ES2383809T3 - Anticuerpos que se unen al receptor de interleucina 4 - Google Patents

Anticuerpos que se unen al receptor de interleucina 4 Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo aislado que se une al receptor de IL-4, que comprende un dominio variable de cadena ligera, donde a. la cadena ligera CDR1 comprende los residuos 24-35 de la SEC ID NO:6 y b. la cadena ligera CDR2 comprende los residuos 51-57 de la SEC ID NO:6, y c. la cadena ligera CDR3 comprende los residuos 90-99 de la SEC ID NO:6.; y un dominio variable de cadena pesada, donde las secuencias de la cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 comprenden los residuos 30 a 35, 49 a 65 y 97 a 104 de la SEC ID NO:16, respectivamente, los residuos 30 a 35, 49 a 65 y 97 a 104 de la SEC ID NO:18, respectivamente, los residuos 30 a 35, 49 a 65 y 97 a 104 de la SEC ID NO: 20, respectivamente, los residuos 30 a 35, 49 a 65 y 97 a 104 de la SEC ID NO:22, respectivamente, los residuos 30 a 35, 49 a 65 y 97 a 104 de la SEC ID NO:26, respectivamente, los residuos 30 a 35, 49 a 65 y 97 a 104 de la SEC ID NO:28, respectivamente, los residuos 30 a 35, 49 a 65 y 97 a 104 de la SEC ID NO:30, respectivamente, los residuos 30 a 35, 49 a 65 y 97 a 104 de la SEC ID N032, respectivamente, los residuos 30 a 35, 49 a 65 y 97 a 104 de la SEC ID NO: 34, respectivamente, los residuos 30 a 35, 49 a 65 y 97 a 104 de la SEC ID NO:38, respectivamente o los residuos 30 a 35, 49 a 65 y 97 a 104 de la SEC ID NO:40, respectivamente.

Description

Anticuerpos que se unen al receptor de interleucina 4
REFERENCIA CRUZADA CON LA SOLICITUD RELACIONADA
La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional estadounidense num. 60/518,166, presentada 5 el 7 de noviembre de 2003.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
La interleucina 4 (IL-4), previamente conocida como factor estimulante de celulas B, o BSF-1, se caracteriz6 originalmente por su capacidad de estimular la proliferaci6n de celulas B en respuesta a bajas concentraciones de anticuerpos dirigidos a la inmunoglobulina superficial. Se ha demostrado que la IL-4 posee un espectro mucho mas 10 amplio de actividades biol6gicas, que incluye la co-estimulaci6n del crecimiento de celulas T, mastocitos, granulocitos, megacariocitos y eritrocitos. Ademas, la IL-4 estimula la proliferaci6n de diversas lfneas celulares dependientes de IL-2- e IL-3-, induce la expresi6n de las moleculas del complejo de histocompatibilidad mayor de clase II en celulas B en reposo y potencia la secreci6n de los isotipos IgE e lgG1 por celulas B estimuladas. La IL-4 esta asociada a una respuesta inmunitaria de tipo TH2-, siendo una de las citocinas segregadas por las celulas TH2.
15 Se ha identificado y caracterizado IL-4 murina y humana, incluyendo la clonaci6n de cDNA de IL-4 y la determinaci6n de las secuencias de aminoacidos codificadas y nucleotfdicas. Veanse Yokota et a/., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5894; Noma et a/., 1986, Nature 319:640; Grabstein et a/., 1986, J. Exp. Med. 163:1405 y la patente estadounidense 5,017,691.
La IL-4 se une a receptores particulares de la superficie celular, lo cual resulta en la transducci6n de una senal
20 biol6gica a celulas tales como celulas efectoras inmunitarias. Los receptores de IL-4 se describen, y la informaci6n sobre DNA y secuencia de aminoacidos se presenta, en Mosley et a/., 1989, Cell 59:335-48, (IL-4R murina); Idzerda et a/, 1990, J. Exp. Med. 171:861-73, (IL-4R humana); y en la patente estadounidense 5,599,905. El receptor de IL-4 descrito en estas publicaciones algunas veces se denomina IL-4R alfa.
Se han publicado otras protefnas asociadas con IL-4R alfa en algunos tipos de celulas, y que son componentes de
25 complejos receptores de IL-4to de multi-subunidades. Una de dichas subunidades es IL-2R gamma, tambien conocida como 1L-2R gamma c. Vease el analisis de complejos IL-4R en Sato et a/., 1994, Current Opinion in Cell Biology, 6:174-79. Tambien se ha publicado que IL-4R alfa es un componente de ciertos complejos receptores de IL13 de multi-subunidades. Venase Zurawski et a/., 1995, J. Biol. Chem. 270:13869; de Vries, 1998, J. Allergy Clin. Immunol. 102:165; y Callard et a/., 1996, Immunology Today, 17:108.
30 Se ha implicado a IL-4 en una serie de trastornos, cuyos ejemplos son alergia y asma.
SUMARIO DE LA INVENCION
La presente invenci6n provee metodos y composiciones relacionados con nuevos antagonistas de IL-4R, que son anticuerpos y derivados de anticuerpos, que se unen a IL-4R alfa. La presente invenci6n proporciona un anticuerpo aislado que se une al receptor de IL-4, comprendiendo un dominio variable de cadena ligera, en donde
35 a. la cadena ligera CDR1 comprende los residuos 24-35 de SEC ID NO:6 y
b.
la cadena ligera CDR2 comprende los residuos 51-57 de SEC ID NO:6, y
c.
la cadena ligera CDR3 comprende los residuos 90-99 de SEC ID NO:6.; y
un dominio variable de la cadena pesada, donde las secuencias de la cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 comprenden los residuos 30 a 35, 49 a 65 y 97 a 104 de SEC ID NO: 16, respectivamente, los residuos 30 a 35, 49 40 a 65 y 97 a 104 de la SEC ID NO: 18, respectivamente, los residuos 30 a 35, 49 a 65 y 97 a 104 de la SEC ID NO: 20, respectivamente, los residuos 30 a 35, 49 a 65 y 97 a 104 de la SEC ID NO: 22, respectivamente, los residuos 30 a 35, 49 a 65 y 97 a 104 de la SEC ID NO: 26, los residuos 30 a 35, 49 a 65 y 97 a 104 de la SEC ID NO:28, respectivamente, los residuos 30 a 35, 49 a 65 y 97 a 104 de la SEC ID NO: 30, respectivamente, los residuos 30 a 35, 49 a 65 y 97 a 104 de la SEC ID NO: 32, respectivamente, los residuos 30 a 35, 49 a 65 y 97 a 104 de la SEC ID
45 NO: 34, respectivamente, los residuos 30 a 35, 49 a 65 y 97 a 104 de la SEC ID NO: 38, respectivamente o los residuos 30 a 35, 49 a 65 y 97 a 104 de la SEC ID NO: 40, respectivamente.
El dominio variable de la cadena pesada puede comprender una secuencia que sea por lo menos 90% identica a una secuencia de SEC ID NO:16. El dominio variable de la cadena pesada puede comprender una secuencia que sea por lo menos 90% identica a una secuencia de SEC ID NO:16 y SEC ID NO:38. En otra realizaci6n, dicho
50 dominio variable de la cadena ligera comprende una secuencia que es la SEC ID NO:6, y dicho dominio variable de la cadena pesada comprende una secuencia que se selecciona del grupo que consiste en la SEC ID NO:16, 18, 20, 22, 26, 28, 30, 32, 34, 38 o 40.
En otro aspecto, la presente invenci6n provee un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en L2H1, L2H4, L2H12, L2H13, L2H2, L2H3, L2H6, L2H7. L2H8, L2H9 y L2H10.
En otro aspecto, la presente invenci6n provee un anticuerpo humano, humanizado o quimerico.
En otro aspecto, la presente invenci6n provee un anticuerpo monoclonal. En otro aspecto, la presente invenci6n provee un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en IgD, IgE, IgM, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4 y lgG4 que tiene por lo menos una mutaci6n en una regi6n bisagra que alivia una tendencia a formar un anticuerpo de enlace disulfuro intra-catenario H.
En otro aspecto, la presente invenci6n provee un polipeptido aislado que comprende una porci6n de uni6n al receptor de IL -4 de un anticuerpo de la invenci6n, donde dicho polipeptido comprende un Fab, F(ab')2, scFv, diacuerpo, triacuerpo o tetracuerpo.
En otro aspecto, la presente invenci6n provee un acido nucleico aislado que comprende una secuencia nucleotfdica que codifica la cadena ligera de un anticuerpo de la invenci6n, la cadena pesada de un anticuerpo de la invenci6n o un polipeptido de la invenci6n. El acido nucleico puede comprender la secuencia de SEC ID NO:5.
En otro aspecto, la presente invenci6n provee un vector que comprende un acido nucleico aislado de la invenci6n. En otra realizaci6n, dicho vector es un vector de expresi6n.
En otro aspecto, la presente invenci6n provee una celula aislada que comprende un acido nucleico de la invenci6n. En una realizaci6n, dicha celula es un hibridoma. En otra realizaci6n, dicha celula es una celula transgenica.
En otro aspecto, la presente invenci6n provee una celula que comprende un anticuerpo de la invenci6n. En una realizaci6n, dicha celula es un hibridoma. En otra realizaci6n, dicha celula es una celula transgenica.
En otro aspecto, la presente invenci6n provee una celula que comprende un polipeptido de la invenci6n. En una realizaci6n, dicha celula es una celula transgenica.
En otro aspecto, la presente invenci6n provee un metodo para preparar un anticuerpo de la invenci6n, que comprende incubar una celula que comprende un acido nucleico que codifica la cadena ligera de dicho anticuerpo y un acido nucleico que codifica la cadena pesada de dicho anticuerpo bajo condiciones que permiten que dicha celula exprese dicha cadena ligera y dicha cadena pesada, y que permiten que dicha cadena ligera y dicha cadena pesada se ensamblen en dicho anticuerpo, y aislar dicho anticuerpo de dicha celula. En una realizaci6n, dicha celula es un hibridoma. En otra realizaci6n, dicha celula es una celula transgenica.
En otro aspecto, la presente invenci6n provee un metodo in vitro para inhibir un receptor de IL-4, que comprende contactar una celula que expresa el receptor de IL-4 alfa con un anticuerpo de la invenci6n o un polipeptido de la invenci6n bajo condiciones que permiten que dicho anticuerpo o dicho polipeptido se una a dicho receptor de IL-4 alfa. En una realizaci6n, dicha celula es una celula humana.
En otro aspecto, la presente invenci6n provee el anticuerpo de la invenci6n o un polipeptido de la invenci6n para uso en medicina o para uso en el tratamiento de una afecci6n inflamatoria o cancerosa. En otra realizaci6n, dicha afecci6n inflamatoria o cancerosa es una afecci6n inmunol6gica. En otra realizaci6n, dicha afecci6n es asma, artritis septicemica, dermatitis herpetiforme, urticaria idiopatica cr6nica, colitis ulcerosa, esclerodermia, cicatrizaci6n hipertr6fica, enfermedad de Whipple, hiperplasia prostatica benigna, un trastorno pulmonar en el que el receptor de IL-4 desempena una funci6n, afecci6n en la que la ruptura de la barrera epitelial mediada por el receptor de IL-4 desempena una funci6n, un trastorno del sistema digestivo en el que el receptor de IL-4 desempena una funci6n, una reacci6n alergica a una medicaci6n, enfermedad de Kawasaki, anemia drepanocftica, sfndrome de Churg-Strauss, enfermedad de Grave, preclampsia, sfndrome de Sjogren, sfndrome linfoproliferativo autoinmunitario, anemia hemolftica autoinmunitaria, es6fago de Barrett, uveftis autoinmunitaria, tuberculosis, fibrosis qufstica, micosis broncopulmonar alergica, enfermedad pulmonar obstructiva cr6nica, fibrosis y neumopatfa inducida por bleomicina, fibrosis pulmonar inducida por radiaci6n, proteinosis alveolar pulmonar, sfndrome de dificultad respiratoria aguda, sarcoidosis, sfndrome de hiper IgE, sfndrome hipereosinofflico idiopatico, enfermedad ampollosa autoinmunitaria, penfigo vulgar, penfigo bulloso, miastenia grave, sfndrome de fatiga cr6nica o nefrosis.
En otro aspecto, la presente invenci6n provee una composici6n farmaceutica que comprende un anticuerpo de la invenci6n o un polipeptido de la invenci6n y un excipiente, diluyente o tamp6n. La invenci6n tambien provee el uso de un anticuerpo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o un polipeptido de la invenci6n, en la elaboraci6n de un medicamento para tratar una afecci6n inflamatoria o cancerosa.
Tambien se provee el uso de un anticuerpo o un polipeptido de la invenci6n, donde dicha afecci6n es asma, artritis septicemica, dermatitis herpetiforme, urticaria idiopatica cr6nica, colitis ulcerosa, esclerodermia, cicatrizaci6n hipertr6fica, enfermedad de Whipple, hiperplasia prostatica benigna, un trastorno pulmonar en el que el receptor de IL-4 desempena una funci6n, afecci6n en la que la ruptura de la barrera epitelial mediada por el receptor de IL-4 desempena una funci6n, un trastorno del sistema digestivo en el que el receptor de IL-4 desempena una funci6n, una reacci6n alergica a una medicaci6n, enfermedad de Kawasaki, anemia drepanocftica, sfndrome de Churg-Strauss, enfermedad de Grave, preclampsia, sfndrome de Sjogren, sfndrome linfoproliferativo autoinmunitario,
anemia hemolftica autoinmunitaria, es6fago de Barrett, uveftis autoinmunitaria, tuberculosis, fibrosis qufstica, micosis broncopulmonar alergica, enfermedad pulmonar obstructiva cr6nica, fibrosis y neumopatfa inducida por bleomicina, fibrosis pulmonar inducida por radiaci6n, proteinosis alveolar pulmonar, sfndrome de dificultad respiratoria aguda, sarcoidosis, sfndrome de hiper IgE, sfndrome de hipereosinofflico idiopatico, una enfermedad ampollosa autoinmunitaria, penfigo vulgar, penfigo bulloso, miastenia grave, sfndrome de fatiga cr6nica o nefrosis.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
Las Figuras 1A-C presentan la secuencia nucleotfdica de la regi6n codificante de un cDNA del receptor de IL-4 humana alfa. La secuencia de aminoacidos codificada por el cDNA tambien se presenta. Se aisl6 el clon de cDNA de una genoteca de cDNA derivada de una lfnea de celulas T humana, T22. La protefna codificada comprende (del termino N al C) un peptido de senal N-terminal, seguido por un dominio extracelular, una regi6n transmembrana (subrayada) y un dominio citoplasmico, como se analiza adicionalmente en la publicaci6n PCT WO 01/92340 A3. La secuencia nucleotfdica y las secuencias de aminoacidos de las Figuras 1A a 1C tambien se presentan en las SEC ID NO:1 y 2, respectivamente.
Las Figuras 2A-2D presentan secuencias de polinucle6tidos que codifican las regiones variables de la cadena ligera de L1 (SEC ID NO:3), L2 (SEC ID NO:5), L3, (SEC ID NO:7), L4 (SEC ID NO:9), L5 (SEC ID NO:11) y L6 (SEC ID NO:13), y secuencias de polinucle6tidos que codifican las regiones variables de la cadena pesada de H1 (SEC ID NO:15), H2 (SEC ID NO:17), H3 (SEC ID NO:19), H4 (SEC ID NO;21), H5 (SEC ID NO:23), H6 (SEC ID NO:25), H7 (SEC ID NO:27), H8 (SEC ID NO:29), H9 (SEC ID NO:31), H10 (SEC ID NO:33), H11 (SEC ID NO:35), H12 (SEC ID NO:37), H13 (SEC ID NO:39), H14 (SEC ID NO:41), H15 (SEC ID NO:43), H16 (SEC ID NO:45), H17 (SEC ID NO:47), H18 (SEC ID NO:49), H19 (SEC ID NO:51), H20 (SEC ID NO:53), H21 (SEC ID NO:55), H22 (SEC ID NO:57), H23 (SEC ID NO:59) y H24 (SEC ID NO:61). Las secuencias se muestran usando abreviaturas de los nucle6tidos de una sola letra. Las secuencias correspondientes a las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 se indican en negrita para cada secuencia y subrayadas en L1 y H1. Las secuencias correspondientes a FR1, FR2, FR3 y FR4 se muestran en tipo simple.
La Figura 3 presenta las secuencias de aminoacidos de las regiones variables de la cadena ligera de L1 (SEC ID NO:4), L2 (SEC ID NO:6), L3, (SEC ID NO:8), L4 (SEC ID NO:10), L5 (SEC ID NO:12) y L6 (SEC ID NO:14), y las secuencias de aminoacidos de las regiones variables de la cadena pesada de H1 (SEC ID NO:16), H2 (SEC ID NO:18), H3 (SEC ID NO:20), H4 (SEC ID NO:22), H5 (SEC ID NO:24), H6 (SEC ID NO:26), H7 (SEC ID NO:28), H8 (SEC ID NO:30), H9 (SEC ID NO:32), H10 (SEC ID NO:34), H11 (SEC ID NO:36), H12 (SEC ID NO:38), H13 (SEC ID NO:40), H14 (SEC ID NO:42), H15 (SEC ID NO:44), H16 (SEC ID NO:46), H17 (SEC ID NO:48), H18 (SEC ID NO:50), H19 (SEC ID NO:52), H20 (SEC ID NO:54), H21 (SEC ID NO:56), H22 (SEC ID NO:58), H23 (SEC ID NO:60) y H24 (SEC ID NO:62). Las secuencias de las regiones variables L1 y H1 se muestran usando abreviaturas de los aminoacidos de una sola letra. Otras secuencias variables de la cadena ligera y de la cadena pesada se indican con guiones en los residuos en los que son identicas a L1 o H1, y con la abreviatura del aminoacido de una sola letra apropiado donde difieren de L1 o H1. Las secuencias correspondientes a las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 se muestran en negrita para cada secuencia y subrayadas en L1 y H1. Las secuencias correspondientes a FR1, FR2, FR3 y FR4 se muestran en tipo simple.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
La presente invenci6n provee composiciones y metodos que se refieren a anticuerpos del receptor anti-IL-4 (1L-4R), incluyendo metodos para tratar determinadas afecciones mediadas por IL-4R, y para inhibir actividades biol6gicas de interleucina 4 (IL-4) e interleucina 13 (IL-13) in vivo. Las composiciones de la invenci6n incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti-IL-4R, polipeptidos, polinucle6tidos, celulas que comprenden o expresan anticuerpos, polipeptidos o polinucle6tidos de la invenci6n, y composiciones farmaceuticas, cuyos ejemplos se proveen a continuaci6n.
Las secuencias de polinucle6tidos y polipeptidos se indican usando abreviaturas estandar de una o tres letras. A menos que se indique otra cosa, las secuencias de polipeptidos tienen sus terminos amino a la izquierda y sus terminos carboxi a la derecha, y las secuencias de acidos nucleicos monocatenarias y la cadena superior de de las secuencias de acido nucleico bicatenarias tienen sus terminos 5' a la izquierda y sus terminos 3' a la derecha. Una secuencia de polipeptidos o polinucle6tidos particular tambien puede describirse explicando c6mo difiere de una secuencia de referencia. Por ejemplo, la frase "una secuencia de polipeptidos que difiere de la SEC ID NO:4 en S28T" describe una secuencia de polipeptidos que es identica a la SEC ID NO:4, excepto que el residuo serina en la posici6n 28 de la SEC ID NO:4 se reemplaza por un residuo treonina.
Las secuencias de polinucle6tidos y polipeptidos de regiones variables de la cadena ligera y pesada particulares se muestran en las Figuras 2 y 3, respectivamente, donde estan marcadas, por ejemplo, L1 ("regi6n variable de la cadena ligera 1"), H1 ("regi6n variable de la cadena pesada 1"), etc. Los anticuerpos que comprenden una cadena ligera y una cadena pesada de la Figura 3 se indican combinando el nombre de la cadena ligera y el nombre de las regiones variables de la cadena pesada. Por ejemplo, "L4H7," indica un anticuerpo que comprende la secuencia variable de la cadena ligera de L4 y la secuencia variable de la cadena pesada de H7.
"Dominio (o regi6n) variable de la cadena ligera", "domino (o regi6n) variable de la cadena pesada", CDR1, 2 y 3" y "FR1, 2, 3 y 4" se definen de acuerdo con el esquema de Kabat et a/, en Sequences of Proteins of Immuno/ogica/ interest, 5ta Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, num. publicaci6n NIH 91-3242,1991.
El "porcentaje de identidad" de dos secuencias de polinucle6tidos o polipeptidos se determina comparando las secuencias usando el programa de ordenador GAP (una parte del paquete GCG Wisconsin, versi6n 10.3 (Accelrys, San Diego, CA)) utilizando sus parametros por defecto.
Una molecula biol6gica (p. ej., un polipeptido, anticuerpo o acido nucleico) esta "aislada" o "sustancialmente purificada" si esta lo suficientemente libre de otras moleculas biol6gicas, sedimentos celulares y otras sustancias que se van a utilizar en protocolos de laboratorio convencionales (p. ej., un ensayo de uni6n o hibridaci6n). Los metodos para purificar sustancialmente polipeptidos, anticuerpos y acidos nucleicos se conocen en la tecnica.
Los terminos "peptido," "polipeptido" y "protefna" se utilizan de manera intercambiable en toda la memoria y se refieren a una molecula que comprende dos o mas residuos de aminoacidos unidos entre sf por enlaces peptfdicos.
Los terminos y expresiones "polinucle6tido," "oligonucle6tido" y "acido nucleico" se utilizan intercambiablemente en toda la memoria e incluyen moleculas de DNA (p. ej., cDNA o DNA gen6mico), moleculas de RNA (p. ej., mRNA), analogos del DNA o RNA generado usando analogos de nucle6tidos (p. ej., acidos nucleicos de peptidos y analogos de nucle6tidos no naturales) y sus hfbridos. La molecula de acido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria. En una realizaci6n, las moleculas de acido nucleico de la invenci6n comprenden un marco de lectura abierto que codifica un anticuerpo su un fragmento, derivado, lutefna o variante de la invenci6n.
Dos moleculas de acido nucleico monocatenarias son "el complemento" una de la otra, si sus secuencias pueden alinearse en una orientaci6n anti-paralela de modo tal que cada nucle6tido en una secuencia es opuesto a su nucle6tido complementario en la otra secuencia, sin la introducci6n de espacios y sin nucle6tidos no aparejados en el extremo 5' o 3' de cualquiera de las secuencias. Una molecula de acido nucleico que es "complementaria" a una secuencia de nucle6tidos determinada es una que es lo suficientemente complementaria a la secuencia de nucle6tidos determinada como para poder hibridarse bajo condiciones moderadamente rigurosas a la secuencia de nucle6tidos determinada. Por lo tanto, un acido nucleico puede ser complementario a otro acido nucleico sin ser su complemento.
Un "vector" es un acido nucleico que se puede utilizar para introducir otro acido nucleico unido a este en una celula. Un tipo de vector es un "plasmido", que se refiere a una molecula de DNA bicatenaria lineal o circular en la cual se pueden ligar segmentos de acido nucleico adicional. Otro tipo de vector es un vector vfrico (p. ej, retrovirus, adenovirus y virus adeno-asociados defectuosos de replicaci6n), donde se pueden introducir segmentos de DNA adicionales en el genoma vfrico. Ciertos vectores son capaces de replicaci6n aut6noma en una celula hospedante en la que se introducen (p. ej., vectores bacterianos que comprenden un origen bacteriano de replicaci6n y vectores mamfferos episomales). Otros vectores (p. ej., vectores mamfferos no episomales) se integran al genoma de una celula hospedante tras la introducci6n en la celula hospedante, y asf se replican junto con el genoma hospedante. Un "vector de expresi6n" es un tipo de vector que puede dirigir la expresi6n de un polinucle6tido seleccionado.
Una secuencia de nucle6tidos esta "operativamente unida" a una secuencia reguladora, si la secuencia reguladora afecta la expresi6n (p. ej., el nivel, el tiempo o la ubicaci6n de expresi6n) de la secuencia nucleotfdica. Una "secuencia reguladora" es un acido nucleico que afecta la expresi6n (p. ej., el nivel, el tiempo o la ubicaci6n de expresi6n) de un acido nucleico. La secuencia reguladora puede, por ejemplo, ejercer sus efectos directamente sobre el acido nucleico regulado, o a traves de la acci6n de uno o mas polipeptidos (p. ej. polipeptidos que se unen a la secuencia reguladora y/o al acido nucleico). Los ejemplos de secuencias reguladoras incluyen promotores, potenciadores y otros elementos de control de expresi6n (p. ej., senales de poliadenilaci6n). Otros ejemplos de secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA y Baron et a/., 1995, Nucleic Acids Res. 23:3605-06.
Una "celula hospedante" es una celula que puede utilizarse para expresar un acido nucleico, p. ej., un acido nucleico de la invenci6n. Una celula hospedante puede ser una procariota, por ejemplo, E. co/i, o puede ser una eucariota, por ejemplo, una eucariota unicelular (p. ej., una levadura u otro hongo), una celula vegetal (p. ej., una celula de tabaco o tomate), una celula animal (p. ej., una celula humana, una celula de mono, una celula de hamster, una celula de rata, una celula de rat6n o una celula de insecto), o un hibridoma. Los ejemplos de celulas hospedantes incluyen la lfnea COS-7 de celulas de rin6n de mono (ATCC CRL 1651) (vease Gluzman et a/., 1981, Cell 23:175), celulas L, celulas C127, celulas 3T3 (ATCC CCL 163), celulas de ovario de hamster chino (CHO) o sus derivados tales como Veggie CHO y lfneas celulares relacionadas que crecen en medios libres de suero (vease Rasmussen et at., 1998, Cytotechnology 28:31) o la cepa de CHO DX-B11, deficiente de DHFR (vease Urlaub et a/., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-20), celulas HeLa, lfneas celulares BHK (ATCC CRL 10), la lfnea celular CV1/EBNA derivada de la lfnea celular de rin6n de mono verde africano CV1 (ATCC CCL 70) (vease McMahan et a/., 1991, EMBO J. 10:2821), celulas renales de embri6n humano tales como 293, 293 EBNA o MSR 293, celulas epidermicas humanas A431, celulas Colo205 humanas, otras lfneas celulares de primates transformadas, celulas diploides normales, cepas celulares derivadas en cultivo in vitro de tejido primario, explantes primarios, celulas HL-60, U937, HaK o Jurkat. Tfpicamente, una celula hospedante es una celula cultivada que puede transformarse o transfectarse con un acido nucleico que codifica un polipeptido, que puede luego expresarse en la celula hospedante. La frase
"celula hospedante recombinante" se puede utilizar para indicar una celula hospedante que se ha transformado o transfectado con un acido nucleico a expresar. Una celula hospedante puede ser tambien una celula que comprende el acido nucleico pero que no lo expresa en un nivel deseado, a menos que se introduzca una secuencia reguladora en la celula hospedante, de modo tal que se torna operativamente unida con el acido nucleico. Se ha de entender que la expresi6n celula hospedante se refiere no solamente a la celula en cuesti6n particular sino tambien a la descendencia o descendencia potencial de dicha celula. Ya que pueden ocurrir ciertas modificaciones en generaciones futuras debido o bien a mutaci6n o a influencias ambientales, dicha descendencia puede, de hecho, no ser identica a la celula madre, pero incluso se incluyen dentro del alcance del termino, tal como se emplea en la presente memoria.
Un "anticuerpo quimerico" es un anticuerpo en el que una porci6n de la cadena pesada y/o liviana es identica, hom6loga o derivada de un anticuerpo de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la cadena(s) es/son identica(s), hom6loga(s) o deriva/n de un anticuerpo(s) de otra especie o que pertenece/n a otra clase o subclase de anticuerpo. Tambien se incluyen fragmentos de dichos anticuerpos que exhiben la actividad biol6gica deseada (es decir, la capacidad de unirse especfficamente al receptor de IL-4). Veanse la patente estadounidense num. 4,816,567 y Morrison, 1985, Science 229:1202-07.
Un "anticuerpo injertado con CDR" es un anticuerpo que comprende una o mas CDR derivadas de un anticuerpo de una especie o isotipo particular y el marco de otro anticuerpo de la misma especie o isotipo o de una especie o isotipo diferente.
Un "anticuerpo multiespecffico" es un anticuerpo que reconoce mas de un epftopo en uno o mas antfgenos. Una subclase de este tipo de anticuerpo es un "anticuerpo bi-especffico" que reconoce dos epftopos distintos en los mismos antfgenos o en antfgenos diferentes.
Una "variante" de un polipeptido (p. ej., un anticuerpo) comprende una secuencia de aminoacidos donde uno o mas residuos de aminoacidos se insertan, eliminan y/o sustituyen en la secuencia de aminoacidos relativa a otra secuencia de polipeptidos. Las variantes de la invenci6n incluyen protefnas de fusi6n.
Un "derivado" de un polipeptido es un polipeptido (p. ej., un anticuerpo) que ha sido qufmicamente modificado en algun modo distinto de las variantes de inserci6n, eliminaci6n o sustituci6n, p. ej., mediante conjugaci6n u otro resto qufmico. A menos que se indique otra cosa, el termino "anticuerpo" incluye, ademas de los anticuerpos que comprenden dos cadenas pesadas de longitud total y dos cadenas ligeras de longitud total, sus derivados, variantes, fragmentos y mutefnas, cuyos ejemplos se describen a continuaci6n.
Una molecula (p. ej., un anticuerpo) "se une especfficamente al receptor de IL-4", si se une al receptor de IL-4, o su fragmento, con por lo menos una afinidad 10 veces mayor que cuando se une la molecula a un polipeptido no relacionado con el receptor de IL-4.
Un "dominio de uni6n al antfgeno" o "regi6n de uni6n al antfgeno" es la porci6n de una molecula de anticuerpo que contiene los residuos de aminoacidos (u otros restos) que interactuan con un antfgeno y confieren al anticuerpo su especificidad y afinidad hacia el antfgeno.
Un "epftopo" es la porci6n de una molecula que esta unida por un anticuerpo. Un epftopo puede comprender porciones no contiguas de la molecula (p. ej., en un polipeptido, residuos de aminoacidos que no son contiguos unos con otros en la secuencia de polipeptidos pero que, juntos en el contexto de la molecula, estan unidos por un anticuerpo.
Indicaciones
En un aspecto, la presente invenci6n provee metodos para tratar, prevenir, curar, aliviar o atenuar una enfermedad, trastorno, afecci6n o padecimiento. Entre las afecciones que se pueden tratar de acuerdo con la presente invenci6n se encuentran asma, artritis septicemica/reactiva, dermatitis herpetiforme, urticaria idiopatica cr6nica, esclerodermia, cicatrizaci6n hipertr6fica, enfermedad de Whipple, hiperplasia prostatica benigna, trastornos pulmonares en los que la IL-4 desempena una funci6n, afecciones en las que la ruptura de la barrera epitelial inducida por IL-4 desempena una funci6n, trastornos del sistema digestivo en los que la IL-4 desempena una funci6n, incluyendo enfermedad inflamatoria de los intestinos y otras afecciones inflamatorias del tubo digestivo, reacciones alergicas a la medicaci6n, enfermedad de Kawasaki, anemia drepanocftica (que incluye crisis drepanocftica), sfndrome de Churg-Strauss, enfermedad de Grave, preclampsia, sfndrome de Sjogren, sfndrome linfoproliferativo inmunitario, anemia hemolftica autoinmunitaria, es6fago de Barrett, uveftis autoinmunitaria, tuberculosis y nefrosis, como se describe en mas detalle a continuaci6n. Los antagonistas de IL-4R tambien son utiles como adyuvantes para inmunoterapia por alergia y como adyuvantes de vacunas.
Los ejemplos de anticuerpos adecuados para tratar estas afecciones se describen a continuaci6n e incluyen, p. ej., anticuerpos que se unen a IL-4R e inhiben allf la uni6n de IL-4. Los anticuerpos particularmente utiles tambien inhiben la uni6n de IL-13 al receptor de IL-13 (IL-13R). Las realizaciones particulares de la invenci6n incluyen nuevos anticuerpos y derivados de anticuerpos, fragmentos, mutefnas y variantes, polipeptidos, moleculas de acido
nucleico, celulas, metodos para elaborar lo precedente, metodos para inhibir IL-4Ra y metodos para tratar a un sujeto, cuyos ejemplos se describen en lo sucesivo.
En un aspecto, la presente invenci6n provee metodos que comprenden administrar un anticuerpo anti-IL-4Ra a un sujeto. En una realizaci6n, el sujeto esta afectado por, o conlleva riesgo de padecer, una afecci6n(incluyendo, p. ej., una enfermedad, infecci6n, lesi6n, patologfa o trastorno) causada, mediada, potenciada, exacerbada o afectada, directa o indirectamente, por la actividad de lL-4Ra. Dichas afecciones incluyen, por ejemplo, afecciones causadas, inducidas, mediadas, potenciadas, exacerbadas, afectadas, directa o indirectamente, por IL-4 y/o IL-13. Otros factores o citocinas tambien pueden desempenar una funci6n en dichas afecciones.
Las actividades biol6gicas de IL-4 son mediadas a traves de la uni6n a los receptores de la superficie celular especfficos, denominados receptores de interleucina 4 (IL-4R). Las afecciones inducidas por IL-4 incluyen aquellas que surgen de las respuestas biol6gicas que resultan de la uni6n de IL-4 a un receptor de IL-4 nativo en una celula,
o que pueden inhibirse o suprimirse evitando que la IL-4 se una a un receptor de IL-4. Las afecciones que se pueden tratar incluyen, aunque sin limitarse a ello, trastornos medicos caracterizados por expresi6n anormal de IL-4 o de uno
o mas componentes de un IL-4R o IL-13R (incluyendo, por ejemplo, expresi6n excesiva o expresi6n deficiente en un tejido o tipo de celula particular, o expresi6n deficiente en una etapa del desarrollo particular), o por una respuesta anormal del hospedante a la producci6n de IL-4. Otros ejemplos son afecciones en las que la producci6n, proliferaci6n o flujo del anticuerpo inducido por IL-4 de un tipo de celula particular desempena una funci6n. Los trastornos inducidos por IL-4 incluyen aquellos en los que la IL-4 induce el aumento de los receptores de IL-4 o aumenta la producci6n de otra protefna que desempena una funci6n en una enfermedad (p. ej., otra citocina).
Un metodo para tratar a un mamffero, incluyendo un sujeto humano, que padece dicho trastorno medico, comprende administrar un anticuerpo anti-IL-4R, o su derivado, al mamffero o de lo contrario poner en contacto un IL-4R del mamffero con el anticuerpo o derivado, p. ej., en un procedimiento ex vivo. Las afecciones que se pueden tratar de acuerdo con la presente invenci6n se describen, por ejemplo, en el documento USSN 09/847,816, presentado el 1 de mayo de 2001, cuya descripci6n relevante se incorpora a la presente memoria por referencia. Dichas afecciones incluyen, aunque sin limitarse a ello, asma, artritis septicemica/reactiva, dermatitis herpetiforme, urticaria (especialmente urticaria idiopatica cr6nica), ulceras, inflamaci6n gastrica, inflamaci6n de las mucosas, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria de los intestinos, otros trastornos del sistema digestivo en los que la IL-4 desempena una funci6n (p. ej., inflamaci6n inducida por IL-4 de parte del tubo digestivo), afecciones en las que la ruptura de la barrera inducida por IL-4 desempena una funci6n (p. ej., afecciones caracterizadas por una disminuci6n del funcionamiento de la barrera epitelial en el pulm6n o el tubo digestivo), esclerodermia, cicatrizaci6n hipertr6fica, enfermedad de Whipple, hiperplasia prostatica benigna, afecciones pulmonares inducidas por IL-4 (incluyendo aquellas que se mencionan a continuaci6n), reacciones alergicas a la medicaci6n, enfermedad de Kawasaki, anemia o crisis drepanocftica, sfndrome de Churg-Strauss, enfermedad de Grave, preclampsia, sfndrome de Sjogren, sfndrome linfoproliferativo autoinmunitario, anemia hemolftica autoinmunitaria, es6fago de Barrett, uveftis autoinmunitaria, tuberculosis, nefrosis, penfigo vulgar o penfigo bulloso (enfermedades ampollosas autoinmunitarias) y miastenia grave (una enfermedad muscular autoinmunitaria).
Los anticuerpos anti-IL-4R y sus derivados, tambien encuentran utilidad como adyuvantes para inmunoterapia de alergia y como adyuvantes de vacunas. Por consiguiente, un anticuerpo anti-IL-4R puede emplearse como adyuvante en el tratamiento de inmunoterapia de alergia. El anticuerpo anti-IL-4R tambien es util como adyuvante de vacuna, como los adyuvantes para vacunas anticancer y vacunas antinfecciosas. El uso de adyuvantes de IL-4, especialmente cuando dirigen la respuesta inmunitaria hacia una respuesta TH1, serfa beneficioso en el tratamiento
o la prevenci6n de la enfermedad en cuesti6n.
Artritis septicemica/reactiva
Un anticuerpo anti-IL-4R puede emplearse en el tratamiento de artritis septicemica, tambien conocida como artritis reactiva o artritis bacteriana. La artritis septicemica puede desencadenarse por (consecuente de, o desarrollarse con posterioridad a) infecci6n con microbios tales como Staphy/ococcus aureus, Ch/amydia trachomatis, Yersinia p. ej.,
Y. enteroco/itica, Sa/mone//a, p. ej., S. enteritidis, Shige//a y Campy/obacter. Se ha descrito que S. aureus es un pat6geno humano principal en la artritis septicemica, responsable de la mayorfa de los casos.
Las respuestas Th2 de IL-4 y dependientes de IL-4 desempenan funciones en la promoci6n de artritis septicemica. Puede emplearse un anticuerpo anti-IL-4R de acuerdo con la invenci6n para inhibir la IL-4 y tambien para suprimir la respuesta Th2 en pacientes que padecen artritis septicemica o conllevan riesgo de contraer artritis septicemica.
La IL-4 aumenta la carga del desarrollo bacteriano y la persistencia bacteriana en articulaciones, inhibiendo el aclaramiento de las bacterias. El anticuerpo anti-IL-4R puede emplearse para ayudar en el aclaramiento de las bacterias asociadas con artritis reactiva, reduciendo asf las manifestaciones clfnicas tales como la inflamaci6n de las articulaciones. El anticuerpo anti-IL-4R puede administrarse a un sujeto humano que padece artritis septicemica para reducir la inflamaci6n articular mediada por IL-4. En un planteamiento, se inyecta un antagonista en una articulaci6n,
p. ej., en el lfquido sinovial de la rodilla.
El uso de un anticuerpo anti-IL-4R puede beneficiar a sujetos que padecen (o conllevan riesgo de contraer) artritis septicemica, suprimiendo una respuesta TH2 y promoviendo una respuesta TH1 contra la infecci6n. Las citocinas
TH2 pueden contribuir a la persistencia bacteriana en la articulaci6n, mientras que una respuesta TH1 desempena una funci6n en la eliminaci6n de las bacterias.
El anticuerpo se puede administrar a sujetos infectados con bacterias u otros microbios, tales como aquellos precedentemente mencionados, para prevenir el desarrollo de la artritis septicemica. Se puede administrar un anticuerpo, por ejemplo, despues del diagn6stico de dicha infecci6n, pero antes del desarrollo de los sfntomas clfnicos de artritis septicemica.
Enfermedad de Whipple
Tropheryma whippe/ii es la bacteria causante de la enfermedad de Whipple, tambien conocida como lipodistrofia intestinal e hipofagia granulomatosa. La enfermedad se caracteriza por esteatorrea, linfadenopatfa frecuentemente generalizada, artritis, fiebre y tos. Tambien se refiere, en pacientes con enfermedad de Whipple, a abundancia de macr6fagos "espumosos" en la lamina propia del yeyuno, y los ganglios linfaticos que contienen partfculas positivas de acido pery6dico Schiff aparecen baciliformes en la microscopfa de electrones (Steadman's Medica/ Dictionary, 26ta Edici6n, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 1995).
El uso de un anticuerpo anti-IL-4R puede beneficiar a sujetos que padecen (o conllevan riesgo de padecer) enfermedad de Whipple, restaurando un equilibrio normal entre los componentes TH1 y TH2 de la respuesta inmunitaria del paciente. El aumento de la producci6n de IL-4 (una citocina de tipo TH2) y la disminuci6n de los niveles de determinadas citocinas de tipo TH1 se han asociado con la enfermedad de Whipple. Las citocinas TH2 pueden contribuir a la persistencia bacteriana, mientras que una respuesta TH1 desempena una funci6n en el aclaramiento de las bacterias causales. Los antagonistas de IL-4R pueden administrarse a sujetos infectados con T. whippe/ii, ya sea que el sujeto exhiba o no sfntomas clfnicos de la enfermedad de Whipple.
Dermatitis herpetiforme
La dermatitis herpetiforme, tambien conocida como enfermedad de Duhring, es una afecci6n cr6nica de la piel caracterizada por lesiones ampollosas en la piel, dep6sitos de IgA cutaneos y comez6n. Los pacientes tienen un trastorno de la piel inmunobulloso con enteropatfa sensible al gluten asociada, mediado por una respuesta inmunitaria Th2. El anticuerpo anti-ll -4R se administra de acuerdo con la presente invenci6n para inhibir la IL-4 y la respuesta Th2, promoviendo asf la curaci6n de las lesiones corrientes y reduciendo o previniendo la formaci6n de ampollas en las superficies corporales extensoras.
Cicatrizaci6n hipertr6fica
De acuerdo con la presente invenci6n, el anticuerpo anti-lL-4R se administra a sujetos que tienen, o son susceptibles de desarrollar, cicatrizaci6n hipertr6fica. En un metodo provisto en la presente invenci6n, se administra un anticuerpo anti-IL-4R a un sujeto con una lesi6n por quemadura. Se cree que una respuesta inmunitaria a quemaduras y otras lesiones desempena una funci6n en la patogenia de la cicatrizaci6n hipertr6fica. El aumento de la producci6n de citocinas de tipo TH2, incluyendo IL-4, y la reducci6n de los niveles de ciertas citocinas de tipo TH1, se han descrito en pacientes con quemaduras que padecen cicatrizaci6n hipertr6fica. El uso de anticuerpos anti-IL-4R puede beneficiar a sujetos que presentan (o conllevan riesgo de padecer) cicatrizaci6n hipertr6fica, suprimiendo una respuesta inmunitaria de tipo TH2.
Urticaria
La urticaria, especialmente sus formas cr6nicas tales como urticaria idiopatica cr6nica (CIU), se pueden tratar con un anticuerpo anti-IL-4R de acuerdo con la presente invenci6n. Los pacientes que padecen CIU tienen mayores niveles sericos de IL-4 que los controles, y pueden tener un perfil de citocinas predominantemente de tipo TH2. Los mastocitos y las celulas T de tipo Th2 estan implicados como celulas efectoras primarias en la urticaria cr6nica. La IL-4 estimula la proliferaci6n celular. La desgranulaci6n de los mastocitos conduce a la liberaci6n de histamina, eritema subsiguiente, eosinofilia, enrojecimiento de la piel y comez6n. Los anticuerpos anti-IL-4R se administran para inhibir la IL-4 y reducir la respuesta de tipo TH2, ayudando de este modo a controlar la urticaria del sujeto.
Colitis ulcerosa: otros trastornos del tubo digestivo
La IL-4 esta implicada en la patogenia de la colitis ulcerosa. Las citocinas de tipo Th2, incluyendo IL-4, pueden predominar en la mucosa col6nica de pacientes con este trastorno. El uso de anticuerpos anti-IL-4R para suprimir la respuesta TH2 puede aliviar esta afecci6n.
Ademas de la colitis ulcerosa, otros trastornos del tubo digestivo o del sistema digestivo pueden tratarse con anticuerpos anti-IL-4R. Los ejemplos de dichos trastornos incluyen, aunque sin limitarse a ello, enfermedad inflamatoria de los intestinos (IBD), siendo la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn formas de IBD, gastritis, ulceras e inflamaci6n de las mucosas.
Cualquier afecci6n gastrointestinal en la que la IL-4 desempena una funci6n puede tratarse con un anticuerpo antilL-4R de acuerdo con la presente invenci6n. Por ejemplo, afecciones que implican inflamaci6n inducida por IL-4 de
parte del tubo digestivo pueden tratarse con un anticuerpo anti-IL-4R. Las realizaciones particulares se refieren al tratamiento de afecciones inflamatorias cr6nicas del tubo digestivo.
Otras realizaciones se refieren a afecciones en las que la ruptura de la barrera inducida por IL-4 desempena una funci6n, p. ej., afecciones caracterizadas por una disminuci6n en el funcionamiento de la barrera epitelial en por lo menos una porci6n del tubo digestivo. Dichas afecciones pueden, por ejemplo, implicar dano al epitelio que es inducido por IL-4, directa o indirectamente.
El epitelio intestinal forma una barrera relativamente impermeable entre el lumen y la submucosa. La ruptura de la barrera epitelial se ha asociado con afecciones tales como enfermedad inflamatoria de los intestinos. Vease el analisis en Youakim, A. and M. Ahdieh (Am. J. Physio/. 276 (Gastrointest. Liver Physio/. 39):G1279-G1288,1999), incorporado a la presente memoria por referencia en su totalidad. Una barrera danada o con "fugas" puede permitir que los antfgenos crucen la barrera, que a su vez produce una respuesta inmunitaria que puede causar mas dano al tejido gastrointestinal. Dicha respuesta inmunitaria puede incluir el reclutamiento de neutr6filos o celulas T, por ejemplo. Puede administrarse un anticuerpo anti-IL-para inhibir la estimulaci6n no deseada de una respuesta inmunitaria.
Trastornos pulmonares
Se proveen en al presente memoria metodos para tratar trastornos pulmonares inducidos por IL-4. Dichos trastornos incluyen, aunque sin limitarse a ello, fibrosis pulmonar, incluyendo enfermedad pulmonar fibr6tica cr6nica, oras afecciones caracterizadas por proliferaci6n de fibroblastos o acumulaci6n de colageno en los pulmones inducidas por IL-4, afecciones pulmonares en las que la respuesta inmunitaria de tipo TH2 desempena una funci6n, afecciones caracterizadas por una disminuci6n del funcionamiento de la barrera (p. ej., como consecuencia de dano al epitelio inducido por IL-4) o afecciones en las que la IL-4 desempena una funci6n en una respuesta inflamatoria (p. ej., asma).
La fibrosis qufstica se caracteriza por la producci6n excesiva de moco y el desarrollo de infecciones cr6nicas. La inhibici6n de IL-4 y la respuesta Th2 reduciran la formaci6n de moco y ayudaran a controlar las infecciones tales como aspergilosis broncopulmonar alergica (ABPA).
La micosis broncopulmonar alergica ocurre principalmente en pacientes con fibrosis qufstica o asma, donde una respuesta inmunitaria Th2 es dominante, inhibiendo la IL-4 y la respuesta Th2 se ayudara a aclarar y controlar estas infecciones.
La enfermedad pulmonar obstructiva cr6nica se asocia con hipersecreci6n de moco y fibrosis. Al inhibir la IL-4 y la respuesta Th2 se reducira la producci6n de moco y el desarrollo de fibrosis, mejorando de este modo la funci6n respiratoria y demorando el avance de la enfermedad. La neumopatfa inducida por bleomicina y la fibrosis, y la fibrosis pulmonar inducida por radiaci6n son trastornos caracterizados por fibrosis del pulm6n que se manifiesta por el flujo de Th2, celulas CD4* y macr6fagos, que producen IL-4, que a su vez media el desarrollo de fibrosis. Al inhibir la IL-4 y la respuesta Th2 se reducira o prevendra el desarrollo de estos trastornos.
La proteinosis alveolar pulmonar se caracteriza por la interrupci6n de aclaramiento de tensioactivo. La IL-4 aumenta el producto tensioactivo. El uso de un anticuerpo anti-IL-4R disminuira la producci6n de tensioactivo y disminuira la necesidad de un lavaje total del pulm6n.
El sfndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS) puede ser atribuible a una serie de factores, uno de los cuales es la exposici6n a sustancias qufmicas t6xicas. Una poblaci6n de pacientes susceptible a ARDS consiste en pacientes crfticamente enfermos que deben hacer uso de ventiladores. ARDS es una complicaci6n frecuente en dichos pacientes. Un tratamiento con anticuerpo anti-IL-4R puede aliviar el ARDS, reduciendo la inflamaci6n y las moleculas de adhesi6n, aunque los metodos para tratar a dichos sujetos de acuerdo con la presente invenci6n no se limitan a un mecanismo de acci6n particular. El anticuerpo anti-IL-4R se puede usar para prevenir o tratar ARDS.
La sarcoidosis se caracteriza por lesiones granulomatosas. El uso del anticuerpo anti-IL-4R para tratar la sarcoidosis, particularmente la sarcoidosis pulmonar, se contempla en la presente invenci6n.
Las afecciones en las que la ruptura de la barrera inducida por IL-4 desempena una funci6n (p. ej., afecciones caracterizadas por una disminuci6n del funcionamiento de la barrera epitelial en el pulm6n) se pueden tratar con anticuerpo anti-IL-4R. El dano a la barrera epitelial en los pulmones puede ser inducido por IL-4 directa o indirectamente. El epitelio en el pulm6n funciona como una barrera selectiva que previene que los contenidos del lumen del pulm6n ingresen en la submucosa. Una barrera danada o con "fugas" permite que los antfgenos crucen la barrera, que a su vez produce una respuesta inmunitaria que puede causar mas dano al tejido del pulm6n. Dicha respuesta inmunitaria puede incluir el reclutamiento de eosin6filo o mastocitos, por ejemplo. Se puede administrar un anticuerpo anti-IL-4R para inhibir dicha estimulaci6n no deseable de una respuesta inmunitaria.
Los anticuerpos anti-IL-4R se pueden emplear para promover la curaci6n del epitelio pulmonar, restaurando asf el funcionamiento de la barrera. El anticuerpo anti-IL-4R se puede emplear para promover la curaci6n del epitelio pulmonar en pacientes asmaticos, por ejemplo. Alternativamente, el antagonista se administra para prop6sitos profilacticos, a fin de prevenir dano inducido por IL-4 al epitelio pulmonar.
Tuberculosis
Una respuesta inmunitaria de tipo TH2 desempena una funci6n, causando dano al tejido (p. ej., necrosis del tejido pulmonar) en pacientes que padecen tuberculosis (TB). Los niveles elevados de IL-4 se asocian con TB. La producci6n de IL-4 puede ser particularmente elevada en tuberculosis cavitaria (es decir, en pacientes con TB que han desarrollado cavidades pulmonares, que pueden ser detectadas/visualizadas por tecnicas tales como radiograffas de t6rax).
Los anticuerpos anti-IL-4R pueden beneficiar a pacientes con TB (especialmente a aquellos con TB cavitaria), suprimiendo una respuesta inmunitaria de tipo TH2. Los metodos para tratar a dichos sujetos de acuerdo con la presente invenci6n no se limitan a un mecanismo de acci6n particular, no obstante. Los anticuerpos anti-IL-4R se administran ventajosamente en una cantidad que restaura el equilibrio deseado entre los componentes TH1 y TH2 de la respuesta inmunitaria, y reduce el dano al tejido inducido por IL-4 en un paciente.
Sfndrome de Chum-Strauss
El sfndrome de Churg-Strauss, una enfermedad tambien conocida como angeftis granulomatosa alergica, se caracteriza por inflamaci6n de los vasos sangufneos en personas con antecedentes de asma o alergia, y por eosinofilia. Se pueden administrar anticuerpos anti-IL-4R para aliviar la inflamaci6n en sujetos que padecen este sfndrome. El uso de anticuerpos anti-IL-4R para suprimir la respuesta inmunitaria de tipo TH2, y para combatir la eosinofilia, beneficiarfa a los sujetos.
Preclampsia
La preclampsia es una toxemia del embarazo avanzado. La afecci6n se caracteriza por un agudo aumento de la presi6n arterial, en general acompanado por edema y albuminuria, durante el tercer trimestre del embarazo.
Las respuestas inmunitarias de tipo TH1 y de tipo TH2 elevadas pueden desempenar una funci6n en la afecci6n. Un metodo provisto por la presente memoria comprende administrar un anticuerpo anti-IL-4R a una mujer embarazada que ha desarrollado preclampsia. El anticuerpo anti-IL-4R se administra en una cantidad, y durante un periodo de tiempo, suficientes para reducir el nivel de IL-4 (o de citocinas de tipo TH2-colectivamente) hasta un nivel que se considere normal durante embarazo. En general, el anticuerpo anti-IL-4R se administra repetidamente durante todo el embarazo.
Esclerodermia
Los anticuerpos anti-IL-4R se administran a sujetos que padecen esclerodermia de acuerdo con la invenci6n. Los anticuerpos reducen la sfntesis de colageno de los fibroblastos inducida por IL-4 en los pacientes. Los anticuerpos se pueden emplear para prevenir o reducir la fibrosis en la piel y en los tejidos pulmonares, como tambien en otros tejidos en los que ocurre la fibrosis en pacientes con esclerodermia, suprimiendo la sfntesis de colageno en dichos tejidos, y tratando la enfermedad pulmonar asociada con esclerodermia.
Hiperplasia prostatica benigna
La hiperplasia prostatica benigna (BPH), tambien conocida como hipertrofia prostatica benigna, se puede tratar con anticuerpos anti-IL-4R. Sin desear estar influenciados por un mecanismo de acci6n particular, la administraci6n de un anticuerpo anti-IL-4R puede beneficiar a un sujeto con BPH, suprimiendo la inflamaci6n inducida por IL-4-o suprimiendo una respuesta inmunitaria de tipo TH2.
Enfermedad de Grave
Los anticuerpos dirigidos contra el receptor de tirotropina desempenan una funci6n importante en la enfermedad de Grave, un trastorno caracterizado por hipertiroidismo. Los estudios de la producci6n de citocinas en pacientes que padecen la enfermedad de Grave indican un desplazamiento hacia una respuesta de citocinas de tipo TH2. El uso de un anticuerpo anti-IL-4R para suprimir la respuesta inmunitaria de tipo TH2, y para suprimir la producci6n de anticuerpos, beneficiarfa a los pacientes con enfermedad de Grave.
Anemia drepanocftica
Los pacientes con anemia drepanocftica tfpicamente experimentan periodos intermitentes de exacerbaci6n aguda denominados crisis, donde las crisis se categorizan como anemicas o vaso-oclusivas. Los anticuerpos anti-IL-4R son utiles en el tratamiento o la prevenci6n de crisis drepanocfticas, especialmente en sujetos con niveles elevados de IL-4 o en quienes la respuesta inmunitaria se ha desplazado hacia una respuesta de tipo TH2. La anemia drepanocftica (especialmente las crisis drepanocfticas) se ha asociado con un aumento de susceptibilidad a enfermedades infecciosas, incluyendo infecciones bacterianas. La administraci6n de anticuerpos anti-IL-4R a pacientes con anemia drepanocftica puede ayudar al paciente a generar una respuesta inmunitaria contra las enfermedades infecciosas.
Sfndrome de Sjogren
La enfermedad autoinmunitaria conocidas como sfndrome de Sjogren o sfndrome sicca tfpicamente combina sequedad en los ojos y sequedad en la boca con un trastorno de los tejidos conjuntivos, tal como artritis reumatoidea, lupus, esclerodermia o polimiositis. La gran mayorfa de los pacientes son mujeres de mediana edad (o mayores). El sfndrome de Sjogren es una enfermedad inflamatoria de las glandulas (p. ej., las glandulas lagrimales y salivales) y otros tejidos del cuerpo. El sfndrome tfpicamente se asocia con la producci6n de auto-anticuerpos.
Se pueden administrar anticuerpos anti-IL-4R para reducir la respuesta inflamatoria (tal como la inflamaci6n de las glandulas, incluyendo las glandulas lagrimales) en dichos sujetos. Los anticuerpos anti-IL-4R pueden beneficiar a pacientes con el sfndrome de Sjogren, suprimiendo una respuesta inmunitaria de tipo TH2. No obstante, los metodos para tratar a sujetos de acuerdo con la presente invenci6n no se limitan a un mecanismo de acci6n particular.
Sfndrome linfoproliferativo autoinmunitario
Las manifestaciones del sfndrome linfoproliferativo autoinmunitario incluyen linfoproliferaci6n y producci6n de autoanticuerpos. Los pacientes que padecen el sfndrome presentan deficiencia heredada de apoptosls. Los anticuerpos anti-!L-4R pueden beneficiar a sujetos con este sfndrome, suprimiendo una respuesta inmunitaria de tipo TH2. No obstante, los metodos para tratar a dichos sujetos de acuerdo con la presente invenci6n no se limitan a un mecanismo de acci6n particular.
Anemia hemolftica autoinmunitaria
La secreci6n excesiva de IL-4 y una deficiencia de las citocinas de tipo TH1 contribuyen a la patogenia de la anemia hemolftica autoinmunitaria. Los anticuerpos anti-IL-4R se administran de acuerdo con la presente invenci6n para beneficiar a los pacientes, reduciendo la producci6n de autoanticuerpos y restaurando un equilibrio mas normal entre los componentes TH1 y TH2 de la respuesta inmunitaria.
Uveftis autoinmunitaria
La uveftis implica la inflamaci6n de la uvea (se considera que en general incluye el iris, el cuerpo ciliar y coroide, en conjunto). El exceso de secreci6n de IL-4 desempena una funci6n en la patogenia de esta enfermedad ocular inflamatoria que pone en riesgo la visi6n. De acuerdo con la presente invenci6n, se administran los anticuerpos antiIL-4R a un sujeto que padece, o conlleva riesgo de padecer, uveftis. En una realizaci6n, los anticuerpos anti-IL-4R se administran a un individuo que padece uveoretinitis autoinmunitaria.
Enfermedad de Kawasaki
Tambien conocida como sfndrome de ganglios linfaticos mucocutaneos, la enfermedad de Kawasaki (KD) afecta principalmente a ninos pequenos. La enfermedad se caracteriza por cambios particulares en el revestimiento de las membranas mucosas, los labios y la boca, y por ganglios linfaticos agrandados e hipersensibles. Los sfntomas tfpicamente incluyen fiebre, conjuntivitis, inflamaci6n de los labios y las membranas mucosas de la boca, ganglios inflamados en el cuello y eritema que cubre las manos y los pies, conduciendo a una piel endurecida, inflamada y desprendida en las manos y los pies. En ninos con enfermedad de Kawasaki (KD), tambien se puede presentar inflamaci6n de las arterias (vasculitis). Debido al efecto de la enfermedad sobre el sistema vascular, la KD es la causa principal de enfermedad cardiaca adquirida en ninos.
Se pueden administrar anticuerpos anti-IL-4R a sujetos con enfermedad de Kawasaki. La secreci6n excesiva de IL-4 y una deficiencia de citocinas de tipo TH1 contribuyen a la patogenia de la enfermedad.
Es6fago de Barrett
El es6fago de Barrett es una afecci6n caracterizada por la alteraci6n (subsiguiente a irritaci6n) de las celulas del tejido epitelial que recubre la porci6n inferior del es6fago. El reflujo frecuente de los contenidos del est6mago hacia el es6fago, con el transcurso del tiempo, puede conducir a es6fago de Barrett. Los pacientes con es6fago de Barrett presentan riesgo de padecer cancer esofagico (p. ej., adenocarcinoma). Sin desear estar influenciados por un mecanismo de acci6n particular, la administraci6n de un anticuerpo anti-IL-4R puede beneficiar a un sujeto con es6fago de Barrett, suprimiendo una respuesta inmunitaria de tipo TH2. En una realizaci6n, se administra un anticuerpo anti-IL-4R a un sujeto que padece esofagitis, para inhibir el avance a es6fago de Barrett.
Nefrosis
La nefrosis, tambien conocida como sfndrome nefr6tico, es una nefropatfa no inflamatoria y no maligna. En la afecci6n conocida como nefrosis con cambio mfnimo, el dano glomerular (que se cree que surge de cambios estructurales en las celulas epiteliales viscerales glomerulares) produce anormalidades que incluyen proteinuria. Una respuesta inmunitaria de tipo TH2 (especialmente secreci6n de citocinas de tipo TH2, IL-4 e IL-13) desempena una funci6n en la patogenia de nefrosis con cambio mfnimo.
Otras indicaciones
Otros ejemplos de afecciones que pueden tratarse de acuerdo con la presente invenci6n incluyen, aunque sin limitarse a ello, los siguientes. los anticuerpos anti-IL-4R se pueden emplear en el tratamiento o la prevenci6n de sfndrome de hiper IgE, sfndrome hipereosinofflico idiopatico, reacciones alergicas a medicaci6n, enfermedades ampollosas autoinmunitarias (p. ej., penfigo vulgar o penfigo bulloso), miastenia grave (una enfermedad muscular autoinmunitaria) y sfndrome de fatiga cr6nica. Los anticuerpos anti-IL-4R se pueden emplear en el tratamiento de GVHD; los metodos particulares para tratar GVHD en combinaci6n con otros agentes terapeuticos se describen a continuaci6n. Los anticuerpos anti-IL-4R tambien son utiles para tratar o prevenir hepatotoxicidad inducida por farmacos tales como diclofenac (un farmaco antinflamatorio no esteroideo).
Se puede emplear un anticuerpo anti-IL-4R como adyuvante del tratamiento de inmunoterapia para alergia. Los anticuerpos anti-IL-4R tambien son utiles como adyuvantes de vacunas, tales como adyuvantes para vacunas contra el cancer y vacunas antinfecciosas. El uso de los anticuerpos anti-IL-4R es especialmente ventajoso cuando resulta beneficioso favorecer una respuesta inmunitaria de tipo TH1 para prevenir o tratar la afecci6n para la cual se administra la vacuna. Los anticuerpos anti-IL-4R se pueden emplear cuando se desea reducir una respuesta inmunitaria mediada por anticuerpos y/o promover una respuesta inmunitaria mediada por celulas T.
Anticuerpos anti-IL-4R
En un aspecto, la presente invenci6n provee anticuerpos y sus fragmentos, derivados, mutefnas y variantes, que se unen al receptor de IL-4 alfa, p. ej., al receptor de IL-4 humano, alfa.
Los anticuerpos anti-IL-4R que se pueden emplear de acuerdo con la presente invenci6n incluyen anticuerpos que inhiben la actividad biol6gica de IL-4. Los ejemplos de dichas actividades biol6gicas incluyen la asociaci6n con otro componente receptor (p. ej., IL-2R gamma o IL-13R alfa), uni6n (o bien solo o como parte de un complejo receptor multimerico), una molecula de senalizaci6n (p. ej., IL-4 o IL-13) y transducci6n de una senal en respuesta a la uni6n de una molecula de senalizaci6n.
Los diferentes anticuerpos anti-IL-4R pueden unirse a diferentes dominios o epftopos de IL-4R o actuar por diferentes mecanismos de acci6n. Los ejemplos incluyen, aunque sin limitarse a ello, anticuerpos que interfieren con la uni6n de IL-4 a IL-4R o que inhiben la transducci6n de senales. El sitio de acci6n puede ser, por ejemplo, intracelular (p. ej., interfiriendo con una cascada de senalizaci6n intracelular) o extracelular. Un anticuerpo no necesita inhibir completamente una actividad inducida por IL-4 para encontrar utilidad en la presente invenci6n, en cambio, los anticuerpos que reducen una actividad particular de IL-4 se contemplan tambien para uso.
Los analisis anteriormente presentados de mecanismos de acci6n particulares para los anticuerpos anti-IL-4R en el tratamiento de enfermedades particulares son ilustrativos solamente, y los metodos presentados en la presente memoria no se limitan a ello. Los mecanismos de acci6n mediante los cuales los anticuerpos anti-IL-4R alivian las enfermedades no estan limitados a aquellos anteriormente analizados.
Un anticuerpo anti-IL-4R puede inhibir un flujo de celulas mediado por IL-4 implicadas en una respuesta inmunitaria
o inflamatoria. Un anticuerpo puede actuar, por ejemplo, reduciendo la proliferaci6n, activaci6n, migraci6n, flujo o acumulaci6n de un tipo de celula particular, o inhibiendo una respuesta biol6gica directa o indirectamente atribuible a un tipo de celula particular. Los ejemplos de tipos de celulas particulares son fibroblastos, mastocitos y eosin6filos.
Como se analiz6 anteriormente, algunas afecciones pueden tratarse suprimiendo una respuesta inmunitaria de tipo TH2. La IL-4R se asocia con una respuesta TH2, y es una de las citocinas segregadas por los linfocitos T cooperadores de tipo 2 (celulas TH2). Un anticuerpo anti-IL-4R se puede administrar para reducir una respuesta inmunitaria de tipo TH2. Se puede decir que el anticuerpo IL-4R reduce la proliferaci6n de celulas TH2, para suprimir una respuesta TH2, para desplazar la respuesta inmunitaria hacia una respuesta TH1, o para favorecer la respuesta de tipo TH1. Los antagonistas de otra citocina(s) de tipo TH2, como IL-5, IL-10 o IL-13, pueden administrarse adicionalmente a sujetos que tienen un trastorno que implica niveles elevados de dichas citocinas. Las tecnicas para medir la cantidad de dichas citocinas en un sujeto, p. ej., en el suero de un sujeto, se conocen bien.
Una realizaci6n de la invenci6n se refiere a un metodo para inhibir el dano al epitelio inducido por IL-4, que comprende administrar un anticuerpo anti-IL-4R a un sujeto que padece, o conlleva riesgo de padecer, una afecci6n en la que la ruptura de la barrera epitelial mediada por IL-4 desempena una funci6n.
Las realizaciones particulares de los metodos provistos en la presente memoria comprenden administrar un anticuerpo anti-IL-4R para inhibir el dano al epitelio inducido por IL-4 en el tubo digestivo o el pulm6n. Dichos metodos se pueden emplear para prevenir el dano epitelial, o para restaurar el funcionamiento de la barrera epitelial (es decir, promover la reparaci6n o curaci6n del epitelio). La capacidad de un anticuerpo anti-IL-4R de inhibir el dano al epitelio inducido por IL-4 se puede confirmar mediante cualquiera de una serie de ensayos adecuados, tales como aquellos descritos en la presente memoria.
Cualquier inflamaci6n asociada con (o subsiguiente a) una infecci6n puede tambien tratarse con un anticuerpo antiIL-4R. El anticuerpo puede administrarse para inhibir cualquier componente inducido por IL-4 de una respuesta inflamatoria que resulta de una infecci6n microbiana en el tubo digestivo, por ejemplo.
Las combinaciones de dos o mas anticuerpos o derivados de anticuerpos, o de un anticuerpo o derivado de anticuerpo y uno o mas de otros antagonistas de IL-4, IL-13, IL-4R y/o IL-13R (como se describe, por ejemplo, en las patentes estadounidenses 5,599,905, 5,840,869, 5,856,296, 5,767,065, 5,717,072, 6,391,581, 5,710,023, Idzerda et al.,1990, J. Exp. Med. 171:861-73 y Mosley et a/., 1989, Cell 59:335-48, se pueden emplear en los metodos y las composiciones.
Se pueden emplear procedimientos de mutagenesis especffica del sitio dirigida a oligonucle6tidos para proveer un gen alterado que tenga codones particulares alterados de acuerdo con la sustituci6n, eliminaci6n o inserci6n requerida. Los ejemplos de tecnicas para preparar dichas alteraciones se describen en Walder et at., 1986, Gene 42:133; Bauer et a/, 1985, Gene 37:73; Craik, BioTechniques, enero 1985,12-19; Smith et a/., 1981, Genetic Engineering: Princip/es and Methods, Plenum Press, y en las patentes estadounidenses num. 4,518,584 y 4,737,462. Estos y otros metodos se pueden utilizar para elaborar, por ejemplo, derivados de anticuerpos anti-IL-4R que tienen, por ejemplo, mayor afinidad, avidez o especificidad hacia IL-4R en comparaci6n con el anticuerpo no derivatizado.
Otros derivados de anticuerpos antl-IL-4R dentro del alcance de la presente invenci6n pueden incluir conjugados covalentes o agregados de anticuerpos anti-IL-4R o sus fragmentos, con otras protefnas o polipeptidos, tales como por expresi6n de protefnas de fusi6n recombinantes que comprenden polipeptidos heter6logos condensados al termino N o al termino C de un polipeptido de anticuerpos anti-IL-4R. Por ejemplo, el peptido conjugado puede ser un polipeptido de senal heter6loga (o inicial), p. ej., el polipeptido inicial del factor alfa de levadura, o un peptido tal como una marca de epftopo. Las protefnas de fusi6n que contienen el anticuerpo anti-iL-4R pueden comprender peptidos anadidos para facilitar la purificaci6n o identificaci6n del anticuerpo anti-IL-4R (p. ej., poly-His). Un polipeptido del anticuerpo anti-IL-4R tambien puede unirse al peptido FLAG Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) (SEC ID NO:69) como se describe en Hopp et a/., Bio/Techno/ogy 6:1204,1988, y en la patente estadounidense 5,011,912. El peptido FLAG es altamente antigenico y provee un epftopo reversiblemente unido por un anticuerpo monoclonal especffico (mAb), que permite el ensayo rapido y la facil purificaci6n de la protefna recombinante expresada. Los reactivos utiles para preparar protefnas de fusi6n en las que el peptido FLAG se condensa a un polipeptido determinado se comercializan (Sigma, St. Louis, MO).
Los olig6meros que contienen uno o mas polipeptidos de anticuerpo anti-IL-4R se pueden emplear como antagonistas de IL-4R. Los olig6meros pueden tener la forma de dfmeros, trfmeros u olig6meros superiores covalentemente unidos o no covalentemente unidos. Los olig6meros que comprenden dos o mas polipeptidos de anticuerpo anti-IL-4R se contemplan para uso, donde un ejemplo es un homodfmero. Otros olig6meros incluyen heterodfmeros, heterotrfmeros, etc.
Se pueden contemplar olig6meros que comprenden multiples polipeptidos de anticuerpo anti-IL-4R unidos mediante interacciones covalentes o no covalentes entre los restos de peptidos condensados a polipeptidos del anticuerpo anti-IL-4R. Dichos peptidos pueden ser enlazadores (espaciadores) peptfdicos, o peptidos que tienen la propiedad de promover la oligomerizaci6n. cremalleras de leucina y determinados polipeptidos derivados de anticuerpos estan entre los peptidos que pueden promover la oligomerizaci6n de los polipeptidos de IL-4R unidos allf, como se describe en mas detalle a continuaci6n.
En realizaciones particulares, los olig6meros comprenden de dos a cuatro polipetidos de anticuerpo anti-IL-4R. Los restos de anticuerpo anti-IL-4R del olig6mero pueden tener cualquiera de las formas anteriormente descritas, p. ej., variantes o fragmentos. Preferiblemente, los olig6meros comprenden polipeptidos de anticuerpo anti-IL-4R que tienen actividad de uni6n a IL-4R.
Un olig6mero se puede preparar usando polipeptidos derivados de inmunoglobulinas. La preparaci6n de protefnas de fusi6n que comprenden ciertos polipeptidos heter6logos condensados a diversas porciones de polipeptidos derivados de anticuerpos (incluyendo el domino Fc) se han descrito, p. ej., por Ashkenazi et a/., 1991, PNAS USA 88:10535; Byrn et a/., 1990, Nature 344:677; y Hollenbaugh et a/., 1992 "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", en Current Protoco/s in Immuno/ogy, Supl. 4, paginas 10.19.1 -10.19.11.
Se puede contemplar un dfmero que comprende dos protefnas de fusi6n creadas condensando un fragmento de uni6n a IL-4R de un anticuerpo anti-IL-4R a la regi6n Fc de un anticuerpo. El dfmero puede estar hecho, por ejemplo, insertando una fusi6n genica que codifica la protefna de fusi6n en un vector de expresi6n apropiado, que expresa la fusi6n genica en celulas hospedantes transformadas con el vector de expresi6n recombinante, y permite que la protefna de fusi6n expresada se ensamble en gran parte como vector de expresi6n recombinante, y permite que la protefna de fusi6n expresada se ensamble en gran parte como moleculas de anticuerpo, donde se forman los enlaces disulfuro entre cadenas entre los restos Fc para producir el dfmero. La expresi6n "polipeptido Fc", tal como se emplea en la presente memoria, incluye formas nativas y de lutefna de los polipeptidos derivados de la regi6n Fc de un anticuerpo. Tambien se incluyen las formas truncadas de dichos polipeptidos que contienen la regi6n bisagra que promueve la dimerizaci6n. Las protefnas de fusi6n que comprenden restos Fc (y olig6meros formados a partir de allf) ofrecen la ventaja de una facil purificaci6n por cromatograffa de afinidad frente a las columnas de protefna A o protefna G.
Un polipeptido Fc adecuado, descrito en la solicitud PCT WO 93/10151, es un polipeptido monocatenario que se extiende desde la regi6n bisagra N-terminal hacia el termino C nativo de la regi6n Fc de un anticuerpo lgG1 humano.
Otro polipeptido Fc util es la mutefna Fc descrita en la patente estadounidense 5,457,035 y en Baum et a/., 1994, EMBO J. 13:3992-4001. La secuencia de aminoacidos de esta mutefna es identica a aquella de la secuencia Fc nativa presentada en el documento WO 93/10151, excepto que el aminoacido 19 ha sido modificado de Leu a Ala, el aminoacido 20 ha sido modificado de Leu a Glu y el aminoacido 22 ha sido modificado de Gly a Ala. La lutefna exhibe menor afinidad hacia los receptores de Fc.
En otras realizaciones, se puede sustituir la porci6n variable de la cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo por la porci6n variable de las cadenas pesada y/o ligera de un anticuerpo anti-IL-4R.
Alternativamente, el olig6mero es una protefna de fusi6n que comprende multiples polipeptidos del anticuerpo antiIL-4R con o sin enlazadores peptfdicos (peptidos espaciadores). Entre los enlazadores peptfdicos adecuados se encuentran aquellos descritos en las patentes estadounidenses 4,751,180 y 4,935,233.
Otro metodo para preparar derivados de anticuerpo anti-IL-4R oligomericos implica el uso de una cremallera de leucina. Los dominios de cremalleras de leucina son peptidos que promueven la oligomerizaci6n de las protefnas en las que se hallan. Las cremalleras de leucina se identificaron originalmente en varias protefnas de uni6n a DNA (Landschulz et a/., 1988, Science 240:1759), y desde entonces se han hallado en una diversidad de protefnas diferentes. Entre las cremalleras de leucina conocidas se encuentra los peptidos naturales y sus derivados que se dimerizan o trimerizan. Los ejemplos de dominios de cremalleras de leucina adecuados para producir protefnas oligomericas solubles se describen en la solicitud PCT WO 94/10308, y la cremallera de leucina derivada de la protefna D de tensioactivo pulmonar (SPD) se describe en Hoppe et al., 1994, FEBS Letters 344:191, incorporado a la presente por referencia. El uso de una cremallera de leucina modificada que permite la trimerizaci6n estable de una protefna heter6loga condensada allf se describe en Fanslow et a/., 1994, Semin. Immunol. 6:267-78. En un planteamiento, las protefnas de fusi6n recombinantes que comprenden un fragmento o derivado de anticuerpo antiIL-4R condensado a un peptido de cremallera de leucina se expresan en celulas hospedantes adecuadas, y los fragmentos o derivados de anticuerpo anti-IL-4R oligomericos solubles que se forman, se recuperan del sobrenadante de cultivo.
Los polipeptidos de anticuerpo anti-IL-4R y las protefnas de fusi6n descritos se pueden preparar mediante una cantidad de tecnicas convencionales. Por ejemplo, los polipeptidos de anticuerpo anti-IL-4R se pueden purificar de celulas que los expresan naturalmente, o se pueden producir en sistemas de expresi6n recombinante, usando cualquier tecnica conocida en el campo.
Se puede usar cualquier sistema de expresi6n conocido en la tecnica para preparar los polipeptidos recombinantes de la invenci6n. En general, las celulas hospedantes se transforman con un vector de expresi6n recombinante que comprende DNA que codifica un polipeptido de anticuerpo anti-IL-4R deseado. Entre las celulas hospedantes que se pueden emplear se encuentran procariotas, celulas de levadura o eucari6ticas superiores. Las procariotas incluyen organismos gramnegativos o grampositivos, por ejemplo E. co/i o bacilli. Las celulas eucari6ticas superiores incluyen celulas de insectos y lfneas celulares consolidadas de origen mamffero.
Los ejemplos de lfneas celulares hospedantes mamfferas adecuadas incluyen la lfnea COS-7 de celulas de rin6n de mono (ATCC CRL 1651) (Gluzman et a/., 1981, Cell 23:175). celulas L, celulas 293, celulas C127, celulas 3T3 (ATCC CCL 163), celulas de ovario de hamster chino (CHO), celulas HeLa, lfneas celulares BHK (ATCC CRL 10) y la lfnea celular CVI/EBNA derivada de rin6n de mono verde africano CVI (ATCC CCL 70) como se describen en McMahan et a/., 1991, EMBO J. 10: 2821. Los vectores de clonaci6n y expresi6n apropiados para uso con hospedantes celulares bacterianos, fungicos y mamfferos son descritos por et a/. (C/oning Vectors: A Laboratory Manua/, Elsevier, New York, 1985). Las celulas transformadas se cultivan bajo condiciones que promueven la expresi6n del polipeptido de anticuerpo anti-IL-4R, y el polipeptido se recupera por procedimientos de purificaci6n de protefnas convencionales. Uno de dichos procedimientos de purificaci6n incluye el uso de cromatograffa de afinidad,
p. ej., sobre una matriz que tiene todo o una porci6n (p. ej., el dominio extracelular) de IL-4R unida a esta. Los polipeptidos contemplados para uso en la presente memoria incluyen polipeptidos del anticuerpo anti-IL-4R de mamfferos recombinantes sustancialmente homogeneos y polipeptidos de anticuerpo anti-lL-4R sustancialmente libres de materiales end6genos contaminantes.
En un aspecto, la presente invenci6n provee anticuerpos que interfieren con la uni6n de IL-4 a un receptor de IL-4. Dichos anticuerpos, denominados en la presente memoria anticuerpos bloqueantes, se pueden dirigir contra IL-4R, o su fragmento, variante o derivado, y estudiar la capacidad de interferir con la uni6n de IL-4 a los receptores de IL-4 en ensayos convencionales. Los ejemplos de ensayos adecuados son ensayos que ensayan la capacidad de los anticuerpos de inhibir la uni6n de IL-4 a las celulas que expresan IL-4R, o que ensayan la capacidad de los anticuerpos de reducir una respuesta biol6gica o celular que resulta de la uni6n de IL-4 a los receptores de IL-4 de la superficie celular.
Se ha descrito que IL-4R alfa es un componente de ciertos complejos receptores de IL-13 de multi-subunidades (Zurawski et a/., 1995, J. Biol. Chem. 270:13869; de Vries, 1998, J. Allergy Clin. Immunol. 102:165; y Callard et a/., 1996, Immunology Today, 17:108, cada uno incorporado a la presente memoria por referencia). Por consiguiente, en una realizaci6n, se provee un anticuerpo que bloquea la uni6n de IL-4 y tambien de IL-13 a las celulas. Los anticuerpos inhiben la actividad biol6gica inducida por IL-4 y tambien inhiben la actividad inducida por IL-13, y por lo tanto se pueden emplear para tratar afecciones inducidas por una o ambas citocinas. Los ejemplos de dichas
afecciones incluyen, aunque sin limitarse a ello, afecciones mediadas por IgE, asma, afecciones alergicas, rinitis alergica y dermatitis, incluyendo dermatitis at6pica.
Los anticuerpos que se unen a IL-4R alfa se pueden estudiar en diversos ensayos convencionales para determinar si interfieren con la uni6n de IL-13 a complejos receptores de IL-13 que contienen IL-4R. Los anticuerpos se pueden ensayar, por ejemplo, en ensayos de uni6n, o se puede ensayar su capacidad de inhibir una actividad biol6gica inducida por IL-13. Un ejemplo de un ensayo adecuado se ilustra en el Ejemplo 2 a continuaci6n.
Los anticuerpos especfficos para IL-4R alfa se pueden preparar usando cualquier tecnica conocida en el campo. Veanse, por ejemplo, Monoc/ona/ Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Bio/ogica/ Ana/yses, Kennet et a/. (eds.), Plenum Press, New York (1980); y Antibodies: A Laboratory Manua/, Harlow and Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988).
Los fragmentos de anticuerpos de uni6n a antfgenos de la invenci6n se pueden producir por tecnicas convencionales. Los ejemplos de dichos fragmentos incluyen, aunque sin limitarse a ello, fragmentos Fab y F(ab')2. Los fragmentos y derivados de anticuerpos producidos por tecnicas de modificaci6n genetica tambien se contemplan. A menos que se especifique otra cosa, el termino "anticuerpo" y la expresi6n "anticuerpo monoclonal", tal como se emplean en la presente memoria, abarcan tanto anticuerpos enteros como sus fragmentos y/o derivados de uni6n a antfgenos.
Las realizaciones adicionales incluyen anticuerpos quimericos, p. ej., versiones humanizadas de anticuerpos monoclonales murinos. Dichos anticuerpos humanizados se pueden preparar por tecnicas conocidas, y ofrecen la ventaja de menor inmunogenicidad cuando los anticuerpos se administran a seres humanos. En una realizaci6n, un anticuerpo monoclonal humanizado comprende el dominio variable de un anticuerpo murino (o todo o parte de su sitio de uni6n al antfgeno) y un dominio constante derivado de un anticuerpo humano. Alternativamente, un fragmento de anticuerpo humanizado puede comprender el sitio de uni6n a antfgeno de un anticuerpo monoclonal murino y un fragmento de dominio variable (que carece del sitio de uni6n a antfgenos) derivado de un anticuerpo humano. Los procedimientos para la producci6n de anticuerpos monoclonales quimericos y ademas geneticamente modificados incluyen aquellos descritos en Riechmann et a/, 1988, Nature 332:323, Liu et a/, 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84:3439, Larrick et a/., 1989, Biotechnology 7:934, y Winter et a/., 1993, TIPS 14:139. El anticuerpo quimerico puede ser un anticuerpo injertado de CDR.
Se han desarrollado procedimientos para generar anticuerpos humanos o parcialmente humanos en animales no humanos. Por ejemplo, se han preparado ratones en los que uno o mas genes de inmunoglobulina end6gena han sido activados por diversos medios. Se han introducido genes de immunoglobulina humana en los ratones para reemplazar los genes de rat6n inactivados. Los anticuerpos producidos en el animal incorporan cadenas de polipeptidos de inmunoglobulina humana codificadas por el material genetico humano introducido en el animal. Un animal no humano, tal como un rat6n transgenico, se puede inmunizar con un polipeptido de IL-4R, de modo tal que los anticuerpos dirigidos contra el polipeptido de IL-4R se generan en dicho animal. Un ejemplo de un inmun6geno adecuado es una IL-4R soluble humana, tal como un polipeptido que comprende el dominio extracelular de la protefna de SEC ID NO:2, u otro fragmento inmunogenico de la protefna de SEC ID NO:2.
Los ejemplos de tecnicas para producci6n y uso de animales transgenicos de anticuerpos humanos o parcialmente humanos se describen en las patentes estadounidenses 5,814,318, 5,569,825 y 5,545,806.
En otro aspecto, la presente invenci6n provee anticuerpos monoclonales que se unen al receptor de IL-4. Los anticuerpos monoclonales pueden producirse usando cualquier tecnica conocida en la materia, p. ej., inmortalizando celulas de bazo cosechadas del animal transgenico despues de completar el esquema de inmunizaci6n. Las celulas de bazo se pueden inmortalizar usando cualquier tecnica conocida en la materia, p. ej., condensandolas con celulas de mieloma para producir hibridomas. Las celulas de mieloma para uso en los procedimientos de fusi6n para producir hibridomas preferiblemente no producen anticuerpos, tienen alta eficiencia de fusi6n y deficiencias enzimaticas que las tornan incapaces de crecer en ciertos medios selectivos que soportan el crecimiento de las celulas condensadas deseadas unicamente (hibridomas). Los ejemplos de lfneas celulares adecuadas para uso en fusiones de ratones incluyen Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC11, MPC11-X45-GTG 1.7 y S194/5XX0 Bui; los ejemplos de lfneas celulares utilizadas en fusiones de ratas incluyen R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F y 4B210. Otras lfneas celulares utiles para fusiones celulares son U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 y UC729-6.
Una lfnea celular de hibridoma se puede producir inmunizando un animal (p. ej., un animal transgenico que tiene secuencias de inmunoglobulina humana) con un inmun6geno de IL-4R; cosechando las celulas de bazo del animal inmunizado, condensando las celulas de bazo cosechadas a una lfnea celular de mieloma, generando asf celulas de hibridoma, estableciendo lfneas celulares de hibridoma de las celulas de hibridoma e identificando una lfnea celular de hibridoma que produce un anticuerpo que se une a un polipeptido de IL-4R. Dichas lfneas celulares de hibridoma y los anticuerpos monoclonales anti-IL-4R producidos a partir de allf, estan abarcados por la presente invenci6n.
Los anticuerpos monoclonales segregados por una lfnea celular de hibridoma pueden purificarse usando cualquier tecnica conocida en el campo. Los hibridomas o mAbs pueden ademas estudiarse para identificar mAbs con
propiedades particulares, tales como la capacidad de bloquear la actividad inducida por IL-4-y/o IL-13. Los ejemplos de dichos ensayos se proveen en los Ejemplos 2, 3 y 4.
Otros ejemplos de procedimientos para preparar anticuerpos dirigidos contra IL-4 humana (incluyendo anticuerpos monoclonales), ensayos mediante los cuales se identifican los anticuerpos bloqueantes y tecnicas para generar derivados humanizados o geneticamente modificados de anticuerpos anti-IL-4 se describen en las patentes estadounidenses 5,041,381, 5,863,537, 5,928,904 y 5,676,940, incorporadas a la presente memoria por referencia. Otros ejemplos de anticuerpos que se pueden emplear como antagonistas de IL-4 se describen en el documento WO 91/09059, tambien incorporado a la presente memoria por referencia.
En otro aspecto, la presente invenci6n provee anticuerpos humanos que se unen a IL-4R. En una realizaci6n de la invenci6n, los anticuerpos humanos dirigidos contra IL-4R alfa y producidos por tecnicas que implican el uso de ratones transgenicos, bloquean la uni6n de IL-4 y tambien de IL-13 a las celulas. Dichos anticuerpos son antagonistas de IL-4 y ademas funcionan como antagonistas de IL-13.
Los anticuerpos de la invenci6n pueden comprender cualquier regi6n constante conocida en la tecnica. La regi6n constante de cadena ligera puede ser, por ejemplo, una regi6n constante de cadena ligera de tipo kappa o lambda,
p.
ej., una regi6n constante de cadena ligera de tipo kappa o lambda humana. La regi6n constante de cadena pesada puede ser, por ejemplo, una regi6n constante de cadena pesada de tipo alfa-, delta-, epsilon-, gamma o mu,
p.
ej., una regi6n constante de cadena pesada de tipo alfa -, delta-, epsilon-, gamma o mu humana. En una realizaci6n, la regi6n constante de cadena ligera o pesada es un fragmento, derivado, variante o lutefna de una regi6n constante natural.
Los anticuerpos dirigidos contra un IL-4R se pueden utilizar, por ejemplo, en ensayos para detectar la presencia de polipeptidos de IL-4R, o bien in vitro o in vivo. Los anticuerpos pueden tambien emplearse para purificar protefnas IL4R por cromatograffa de inmunoafinidad. Esos anticuerpos que adicionalmente pueden bloquear la uni6n de IL-4 a IL-4R se pueden utilizar para inhibir una actividad biol6gica que resulta de dicha uni6n. El bloqueo de los anticuerpos es util en los metodos de la presente invenci6n. Dichos anticuerpos que funcionan como antagonistas de IL-4 se pueden emplear para tratar cualquier afecci6n inducida por IL-4, incluyendo aunque sin limitaci6n, asma y alergias,
p. ej., rinitis alergica, dermatitis de contacto y dermatitis at6pica. En una realizaci6n, se emplea un anticuerpo monoclonal anti-IL-4R humano generado por procedimientos que implican inmunizaci6n de ratones transgenicos para tratar dichas afecciones.
Los anticuerpos se pueden emplear en un procedimiento in vitro, o se pueden administrar in vivo para inhibir una actividad biol6gica inducida por IL-4. Se pueden tratar asf trastornos causados o exacerbados (directa o indirectamente) por la interacci6n de IL-4 con los receptores de IL-4 de la superficie celular, cuyos ejemplos se expusieron precedentemente en la memoria. En una realizaci6n, la presente invenci6n proporciona un metodo terapeutico que comprende la administraci6n in vivo de un anticuerpo bloqueante de IL-4 y/o IL-13 a un mamffero que lo necesita, en una cantidad eficaz para reducir una actividad biol6gica inducida por IL-4 y/o IL-13.
Los anticuerpos de la invenci6n incluyen, aunque sin limitarse a ello, anticuerpos monoclonales parcialmente humanos y totalmente humanos que inhiben una actividad biol6gica de IL-4 y tambien inhiben una actividad biol6gica de IL-13. Una realizaci6n se refiere a un anticuerpo monoclonal humano que bloquea por lo menos parcialmente la uni6n de IL-4 a una celula, y por lo menos parcialmente la uni6n de IL-13 a una celula. En una realizaci6n, los anticuerpos se generan inmunizando un rat6n transgenico con un inmun6geno del receptor de IL-4. En otra realizaci6n, el inmun6geno es un polipeptido del receptor de IL-4 humana. Las lfneas celulares de hibridoma derivadas de ratones asf inmunizados, donde el hibridoma segrega un anticuerpo monoclonal que se une a IL-4R, tambien se proveen en la presente memoria.
Si bien los anticuerpos humanos, parcialmente humanos o humanizados seran adecuados para muchas aplicaciones, particularmente aquellas que implican la administraci6n del anticuerpo a un sujeto humano, otros tipos de anticuerpos seran adecuados para otras aplicaciones. Los anticuerpos no humanos de la invenci6n pueden ser, por ejemplo, derivados de cualquier animal que produzca anticuerpos, tales como rat6n, rata, cabra, mono o primates no humanos (como mono (p. ej., cynomologous o rhesus) o simios (p. ej., chimpance)). Los anticuerpos no humanos de la invenci6n se pueden utilizar, por ejemplo, en aplicaciones de cultivo celular in vitro, o en cualquier otra aplicaci6n en la que una respuesta inmunitaria al anticuerpo de la invenci6n no ocurre o es insignificante, puede prevenirse, no es una preocupaci6n, o se desea. En una realizaci6n, un anticuerpo no humano de la invenci6n se administra a un sujeto no humano. En otra realizaci6n, el anticuerpo no humano no produce una respuesta inmunitaria en el sujeto no humano. En otra realizaci6n, el anticuerpo no humano es de la misma especie que el sujeto no humano, p. ej., un anticuerpo de rat6n de la invenci6n se administra a un rat6n. Un anticuerpo de una especie particular se puede preparar, por ejemplo, inmunizando a un animal de esa especie con el inmun6geno deseado (p. ej., un polipeptido del receptor de IL-4 soluble) o usando un sistema artificial para generar anticuerpos de esa especie (p. ej., un sistema a base de exhibici6n de fagos o bacterias para generar anticuerpos de una especie particular), o convertir un anticuerpo de una especie en un anticuerpo de otra especie, reemplazando, p. ej., la regi6n constante del anticuerpo con una regi6n constante de otra especie, o reemplazando uno o mas residuos de aminoacidos del anticuerpo de modo que se asemeje mas a la secuencia de un anticuerpo de la otra especie. En una realizaci6n, el anticuerpo es un anticuerpo quimerico que comprende secuencias de aminoacidos derivadas de
anticuerpos de dos o mas especies diferentes. En otro aspecto, la presente invenci6n provee anticuerpos que comprenden una regi6n variable de la cadena ligera L2 y/o una regi6n variable de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en H1-H24 (excluyendo H5, H11, H14 a H16), y sus fragmentos, derivados, lutefnas y variantes (veanse las Figuras 2 y 3). Dicho anticuerpo puede indicarse usando la nomenclatura "LxHy", en donde x corresponde al numero de la regi6n variable de la cadena ligera y y corresponde al numero de la regi6n variable de la cadena pesada tal como estan marcados en la Figura 3. Por ejemplo, L4H17 se refiere a un anticuerpo con una regi6n variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de L4 y una regi6n variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de H17, como se muestra en la Figura 3. Las Figuras 2 y 3 tambien indican la ubicaci6n de las regiones CDR y marco de cada una de estas secuencias de dominio variable. Los anticuerpos de la invenci6n incluyen, por ejemplo, L2H1, L2H4, L2H12, L2H13, L2H2, L2H3, L2H6, L2H7, L2H8, L2H9 y L2H10. Tambien se pueden usar secuencias variables adicionales de anticuerpos, p. ej., secuencias variables de anticuerpo humano. Veanse, p. ej., Sblattero et a/., 1998, Immunotechnology 3:271-78, de Haard et a/., 1999. J. Biol. Chem. 274:18218-30.
En otra realizaci6n, la presente invenci6n provee un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en: una regi6n determinante de complementaridad de cadena ligera (CDR) 1 que consiste en los residuos 24-35 de SEC ID NO:6, una CDR2 de cadena ligera que consiste en los residuos 51-57 de SEC ID NO:6.
En otra realizaci6n, el anticuerpo inhibe la uni6n de IL-4 a un receptor de IL-4. El anticuerpo puede inhibir la uni6n de IL-13 a un receptor de IL-13. En otra realizaci6n, el anticuerpo inhibe la uni6n de IL-4 a un receptor de IL-4 y de IL-13 a un receptor de IL-13. En otra realizaci6n, el anticuerpo se une especfficamente al receptor de IL-4 alfa.
El anticuerpo puede comprender un dominio variable de la cadena ligera que es por lo menos 80, 85, 90, 95 o 100% identico a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID NO:6, con la salvedad que dicho dominio variable de la cadena ligera no comprende la secuencia de SEC ID NO:4.
En otra realizaci6n, la presente invenci6n provee un fragmento de dicho anticuerpo, donde dicho fragmento se une al receptor de IL-4 alfa.
Los anticuerpos se pueden seleccionar del grupo que consiste en L2H1; un anticuerpo de L2H1 de reacci6n cruzada, un anticuerpo que se une al mismo epftopo que L2H1; un anticuerpo que compite con L2H1 para la uni6n a una celula que expresa IL-4R humano; un anticuerpo que posee una actividad biol6gica de L2H1 y un fragmento de uni6n a antfgenos (incluyendo uno derivado por medios recombinantes) de L2H1. En una realizaci6n, el anticuerpo que tiene una afinidad de uni6n hacia IL-4R humano es sustancialmente equivalente a la afinidad de uni6n de L2H1 hacia IL-4R humano. Las lfneas celulares de hibridoma que producen cualquiera de dichos anticuerpos tambien se proveen en la presente invenci6n.
Un ejemplo de una actividad biol6gica de L2H1 es la capacidad de funcionar tanto como antagonista de IL-4 como antagonista de IL-13. El anticuerpo de la invenci6n puede poseer actividad bloqueante de IL-4 sustancialmente equivalente a aquella de L2H1; y posee actividad bloqueante de IL-13 sustancialmente equivalente a aquella de L2H1. Dicha actividad puede medirse en cualquier ensayo convencional adecuado (p. ej., medirse en el ensayo de expresi6n de CD23 descrito en el Ejemplo 2).
Las regiones determinantes de complementaridad (CDR) de un anticuerpo determinado se pueden identificar usando el sistema descrito por Kabat et a/. en Sequences of Proteins of Immuno/ogica/ Interest, 5ta Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publicaci6n num. 91-3242,1991. Las realizaciones particulares de anticuerpos de la presente invenci6n comprenden, dentro del dominio variable de su cadena ligera, por lo menos una de las regiones determinantes de complementaridad (CDR), o regiones hipervariables, que se hallan en la cadena ligera de L2H1. Las CDR de L2H1 se analizan en el Ejemplo 5. Por lo tanto, entre los anticuerpos provistos en la presente invenci6n se encuentran aquellos que comprenden una a tres de las siguientes secuencias en el dominio variable de la cadena ligera de L2H1: residuos de aminoacidos 24-35; residuos 51-57; y residuos 90-99 de SEC ID NO:6. Los anticuerpos particulares provistos en la presente memoria comprenden, dentro del dominio variable de su cadena pesada, por lo menos una de las CDR halladas en la cadena pesada de L2H1. Por ende, entre los anticuerpos provistos en la presente invenci6n se encuentran aquellos que comprenden una a tres de las siguientes secuencias en el dominio variable de la cadena pesada: residuos 31-35; residuos 50-65; y residuos 98104 de la SEC ID NO: 16.
La secuencia de DNA del dominio variable de la cadena pesada de L2H1 se presenta en la SEC ID NO:5, y la secuencia de aminoacidos codificados se presenta en la SEC ID NO:6. La secuencia de DNA para el dominio variable de la cadena pesada de L2H1 se presenta como la SEC ID NO:15, y la secuencia de aminoacidos codificados se presenta en la SEC ID NO:16. Los anticuerpos de la presente invenci6n incluyen, aunque sin limitarse a ello, anticuerpos que comprenden en su cadena ligera, la SEC, ID NO:6; y anticuerpos que ademas o alternativamente comprenden, en su cadena pesada, la SEC ID NO:16.
Por lo tanto, entre los anticuerpos provistos en la presente invenci6n se encuentran aquellos que comprenden una a tres de las siguientes secuencias en el dominio variable de la cadena pesada: residuos 31-35; residuos 50-65; y residuos 98-104 de la SEC ID NO:16.
En otra realizaci6n, los anticuerpos particulares de la invenci6n se seleccionan del grupo que consiste en L2H4; un anticuerpo de reacci6n cruzada con L2H4; un anticuerpo que se une al mismo epftopo que L2H4; un anticuerpo que compite con L2H4 para la uni6n a una celula que expresa IL-4R humano; un anticuerpo que posee una actividad biol6gica de L2H4; y un fragmento de uni6n a antfgenos de cualquiera de los anticuerpos antedichos. En una realizaci6n, el anticuerpo tiene una afinidad de uni6n hacia IL-4R humano que es sustancialmente equivalente a la afinidad de uni6n de L2H4 hacia IL-4R humano. Las lfneas celulares de hibridoma que producen cualquiera de dichos anticuerpos se proveen en la presente invenci6n.
Un ejemplo de una actividad biol6gica de L2H4 es la capacidad de funcionar tanto como antagonista de IL-4 como antagonista de IL-13. En una realizaci6n, un anticuerpo de la invenci6n posee actividad bloqueante de IL-4 sustancialmente equivalente a aquella de L2H4; y posee actividad bloqueante de IL-13 sustancialmente equivalente a aquella de L2H4. Dicha actividad se puede medir con cualquier ensayo convencional adecuado (p. ej., medirse en el ensayo de expresi6n de CD23 descrito en ele Ejemplo 2).
La secuencia de DNA del dominio variable de la cadena ligera de L2H4 se presenta en la SEC ID NO:5, y la secuencia de aminoacidos codificada se presenta en la SEC ID NO:6. La secuencia de DNA para el dominio variable de la cadena pesada de L2H4 se presenta como la SEC ID NO:21, y la secuencia de aminoacidos codificada se presenta en la SEC ID NO:22. Los anticuerpos de la presente invenci6n incluyen, aunque sin limitarse a ello, anticuerpos que comprenden, en su cadena ligera, los residuos 1 a 109 de la SEC ID NO:6; y anticuerpos que adicional o alternativamente comprenden, en su cadena pesada, los residuos 1 a 115 de la SEC ID NO:22.
Las realizaciones particulares de anticuerpos de la presente invenci6n comprenden, dentro del dominio variable de su cadena ligera, por lo menos una de las regiones determinantes de complementaridad (CDR), o regiones hipervariables, que se hallan en la cadena ligera de L2H4. Las CDR de L2H4 se analizan en el Ejemplo 5. Por lo tanto, entre los anticuerpos provistos en la presente memoria se encuentran aquellos que comprenden entre una y tres de las siguientes secuencias en el dominio variable de la cadena ligera: residuos de aminoacidos 24-35; residuos 51-57; y residuos 90-99 de la SEC ID NO:6. Los anticuerpos particulares provistos en la presente invenci6n comprenden, dentro del dominio variable de su cadena pesada, por lo menos una de las CDR que se hallan en la cadena pesada de L2H4. Por lo tanto, entre los anticuerpos provistos en la presente invenci6n se encuentran aquellos que comprenden una a tres de las siguientes secuencias en el dominio variable de la cadena pesada: residuos 31-35; residuos 50-65; y residuos 98-104 de la SEC !D NO:22.
En otra realizaci6n, los anticuerpos particulares de la invenci6n se seleccionan del grupo que consiste en L2H12; un anticuerpo de reacci6n cruzada con L2H12; un anticuerpo que se une al mismo epftopo que L2H12; un anticuerpo que compite con L2H12 para la uni6n a una celula que expresa IL-4R humano; un anticuerpo que posee una actividad biol6gica de L2H12; y un fragmento de uni6n a antfgenos de cualquiera de los anticuerpos antedichos. En una realizaci6n, el anticuerpo posee una afinidad de uni6n hacia IL-4R humano que es sustancialmente equivalente a la afinidad de uni6n de L2H12 hacia IL-4R humano. Las lfneas celulares de hibridoma que producen cualquiera de dichos anticuerpos tambien se proveen en la presente invenci6n.
Un ejemplo de una actividad biol6gica de L2H12 es la capacidad de funcionar tanto como antagonista de IL-4 como antagonista de IL-13. En una realizaci6n, un anticuerpo de la invenci6n posee actividad bloqueante de IL-4 sustancialmente equivalente a aquella de L2H12; y posee actividad bloqueante de IL-13 sustancialmente equivalente a aquella de L2H12. Dicha actividad se puede medir en cualquier ensayo convencional adecuado (p. ej., medirse en el ensayo de expresi6n de CD23 descrito en el Ejemplo 2).
La secuencia de DNA del dominio variable de la cadena ligera de L2H12 se presenta en la SEC ID NO:5, y la secuencia de aminoacidos codificada se presenta en la SEC ID NO:6. La secuencia de DNA para el dominio variable de la cadena pesada de L2H12 se presenta como la SEC ID NO:37, y la secuencia de aminoacidos codificada se presenta como la SEC ID NO:38. Los anticuerpos de la presente invenci6n incluyen, aunque sin limitarse a ello, anticuerpos que comprenden, en su cadena ligera, los residuos 1 a 109 de la SEC ID NO:6; y anticuerpos que adicional o alternativamente comprenden, en su cadena pesada, los residuos 1 a 115 de la SEC ID NO:38.
Las realizaciones particulares de anticuerpos de la presente invenci6n comprenden, dentro del dominio variable de su cadena ligera, por lo menos una de las regiones determinantes de complementaridad (CDR), o regiones hipervariables que se hallan en la cadena ligera de L2H12. Las CDR de L2H12 se analizan en el Ejemplo 5. Por lo tanto, entre los anticuerpos provistos en la presente memoria se encuentran aquellos que comprenden entre una y tres de las siguientes secuencias en el dominio variable de la cadena ligera: residuos de aminoacidos 24-35; residuos 51-57; y residuos 90-99 de la SEC ID NO:6. Los anticuerpos particulares provistos en la presente memoria comprenden, dentro del dominio variable de su cadena pesada, por lo menos una de las CDR que se hallan en la cadena pesada de L2H12. Por ende, entre los anticuerpos provistos en la presente invenci6n se encuentran aquellos que comprenden entre una y tres de las siguientes secuencias en el dominio variable de la cadena pesada: residuos 31-35; residuos 50-65; y residuos 98-104 de la SEC ID NO:38.
En otra realizaci6n, los anticuerpos particulares de la invenci6n se seleccionan del grupo que consiste en L2H13; un anticuerpo de reacci6n cruzada con L2H13; un anticuerpo que se une al mismo epftopo que L2H13; un anticuerpo que compite con L2H13 para la uni6n a una celula que expresa IL-4R humano; un anticuerpo que posee una actividad biol6gica de L2H13; y un fragmento de uni6n a antfgenos de cualquiera de los anticuerpos antedichos. En
una realizaci6n, el anticuerpo posee una afinidad de uni6n hacia IL-4R humano que es sustancialmente equivalente a la afinidad de uni6n de L2H13 hacia IL-4R humano. Las lfneas celulares de hibridoma que producen cualquiera de dichos anticuerpos tambien se proveen en la presente invenci6n.
Un ejemplo de una actividad biol6gica de L2H13 es la capacidad de funcionar tanto como antagonista de IL-4 como antagonista de IL-13. En una realizaci6n, un anticuerpo de la invenci6n posee actividad bloqueante de IL-4 sustancialmente equivalente a aquella de L2H13; y posee actividad bloqueante de IL-13 sustancialmente equivalente a aquella de L2H13. Dicha actividad se puede medir en cualquier ensayo convencional adecuado (p.. ej., medirse en el ensayo de expresi6n de CD23 descrito en el Ejemplo 2).
La secuencia de DNA del dominio variable de la cadena ligera de L2H13 se presenta en la SEC ID NO:5, y la secuencia de aminoacidos codificada se presenta en la SEC ID NO:6. La secuencia de DNA para el dominio variable de la cadena pesada de L2H13 se presenta como la SEC ID NO:39, y la secuencia de aminoacidos codificada se presenta en la SEC ID NO:40. Los anticuerpos de la presente invenci6n incluyen, aunque sin limitarse a ello, anticuerpos que comprenden, en su cadena ligera, los residuos 1 a 109 de la SEC ID NO:6; y anticuerpos que adicional o alternativamente comprenden, en su cadena pesada, los residuos 1 a 115 de la SEC ID NO:40.
Las realizaciones particulares de anticuerpos de la presente invenci6n comprenden, dentro del dominio variable de su cadena ligera, por lo menos una de las regiones determinantes de complementaridad (CDR), o sus regiones hipervariables en la cadena ligera de L2H13. Las CDR de L2H13 se analizan en el Ejemplo 5. Por lo tanto, entre los anticuerpos provistos en la presente invenci6n se encuentran aquellos que comprenden entre una y tres de las siguientes secuencias en el dominio variable de la cadena ligera: residuos de aminoacidos 24-35; residuos 51-57; y residuos 90-99 de la SEC ID NO:6. Los anticuerpos particulares provistos en la presente invenci6n comprenden, dentro del dominio variable de su cadena pesada, por lo menos una de las CDR que se hallan en la cadena pesada de L2H13. Por ende, entre los anticuerpos provistos en la presente memoria se encuentran aquellos que comprenden entre una y tres de las siguientes secuencias en el dominio variable de la cadena pesada; residuos 3135; residuos 50-65; y residuos 98-104 de la SEC ID NO:40.
En otra realizaci6n, los anticuerpos particulares de la invenci6n se seleccionan del grupo que consiste en L2H2; un anticuerpo de reacci6n cruzada con L2H2; un anticuerpo que se une al mismo epftopo que L2H2; un anticuerpo que compite con L2H2 para la uni6n a una celula que expresa IL-4R humano; un anticuerpo que posee actividad biol6gica de L2H2; y un fragmento de uni6n a antfgenos de cualquiera de los anticuerpos antedichos. En una realizaci6n, el anticuerpo posee una afinidad de uni6n hacia IL-4R humano que es sustancialmente equivalente a la afinidad de uni6n de L2H2 hacia IL-4R humano. Las lfneas celulares de hibridoma que producen cualquiera de dichos anticuerpos tambien se proveen en la presente invenci6n.
Un ejemplo de una actividad biol6gica de L2H2 es la capacidad de funcionar tanto como antagonista de IL-4 como antagonista de IL-13. En una realizaci6n, un anticuerpo de la invenci6n posee actividad bloqueante de IL-4 sustancialmente equivalente a aquella de L2H2; y posee actividad bloqueante de IL-13 sustancialmente equivalente a aquella de L2H2. Dicha actividad se puede medir en cualquier ensayo convencional adecuado (p. ej., medirse en el ensayo de expresi6n de CD23 descrito en el Ejemplo 2).
La secuencia de DNA del dominio variable de la cadena ligera de L2H2 se presenta en la SEC ID NO:5, y la secuencia de aminoacidos codificada se presenta en la SEC ID NO:6. La secuencia de DNA para el dominio variable de la cadena pesada de L2H2 se presenta como la SEC ID NO:17, y la secuencia de aminoacidos codificada se presenta en la SEC ID NO:18. Los anticuerpos de la presente invenci6n incluyen, aunque sin limitarse a ello, anticuerpos que comprenden, en su cadena ligera, los residuos 1 a 109 de la SEC ID NO:6; y anticuerpos que adicional o alternativamente comprenden, en su cadena pesada, los residuos 1 a 115 de la SEC ID NO: 18.
Las realizaciones particulares de anticuerpos de la presente invenci6n comprenden, dentro del dominio variable de su cadena ligera, por lo menos una de las regiones determinantes de complementaridad (CDR), o sus regiones hipervariables, que se hallan en la cadena ligera de L2H2. Las CDR de L2H2 se analizan en el Ejemplo 5. Por lo tanto, entre los anticuerpos provistos en la presente invenci6n se encuentran aquellos que comprenden una a tres de las siguientes secuencias en el dominio variable de la cadena ligera: residuos de aminoacidos 24-35; residuos 51-57; y residuos 90-99 de la SEC ID NO:6. Los anticuerpos particulares provistos en la presente invenci6n comprenden, dentro del dominio variable de su cadena pesada, por lo menos una de las CDR que se hallan en la cadena pesada de L2H2. Por ende, entre los anticuerpos provistos en la presente invenci6n se encuentran aquellos que comprenden entre una y tres de las siguientes secuencias en el dominio variable de la cadena pesada: residuos 31-35; residuos 50-65; y residuos 98-104 de la SEC ID NO:18.
En otra realizaci6n, los anticuerpos particulares de la invenci6n se seleccionan del grupo que consiste en L2H3; un anticuerpo de reacci6n cruzada con L2H3; un anticuerpo que se une al mismo epftopo que L2H3; un anticuerpo que compite con L2H3 para uni6n a la celula que expresa IL-4R humano; un anticuerpo que posee una actividad biol6gica de L2H3; y un fragmento de uni6n a antfgenos de cualquiera de los anticuerpos antedichos. En una realizaci6n, el anticuerpo posee una afinidad de uni6n hacia IL-4R humano que es sustancialmente equivalente a la afinidad de uni6n de L2H3 hacia IL-4R humano. Las lfneas celulares de hibridoma que producen cualquiera de dichos anticuerpos se proveen en la presente invenci6n.
Un ejemplo de una actividad biol6gica de L2H3 es la capacidad de funcionar tanto como antagonista de IL-4 como antagonista de IL-13. En una realizaci6n, un anticuerpo de la invenci6n posee actividad bloqueante de IL-4 sustancialmente equivalente a aquella de L2H3; y posee actividad bloqueante de IL-13 sustancialmente equivalente a aquella de L2H3. Dicha actividad se puede medir en cualquier ensayo convencional adecuado (p. ej., medirse en el ensayo de expresi6n de CD23 descrito en el Ejemplo 2).
La secuencia de DNA del dominio variable de la cadena ligera de L2H3 se presenta en la SEC ID NO:5, y la secuencia de aminoacidos codificada se presenta en la SEC ID NO:6. La secuencia de DNA para el dominio variable de la cadena pesada de L2H3 se presenta como SEC ID NO:19, y la secuencia de aminoacidos codificada se presenta en la SEC ID NO:20. Los anticuerpos de la presente invenci6n incluyen, aunque sin limitarse a ello, anticuerpos que comprenden, en su cadena ligera, los residuos 1 a 109 de la SEC ID NO:6; y anticuerpos que adicional o alternativamente comprenden, en su cadena pesada, los residuos 1 a 115 de la SEC ID NO:20.
Las realizaciones particulares de anticuerpos de la presente invenci6n comprenden, dentro del domino variable de su cadena ligera, por lo menos una de las regiones determinantes de complementaridad (CDR), o regiones hipervariables, que se hallan en la cadena ligera de L2H3. Las CDR de L2H3 se analizan en el Ejemplo 5. Por consiguiente, entre los anticuerpos provistos en la presente memoria se encuentran aquellos que comprenden entre una y tres de las siguientes secuencias en el dominio variable de la cadena ligera: residuos de aminoacidos 24-35; residuos 51-57; y residuos 90-99 de la SEC ID NO:6. Los anticuerpos particulares provistos en la presente invenci6n comprenden, dentro del dominio variable de su cadena pesada, por lo menos una de las CDR que se hallan en la cadena pesada de L2H3. Por lo tanto, entre los anticuerpos provistos en la presente memoria se encuentran aquellos que comprenden entre una y tres de las siguientes secuencias en el dominio variable de la cadena pesada: residuos 31-35; residuos 50-65; y residuos 98-104 de la SEC ID NO:20.
En otra realizaci6n, los anticuerpos particulares de la invenci6n se seleccionan del grupo que consiste en L2H6; un anticuerpo de reacci6n cruzada con L2H6; un anticuerpo que se une al mismo epftopo que L2H6; un anticuerpo que compite con L2H6 para la uni6n a una celula que expresa IL-4R humano; un anticuerpo que posee una actividad biol6gica de L2H6; y un fragmento de uni6n a antfgenos de cualquiera de los anticuerpos antedichos. En una realizaci6n, el anticuerpo tiene una afinidad de uni6n hacia IL-4R humano que es sustancialmente equivalente a la afinidad de uni6n de L2H6 hacia IL-4R humano. Las lfneas celulares de hibridoma que producen cualquiera de dichos anticuerpos tambien se proveen en la presente invenci6n.
Un ejemplo de una actividad biol6gica de L2H6 es la capacidad de funcionar tanto como antagonista de IL-4 como antagonista de IL-13. En una realizaci6n, un anticuerpo de la invenci6n posee actividad bloqueante de IL-4 sustancialmente equivalente a aquella de L2H6; y posee actividad bloqueante de IL-13 sustancialmente equivalente a aquella de L2H6. Dicha actividad se puede medir en cualquier ensayo convencional adecuado (p. ej., medirse en el ensayo de expresi6n de CD23 descrito en el Ejemplo 2).
La secuencia de DNA del dominio variable de la cadena ligera de L2H6 se presenta en la SEC ID NO:5, y la secuencia de aminoacidos codificada se presenta en la SEC ID NO:6. La secuencia de DNA para el dominio variable de la cadena pesada de L2H6 se presenta como la SEC ID NO:25, y la secuencia de aminoacidos codificada se presenta en la SEC ID NO:26. Los anticuerpos de la presente invenci6n incluyen, aunque sin limitarse a ello, anticuerpos que comprenden, en su cadena ligera, los residuos 1 a 109 de la SEC ID NO:6; y anticuerpos que adicional o alternativamente comprenden, en su cadena pesada, los residuos 1 a 115 de la SEC ID NO:26.
Las realizaciones particulares de anticuerpos de la presente invenci6n comprenden, dentro del domino variable de su cadena ligera, por lo menos una de las regiones determinantes de complementaridad (CDR), o regiones hipervariables, que se hallan en la cadena ligera de L2H6. Las CDR de L2H6 se analizan en el Ejemplo 5. Por lo tanto, entre los anticuerpos provistos en la presente invenci6n se encuentran aquellos que comprenden de una a tres de las siguientes secuencias en el dominio variable de la cadena ligera: residuos de aminoacidos 24-35; residuos 51-57; y residuos 90-99 de la SEC ID NO:6. Los anticuerpos particulares provistos en la presente invenci6n comprenden, dentro del dominio variable de su cadena pesada, por lo menos una de las CDR que se hallan en la cadena pesada de L2H6. Por ende, entre los anticuerpos provistos en la presente invenci6n se encuentran aquellos que comprenden de una a tres de las siguientes secuencias en el dominio variable de la cadena pesada: residuos 31-35; residuos 50-65; y residuos 98-104 de la SEC ID NO:26.
En otra realizaci6n, los anticuerpos particulares de la invenci6n se seleccionan del grupo que consiste en L2H7; un anticuerpo de reacci6n cruzada con L2H7; un anticuerpo que se une al mismo epftopo que L2H7; un anticuerpo que compite con L2H7 para la uni6n a una celula que expresa IL-4R humano; un anticuerpo que posee una actividad biol6gica de L2H7; y un fragmento de uni6n a antfgenos de cualquiera de los anticuerpos antedichos. En una realizaci6n, el anticuerpo tiene una afinidad de uni6n hacia IL-4R humano que es sustancialmente equivalente a la afinidad de uni6n de L2H7 hacia IL-4R humano. Las lfneas celulares de hibridoma que producen cualquiera de dichos anticuerpos tambien se proveen en la presente invenci6n.
Un ejemplo de una actividad biol6gica de L2H7 es la capacidad de funcionar tanto como antagonista de IL-4 como antagonista de IL-13. En una realizaci6n, un anticuerpo de la invenci6n posee actividad bloqueante de IL-4 sustancialmente equivalente a aquella de L2H7; y posee actividad bloqueante de IL-13 sustancialmente equivalente
a aquella de L2H7. Dicha actividad se puede medir en cualquier ensayo convencional adecuado (p. ej., medirse en el ensayo de expresi6n de CD23 descrito en el Ejemplo 2).
La secuencia de DNA del dominio variable de la cadena ligera de L2H7 se presenta en la SEC ID NO:5, y la secuencia de aminoacidos codificada se presenta en la SEC ID NO:6. La secuencia de DNA para el dominio variable de la cadena pesada de L2H7 se presenta como SEC ID NO:27, y la secuencia de aminoacidos codificada se presenta en la SEC ID NO:28. Los anticuerpos de la presente invenci6n incluyen, aunque sin limitarse a ello, anticuerpos que comprenden, en su cadena ligera, los residuos 1 a 109 de la SEC ID NO:6; y anticuerpos que adicional o alternativamente comprenden, en su cadena pesada, los residuos 1 a 115 de la SEC ID NO:28.
Las realizaciones particulares de anticuerpos de la presente invenci6n comprenden, dentro del domino variable de su cadena ligera, por lo menos una de las regiones determinantes de complementaridad (CDR), o regiones hipervariables, que se hallan en la cadena ligera de L2H7. Las CDR de L2H7 se analizan en el Ejemplo 5. Por lo tanto, entre los anticuerpos provistos en la presente invenci6n se encuentran aquellos que comprenden entre una y tres de las siguientes secuencias en el dominio variable de la cadena ligera: residuos de aminoacidos 24-35; residuos 51-57; y residuos 90-99 de la SEC ID NO:6. Los anticuerpos particulares provistos en la presente invenci6n comprenden, dentro del dominio variable de su cadena pesada, por lo menos una de las CDR que se hallan en la cadena pesada de L2H7. Por lo tanto, entre los anticuerpos provistos en la presente invenci6n se encuentran aquellos que comprenden entre una y tres de las siguientes secuencias en el dominio variable de la cadena pesada: residuos 31-35; residuos 50-65; y residuos 98-104 de la SEC ID NO:28.
En otra realizaci6n, los anticuerpos particulares de la invenci6n se seleccionan del grupo que consiste en L2H8; un anticuerpo de reacci6n cruzada con L2H8; un anticuerpo que se une al mismo epftopo que L2H8; un anticuerpo que compite con L2H8 para la uni6n a una celula que expresa IL-4R humano; un anticuerpo que posee una actividad biol6gica de L2H8; y un fragmento de uni6n a antfgenos de cualquiera de los anticuerpos antedichos. En una realizaci6n, el anticuerpo posee una afinidad de uni6n hacia IL-4R humano que es sustancialmente equivalente a la afinidad e uni6n de L2H8 hacia IL-4R humano. Las lfneas celulares de hibridoma que producen cualquiera de dichos anticuerpos tambien se proveen en la presente invenci6n.
Un ejemplo de dicha actividad biol6gica de L2H8 es la capacidad de funcionar tanto como antagonista de IL-4 como antagonista de IL-13. En una realizaci6n, un anticuerpo de la invenci6n posee actividad bloqueante de IL-4 sustancialmente equivalente a aquella de L2H8; y posee actividad bloqueante de IL-13 sustancialmente equivalente a aquella de L2H8. Dicha actividad puede medirse en cualquier ensayo convencional adecuado (p. ej., medirse en el ensayo de expresi6n de CD23 descrito en el Ejemplo 2).
La secuencia de DNA del dominio variable de la cadena ligera de L2H8 se presenta en la SEC ID NO:5, y la secuencia de aminoacidos codificada se presenta en la SEC ID NO:6. La secuencia de DNA para el dominio variable de la cadena pesada de L2H8 se presenta como la SEC ID NO:29, y la secuencia de aminoacidos codificada se presenta en la SEC ID NO:30. Los anticuerpos de la presente invenci6n incluyen, aunque sin limitarse a ello, anticuerpos que comprenden, en su cadena ligera, los residuos 1 a 109 de la SEC ID NO:6; y anticuerpos que adicional o alternativamente comprenden, en su cadena ligera, los residuos 1 a 115 de la SEC ID NO:30.
Las realizaciones particulares de los anticuerpos de la presente invenci6n comprenden, dentro del dominio variable de su cadena ligera, por lo menos una de las regiones determinantes de complementaridad (CDR), o regiones hipervariables, que se hallan en la cadena ligera de L2H8. Las CDR de L2H8 se analizan en el Ejemplo 5. Por lo tanto, entre los anticuerpos provistos en la presente invenci6n se encuentran aquellos que comprenden entre una y tres de las siguientes secuencias en el dominio variable de la cadena ligera: residuos de aminoacidos 24-35; residuos 51-57; y residuos 90-99 de la SEC ID NO:6. Los anticuerpos particulares provistos en la presente invenci6n comprenden, dentro del dominio variable de su cadena pesada, por lo menos una de las CDR que se hallan en la cadena pesada de L2H8. Por lo tanto, entre los anticuerpos provistos en la presente invenci6n se encuentran aquellos que comprenden entre una y tres de las siguientes secuencias en el dominio variable de la cadena pesada: residuos 31-35; residuos 50-65; y residuos 98-104 de la SEC ID NO:30.
En otra realizaci6n, los anticuerpos particulares de la invenci6n se seleccionan del grupo que consiste en L2H9; un anticuerpo de reacci6n cruzada con L2H9; un anticuerpo que se une al mismo epftopo que L2H9; un anticuerpo que compite con L2H9 para la uni6n a una celula que expresa IL-4R humano; un anticuerpo que posee una actividad biol6gica de L2H9; y un fragmento de uni6n a antfgenos de cualquiera de los anticuerpos antedichos. En una realizaci6n, el anticuerpo tiene una afinidad de uni6n hacia IL-4R humano que es sustancialmente equivalente a la afinidad de uni6n de L2H9 hacia IL-4R humano. Las lfneas celulares de hibridoma que producen cualquiera de dichos anticuerpos tambien se proveen en la presente invenci6n.
Un ejemplo de una actividad biol6gica de L2H9 es la capacidad de funcionar tanto como antagonista de IL-4 como antagonista de IL-13. En una realizaci6n, un anticuerpo de la invenci6n posee actividad bloqueante de IL-4sustancialmente equivalente a aquella de L2H9; y posee actividad bloqueante de IL-13 sustancialmente equivalente a aquella de L2H9. Dicha actividad puede medirse en cualquier ensayo convencional adecuado (p. ej., medirse en el ensayo de expresi6n de CD23 descrito en el Ejemplo 2 La secuencia de DNA del dominio variable de la cadena ligera de L2H9 se presenta en la SEC ID NO:5, y la secuencia de aminoacidos codificada se presenta en la SEC ID NO:6. La secuencia de DNA para el dominio variable de la cadena pesada de L2H9 se presenta como la SEC ID
NO:31, y la secuencia de aminoacidos codificada se presenta en la SEC ID NO:32. Los anticuerpos de la presente invenci6n incluyen, aunque sin limitarse a ello, anticuerpos que comprenden, en su cadena ligera, los residuos 1 a 109 de la SEC ID NO:6; y anticuerpos que adicional o alternativamente comprenden, en su cadena ligera, los residuos 1 a 115 de la SEC ID NO:32.
Las realizaciones particulares de los anticuerpos de la presente invenci6n comprenden, dentro del dominio variable de su cadena ligera, por lo menos una de las regiones determinantes de complementaridad (CDR), o regiones hipervariables, que se hallan en la cadena ligera de L2H9. Las CDR de L2H9 se analizan en el Ejemplo 5. Por lo tanto, entre los anticuerpos provistos en la presente invenci6n se encuentran aquellos que comprenden entre una y tres de las siguientes secuencias en el dominio variable de la cadena ligera: residuos de aminoacidos 24-35; residuos 51-57; y residuos 90-99 de la SEC NO:6. Las realizaciones particulares de los anticuerpos de la presente invenci6n comprenden, dentro del dominio variable de su cadena ligera, por lo menos una de las CDR que se hallan en la cadena pesada de L2H9. Por ende, entre los anticuerpos provistos en la presente invenci6n se encuentran aquellos que comprenden entre una y tres de las siguientes secuencias en el dominio variable de la cadena pesada: residuos 31-35; residuos 50-65; y residuos 98-104 de la SEC ID NO:32.
En otra realizaci6n, los anticuerpos particulares de la invenci6n se seleccionan del grupo que consiste en L2H10; un anticuerpo de reacci6n cruzada con L2H10; un anticuerpo que se une al mismo epftopo que L2H10; un anticuerpo que compite con L2H10 para la uni6n a una celula que expresa IL-4R humano; un anticuerpo que posee una actividad biol6gica de L2H10; y un fragmento de uni6 a antfgenos de cualquiera de los anticuerpos antedichos. En una realizaci6n, el anticuerpo posee una afinidad de uni6n hacia IL-4R humano que es sustancialmente equivalente a la afinidad de uni6n de L2H10 hacia IL-4R humano. Las lfneas celulares de hibridoma que producen cualquiera de dichos anticuerpos tambien se proveen en la presente invenci6n. Un ejemplo de una actividad biol6gica de L2H10 es la capacidad de funcionar tanto como antagonista de IL-4 como antagonista de IL-13. En una realizaci6n, un anticuerpo de la invenci6n posee actividad bloqueante de IL-4 sustancialmente equivalente a aquella de L2H10; y posee actividad bloqueante de IL-13 sustancialmente equivalente a aquella de L2H10. Dicha actividad puede medirse en cualquier ensayo convencional adecuado (p. ej., medirse en el ensayo de expresi6n de CD23 descrito en el Ejemplo 2).
La secuencia de DNA del dominio variable de la cadena ligera de L2H10 se presenta en la SEC ID NO:5, y la secuencia de aminoacidos codificada se presenta en la SEC ID NO:6. La secuencia de DNA para el dominio variable de la cadena pesada de L2H10 se presenta como la SEC ID NO:33, y la secuencia de aminoacidos codificada se presenta en la SEC ID NO:34. Los anticuerpos de la presente invenci6n incluyen, aunque sin limitarse a ello, anticuerpos que comprenden, en su cadena ligera, los residuos 1 a 109 de la SEC ID NO:6; y anticuerpos que adicional o alternativamente comprenden, en su cadena pesada, la SEC ID NO:34.
Las realizaciones particulares de los anticuerpos de la presente invenci6n comprenden, dentro del dominio variable de su cadena ligera, por lo menos una de las regiones determinantes de complementaridad (CDR), o regiones hipervariables, que se hallan en la cadena ligera de L2H10. Las CDR de L2H10 se analizan en el Ejemplo 5. Por lo tanto, entre los anticuerpos provistos en la presente invenci6n se encuentran aquellos que comprenden entre una y tres de las siguientes secuencias en el dominio variable de la cadena ligera: residuos de aminoacidos 24-35; residuos 51-57; y residuos 90-99 de la SEC ID NO:6. Los anticuerpos particulares provistos en la presente invenci6n comprenden, dentro del dominio variable de su cadena pesada, por lo menos una de las CDR que se hallan en la cadena pesada de L2H10. Por ende, entre los anticuerpos provistos en la presente invenci6n se encuentran aquellos que comprenden entre una y tres de las siguientes secuencias en el dominio variable de la cadena pesada: residuos 31-35; residuos 50-65; y residuos 98-104 de la SEC ID NO:34.
Acidos nucleicos
En un aspecto, la presente invenci6n provee moleculas aisladas de acido nucleico. Los acidos nucleicos comprenden, por ejemplo, polinucle6tidos que codifican un anticuerpo de la invenci6n, o sus fragmentos, derivados, mutefnas o variantes, polinucle6tidos suficientes para usar como sondas de hibridaci6n, cebadores PCR o cebadores de secuenciaci6n para identificar, analizar, mutar o ampliar un polinucle6tido que codifica un polipeptido, acidos nucleicos antisentido para inhibir la expresi6n de un polinucle6tido, y secuencias complementarias de lo antedicho. Los acidos nucleicos pueden tener cualquier longitud. Pueden, por ejemplo, tener 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125,150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750,1,000,1,500, 3,000, 5,000 o mas nucle6tidos de longitud, y/o pueden comprenden una o mas secuencias adicionales, por ejemplo, secuencias reguladoras, y/o se parte de un acido nucleico mas grande, por ejemplo un vector. Los acidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios y pueden comprender nucle6tidos de RNA y/o DNA, y sus variantes artificiales (p. ej., acidos nucleicos de peptidos).
Los polipeptidos de anticuerpos que codifican DNA (p. ej., de cadena pesada o ligera, de dominio variable solamente
o de longitud total) se pueden aislar de celulas B de ratones que han sido inmunizados con IL-4R. El DNA se puede aislar por procedimientos convencionales tales como reacci6n en cadena de la polimerasa (PCR). La exhibici6n de fagos es otro ejemplo de una tecnica conocida, mediante la cual se pueden preparar derivados de anticuerpos. En un planteamiento, los polipeptidos que son componentes de un anticuerpo de interes se expresan en cualquier
sistema de expresi6n recombinante adecuado, y se permite que los polipeptidos expresados se ensamblen para formar moleculas de anticuerpo.
La Figura 2 proporciona secuencias de acidos nucleicos que codifican regiones variables de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera que se muestran en la Figura 3. Debido a la degeneraci6n del c6digo genetico, cada una de las secuencias de polipeptidos de la Figura 3 tambien esta codificada por un gran numero de otras secuencias de acidos nucleicos. La presente invenci6n provee cada secuencia nucleotfdica degenerada que codifica cada anticuerpo de la invenci6n.
La invenci6n provee tambien acidos nucleicos que se hibridan a otros acidos nucleicos (p. ej., acidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucle6tidos de la Figura 2) bajo condiciones de hibridaci6n particulares. Los metodos para hibridar acidos nucleicos se conocen en la tecnica, vease p. ej., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Como se define en la presente memoria, una condici6n de hibridaci6n moderadamente rigurosa utiliza una disoluci6n de prelavado que contiene 5X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC), SDS al 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8,0), tamp6n de hibridaci6n de aproximadamente 50% formamida, 6X SSC, y una temperatura de hibridaci6n de 55° C (u otras disoluciones de hibridaci6n similares, tal como una que contenga aproximadamente 50% formamida, con una temperatura de hibridaci6n de 42° C), y condiciones de lavado de 60° C, en 0,5X SSC, SDS al 0,1%. Una condici6n de hibridaci6n rigurosa 6X SSC a 45° C, seguida de uno o mas lavados en 0,1X SSC, SDS al 0,2% a 68° C. Asimismo, el experto en la tecnica puede manipular la hibridaci6n y/o las condiciones de lavado para aumentar o reducir la rigurosidad de la hibridaci6n, de modo tal que los acidos nucleicos que comprendan secuencias nucleotfdicas por lo menos 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 o 99% identicas entre sf tfpicamente permanezcan hibridadas entre sf. Los parametros basicos que afectan la elecci6n de las condiciones de hibridaci6n y los lineamientos para idear condiciones adecuadas se exponen en Sambrook, Fritsch, and Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., capftulos 9 y 11; y en Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel et a/., eds., John Wiley & Sons, Inc., secciones 2.10 y 6.3-6.4), y pueden determinarse facilmente por aquellos que tengan experiencia ordinaria en la tecnica basados, por ejemplo, en la longitud y/o composici6n base del DNA.
Los cambios se pueden introducir por mutaci6n en un acido nucleico, conduciendo asf a cambios en la secuencia de aminoacidos de un polipeptido (p. ej., un anticuerpo) al que codifica. Las mutaciones se pueden introducir por tecnicas estandar, tales como mutagenesis dirigida al sitio y mutagenesis mediada por PCR. Preferiblemente, las sustituciones de aminoacidos conservadoras se realizan en uno o mas residuos de aminoacidos no esenciales. Alternativamente, las mutaciones pueden introducirse aleatoriamente en todo o parte de la secuencia codificante, tal como por mutagenesis de saturaci6n, y puede estudiarse la actividad biol6gica de los mutantes resultantes para identificar mutantes que retengan actividad (p. ej., uni6n al receptor de IL-4). Despues de la mutagenesis, la protefna codificada puede expresarse de manera recombinante, y puede determinarse la actividad de la protefna. Las mutaciones pueden introducirse en un acido nucleico sin alterar significativamente la actividad biol6gica de un peptido al que codifica. Por ejemplo, se pueden realizar sustituciones de nucle6tidos que conduzcan a las sustituciones de aminoacidos en residuos de aminoacidos no esenciales. En una realizaci6n, una secuencia de nucle6tidos provista en la Figura 2, o su fragmento, variante o derivado deseado, se muta de forma tal que codifique una secuencia de aminoacidos que comprenda una o mas eliminaciones o sustituciones de los residuos de aminoacidos que se muestran en la Figura 3 para que sean residuos en los que difieran dos o mas secuencias. En otra realizaci6n, la mutagenesis inserta un aminoacido adyacente a uno o mas residuos de aminoacidos que se muestran en la Figura 3 para que sean residuos en los que difieran dos o mas secuencias. Alternativamente, pueden introducirse mutaciones en un acido nucleico que cambian selectivamente la actividad biol6gica (p. ej., uni6n al receptor de IL-4, inhibiendo la IL-4 y/o IL-13, etc.) de un polipeptido al que codifica. Por ejemplo, la mutaci6n puede cambiar cuantitativa o cualitativamente la actividad biol6gica. Los ejemplos de cambios cuantitativos incluyen aumentar, reducir, o eliminar la actividad. Los ejemplos de cambios cualitativos incluyen cambiar la especificidad antigenica de un anticuerpo.
En otro aspecto, la presente invenci6n provee moleculas de acidos nucleicos que son adecuadas para uso como cebadores o sondas de hibridaci6n para la detecci6n de secuencias de acidos nucleicos de la invenci6n. Una molecula de acido nucleico de la invenci6n puede comprender solamente una porci6n de una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido de longitud total de la invenci6n, por ejemplo, un fragmento que se puede utilizar como sonda o cebador, o un fragmento que codifica una porci6n activa (p. ej., una porci6n de uni6n al receptor de IL-4) de un polipeptido de la invenci6n.
Las sondas basadas en la secuencia de un acido nucleico de la invenci6n se pueden utilizar para detectar el acido nucleico o acidos nucleicos similares, por ejemplo, transcriptos que codifican un polipeptido de la invenci6n. La sonda puede comprender un grupo de etiquetas, p. ej., un radiois6topo, un compuesto fluorescente, una enzima o un co-factor enzimatico. Dichas sondas se pueden usar para identificar una celula que expresa el polipeptido.
En otro aspecto, la presente invenci6n provee vectores que comprenden un acido nucleico que codifica un polipeptido de la invenci6n o su porci6n. Los ejemplos de vectores incluyen, aunque sin limitarse a ello, plasmidos, vectores vfricos, vectores mamfferos no episomales y vectores de expresi6n, por ejemplo, vectores de expresi6n recombinantes.
Los vectores de expresi6n recombinantes de la invenci6n pueden comprender un acido nucleico de la invenci6n en una forma adecuada para expresi6n del acido nucleico en una celula hospedante. Los vectores de expresi6n recombinantes incluyen una o mas secuencias reguladoras, seleccionadas en base a las celulas hospedantes que se han de utilizar para expresi6n, operativamente unidas a la secuencia de acido nucleico que se ha de expresar. Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresi6n constitutiva de una secuencia de nucle6tidos en muchos tipos de celulas hospedantes (p. ej., el potenciador de genes temprano SV40, el promotor de sarcoma virus Rous y el promotor de cytomegalovirus), aquellas que dirigen la expresi6n de la secuencia de nucle6tidos solamente en ciertas celulas hospedantes (p. ej., secuencias reguladoras especfficas de tejido, veanse Voss et a/., 1986, Trends Biochem. Sci. 11:287, Maniatis et a/., 1987, Science 236:1237, incorporados por referencia a la presente memoria en su totalidad), y aquellas que dirigen la expresi6n inducible de una secuencia de nucle6tidos en respuesta a un tratamiento o condici6n particular (p. ej., el promotor de metalotionina en celulas mamfferas y el promotor sensible a tet y/o sensible a estreptomicina, tanto en sistemas procari6ticos como eucari6ticos (vease id.). Los expertos en la tecnica apreciaran que el diseno del vector de expresi6n puede depender de dichos factores como la elecci6n de la celula hospedante que se va a transformar, el nivel de expresi6n de la protefna deseada, etc. Los vectores de expresi6n de la invenci6n se pueden introducir en las celulas hospedantes para producir asf protefnas o peptidos, incluyendo protefnas o peptidos de fusi6n, codificados por acidos nucleicos, como se describe en la presente memoria.
En otro aspecto, la presente invenci6n provee celulas hospedantes en las que se ha introducido un vector de expresi6n recombinante de la invenci6n. Una celula hospedante puede ser cualquier celula procari6tica (por ejemplo,
E. co/i) o celula eucari6tica (por ejemplo, celulas de levadura, insecto o mamffero (p. ej., celulas CHO)). El DNA del vector puede introducirse en las celulas procari6ticas o eucari6ticas mediante tecnicas de transfecci6n o transformaci6n convencionales. Para transfecci6n estable de celulas mamfferas, se sabe que, dependiendo del vector de expresi6n y la tecnica de transfecci6n utilizada, solamente una pequena fracci6n de celulas puede integrar el DNA ex6geno en su genoma. Con el fin de identificar y seleccionar estos integrantes, en general se introduce un gen que codifica un marcador seleccionable (p. ej., para resistencia a antibi6ticos) en las celulas hospedantes, junto con el gen de interes. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen aquellos que confieren resistencia a los farmacos, tales como G418, higromicina y metotrexato. Las celulas establemente transfectadas con el acido nucleico introducido pueden identificarse por selecci6n de farmacos (p. ej., las celulas que han incorporado el gen marcador seleccionable sobreviviran, mientras que las otras celulas moriran), entre otros metodos.
Derivados, fragmentos y mutefnas de anticuerpos
Se pueden preparar derivados de anticuerpos dirigidos contra IL-4R, y se pueden ensayar sus propiedades deseadas mediante cualquiera de una serie de tecnicas conocidas. Ciertas de estas tecnicas implican aislar DNA que codifica una cadena de polipeptidos (o su porci6n) de un anticuerpo de interes, y manipular el DNA a traves de tecnologfa de DNA recombinante. El DNA se puede condensar a otro DNA de interes, o alterarse (p. ej., por mutagenesis u otras tecnicas convencionales) para anadir, eliminar o sustituir uno o mas residuos de aminoacidos, por ejemplo.
En un aspecto, la presente invenci6n provee fragmentos de uni6n a antfgenos de los anticuerpos de la invenci6n. Dichos fragmentos pueden consistir completamente en secuencias derivadas de anticuerpos o pueden comprender secuencias adicionales. Los ejemplos de fragmentos de uni6n a antfgenos incluyen Fab y F(ab')2. Oros ejemplos se proveen en Lunde et a/., 2002, Biochem. Soc. Trans. 30:500-06.
Los anticuerpos monocatenarios pueden formarse enlazando fragmentos de dominio variable de cadena pesada y ligera (regi6n Fv) mediante un puente de aminoacidos (enlazador peptfdico corto), lo que resulta en una cadena de polipeptidos sencilla. Dicha cadena sencilla Fvs (scFvs) ha sido preparada condensando DNA que codifica un enlazador peptfdico entre los DNA que codifican dos polipeptidos de dominio variable (VL y VH). Los polipeptidos resultantes pueden volver a plegarse en sf mismos para formar los mon6meros de uni6n a antfgenos, o pueden formar multfmeros (p. ej., dfmeros, trfmeros o tetrameros), dependiendo de la longitud de un enlazador flexible entre los dos dominios variables (Kortl et a/., 1997, Prot. Eng. 10:423; Kortl et a/., 2001, Biomol. Eng. 18:95-108). Al combinar diferentes polipeptidos que comprenden VL y VH, se pueden formar scFvs multimericos que se unen a diferentes epftopos (Kriangkum et a/., 2001, Biomol. Eng. 18:31-40). Las tecnicas desarrolladas para la producci6n de anticuerpos monocatenarios incluyen aquellas descritas en la patente estadounidense num. 4,946,778; Bird, 1988, Science 242:423; Huston et a/., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879; Ward et a/., 1989, Nature 334:544, de Graaf et a/., 2002, Methods Mol Biol. 178:379-87. Los anticuerpos monocatenarios derivados de los anticuerpos provistos en la presente invenci6n (incluyendo sin limitaci6n scFvs que comprenden las combinaciones de dominio variable L2H1, L2H4, L2H12, L2H13, L2H2, L2H3, L2H6, L2H7, L2H8, L2H9 y L2H10) se contemplan en la presente invenci6n.
Se conocen las tecnicas que derivan un anticuerpo de una subclase diferente o isotipo de un anticuerpo de interes, es decir cambio de subclase. Por lo tanto, los anticuerpos IgG pueden derivar de un anticuerpo IgM, por ejemplo, y viceversa. Dichas tecnicas permiten la preparaci6n de nuevos anticuerpos que poseen las propiedades de uni6n a antfgenos de un anticuerpo determinado (el anticuerpo parental), pero tambien exhiben propiedades biol6gicas asociadas con un isotipo de anticuerpo o subclase diferente de aquella del anticuerpo parental. Se pueden emplear tecnicas de DNA recombinante. El DNA clonado que codifica polipeptidos de anticuerpo particulares se puede
emplear en dichos procedimientos, p. ej., DNA que codifica el dominio constante de un anticuerpo del isotipo deseado. Vease tambien Lantto et a/., 2002, Methods Mol. Biol.178:303-16.
Por consiguiente, los anticuerpos de la presente invenci6n incluyen aquellos que comprenden, por ejemplo, las combinaciones de dominio variable L2H1, L2H4, L2H12, L2H13, L2H2, L2H3, L2H6, L2H7, L2H8, L2H9 y L2H10, que tienen un isotipo deseado (por ejemplo, IgA, IgGl, !gG2, lgG3, lgG4, IgM, IgE y IgD) como tambien sus fragmentos Fab o F(ab')2. Ademas, si se desea un lgG4, puede tambien desearse introducir una mutaci6n de punto (CPSCP -> CPPCP) en la regi6n bisagra, como se describe en Bloom et a/., 1997, Protein Science 6:407, incorporado a la presente memoria por referencia) para aliviar una tendencia a formar enlaces disulfuro intracatenarios H que pueden conducir a heterogeneidad en los anticuerpos lgG4.
A su vez, tambien se conocen las tecnicas para derivar anticuerpos que tengan diferentes propiedades (es decir, afinidades variables para el antfgeno al que se unen). Una de dichas tecnicas, denominada transposici6n de cadenas, implica exhibir repertorios genicos de dominio variable de inmunoglobulina en la superficie del bacteri6fago filamentoso, a menudo denominada exhibici6n de fagos. La transposici6n de cadenas se ha utilizado para preparar anticuerpos de gran afinidad al hapteno 2-fenilloxazol-5-ona, como lo describen Marks et a/., 1992, BioTechnology,
10:779.
La evoluci6n molecular de las regiones determinantes de complementaridad (CDR) en el centro del sitio de uni6n al anticuerpo tambien se ha utilizado para aislar anticuerpos con mayor afinidad, por ejemplo, anticuerpos que tienen mayor afinidad hacia c-erbB-2, como lo describen Schier et a/., 1996, J. Mol. Biol. 263:551. Por consiguiente, dichas tecnicas son utiles para preparar anticuerpos a IL-4R.
En realizaciones particulares, los anticuerpos de la presente invenci6n poseen afinidad de uni6n (Ka) hacia IL-4R de por lo menos 1 x 108. En otras realizaciones, los anticuerpos exhiben una Ka de por lo menos 1 x 109, por lo menos 1x1010 o por lo menos 1 x 10".
La presente invenci6n incluye ademas anticuerpos multiespecfficos, por ejemplo, anticuerpos biespecfficos, p. ej., dos epftopos distintos de IL-4R, o un epftopo de IL-4R y un epftopo de IL-13R, mediante dos sitios o regiones de uni6n a antfgenos diferentes. Ademas, los anticuerpos biespecfficos descritos en la presente memoria pueden comprender un sitio de uni6n a antfgenos de uno de los anticuerpos descritos en la presente invenci6n y una segunda regi6n de uni6n a antfgenos de otro de los anticuerpos descritos en la presente invenci6n. Alternativamente, un anticuerpo biespecffico puede comprender un sitio de uni6n a antfgenos de uno de los anticuerpos aquf descritos y un segundo sitio de uni6n a antfgenos de otro anticuerpo IL-4R conocido en la tecnica (o uno que pueda prepararse por metodos conocidos).
Se conocen en la tecnica numerosos metodos para preparar anticuerpos especfficos, y se analizan en la solicitud de patente estadounidense 09/839.632, presentada el 20 de abril de 2001 (incorporada a la presente memoria por referencia). Dichos metodos incluyen el uso de hfbridos-hibridomas descritos por Milstein et a/, 1983, Nature 305:537, y otros (patente estadounidense 4,474,893, patente estadounidense 6,106,833) y acoplamiento qufmico de fragmentos de anticuerpos (Brennan et a/.,1985, Science 229:81; Glennie et a/.,1987, J. Immunol. 139:2367; patente estadounidense 6,010,902). Ademas, los anticuerpos biespecfficos pueden producirse a traves de medios recombinantes, por ejemplo, usando restos de cremallera de leucina (es decir, a partir de protefnas Fos y Jun, que preferiblemente forman heterodfmeros; Kostelny et a/., 1992, J. Immnol. 148:1547) u otras estructuras de dominio interactivo /ock and key, como se describe en la patente estadounidense 5,582,996. Otras tecnicas utiles adicionales incluyen aquellas descritas en Kortt et a/., 1997, mas arriba; patente estadounidense 5,959,083; y patente estadounidense 5,807,706.
En otro aspecto, la presente invenci6n provee un derivado de un anticuerpo. El anticuerpo derivatizado puede comprender cualquier molecula o sustancia que imparta una propiedad deseada al anticuerpo, tal como mayor semivida en un uso particular. El anticuerpo derivatizado puede comprender, por ejemplo, un resto detectable (o de etiquetado) (p. ej., una molecula radiactiva, colorimetrica, antigenica o enzimatica, una esfera detectable (tal como una esfera magnetica o de oro), o una molecula que se une a otra molecula (p. ej., biotina)), un resto terapeutico o diagn6stico (p. ej., un resto activo radiactivo, citot6xico o farmaceutico), o una molecula que aumente la adecuaci6n del anticuerpo para un uso particular (p. ej., administraci6n a un sujeto, tal como un ser humano, u otros usos in vivo
o in vitro). Los ejemplos de moleculas que se pueden usar para derivatizar un anticuerpo son albumina (p. ej., albumina de suero humano) y polietilenglicol (PEG). Los derivados unidos a albumina y PEGilados de los anticuerpos se pueden preparar empleando tecnicas conocidas en el campo. En una realizaci6n, el anticuerpo se conjuga o se une a transtiretina (TTR) o una variante de TTR. La TTR o variante de TTR puede modificarse qufmicamente con, por ejemplo, una sustancia qufmica seleccionada del grupo que consiste en dextrano, poli(n-vinil pirrolidona), polietilenglicoles, homopolfmeros de propilenglicol, copolfmeros de 6xido de polipropileno/6xido de etileno, polioles polietoxilados y alcoholes polivinflicos. Solicitud de patente estadounidense num. 20030195154.
Metodos terapeuticos y administraci6n de anticuerpos
Se provee un anticuerpo anti-IL-4R para uso en medicina, reduciendo de este modo una respuesta biol6gica inducida por IL-4 que desempena una funci6n en una afecci6n particular. En realizaciones particulares, los metodos
de la invenci6n implican poner en contacto IL-4R end6gena con un anticuerpo anti-IL-4R, p. ej., en un procedimiento ex vivo.
El tratamiento abarca el alivio o la prevenci6n de por lo menos un sfntoma de un trastorno, o la reducci6n de la gravedad de una enfermedad, y similares. No es necesario que un anticuerpo realice una "cura" completa, ni que erradique cada sfntoma o manifestaci6n de una enfermedad para constituir un agente terapeutico viable. Como se reconoce en el campo pertinente, los farmacos empleados como agentes terapeuticos pueden reducir la gravedad de un estado de enfermedad determinado, pero no necesariamente deben abolir cada manifestaci6n de la enfermedad para considerarse utiles como agentes terapeuticos. Una realizaci6n de la invenci6n se refiere a un metodo que comprende administrar a un paciente un antagonista de IL-4R en una cantidad y por un periodo suficiente para inducir una mejora sostenida en comparaci6n con la situaci6n inicial de un indicador que refleja la gravedad del trastorno particular.
Los anticuerpos que inhiben la uni6n tanto de IL-4 como de IL-13 a las celulas se analizan en la presente memoria. Un metodo para suprimir las actividades inducidas por IL-4 y por IL-13 en seres humanos comprende administrar una cantidad eficaz de dicho anticuerpo. Se pueden tratar asf afecciones inducidas por IL-4 o por IL-13, o por ambas citocinas.
Como se entiende en el campo pertinente, los anticuerpos se administran a un sujeto en un modo apropiado a la indicaci6n. Los anticuerpos pueden administrarse mediante cualquier tecnica adecuada, incluyendo sin limitaci6n, la vfa parenteral, t6pica o por inhalaci6n. Si se inyecta, el anticuerpo puede administrarse, por ejemplo, por las rutas intra-articular, intravenosa, intramuscular, intralesional, intraperitoneal o subcutanea, por inyecci6n intravenosa rapida o por infusi6n continua. Se contempla la administraci6n localizada, p. ej., en un sitio de enfermedad o lesi6n, como tambien la administraci6n transdermica y la liberaci6n sostenida desde implantes. La administraci6n por inhalaci6n incluye, por ejemplo, inhalaci6n nasal u oral, el uso de un nebulizador, inhalaci6n del antagonista en forma de aerosol y similares. Otras alternativas incluyen gotas oculares; preparaciones orales que incluyen pfldoras, jarabes, pastillas o gomas de mascar; y preparaciones t6picas tales como lociones, geles, pulverizaciones y ungOentos.
Tambien se contempla el uso de anticuerpos anti-IL-4R en procedimientos ex vivo. Por ejemplo, se puede contactar la sangre u otro fluido corporal de un paciente con un anticuerpo que se una a IL-4R ex vivo. El anticuerpo se puede unir a una matriz insoluble o a un material de soporte s6lido adecuado.
Ventajosamente, los anticuerpos se administran en la forma de una composici6n que comprende por lo menos un anticuerpo anti-IL-4R y uno o mas componentes adicionales tales como un vehfculo, excipiente o diluyente fisiol6gicamente aceptable. La presente invenci6n proporciona dichas composiciones que comprenden una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-IL-4R para uso en los metodos provistos en la presente memoria.
Las composiciones contienen anticuerpo(s) anti-IL-4R en, por ejemplo, cualquiera de las formas aquf descritas. El anticuerpo puede ser un anticuerpo entero o su fragmento de uni6n al antfgeno o derivado geneticamente modificado, por ejemplo.
Las composiciones pueden, por ejemplo, comprender un anticuerpo junto con un tamp6n, antioxidante tal como acido asc6rbico, polipeptido de bajo peso molecular (tal como aquellos que tienen menos de 10 aminoacidos), protefna, aminoacido, carbohidrato tal como glucosa, sacarosa o dextrinas, agentes quelantes tales como EDTA, glutati6n, y otros estabilizantes y excipientes. La soluci6n salina tamponada neutra o la soluci6n salina mixta con albumina de suero co-especffica son ejemplos de diluyentes apropiados. De acuerdo con los estandares de la industria apropiada, tambien pueden anadirse conservantes tales como alcohol bencflico. La composici6n se puede formular como un liofilizado, utilizando disoluciones excipientes apropiadas (p. ej., sacarosa) como diluyentes. Los componentes adecuados no son t6xicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas. Otros ejemplos de componentes que pueden emplearse en las formulaciones farmaceuticas se presentan en Remington's Pharmaceutica/ Sciences, 16ta Ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1980.
Los kits para uso por parte de profesionales medicos incluyen un anticuerpo anti-IL-4R y una etiqueta u otras instrucciones para usar en el tratamiento de cualquiera de las afecciones anteriormente analizadas. El kit preferiblemente incluye una preparaci6n esteril de uno o mas anticuerpos anti-IL-4R, que puede tener la forma de una composici6n tal como se analiz6 anteriormente, y puede estar en uno o mas viales.
La dosis y frecuencia de administraci6n pueden variar de acuerdo con factores tales como la ruta de administraci6n, el anticuerpo particular empleado, la naturaleza y la gravedad de la enfermedad que se ha de tratar, si la afecci6n es aguda o cr6nica y la contextura y el estado general del sujeto. La dosis apropiada puede determinarse por procedimientos conocidos en la tecnica, p. ej., en ensayos clfnicos que pueden implicar estudios de aumento de la dosis.
Un anticuerpo se puede administrar, por ejemplo, una vez o mas, en intervalos regulares durante un periodo de tiempo. En realizaciones particulares, el anticuerpo se administra durante un periodo de tiempo de por lo menos un mes o mas, p. ej., uno, dos o tres meses, o incluso indefinidamente. Para tratar afecciones cr6nicas, el tratamiento a largo plazo en general es el mas eficaz. No obstante, para tratar afecciones agudas, la administraci6n durante
periodos mas cortos, p. ej., entre una y seis semanas, puede ser suficiente. En general, el anticuerpo se administra hasta que el paciente manifiesta un grado relevante de mejorfa desde el punto de vista medico en comparaci6n con la situaci6n inicial para el indicador o los indicadores elegidos.
Las realizaciones particulares de la presente invenci6n comprenden administrar un anticuerpo en una dosis de aproximadamente 1 ng de anticuerpo por kg de peso del sujeto por dfa ("1ng/kg/dfa") a aproximadamente 10 mg/kg/dfa, mas preferiblemente de aproximadamente 500 ng/kg/dfa a aproximadamente 5 mg/kg/dfa, y lo mas preferiblemente de aproximadamente 5 ug/kg/dfa a aproximadamente 2 mg/kg/dfa, a un sujeto. En realizaciones adicionales, un anticuerpo se administra a adultos una vez por semana, dos veces por semana o tres o mas veces por semana, para tratar una enfermedad, afecci6n o trastorno mediado por IL-4 y/o IL-13, p. ej., un trastorno medico descrito en la presente memoria. Si se inyecta, la cantidad eficaz de anticuerpo por dosis de adulto puede oscilar entre 1-20 mg/m2, y preferiblemente es de aproximadamente 5-12 mg/m2. Alternativamente, se puede administrar una dosis plana, la cantidad puede oscilar entre 5-100 mg/dosis. Un intervalo para una dosis plana es aproximadamente 20-30 mg por dosis. En una realizaci6n de la invenci6n, una dosis plana de 25 mg/dosis se administra repetidamente por inyecci6n. Si se emplea una ruta de administraci6n que no sea una inyecci6n, la dosis se ajusta apropiadamente de acuerdo con practicas medicas estandar. Un ejemplo de un regimen terapeutico comprende inyectar una dosis de aproximadamente 20-30 mg de anticuerpo anti-IL-4R una a tres veces por semana durante un periodo de por lo menos tres semanas, aunque puede ser necesario el tratamiento por periodos mas prolongados para inducir el grado deseado de mejorfa. Para sujetos pediatricos (edad 4-17), un regimen adecuado ilustrativo implica la inyecci6n subcutanea de 0,4 mg/kg, hasta una dosis maxima de 25 mg de anticuerpo administrada dos o tres veces por semana.
Las realizaciones particulares de los metodos provistos en la presente memoria implica la administraci6n subcutanea de 0,5 mg a 10 mg, preferiblemente de 3 a 5 mg, de un anticuerpo anti-IL-4R, una o dos veces por semanas. Otra realizaci6n se refiere a la administraci6n pulmonar (p. ej., con nebulizador) de 3 o mas mg de anticuerpo una vez por semana.
Los ejemplos de regfmenes terapeuticos provistos en la presente memoria comprenden la inyecci6n subcutanea de un anticuerpo anti-IL-4R una vez por semana, en una dosis de 1,5 a 3 mg, para tratar asma, sarcoidosis pulmonar, nefrosis con cambio mfnimo, uveftis autoinmunitaria, crisis drepanocftica, sfndrome de Churg-Strauss, sfndrome de Sjogren, sfndrome linfoproliferativo autoinmunitario, preclampsia, anemia hemolftica autoinmunitaria, es6fago de Barrett, enfermedad de Grave, enfermedad de Kawasaki y tuberculosis cavitaria. La administraci6n semanal de anticuerpo anti-IL-4R continua hasta que se obtiene un resultado deseado, p. ej., seden los sfntomas del sujeto. El tratamiento se puede retomar segun sea necesario o, alternativamente se pueden administrar dosis de mantenimiento.
En otra realizaci6n, un anticuerpo se administra al sujeto en una cantidad y durante un tiempo suficiente para inducir una mejorfa, preferiblemente una mejorfa sostenida, en por lo menos un indicador que refleja la gravedad del trastorno que se esta tratando. Se pueden evaluar diversos indicadores que reflejan el grado de enfermedad, trastorno o afecci6n del sujeto, para determinar si la cantidad y el tiempo del tratamiento son suficientes. Dichos indicadores incluyen, por ejemplo, indicadores clfnicamente conocidos de gravedad de la enfermedad, sfntomas o manifestaciones del trastorno en cuesti6n. En la mayorfa de los casos, se considera que una mejorfa es sostenida si el sujeto exhibe la mejorfa en por lo menos dos ocasiones separadas por dos a cuatro semanas. El grado de mejorfa en general es determinado por un medico, quien puede realizar su determinaci6n en base a signos y sfntomas, y puede tambien emplear cuestionarios que se administran al sujeto, tales como cuestionarios de calidad de vida creados para una enfermedad determinada.
Como ejemplo, en el tratamiento de hiperplasia prostatica benigna, se administra un anticuerpo anti-IL-4R al sujeto en una cantidad y durante un tiempo eficaz en la regresi6n de cicatrices o la curaci6n completa. Se pueden administrar dosis de mantenimiento o retomar el tratamiento segun sea necesario.
Los niveles elevados de IL-4 se asocian con una serie de trastornos, como se analiz6 anteriormente. Se pueden estudiar sujetos con un trastorno determinado para identificar a aquellos individuos que tengan niveles elevados de IL-4, o para identificar a aquellos con una respuesta inmunitaria de tipo TH2 elevada, identificando de esta forma a los sujetos que pueden beneficiarse mas a partir del tratamiento con un anticuerpo anti-IL-4R. Por consiguiente, los metodos de tratamiento provistos en la presente memoria comprenden opcionalmente una primera etapa de medir el nivel de IL-4 de un sujeto. Un anticuerpo anti-IL-4R puede administrarse a un sujeto en quien los niveles de IL-4 estan elevados por encima de lo normal. Alternativa o adicionalmente, se puede pre-estudiar a un sujeto para determinar si el sujeto tiene una respuesta inmunitaria de tipo TH2 elevada, antes de la administraci6n de un anticuerpo o anticuerpos y/o un antagonista o antagonistas contra una o mas citocinas de tipo TH2.
Los niveles de IL-4 de un sujeto (y opcionalmente de otras citocinas de tipo TH2) pueden monitorearse durante y/o despues del tratamiento con un anticuerpo anti-IL-4R, para detectar la reducci6n en los niveles de las citocinas. Para algunos trastornos, la incidencia de niveles elevados de IL-4, y el equilibrio entre respuestas inmunitarias de tipo TH1 y de tipo TH2 pueden variar de acuerdo con factores tales como la etapa de la enfermedad o la forma particular de la enfermedad. Se pueden emplear tecnicas conocidas para medir los niveles de IL-4, p. ej., en el suero de un sujeto, y para evaluar las respuestas inmunitarias de tipo TH2. Los niveles de citocina en las muestras de sangre se
pueden medir por ELISA, o por un ensayo de citocinas multiple LUMINEX� (Luminex Corporation, Austin, TX) o DELFIA� (PerkinElmer LifeSciences, Wallac Oy., Turku, Finlandia), por ejemplo.
Las realizaciones particulares de los metodos y composiciones de la invenci6n implican el uso de un anticuerpo anti-IL4R y uno o mas antagonistas de IL-4R adicionales, por ejemplo, dos o mas anticuerpos o derivados de anticuerpos de la invenci6n, o un anticuerpo o derivado de anticuerpo de la invenci6n y uno o mas de otros antagonistas de IL4R. En otras realizaciones, los anticuerpos anti-IL-4R se administran solos o combinados con otros agentes utiles para tratar la afecci6n con la que esta afectado el paciente. Los ejemplos de dichos agentes incluyen tanto farmacos proteinaceos como no proteinaceos. Cunado se co-administran multiples agentes terapeuticos, las dosis se pueden ajustar de manera acorde, como se reconoce en la tecnica pertinente. La "co-administraci6n" y la terapia de combinaci6n no se limitan a la administraci6n simultanea, pero incluyen regfmenes de tratamiento en los que se administra un anticuerpo IL-4R por lo menos una vez durante el curso del tratamiento que implica administrar por lo menos otro agente terapeutico al paciente.
Los ejemplos de otros agentes que se pueden co-administrar con los anticuerpos IL-4R son otros anticuerpos, citocinas o receptores de citocinas, que se escogen de acuerdo a la afecci6n particular que se ha de tratar. Alternativamente, los farmacos no proteinaceos que son utiles para tratar una de las afecciones particulares analizadas previamente se pueden co-administrar con un antagonista de IL-4R.
Para tratar afecciones mediadas por IgE, se puede co-administrar un anticuerpo anti-IL-4R con un antagonista de IgE. Un ejemplo es un anticuerpo anti-lgE, p. ej., XOLAIR� (Genentech, South San Francisco, CA). Los anticuerpos monoclonales de anti-lgE humanizados se describen, por ejemplo, en Presta et a/., 1993, J. Immunol. 151:2623-32 y en Adelroth et a/., 2000, J. Allergy Clin. Immunol. 106:253-59.
Los anticuerpos anti-IL-4R se pueden co-administrar con un antagonista de IL-5, que puede ser una molecula que interfiere con la uni6n de IL-5 a un receptor de IL-5, tal como un anticuerpo anti-IL-5R o anti-IL-5 (p. ej., un anticuerpo monoclonal anti-IL-5 o anti-IL-5R humano o humanizado), o un receptor tal como un polipeptido del receptor de IL-5 soluble humano. La IL-5 ha desempenado una funci6n en mediar respuestas alergicas. Por lo tanto, se contempla la administraci6n de un antagonista(s) de IL-4R e IL-5 para el tratamiento de reacciones alergicas, incluyendo sin limitaci6n, asma alergica.
Otros ejemplos de agentes que se pueden utilizar junto con los anticuerpos de IL-4R incluyen anticuerpos anti-IL-4, mutefnas de IL-4, derivados de uni6n a IL-4 de IL-4R (como se describe, p. ej., en las patentes estadounidenses 5,840,869; 5,599,905, 5,856,296, 5,767,065, 5,717,072, 6,391,581, 6,548,655, 6,472,179 y 5,844,099), derivados de uni6n a IL-13 de IL-13, derivados quimericos de uni6n a IL-4 y/o IL-13 de IL-4R y IL-13R, lutefnas de IL-13 y antagonistas de CD23 (p. ej., anticuerpos anti-CD23 tales como IDEC-152� (IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA), Fosfodiesterasa 4 (p. ej., ROFLUMILAST�, Byk Gulden Pharmaceuticals, Konstanz, Alemania), integrinas (p. ej., R411�, Roche, Nutley, NJ), TIMs, Gob5, STAT6 y leucotrienos.
Para tratar el asma, un anticuerpo IL-4R puede co-administrarse con otros medicamentos antiasmaticos, tales como corticosteroides inhalados, beta agonistas, antagonistas de leucotrienos, xantinas, fluticasona, salmeterol, albuterol, agentes no esteroideos tales como cromolina, y similares. Los anticuerpos IL-4R pueden co-administrarse con otros antialerigcos para tratar reacciones alergicas.
Una realizaci6n de la presente invenci6n se refiere a la co-administraci6n de un anticuerpo o derivado de anticuerpo de la invenci6n y fluticasona y/o salmeterol para tratar un trastorno tal como asma. Las composiciones que comprenden un anticuerpo o derivado de anticuerpo de la invenci6n, fluticasona, y salmeterol se proveen en la presente memoria. ADVAIR DISKUS� (GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC) comprende fluticasona propionato y salmeterol xinafoato. ADVAIR DISKUS � y el anticuerpo o derivado de anticuerpo se pueden administrar por cualquier ruta de administraci6n eficaz para tratar o prevenir una enfermedad, trastorno, lesi6n o afecci6n particular, p. ej., por inhalaci6n para tratar el asma.
Otro ejemplo de terapia combinada comprende la co-administraci6n de un anticuerpo o derivados de anticuerpo de la invenci6n y un antagonista de IL-9 a un paciente que padece asma. Se puede emplear cualquier antagonista de IL-9 adecuado, tal como un receptor de IL-9 (p. ej., su forma soluble), un anticuerpo que interfiere con la uni6n de IL9 a un receptor de superficie celular (p. ej., un anticuerpo que se une a IL-9 o a un polipeptido del receptor de IL-9),u otro compuesto que inhibe la actividad biol6gica inducida por IL-9. Los receptores de IL-9 incluyen aquellos descritos en el documento WO 93/18047 y en las patentes estadounidenses 5,789,237 y 5,962,269, que se incorporan a la presente memoria por referencia.
En una realizaci6n adicional de una terapia combinada, un metodo para tratar colitis ulcerosa comprende la coadministraci6n de un anticuerpo o derivado de anticuerpo de la invenci6n y por lo menos un antagonista de IL-1. Los ejemplos de antagonistas de IL-1 incluyen el receptor de IL-1 de tipo I, el receptor de IL-1 de tipo II, un antagonista del receptor de IL-1 (IL-1Ra), anticuerpos antagonistas (bloqueantes) dirigidos contra IL-1, y anticuerpos antagonistas dirigidos contra un receptor de IL-1. Se pueden emplear diversas formas de los receptores, tales como fragmentos, variantes y fusiones, por ejemplo, una forma soluble del receptor de IL-1 de tipo II, p. ej., como se describe en la patente estadounidense 5,350,683, incorporada a la presente memoria por referencia.
Un metodo de la presente invenci6n comprende co-administrar un anticuerpo o derivado de anticuerpo de la presente invenci6n, solo o combinado con un antagonista(s) de IL-13, a un paciente que padece nefrosis con cambio mfnimo, p. ej., para reducir la gravedad de la enfermedad.
Otro metodo provisto en la presente invenci6n es un metodo para tratar diversas afecciones inflamatorias alergicas, que comprende co-administrar un anticuerpo o derivado de anticuerpo de la invenci6n y un antagonista(s) de IL-13. Las afecciones tales como asma, alergias y enfermedades pulmonares cr6nicas tales como fibrosis qufstica y enfermedad pulmonar obstructiva cr6nica se tratan con dicho metodo.
Se puede emplear cualquier antagonista de IL-13 adecuado, incluyendo sin limitaci6n, receptores de IL-13 (preferiblemente sus formas solubles), antagonistas del receptor de IL-13, anticuerpos dirigidos contra IL-13 o IL13R, otras protefnas que interfieren con la uni6n de IL-13 a una IL-13R, y compuestos que inhiben la transducci6n de senales mediada por IL-13. Los receptores de IL-13 y los heterodfmeros que comprenden polipeptidos de IL-13R como sus componentes se han descrito anteriormente en la presente memoria. Se puede estudiar la capacidad de los anticuerpos que se dirigen contra IL-4R de funcionar como antagonistas de IL-13, como se analiz6 previamente en este documento.
Un metodo para tratar o prevenir una afecci6n caracterizada por una reducci6n del funcionamiento de la barrera epitelial comprende co-administrar un anticuerpo o derivado de anticuerpo de la invenci6n y uno o mas antagonistas de IL-13. Dichas afecciones se analizaron anteriormente en la presente memoria. En una realizaci6n, la afecci6n es asma. Las realizaciones particulares se refieren a co-administrar uno o mas anticuerpos o derivados de anticuerpos de la invenci6n y uno o mas antagonistas de IL-13 a un paciente que padece una afecci6n que implica la reducci6n del funcionamiento de la barrera epitelial o del funcionamiento de la barrera epitelial intestinal, donde tanto la IL-4 como la IL-13 desempenan una funci6n en la reducci6n del funcionamiento de la barrera. El efecto adverso de IL-13 en el funcionamiento de la barrera epitelial pulmonar e intestinal puede confirmarse usando tecnicas de ensayos tales como aquellas descritas en el Ejemplo 3. Vease tambien Zund et a/., 1996, J. Biol. Chem. 271:7460-64.
Otro metodo provisto en la presente invenci6n comprende co-administrar un anticuerpo o derivados de anticuerpo de la invenci6n e interfer6n-y (IFN-y) a un paciente que tiene una afecci6n que implica la reducci6n del funcionamiento de la barrera epitelial. Opcionalmente, dicho metodo comprende ademas co-administrar uno o mas antagonistas de IL-13 al paciente (es decir, co-administrar un anticuerpo o derivado de anticuerpo de la invenci6n, IFN-y, y un antagonista de IL-13). En una realizaci6n, el paciente padece asma. El anticuerpo o derivado de anticuerpo de la invenci6n, IFN-y y/o antagonista de IL-13 se puede administrar a traves de cualquier metodo de administraci6n eficaz para tratar o prevenir una enfermedad, trastorno, afecci6n o lesi6n particular, p. ej., para tratar asma, mediante inhalaci6n o inyecci6n.
Un metodo provisto en la presente memoria para tratar asma comprende administrar un anticuerpo o derivado de anticuerpo de la invenci6n e interfer6n-y a un ser humano que padece asma. Otro metodo para tratar asma comprende co-administrar un anticuerpo o derivado de anticuerpo de la invenci6n, IFN-y y un antagonista de IL-13 a un ser humano que padece asma. En una realizaci6n, el IFN-y se co-administra a un paciente asmatico, junto con un anticuerpo que funciona como antagonista tanto de IL-4 como de IL-13. Los ejemplos de dichos anticuerpos se describen en la presente memoria.
Un anticuerpo o derivado de anticuerpo de la invenci6n solo puede funcionar como antagonista de IL-4 y antagonista de IL-13, como se analiz6 anteriormente. Como ejemplo de dicho agente, algunos anticuerpos dirigidos contra IL4Ra pueden interferir con la uni6n tanto de complejos del receptor de IL-4 como de IL-13, debido al componente de IL-4Roc compartido en dichos complejos de receptores de multiples subunidades (anteriormente analizados). Por lo tanto, un anticuerpo o derivado de anticuerpo de la invenci6n solo puede emplearse en un metodo para inhibir la reducci6n del funcionamiento de la barrera.
Un anticuerpo o derivado de anticuerpo de la invenci6n puede co-administrarse con uno o mas antagonistas de los receptores de leucotrienos para tratar trastornos tales como enfermedades inflamatorias alergicas, p. ej., asma y alergias. Los ejemplos de antagonistas de los receptores de leucotrieno incluyen, aunque sin limitarse a ello, montelukast (p. ej., SINGULAR�, Merck & Co., Whitehouse, NJ), pranlukast (p. ej., ONON�, Ono Pharmaceuticals, Osaka, Jap6n) y zafirlukast (p. ej., ACCOLATE�, AstraZeneca, Wilmington, DE). Los farmacos que funcionan como inhibidores de 5-lipoxigenasa se pueden co-administrar con un antagonista de IL-4R para tratar el asma.
Los metodos provistos en la presente memoria comprenden administrar un anticuerpo o derivado de anticuerpo de la invenci6n y uno o mas de los siguientes a pacientes que padecen el sfndrome de Churg-Strauss: antagonista(s) de IL-4R, antagonista(s) de IL-5, antagonista(s) de IL-13 y antagonista(s) de IgE. Un ejemplo de dicho metodo implica co-administrar un anticuerpo o derivado de anticuerpo de la invenci6n y un antagonista(s) de IL-5 a un paciente que padece sfndrome de Churg-Strauss. En otra realizaci6n, un anticuerpo o derivado de anticuerpo de la invenci6n y un antagonista(s) de IgE se co-administran al paciente. Incluso en otra realizaci6n, un anticuerpo o derivado de anticuerpo y un antagonista(s) de IL-13 se co-administran al paciente.
La hormona relaxina se puede co-administrar con un anticuerpo o derivado de anticuerpo de la invenci6n para tratar esclerodermia (esclerosis sistemica), fibrosis pulmonar idiopatica o cualquier otro trastorno caracterizado por fibrosis
pulmonar idiopatica, tal como afecciones que implican fibrosis del pulm6n anteriormente analizadas en este documento. Se prefiere la relaxina humana recombinante para uso en el tratamiento de seres humanos.
Un metodo para tratar hiperplasia prostatica benigna comprende co-administrar un anticuerpo o derivado de anticuerpo de la invenci6n y uno o mas agentes anti-inflamatorios adicionales.
Los ejemplos de agentes que inhiben la inflamaci6n incluyen antagonistas del factor de necrosis tumoral (TNF) y antagonistas de IL-17.
Se puede emplear cualquier antagonista de IL-17 adecuado, incluyendo sin limitaci6n, un receptor de IL-17 (p. ej., sus formas solubles), antagonistas del receptor de IL-17, anticuerpos dirigidos contra IL-17 o un receptor de IL-17, otras protefnas que interfieren con la uni6n de IL-17 a un receptor de IL-17, y compuestos que inhiben la transducci6n de senales mediada por IL-17. Un receptor de IL-17, incluyendo sus formas solubles y sus olig6meros, se describe en el documento WO 96/29408, incorporado a la presente memoria por referencia. Una alternativa provista en la presente invenci6n comprende administrar un antagonista de IL-17 para tratar a un paciente con hiperplasia prostatica benigna.
Asimismo, se puede emplear cualquier antagonista de TNF adecuado, incluyendo sin limitaci6n, un receptor de TNF (preferiblemente sus formas solubles), protefnas de fusi6n que comprenden un receptor de TNF (o que comprenden la porci6n de uni6n a TNF de un receptor de TNF), antagonistas del receptor de TNF, anticuerpos dirigidos contra TNF o un receptor de TNF, otras protefnas que interfieren con la uni6n de TNF al receptor de TNF, y compuestos que inhiben la transducci6n de senales mediada por TNF. Otros ejemplos de inhibidores de TNF son los farmacos talidomida y pentoxifilina. Preferiblemente, se emplea la protefna del receptor de TNF conocida como p75 o p80 TNF-R. Un antagonista de TNF preferido es un receptor de TNF humano soluble (sTNF-R) en forma dimerica, tal como dfmeros de protefnas de fusi6n sTNF-R/Fc. Uno de dichos dfmeros es etanercept (ENBREL�, Immunex Corporation, Seattle, WA). La protefna p75/p80 TNF-R, incluyendo sus fragmentos solubles y otras formas, se describe en el documento WO 91/03553, incorporado a la presente memoria por referencia.
Por consiguiente, en una realizaci6n de la presente invenci6n, un anticuerpo o derivado de anticuerpo de la invenci6n se co-administra con un antagonista de TNF para tratar cualquier afecci6n en la que las respuestas inmunitarias mediadas por IL-4R o inducidas por TNF desempenan una funci6n, tal como inflamaci6n. Un metodo provisto en la presente invenci6n comprende co-administrar un anticuerpo o derivado de anticuerpo de la invenci6n y un antagonista de TNF a un paciente con enfermedad inflamatoria de los intestinos, enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa. Otras realizaciones se refieren a un metodo que comprende co-administrar un anticuerpo o derivado de anticuerpo de la invenci6n y un antagonista de TNF a un paciente que padece enfermedad de Kawasaki, anemia hemolftica autoinmunitaria, uveoretinitis autoinmunitaria, sfndrome linfoproliferativo autoinmunitario, sfndrome de Sjogren, sfndrome de fatiga cr6nica o hepatotoxicidad inducida por un farmaco tal como diclofenac.
Otro metodo provisto en la presente invenci6n comprende co-administrar un anticuerpo o derivado de anticuerpo de la invenci6n y un antagonista de TNF a una mujer embarazada que experimenta preclampsia. En una realizaci6n, la administraci6n del anticuerpo o derivado de anticuerpo de la invenci6n con el antagonista de TNF continua durante todo el embarazo.
Las dosis adecuadas de etanercept variaran de acuerdo con la naturaleza de la enfermedad que se ha de tratar, la gravedad de la enfermedad, el tamano del paciente (p. ej., adulto o nino) y otros factores, como se reconoce en el campo correspondiente. En una realizaci6n de los metodos provistos en la presente invenci6n, ENBREL� se administra dos veces por semana por inyecci6n subcutanea en una dosis de 1 a 25 mg. Una realizaci6n de una dosis pediatrica es 0,4 mg/kg. Los metodos particulares provistos en la presente memoria comprenden coadministrar un anticuerpo o derivado de anticuerpo de la invenci6n y ENBREL� a un paciente que padece el sfndrome linfoproliferativo autoinmunitario, o el sfndrome de Sjogren, donde ENBREL� se administra por inyecci6n subcutanea en una dosis de 1 a 25 mg.
Para tratar la enfermedad de injerto contra hospedante ("GVHD"), un anticuerpo o derivado de anticuerpo de la invenci6n se administra con por lo menos uno de los siguientes agentes: un antagonista de TNF, un antagonista de IL-1, esteroides o corticosteroides. En una realizaci6n, el inhibidor de TNF es ENBREL�. En otra realizaci6n, el antagonista de IL-1 es una forma soluble del receptor de IL-1 de tipo II, p. ej., como se describe en la patente estadounidense 5,350,683. En otra realizaci6n, la GVHD se asocia con (p. ej., se desarrolla con posterioridad a) trasplante de medula 6sea. Un anticuerpo o derivado de anticuerpo de la invenci6n se puede emplear combinado con por lo menos uno de los agentes anteriormente enumerados, en metodos para suprimir una respuesta inmunitaria dirigida contra celulas, tejido y/o aloantfgeno trasplantados.
Se describe en la presente memoria una serie de antagonistas de citocinas y otros agentes/farmacos como utiles para la terapia combinada (p. ej., co-administraci6n con un anticuerpo o derivado de anticuerpo de la invenci6n) en el tratamiento de enfermedades particulares. Se ha de entender que dichos antagonistas, agentes o farmacos tambien pueden encontrar utilidad como agentes individuales en el tratamiento de esas enfermedades. Tambien se ha de entender que la descripci6n de los metodos que implican la administraci6n de un antagonista a una citosina particular, para tratar una enfermedad, abarca la administraci6n de un tipo de antagonista para esa citosina, a menos que se especifique otra cosa.
EJEMPLO 1: Preparaci6n de anticuerpos monoclonales
Este ejemplo demuestra un metodo para preparar anticuerpos monoclonales que reconocen el receptor de IL-4 humano.
Los polipeptidos del receptor de IL-4 pueden emplearse como inmun6genos en la generaci6n de anticuerpos monoclonales por tecnicas convencionales, p. ej., las tecnicas descritas en la patente estadounidense 5,599,905, incorporada a la presente memoria por referencia en su totalidad. Se reconoce que se pueden emplear polipeptidos en diversas formas como inmun6genos, p. ej., protefnas de longitud total, sus fragmentos, sus protefnas de fusi6n tales como fusiones Fc, celulas que expresan la protefna recombinante en la superficie celular, etc.
Para resumir un ejemplo de dicho procedimiento, se inyecta subcutaneamente a ratas Lewis un inmun6geno de IL4R emulsionado en adyuvante de Freund completo, en cantidades que oscilan entre 10-100 �l. Tres semanas despues, los animales inmunizados reciben un refuerzo de inmun6geno adicional emulsionado en adyuvante de Freund incompleto y otro refuerzo cada tres semanas de allf en mas. Se toman peri6dicamente muestras sericas por sangrado retro-orbital o extirpaci6n de la punta del rabo para ensayar por inmunotransferencia, ELISA (enzimoinmunoanalisis de adsorci6n), o inhibici6n de uni6n de 125l-IL-4 a extractos de celulas que expresan IL-4R. Tras la detecci6n de una titulaci6n de anticuerpos apropiada, los animales positivos reciben una inyecci6n intravenosa final de antfgeno en soluci6n salina. Tres o cuatro dfas despues, los animales son sacrificados, se cosechan los esplenocitos y se condensan a la lfnea celular de mieloma murino AG8653. Las lfneas celulares de hibridoma resultantes se disponen en multiples placas de microtitulaci6n en un medio selectivo HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferaci6n de celulas no condensadas, hfbridos de mieloma e hfbridos de celulas de bazo.
Se detecta la reactividad con IL-4R de los clones de hibridoma asf generados. La detecci6n inicial de los sobrenadantes de hibridoma utiliza una captura de anticuerpos y la uni6n al receptor de 125l-IL-4 parcialmente purificado. Los hibridomas que son positivos en el metodo de detecci6n se ensayan con una captura de anticuerpos modificada para detectar celulas de hibridoma que estan produciendo anticuerpo bloqueante. Se detectan, por lo tanto, hibridomas que segregan un anticuerpo monoclonal capaz de inhibir la uni6n de 125l-IL-4 a las celulas que expresan IL-4R. Dichos hibridomas luego se inyectan en las cavidades peritoneales de ratones atfmicos para producir ascitis que contiene altas concentraciones (>1 mg/ml) de anticuerpo monoclonal anti-IL-4R. Los anticuerpos monoclonales resultantes se pueden purificar por precipitaci6n de sulfato de amonio seguida por cromatograffa de exclusi6n en gel, y/o cromatograffa de afinidad en base a la uni6n de anticuerpo a la protefna G.
Los metodos para generar anticuerpos humanos en ratones transgenicos se han descrito y se conocen en la tecnica. Veanse, p. ej., Chen et a/., 1993, Internal Immunol. 5: 647-56; Chen et a/., 1993, EMBO J. 12: 821-30; Choi et a/., 1993, Nature Genetics 4: 117-23; Fishwild et a/., 1996, Nature Biotech. 14: 845-51; Harding et a/., 1995, Annals New York Acad. Sci.; Lonberg et a/., 1994, Nature 368: 856-59; Lonberg, 1994, Handbook Exper.l Pharmacol. 113: 49101; Lonberg et a/., 1995, Internal Rev. Immunol. 13: 65-93; Morrison, S, 1994, Nature 368: 812-13; Neuberger, 1996, Nature Biotech. 14: 826; Taylor et a/., 1992, Nuc. Acids Res. 20: 6287-95; Taylor et a/., 1994, Internal Immunol. 6: 579-91; Tomizuka et a/., 1997, Nature Genetics 16:133-43; Tomizuka et a/., 2000, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 97: 722-27; Tuaillon et a/., 1993, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 3720-24; Tuaillon et a/., 1994, J. Immunol. 152: 2912-20; Russel et a/., 2000, Infection and Immunity abril 2000:1820-26; Gallo et a/., 2000, Eur. J. Immunol. 30: 53440; Davis et a/., 1999, Cancer Metastasis Rev. 18:421-25; Green, 1999, J. Immunol. Methods 231:11-23; Jakobovits, 1998, Advanced Drug Delivery Rev. 31:33-42; Green et a/., 1998, J. Exp. Med. 188: 483-95; Jakobovits, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs 7: 607-14; Tsuda et a/., 1997, Genomics 42: 413-21; Mendez et a/., 1997, Nature Genetics 15:146-56; Jakobovits, 1996, Weir's Handbook of Experimental Immunology, The Integrated Immune System Vol. IV, 194.1-194.7; Mendez et a/.,1995, Genomics 26: 294-307; Jakobovits, 1994, Current Biol. 4: 761-63; Arbones, 1994, Immunity 1: 247-60; Green et. a/., 1994, Nature Genetics 7: 13-21; Jakobovits et a/., 1993, Nature 362: 255-58; Jakobovits et a/., 1993, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 2551-55.
EJEMPLO 2: Ensayo para evaluar la actividad bloqueante
Este ejemplo demuestra un ensayo que se puede utilizar para identificar anticuerpos que reducen la IL-4 y/o la expresi6n de CD23 dependiente de IL-13. El ensayo se basa en la capacidad tanto de IL-4 como de IL-13 de potenciar la expresi6n del antfgeno de superficie asociado con la activaci6n de CD23 en celulas B humanas.
Se ensayan anticuerpos dirigidos contra IL-4R humano (hulL-4R) o bien en la forma de sobrenadantes de hibridoma
o protefna purificada. Antes de la adici6n a cultivos, los anticuerpos se intercambian de tamp6n contra el medio de cultivo (RPM11640 mas 10% suero bovino fetal inactivado por calor) por centrifugaci6n, usando dispositivos de filtro Centricon (Amicon) con un valor de corte de 10kDa.
Se purifican celulas B de sangre periferica humana como se describi6 previamente (Morris et a/., 1999, J. Biol. Chem. 274:418-23). Las celulas B (3x105/pocillo) en medio de cultivo se disponen en placas de microtitulaci6n con fondo redondo de 96 pocillos y se preincuban a temperatura ambiente durante 30 min con los anticuerpos de ensayo en la concentraci6n final indicada. Luego se anade IL-4 o IL-13 humana recombinante a los cultivos en las concentraciones indicadas, y las celulas se cultivan durante 20-24 horas a 37° C en una atm6sfera humidificada de 5% C02. Al final del periodo de cultivo, las celulas se lavan una vez en PBS � 0,02% NaN3 en la placa de cultivo de
96 pocillos y se resuspenden en tamp6n bloqueante (2% suero de conejo normal � 1 % suero de cabra normal en PBS � NaN3). Se anaden luego anticuerpo monoclonal (mAb) CD23 conjugado a ficoeritrina (PE) o mAb control de isotopo conjugado a PE (ambos de Pharmingen) a las celulas a una diluci6n final de 1:10. Las celulas se incuban durante 30 minutos a 4° C, se lavan x3 en PBS � NaN3 y se analizan en FacScan (Becton Dickinson) para expresi6n de CD23.
Las celulas cultivadas con medio de crecimiento de hibridoma o anticuerpo anti-hIL-4R humano no bloqueante aparejado al isotopo se incluyen como controles negativos. Se utiliza un mAb murino anti-hulL-4R (MAB 230, R&D Systems, Minneapolis, MN), que previamente se demostr6 que bloquea la uni6n y el funcionamiento tanto de hlL-4 como de hlL-13, como control positivo para neutralizaci6n de inducci6n de CD23 por parte de IL-4 e IL-13.
EJEMPLO 3: Ensayos para medir la perdida del funcionamiento de la barrera
Este ejemplo provee metodos para evaluar la capacidad de un antagonista de IL-4 de inhibir el dano inducido por IL4 al tejido epitelial y la perdida del funcionamiento de la barrera epitelial.
En un aspecto, la presente invenci6n provee un metodo para usar un antagonista de IL-4 a fin de inhibir el dano inducido por IL-4 al epitelio, incluyendo sin limitaci6n el epitelio pulmonar o el epitelio intestinal. El dano al epitelio puede producir la perdida del funcionamiento de la barrera. Los siguientes son ejemplos no limitativos de tecnicas que se pueden emplear para evaluar la capacidad de un antagonista de IL-4 de inhibir el dano inducido por IL-4 al epitelio y la perdida del funcionamiento de la barrera epitelial.
Se conocen las celulas que se pueden emplear en la preparaci6n de modelos in vitro de epitelio (barreras epiteliales). Por ejemplo, las celulas epiteliales de pulm6n humano Calu-3 son adecuadas para uso en estudios del funcionamiento de la barrera epitelial (Ahdieh et a/., 2001, Am. J. Physiol. Cell Physiol. 281:C2029-38). Otra lfnea celular adecuada es la lfnea celular epitelial intestinal humana designada T84. Las celulas T84 se cultivan bajo condiciones que producen la formaci6n de una monocapa de celulas epiteliales en un soporte permeable, como se describe en Madara et a/., 1985, J. Cell Biol., 101:2124-33, Madara et a/., 1989, J. Clin. Invest. 83:724-27 y Youakim et a/., 1999, Am. J. Physiol. 276 (Gastrointest. Liver Physiol. 39):G1279-88. La monocapa epitelial asf generada simula la barrera epitelial intestinal.
Se ensaya una propiedad de las monocapas cultivadas (p. ej., resistencia a flujo i6nico transepitelial pasivo) que puede distinguir un epitelio intacto de un epitelio danado. Dicho ensayo determina si un compuesto radiomarcado particular es capaz de atravesar una monocapa epitelial. La fuga del compuesto radiomarcado a traves de la monocapa indica que la barrera es permeable en lugar de intacta. Por ejemplo, el analisis de flujo de manitol se puede usar para detectar dano epitelial, evaluando el movimiento del manitol radiomarcado (p. ej., 3H manitol) a traves de una monocapa (vease Madara and Stafford, mas arriba).
Otros ejemplos de metodos para evaluar la condici6n de un epitelio incluyen metodos de diagn6stico por imagenes
(p.
ej., aquellos analizados en Madara and Stafford, mas arriba) y mediciones de resistencia electrica transepitelial
(p.
ej., aquellas analizadas en Youakim and Ahdieh, mas arriba).
La patente estadounidense 6,033,688 ("la patente '688"), incorporada a la presente memora por referencia en su totalidad, tambien describe procedimientos que se pueden emplear en estudios de permeabilidad de barreras, vease, p. ej., los Ejemplos 1 y 4 de la patente. Las celulas epiteliales de traquea humana se cultivan bajo condiciones que producen una monocapa que exhibe resistencia electrica transepitelial. La resistencia transepitelial (que indica una barrera intacta) se determina usando un voltfmetro. El efecto de una sustancia o tratamiento en la monocapa epitelial se evalua exponiendo la monocapa a la sustancia o tratamiento, y luego midiendo las actividades de transporte i6nico en Ussing chambers (columna 8, lfneas 40-56).
Se pueden llevar a cabo procedimientos similares utilizando monocapas generadas a partir de otros tipos de celulas,
p. ej., celulas epiteliales bronquiales de un paciente con fibrosis qufstica humana (vease la patente '688, ejemplo 4, columna 11).
Por consiguiente, la capacidad de una sustancia o tratamiento de inhibir la reducci6n inducida por IL-4 en el funcionamiento de la barrera de una capa epitelial se puede evaluar exponiendo la capa epitelial a IL-4 y a la sustancia o tratamiento, ensayando el estado de la capa epitelial y comparando el estado de la capa epitelial con el estado de una capa epitelial que ha sido expuesta a IL-4 en ausencia de la sustancia. Una mejorfa en el estado de la capa epitelial expuesta a la sustancia o tratamiento en relaci6n con una capa epitelial no expuesta a la sustancia o tratamiento indica que la sustancia o tratamiento inhibe el dano inducido por IL-4 al tejido epitelial y la perdida de funcionamiento de la barrera epitelial.
En dicho ensayo, una monocapa de celulas T84 se us6 como modelo in vitro de una barrera epitelial intestinal, como se analiz6 anteriormente. Se descubri6 que la IL-4 anadida al lado basolateral de celulas epiteliales polarizadas reduce el funcionamiento de la barrera en 70% dentro de 48-72 horas de tratamiento. Cuando se anadi6 un polipeptido del receptor de IL-4 soluble, que consistfa en el dominio extracelular. simultaneamente con IL-4, se evit6 la reducci6n del funcionamiento de la barrera, y la barrera se mantuvo en el mismo nivel que las celulas no tratadas (control).
El procedimiento de ensayo tambien se llev6 a cabo en una monocapa derivada de celulas epiteliales de pulm6n, que sirvi6 como modelo in vitro de una barrera epitelial pulmonar. Se descubri6 que la IL-4 anadida al lado basolateral de las celulas epiteliales polarizadas reduce el funcionamiento de la barrera en 50% dentro de 48-72 horas de tratamiento. Cuando se anadi6 el polipeptido del receptor de IL-4 simultaneamente con IL-4, se evit6 la reducci6n del funcionamiento de la barrera, y la barrera se mantuvo en el mismo nivel que las celulas no tratadas (control).
EJEMPLO 4: Ensayos para medir la actividad de uni6n
Este ejemplo provee metodos para evaluar la actividad de uni6n de un anticuerpo anti-IL-4R.
Anti-hulL-4R (o su variante, derivado o fragmento), se radiomarca con 125l usando un analogo de cloramina T en fase s6lida (IODOGEN�, Pierce, St. Louis, MO) u otra tecnica de radiomarcado adecuada, hasta una actividad especffica de aproximadamente 3 x 1016 cpm/mmol. La perdida de bioactividad se evalua comparando la inhibici6n de la uni6n u otro ensayo de inhibici6n biol6gica con la correspondiente protefna no marcada. Alternativamente, se puede medir la inhibici6n de la uni6n de IL-4 radiomarcada por anti-hulL-4R (o su variante o fragmento). Los ensayos de uni6n de equilibrio en celulas que expresan IL-4R se realizan en bandejas de microtitulaci6n de 96 pocillos sustancialmente como se describe en Idzerda, et a/, 1990, J. Exp. Med. 171:3 861-73. En sfntesis, diluciones en serie de protefna radiomarcada en medio de uni6n (RPMI 1640, 2,5% BSA, HEPES 20 mM, 0,02% azida de sodio, pH 7,2), enriquecido con 0,5 mg/ml de IgG humana y 5% de suero humano), se incuban con celulas (2,5 x 106/pocillo) durante 2 horas a 4° C en un volumen total de 150 microlitros. Sondas radiomarcadas libres y ligadas se separan por microcentrifugaci6n a traves de una mezcla de ftalato-aceite de separaci6n, y se cuentan en un contador gamma. Los ensayos de inhibici6n utilizan protefna radiomarcada a una concentraci6n constante de 0,5 nM en presencia o ausencia de inhibidores potenciales. La uni6n no especffica se determina en presencia de un exceso de 100 veces protefna no marcada. Las curvas te6ricas basadas en el modelo de inhibici6n competitiva de un solo sitio se ajustan a los datos descritos en Dower et a/., 1984, J Immunol. 132:751.
El porcentaje de inhibici6n se calcula de acuerdo con la ecuaci6n l(%) � �100 Ki(l)/�1� Ka(L) � Ki(l)�, donde I es la concentraci6n molar de inhibidor, L es la concentraci6n molar de protefna radiomarcada y Ki y Ka son las constantes de afinidad del inhibidor y la protefna, respectivamente.
Los isotermos de uni6n de equilibrio e inhibici6n competitiva pueden tambien determinarse en placas de microtitulaci6n de 96 pocillos revestidas con IL-4R/Fc o una protefna Fc control, capturada a traves de anticuerpo policlonal Fc anti-humano de cabra (u otro anticuerpo Fc anti-humano adecuado). En sfntesis, las placas se incuban con 5 microgramos/ml de Fc anti-humano en PBS a 4° C, se lavan dos veces con PBS y luego se incuban con IL-4R/Fc o una protefna Fc control en PBS/0,01% Tween 20 durante aproximadamente 12 horas a 4° C y se lavan nuevamente dos veces con PBS. Los isotermos de uni6n de equilibrio utilizan diluciones en serie de protefna de uni6n marcada con 12Sl en medio de uni6n, y los ensayos de inhibici6n utilizan una constante de 0,5 nM de anti-hulL4R marcado con 125l en presencia o ausencia de inhibidores competitivos no marcados, potenciales, como se describi6 mas arriba. Despues de 2 horas a 4° C, las placas se lavan dos veces en PBS, y la protefna especfficamente unida se libera con citrato 50 mM (pH 3,0), o tratamiento de SDS, y se mide la anti-hulL-4R marcada con 125l liberada en un contador gamma. Los datos se procesan como se describe en Dower et a/, mas arriba.
La actividad de uni6n se puede evaluar tambien por resonancia de plasmones superficiales, utilizando un biosensor BIACORE� (BIAcore International AB, Uppsala, Suecia). En sfntesis, se acopla covalentemente anticuerpo especffico de cadena gamma, IgG antihumano de cabra (u otro anticuerpo especffico de cadena gamma adecuado; GHFC) a chips de un biosensor usando un procedimiento estandar de acoplamiento de amina y reactivos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se inyecta anti-hulL-4R o un anticuerpo control en GHFC inmovilizado, y se pasan cantidades variables de IL-4R independientemente sobre un chip recubierto con GHFC (control negativo) como tambien chip recubierto con anti-hulL-4R. La regeneraci6n del chip se logra con un pulso de 10 microlitos de acido fosf6rico 100 mM a 10 microlitros/minuto. Toda la uni6n se efectua en HBS (HEPES 10 mM, NaCl 0,15 M, EDTA 3,4 mM, 0,02% NaN3, 0,005% tensioactivo P20, pH 7,4).
EJEMPLO 5: Anticuerpos de uni6n al receptor de IL-4
Este ejemplo proporciona las secuencias de aminoacidos, y las secuencias de nucle6tidos que los codifican, de los dominios variables de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos y derivados de anticuerpos que se unen a hulL-4R.
Se aisl6 un anticuerpo lgG4 totalmente humano que comprendfa la regi6n variable de la cadena ligera de L1 y la regi6n variable de la cadena pesada de H1, tal como se describe en el Ejemplo 8 del documento WO 01/92340 (publicado el 6 de diciembre de 2001), incorporado a la presente memoria por referencia en su totalidad.
La regi6n variable de la cadena pesada H1 se aisl6 por clonaci6n de cDNA de la lfnea celular de hibridoma que produjo el anticuerpo L1H1 mediante la reacci6n en cadena de la polimerasa (PCR) usando los siguientes oligonucle6tidos como cebadores:
GTCGACGCCGCCACCATGGA(A/G)TT(G/T)GGGCTGAGCTGG (SEC ID NO:70)
Sa/ I
Degenerado; comp/ementario a VH����
CTTGACCAGGCAGCCCAGGGC (SEC ID NO:71)
Comp/ementario a huIgG, �'de Apa sitio I
El producto de ampliaci6n se insert6 como un fragmento Sa/ I/Apa I en pGem-T easy (Promega, Madison, Wl). Con el fin de mejorar la escisi6n, la secuencia inicial H1 nativa se reemplaz6 con la secuencia inicial H1 VH3-30 (Matsuda et a/., 1993, Nature Genetics 3:88-94).
La mutagenesis basada en oligonucle6tidos del dominio variable de la cadena pesada de H1 se us6 para crear las secuencias de domino variable de la cadena pesada H2-H14, que se muestran en la Figura 3. Se demostr6 que cada una de estas secuencias de dominio variable de la cadena pesada se une, en combinaci6n con la secuencia de dominio variable de la cadena ligera de L1, al receptor de IL-4 alfa, usando un enzimoinmunoanalisis de adsorci6n (ELISA).
Se generaron genes de cadena variable ligera humana virgen por PCR a partir de celulas B humanas y se utilizaron para construir una genoteca de cDNA de regi6n variable. Estos se estudiaron en combinaci6n con la regi6n variable de la cadena pesada H1 para uni6n al receptor de IL-4 humana. Las regiones variables de la cadena ligera L2-L6 se identificaron usando este metodo. Sus secuencias de nucle6tidos y aminoacidos se muestran en las Figuras 2 y 3, respectivamente, donde las regiones CDR de cada cadena se indican en negrita y subrayadas en L1. Tambien se indican las regiones marco (FR).
Para clonar la regi6n constante kappa humana, se aisl6 RNA de una lfnea celular de hibridoma murino que expresa una cadena ligera kappa humana usando el RNeasy Mini Kit (�iagen, Valencia, CA). El RNA se transcribi6 inversamente usando un kit de sfntesis de cDNA de primera cadena (First�Strand cDNA Synthesis �it) (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). El acido nucleico de la cadena ligera kappa humana se ampli6 por PCR a partir del cDNA como un casete Bsw I/Not I usando los cebadores:
ATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC (SEC ID NO:72)
Bsi� I
GTTTAAACGCGGCCGCGGATCCTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTT (SEC ID NO:73) Not I
Las regiones de la cadena variable ligera L1 y L2 se unieron independientemente a la regi6n constante de la cadena ligera kappa humana de la siguiente manera: un fragmento de DNA de Nhe I/BSi Wl que codifica la regi6n variable de la cadena ligera de L1 y el fragmento de Bsi WI/Not I que codifica el fragmento de DNA de regi6n constante kappa humana se subclonaron simultaneamente en un vector de expresi6n mamffero pDC409 (descrito en Giri et a/., 1994, EMBO J. 13:2822-30 y en la patente estadounidense num. 6,642,358, incorporadas a la presente memoria por referencia en su totalidad) utilizando una secuencia inicial Vklll. La secuencia inicial Vklll se construy6 como un casete Sa/ I/Nhe I por ampliaci6n PCR de Kozak (Kozak, 1989, J Cell Biol. 108:229-41) y las secuencias iniciales Vklll A27 (Straubinger et a/., 1988, J Mol Biol. 199:23-34) utilizando los siguientes oligonucle6tidos como cebadores:
GTCGACGCCGCCACCATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGA
Sa/ I
TACCGCTAGCGAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCA (SEC ID NO:74)
TGGAGACTGCGTCAACACAATTTCGCTAGCGGTATCTGGGAGCCAGAGTAGCAGGAGGAAGAGAAG CTGCGCTGGGGTTTCCATGGTGGCGGCGTCGAC (SEC ID NO:75)
Sa/ I
Los ultimos seis nucle6tidos en la secuencia inicial natural Vklll A27 se reemplazaron con los nucle6tidos que codifican un sitio Nhe I. Esto produjo cambios de aminoacidos de treonina a glicina y alanina a serina, pero no afect6 el sitio de escisi6n.
Cada regi6n variable de la cadena pesada H1, H4 y H14 se uni6 a la regi6n constante de lgG4 humana de la siguiente manera: un fragmento de DNA Sa/ /Apa I que codifica la regi6n variable de la cadena pesada de H1 y un fragmento de DNA Apa I/Not I que codifica la regi6n constante de lgG4 humana (SEC ID NO:77) se insertaron simultaneamente en el vector de expresi6n mamffera digerido Sa/ /Not I pDC409 (descrito en Giri et a/., 1994, EMBO
J. 13:2822-30) empleando una secuencia inicial VH5a que se modific6 en su extremo 3' para codificar el sitio Nhe I:
ATGGGGTCAACCGCCATCCTTGGCCTCCTCCTGGCTGTTCTCCAAGGAGTCGCTAGC (SEC ID NO:76) Nhe I
Como consecuencia de este cambio, los ultimos dos aminoacidos son alanina y serina, mientras que los ultimos dos aminoacidos del tipo silvestre VH5a son cistefna y alanina. Se us6 mutagenesis dirigida al sitio en el constructo que codifica H4-lgG4 para realizar los constructos que comprenden las regiones variables de las cadenas pesadas H12 y H13. Las secuencias de nucle6tidos y aminoacidos de H1-H14 se muestran en las Figuras 2 y 3, respectivamente, donde las regiones CDR de cada cadena se indican en negrita y subrayadas en H1. Tambien se indican las regiones marco (FR).
Los anticuerpos y/o derivados de anticuerpos que comprenden las combinaciones de dominio variable L1H1, L1H2, L1H3, L1H4, L1H5, L1H6, L1H7, L1H8, L1H9, L1H10, L1H11, L2H1, L2H2, L2H3, L2H4, L2H5, L2H6, L2H7, L2H8, L2H9, L2H10, L2H11, L2H12, L2H13, L2H14, L3H1, L4H1, L5H1 y L6H1 se ensayaron usando un ensayo de uni6n bioqufmica y/o el metodo del Ejemplo 2, y se hall6 que se unen al receptor de IL-4.
EJEMPLO 6: Especies y especificidad de secuencias a los anticuerpos
Este ejemplo provee un metodo para determinar la especie y la especificidad de secuencia de un anticuerpo que se une al receptor de IL-4.
Se puede usar un ensayo de uni6n con clasificador celular activado por fluorescencia (FACS) para evaluar la especie y/o la especificidad de secuencia de un anticuerpo anti-IL-4. El dominio extracelular del receptor de IL-4 comprende un dominio del receptor de citocinas (dominio I) y un dominio de fibronectina de tipo III (dominio II) (Hage et a/., 1999, Cell 97:271-81). Los constructos que comprenden los dominios del receptor de IL-4 humano I y/o II, dominios del receptor de IL-4 murino I y/o II, combinaciones de dominios del receptor de IL-4 humano y murino I y II, fragmentos de dominios del receptor de IL-4 humano y murino I y/o II se expresan como fusiones dentro del marco C-terminal con avidina de pollo. (Las secuencias del receptor de IL-4 murino se proveen, por ejemplo, en Schulte et a/., 1997, J. Exp. Med. 186:1419-29, Wrighton et a/., 1992, Growth Factors 6:103-18, Harada et a/., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:857-61, Mosley et a/., 1989, Cell 59:335-48.) Los vectores de expresi6n de la protefna de fusi6n se transfectan transitoriamente en forma individual en celulas 293T. Los medios condicionados se utilizan como la fuente de protefna de fusi6n sin purificaci6n. La etiqueta de avidina del constructo del receptor de IL-4 es capturada a partir de una disoluci6n por una esfera recubierta con biotina. Se emplea un anticuerpo anti-avidina FITC para detectar la porci6n de avidina del constructo de fusi6n. Se incuba un anticuerpo del receptor anti-IL-4 con el constructo del receptor de IL-4 capturado por biotina. Se utiliza IgG anti-humana de rat6n marcada con FITC F(ab')2 como anticuerpo secundario para detecci6n. La mezcla de esfera-anticuerpo se somete a analisis FACS en Becton Dickinson Bioscience FACScan (BD, Franklin Lakes, NJ).
Utilizando el metodo anterior, se hall6 que varios anticuerpos del receptor anti-IL-4 descritos en la presente memoria se unieron bien a un constructo que comprende los dominios I y II del receptor de IL-4 humano, pero no se unieron a un constructo que comprende los dominios I y II del receptor de IL-4 murino. Los anticuerpos se unieron debilmente a un constructo que comprende el dominio I del receptor de IL-4 humano (pero no comprende el dominio II) y no todos a un constructo que comprende el dominio del receptor de IL-4 humano II (pero que no comprende el dominio I). Se descubri6 ademas que los anticuerpos se unieron bien a un constructo que comprende el dominio I del receptor de IL-4 humano y el dominio II del receptor de IL-4murino.
Los ejemplos anteriores, tanto practicos como te6ricos, no son limitativos y se proveen para ilustrar las realizaciones particulares de la presente invenci6n. Todas las referencias citadas en la presente memoria se incorporan por referencia en su totalidad.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> IMMUNEX CORPORATION Carter, Paul J. Zhou, Hongxing
5 <120> ANTICUERPOS �UE SE UNEN AL RECEPTOR INTERLEUCINA-4
<130> 3492-WO
<140> --pendiente de asignar -
<141>
<150> 60/518.166 10 <151>
<160> 77
<170> PatentIn versi6n 3.2
<210> 1
<211> 2475 15 <212> DNA
<213> Homo sapien
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2475) 20 <400> 1
5
<210> <211> <212> <213> 2 825 PRT Homo sapien
<400>
2
5
<210> <211> <212> <213> 3 327 DNA Artificial
<220> <223>
Secuencia variable de la cadena ligera
10
<220> <221> <222> CDS (1)..(327)
<400>
3
5
<210> <211> <212> <213> 4 109 PRT Artificial
<220> <223>
Constructo Sintetico
<400>
4
10
<210> <211> <212> <213> 5 327 DNA Artificial
15
<220> <223> Secuencia variable de la cadena ligera
<220> <221> <222>
CDS (1)..(327)
<400>
5
5
<210> <211> <212> <213> 6 109 PRT Artificial
<220> <223>
Constructo Sintetico
<400>
6
<210> <211> <212> <213>
7 327 DNA Artificial
5
<220> <223> Secuencia variable de la cadena ligera
<220> <221> <222>
CDS (1)..(327)
10
<400> 7
15
<210> <211> <212> <213> 8 109 PRT Artificial
<220> <223>
Constructo Sintetico
<400>
8
5
<210> <211> <212> <213> 9 327 DNA Artificial
<220> <223>
Secuencia variable de la cadena ligera
10
<220> <221> <222> CDS (1)..(327)
<400>
9
5
<210> <211> <212> <213> 10 109 PRT Artificial
<220> <223>
Constructo Sintetico
<400>
10
10
<210> <211> <212> <213> 11 327 DNA Artificial
15
<220> <223> Secuencia variable de la cadena ligera
<220> <221> <222>
CDS (1)..(327)
<400> 11
5
<210> <211> <212> <213> 12 109 PRT Artificial
<220> <223>
Constructo Sintetico
<400>
12
5
<210> <211> <212> <213> 13 327 DNA Artificial
<220> <223>
Secuencia variable de la cadena ligera
10
<220> <221> <222> CDS (1)..(327)
<400>
13
15
<210> <211> <212> <213> 14 109 PRT Artificial
<220> <223>
Constructo Sintetico
<400> 14
5
<210> <211> <212> <213> 15 345 DNA Artificial
<220> <223>
Secuencia variable de la cadena pesada
10
<220> <221> <222> CDS (1)..(345)
<400>
15
5
<210> <211> <212> <213> 16 115 PRT Artificial
<220> <223>
Constructo Sintetico
<400>
16
<210> 17
<211> <212> <213>
345 DNA Artificial
5
<220> <223> Secuencia variable de la cadena pesada
<220> <221> <222>
CDS (1)..(345)
<400>
17
<210> 18
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial
15 <220>
<223> Constructo Sintetico
<400> 18
5
<210> <211> <212> <213> 19 345 DNA Artificial
<220> <223>
Secuencia variable de la cadena pesada
10
<220> <221> <222> CDS (1)..(345)
<400>
19
5
<210> <211> <212> <213> 20 115 PRT Artificial
<220> <223>
Constructo Sintetico
<400>
20
10
<210> <211> <212> <213> 21 345 DNA Artificial
15
<220> <223> Secuencia variable de la cadena pesada
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(345)
<400> 21
<210> 22
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial
10 <220>
<223> Constructo Sintetico
<400> 22
5
<210> <211> <212> <213> 23 345 DNA Artificial'
<220> <223>
Secuencia variable de la cadena pesada
10
<220> <221> <222> CDS (1)..(345)
<400>
23
5
<210> <211> <212> <213> 24 115 PRT Artificial
<220> <223>
Constructo Sintetico
<400>
24
10
<210> <211> <212> <213> 25 345 DNA Artificial
15
<220> <223> Secuencia variable de la cadena pesada
<220> <221> <222>
CDS (1)..(345)
<400> 25
5
<210> <211> <212> <213> 26 115 PRT Artificial
<220> <223>
Constructo Sintetico
<400>
26
5
<210> <211> <212> <213> 27 345 DNA Artificial
<220> <223>
Secuencia variable de la cadena pesada
10
<220> <221> <222> CDS (1)..(345)
<400>
27
5
<210> <211> <212> <213> 28 115 PRT Artificial
<220> <223>
Constructo Sintetico
<400>
28
10
<210> <211> <212> <213> 29 345 DNA Artificial
15
<220> <223> Secuencia variable de la cadena pesada
<220> <221> <222>
CDS (1)..(345)
<400>
29
5
<210> <211> <212> <213> 30 115 PRT Artificial
<220> <223>
Constructo Sintetico
<400>
30
5
<210> <211> <212> <213> 31 345 DNA Artificial
<220> <223>
Secuencia variable de la cadena pesada
10
<220> <221> <222> CDS (1)..(345)
<400>
31
<210> <211> <212> <213>
32 115 PRT Artificial
5
<220> <223> Constructo Sintetico
<400>
32
10
<210> <211> <212> <213> 33 345 DNA Artificial
<220> <223>
Secuencia variable de la cadena pesada
15
<220> <221> <222> CDS (1)..(345)
<400>
33
5
<210> <211> <212> <213> 34 115 PRT Artificial
<220> <223>
Constraucto Sintetico
<400>
34
5
<210> <211> <212> <213> 35 345 DNA Artificial
<220> <223>
Secuencia variable de la cadena pesada
10
<220> <221> <222> CDS (1)..(345)
<400>
35
<210>
36
<211>
115
15
<212> PRT
<213>
Artificial
<220>
<223>
Constructo Sintetico
<400>
36
5
<210> <211> <212> <213> 37 345 DNA Artificial
10
<220> <223> Secuencia variable de la cadena pesada
<220> <221> <222>
CDS (1)..(345)
<400>
37
5
<210> <211> <212> <213> 38 115 PRT Artificial
<220> <223>
Constructo Sintetico
<400>
38
5
<210> <211> <212> <213> 39 345 DNA Artificial
<220> <223>
Secuencia variable de la cadena pesada
10
<220> <221> <222> CDS (1)..(345)
<400>
39
15
<210> <211> <212> <213> 40 115 PRT Artificial
<220> <223>
Constructo Sintetico
<400> 40
5
<210> <211> <212> <213> 41 345 DNA Artificial
<220> <223>
Secuencia variable de la cadena pesada
10
<220> <221> <222> CDS (1)..(345)
<400>
41
5
<210> <211> <212> <213> 42 115 PRT Artificial
<220> <223>
Constructo Sintetico
<400>
42
5
<210> <211> <212> <213> 43 345 DNA Artificial
<220> <223>
Secuencia variable de la cadena pesada
10
<220> <221> <222> CDS (1)..(345)
<400>
43
15
<210> <211> <212> <213> 44 115 PRT Artificial
<220> <223>
Constructo Sintetico
<400>
44
5
<210> <211> <212> <213> 45 345 DNA Artificial
<220> <223>
Secuencia variable de la cadena pesada
10
<220> <221> <222> CDS (1)..(345)
<400>
45
5
<210> <211> <212> <213> 46 115 PRT Artificial
<220> <223>
Constructo Sintetico
<400>
46
<210> <211> <212> <213>
47 345 DNA Artificial
5
<220> <223> Secuencia variable de la cadena pesada
<220> <221> <222>
CDS (1)..(345)
10
<400> 47
15
<210> <211> <212> <213> 48 115 PRT Artificial
<220> <223>
Constructo Sintetico
<400>
48
5
<210> <211> <212> <213> 49 345 DNA Artificial
<220> <223>
Secuencia variable de la cadena pesada
10
<220> <221> <222> CDS (1)..(345)
<400>
49
5
<210> <211> <212> <213> 50 115 PRT Artificial
<220> <223>
Constructo Sintetico
<400>
50
10
<210> 51
<211>
345
<212>
DNA
<213>
Artificial
<220> <223>
Secuencia variable de la cadena pesada
5
<220> <221> <222> CDS (1)..(345)
<400>
51
10
<210> <211> <212> <213> 52 115 PRT Artificial
<220> <223>
Constructo Sintetico
15
<400> 52
5
<210> <211> <212> <213> 53 345 DNA Artificial
<220> <223>
Secuencia variable de la cadena pesada
10
<220> <221> <222> CDS (1)..(345)
<400>
53
5
<210> <211> <212> <213> 54 115 PRT Artificial
<220> <223>
Constructo Sintetico
<400>
54
10
<210> <211> <212> <213> 55 345 DNA Artificial
15
<220> <223> Secuencia variable de la cadena pesada
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(345)
<400> 55
<210> 56
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial
10 <220>
<223> Constructo Sintetico
<400>
56
<400>
59
5
<210> <211> <212> <213> 57 345 DNA Artificial
<220> <223>
Secuencia variable de la cadena pesada
10
<220> <221> <222> CDS (1)..(345)
<400>
57
5
<210> <211> <212> <213> 58 115 PRT Artificial
<220> <223>
Constructo Sintetico
<400>
58
10
<210> <211> <212> <213> 59 345 DNA Artificial
15
<220> <223> Secuencia variable de la cadena pesada
<220> <221> <222>
CDS (1)..(345)
5
<210> <211> <212> <213> 60 115 PRT Artificial
<220> <223>
Constructo Sintetico
<400>
60
5
<210> <211> <212> <213> 61 345 DNA Artificial
<220> <223>
Secuencia variable de la cadena pesada
10
<220> <221> <222> CDS (1)..(345)
<400>
61
5
<210> <211> <212> <213> <220> 62 115 PRT Artificial
<223>
Constructo Sintetico
<400>
62
10
<210> <211> <212> <213> 63 109 PRT Artificial
15
<220> <223> Regi6n variable de la cadena ligera 27A1
<400>
63
5
<210> <211> <212> <213> 64 116 PRT Artificial
<220> <223>
Regi6n variable de la cadena pesada 27A1
<400>
64
5
<210> <211> <212> <213> 65 107 PRT Artificial
<220> <223>
Regi6n variable de la cadena ligera 5A1
<400>
65
10
<210> <211> <212> <213> 66 123 PRT Artificial
15
<220> <223> Regi6n variable de la cadena pesada 5A1
<400>
66
5
<210> <211> <212> <213> 67 107 PRT Artificial
<220> <223>
Regi6n variable de la cadena ligera 63
<400>
67
<210> 68
<211> <212> <213>
117 PRT Artificial
5
<220> <223> Regi6n variable de la cadena pesada 63
<400>
68
10
<210> <211> <212> <213> 69 107 PRT Artificial
<220> <223>
Regi6n variable de la cadena ligera 1B7
<400>
69
<210> <211> <212> <213>
70 36 DNA Artificial
<220> <223>
Cebadores
<220> <221> <222> <223>
Caracterfstica miscelanea (21)..(21) N es A o G
<220> <221> <222> <223>
Caracterfstica miscelanea (24)..(24) N es G o T
<400> 70 gtcgacgccg ccaccatgga nttngggctg agctgg
36
<210> <211> <212> <213>
71 21 DNA Artificial
<220> <223>
Cebadores
<400> 71 cttgaccagg cagcccaggg c
21
<210> <211> <212> <213>
72 36 DNA Artificial
<220> <223>
Cebadores
<400> 72 atcaaacgta cggtggctgc accatctgtc ttcatc
36
<210> <211> <212> <213>
73 49 DNA Artificial
5
<220> <223> Cebadores
<400>
73
gtttaaacgc ggccgcggat cctaacactc tcccctgttg aagctcttt
49
10
<210> <211> <212> <213> 74 99 DNA Artificial
<220> <223>
Cebadores
15
<400> 74
20
<210> <211> <212> <213> 75 99 DNA Artificial
<220> <223>
Cebadorse
<400>
75
25
<210> <211> <212> <213> 76 57 DNA Artificial
30
<220> <223> Cebadores
<400>
76
atggggtcaa ccgccatcct tggcctcctc ctggctgttc tccaaggagt cgctagc
57
35
<210> <211> <212> <213> 77 327 PRT Homo sapiens
<400>
77

Claims (31)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un anticuerpo aislado que se une al receptor de IL-4, que comprende un dominio variable de cadena ligera, donde
    a.
    la cadena ligera CDR1 comprende los residuos 24-35 de la SEC ID NO:6 y
    b.
    la cadena ligera CDR2 comprende los residuos 51-57 de la SEC ID NO:6, y
    c.
    la cadena ligera CDR3 comprende los residuos 90-99 de la SEC ID NO:6.; y un dominio variable de cadena pesada, donde las secuencias de la cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 comprenden los residuos 30 a 35, 49 a 65 y 97 a 104 de la SEC ID NO:16, respectivamente, los residuos 30 a 35, 49 a 65 y 97 a 104 de la SEC ID NO:18, respectivamente, los residuos 30 a 35, 49 a 65 y 97 a 104 de la SEC ID NO: 20, respectivamente, los residuos 30 a 35, 49 a 65 y 97 a 104 de la SEC ID NO:22, respectivamente, los residuos 30 a 35, 49 a 65 y 97 a 104 de la SEC ID NO:26, respectivamente, los residuos 30 a 35, 49 a 65 y 97 a 104 de la SEC ID NO:28, respectivamente, los residuos 30 a 35, 49 a 65 y 97 a 104 de la SEC ID NO:30, respectivamente, los residuos 30 a 35, 49 a 65 y 97 a 104 de la SEC ID N032, respectivamente, los residuos 30 a 35, 49 a 65 y 97 a 104 de la SEC ID NO: 34, respectivamente, los residuos 30 a 35, 49 a 65 y 97 a 104 de la SEC ID NO:38, respectivamente o los residuos 30 a 35, 49 a 65 y 97 a 104 de la SEC ID NO:40, respectivamente.
  2. 2.
    Un anticuerpo segun la reivindicaci6n 1, en el que el dominio variable de la cadena pesada es por lo menos 90% identico a la SEC ID NO: 16.
  3. 3.
    Un anticuerpo segun la reivindicaci6n 1 o 2, en el que el dominio variable de la cadena pesada es por lo menos 90% identico a la secuencia de SEC ID NO:16 o por lo menos 90% identico a la secuencia de SEC ID NO:38.
  4. 4.
    El anticuerpo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el dominio variable de la cadena ligera es por lo menos 90% identico a la SEC ID NO:6.
  5. 5.
    El anticuerpo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el dominio variable de la cadena ligera comprende la SEC ID NO:6.
  6. 6.
    El anticuerpo segun la reivindicaci6n 1, en el que la regi6n variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en la SEC ID NO: 16, 18, 20, 22, 26, 28, 30, 32, 34, 38 y 40.
  7. 7.
    El anticuerpo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado o quimerico.
  8. 8.
    El anticuerpo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
  9. 9.
    El anticuerpo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en IgD, IgE, IgM, IgGl, IgG2, IgG3 e lgG4, que tiene por lo menos una mutaci6n en la regi6n bisagra que alivia una tendencia a formar un anticuerpo de enlace disulfuro intra-catenario H.
  10. 10.
    Un polipeptido aislado que comprende una porci6n de uni6n al receptor de IL-4 del anticuerpo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde dicho polipeptido comprende un Fab, F(ab')2, scFv, diacuerpo, triacuerpo o tetracuerpo.
  11. 11.
    Un acido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucle6tidos, o su complemento, que codifica la cadena ligera del anticuerpo segun la reivindicaci6n 1.
  12. 12.
    El acido nucleico aislado segun la reivindicaci6n 11, en el que dicho acido nucleico comprende la secuencia de nucle6tidos de la SEC ID NO:5.
  13. 13.
    Un vector que comprende dicho acido nucleico de la reivindicaci6n 11.
  14. 14.
    El vector segun la reivindicaci6n 13, en el que dicho vector es un vector de expresi6n.
  15. 15.
    Una celula aislada que comprende dicho acido nucleico segun la reivindicaci6n 11.
  16. 16.
    La celula aislada segun la reivindicaci6n 15, en la que dicha celula es un hibridoma.
  17. 17.
    La celula aislada segun la reivindicaci6n 15, en la que dicha celula es una celula transgenica.
  18. 18.
    Un metodo que expresa el anticuerpo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende incubar una celula que comprende un acido nucleico que codifica la cadena ligera de dicho anticuerpo y un acido nucleico que codifica la cadena pesada de dicho anticuerpo bajo condiciones que permiten que dicha celula exprese dicha cadena ligera y dicha cadena pesada, y que permiten que dicha cadena ligera y dicha cadena pesada se ensamblen en dicho anticuerpo, y aislar dicho anticuerpo de dicha celula.
  19. 19.
    El metodo segun la reivindicaci6n 18, en el que dicha celula es un hibridoma.
  20. 20.
    El metodo segun la reivindicaci6n 18, en el que dicha celula es una celula transgenica.
  21. 21.
    Un metodo in vitro para inhibir un receptor de IL-4 que comprende contactar una celula que expresa un receptor de IL-4 con el anticuerpo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 bajo condiciones que permiten que dicho anticuerpo se una a dicho receptor de IL-4, donde la uni6n de dicho anticuerpo a dicho receptor de IL-4 inhibe la transducci6n de senales a traves de dicho receptor de IL-4.
  22. 22.
    Un metodo in vitro para inhibir un receptor de IL-4 que comprende contactar una celula que expresa el receptor de IL-4 alfa con el polipeptido segun la reivindicaci6n 10 bajo condiciones que permiten que dicho polipeptido se una a dicho receptor de IL-4 alfa, donde la uni6n de dicho polipeptido a dicho receptor de IL-4 inhibe la transducci6n de senales a traves de dicho receptor de IL-4.
  23. 23.
    El metodo segun la reivindicaci6n 21 o la reivindicaci6n 22, en el que dicha celula es una celula humana.
  24. 24.
    Un anticuerpo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o un polipeptido segun la reivindicaci6n 10, para uso en medicina.
  25. 25.
    El anticuerpo o polipeptido segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para uso en el tratamiento de una afecci6n inflamatoria o cancerosa.
  26. 26.
    El anticuerpo o polipeptido para uso segun la reivindicaci6n 25, en el que dicha afecci6n es asma, artritis septicemica, dermatitis herpetiforme, urticaria idiopatica cr6nica, colitis ulcerosa, esclerodermia, cicatrizaci6n hipertr6fica, enfermedad de Whipple, hiperplasia prostatica benigna, un trastorno pulmonar en el que el receptor de IL-4 desempena una funci6n, una afecci6n en la que la ruptura de la barrera epitelial mediada por el receptor de IL-4 desempena una funci6n, un trastorno del sistema digestivo en el que el receptor de IL-4 desempena una funci6n, una reacci6n alergica a una medicaci6n, enfermedad de Kawasaki, anemia drepanocftica, sfndrome de Churg-Strauss, enfermedad de Grave, preclampsia, sfndrome de Sjogren, sfndrome linfoproliferativo autoinmunitario, anemia hemolftica autoinmunitaria, es6fago de Barrett, uveftis autoinmunitaria, tuberculosis, fibrosis qufstica, micosis broncopulmonar alergica, enfermedad pulmonar obstructiva cr6nica, fibrosis y neumopatfa inducida por bleomicina, fibrosis pulmonar inducida por radiaci6n, proteinosis alveolar pulmonar, sfndrome de dificultad respiratoria aguda, sarcoidosis, sfndrome de hiper IgE, sfndrome hipereosinofflico idiopatico, una enfermedad ampollosa autoinmunitaria, penfigo vulgar, penfigo bulloso, miastenia grave, sfndrome de fatiga cr6nica o nefrosis.
  27. 27.
    Uso de un anticuerpo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o un polipeptido segun la reivindicaci6n 13 o la reivindicaci6n 14, en la elaboraci6n de un medicamento para tratar una afecci6n inflamatoria o cancerosa.
  28. 28.
    Uso de un anticuerpo o polipeptido segun la reivindicaci6n 27, en el que dicha afecci6n es ama, artritis septicemica, dermatitis herpetiforme, urticaria idiopatica cr6nica, colitis ulcerosa, esclerodermia, cicatrizaci6n hipertr6fica, enfermedad de Whipple, hiperplasia prostatica benigna, un trastorno pulmonar en el que el receptor de IL-4 desempena una funci6n, una afecci6n en la que la ruptura de la barrera epitelial mediada por el receptor de IL-4 desempena una funci6n, un trastorno del sistema digestivo en el que el receptor de IL-4 desempena una funci6n, una reacci6n alergica a una medicaci6n, enfermedad de Kawasaki, anemia drepanocftica, sfndrome de Churg-Strauss, enfermedad de Grave, preclampsia, sfndrome de Sjogren, sfndrome linfoproliferativo autoinmunitario, anemia hemolftica autoinmunitaria, es6fago de Barrett, uveftis autoinmunitaria, tuberculosis, fibrosis qufstica, micosis broncopulmonar alergica, enfermedad pulmonar obstructiva cr6nica, fibrosis y neumopatfa inducida por bleomicina, fibrosis pulmonar inducida por radiaci6n, proteinosis alveolar pulmonar, sfndrome de dificultad respiratoria aguda, sarcoidosis, sfndrome de hiper IgE, sfndrome hipereosinofflico idiopatico, una enfermedad ampollosa autoinmunitaria, penfigo vulgar, penfigo bulloso, miastenia grave, sfndrome de fatiga cr6nica o nefrosis.
  29. 29.
    Una composici6n farmaceutica que comprende un anticuerpo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9
    o un polipeptido segun la reivindicaci6n 10, y un excipiente, diluyente o tamp6n.
  30. 30.
    El anticuerpo segun la reivindicaci6n 1, en el que dicho anticuerpo no se une al dominio I y II del receptor de IL-4 murino.
  31. 31.
    El anticuerpo segun la reivindicaci6n 1, en el que dicho anticuerpo se une al dominio I del receptor de IL-4 humano.
    Figura 1A Figura 1B Figura 1C Figura 2A Figura 2B Figura 2C Figura 2D Figura 3
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