(5663):1526-9. Diebold SS, Kaisho T. et al., 2004. Science 303(5663):1529-31.

Los virus que contienen tales secuencias incluyen, sin limitaciones, diferentes virus de la gripe (por ejemplo, el virus de la gripe bovina, el virus de la gripe canina, el virus de la gripe equina, el virus de la gripe porcina y similares). En realizaciones particularmente preferentes, el componente antigénico de la vacuna esencialmente libre de CpG ODN contiene virus de la gripe.

Un componente antigénico puede incluir, en diferentes realizaciones ejemplares, antígenos bovinos, antígenos caprinos, antígenos porcinos, antígenos de aves de corral, antígenos equinos, antígenos caninos, antígenos equinos y antígenos felinos.

Los antígenos pueden ser cualquiera de una amplia variedad de sustancias capaces de producir una respuesta inmunitaria deseada en un sujeto, incluyendo, sin limitaciones, uno o más de los virus (inactivados, atenuados y vivos modificados), bacterias, parásitos, nucleótidos (incluyendo, sin limitación, antígenos a base de ácidos nucleicos, por ejemplo vacunas de ADN o de ARNm), polinucleótidos, péptidos, polipéptidos, proteínas recombinantes, péptidos sintéticos, extractos de proteínas, células (incluidas las células tumorales), tejidos, polisacáridos, hidratos de carbono, ácidos grasos, ácido lipotequioc, peptidoglicanos, lípidos o glicolípidos, individualmente o en cualquier combinación de los mismos.

Los antígenos utilizados con los adyuvantes de la invención también incluyen fragmentos inmunogénicos de nucleótidos, polinucleótidos, péptidos, polipéptidos, que pueden ser aislados de los organismos mencionados en el presente documento, o fabricados química o biológicamente.

Las cepas virales vivas, vivas modificadas y atenuadas que no causan la enfermedad en un sujeto se han aislado en forma no virulenta o se han atenuado mediante procedimientos bien conocidos en la técnica, incluida la etapa en serie en una línea celular adecuada o la exposición a la luz ultravioleta o a un mutágeno químico. Las cepas virales inactivadas o muertas son aquellas que han sido inactivadas por procedimientos conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo el tratamiento con formalina, beta-propilactona (BPL), peróxidos, etilenimina binaria (BEI), radiación esterilizante, calor u otros procedimientos similares.

Se pueden combinar dos o más antígenos para producir una composición polivalente que pueda proteger a un sujeto contra una amplia variedad de enfermedades causadas por los patógenos. Actualmente, los fabricantes comerciales de vacunas, así como los usuarios finales, prefieren los productos de vacunas polivalentes. Mientras que los adyuvantes convencionales suelen estar limitados en cuanto a la variedad de antígenos con los que pueden utilizarse eficazmente (de forma monovalente o polivalente), los adyuvantes descritos en el presente documento pueden utilizarse eficazmente con una amplia gama de antígenos, tanto de forma monovalente como polivalente. Así, los antígenos descritos en el presente documento pueden combinarse en una única composición que comprenda los adyuvantes descritos en el presente documento.

] Los ejemplos de bacterias que pueden utilizarse como antígenos con las composiciones adyuvantes descritas en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, Acinetobacter calcoaceticus, Acetobacter paseruianus, Actinobacillus pleuropneumoniae, Aeromonas hydrophila, Alicyclobacillus acidocaldarius, Arhaeglobus fulgidus, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophillus, Bacillus subtilis, Bacillus thermocatenulatus, Bordetella bronchiseptica, Burkholderia cepacia, Burkholderia glumae, Campylobacter coli, Campylobacter fetus, Campylobacter jejuni, Campylobacter hyointestinalis, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila spp., Chromobacterium viscosum, Erysipelothrix rhusiopathieae, Listeria monocytogenes, Ehrlichia canis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Haemophilus somnus, Helicobacter suis, Lawsonia intracellularis, Legionella pneumophilia, Moraxellsa sp, Mycobactrium bovis, Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma mycoides subsp. mycoides LC, Clostridium perfringens, Odoribacter denticanis, Pasteurella (Mannheimia) haemolytica, Pasteurella multocida, Photorhabdus luminescens, Porphyromonas gulae, Porphyromonas gingivalis, Porphyromonas salivosa, Propionibacterium acnes, Proteus vulgaris, Pseudomonas wisconsinensis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens C9, Pseudomonas fluorescens SIKW1, Pseudomonas fragi, Pseudomonas luteola, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas sp B11-1, Alcaliges eutrophus, Psychrobacter immobilis, Rickettsia prowazekii, Rickettsia rickettsii, Salmonella enterica todos los serovares, incluyendo por ejemplo: Salmonella enterica Typhimurium, Salmonella enterica Bongori, Salmonella enterica Dublin,, Salmonella enterica Choleraesuis, y Salmonella enterica Newport, Serratia marcescens, Spirluina platensis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hyicus, Streptomyces albus, Streptomyces cinnamoneus, Streptococcus uberis, Streptococcus suis, Streptomyces exfoliates, Streptomyces scabies, Sulfolobus acidocaldarius, Syechocystis sp., Vibrio cholerae, Borrelia burgdorferi, Treponema denticola, Treponema minutum, Treponema phagedenis, Treponema refringens, Treponema vincentii, Treponema palladium, Trueperella pyogenes y especies de Leptospira, tal como los patógenos conocidos Leptospira canicola, Leptospira grippotyposa, Leptospira hardjo, Leptospira borgpetersenii hardjo-bovis, Leptospira borgpetersenii hardjoprajitno, Leptospira interrogans, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira pomona y Leptospira bratislava, y sus combinaciones.

En las composiciones adyuvantes pueden utilizarse tanto virus inactivados como virus vivos atenuados. Algunos ejemplos de virus que pueden utilizarse como antígenos incluyen, pero no se limitan a, herpesvirus aviar, herpesvirus bovino, herpesvirus canino, herpesvirus equino, virus de la rinotraqueitis viral felina, virus de la enfermedad de Marek, herpesvirus ovino, Herpesvirus porcino, Virus de la diarrea epidémica porcina (PEDv), Virus de la pseudorabia, Paramixovirus aviar, Virus respiratorio sincitial bovino, Virus del moquillo canino, Virus de la parainfluenza canina, Adenovirus canino, Parvovirus canino, Virus de la parainfluenza bovina 3, Virus de la parainfluenza ovina 3, Virus de la peste bovina, Virus de la enfermedad de las fronteras, Virus de la diarrea vírica bovina (VDB), Virus de la diarrea vírica bovina tipo I, Virus de la diarrea vírica bovina tipo II, Virus de la peste porcina clásica, Virus de la leucosis aviar, Virus de la inmunodeficiencia bovina, Virus de la leucemia bovina, Tuberculosis bovina, Virus de la anemia infecciosa equina, Virus de la inmunodeficiencia felina, Virus de la leucemia felina (FeLV), Virus de la enfermedad de Newcastle, Virus de la neumonía progresiva ovina, Virus del adenocarcinoma pulmonar ovino, Coronavirus canino (CCV), Coronavirus respiratorio canino, Coronavirus bovino, Calicivirus felino, coronavirus entérico felino, peritonitis infecciosa felina, virus de la diarrea epidémica porcina, virus de la encefalomielitis hemaglutinante porcina, parvovirus porcino, circovirus porcino (PCV) tipo I, PCV Tipo II, Virus del Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino (PRRS), Virus de la gastroenteritis transmisible, Coronavirus del pavo, Virus de la fiebre efímera bovina, Rabia, Rotovirus, Virus de la estomatitis vesicular, Lentivirus, influenza aviar, rinovirus, virus de la influenza equina, virus de la influenza porcina, virus de la influenza canina, virus de la influenza felina, virus de la influenza humana, virus de la encefalitis equina oriental (EEE), virus de la encefalitis equina venezolana, virus del Nilo Occidental, virus de la encefalitis equina occidental, virus de la inmunodeficiencia humana, virus del papiloma humano, virus de la varicela zoster, virus de la hepatitis B, rinovirus y virus del sarampión, y sus combinaciones.

Los ejemplos de antígenos peptídicos incluyen Bordetella bronchiseptica p68, GnRH, péptidos IgE, Fel dl, y antígenos de cáncer, y combinaciones de los mismos. Los ejemplos de otros antígenos incluyen nucleótidos, carbohidratos, lípidos, glicolípidos, péptidos, ácidos grasos, ácido lipoteico y teicoico, y peptidoglicanos, y combinaciones de los mismos.

Los ejemplos de parásitos que pueden utilizarse como antígenos con las composiciones adyuvantes descritas en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, Anaplasma, Fasciola hepatica (chiripa hepática), Coccidia, Eimeria spp, Neospora caninum, Toxoplasma gondii, Giardia, Dirofilaria (gusanos del corazón), Ancylostoma (gusanos del anzuelo), Cooperia, Haemonchus contortus (gusano de la barba), Ostertagia ostertagi (gusano del estómago), Dictyocaulus viviparous (gusanos del pulmón), Trypanosoma spp, Leishmania spp., Trichomonas spp., Cryptosporidium parvum, Babesia, Schistosoma, Taenia, Strongyloides, Ascaris, Trichinella, Sarcocystis, Hammondia, e Isopsora, y sus combinaciones. También se contemplan los parásitos externos que incluyen, pero no se limitan a, las garrapatas, incluidas las especies Ixodes, Rhipicephalus, Dermacentor, Amblyomma, Boophilus, Hyalomma y Haemaphysalis, y sus combinaciones.

La cantidad de antígeno utilizada para inducir una respuesta inmunitaria variará considerablemente según el antígeno utilizado, el sujeto y el nivel de respuesta deseado, y puede ser determinada por un experto en la técnica. Para las vacunas que contienen virus vivos modificados o virus atenuados, una cantidad terapéuticamente eficaz del antígeno suele oscilar entre aproximadamente 102 dosis infectivas de cultivo de tejidos (TCID)⁵⁰ y aproximadamente 1010 TCID⁵⁰, inclusive. Para muchos de estos virus, una dosis terapéuticamente eficaz está en general en el intervalo de aproximadamente 102 TCID⁵⁰ a aproximadamente 108 TCID⁵⁰, inclusive. En algunas realizaciones, los intervalos de las dosis terapéuticas efectivas son de aproximadamente 103 TCID⁵⁰ a aproximadamente 106 TCID⁵⁰, inclusive. En algunas otras realizaciones, los intervalos de las dosis terapéuticas efectivas son de aproximadamente 104 TCID⁵⁰ a aproximadamente 105 TCID⁵⁰, inclusive.

Para las vacunas que contienen virus inactivados, una cantidad terapéuticamente eficaz del antígeno es en general de al menos aproximadamente 100 unidades relativas por dosis, y a menudo en el intervalo de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 4.500 unidades relativas por dosis, inclusive. En otras realizaciones, la cantidad terapéuticamente eficaz del antígeno está en un intervalo de aproximadamente 250 a aproximadamente 4.000 unidades relativas por dosis, inclusive, de aproximadamente 500 a aproximadamente 3.000 unidades relativas por dosis, inclusive, de aproximadamente 750 a aproximadamente 2.000 unidades relativas por dosis, inclusive, o de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 1.500 unidades relativas por dosis, inclusive.

Una cantidad terapéuticamente eficaz de antígeno en las vacunas que contienen virus inactivados también puede medirse en términos de potencia relativa (RP) por ml. Una cantidad terapéuticamente eficaz está a menudo en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50 RP por ml, inclusive. En otras realizaciones, la cantidad terapéuticamente eficaz del antígeno está en un intervalo de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 30 RP por ml, inclusive, de aproximadamente 1 a aproximadamente 25 RP por ml, inclusive, de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 RP por ml, inclusive, de aproximadamente 3 a aproximadamente 15 RP por ml, inclusive, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 RP por ml, inclusive.

El número de células para un antígeno bacteriano administrado en una vacuna oscila de aproximadamente 1x106 a aproximadamente 5x1010 unidades formadoras de colonias (UFC) por dosis, inclusive. En otras realizaciones, el número de células oscila de aproximadamente 1x107 a 5x1010 UFC/dosis, inclusive, o de aproximadamente 1x108 a 5x1010 UFC/dosis, inclusive. En otras realizaciones, el número de células oscila de aproximadamente 1x102 a 5x1010 UFC/dosis, inclusive, o de aproximadamente 1x104 a 5x109 UFC/dosis, inclusive, o de aproximadamente 1x105 a 5x109 UFC/dosis, inclusive, o de aproximadamente 1x106 a 5x109 UFC/dosis, inclusive, o de aproximadamente 1x106 a 5x108 UFC/dosis, inclusive, o de aproximadamente 1x107 a 5x109 UFC/dosis, inclusive.

El número de células para un antígeno parasitario administrado en una vacuna oscila de aproximadamente 1x102 y aproximadamente 1x1010 por dosis, inclusive. En otras realizaciones, el número de células oscila de aproximadamente 1x103 a aproximadamente 1x109 por dosis, inclusive, o de aproximadamente 1x104 a aproximadamente 1x108 por dosis, inclusive, o de aproximadamente 1x105 a aproximadamente 1x107 por dosis, inclusive, o de aproximadamente 1x106 a aproximadamente 1x108 por dosis, inclusive.

Excipientes

Las composiciones de adyuvantes y/o vacunas pueden incluir un vehículo aceptable para uso farmacéutico. Tal como se utiliza aquí, "un vehículo aceptable para uso farmacéutico" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes estabilizadores, diluyentes, conservantes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos, agentes retardadores de la adsorción y similares. El vehículo o vehículos deben ser "aceptables" en el sentido de ser compatibles con los otros componentes de las composiciones y no ser perjudiciales para el sujeto. Por lo general, los vehículos serán estériles y libres de pirógenos, y se seleccionarán en función del modo de administración que se vaya a utilizar. Es bien sabido por los expertos en la técnica que las formulaciones preferentes para el vehículo aceptable para uso farmacéutico que comprende las composiciones son aquellos vehículos farmacéuticos aprobados en las regulaciones aplicables promulgadas por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (EE.UU.) o la Administración de Alimentos y Medicamentos de los EE.UU., o la agencia gubernamental equivalente en un país no estadounidense. Por lo tanto, el vehículo aceptable para uso farmacéutico para la producción comercial de las composiciones es un vehículo que ya está aprobado o será aprobado por la agencia gubernamental apropiada en los Ee .UU. o el país extranjero.

Administración de las Composiciones

Los tamaños de las dosis de las composiciones varían típicamente de aproximadamente 1 ml a aproximadamente 5 ml, inclusive, dependiendo del sujeto y del antígeno. Por ejemplo, para un canino o felino, se suele utilizar una dosis de aproximadamente 1 ml, mientras que en el ganado vacuno se suele utilizar una dosis de aproximadamente 2-5 ml. Sin embargo, estos adyuvantes también pueden formularse en microdosis, en las que pueden utilizarse dosis de aproximadamente 100 pl.

Las vías de administración de las composiciones adyuvantes incluyen la administración parenteral, oral, oronasal, intranasal, intratraqueal, subcutánea, intramuscular, transcutánea, intradérmica, intraperitoneal, intraocular, intravenosa y en óvulos. Se puede utilizar cualquier dispositivo adecuado para administrar las composiciones, incluyendo jeringas, goteros, dispositivos de inyección sin aguja, parches y similares. La vía y el dispositivo seleccionados para su uso dependerán de la composición del adyuvante, el antígeno y el sujeto, y son bien conocidos por el artesano experto.

Uso de las composiciones

Las formulaciones de adyuvantes aquí descritas son fáciles de fabricar y son estables durante al menos 18 meses a 4 °C. Las formulaciones pueden ser estables, por ejemplo, durante aproximadamente 18 meses, o aproximadamente 18 a aproximadamente 24 meses a 4 °C. En otra realización, las formulaciones son estables durante al menos aproximadamente 24 meses a 4 °C. Los procedimientos de pruebas aceleradas también indican que las formulaciones aquí descritas son estables durante al menos dos semanas a 37 °C, lo que corresponde a aproximadamente 24 meses a 4 °C.

Las composiciones adyuvantes descritas en el presente documento pueden administrarse de forma segura y eficaz a una amplia gama de sujetos. Se ha encontrado sorprendentemente que las composiciones adyuvantes descritas en el presente documento demuestran mejoras de seguridad en comparación con otras composiciones adyuvantes. Los siguientes ejemplos se presentan como realizaciones ilustrativas, pero no deben tomarse como limitantes del alcance de la invención. Muchos cambios, variaciones, modificaciones y otros usos y aplicaciones de esta invención serán evidentes para los expertos en la técnica.

EJEMPLOS

Ejemplo 1 - Caracterización de los liposomas

Los liposomas DCRL (que contienen DDA, colesterol, Bay®R1005 y lecitina) se ajustaron a una concentración final de 50, 50, 100 y 100 pg/ml de DDA, colesterol, R1005 y lecitina de soja, respectivamente.

Los compuestos se añadieron a un matraz de fondo redondo de 250 ml y se llenaron hasta un volumen final de 5 ml con cloroformo de grado anhidro (Sigma-Aldrich, Poole, Dorset, Reino Unido) utilizando puntas de pipeta Solvent Safe™ de 1 ml (Sigma-Aldrich). El disolvente se eliminó utilizando un evaporador rotatorio (Büchi, Flawil, Suiza) a 55 °C bajo vacío (KNF Neuberger, Witney, Oxfordshire, Reino Unido) durante 1 hora hasta que se formó una película lipídica blanca y seca. Los liposomas se rehidrataron con agua bidestilada (ddH²O) procedente de un purificador de agua interno modificado de la Opción 3 que incluye ósmosis inversa para lograr una pureza ultra alta (ELGA LabWater, Wycombe, Buckinghameshire, Reino Unido) o con solución salina tamponada con fosfato (PBS; Sigma-Aldrich) reconstituida a partir de comprimidos con ddH²O.

Tras la rehidratación, los liposomas se manipularon con puntas de pipeta de orificio ancho de 1 ml (VWR, Lutterworth, Leicestershire, Reino Unido) para reducir el cizallamiento. A continuación, la suspensión de liposomas se sonicó en un baño (Sarose Scientific Instruments, Perivale, Middlesex, Reino Unido) durante 1 hora y/o se extruyó hasta 3 veces a través de una membrana de policarbonato Whatman® Nucleopore Track-Etched de 100 nm (Sigma-Aldrich) utilizando una minicélula de extrusión equipada con dos jeringas de 1 ml. La membrana de policarbonato estaba flanqueada por soportes filtrantes de 10 mm.

Los liposomas DCRL sonicados (1,14 pm de diámetro medio) eran significativamente más grandes (5,44 veces) que los liposomas extruidos. La sonicación seguida de extrusión no afectó significativamente al tamaño de las vesículas en comparación con las muestras extruidas (209,6 nm). La polidispersidad de los liposomas extruidos fue 2,10 veces menor que la de los sonicados. La combinación de sonicación y extrusión aumentó significativamente la polidispersidad de los DCRL 1,42 veces en comparación con los liposomas extruidos.

Para evaluar la estabilidad coloidal de los liposomas en solución acuosa, se evaluaron los liposomas DCRL hidratados en ddH²O durante 4 semanas. En particular, un equivalente termodinámico aproximado de 2 años a 4 °C es el almacenamiento de 4 semanas a 37 °C, lo que motiva la evaluación de la estabilidad del producto tanto a 4 como a 37 °C. Se evaluaron tanto los liposomas DCRL vacíos ["-ODN"] como los liposomas DCRL cargados con un oligonucleótido inmunoestimulador ejemplar CpG ODN ("+ODN") para determinar el efecto de los ácidos nucleicos aniónicos en la estabilidad coloidal liposomal catiónica. Para ello, se cargó el ODN rehidratando la película lipídica con una solución de ddH²O y ODN. El tamaño y la polidispersidad de los liposomas DCRL hidratados en ddH2O (177 nm, 0,24) fueron estadísticamente similares a los hidratados en PBS (210 nm, 0,17).

A 4°C, los liposomas DCRL+/-ODN sufrieron aumentos insignificantes de diámetro de 1,10 y 1,01 veces después de 28 días, respectivamente. Los liposomas que contenían ODN (liposomas ODN) (417 nm) eran significativamente mayores que los liposomas que carecían de ODN (liposomas -ODN) (177 nm). Del mismo modo, la polidispersidad disminuyó modestamente 1,08 y 1,03 veces para los liposomas /-ODN después de 28 días, respectivamente, aunque la polidispersidad en el día 28 fue significativamente mayor en los liposomas ODN (1,23 veces) en comparación con los homólogos -ODN.

Por el contrario, el comportamiento de agregación de los liposomas se observó después de 28 días cuando se almacenaron a 37 °C. Los liposomas /-ODN sufrieron aumentos significativos de diámetro de 3,24 y 2,00 veces después de 28 días, respectivamente, pero se estabilizaron después del día 21. Aunque los liposomas ODN eran más grandes (1,46 veces en el día 28) que los liposomas -ODN debido a la compensación de carga mediada por el ODN y a la pérdida de estabilidad coloidal, las tendencias de estabilidad a lo largo del tiempo fueron cualitativamente similares. Sin embargo, la desestabilización de los liposomas ODN se produjo después del día 7, mientras que en los liposomas -ODN, la estabilidad se mantuvo hasta después del día 14. Además, la polidispersidad de los liposomas /-ODN fue estadísticamente similar después de 28 días, habiendo sufrido reducciones significativas de 1,92 y 1,50 veces, respectivamente, en la polidispersidad en comparación con las vesículas del día 0.

Estos resultados sugieren la necesidad de desarrollar tecnologías para la preservación del liposoma y también sugieren que las técnicas de sonicación y/o extrusión más potentes que dan lugar a un tamaño de liposoma inicialmente más pequeño pueden compensar la agregación inicial de los liposomas.

Se compararon los tamaños de los liposomas preparados mediante microfluidización (Microfluidics Corp., Modelo 110EH) y sonicación. Cuando se sustituyó la etapa de sonicación por la de microfluidización, la formulación produjo liposomas con un diámetro medio de aproximadamente 59 nm.

Estos resultados demuestran que los liposomas preparados mediante microfluidización pueden minimizar la agregación de los liposomas que potencialmente puede ser causada por la adición de ODN u ORN.

Ejemplo 2 - Estabilidad de los liposomas liofilizados

La liofilización se realizó utilizando un liofilizador Dura-Stop (SP Scientific, Ipswich, Suffolk, Reino Unido). Las muestras se llenaron en viales tubulares de vidrio tipo I de 10 ml para liofilización (Schott, Stafford, Staffordshire, Reino Unido) antes de la liofilización. Los parámetros del ciclo de liofilización fueron los siguientes. Las muestras se congelaron durante 30 minutos a 5 °C, 30 minutos a -5 °C y 60 minutos a -40 °C, todo ello a una velocidad de rampa de 1,00 °C/min. El secado primario se realizó durante 59 minutos a -37 °C, 59 minutos a -28 °C, 59 minutos a -23 °C y 552 minutos a -21 °C, todo ello con una velocidad de rampa de 0,50 °C/min. El secado secundario se realizó a 20 °C durante 360 minutos con una tasa de rampa de 0,10 °C/min. Todo el secado se realizó con una presión de cámara de 57 mTorr. Se realizó un ciclo de secado primario alternativo a 57 mTorr durante 59 minutos a -38 °C, 59 minutos a -38 °C, 59 minutos a -37 °C y 552 minutos a -35 °C, todo ello con una velocidad de rampa de 0,50 °C/min. Las muestras liofilizadas se sellaron con tapones liofilizados de caucho butílico de grado farmacéutico de 14 mm (Fisher Scientific, Loughborough, Leicestershire, Reino Unido) y Parafilm M° (Sigma-Aldrich).

Los licoprotectores D-manitol, D-(+)-glucosa, D-(-)-fructosa, sacarosa, D-(+)-trehalosa dihidratada (Sigma-Aldrich) o D(+)-manosa (Acros Organics) se solubilizaron en ddH²O o PBS y se añadieron a la suspensión de liposomas hasta una concentración final del 2-4% p/v antes de la liofilización, como se indica.

En ausencia de azúcares, los liposomas rehidratados con ddH²O y PBS tenían un tamaño ~210 nm antes de la liofilización. Sin lioprotectores, la liofilización aumentó el tamaño de los liposomas en 3,55 y 6,05 veces en las muestras rehidratadas con ddH²O y PBS, respectivamente. Los liposomas DCRL rehidratados en ddH²O o PBS no sufrieron cambios de tamaño significativos tras la adición de sacarosa al 3%, manitol al 4% o una combinación de ambos, lo que demuestra que la agregación observada tras la liofilización no fue causada directamente por la adición de el(los) licoprotector(es).

Para los liposomas rehidratados en PBS, el tamaño de los liposomas aumentó significativamente (2,00 veces) sólo en las muestras sin lioprotector después del ciclo de congelación. Sin embargo, después del ciclo completo de liofilización, el tamaño del liposoma aumentó significativamente 6,05, 3,03, 5,15 y 4,13 veces para las muestras sin lioprotector, con 3% de sacarosa, con 4% de manitol y con una combinación, respectivamente. Del mismo modo, la polidispersidad aumentó significativamente en 2,61, 2,61, 2,85 y 2,79 veces para la DCRL sin lioprotector, con 3% de sacarosa, con 4% de manitol y con una combinación, respectivamente, en comparación con los controles preliofilizados.

En el caso de los liposomas rehidratados en ddH²O, el tamaño de las vesículas después del ciclo de congelación aumentó significativamente con respecto a los controles previos a la liofilización en 17,90 y 11,45 veces para los liposomas sin lioprotectores y con manitol al 4%, respectivamente, mientras que los liposomas con sacarosa al 3% o una combinación de sacarosa al 3% y manitol al 4% sufrieron cambios insignificantes. Tras el ciclo completo de liofilización, los tamaños de los liposomas cambiaron modestamente 3,55, 0,88, 3,48 y 1,47 veces para las muestras sin lioprotector, con 3% de sacarosa, con 4% de manitol y con una combinación, respectivamente.

Estos hallazgos demuestran que los liposomas rehidratados en ddH²O tienen una mejor estabilidad coloidal en comparación con los rehidratados en PBS, como lo ilustra el tamaño inalterado de las vesículas después de la liofilización, y que la sacarosa al 3% puede ser un lioprotector más ideal para conferir una buena estabilidad coloidal. Para la optimización de un esquema de liofilización para liposomas DCRL rehidratados en ddH²O, se evaluó el efecto de 6 lioprotectores de azúcar conocidos (individualmente y en combinación), al 2% p/v en el tamaño de la vesícula y la polidispersidad.

Se probaron la sacarosa, la glucosa, el manitol, la trehalosa, la fructosa y la manosa como lioprotectores. Sólo el 2% de manitol como lioprotector aumentó significativamente el tamaño de la vesícula (39,66 veces) y la polidispersidad (2,95 veces). Sin embargo, mientras que la liofilización con todos los demás azúcares no dio lugar a un cambio de tamaño apreciable, los productos lioprotegidos con glucosa, fructosa y/o manosa se colapsaron en capas impermeables y compactas de azúcar y liposomas, que fueron difíciles de rehidratar. En consonancia con la literatura, los liposomas lioprotegidos con sacarosa o trehalosa evitaron el cambio de tamaño de las partículas y dieron lugar a una torta que podía reconstituirse en una dispersión liposomal con buena estabilidad coloidal.

El DCRL también se liofilizó con combinaciones de azúcares. Este estudio reveló que sólo el 2% de sacarosa, el 2% de trehalosa y el 2% de sacarosa/2% de trehalosa soportaban una buena estabilidad coloidal después de la liofilización y lograban una estructura de torta farmacéuticamente elegante. Sin embargo, la combinación de 2% de sacarosa/2% de trehalosa no parecía ser ventajosa en cuanto a la estabilidad del tamaño del liposoma y la polidispersidad respecto a la liofilización con 2% de sacarosa o 2% de trehalosa sola.

Ejemplo 3 - Vacuna IBR/BVDV

Se ha reportado que el adyuvante Quil A causa una respuesta inmune sistémica a menudo acompañada por una fiebre transitoria. Se cree que dicha fiebre está asociada a la disminución de la producción de leche en las vacas lactantes. El objetivo de este estudio era evaluar los efectos de los liposomas sin saponina en la respuesta inmunitaria provocada por los liposomas y los posibles efectos secundarios causados por los adyuvantes.

Para este estudio se utilizaron terneros machos Holstein de ocho meses de edad. Los potenciales animales de prueba fueron examinados serológicamente y aquellos con títulos de neutralización sérica (SN) <1:2 para BVDV-1 y BVDV-2 fueron elegibles para la inscripción en el estudio. Además, los animales no estaban infectados de forma persistente (PI) por BVDV, según se determinó mediante una biopsia con punción de oreja y una inmunohistoquímica. Los animales fueron alojados en un ambiente controlado en cuanto a temperatura y humedad y recibieron ad libitum pienso comercial y agua del sistema de la ciudad.

La aclimatación comenzó aproximadamente una semana antes del día 0 del estudio. Los terneros recibieron DRAXXIN® y DECTOMAX® antes del envío.

Los animales de prueba que se tornaron moribundos, se lesionaron o murieron debido a condiciones no relacionadas con la investigación fueron excluidos del estudio y del análisis de datos pertinentes. Los animales moribundos fueron sometidos a eutanasia.

Los animales fueron vacunados en los días cero y 28 mediante la administración subcutánea de 2 ml de la vacuna como se resume en la Tabla 1.

Tabla 1

En el día 49, los animales se expusieron al virus de la diarrea viral bovina no citopática tipo 2 (cepa 24515). Cada animal recibió aproximadamente 4,88 Log-ioTCIDso por dosis en 5 ml administrados por vía intranasal (2,5 ml por fosa nasal) utilizando un atomizador de gas comprimido.

En los grupos T02-T06, el componente antigénico contenía 4500RUs/virus preinactivado de BVDV A y IBR modificado (8,0 log-ioTCIDso).

Los animales se expusieron el día 48 a 5 ml de la cepa 24515 del BVDV-2 (4,88 Log-ioTCIDso por dosis) por vía intranasal (2,5 ml por fosa nasal) utilizando un atomizador de gas comprimido.

Las medias e intervalos de mínimos cuadrados de la temperatura rectal después de la primera y segunda vacunación se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2. Análisis de mínimos cuadrados de la red para las temperaturas rectales Fase de vacunación

Las temperaturas rectales de algunos sujetos T02 y T07 mostraron un aumento transitorio el día después de la primera y la segunda vacunación. El aumento de las temperaturas rectales de los animales del grupo T02 fue significativamente mayor (P<0,10) que en los otros grupos (T01, T03, T04, T05, T06 y T07) durante 1 día después de la primera vacunación.

Después de la primera vacunación, cuatro de 9 animales en el grupo T02 tenían temperaturas superiores a 103,5 °F (tres tenían temperaturas de más de 104,0 °F). En cambio, ningún animal del grupo T05 tenía temperaturas superiores a 102,5 °F un día después de la primera vacunación (datos no mostrados).

Después de la segunda vacunación, el aumento de la temperatura rectal de los grupos T02 y T07 fue significativamente (P<0,10) más alto que el de los controles y los vacunados (T03, T04, T05 y T06); sin embargo, las temperaturas rectales elevadas fueron de corta duración (Tabla 2). Las respuestas individuales en el grupo T02 oscilaron entre 101,1 y 104,5 °F. Cinco de los nueve animales del grupo T02 tuvieron temperaturas superiores a 103,5 °F (y otro animal tuvo una temperatura de 103,5 °F) después de la segunda vacunación. Sólo tres de los nueve animales del grupo T02 tenían temperatura inferior a 103,5 °F un día después de la segunda vacunación. Por el contrario, ninguna de las formulaciones DCRL indujo una elevación de la temperatura rectal superior a 103,7 °F. Las respuestas individuales en el grupo T05 variaron entre 101,4 y 102,6 °F (datos no mostrados).

Se observó una reacción febril (>104,5°F) en 8 de 8 animales en el grupo T01 después de la exposición; esto cumplió con los criterios de resultado para una exposición exitosa. Las temperaturas rectales de todos los grupos vacunados fueron significativamente más bajas (P<0,10) en el día 53 del estudio en comparación con los controles (4 días después de la exposición) y hubo algunas diferencias en los días siguientes (datos no mostrados). En el grupo de control, en respuesta a la exposición, se observó una elevación bifásica típica de la temperatura rectal. La presencia de la enfermedad clínica del BVDV (un animal tenía que tener una puntuación clínica de > 2) después de la exposición se determinó de acuerdo con el siguiente sistema de puntuación:

0 - sin signos clínicos

1 -Los signos clínicos en su conjunto no son específicos de la infección aguda por BVD. Los signos clínicos pueden incluir secreción nasal, respiración anormal y letargo leve.

2 -Los signos clínicos en su conjunto son de grado moderado y específicos de la infección aguda por BVD. Los signos clínicos pueden incluir secreción nasal, respiración anormal, letargo, aturdimiento, secreción ocular, hipersalivación, diarrea, deshidratación, cojera y/o renuencia a moverse.

3 -Los signos clínicos en su conjunto son graves y característicos de la infección aguda por BVD. Los signos clínicos pueden incluir secreción nasal, respiración anormal, letargo, aturdimiento, secreción ocular, hipersalivación, diarrea, hematomas excesivos, deshidratación, decúbito, cojera y/o renuencia a moverse. No hubo diferencias significativas entre el grupo de control y los grupos vacunados.

Leucopenia

El resultado del estudio cumplió los criterios de un estudio válido ya que el 100% de T01 (controles) tuvo leucopenia cuando se utilizó > 40% de disminución y el 75% de los controles tuvo <4000 células/pl. No hubo diferencias significativas entre el número de animales que desarrollaron leucopenia > 40% de disminución de glóbulos blancos respecto al fondo postexposición en T01 en comparación con los grupos de tratamiento vacunados T02, T03, T04, T05, T06 y T07 (P<0,10). Sin embargo, la leucopenia clínica (<4000 células/pl), que es una definición más relevante, se detectó en 6 de 8 (75%), 2 de 9 (22,2%), 1 de 8 (12,5%), 3 de 9 (33,3%), 4 de 9 (44,4%), 4 de 9 (44,4%) y 0 de 6 en T01, T02, T03, T04, T05, T06 y T07, respectivamente (Tabla 3). La duración de la leucopenia fue significativamente mayor (P<0,10) en el grupo T01 cuando se utilizó una gota >40% en comparación con todos los vacunados y significativamente mayor (P<0,10) cuando se utilizó <4000 pl en comparación con los grupos vacunados T02, T03, T05, T06 y T07 (Tabla 4).

Tabla 3 Resumen de la fase de exposición a la leucopenia

Tabla 4. Duración de la leucopenia

Viremia

Todas las vacunas experimentales protegieron contra la viremia. En algunos grupos hubo una protección completa (T02 y T05, ambos con CpG) y en otros parcial (T03, T04, T06 y T07). El número de animales virémicos en T01 fue significativamente mayor que el de T02, T03, T04, T05, T06 y T07 (P<0,10) (Tabla 5). No se observó viremia en los grupos T02 y T05. Sin embargo, hubo una diferencia entre el número de animales virémicos en los grupos T03, T04 y T06 que no contenían ORN, dosis bajas de ORN y dosis altas de ORN en comparación con los controles.

Tabla 5. Resumen de la fase de aislamiento del virus

La duración de la viremia para el grupo T01 fue significativamente mayor que la de todos los grupos vacunados (T02 a T07) (P<0,1) (Tabla 6). Los terneros del grupo T07 habían recibido una vacuna que contenía un adyuvante Quil A antígeno gp53 recombinante del virus BVDV-1 y también estaban parcialmente protegidos y tenían una duración de la viremia significativamente menor en comparación con el grupo T01. Para estos terneros el exposición fue con un biotipo diferente de BVDV (tipo 2), lo que refleja que hubo una protección cruzada parcial entre el antígeno gp53 de BVDV-1 y la cepa de exposición.

Tabla 6 Días con excreción de virus positiva

Títulos SN

En el día 49, antes de la exposición, todos los animales del grupo T02 a T07 tenían un título SN para BVDV-1, BVDV-2 y sólo los T02 a T06 tenían anticuerpos contra el antígeno IBR de >1:8. Se consideró que todas las vacunas tenían una potencia adecuada, ya que cumplían el requisito de >1:8. En la tabla 7 se muestran las medias de mínimos cuadrados de los títulos de SN para BVDV-1 y 2 después de la primera y segunda vacunación (días 28 y 49). Todos los animales vacunados tuvieron títulos de SN significativamente más altos que el grupo de control y hubo diferencias significativas entre los títulos de SN de los grupos vacunados. Las vacunas liposomales (T03 a T06) indujeron títulos de SN significativamente más bajos para BVDV-1 y 2 que la vacuna adyuvada con una composición que contenía Quil A (T02). La adición de ^o RⁿS o CpG a estas formulaciones no mejoró estas respuestas. La vacuna gp53 adyuvada con una composición que contenía Quil A también indujo títulos elevados de SN en el día 49 para el antígeno de BVDV-1, pero menores para el antígeno de BVDV-2. Los títulos de SN de BVDV-1 del grupo T07 no fueron significativamente diferentes de los títulos de T02, pero los títulos de BVDV-2 sí lo fueron. Después de la exposición del BVDV-2, los títulos de SN de todos los grupos vacunados se reforzaron, mientras que los terneros del grupo T01 desarrollaron respuestas de anticuerpos primarios (día 63).

Tabla 7. Medias de mínimos cuadrados del título SN de BVDV-1a y BVDV2

Tabla 8 Medias de mínimos cuadrados del título SN de IBR

Reacciones en el lugar de la inyección

Las medias de los mínimos cuadrados de las reacciones en el lugar de la inyección (ISR) para el cuello izquierdo y derecho se muestran en las Tablas 9 y 10. En el día 1, se produjeron pequeñas reacciones en los seis grupos de vacunación, pero retrocedieron. Las mayores reacciones en el lugar de la inyección se produjeron el día 29 en los grupos T02 y T07, con 41,8 y 16,3 respectivamente. Hubo diferencias significativas entre las reacciones en el lugar de la inyección en determinados días. Todas las vacunas fueron seguras, ya que las reacciones en el lugar de la inyección se resolvieron rápidamente.

Tabla 9. Media de mínimos cuadrados para las reacciones en el lugar de la inyección (cuello izquierdo)

Tabla 10 Media de mínimos cuadrados para las reacciones en el lugar de la inyección (cuello derecho)

Inmunidad mediada por células

El ensayo ELISPOT de IFN gamma del BVDV tuvo un alto fondo en el grupo T01 antes de la exposición y, por lo tanto, se considera poco fiable para la demostración de la inducción de respuestas CMI por estas vacunas a este antígeno (datos no mostrados). Sin embargo, los ensayos para los antígenos de la IBR reflejaron la inducción de una CMI por parte de las vacunas respectivas (véanse las Tablas 11-13, respuestas al antígeno muerto de la IBR, respuestas de recuerdo del péptido de la IBR gB y gD de T02 a T06). En general, las respuestas más altas se dieron en el grupo de la vacuna T02 y en el grupo T05 que tenía CpG en la formulación. Las respuestas posteriores a la exposición no fueron mayores, ya que la exposición fue una exposición con el virus BVDV. Es de suponer que las vacunas indujeron respuestas CMI similares al antígeno de BVDV.

Tabla 11

Tabla 12

Tabla 13

Se observó un efecto de la vacuna sobre el desarrollo y la duración de la viremia. Todas las vacunas experimentales protegieron contra la viremia. Se observó una protección completa en algunos grupos (T02 y T05 que contenían CpG) mientras que se observó una protección parcial en los otros grupos (T03, T04, T06 y T07). Los perfiles de temperatura rectal mostraron un aumento transitorio un día después de la primera y segunda vacunación para los grupos de tratamiento T02 y T07 en comparación con los controles T01. Las vacunas liposomales indujeron menores elevaciones de la temperatura rectal en comparación con los T02 y T07 que tenían adyuvante que contenía Quil A. Este adyuvante que contiene Quil A suele inducir una elevación de la temperatura en un solo día inmediatamente después de la vacunación. Esto último es especialmente importante en el caso de las vacas lecheras, ya que la fiebre que acompaña a la vacunación suele provocar un descenso inaceptable de la producción de leche. Las formulaciones liposomales indujeron respuestas robustas de anticuerpos y de células T (incluso las liposomales sin inmunomoduladores adicionales). Las vacunas liposomales indujeron títulos SN significativamente más bajos frente a los antígenos de BVDV-1 y 2 y de IBR en comparación con las vacunas que contenían Quil A, aunque los niveles alcanzados se consideraron en el intervalo de protección para estas enfermedades respectivas (títulos SN del BVDV-1 de 1:256-512; del BVDV-2 ± 256 o más; título SN de la IBR de 1:32).

En conclusión, las formulaciones liposomales ofrecen una opción segura y nueva para administrar antígenos muertos para enfermedades que requieren no sólo anticuerpos sino también CMI para su protección. Las formulaciones fueron comparables a las vacunas que contienen Quil-A en cuanto a eficacia. El efecto del CpG sobre la eficacia fue reproducible, pero el ORN no fue eficaz para mejorar la inmunidad contra el exposición del BVDV. Ejemplo 4 - Virus de la gripe porcina

0147] El objetivo de este estudio fue evaluar la respuesta inmunitaria y la eficacia de varias vacunas contra el SIV (virus muerto, pH1N1 y H3N2) que contienen nuevas formulaciones adyuvantes e inmunomoduladores. La eficacia se determinó por medio de parámetros inmunológicos (humorales y celulares) y por criterios de valoración de la eficacia, incluidos los signos clínicos, la viremia, la excreción viral y las lesiones pulmonares.

Animales.

Para este estudio se utilizaron cerdos de tres semanas (21+/- 3 días) de ambos sexos. Los animales no tenían antecedentes de exposición a PRRSV ni al Mycoplasma hyopneumoniae. Los animales o sus madres no tenían antecedentes de vacunación o exposición a ningún serotipo de SIV. Los animales llegaron al lugar entre cuatro y siete días antes de la vacunación y fueron alimentados con una ración estándar y agua ad libitum.

Los cerdos fueron vacunados con las composiciones de la Tabla 14 en los días cero (cuello izquierdo) y 21 (cuello derecho) y se expusieron a virus H3N2 IN/12 en el día 35.

Tabla 14. Configuración experimental

Se recogió suero sanguíneo para el análisis de la inhibición de la hemaglutinación (HAI) en los días 35 y 40, y se recogió sangre completa para el análisis ELISPOT (IFNy) en los días 28, 35 y 40. Los cerdos fueron sacrificados el día 40 (5 días después de la exposición) y el porcentaje de consolidación para cada lóbulo (craneal izquierdo, medio izquierdo, caudal izquierdo, craneal derecho, medio derecho, caudal derecho y accesorio) se anotó y registró como un porcentaje entre 0 y 100%.

Ninguna de las vacunas dio lugar a efectos secundarios sistémicos o reacciones secundarias inaceptables a la inyección (datos no mostrados).

Los títulos de HAI se muestran en la Tabla 15.

Tabla 15. Títulos de HI (Día 35 previo a la exposición, Día 40 posterior a la exposición)

Las puntuaciones de las lesiones pulmonares se muestran en la tabla 16.

Tabla 16 Resumen de las puntuaciones de las lesiones pulmonares (Día 40)

El grupo T04 tuvo el título más alto de HAI para una de las cepas de la vacuna (H1N1), mientras que el T07 tuvo el título más alto para la otra cepa (H3H2), aunque, los títulos en los grupos T02-T08 fueron significativamente más altos que en el grupo de control T01.

Todas las vacunas (excepto T08) tendieron a reducir LLS a los 5 días después de la exposición. El grupo T06 (TXO) tendió a tener las puntuaciones de lesiones pulmonares más bajas.

Las células secretoras de IFN-gamma específicas del péptido de la proteína NP de la gripe y las células secretoras de IFN-gamma específicas del virus de la gripe entero (ambas determinadas por ELISPOT) se proporcionan en las Tablas 19 y 20, respectivamente. Los péptidos de las mezclas son de 16 mers con un solapamiento de 12 aminoácidos. Las cuatro mezclas contienen la secuencia del péptido NP desde el N-terminal (mezcla 1) hasta el C-terminal (mezcla 4). Las secuencias de los péptidos se presentan en las tablas 17 y 18.

Tabla 17. Mezclas de péptidos NP utilizados para ELISPOT IFN-^y (mezclas 1 y 2)

Tabla 18. Mezclas de péptidos NP utilizados para IFN-y ELISPOT (mezclas 3 y 4)

Tabla 19 Mezclas de péptidos NP EUSPOT IFN-y (Día 40)

La proteína NP está en general muy conservada entre las cepas del SIV, y por lo tanto, una respuesta eficiente de CMI probablemente se traduce en un mejor potencial de protección cruzada.

Tabla 20. antígeno de recuerdo del virus ELISPOT IFN-y (Día 40)

El grupo T07 (liposomas DCRL) proporcionó las respuestas de IFN gamma más altas de tres de las cuatro mezclas de péptidos de proteínas NP y de dos de los tres virus enteros probados. El único grupo con respuesta de IFN-^y observada después de la vacunación (antes de la exposición) fue el T06 (TXO) (datos no mostrados).

La adición del agonista CD40 y del CpG tendió uniformemente a disminuir los títulos, así como a aumentar la LLS, especialmente en el contexto de la formulación liposomal.

En conjunto, estos resultados indican que la vacuna adyuvada con liposomas DCRL es tan eficaz como la formulación T02 (formulación experimental similar a la vacuna comercial) para reducir las puntuaciones de las lesiones pulmonares. Al mismo tiempo, los liposomas DCRL son mucho más eficaces en la activación de la respuesta CMI que las otras vacunas probadas, proporcionando así posiblemente un potencial de protección cruzada más amplio y una mejor duración de la inmunidad que el producto comercial.

Ejemplo 5 Desarrollo de la inmunidad a Eimeria maxima tras la vacunación con profilina

El objetivo del estudio fue evaluar los efectos de varios adyuvantes (propiedad de Zoetis) en el desarrollo de la inmunidad a Eimeria maxima tras la vacunación con profilina.

Los pollitos recién nacidos se compraron en la incubadora de Longenecker, Elizabethtown, PA. Los pollitos recibieron alimento y agua ad libitum. Las aves se mantuvieron en corrales de cría en instalaciones libres de Eimeria y se transfirieron a grandes jaulas colgantes en un lugar separado donde se infectaron y se mantuvieron hasta el final del período experimental.

La profilina purificada (50|jg/dosis) se mezcló con diferentes adyuvantes como se indica en la Tabla 21.

Tabla 21

Las aves fueron inmunizadas con dos inyecciones subcutáneas (0,5 ml por dosis) de profilina más adyuvante en el día 1 y en el día 7 de edad posteriormente. Siete días después de la segunda inmunización (14 días de edad), las aves (excepto en el grupo T01) fueron expuestas con 1 x 104 ooquistes esporulados de Eimeria maxima.

Se determinó el aumento de peso corporal en los días 6 y 15 después del exposición. También se determinó la presencia de ooquistes en las heces del día 6 al 9 después de la exposición. Los anticuerpos séricos contra la profilina se evaluaron mediante ELISA.

Grupos de control: Inyecciones de PBS y ningún exposición (control no vacunado no expuesto), inyecciones de PBS y exposición en el día 14 (control no vacunado expuesto), profilina/sin adyuvante y exposición en el día 14 (control de antígeno).

Para evaluar las puntuaciones de las lesiones, se mataron seis aves/grupo 6 días después del exposición. Se obtuvieron segmentos intestinales de aproximadamente 20 cm que se extendían 10 cm por delante y por detrás del divertículo y se cortaron longitudinalmente. El contenido intestinal se extrajo con cuidado. Se asignó una puntuación de 0 a 4 en función de la gravedad de las lesiones.

Para evaluar la producción fecal de ooquistes, se recogieron por separado las heces de cada grupo (8 aves/grupo; 4 jaulas con 2 aves/jaula) de 6 a 9 días después del exposición. A partir de los 6 días posteriores a la exposición, se instalaron las jaulas de recogida y se instruyó a los cuidadores de los animales para que no limpiaran las heces. Los excrementos fecales se recogieron en cada jaula de recogida de ooquistes con capacidad para 2 aves por jaula. Se colocaron bandejas colectoras debajo de cada jaula durante 3 días a partir de los 6 días pi, y el material fecal se recogió en grandes tarros de plástico. Los excrementos fecales de cada frasco se trituraron en una batidora con agua, y se tomaron dos muestras al azar de 35 ml de cada muestra. Para contar los ooquistes de coccidios, se hicieron inicialmente varias diluciones para determinar las diluciones óptimas para el recuento de ooquistes de cada muestra. Los ooquistes se contaron al microscopio. El número total de ooquistes desprendidos por pollo se calculó mediante la fórmula: total de ooquistes/ave = (recuento de ooquistes x factor de dilución x volumen de la muestra fecal/volumen de la cámara de recuento)/número de aves por jaula.

Se tomaron muestras de sangre (4 aves/grupo) el día 9 después de la exposición con Eimeria para medir la respuesta de anticuerpos. Las muestras de sangre se dejaron coagular a 4°C durante 4 horas y se separaron los sueros. Las muestras de suero se analizaron para detectar anticuerpos contra Eimeria mediante ELISA. Brevemente, las placas de microtitulación se recubrieron durante la noche con 200ng/weM del antígeno coccidial recombinante, se lavaron con PBS-0,05% Tween y se bloquearon con PBS-1% BSA. Se añadieron diluciones de suero, se incubaron con agitación suave continua, se lavaron y se detectó el Ab unido con IgG de conejo antipollo conjugada con peroxidasa (Sigma) y sustrato específico para peroxidasa. La densidad óptica (DO) se midió a 450 nm con un lector de microplacas (Bio-Rad, Richmond, CA).

Todos los valores se expresan como media ± SEM. Las diferencias entre las medias se consideraron significativas a p < 0,05.

El control negativo y el control de exposición fueron significativamente diferentes a los 6 días pero no a los 15 días post-infección. La pérdida de peso en el día 6 después del exposición en los controles de exposición en comparación con los controles negativos fue de aproximadamente el 15%. Ningún tratamiento se diferenció de los controles sin adyuvante o de exposición, pero los tratamientos T05, T06 y T08 tampoco se diferenciaron del control negativo.

Un poco menos del 60% de las aves tuvieron puntuaciones de lesión de 2 o más. Ninguna de las formulaciones fue significativamente diferente del control de exposición. El grupo T09 fue el de menor rendimiento. T04 fue el de mejor rendimiento.

En general, una disminución de < 1 log en la producción no se considera biológicamente relevante, pero aún puede ser indicativa de inmunidad activa. Las únicas formulaciones que fueron significativamente menores que el control de exposición fueron T05 y T09.

La respuesta de anticuerpos no se considera en general relevante para la inmunidad a la coccidiosis, por lo que puede no correlacionarse con otros criterios. En los experimentos anteriores, el grupo T07 provocó una respuesta de anticuerpos más alta que las respuestas provocadas por las aves negativas (no vacunadas, no infectadas), el control positivo (aves no vacunadas, infectadas) o las aves vacunadas sólo con el antígeno. Los grupos T05, T06 y T08-T10 provocaron respuestas de anticuerpos superiores a las del control negativo (aves no vacunadas e infectadas).

Los resultados se resumen en la Tabla 22. Aumento de peso, niveles de anticuerpos en suero (expresados en % del control no infectado) y puntuaciones de lesiones, producción de ooquistes (expresados en % del control infectado) tras la inmunización de las aves con dos inyecciones subcutáneas de profilina más varios adyuvantes en el día 1 y el día 7 de edad y la posterior exposición con 1 X 104 ooquistes de Eimeria maxima a los 14 días de edad.

Tabla 22

Ejemplo 6 - Vacuna BVDV/IBR adyuvada con DCRL CpG

En este ejemplo, se accedió al potencial adyuvante de los liposomas DCRL con CpG (sin ORN). Además, se compararon diferentes procedimientos de carga de los liposomas.

El montaje experimental fue el siguiente (Tabla 21):

Las vacunas de los grupos T03-T06 también contenían mBVD1 (4.500 RU/ds) BVDV1 (4500RUs), BVDV 2 (4500RUs), mIBR 108log-i0 TCID⁵⁰ (dosis de preinactivación).

En este estudio se inscribieron terneros Holstein sanos (6-7 meses de edad, seronegativos para BVDV1, BVDV2 e IBR) (n=9/grupo de tratamiento). Los terneros recibieron 2 ml de la vacuna asignada por vía subcutánea en los días 0 y 28. Se administró un exposición virulento de BVDV2 (4 ml (5,14 log-¹⁰ TCID⁵⁰ por dosis) por vía intranasal) el Día 49. Se realizaron observaciones clínicas y se midieron los lugares de inyección y la temperatura rectal alrededor de cada vacunación. Se tomaron muestras de sangre para recuentos de glóbulos blancos, viremia y serología hasta el día 63.

Todos los terneros en T02, T03, T04 y T06 alcanzaron títulos de 1:8 contra el BVDV-la y el BVDV2 antes del exposición, en comparación con el 22,1 y el 11,1% de los terneros en T05. Se cree que debido a la carga activa utilizada en T5, la mayor parte del antígeno fue eliminado de la preparación de la vacuna. Por ello, los animales del grupo T05 recibieron menos antígeno que los animales de los grupos T03, T04 y T06. Por lo tanto, la interpretación de los resultados del grupo T05 debe interpretarse con cautela.

Dicho esto, los títulos de BVDV-la y BVDV2 para T05 fueron significativamente más bajos que los otros grupos vacunados en los Días 28, 49 y 63. Ningún ternero en T02 o T05 alcanzó títulos de 1:8 contra el BHV antes del exposición, y estos grupos también tuvieron títulos significativamente más bajos en comparación con los otros grupos vacunados en los Días 28, 49 y 63. La media de mínimos cuadrados para la SFC de gp53-1 fue significativamente mayor para el T02 en comparación con todos los demás grupos de tratamiento en los días 0, 35 y 56, y la media de mínimos cuadrados para la SFC de gp53-2 fue significativamente mayor para el T02 en los días 35 y 56.

Se observó viremia en todos los terneros de T01 y T05. Ningún ternero del grupo T02 desarrolló viremia tras la exposición. En los grupos T03, T04 y T06, 22,2, 33,3 y 33,3% de los terneros desarrollaron viremia; estos grupos no fueron significativamente diferentes de T02. La duración de la viremia fue significativamente mayor en los grupos T01 y T05 en comparación con todos los demás grupos de tratamiento. Cuando la leucopenia se determinó por una reducción del 40% en los glóbulos blancos con respecto a la línea de base, el 22,2% de los terneros en T02 eran leucopénicos después de la exposición, mientras que todos los terneros en todos los grupos eran leucopénicos. Los terneros en T01 y T05 tuvieron una duración significativamente mayor de leucopenia en comparación con todos los demás grupos (8,6 días, cero días, 0,2 días, 0,7 días, 6,7 días y 0,8 días para los grupos T01-T06, respectivamente). En este estudio sólo se observaron signos leves de enfermedad clínica tras la exposición. En el grupo de control T01, el 22,2% de los terneros tenían puntuaciones clínicas de >2 después de la exposición, mientras que el 11,1% de los terneros en T05 tenían puntuaciones clínicas de >2 después de la exposición. Ningún ternero de ningún otro grupo de tratamiento tuvo puntuaciones clínicas de >2 después de la exposición.

Se observaron fiebres transitorias en T02 en los días 1 y 29. Las temperaturas de todos los demás terneros fueron normales durante todo el estudio.

Tabla 22. Medias de mínimos cuadrados para la fase de vacunación Temperatura rectal, °F

Tabla 23. Medias de mínimos cuadrados para la fase de exposición Temperatura rectal, °F

Los valores con superíndices diferentes son significativamente diferentes (p<0,10)

El análisis de los animales individuales reveló que en el grupo T02 (adyuvado con un adyuvante que contenía Quil A), cuatro animales tenían una temperatura superior a 103,5 F después de la primera inyección y dos animales tenían una temperatura superior a 103,5 F después de la segunda inyección. Además, un animal tenía una temperatura de 103,2 F el día 1 (un día después de la primera vacunación) y cinco tenían temperaturas en el intervalo de 103,0-103,4 F el día 29 (un día después de la segunda vacunación). En cambio, ninguno de los animales vacunados con los adyuvantes sin Quil A tuvo temperaturas superiores a 103,5 F ni después de la primera ni después de la segunda vacunación. Dos de ellos tenían temperaturas de entre 103,0 y 103,4 F.

En este estudio no se observaron reacciones en el lugar de la inyección >200 cm3. El grupo T02 (adyuvado con un adyuvante que contiene Quil A) tuvo reacciones en el lugar de la inyección significativamente mayores en los días 2, 7 y 29 en comparación con todos los demás grupos de tratamiento. Las reacciones medibles en el lugar de la inyección seguían presentes el día 49 en el T02 (segunda inyección) y en el T06 (primera inyección).

Tabla 1. Medias de mínimos cuadrados para las reacciones en el lugar de la inyección tras la primera vacunación (cm3)

Tabla 25. Medias de mínimos cuadrados para las reacciones en el lugar de la inyección tras la segunda vacunación (cm3)

Claims (23)

REIVINDICACIONES

1. Un liposoma esencialmente libre de saponina que comprende una membrana bicapa lipídica externa y un compartimento interno, comprendiendo la membrana externa:

a) un compuesto de amonio cuaternario formado por cuatro cadenas de alquilo, dos de las cuales son alquilos C10-C20 y las dos restantes son alquilos C1-C4;

b) un esterol seleccionado del grupo formado por p-sitosterol, estigmasterol, ergosterol, ergocalciferol y colesterol;

c) un fosfolípido; y

d) un glicolípido de fórmula I:

en el que R1 es hidrógeno o un radical alquilo saturado de hasta 20 átomos de carbono; X es -CH²-, -O- o -NH-; R2 es hidrógeno o un radical alquilo saturado o insaturado de hasta 20 átomos de carbono; R3, R4 y R5 son independientemente hidrógeno, - SO⁴²-, -PO⁴2', -COC^1-10 alquilo; R6 es L-alanilo, L-alfa-aminobutilo, L-arginilo, L-asparginilo, L-aspartilo, L-cisteinilo, L-glutamilo, L-glicilo, L-histidilo, L-hidroxiprolilo, L-isoleucilo, L-leucilo, L-lisilo, L-metionilo, L-ornitinilo, L-fenialilo, L-prolilo, L-serilo, L-treonilo, L-tirosilo, L-triptófano y L-valilo o sus isómeros D,

2. El liposoma de la reivindicación 1, en el que dicho liposoma está libre de saponina.

3. El liposoma de la reivindicación 1 o 2, en el que el compuesto de amonio cuaternario es DDA (dimetildioctadecilamonio), el esterol es colesterol, y el glicolípido es N-(2-deoxi-2-L-leucilamino-p-D-glucopiranosil)-N-octadecildodecanoilamida o una sal de la misma.

4. El liposoma de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además, en el compartimento interno, un oligonucleótido inmunoestimulador seleccionado del grupo que consiste en un ribonucleótido inmunoestimulador, un oligodeoxirribonucleótido CpG y una combinación de los mismos.

5. El liposoma de la reivindicación 4, en el que dicho oligonucleótido inmunoestimulador comprende uno cualquiera de las SEQ ID NO: 1-14,

6. Una formulación adyuvante que comprende el liposoma según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

7. La composición adyuvante de la reivindicación 6, en la que dicha formulación adyuvante está esencialmente libre de saponina.

8. Una composición de vacuna que comprende una cantidad eficaz de un componente antigénico y la formulación adyuvante de la reivindicación 6 o la reivindicación 7.

9. La composición de vacuna de la reivindicación 8, en la que dicha composición de vacuna está esencialmente libre de saponina.

10. La composición de vacuna de la reivindicación 8 o 9, en la que el componente antigénico está dentro del compartimento interno.

11. La composición de vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 8-10, en la que el componente antigénico se selecciona del grupo que consiste en antígenos bovinos, antígenos caprinos, antígenos porcinos, antígenos avícolas, antígenos equinos, antígenos caninos, antígenos equinos y antígenos felinos.

12. La composición de vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 8-11, en la que el oligonucleótido inmunoestimulador comprende un oligodeoxirribonucleótido CpG.

13. La composición de vacuna de la reivindicación 9, en la que el componente antigénico comprende IBR, BVDV-1 y BVDV-2, y en la que la composición de vacuna está esencialmente libre de saponina.

14. Una composición de vacuna para su uso en un procedimiento de inducción de una respuesta inmunitaria contra el virus de la diarrea viral bovina (BVDV) en un bovino que comprende la administración a dicho bovino de la composición de vacuna según la reivindicación 13.

15. La composición de la vacuna para su uso en el procedimiento de la reivindicación 14, en la que dicha respuesta inmune se induce sin una fiebre acompañante.

16. La composición de vacuna de la reivindicación 12, en la que el antígeno comprende un antígeno de aves de corral.

17. La composición de vacuna de la reivindicación 16, en la que el antígeno es profilina.

18. Una composición de vacuna para su uso en un procedimiento de prevención de la excreción de ooquistes de Eimeria en un animal de corral infectado con Eimeria, que comprende la administración a dicho animal de la composición de vacuna de la reivindicación 17 antes de dicha infección.

19. La composición de vacuna de la reivindicación 11, en la que el componente antigénico comprende un virus ssRNA, y en la que la composición de vacuna está sustancialmente libre de oligodesoxirribonucleótido CpG.

20. La vacuna de la reivindicación 19, en la que el virus ssRNA es un virus de la gripe.

21. La vacuna de la reivindicación 20, en la que el virus de la gripe es un virus de la gripe porcina inactivado (SIV).

22. Un procedimiento para preparar el liposoma de la reivindicación 1, comprendiendo el procedimiento:

a) disolver en un disolvente orgánico el compuesto de amonio cuaternario, el esterol, el fosfolípido y el glicolípido de fórmula I

Fórmula I

en la que R1 es hidrógeno o un radical alquilo saturado de hasta 20 átomos de carbono; X es -CH²-, -O- o -NH-; R2 es hidrógeno o un radical alquilo saturado o insaturado de hasta 20 átomos de carbono; R4, R4 y R5 son independientemente hidrógeno, -SO⁴²-, -PO⁴²-, -COC^1-10 alquilo; R6 es L-alanilo, L-alfa-aminobutilo, L-arginilo, L-asparginilo, L-aspartilo, L-cisteinilo, L-glutamilo, L-glicilo, L-histidilo, L-hidroxiprolilo, L-isoleucilo, L-leucilo, L-lisilo, L-metionilo, L-ornitinilo, L-fenialilo, L-prolilo, L-serilo, L-treonilo, L-tirosilo, L-triptófano y L-valilo o sus isómeros D;

b) eliminar el disolvente orgánico y la formación de una película;

c) rehidratar la película en un disolvente acuoso, formando así una composición rehidratada;

d) microfluidizar la composición rehidratada.

23. El procedimiento de la reivindicación 22, en el que el disolvente acuoso comprende un oligonucleótido inmunoestimulador.