ES2633767T3 - Anticuerpos contra IL-17BR - Google Patents

Abstract

Una molécula de anticuerpo que se une específicamente al IL-17BR murino y/o humano y que comprende: un dominio VH que comprende una CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, una CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 y una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7; y, un domino VL que comprende una CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, una CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

Description

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DESCRIPCION

Anticuerpos contra IL-17BR Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a anticuerpos, incluyendo fragmentos de union de los mismos, dirigidos contra el receptor de interleucina 17B (IL-17BR).

Antecedentes de la invencion

El asma es un trastorno inflamatorio cronico habitual de las vlas respiratorias. El numero de personas que lo padecen ha aumentado de forma espectacular en las ultimas decadas y la Organizacion Mundial de la Salud estima que del orden de 300 millones de personas en todo el mundo padecen asma. El asma alergica se caracteriza por una hiperrespuesta de las vlas respiratorias (AHR, siglas por su traduccion al ingles airways hyperresponsiveness) incontrolable, inducida por diversos estlmulos provocadores y esta asociada a infiltrados inflamatorios de tipo 2 en los pulmones.

La enfermedad inflamatoria intestinal (IBD, por las siglas inflammatory bowel disease) es una inflamacion cronica que afecta a la capa mucosa del colon (tambien conocida como intestino grueso), que incluye dos patologlas: colitis ulcerosa (UC, ulcerative colitis) y enfermedad de Crohn (CD, Crohn's disease). Las terapias convencionales para el tratamiento de IBD implican o bien antibioticos o bien farmacos derivados de esteroides o agentes anti-TNF-a; sin embargo, de momento, no se ha logrado con ellas inducir o mantener la remision cllnica en los pacientes (Hanauer et al., 2008). Se cree que UC es una enfermedad mediada por Th2, habiendose demostrado con un modelo de raton representativo que las citocinas de tipo 2 estan relacionadas con el desarrollo de inflamacion intestinal (Heller et al., 2002).

El receptor de interleucina-17B, conocido en sus variedades como IL-25R, IL-17BR, IL-17RB o IL-17RH1 se identifico por primera vez en una base de datos de marcadores de secuencia expresada por su homologla con el receptor IL-17A (IL-17RA) (Tian et al., 2000). Mas adelante, se demostro que IL-17BR se unla tanto a IL-17B como a IL-25 (Lee et al., 2001; shi et al., 2000; Tian et al., 2000). IL-25 se une a IL-17BR con una afinidad mas potente (1,4 nM) que IL-17B (7,6 nM).

La IL-25, un miembro de la familia de citocinas IL-17 (IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D e IL-17F - asociado a la inflamacion de tipo 1) difiere notablemente de otros miembros de la familia IL-17 por el hecho de que su produccion induce expresion de citocina de tipo 2 asociada con esplenomegalia, niveles elevados de IgG1 e IgE en suero y cambios patologicos en los pulmones y el tracto digestivo, incluyendo infiltrados eosinofilos, aumento de la secrecion de moco e hiperplasia de celulas epiteliales (Fort et al., 2001; Lee et al., 2001; Moseley et al., 2003; Pan et al., 2001). La ablacion genetica de IL-25 o el uso de anticuerpos anti-IL-25 bloqueantes han demostrado claramente la importancia de IL-25 en la proteccion contra la infeccion por helmintos (Fallon et al., 2006; Owyang et al., 2006), as! como su papel crucial en la regulacion de las respuestas caracterlsticas de asma (Ballantyne et al., 2007). Parece ser que IL-25 estimula estas respuestas gracias a su capacidad para inducir la liberacion de citocinas de tipo 2, como IL-13, inicialmente desde celulas que no son linfocitos B ni linfocitos T innatas (NBNT) (Fallon et al., 2006; Fort et al., 2001) y posteriormente de la respuesta de linfocito T adaptativa (Angkasekwinai et al., 2007; Wang et al., 2007).

Se ha identificado el mensaje il17br en bibliotecas desde pulmon, cerebro, pancreas, rinon, tiroides y eosinofilos (Lee et al., 2001; Shi et al., 2000). Parece ser que la expresion en las celulas del musculo liso de los pulmones esta regulada inmnologicamente (Lajoie-Kadoch et al., 2006).

En correspondencia con el papel que desempena en el asma, se ha detectado ARNm o protelna de IL-25 a partir de diversos tipos de celulas que se encuentran en el pulmon, incluyendo macrofagos alveolares, mastocitos, eosinofilos y basofilos (Wang et al., 2007). Mas recientemente, la produccion de celulas epiteliales de pulmon de raton y de ser humano estimuladas con alergeno ha corroborado el posible papel de IL-25 en la modulacion de las respuestas pulmonares alergicas (Angkasekwinai et al., 2007). Por otra parte, se ha notificado que IL-25 induce la produccion inflamatoria de citocina y quimiocinas a partir de fibroblastos de pulmon y componentes de la matriz extra-celular de celulas del musculo liso de las vlas respiratorias. Por otra parte, estudios recientes han indicado que los transcritos de IL-25 e IL-17BR se regulan a la alza de forma significativa en tejido de biopsia de pacientes asmaticos asociado con infiltracion eosinofila (Wang et al., 2007). El tratamiento de ratones sensibilizados con ovoalbumina (OVA) con un anticuerpo monoclonal bloqueante dirigido contra IL-25 tiene como resultado una reduccion de AHR y menores concentraciones de IL-13 en el lavado broncoalveolar como respuesta al desaflo con OVA y la administracion de metacolina.

Recientemente, Rickel et al. (J Immunol 181, 4299-4310 (2008)) han utilizado anticuerpo monoclonal bloqueante contra IL-17RA humano para prevenir la actividad de IL-25 en un ensayo basado en celulas humanas primarias. Se

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ha demostrado con ello que la actividad de IL-25 requiere tanto IL-17BR como IL-17RA. Sin embargo, se ha notificado asimismo que IL-17A e IL-17F senalizan a traves de un complejo heteromerico que contiene IL-17RA e IL- 17RC.

Rickel et al. describen tambien un anticuerpo reactivo con IL-17BR de raton que bloquea la inflamacion de pulmon inducida por IL-25 en un modelo de raton con asma alergica. Hasta la fecha, no se ha notificado ningun anticuerpo reactivo con IL-17BR humano.

En correspondencia con su papel en IBD, se ha observado la production de IL-25 en un modelo experimental de colitis cronica en raton, en asociacion con un cambio de respuesta de tipo Th1 a Th2 (Fichtner-Feigl et al 2008) y se observo una alta expresion de ARNm de IL-25 en todo el tracto gastrointestinal de ratones (Fort et al., 2001). Asimismo, el gen de IL-25 esta localizado dentro de una region de susceptibilidad de enfermedad de Crohn en el cromosoma 14 de seres humanos, si bien su posible asociacion con la enfermedad esta todavla por investigarse (Buning et al. 2003).

Divulgacion de la invencion

La presente invencion proporciona moleculas de anticuerpo, acidos nucleicos aislados, metodos de produccion de moleculas de anticuerpos, composiciones y moleculas de anticuerpos para su uso en metodos de tratamiento terapeutico, tal como se expone en las reivindicaciones.

Los autores de la presente invencion han identificado una molecula de anticuerpo que se une con alta afinidad y especificidad a IL-17BR.

Las moleculas de anticuerpo descritas en el presente documento pueden ser utiles para bloquear la bioactividad de IL-25 in vivo y prevenir la inflamacion de las vlas respiratorias, AHR, y la inflamacion del colon.

Se ha demostrado que la administration de una molecula de anticuerpo descrita en el presente documento en ratones desafiados con antlgeno reduce los niveles de IL-13 e IL-5, ambas citocinas crlticas en la regulation del asma, y que reduce el numero de celulas que producen IL-13 en los pulmones a niveles y numeros similares a los que se observan en ausencia de desaflo con antlgeno o en ratones con deficit de IL-17BR desafiados con antlgeno. Las moleculas de anticuerpo descritas en el presente documento tambien pueden reducir significativamente la hiperreactividad de las vlas respiratorias. Asimismo, las moleculas de anticuerpo descritas en el presente documento pueden reducir in vivo la expansion de linfocitos T gamma/delta relacionada con la enfermedad. Esto indica que las moleculas de anticuerpo descritas en el presente documento inhiben dos rutas aceptadas como esenciales en el desarrollo del asma: la produccion de IL-13 y la capacidad de respuesta de linfocitos T gamma/delta.

Se desafio a los ratones antes descritos desafiados con antlgeno con antlgeno ovoalbumina (OVA) en un modelo de asma experimental. Se demuestra que la administracion de una molecula de anticuerpo descrita en el presente documento en ratones desafiados con antlgeno OXA (oxazolona) en un modelo experimental de IBD reduce la tasa de mortalidad y los signos cllnicos de IBD, tales como la perdida de peso y el acortamiento del colon como consecuencia de la inflamacion y la hemorragia.

Las moleculas de anticuerpo descritas en el presente documento pueden presentar reaction cruzada tanto con IL- 17BR murino como humano y pueden inhibir la union de IL-25 humana con IL-17BR humano. Por lo tanto, las moleculas de anticuerpo pueden ser utilizadas en modelos de raton para investigar sus mecanismos de accion in vivo. Asimismo, las moleculas de anticuerpo descritas en el presente documento pueden bloquear la action biologica del complejo IL-25/IL-17BR en celulas humanas. Las moleculas de anticuerpo descritas en el presente documento tienen por tanto una posible utilidad para el tratamiento de enfermedades tales como asma.

En un aspecto de la divulgacion, se proporciona una molecula de anticuerpo que se une a IL-17BR y que comprende un dominio VH de anticuerpo que comprende una CDR3 VH con la secuencia de aminoacidos de sEq ID NO: 7.

Preferentemente, una molecula de anticuerpo bloquea la union de IL-17BR a IL-25 y reduce o inhibe al menos una AHR mediada por IL-25; la produccion de IL-13; la produccion de IL-5 medida por IL-25; la produccion de IL-8 medida por IL-25 y la expansion y filtration de linfocitos T gamma/delta.

Una molecula de anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende una CDR3 de VH de SEQ ID NO: 7 junto con una CDR1 de SEQ ID NO: 5 y una CDR2 de SEQ ID nO: 6.

Un dominio VH puede estar apareado con un dominio VL, por ejemplo un dominio VL con una CDR1 de SEQ ID NO: 8, una CDR2 de SEQ ID NO: 9 y una CDR3 de SEQ ID NO: 10. En algunas realizaciones, un dominio VH puede estar apareado con un dominio VL de SEQ ID NO: 4.

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En algunos casos, una molecula de anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende una CDR1 de VH de SEQ ID NO: 5, una CDR2 VH de SEQ ID NO: 6 y una CDR3 VH de SEQ ID NO: 7 y un dominio VL que comprende una CDR1 VL de SEQ ID NO: 8, una CDR2 VL de SEQ ID NO: 9 y una CDR3 VL de SEQ ID NO: 10.

Un dominio VH puede comprender ademas regiones marco, humanas y no humanas, como por ejemplo, las regiones marco que se presentan en SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, la molecula de anticuerpo puede comprender el dominio VH de SEQ ID NO: 2.

Un dominio VL puede comprender ademas regiones marco, humanas o no humanas, como por ejemplo la region marco que se presenta en SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, la molecula de anticuerpo puede comprender el dominio VL de SEQ ID NO: 4.

En algunos casos, la molecula de anticuerpo puede comprender el dominio VH de SEQ ID NO: 2 y el dominio VL de SEQ ID NO: 4.

Ciertos aspectos de la divulgacion proporcionan tambien un acido nucleico aislado que codifica la molecula de anticuerpo descrita en el presente documento, vectores que comprenden dicho acido nucleico y metodos para expresar dicho acido nucleico en una celula huesped para producir moleculas de anticuerpo.

La divulgacion proporciona ademas el uso de moleculas de anticuerpo de la invencion, por ejemplo, en forma de una composicion farmaceutica, para el tratamiento de enfermedades, como por ejemplo enfermedades mediadas por IL- 25, tales como alergia, asma y colitis.

Estos y otros aspectos de la invencion se describen con mayor detalle a continuacion haciendo referencia a los ejemplos adjuntos.

Descripcion de las figuras

La Figura 1 muestra que el clon D9.2 anti-IL-17BR presenta reaccion cruzada para la union de IL-17BR humano y murino por ELISA. Las barras muestran la union de medios (barras blancas) o clon de anticuerpo D9.2 (barras negras) para IL-17BR-Fc murina inmovilizada, IL-17BR-Fc humana o IgG humana de control.

La Figura 2 muestra la union de D9.2 a IL-17BR en celulas COS7 transfectadas y celulas de raton primarias. Las celulas COS7 transfectadas con vectores de expresion de IL-17BR murino (a) o humano (b) expresan IL-17BR que es reconocido por D9.2. Se incubaron las celulas con 1 pg/ml de D9.2 durante 20 minutos y despues se lavaron. Se detecto la union de D9.2 por FACS transcurridos 20 minutos de incubacion con FITC IgG anti-raton a 0,5 pl/ml. (c) Celulas Th2 diferenciadas in vitro expresan IL-17BR y estan unidas mediante D9.2. La expresion es baja o ausente en celulas Th1. (d) Tras tres dosis intraperitoneales diarias consecutivas de 400 ng de IL-25, una poblacion de celulas que no son linfocitos T ni linfocitos B (NBNT) que expresa II-17BR aparece en el ganglio linfatico mesenterico de ratones de tipo silvestre (d, e) pero no en ratones con silenciamiento de IL-17BR (d,f). Esta poblacion es reconocida por D9.2 y produce IL-13.

La Figura 3 muestra la union de D9.2 a IL-17BR pero no reacciona en reaccion cruzada con IL-17RA, IL-17RC o IL-17RD de raton o humano. Brevemente, se revistieron placas ELISA con miembros de la familia IL-17R; IL- 17RA, IL-17BR, IL-17RC o IL-17RD o control IL-13Ra, a 2 pg/ml, se incubaron durante toda la noche a 4 °C, se lavaron en PBS/0,05 % tween y se bloquearon en PBS/10 % FCS a temperatura ambiente durante 4 horas. Se detecto la union de D9.2 biotinilado utilizando estreptavidina-HRP y solucion de revelado ELISA y midiendo la absorbancia a 405 nm.

La Figura 4 muestra que el anticuerpo monoclonal de raton D9.2, pero ningun otro anticuerpo anti-IL-17BR monoclonal de raton (3b9, 2c1, 5h9, 7e1, 10c6, 10e6), inhibe la union de IL-25 humano al receptor IL-25 humano. Se diluyo cada anticuerpo monoclonal de raton purificado (x 100) en hIL17Br/Fc (100 ng/ml) hasta una concentracion final de 1 pg/ml en una solucion de hIL17Br/Fc a 100 ng/ml. Brevemente, se anadio una mezcla de [anticuerpo x hIL17Br/Fc] a placas revestidas con IL-25 humano y se incubaron durante 1 hora y 30 minutos y se lavo tres veces. Se anadio conjugado (Fc)-HRP anti-hIgG (Serotec) a la placa y se incubo durante 45 minutos a temperatura ambiente, se lavo tres veces y se revelo con TMB. Se detuvo la reaccion con IM HCl. Se realizo la lectura de la densidad optica a 450 nm y se sustrajo la lectura del blanco de reactivos de todas las lecturas.

La Figura 5 muestra que los anticuerpos de D9.2 bloquean la produccion de IL-13 in vitro de celulas NBNT y linfocitos CD4+ (T y/o NKT). (a) celula NBNT. Brevemente, se extirparon los ganglios linfaticos mesentericos de ratones BALB/c no tratados previamente y con empobrecimiento de linfocitos CD3+ y CD19+. Se colocaron en placa celulas NBNT en placas de 96 pocillos de fondo redondo, a 3 x 105 celulas/pocillo, y se incubaron durante 72 horas en RPMI 10% en solitario (Medios) o RPMI 10 % FCS con 10 ng/ml IL-25 (IL-25). Se anadio D9.2 a los pocillos en diluciones en serie desde una concentracion maxima de 2 pg/ml y se incubaron durante 1,5 horas antes de anadir 10 ng/ml IL-25 a los pocillos. A continuacion, se incubaron las placas a 37°C durante 72 horas antes de examinar los sobrenadantes para determinar el contenido de IL-13 por ELISA. (b) linfocito CD4+ (T y/o

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NKT). Se tomaron los bazos de ratones BALB/c de tipo silvestre sin tratar previamente y se preparo una unica suspension de celulas. Se cultivaron los linfocitos CD4+ aislados, a 1 x 106 celulas/ml, en placas de 96 pocillos o bien en RPMI en solitario o bien en RPMI suplementado con 10 ng/ml IL-25 con y sin D9.2 a 1 pg/ml. Se cultivaron las celulas durante 72 horas antes de recoger los sobrenadantes para analizar los niveles de protelna IL-13 por ELISA.

La Figura 6 muestra que D9.2 inhibe la produccion de KC inducida por IL-25 (raton IL-8) de una llnea celular de carcinoma renal de raton (RENCA) dependiendo de la dosis. Se pre-incubo IL-25 (100 ng/ml) con diversas concentraciones de D9.2 o anticuerpo de control IgG1 durante 30-60 minutos a temperatura ambiente antes de la adicion a las celulas. Se anadio TNF-a (10 ng/ml) a placas revestidas con celulas RENCA inmediatamente antes de anadir la mezcla de protelna IL-25 /D9.2. Se incubaron muestras de control sin anticuerpo con 100 ng/ml de IL-25 y 10 ng/ml TNF-a (IL-25 + TNF-a) o solamente medio como control (Medios) durante 24 horas antes de anadirlo a las celulas. Se llevo a cabo la determinacion de la liberacion de KC por ELISA transcurridas 24 horas desde la estimulacion.

La Figura 7 muestra que D9.2 inhibe la produccion de IL-8 inducida por IL-25 -de una llnea celular de carcinoma renal humano (TK-10) dependiendo de la dosis. Se incubo previamente IL-25 (100 ng/ml) con diversas concentraciones de D9.2 o anticuerpo de control IgG1 durante 30-60 minutos a temperatura ambiente. Se anadio TNF-a (10 ng/ml) a placas revestidas con celulas TK-10 inmediatamente antes de la adicion de la mezcla de protelna IL-25 /D9.2. Se incubaron muestras de control sin anticuerpo con 100 ng/ml de IL-25 y 10 ng/ml TNF-a (IL-25 + TNF-a), o medio solamente como control (Medios) durante 24 horas antes de anadirlo a las celulas. Se llevo a cabo la determinacion de la liberacion de IL-8 por ELISA a las 24 horas de la estimulacion.

La Figura 8 muestra que D9.2 bloquea las respuestas IL-25 in vivo. (a) Celulas de ganglio linfatico mediastinal de ratones sensibilizados y desafiados de ovoalbumina (OVA) producen IL-13 cuando se las vuelve a estimular con OVA in vitro. La administracion de D9.2 antes del desaflo con OVA reduce la respuesta IL-13 a niveles comparables con los de ratones KO IL-17BR. (b) Celulas de ganglio linfatico mediastinal de ratones sensibilizados y desafiados con OVA producen IL-5 cuando se las vuelve a estimular con OVA in vitro. La administracion de D9.2 antes del desaflo con OVA reduce la respuesta IL-5 a niveles comparables con los de ratones KO IL-17BR. (c) El tratamiento con D9.2 redujo el numero de celulas que producen IL-13 en el pulmon de ratones sensibilizados y desafiados con OVA. El manchado de citocina intracelular de IL-13 revela una poblacion de celulas que producen IL-13 en ratones sensibilizados y desafiados con OVA que esta ausente en ratones KO IL-17BR y es reducida en animales tratados con anticuerpo D9.2 anti-IL-17BR antes del desaflo con OVA. (d) Se reduce el numero de linfocitos T gamma- delta en el bazo de ratones sensibilizados y desafiados con OVA en ratones KO IL-17BR y en ratones a los que se administra D9.2 antes del desaflo con OVA. (e) El tratamiento con D9.2 reduce AHR en ratones sensibilizados y desafiados con OVA.

La Figura 9 muestra que D9.2 bloquea las respuestas IL-25 in vivo en un modelo de raton de IBD. (a) El porcentaje de supervivencia de animales desafiados con oxazolona es mas bajo que el de los controles que reciben solamente etanol. La administracion de D9.2 antes de la sensibilizacion y el desaflo reduce la tasa de mortalidad. (b) Se calculan las puntuaciones cllnicas sobre la base de la perdida de peso en combinacion con el aspecto general y la conducta de cada animal. La administracion de 9.2 tiene como resultado una mejora de la puntuacion cllnica en comparacion con los ratones que reciben unicamente anticuerpo de isotopo. (c) Se reducen las longitudes del colon en ratones IBD en comparacion con los controles. La administracion de D9.2 protege contra dicha reduccion en animales IBD.

Secuencias:

Las moleculas de anticuerpo de la presente invencion se describen en el presente documento ademas haciendo referencia a los siguientes numeros de identificacion de secuencia:

SEQ ID NO: 1 secuencia de nucleotidos que codifica VH D9.2 SEQ ID NO: 2 secuencia de aminoacidos VH D9.2 SEQ ID NO: 3 secuencia de nucleotidos que codifica VL D9.2 SEQ ID NO: 4 secuencia de aminoacidos VL D9.2 SEQ ID NO: 5 secuencia de aminoacidos CDR1 VH D9.2

SEQ ID NO: 6 secuencia de aminoacidos CDR2 VH D9.2

SEQ ID NO: 7 secuencia de aminoacidos CDR3 VH D9.2

SEQ ID NO: 8 secuencia de aminoacidos CDR1 VL D9.2

SEQ ID NO: 9 secuencia de aminoacidos CDR2 VL D9.2

SEQ ID NO: 10 secuencia de aminoacidos CDR3 VL D9.2

En la lista de secuencias expuesta mas adelante se indican otras secuencias.

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Descripcion detallada de la invencion

La presente solicitud se refiere a reacciones de tipo antlgeno-anticuerpo.

En general, la region variable de cadena pesada (dominio VH) de un anticuerpo desempena un importante papel en la union de un anticuerpo a un antlgeno. Se ha observado que la region CDR3 de un dominio VH es mas diversa que las regiones CDR1 y CDR2 y, por tanto, en la mayorla de los anticuerpos proporciona especificidad para la diana del anticuerpo. As! pues, las moleculas de anticuerpo de la invencion se basan en torno a la region cDR3 de VH del anticuerpo D9.2. Las moleculas de anticuerpo de la invencion comprenden las seis CDR del anticuerpo D9.2.

La estructura de una molecula de anticuerpo que comprende una CDR sera generalmente de una secuencia de cadena pesada o ligera de una molecula de anticuerpo, o una sustancial porcion de la misma, en la que la CDR esta situada en una localizacion que corresponde a la CDR de dominios variables de anticuerpo VH y VL naturales codificados por genes de inmunoglobulina reordenados. Las estructuras y las localizaciones de los dominios variables de inmunoglobulina se pueden determinar haciendo referencia a Kabat, E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4a Edicion. US Department of Health and Human Services. 1987, y las actualizaciones de la misma. Se dispone de una serie de recursos online academicos y comerciales para consultar esta base de datos. Por ejemplo, vease Martin, A.C.R. Accessing the Kabat Antibody Sequence Database by Computer PROTEINS: Structure,Function and Genetics, 25 (1996), 130-133 y el recurso online asociado, actualmente en la direccion web
http://www.bioinf.org.uk/abs/simkab.html.

Generalmente, una molecula de anticuerpo comprende un dominio VH que esta apareado con un dominio VL para proporcionar un dominio de union de antlgeno a anticuerpo, si bien en algunos casos, se puede utilizar un dominio VH en solitario para unir el antlgeno. Por ejemplo, el dominio VH de D9.2 (SEQ ID NO: 2) puede aparearse con el dominio VL D9.2 (SEQ ID NO: 4), de manera que se forma un sitio de union de antlgeno a anticuerpo que comprende ambos dominios VH y VL de D9.2. Alternativamente, se puede aparear el dominio VH de D9.2 con un dominio VL distinto al dominio VL de D9.2.

La promiscuidad de la cadena ligera esta perfectamente establecida en la tecnica, tal como se explica a continuation en el presente documento.

Una molecula de anticuerpo descrita en el presente documento se puede unir a IL-17BR humana y/o IL-17BR de raton. Por ejemplo, una molecula de anticuerpo se puede unir a IL-17BR humana y no presentar union o sustancialmente ninguna union con IL-17BR de raton. Alternativamente, una molecula de anticuerpo descrita en el presente documento se puede unir a IL-17BR de raton y no presentar union o sustancialmente ninguna union con IL- 17BR humana.

Preferentemente, las moleculas de anticuerpo presentan reaction cruzada con IL-17BR tanto humano como de raton. Por ejemplo, una molecula de anticuerpo reactiva en reaccion cruzada se une tanto a IL-17BR humana como a IL-17BR de raton.

Una molecula de anticuerpo descrita en el presente documento se puede unir a IL-17BR con una afinidad que es sustancialmente similar a la de D9.2, p.ej. de 90 % a 110 % de la afinidad de union de D9.2. Una molecula de anticuerpo sera generalmente especlfica para IL-17BR. Es decir, una molecula de anticuerpo se puede unir a IL- 17BR pero no presentara union, o sustancialmente ninguna union, con otros miembros de la familia IL-17R. Preferentemente, una molecula de anticuerpo especlfica para IL-17BR se une a IL-17BR pero no presenta union o sustancialmente ninguna union con IL-17RA, IL-17RC y/o IL-17RD.

Normalmente, la especificidad se puede determinar por medio de un ensayo de union como ELISA empleando un panel de antlgenos.

La union de una molecula de anticuerpo descrita en el presente documento con IL-17BR se puede eliminar por competencia con una IL-17BR recombinante.

Se pueden comparar la afinidad de union y la potencia de neutralization de diferentes moleculas de anticuerpo descritas en el presente documento en condiciones apropiadas aplicando tecnicas de rutina.

Las moleculas de anticuerpo incluyen cualquier miembro o sustancia de union que tenga un sitio de union de antlgeno a anticuerpo con la especificidad requerida y/o que se una a IL-17BR. Entre los ejemplos de moleculas de anticuerpo se incluyen isotipos de inmunoglobulina y sus subclases isotlpicas; fragmentos de anticuerpo, tales como Fab, Fab', Fab'-SH, scFv, Fv, dAb y Fd; moleculas de anticuerpo obtenidas por ingenierla genetica, tales como Fab2, Fab3, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y minicuerpos; y cualquier otro polipeptido que comprenda un sitio de union de antlgeno a anticuerpo, ya sea natural o total o parcialmente sintetico. Por lo tanto, se incluyen las moleculas quimericas, que comprenden un dominio de union del antlgeno o equivalente, fusionadas con otro polipeptido. La donation y expresion de anticuerpos quimericos se describe en las patentes europeas EP-A- 0120694 y EP-A-0125023.

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Entre los ejemplos de moleculas de anticuerpo se incluyen (i) el fragmento Fab que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) el fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iii) el fragmento Fv que consiste en los dominios VL o VH de un solo anticuerpo; (iv) el fragmento dAb (Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989)) que consiste en un dominio VH; (v) regiones CDR aisladas; (vi) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos (vii) moleculas Fv monocatenarias (scFv), en las que estan unidos un dominio VH y un dominio VL mediante un engarce de peptido que permite la asociacion de los dos dominios para formar un sitio de union a antlgeno (Bird et al, Science, 242, 423-426, 1988; Huston et al, PNAS Estados Unidos, 85, 5879-5883, 1988); (viii) dlmeros Fv monocatenarios biespeclficos (documento PCT/US92/09965) y (ix) "diacuerpos", fragmentos multivalentes o multiespeclficos construidos por fusion genica (WO94/13804; P. Holliger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 90 6444-6448, 1993). Fv, scFv o las moleculas de diacuerpo se pueden estabilizar mediante la incorporacion de puentes disulfuro que unen los dominios VH y VL (Y. Reiter et al, Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996). Se pueden fabricar tambien minicuerpos que comprenden un scFV unido a un dominio CH3. (S. Hu et al, Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996). Las moleculas de anticuerpo y los metodos para su construccion y uso se describen en Holliger & Hudson, Nature Biotechnology 23(9): 1126-1136 (2005).

Cuando se utilicen moleculas de anticuerpo biespeclficas, pueden ser anticuerpos biespeclficos convencionales que se pueden fabricar de diversas formas (Holliger, P. and Winter G. Current Opinion Biotechnol. 4, 446-449 (1993)), p.ej. se pueden preparar qulmicamente o a partir de hibridomas hlbridos, o pueden consistir en cualquiera de los fragmentos de anticuerpos biespeclficos que se han mencionado antes. Los diacuerpos y scFv se pueden construir sin una region Fc, utilizando solamente dominios variables, reduciendo potencialmente los efectos de una reaccion anti-idiopatica.

Asimismo, los diacuerpos biespecificos, en contraposicion con los anticuerpos enteros biespeclficos, pueden ser particularmente utiles ya que se pueden construir facilmente y expresar en E. coli. Se pueden seleccionar facilmente los diacuerpos (y muchos otros polipeptidos, como fragmentos de anticuerpo) de especificidades de union apropiadas utilizando despliegue en fagos (documento WO94/13804) desde bibliotecas. Si se tiene que mantener constante un brazo del diacuerpo, por ejemplo, con una especificidad dirigida contra IL-217BR, entonces se puede fabricar una biblioteca en la que el otro brazo se varla y se selecciona un anticuerpo de la especificidad apropiada. Se pueden fabricar anticuerpos enteros biespeclficos por ingenierla de boton en ojal (J. B. B. Ridgeway et al, Protein Eng., 9, 616-621, 1996).

Es posible tomar anticuerpos monoclonales y otros anticuerpos y aplicar tecnicas de la tecnologla de ADN recombinante para producir otras moleculas de anticuerpo o moleculas quimericas que retengan la especificidad del anticuerpo original. Dichas tecnicas pueden implicar la introduccion de ADN que codifica la region variable de inmunoglobulina, o las regiones determinantes de complementariedad (CDR), de un anticuerpo para las regiones constantes, o las regiones constantes mas las regiones marco, de una inmunoglobulina diferente. Vease, por ejemplo, los documentos EPA- 184187, GB 2188638A o EP-A-239400.

Preferentemente, se injertan las regiones CDR en una region marco humana. La region marco humana puede seleccionarse a traves de diversos metodos, p.ej., comparando la region marco de raton o las secuencias de la region V de raton con la region marco humana o las secuencias de la region V conocidas u seleccionando la region marco humana que tenga mayor grado de similitud o identidad de aminoacidos, o uno de los mas altos. Se pueden realizar modificaciones de regiones marco de secuencias humanas sin tratar previamente para optimizar aun mas los anticuerpos con injerto de CDR resultantes.

Aunque las moleculas de anticuerpo que comprenden un par de dominios VH y VL son preferentes, se pueden utilizar tambien dominios de union simples basados en secuencias de dominio o bien VH o bien VL. Se sabe que los dominios de inmunoglobulina simples, especialmente los dominios VH, son capaces de union de antlgenos diana de una manera especlfica.

Ya sea uno u otro dominio de union de cadena simple, dichos dominios se pueden utilizar para rastrear dominios complementarios capaces de formar una molecula de anticuerpo de doble dominio capaz de unir IL-17BR, tal como se describe en el presente documento mas adelante.

Las moleculas de anticuerpo pueden comprender ademas regiones constantes de anticuerpo o partes de las mismas. Por ejemplo, un dominio VL puede unirse en su extremo terminado en C a dominios constantes de cadena ligera de anticuerpo, incluyendo las cadenas Ck o CA humanas, preferentemente cadenas CA. De manera similar, una molecula de anticuerpo basada en un dominio VH puede unirse en su extremo terminado en C a toda o parte de la cadena pesada de inmunoglobulina derivada cualquier isotopo de anticuerpo, p.ej., IgG, IgA, IgE e IgM y cualquiera de las subclases del isotipo, en particular, IgG1 e IgG4. IgG4 es preferente. Se pueden emplear las regiones Fc como Anab y Anac que se describen en el documento WO99/58572.

Las regiones marco de las moleculas de anticuerpo de la invencion tambien pueden incluir secuencias de glicosilacion que incluyen uno o mas sitios de glicosilacion. Dependiendo de la celula huesped en la que se expresa el anticuerpo, el patron de glicosilacion puede variar. As! pues, las construcciones de acido nucleico que codifican sitios de glicosilacion pueden modificarse para eliminar el sitio o, alternativamente, se pueden introducir dichos sitios

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en la protelna. Por ejemplo, los sitios de N-glicosilacion en protelnas eucariotas se caracterizan por un triplete de aminoacido Asn-X-Y, en el que X es cualquier aminoacido excepto Pro, e Y es Ser o Thr. Las sustituciones, adiciones o deleciones apropiadas de la secuencia de nucleotidos que codifican estos tripletes tendran como resultado evitar que se unan restos de carbohidrato en la cadena lateral Asn. La alteracion de un solo nucleotido, seleccionado para que Asn este reemplazado por un aminoacido diferente, por ejemplo, es suficiente para inactivar un sitio de N-glicosilacion. Los procedimientos conocidos para inactivar sitios de N-glicosilacion en protelnas incluyen los descritos en la patente estadounidense. No. 5.071.972 y la patente europea EP 276.846.

La expresion “dominio de union a antlgeno” describe la parte de una molecula de anticuerpo que comprende el area que se une especlficamente a un antlgeno y es complementaria de parte o todo el antlgeno. Cuando el antlgeno es grande, es posible que el anticuerpo se una solamente a una parte concreta del antlgeno, parte que se denomina epltopo. El dominio de union a antlgeno se puede proporcionar a traves de uno o mas dominios variables de anticuerpo (p.ej., el llamado fragmento de anticuerpo Fd que consiste en un domino VH). Preferentemente, un dominio de union a antlgeno comprende una region variable de cadena ligera de anticuerpo (VL), o al menos una sustancial porcion del mismo, y una region variable de cadena pesada de anticuerpo (VH), o al menos una sustancial porcion del mismo.

Una porcion sustancial de un dominio variable de inmunoglobulina comprendera al menos tres regiones CDR, junto con sus regiones marco intermedias. Preferentemente, la porcion tambien incluira al menos aproximadamente 50 % de una o ambas regiones marco primera y cuarta, siendo dicho 50 % el 50 % de la primera region marco C-terminal y el 50 % de la cuarta region marco N-terminal. Los restos adicionales en el extremo N-terminal o C-terminal de una parte sustancial del dominio variable pueden ser los que no estan asociados normalmente con las regiones del dominio variable natural. Por ejemplo, la construccion de moleculas de anticuerpo fabricadas a traves de tecnicas de ADN recombinante puede tener como resultado la introduction de restos N- o C-terminales codificados por engarces introducidos para facilitar la donation u otras etapas de manipulation. Otras etapas de manipulation incluyen la introduccion de engarces para unir dominios variables a otras secuencias de protelna incluyendo cadenas pesadas de inmunoglobulina, otros dominios variables (por ejemplo, en la production de diacuerpos) o marcadores de protelnas tal como se explica con mayor detalle mas adelante.

Por lo general, se aislaran las moleculas de anticuerpo y los acidos nucleicos que codifican moleculas de anticuerpo, es decir, se las dejara desprovistas o sustancialmente desprovistas del material con el que estan asociadas de forma natural, como pueda ser otros polipeptidos o acidos nucleicos con los que se encuentran en su entorno natural o el entorno en el que se preparan (p.ej., cultivo celular), cuando dicha preparation se realiza mediante tecnologla de ADN recombinante in vitro o in vivo.

Las moleculas de anticuerpo y el acido nucleico se pueden formular con diluyentes o adyuvantes y, aun asl, por motivos practicos, aislarse; por ejemplo las moleculas estaran mezcladas por lo general con gelatina u otros vehlculos si se utilizan para revestir placas de microtitulacion para su uso en inmunoensayos, o se mezclaran con vehlculos o diluyentes farmaceuticamente aceptables, cuando se utilicen en diagnostico o terapia. Las moleculas de anticuerpo se pueden glicosilar, ya sea de forma natural o a traves de sistemas de celulas eucariotas heterologas (p.ej., celulas CHO o NS0 (ECACC 85110503)), o pueden estar sin glicosilar (por ejemplo, si se producen por expresion en una celula procariota).

Ademas de las secuencias de anticuerpo, una molecula de anticuerpo, tal como se describe en el presente documento, puede comprender otros aminoacidos, p.ej., formando un peptido o polipeptido, como pueda ser un dominio plegado, o para impartir a la molecula otra caracterlstica funcional ademas de la capacidad de unirse a antlgeno.

En algunas realizaciones, las moleculas de anticuerpo pueden llevar un marcador detectable o funcional o se pueden conjugar con una toxina o enzima (p.ej., una union peptidilo o un engarce).

Un marcador puede ser una molecula que produce o que puede inducir a producir una senal, incluyendo pero sin limitarse solo a ellas, agentes de fluorescencia, radiomarcadores, enzimas, quimioluminiscentes o fotosensibilizadores. De esta manera, se puede detectar y/o medir la union detectando la fluorescencia o luminiscencia, radioactividad, actividad enzimatica o absorbancia de luz.

Entre los marcadores adecuados se incluyen radiomarcadores tales como I131 o Tc99, que se pueden unir a moleculas de anticuerpo utilizando tratamientos qulmicos convencionales conocidos en la tecnica de la obtencion de imagenes de anticuerpos. Los marcadores tambien incluyen marcadores enzimaticos, tales como peroxidasa de rabano rusticano, fosfatasa alcalina, glucosa-6-fosfato dehidrogenasa ("G6PDH"), alfa-D-galactosidasa, glucosa oxidasa, glucosa amilasa, anhidrasa carbonica y acetilcolinesterasa. Los marcadores incluyen marcadores fluorescentes o agentes fluorescentes, tales como fluorescelna y sus derivados, fluorocromo, compuestos de rodamina y derivados y PFV (las siglas PFV se refieren a “protelna fluorescente verde”). Los marcadores pueden incluir ademas fracciones qulmicas como biotina, que se puede detectar a traves de la union a una fraction detectable de cognado especlfico, p.ej., avidina marcada.

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Cuando la caracterlstica adicional es un dominio de polipeptido o marcador, la molecula de anticuerpo puede producirse a traves de tecnicas recombinantes, es decir, a traves de la expresion de acido nucleico que codifica una fusion de la molecula de anticuerpo y el dominio adicional.

Las moleculas de anticuerpo reactivas con IL-17BR pueden comprender variantes de los dominios VH y VL y la CDR descritas en el presente documento. Las variantes se pueden obtener por medio de metodos de alteracion o mutacion de secuencias y cribado.

La molecula de anticuerpo puede ser aquella que compite por la union con IL-17BR con cualquier molecula de anticuerpo que se une a IL-17BR y comprende un dominio VH y/o -VL tal como se describe en el presente documento, mas preferentemente, una molecula de anticuerpo que comprende el dominio VH de SEQ ID NO: 2 y el dominio VL de SEQ ID NO: 4. Por tanto, un aspecto mas de la presente divulgacion proporciona una molecula de anticuerpo que comprende un sitio de union de antlgeno a anticuerpo humano que compite con D9.2 por la union con IL-17-bR. La competicion entre las moleculas de anticuerpo se puede determinar facilmente por ensayo in vitro, por ejemplo, empleando ELISA y/o por marcado de una molecula informadora especlfica para una molecula de anticuerpo que se puede detectar en presencia de otra(s) molecula(s) de anticuerpo sin marcar, para dar cabida a la identification de molecula(s) de anticuerpo que se unen al mismo epltopo o un epltopo superpuesto.

Se dispone de diversos metodos en la tecnica para la obtencion de moleculas de anticuerpo contra IL-17-BR y que pueden competir con D9.2 por la union con IL-17BR.

Se pueden emplear variantes de las secuencias de dominio variable de los aminoacidos descritos en el presente documento, tal como se ha explicado. Las variantes en particular pueden incluir una o mas alteraciones de las secuencias de aminoacidos (adicion, delecion, sustitucion y/o insercion de un resto aminoacido), pueden consistir en menos de aproximadamente 20 alteraciones, menos de aproximadamente 15 alteraciones, menos de aproximadamente 10 alteraciones o menos de aproximadamente 5 alteraciones, 4, 3, 2 o 1. Las alteraciones se pueden introducir en una o mas regiones marco y/o una o mas CDR.

Se puede transportar una secuencia de aminoacidos CDR sustancialmente tal como se expone en el presente documento como una CDR en un dominio variable humano o una portion sustancial del mismo. Por ejemplo, se pueden transportar secuencias CDR3 de VH sustancialmente tal como se expone en el presente documento como una CDR3 de VH en un dominio variable de cadena pesada humano o una porcion sustancial del mismo.

Otro aspecto de la divulgacion proporciona una molecula de anticuerpo que se une a IL-17-BR y que comprende un dominio VH de anticuerpo que comprende CDR3 de VH sustancialmente tal como se exponen en SEQ ID NO: 7.

La molecula de anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende una CDR1, CDR2 y CDR3 de VH sustancialmente, tal como se expone en las SEQ ID NOS: 5, 6 y 7, respectivamente.

Un dominio VH se puede aparear con un dominio VL, por ejemplo, un dominio VL con CDR1, CDR2 y CDR3, sustancialmente tal como se expone en SEQ ID NOS: 8, 9 y 10, respectivamente.

En algunos casos, una molecula de anticuerpo puede comprender un dominio VH que comprende una CDR1, CDR2 y CDR3 de VH sustancialmente tal como se expone en las SEQ ID NO: 5, 6 y 7, respectivamente; y un dominio VL con una CDR1, CDR2 y CDR3 sustancialmente tal como se expone en las SEQ ID NO: 8, 9 y 10, respectivamente.

Los dominios VH y VL pueden tener regiones marco humanas o no humanas, como por ejemplo regiones marco sustancialmente tal como se expone en las regiones marco de SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4, respectivamente.

En algunos casos, la molecula de anticuerpo puede comprender las secuencias de dominio VH y VL sustancialmente tal como se expone en SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4, respectivamente.

Ha de entenderse por “sustancialmente tal como se expone” que la CDR o dominio VH o VL correspondiente sera identica o muy similar a las regiones especificadas cuya secuencia se expone en el presente documento. Se contempla como “muy similar” la posibilidad de realizar de 1 a 5, preferentemente de 1 a 4, como por ejemplo de 1 a 3 o 1 o 2, o 3 o 4 sustituciones de aminoacido en la CDR y/o dominio VH o VL.

Se pueden generar variantes de moleculas de anticuerpo llevando a cabo una mutagenesis aleatoria de uno o ambos genes VH y/o VL de D9.2 para generar mutaciones dentro de todo el dominio variable. Gram et al (1992, Proc. Natl. Acad. Sci., Estados Unidos, 89:3576-3580) describe dicha tecnica empleando PCR propensa a error.

Otro metodo que se puede aplicar consiste en dirigir la mutagenesis a regiones CDR de genes VH o VL. Dichas tecnicas estan descritas por Barbas et al, (1994, Proc. Natl. Acad. Sci., Estados Unidos, 91:3809-3813) y Schier et al (1996, J. Mol. Biol. 263:551-567).

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Todas las tecnicas que se han descrito son conocidas como tales dentro de la especialidad y por si mismas no forman parte de la presente invencion. Las personas especializadas en la tecnica podran aplicar dichas tecnicas para proporcionar las moleculas de anticuerpo tal como se describen en el presente documento aplicando la metodologla habitual en la especialidad.

Otro aspecto de la divulgacion proporciona un metodo para obtener una molecula de anticuerpo contra IL-17BR que comprende:

proporcionar un acido nucleico de partida que codifica una molecula de anticuerpo que tiene una o mas (es decir, una, dos, tres, cuatro, cinco o las seis) de las secuencias CDR de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4; modificar dicho acido nucleico para alterar la secuencia o secuencias CDR; expresar dicha molecula de anticuerpo modificada; y

someter a ensayo dicha molecula de anticuerpo modificada para determinar su union contra IL-17BR.

Preferentemente, la modification se llevara a cabo en una pluralidad de moleculas de acido nucleico de partida para proporcionar un repertorio de secuencias modificadas que tienen diversidad de afinidades de union.

El acido nucleico de partida comprende preferentemente las tres CDR de cadena pesada de SEQ ID NO: 2, ya sea en la propia forma SEQ ID NO: 2 o transportada en otra secuencia marco.

Las modificaciones pueden dirigirse a una sola CDR, p.ej., la CDR3, o se pueden dirigir modificaciones a dos o mas regiones CDR simultaneamente.

Los dominios variables pueden obtenerse de cualquier llnea germinal o dominio variable humano reordenado o pueden consistir en un dominio variable sintetico basado en secuencias de consenso de dominios variables humanos conocidos. La secuencia CDR tal como se describe en el presente documento (p.ej., CDR3) se puede introducir en un repertorio de dominios variables que carece de CDR (en particular CDR3) aplicando tecnologla de ADN recombinante.

Por ejemplo, Marks et al (Bio/Technology, 1992, 10:779-783) describe metodos de production de repertorios de dominios variables de anticuerpo en los que se utilizan cebadores de consenso dirigidos o adyacentes al extremo 5' del area de dominio variable en conjuncion con cebadores de consenso para la tercera region marco de genes VH humanos para proporcionar un repertorio de dominios variables VH que carecen de una CDR3. Marks et al describe ademas como este repertorio se puede combinar con una CDR3 de un anticuerpo en particular. Con tecnicas analogas, las secuencias derivadas de CDR3 se pueden barajar con repertorios de dominios VH o VL que carecen de una CDR3 y combinarse los dominios VH o VL completos barajados con un dominio VL o VH cognado para proporcionar moleculas de anticuerpo tal como se describen en el presente documento. El repertorio se puede desplegar a continuation en un sistema huesped adecuado, como pueda ser el sistema de despliegue en fagos del documento WO92/01047 de manera que se puedan seleccionar moleculas de anticuerpo adecuadas. Un repertorio puede consistir en desde 104 miembros individuales en adelante, como por ejemplo de 106 a 108 o 1010 miembros.

Stemmer (Nature, 1994, 370:389-391) divulga tecnicas de barajado o combinatorias analogas, describiendo la tecnica en relation con un gen p-lactamasa, si bien observa que el enfoque se puede aplicar a la generation de anticuerpos.

Un aspecto mas de la divulgacion proporciona por tanto un metodo para preparar una molecula de anticuerpo especlfica para IL-17BR, metodo que comprende:

(a) proporcionar un repertorio de partida de acidos nucleicos que codifican un dominio VH que o bien incluye una CDR3 para ser reemplazada o bien carece de una region que codifica CDR3;

(b) combinar dicho repertorio con un acido nucleico donador que codifica una secuencia de aminoacidos sustancialmente tal como se expone en SEQ ID NO: 7 de manera que se inserta el acido nucleico donador en la region CDR3 del repertorio para proporcionar un repertorio de productos de acidos nucleicos que codifican un dominio VH;

(c) expresar los acidos nucleicos de dicho repertorio de productos;

(d) seleccionar una molecula de anticuerpo especlfica para IL-17BR; y

(e) recuperar dicha molecula de anticuerpo o dicho acido nucleico que la codifica.

El repertorio de productos se puede co-expresar, desde el mismo vector o desde un vector diferente, con un dominio VL. El dominio VL puede ser el dominio VL descrito en el presente documento, p.ej. el dominio VL de SEQ ID NO: 4, o puede ser uno o mas dominios VL diferentes, tal como se describe mas adelante en relacion con el barajado de cadena.

Se puede emplear un metodo analogo en el que se combina CDR3 de VL sustancialmente tal como se expone en SEQ ID NO: 10 con un repertorio de acidos nucleicos que codifican un dominio VL que o bien incluye una CDR3 para ser reemplazada o bien carece de region que codifica CDR3. Al igual que con el metodo antes descrito, el

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repertorio de productos VL puede co-expresarse, desde el mismo vector o desde un vector diferente, con un dominio VH. El dominio VH puede ser el dominio VH descrito en el presente documento, es decir el dominio VH de SEQ ID NO: 2 o puede ser uno o mas dominios VH diferentes, tal como se describe mas adelante en relacion con el barajado de cadena.

De manera similar, se pueden injertar una o mas, o las tres CDR en un repertorio de dominios VH o VL que se rastrean a continuation en busca de moleculas de anticuerpo o moleculas de anticuerpo especlficas para IL-17BR.

Otro aspecto de la divulgation proporciona un metodo para obtener un dominio de union de antlgeno a anticuerpo para IL-17BR, comprendiendo dicho metodo combinar un dominio VH de una molecula de anticuerpo descrita en el presente documento (incluyendo variantes como las que se han explicado antes) con uno o mas dominios VL, y someter a ensayo la combination o combinaciones de VH/VL para determinar el dominio de union de antlgeno a anticuerpo para IL-17BR.

Dicho dominio VL puede tener una secuencia de aminoacidos que es sustancialmente como la expuesta en el presente documento. Por ejemplo, el dominio VL puede ser sustancialmente tal como se expone en SEQ ID NO: 4.

Se puede emplear un metodo analogo en el que se combinan una o mas variantes de secuencia de un dominio VL descrito en el presente documento con uno o mas dominios VH.

Esto se puede conseguir a traves de metodos de cribado de despliegue en fagos aplicando el llamado enfoque combinatorio dual jerarquico descrito en el documento WO92/01047 en el que se utiliza una colonia individual que contiene un clon de cadena H o L para infectar una biblioteca completa de clones que codifican la otra cadena (L o H) y se selecciona la molecula de anticuerpo bicatenaria resultante con arreglo a tecnicas de despliegue en fagos como las que se describen en dicho trabajo de referencia.

Otro aspecto de la presente divulgacion proporciona un metodo para la selection de una molecula de anticuerpo para IL-17BR, metodo que comprende

(a) proporcionar un dominio VH de anticuerpo que comprende una CDR3 de VH con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO. 7;

(b) combinar dicho dominio VH con una pluralidad de dominios VL de anticuerpo para proporcionar moleculas de anticuerpo;

(c) rastrear dichas moleculas de anticuerpo para determinar la union a IL-17BR; y

(d) seleccionar una molecula de anticuerpo que se une a IL-17BR.

En dicho metodo, se puede proporcionar los dominios VH y VL en forma de protelnas expresadas por ADN recombinante, en particular por ADN de fago o fagemido.

La pluralidad de los dominios VL puede ser cualquier a partir de 104 dominios individuales en adelante, por ejemplo de 106 a 108 o 1010 dominios.

IL-17BR, conocida en la tecnica tambien como IL-25R, IL-17RB o IL-17RH1, esta disponible en el mercado (p.ej. R&D Systems, MN, Estados Unidos) como protelna de fusion Fc, o se puede clonar o sintetizar haciendo referencia a secuencias de IL-17BR disponible en la tecnica.

IL-17BR murina (GeneID: Acido nucleico: NM_019583.3 GI: 142368701; NP_062529.2 GI: 83025064) esta descrita por Tian et al., 2000 (Ref. 11 mas adelante). IL-17BR humana (GeneID: 55540, Acido nucleico: NM_018725.3 GI:112382255; Protelna NP_061195.2 GI:27477074) esta descrita por Shi, Y., et al., 2000 (Ref. 10 mas adelante).

Para la production de anticuerpos o su uso en inmunoensayos se pueden utilizar fragmentos de IL-17BR recombinante, en particular los que contienen el dominio extracelular.

En otros aspectos, la divulgacion proporciona un acido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una molecula de anticuerpo, un dominio VH o un dominio VL tal como se ha descrito, por ejemplo, un dominio VH o VL de SEQ ID NO: 2 y 4 respectivamente, as! como metodos de preparation de una molecula de anticuerpo, un dominio VH o un dominio VL tal como se ha descrito, que comprende la expresion de dicho acido nucleico en condiciones idoneas para dar lugar a la produccion de dicha molecula de anticuerpo, dominio VH o dominio VL y su recuperation.

Otro aspecto de la presente divulgacion proporciona un acido nucleico, generalmente aislado, que codifica una secuencia de CDR de VH o CDR de VL divulgada en el presente documento, especialmente una CDR de VH seleccionada de las SEQ ID NO: 5, 6 y 7, una CDR de VL seleccionada de las SEQ ID NO: 8, 9 y 10, siendo lo mas preferente CDR VH de D9.2 (SEQ ID NO. 7).

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Los acidos nucleicos pueden comprender las secuencias o las porciones pertinentes de las mismas (p.ej., regiones que codifican CDR) de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, o variantes de estas secuencias modificadas, por ejemplo, por mutagenesis dirigida a sitio para codificar otros dominios VH y VL. Sin embargo, el uso de codon puede variar, p.ej., para optimizar la expresion de la secuencia en una celula huesped deseada.

Otro aspecto de la presente invencion proporciona un acido nucleico aislado que codifica una molecula de anticuerpo de la presente invencion. El acido nucleico incluye ADN y ARN. En un aspecto preferente, la presente invencion proporciona un acido nucleico que codifica las CDR de los dominios VH y VL de un anticuerpo de la invencion, tal como se expone en las reivindicaciones.

El acido nucleico de acuerdo con la presente invencion puede comprender ADN o ARN y puede ser total o parcialmente sintetico. La referencia a una secuencia de nucleotidos, tal como se muestra en el presente documento, abarca una molecula de ADN con la secuencia especificada y abarca una molecula de ARN con la secuencia especificada en la que U esta sustituido por T, a no ser que el contexto lo requiera de otra forma.

Otros aspectos de la presente invencion proporcionan tambien vectores como, por ejemplo, en forma de un plasmido, virus, p.ej., fago o fagemido, cosmidos, casetes de transcripcion o expresion que comprenden al menos un acido nucleico como los descritos.

Los vectores adecuados se pueden seleccionar o construir, con un contenido de secuencias reguladoras apropiado, incluyendo secuencias promotoras, secuencias de terminacion, secuencias de poliadenilacion, secuencias potenciadoras, genes marcadores y otras secuencias, segun sea apropiado. Para mayor detalle, vease por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2a Edicion, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Los vectores tambien incluyen vectores virales capaces de infectar celulas humanas in vivo, p.ej., vectores de virus, adenovirales, retrovirales o adenoasociados. Dichos vectores pueden ser utiles para la expresion de una molecula de anticuerpo de la invencion en las celulas de un sujeto humano o animal, para proporcionar la produccion y entrega de la molecula de anticuerpo a dicho sujeto.

Una secuencia de acido nucleico que codifica una molecula de anticuerpo de la invencion estara, en uno de los aspectos, unida operativamente a un promotor para llevar a efecto la expresion de la molecula de anticuerpo en una celula huesped. La secuencia puede incluir en su extremo 5' una secuencia llder para facilitar la expresion y/o secrecion de la molecula de anticuerpo en la celula huesped y/o desde ella. Se conocen numerosas secuencias llder adecuadas como tales en la tecnica, que podran ser seleccionadas por la persona especializada en la tecnica teniendo en cuenta la celula huesped.

En Current Protocols in Molecular Biology, 2a Edicion, Ausubel et al., eds. John Wiley & Sons, 1992, se describen con detalle muchas tecnicas y protocolos conocidos para la manipulation de acidos nucleicos, por ejemplo, en la preparation de construcciones de acido nucleico, mutagenesis, secuenciacion, introduction de ADN en celulas y expresion genica y analisis de protelnas.

Otro aspecto proporciona una celula huesped transformada con un acido nucleico (p.ej., una secuencia de acidos nucleicos en forma de vector) de la invencion.

El acido nucleico puede estar integrado en el genoma (p.ej., cromosoma) de la celula huesped. La integration se puede promover por inclusion de secuencias que promueven la recombination con el genoma con arreglo a tecnicas convencionales.

Otro aspecto proporciona un metodo de produccion de una molecula de anticuerpo tal como se describe en el presente documento, incluyendo dicho metodo causar la expresion desde el acido nucleico de codificacion. Dicho metodo puede comprender el cultivo de celulas huesped en condiciones adecuadas para la produccion de dicha molecula de anticuerpo.

Tras la produccion por expresion, se puede aislar y/o purificar un dominio VH o VL o una molecula de anticuerpo aplicando cualquier tecnica adecuada y utilizarlo despues segun sea apropiado. Un metodo de produccion puede comprender una etapa de aislamiento y/o purification del producto.

Tras la purificacion del producto, se puede modificar la molecula de anticuerpo por medios flsicos o qulmicos, por ejemplo para introducir grupos protectores que alteren, p.ej., que aumenten, la estabilidad o semivida biologica de la protelna. Por ejemplo, dentro de la tecnica se conoce como tal la PEGilacion de protelnas para conseguir dichos efectos y las moleculas de anticuerpo de la invencion se pueden presentar en forma PEGilada.

Un metodo de produccion puede comprender la formulation del producto en una composition que incluya al menos un componente adicional, como pueda ser un excipiente farmaceuticamente aceptable.

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La presente divulgacion proporciona asimismo una celula huesped recombinante que comprende uno o mas acidos nucleicos o vectores, tal como se ha descrito.

Los sistemas para la clonacion y expresion de una molecula de anticuerpo en diversas celulas huespedes diferentes son conocidos. Entre las celulas huesped adecuadas se incluyen bacterias, celulas de mamlfero, levaduras y sistemas de baculovirus. Las llneas celulares de mamlfero de las que dispone la tecnica para la expresion de un polipeptido heterologo incluyen celulas de ovario de hamster chino, celulas HeLa, celulas de rinon de hamster recien nacido, celulas de melanoma de raton NS0, celulas de mieloma de rata YB2/0 y muchas otras. Un huesped bacteriano preferente es E. coli.

La expresion de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos en celulas procariotas como E. coli esta perfectamente establecida en la tecnica. Para una revision, vease por ejemplo Pluckthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991). La expresion de celulas eucariotas en cultivo tambien esta disponible para las personas especializadas en la tecnica como opcion para la produccion de una molecula de anticuerpo, vease las revisiones recientes, como por ejemplo Ref, M.E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4: 573-576; Trill J.J. et al. (1995) Curr. Opinion Biotech 6: 553-560.

Los datos que se exponen en el presente documento demuestran por primera vez que los anticuerpos contra IL- 17BR son eficaces para prevenir o reducir la hiperrespuesta de las vlas respiratorias in vivo, slntoma clave del asma.

La invencion proporciona ademas una molecula de anticuerpo de la invencion para su uso en un metodo de tratamiento, tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Otro aspecto de la divulgacion proporciona un metodo para prevenir o reducir la hiperrespuesta de las vlas respiratorias en un sujeto (p.ej., un ser humano) que lo necesita, que comprende la administracion a dicho sujeto de una molecula de anticuerpo que se une a IL-17BR, por ejemplo, una molecula de anticuerpo que se ha descrito. Otro aspecto de la divulgacion proporciona un metodo de prevencion, reduccion o tratamiento de asma, u otra afeccion mediada por IL-25 en un sujeto que lo necesita, que comprende la administracion al sujeto de una molecula de anticuerpo que se une a IL-17BR. Otras afecciones medidas por IL-25 incluyen alergia y colitis, que incluye a su vez colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn. El asma incluye asma alergica.

Por consiguiente, otro aspecto de la divulgacion proporciona un metodo para prevenir o reducir la inflamacion del colon en un sujeto (p.ej., un ser humano) que lo necesita, que comprende la administracion a dicho sujeto de una molecula de anticuerpo que se une a IL-17BR, por ejemplo la molecula de anticuerpo que se ha descrito. Otro aspecto de la divulgacion proporciona un metodo para prevenir, reducir o tratar iBd, que comprende la administracion al sujeto de una molecula de anticuerpo que se une a IL-17BR. Las afecciones medidas por IL-25 incluyen colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn. Otras afecciones medidas por IL-25 incluyen colitis (inflamacion del colon), incluyendo colitis cronica.

Los metodos terapeuticos se pueden poner en practica con moleculas de anticuerpo (incluyendo composiciones de las mismas), tal como se ha descrito, que son utiles en la union a IL-17BR y que antagonizan los efectos de la union de IL-17BR/IL-25, con potencial terapeutico para varias enfermedades y trastornos en los que IL-17BR desempena un papel. Asimismo, se pueden poner en practica los metodos con otras moleculas de anticuerpo (incluyendo composiciones de las mismas) que se unen a IL-17BR y que antagonizan los efectos de la union de IL-17Br-I L-25, que se pueden obtener tal como se describe mas adelante, en los ejemplos adjuntos.

Las moleculas de anticuerpo (incluyendo composiciones de las mismas) que se han descrito se pueden utilizar en un metodo de tratamiento (incluyendo un tratamiento profilactico) o diagnostico en un sujeto humano o animal. Dicho metodo de tratamiento o diagnostico (que puede incluir un tratamiento profilactico) puede comprender la administracion a dicho sujeto de una cantidad eficaz de la molecula de anticuerpo de la invencion. A continuacion, se exponen ejemplos de dichas enfermedades y trastornos.

Se describe asimismo el uso de una molecula de anticuerpo (incluyendo una composition de la misma) tal como se describe en el presente documento para la fabrication de un medicamento para su administracion a un sujeto humano o animal.

Las indicaciones cllnicas en las que se puede utilizar la molecula de anticuerpo anti-IL-17BR para proporcionar un beneficio terapeutico incluyen cualquier afeccion en la que la union de IL-17BR/IL-25 tiene consecuencias patologicas. Por lo tanto, en general, la molecula de anticuerpo descrita en el presente documento se puede utilizar en el tratamiento de cualquier afeccion medida por IL-25, como por ejemplo la asociada con una respuesta de Th2 o respuesta de tipo -2 no deseada. En algunos casos, la molecula de anticuerpo de la invencion se puede utilizar para el tratamiento de alergia y asma, en particular asma. En algunos casos, la molecula de anticuerpo de la invencion se puede utilizar para el tratamiento de IBD, en particular, para el tratamiento de UC y/o CD.

El tratamiento anti-IL-17BR se puede administrar por inyeccion (p.ej., por via intravenosa) o a traves de metodos de administracion local. Anti-IL-17BR se puede suministrar a traves de tecnologlas genicas. Las estrategias de formulation alternativas pueden proporcionar preparaciones adecuadas para ruta oral o supositorios. La ruta de

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administracion se puede determinar basandose en las caracterlsticas psicoqulmicas del tratamiento, segun consideraciones concretas dependiendo de la enfermedad, para optimizar la eficacia y reducir al mlnimo los efectos secundarios.

Las composiciones proporcionadas se pueden administrar a individuos. La administracion se realiza preferentemente en una “cantidad terapeuticamente eficaz”, es decir la suficiente para producir un beneficio al paciente. Dicho beneficio puede consistir en al menos una mejora de al menos un slntoma. La cantidad administrada real, la pauta y el periodo de administracion dependeran del caracter y gravedad de la patologla que se este tratando. La prescripcion del tratamiento, p.ej., las decisiones en cuanto a la posologla, etc., entra dentro del criterio del facultativo o el medico responsable. Las dosis apropiadas de anticuerpo son conocidas dentro de la especialidad; vease Ledermann J.A. et al. (1991) Int. J. Cancer 47: 659-664; Bagshawe K.D. et al. (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922.

La dosis exacta dependera de una serie de factores, incluyendo si el anticuerpo es para el diagnostico o para el tratamiento, el tamano y la localizacion del area que se vaya a tratar, la naturaleza exacta del anticuerpo (p.ej., un anticuerpo completo, un fragmento o un diacuerpo) y la naturaleza de cualquier marcador detectable u otra molecula unida al anticuerpo. Una dosis de anticuerpo normal se encontrara dentro del intervalo de 0,5 mg - 1,0 g, que se pueden administrar por via intravenosa, como un bolo o como una infusion, a lo largo de varias horas, segun sea apropiado para conseguir la dosis requerida. Otros modos de administracion incluyen infusion intravenosa a lo largo de varias horas para conseguir una dosis acumulativa total similar. Esto se refiere a una dosis para un unico tratamiento de un paciente adulto, que se podra ajustar proporcionalmente para ninos y lactantes y ajustarse tambien para otros formatos de anticuerpo en proporcion con el peso molecular. Los tratamientos se pueden repetir de forma diaria, dos veces a la semana, semanalmente o a intervalos mensuales, a discrecion del medico.

En otro modo de administracion se emplea un revestimiento previo o se incorpora de otra forma en dispositivos fijos para los cuales, se determinara la cantidad de anticuerpo optima por experimentacion apropiadamente.

En algunas realizaciones, la molecula de anticuerpo puede ser un fragmento monomerico como F(ab) o scFv. Dichos fragmentos de anticuerpo pueden tener la ventaja de una semi-vida relativamente corta y un menor riesgo de activacion de plaquetas, que puede derivarse de la agregacion en el receptor. La agregacion que da lugar a la activacion plaquetaria podrla ser de moleculas IL-17BR o de IL-17BR con moleculas FcyRII por ejemplo.

Si se utiliza un anticuerpo completo, preferentemente esta en una forma que no pueda activar y/o destruir plaquetas. El isotipo IgG4 o, alternativamente, los isotipos “disenadores” derivados de la estructura de IgG1 (construcciones de gen Fc nuevas, documento WO99/58572, Clark, Armour, Williamson) son opciones preferentes. Se pueden utilizar fragmentos de anticuerpo mas pequenos como F(ab')2. Por otra parte, se pueden utilizar anticuerpos enteros o fragmentos (p.ej., F(ab')2 o diacuerpos) con especificidad de epltopo dual (p.ej. para los epltopos reconocidos por D9.2 scFv). Aunque dicha realizacion puede promover la agregacion en el receptor, una alta velocidad de asociacion para receptores individuales puede descartar este problema.

Las moleculas de anticuerpo descritas en el presente documento se administraran normalmente en forma de una composicion farmaceutica que puede comprender al menos un componente ademas de la molecula de anticuerpo.

Por lo tanto, las composiciones farmaceuticas de acuerdo con la presente invencion, as! como para su uso de acuerdo con la presente invencion, pueden comprender, ademas del principio activo, un excipiente, vehlculo, tampon, estabilizante u otro material farmaceuticamente aceptable conocido entre las personas especializadas en la tecnica. Dichos materiales no deberan ser toxicos y no deberan interferir con la eficacia del principio activo. La naturaleza exacta del vehlculo u otro material dependera de la ruta de administracion, que puede ser oral o por inyeccion, p.ej., intravenosa.

Las formulaciones terapeuticas de la molecula de anticuerpo se pueden preparar para su almacenamiento mezclando la molecula de anticuerpo con el grado de pureza deseado con vehlculos, excipientes o estabilizantes fisiologicamente aceptables opcionales (vease, p.ej., "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20a Edicion, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins.), en forma de polvo liofilizado o soluciones acuosas. Los vehlculos, excipientes y estabilizantes aceptables no son toxicos para los receptores en las posologlas y concentraciones empleadas e incluyen tampones como fosfato, citrato y otros acidos organicos; antioxidantes, incluyendo acido ascorbico; polipeptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 restos); protelnas, como albumina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; pollmeros hidrofilos como polivinil pirrolidona; aminoacidos como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacaridos, disacaridos y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes como EDTA; alcoholes de azucar como manitol o sorbitol; contraiones de formacion de sal como sodio; y/o tensioactivos no ionicos como Tween, Pluronics o polietilen glicol (PEG).

La molecula de anticuerpo que se utilice para su administracion in vivo debera ser esteril. Esto se consigue facilmente por filtracion a traves de membranas de filtracion esteriles, antes o despues de la liofilizacion y reconstitucion. La molecula de anticuerpo se almacenara por lo general en forma liofilizada o en solucion.

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Las composiciones farmaceuticas para administracion oral pueden presentarse como comprimidos, capsulas, polvos o en forma llquida. Un comprimido puede comprender un vehlculo solido, como gelatina, o un adyuvante. Las composiciones llquidas farmaceuticas comprenden generalmente un vehlculo llquido como agua, petroleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintetico. Puede incluirse solucion salina fisiologica, dextrosa u otras soluciones de sacarido o glicoles como etilen glicol, propilen glicol o polietilen glicol.

Para inyeccion intravenosa, o para inyeccion en el sitio afligido, se puede presentar el principio activo en forma de solucion acuosa parenteralmente aceptable, desprovista de pirogenos y con pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Las personas especializadas en la tecnica correspondiente podran preparar soluciones adecuadas utilizando por ejemplo vehlculos isotonicos como inyeccion de cloruro sodico, inyeccion de Ringer, inyeccion de Ringer lactato. Se pueden incluir tambien, segun sea necesario, conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos.

Una molecula de anticuerpo de la invencion se puede administrar en solitario o combinada con otros tratamientos, ya sea de forma simultanea o secuencialmente, dependiendo de la afeccion que se vaya a tratar. Otros tratamientos pueden incluir la administracion de dosis adecuadas de farmacos para aliviar el dolor, tales como farmacos no esteroides antiinflamatorios (p.ej., aspirina, paracetamol, ibuprofeno o cetoprofeno) u opiaceos como morfina; la administracion de antiemeticos; o la administracion de al menos otro compuesto activo contra el asma, generalmente un agente broncodilatador que produce relajacion de las vlas respiratorias o que potencia la eliminacion de moco, p.ej., un beta-agonista (p.ej., salbutamol, salmeterol), cromoglicato disodico, esteroides o un inhibidor de PDEiv.

Otro aspecto de la divulgacion proporciona un metodo que comprende causar o permitir la union de una molecula de anticuerpo tal como se proporciona en el presente documento con IL-17Br. Tal como se ha senalado, dicha union puede tener lugar in vivo, p.ej., tras la administracion de una molecula de anticuerpo, o acido nucleico que codifica una molecula de anticuerpo, o puede tener lugar in vitro, por ejemplo en ELlSA, transferencia de Western, inmunocitoqulmica, inmunoprecipitacion o cromatografla de afinidad.

La cantidad de union de molecula de anticuerpo a IL-17BR puede determinarse. La cuantificacion puede estar relacionada con la cantidad del antlgeno en una muestra de ensayo que puede ser de interes diagnostico.

Se pueden determinar las reactividades de las moleculas de anticuerpo en una muestra a traves de medios apropiados. El radioinmunoensayo (RIA) es una posibilidad. Se mezcla un antlgeno marcado radioactivo con un antlgeno sin marcar (muestra de ensayo) y se permite que se una a la molecula de anticuerpo. Se separa flsicamente el antlgeno unido del antlgeno no unido y se determina la cantidad de antlgeno radioactivo unida al anticuerpo. Cuanto mas antlgeno haya en la muestra de ensayo, menos antlgeno radioactivo se unira a la molecula de anticuerpo. Se puede utilizar tambien un ensayo de union competitiva con un antlgeno no radioactivo utilizando un antlgeno o un analogo unido a una molecula informadora. La molecula informadora puede ser un fluorocromo, fosforo o laser de colorante, con caracterlsticas de absorcion o emision espectralmente aisladas. Los fluorocromos adecuados incluyen fluorescelna, rodamina, ficoeritrina y rojo de Texas. Entre los colorantes cromogenos adecuados se incluyen diaminobencidina.

Otros informadores incluyen partlculas o material en partlculas coloidales macromoleculares, como perlas de latex coloreadas, magneticas o paramagneticas y agentes biologica o qulmicamente activos que pueden causar directa o indirectamente senales detectables para ser observadas visualmente, detectadas electronicamente o registradas de otro modo. Dichas moleculas pueden ser enzimas que catalizan reacciones que revelan o cambian los colores o causan cambios en las propiedades electricas, por ejemplo. Se pueden excitar molecularmente, de manera que las transiciones electronicas entre estados de energla tienen como resultado absorciones o emisiones espectrales caracterlsticas. Pueden incluir entidades qulmicas utilizadas en combination con biosensores. Se pueden emplear los sistemas de detection de biotina/avidina o biotina/estreptavidina y fosfatasa alcalina.

Las senales generadas por conjugados individuales anticuerpo-informador se pueden utilizar para producir datos relativos o absolutos cuantificables de la correspondiente union de anticuerpo en las muestras (normal y de ensayo).

La presente divulgation proporciona tambien el uso de una molecula de anticuerpo como la descrita para medir los niveles de antlgeno en un ensayo de competencia, es decir, un metodo para medir el nivel de antlgeno en una muestra empleando una molecula de anticuerpo tal como se proporciona en el presente documento en un ensayo de competencia. Esto es posible en los casos en los que no se requiere la separation flsica de antlgeno unido o sin unir. Una posibilidad es la union de una molecula informadora a la molecula de anticuerpo para que tenga lugar un cambio flsico u optico. La molecula informadora puede generar senales directa o indirectamente, preferentemente medibles. La union de las moleculas informadoras puede ser directa o indirecta, covalente, p.ej., una union peptldica, o no covalente. La union a traves de un enlace peptido puede ser como resultado de una expresion recombinante de una fusion del gen que codifica anticuerpo y molecula informadora.

La presente divulgacion proporciona tambien la medicion de los niveles de antlgeno directamente empleando una molecula de anticuerpo tal como se describe en el presente documento, por ejemplo, en un sistema de biosensor.

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El modo de determinacion de la union no es una caracterlstica de la presente divulgacion y las personas especializadas en la tecnica podran elegir un modo adecuado segun sus preferencias y su conocimiento general.

La presente divulgacion se extiende ademas a una molecula de anticuerpo que compite por la union con IL-17BR con cualquier molecula de anticuerpo que se une al antlgeno y que comprende un dominio VH y/o VL incluyendo una CDR con aminoacido sustancialmente tal como se expone en el presente documento o un dominio VH y/o VL con una secuencia de aminoacidos sustancialmente, tal como se expone en el presente documento. La competencia entre las moleculas de anticuerpo se puede determinar por ensayo in vitro facilmente, por ejemplo, por marcado de una molecula informadora especlfica para una molecula de anticuerpo que se puede detectar en presencia de otra(s) molecula(s) de anticuerpo no marcada(s), para permitir la identificacion de moleculas de anticuerpo que se unen al mismo epltopo o un epltopo de superposicion. La competencia puede determinarse por ejemplo por ELISA o citometrla de flujo.

Se puede recurrir a una reaccion de competencia para seleccionar una o mas moleculas de anticuerpo, tales como derivados de D9.2, que puedan tener una o mas propiedades adicionales o mejoradas. Esto es analogo al metodo de seleccion para D.9.2 con la excepcion de que no se eluye IL-17BR desde su mini-ligando, sino de una molecula de anticuerpo. Esto puede ser importante, ya que deberla producir una mayor proporcion de moleculas de anticuerpo hijas que compiten directamente con la parental. De hecho, dichas moleculas de anticuerpo hijas, tal como se seleccionan, pueden tener una mayor afinidad para el antlgeno que la parental (lo que da cabida a una potenciacion de la avidez que puede derivarse del despliegue de mas de una molecula de anticuerpo por fago). Los metodos actuales para seleccionar las moleculas de anticuerpo en fagos “hijas” de mejor afinidad incluyen:

uso de concentraciones de antlgeno diana (marcado) menores que la constante de disociacion del anticuerpo parental original;

uso de un exceso de antlgeno diana sin marcar como competidor tal como se demuestra en Hawkins et al. (1992). Si bien no especifican necesariamente que el anticuerpo “mejorado” deba desplazar/ocupar el mismo epltopo que el parental.

La incorporacion de la etapa de elucion debera producir una mayor proporcion de moleculas de anticuerpo hijas que no desplazan la parental. Las moleculas de anticuerpo hijas seleccionadas de esta forma pueden unirse a un epltopo muy similar con la molecula de anticuerpo parental, ero con una mayor afinidad.

Al someter a ensayo la competencia, se puede emplear un fragmento peptldico de IL-17BR, especialmente un peptido que incluya un epltopo de interes. Se puede usar un peptido que tenga la secuencia del epltopo mas uno o mas aminoacidos en cada extremo. Se puede decir que dicho peptido “consiste esencialmente” en la secuencia especificada. Las moleculas de anticuerpo pueden ser moleculas de anticuerpo para que se inhiba su union con IL- 17BR mediante un peptido con la secuencia dada o que la incluya. En el ensayo para determinarlo, se puede utilizar un peptido con cualquiera de las secuencias mas uno o mas aminoacidos.

Las moleculas de anticuerpo que se unen a un peptido especlfico se pueden aislar por ejemplo desde una biblioteca de despliegue en fagos por seleccion con el (los) peptido(s).

“y/o”, cuando se utilizan en el presente documento, ha de entenderse como la descripcion especlfica de cada una de las dos caracterlsticas o componentes especificados con o sin el otro. Por ejemplo “A y/o B” ha de entenderse como una descripcion especlfica de cada uno de los siguientes: (i) A, (ii) B y (ii) A y B, como si se mencionaran individualmente en el presente documento.

A no ser que venga dictado por el contexto de otra forma, las descripciones y las definiciones de las caracterlsticas que se han expuesto no estan limitadas a ningun aspecto o realizacion en particular de la invention y se aplican igualmente a todos los aspectos y realizaciones que se describen.

A continuation, se ilustran ciertos aspectos y realizaciones de la invencion mediante ejemplos y haciendo referencia a las figuras antes descritas.

Ejemplos

Metodos y materiales

Cribado de sobrenadantes por ELISA

Se revistieron inmunoplacas de 96 pocillos (Nunc) con 50 pl/pocillo de IL-17Br-Protelna de fusion Fc murina o humana a 1 pg/ml en 0,1 M NaHCO3 durante toda la noche a 4 °C o durante 3 horas, a temperatura ambiente. Al dla siguiente, se lavaron los pocillos 5 veces con PBS, 0,05% tween y despues se bloquearon en PBS 10 % FCS durante 4 horas a temperatura ambiente. Durante el mismo perlodo de 4 horas, se incubaron los sobrenadantes desde el cultivo de celulas del hibridoma con 50 pg/ml hIgG. Esto fue para bloquear cualquier anticuerpo en el sobrenadante que pudiera haberse desarrollado contra la portion Fc de la protelna de fusion. Los sobrenadantes

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que no recibieron este tratamiento tambien fueron incluidos en el ELISA para servir como indicacion de la cantidad de anticuerpo anti-Fc en cada muestra.

Transcurridas 4 horas de la etapa de bloqueo, se lavaron las inmunoplacas 5 veces en PBS 0,05% tween y se anadieron los sobrenadantes puros, a 50 pl/pocillo. Se dejaron sobre la placa los sobrenadantes durante toda la noche a 4 °C o durante 3 horas a temperatura ambiente antes de lavar los pocillos 5 veces en PBS 0,05% tween. 50 pl of 0,5 pg/ml immunoglobulinas anti-raton-HRP (DAKO) en PBS 10 %, se anadio FCS a cada pocillo y se dejo durante una hora a temperatura ambiente antes de realizar 8 lavados finales en PBS 0,05% tween. Se detecto el anticuerpo unido con una solucion de revelado ELISA y se registro A405 en un lector de inmunoplaca Tecan.

Para distinguir los anticuerpos desarrollados contra la porcion Fc de la protelna de fusion de los dirigidos contra IL- 17BR, se revistieron placas de control con hIgG y se anadieron los sobrenadantes siguiendo el protocolo descrito. Las muestras que dieron una alta A405 en placas revestidas con hIgG no fueron consideradas para posterior estudio.

Cribado por citometria de flujo de celulas COS7 transfectadas

Se clonaron por separado ADNc para genes IL-17Br murinos y humanos en el vector de expresion pME18S y se denominaron mIL17BR-pME18S e hIL17BR-pME18S respectivamente.

Se colocaron en placa 2 x 106 celulas COS7 en DMEM 10% FCS sobre un disco de 10 cm y se incubaron durante toda la noche a 37 °C. Al dla siguiente, se mezclaron 4 pg de mIL17BR-pME18S o hIL17BR-pME18S con 10 pl de lipofectamina en 500 pl de Optimem desprovisto de suero y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de anadirlo a celulas en placa. A continuacion se incubaron las celulas a 37 °C durante 6 horas antes de anadir medio nuevo. Se recogieron las celulas para analisis FACS 48 horas despues de la transfeccion.

Para el analisis FACS, se incubaron celulas transfectadas o no transfectadas con anticuerpos anti-IL17BR candidato a varias concentraciones en PBS 2 % FCS durante 30 minutos. A continuacion, se lavaron las celulas antes de la incubacion con FITC IgG anti-raton (BD Pharmingen) a 2 pg/ml en PBS 2% FCS durante 30 minutos mas. Finalmente, se lavaron las celulas dos veces en PBS 2 % FCS y se analizaron para determinar la expresion de IL- 17Br en una maquina FACScalibur de Becton Dickinson.

Reactividad cruzada de D9.2

Se revistieron las placas ELISA con miembros de la familiaIL-17R; IL-17RA, IL-17BR, IL-17RC, o IL-17RD, o IL- 13Ra, control (R&D Systems) a 2 pg/ml durante toda la noche a 4°C antes de lavado en PBS/0,05 % tween y bloqueo en PBS/10 % FCS a temperatura ambiente durante 4 horas. Se anadio D9.2 biotinilado a 1 pg/ml en PBS/10 % FCS y se incubaron durante toda la noche a 4°C. A continuacion, se lavaron las placas antes de anadir estreptavidina-HRP y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuacion, se lavaron las placas una ultima vez antes de anadir solucion de revelado ELISA y de medir la absorbancia a 405 nm.

Ensayo de union de anticuerpo monoclonal de raton a IL-17BR humana

Se revistio una placa de micropocillos Nunc Maxisorp con IL-25 humana (hIL17e) (R&D Sys) a 0,5 pg/ml y se incubo durante 1 hora y 30 minutos a temperatura ambiente. Se lavo la placa tres veces y despues se bloqueo con Tris / 1 % BSA durante 1 hora. Se diluyo hIL17Br/Fc quimerico (R&D Sys) a 100 ng/ml. Se diluyo cada anticuerpo monoclonal de raton purificado (x 100) en hIL17Br/Fc (100 ng/ml) hasta una concentracion final de 1 pg/ml en una solucion de hIL17Br/Fc a 100 ng/ml. Se incubo la mezcla [anticuerpo x hIL17Br/Fc] 1 hora y 30 minutos a temperatura ambiente. Se anadio la mezcla [anticuerpo x hIL17Br/Fc] a una placa revestida con hIL17e-y se incubo 1 hora y 30 minutos antes de lavarse tres veces. Se anadio conjugado (Fc) anti-hIgG-HRP (Serotec) a la placa y se incubo durante 45 minutos a temperatura ambientes antes de lavarlo tres veces y revelarlo con TMB. Se detuvo la reaccion con 1 M HCL. Se realizo la lectura de la densidad optica a 450 nm y se sustrajo la lectura del reactivo en blanco de todas las lecturas.

Ensayo de inhibicion de I L-17Br/I L-25

Se extirparon los ganglios linfaticos mesentericos de ratones BALB/c sin tratar previamente y se pasaron a traves de tamices celulares de 70 pm para obtener una suspension celular unica. Se lavaron las celulas en PBS 2 % FCS y a continuacion se empobrecieron de linfocitos T y linfocitos B. Esto se consiguio por incubacion de las celulas con anticuerpo anti-CD19 y anti-CD3 biotinilados a 5 pg/ml, sobre hielo, durante 30 minutos e incubandolo despues con perlas Dynabeads (Invitrogen) anti-biotina a una concentracion de 4 perlas por celula durante 20 minutos a 4 °C. A continuacion, se lavo la mezcla antes de pasar sobre un iman para separar los linfocitos T y B marcados de la fraccion de celulas que no eran linfocitos T ni linfocitos B (NBNT). Se sometio a ensayo la pureza de la fraccion NBNT por FACS, se mancho con B220, CD4 y CD8.

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A continuacion, se colocaron en placa celulas NBNT, a 3 x 105 celulas/pocillo, en placas de 96 pocillos de fondo redondo y se incubaron durante 72 horas en RPMI 10 % en solitario o RPMI 10 % FcS con 10 ng/ml de IL-25. Se anadieron a los pocillos anticuerpos bloqueantes IL-17BR candidato en diluciones en serie desde una concentracion maxima de 2 pg/ml y se incubaron durante 1,5 horas antes de anadir 10 ng/ml de IL-25 a los pocillos. A continuacion, se incubaron a 37 °C durante 72 horas antes de recoger los sobrenadantes y se sometieron a ensayo para determinar el contenido de protelna IL-13 por ELISA Quantikine (R&D Systems).

Para linfocitos CD4+ (T y/o NKT), se tomaron los bazos de ratones BALB/c de tipo silvestre sin tratar previamente y se reparo una suspension celular unica. Se llevo a cabo la lisis de globulos rojos antes de lavar las celulas en tampon MACS (Miltenyi Biotec). Se llevo a cabo el aislamiento de linfocitos CD4+ por seleccion positiva utilizando CD4 MicroBeads (Miltenyi Biotec) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuacion, se cultivaron linfocitos CD4+ a 1 x 106 celulas/ml en placas de 96 pocillos o bien en RPMI solo o bien en RPMI suplementado con 10 ng/ml de IL-25 con o sin D9.2 a 1 pg/ml. Se cultivaron las celulas durante 72 horas y, a continuacion, se tomaron los sobrenadantes para analisis de los niveles de protelna IL-13 por ELISA Quantikine (R&D Systems).

Bioensayos de linea celular de carcinoma renal

Se obtuvieron celulas de carcinoma renal TK-10 humanas del National Cancer Institute (NCI). Se obtuvieron celulas RENCA del Cell Biology Services, Centocor R&D. Se mantuvieron ambas llneas celulares en medio de crecimiento DMEM con 10 % FCS a 37 °C, 5% CO2 en una atmosfera humidificada. Se colocaron las celulas en placas tratadas con cultivo tisular de fondo plano de 96 pocillos a una densidad de 2,5 x 104 celulas/pocillo en un volumen total de 100 pl de medio de crecimiento completo. Despues de incubarlas durante toda la noche, se lavaron las celulas con 1 X PBS y despues se incubaron con 100 ng/ml de IL-25 y 10 ng/ml TNF-a en medio de suero reducido OptiMEM, o medio solamente de control, durante 24 horas. Se recogio el sobrenadante de celulas 20-24 horas despues de la estimulacion con IL-25 y se almaceno a -20°C para posterior analisis de la liberacion de KC/IL-8 soluble utilizando ELISA Quantikine de raton para KC o ELISA Quanitkine humana para IL-8 (R&D Systems).

Se sometieron a ensayo D9.2 o IgG1 como control para determinar la capacidad para evitar la liberacion de IL-8 mediada por IL-25 (KC). Para los experimentos de inhibicion se incubo previamente una cantidad constante de IL-25 (100 ng/ml) con diversas concentraciones de D9.2 o anticuerpo de control IgG1 de raton anti-c-myc (clon 9E10.2) durante 30-60 minutos a temperatura ambiente antes de la adicion de las correspondientes celulas. Se anadio TNF- a (10 ng/ml) a las celulas inmediatamente antes de la adicion de la protelna IL-25/D9.2. La determinacion de la liberacion de IL-8 (KC) se llevo a cabo 24 horas despues de la estimulacion, tal como se ha descrito antes.

Ratones

Se obtuvieron ratones BALB/c para su uso en el modelo experimental de asma alergica de Harlan Reino Unido, y ratones BALB/c para su uso en el modelo experimental de IBD, de Charles River. Se mantuvo a los ratones en las instalaciones del SABU/CBS/Ares-MRC o el National Heart and Lung Institute en entornos desprovistos de patogenos especlficos. Todos los experimentos con animales descritos en este informe fueron emprendidos con la aprobacion del Ministerio del Interior del Reino Unido.

Sensibilizacion y exposition a alergeno

Para el modelo experimental de asma alergica, se sensibilizaron ratones BALB/c, ratones de tipo silvestre o ratones con silenciamiento de IL-17BR sobre antecedente de ratones BALB/c por administration intraperitoneal de OVA (20 pg/inyeccion) formando complejo con alum o 1:1 PBS:alum (controles), en los dlas 0 y 12. La administracion por aerosol de PBS o 1% OVA se llevo a cabo los dlas 19, 20, 21 durante 20 minutos al dla. El dla 22 se sacrifico a los animales y se recogieron los tejidos.

Para el modelo experimental de IBD, se sensibilizaron ratones BALB/c por aplicacion cutanea de una solution al 4 % (p/v) de oxazolona (OXA) en 100 % de etanol o etanol solamente (controles), el dla 0. Se llevo a cabo la administracion intra-rectal de 3 % (p/v) de solucion de oxazolona en 50 % de etanol o 50 % de etanol solamente (controles) el dla 7. El dla 9, se sacrifico a los animales y se recogieron los tejidos.

Administracion de anticuerpos anti-IL-17BR

En el modelo experimental de asma alergica, para los ratones que recibieron el tratamiento de anticuerpo, se aplico una inyeccion intraperitoneal de 250 pg de d9.2 o anticuerpo de control IgG1 de raton anti-c-myc (clon 9E10.2) en PBS dos horas antes de cada nebulizacion. Cada uno de los ratones recibio tres dosis de anticuerpo.

En el modelo experimental de IBD, para los ratones que recibieron el tratamiento de anticuerpo, se aplico una inyeccion intraperitoneal de 500 pg de D9.2 o un anticuerpo de control IgG1 de raton anti-KLH en PBS 24 horas antes de la sensibilizacion (dla -1) y el desaflo (dla 6). As! pues, cada raton recibio dos dosis de anticuerpo.

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Evaluacion AHR

En relacion con la figura 8(e), se sensibilizo a los ratones por administration intraperitoneal (i.p.) de ovoalbumina con bajo contenido de endotoxina y se los desafio diariamente durante 6 dias por nebulizacion con PBS aerosolizado (control) u OVA.

Se administro a los ratones que recibieron tratamiento con anticuerpo D9.2 una inyeccion intraperitoneal de 250 mg de D9.2 o anticuerpo de control IgG1 de raton anti-c-myc (clon 9E10.2) en PBS 2 horas antes de cada una de las 3 ultimas nebulizaciones. 24 horas despues del desafio con aerosol final, se valoro AHR utilizando un pletismografo de cuerpo entero restringido (EMMS, Reino Unido). Se anestesio a los animales, se les realizo una traqueotomia y se los ventilo (ventilador MiniVent 845, EMMS, Reino Unido) a una velocidad de 175 respiraciones/min, con un volumen corriente de 200 ml/impulso. Despues de registrar la resistencia pulmonar basal estable durante 3 minutos, se administraron concentraciones crecientes de cloruro de acetil-p-metilcolina (metacolina) (Sigma-Aldrich) con un aerosol durante 10 segundos con un nebulizador ultrasonico y se registro la resistencia pulmonar durante un periodo de 3 minutos. Se utilizo el software eDaq para analizar la resistencia de las vias respiratorias, el cumplimiento y los parametros pulmonares normales.

Reestimulaciones del ganglio linfatico mediastinal

Se presionaron ganglios linfaticos mediastinales de ratones tratados con PBS o con OVA a traves de tamices celulares de 70 pm para obtener una suspension celular unica. Se hizo el recuento de las celulas y se colocaron en placa, a 3 x 105 celulas/pocillo, sobre placas de 96 pocillos de fondo redondo. Se cultivaron las celulas durante 72 horas en RPMI 10% FCS en solitario, o en presencia de 100 pg/ml OVA. A continuation, se recogieron los sobrenadantes y se sometieron a ensayo para determinar la concentration de IL-13 utilizando un kit de ELISA Quantikine (R&D Systems).

Evaluacion IBD

En lo que se refiere a la Figura 9, se sensibilizo a ratones por aplicacion cutanea de una solution de oxazolona en etanol el dia 0 y se desafiaron con una solucion de oxazolona en etanol el dia 7. Los controles recibieron solo etanol. Se administro a los ratones que habian recibido tratamiento con anticuerpo una inyeccion intraperitoneal de D9.2 o anticuerpo IgG1 de raton anti-KLH (control) el dia 1 y el dia 6. El dia 9, se sacrifico a los animales y se recogieron los tejidos. (En las Figuras 9(a) y 9(b), los dias 7, 8 y 9 se enumeran como los dias 0, 1 y 2 respectivamente.)

En los dias 7, 8 y 9, se peso a los ratones y se evaluo su aspecto general y su conducta para la asignacion de una puntuacion clinica de 0 a 3 para cada animal, sobre la base del metodo descrito en Wang et al., 2004, estableciendose la puntuacion clinica el dia 7 en 0 (Figura 9b). El dia 9, se sacrifico a los ratones y se recupero el colon de cada uno de los ratones; se inspecciono y se midio (Figura 9(c)).

Ejemplo 1: Generation de anticuerpos contra IL-17BR

Inicialmente, los autores de invention trataron de generar anticuerpos inmunizando ratones con peptidos sinteticos derivados de la secuencia de aminoacidos de IL-17BR humana. A pesar de la generacion de anticuerpos anti- peptido monoclonales, no pudieron producir anticuerpos que reconocieran la proteina IL-17BR humana madura. Trataron entonces de generar anticuerpos contra una proteina de fusion de la proteina IL-17BR humana inmunizando ratones de tipo silvestre. A pesar de las multiples inmunizaciones y las fusiones del hibridoma, no pudieron generar anticuerpos de alta afinidad contra IL-17BR.

Los ratones tambien expresan una forma de IL-17BR y los inventores lanzaron la hipotesis de que la incapacidad de desarrollar un anticuerpo util tal vez pudiera estar limitada por la falta de nuevos epitopos entre las moleculas IL- 17BR de raton y humanas. Generaron una linea de raton con deficit de IL-17BR que no pudiera expresar ya IL-17Br. Se disenaron ratones con deficit de IL-17BR para eliminar todas las formas de IL-17BR incluyendo variantes empalmadas alternativamente. El alto grado de conservation de la interfaz de union entre IL-17BR humana y de raton puede reducir la probabilidad de desarrollar anticuerpos bloqueadores en ratones de tipo silvestre, de manera que la elimination de IL-17BR endogena puede facilitar el desarrollo de anticuerpos contra el sitio de union de ligando del IL-17BR. Esta estrategia tambien aumento la posibilidad de desarrollar un anticuerpo para IL-17BR que pudiera bloquear la union de IL-25 tanto humano como de raton. Esto es util ya que es posible determinar por ensayo la eficacia de anticuerpos reactivos en reaccion cruzada en modelos de raton de la enfermedad.

Una vez generados y caracterizados los animales con deficit de IL-17BR, se llevo a cabo la inmunizacion con IL- 17BR-Proteina de fusion Fc. Esta estrategia demostro ser mas acertada que el uso de ratones de tipo silvestre, pero siguio requiriendo el cribado de un gran numero de hibridomas para identificar anticuerpos candidato.

Se rastreo un gran panel de anticuerpos, generados en ratones il17br-/- inmunizados contra IL-17BR-Proteina de fusion Fc de raton para determinar la union a IL-17BR humana y de raton por ELISA. Uno de los anticuerpos anti-IL- 17BR identificados (D9.2) se unio perfectamente a IL-17BR murina y humana segun ELISA (Figura 1) al igual que

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protelna IL-17BR tanto de raton sin tratar previamente como humana expresada en celulas COS transfectadas con ADNc de IL-1BR de raton o ADNc IL-17BR humana (Figura 2).

Ejemplo 2: Ensayo in vitro de D9.2

Se determino por ensayo la especificidad de D9.2 evaluando la interaction de D9.2 con otros miembros de la familia de receptores IL-17. D9.2 no reacciono en reaction cruzada con receptor IL-17A (IL-17RA), receptor IL-17C (IL- 17RC) o receptor IL-17D (IL-17RD) (Figura 3).

El cribado identifico varios anticuerpos que se unieron a IL-17BR, sin embargo, solamente D9.2 fue capaz de inhibir la interaccion entre IL-25 humano e IL-17Br humana (Figura 4).

Se sometio a ensayo D9.2 para determinar su capacidad de inhibir la actividad biologica de IL-25. IL-25 induce la liberation de citocinas de tipo 2, tales como IL-13, inicialmente, desde celulas que no son linfocitos B ni linfocitos T (NBNT) innatas (Fallon et al., 2006; Fort et al., 2001) y desde linfocitos T (Angkasekwinai et al., 2007). Por otra parte, tanto TK-10 humano (llnea celular de carcinoma renal) como las llneas celulares de carcinoma renal de raton (RENCA) secretan la quimiocina IL-8 (conocida como KC en el raton) como respuesta a la estimulacion con TNF-a y IL-25 (Sayers et al., 1990).

En un bioensayo in vitro, D9.2 inhibio la bioactividad desencadenada por la union de IL-17BR/IL-25, es decir, la production dependiente de IL-25 de IL-13 por celulas NBNT de raton primario (Figura 5a) y linfocitos CD4+ T/NKT (Figura 5b).

Por otra parte, D9.2 inhibio la produccion de KC desde celulas RENCA de raton estimuladas con IL-25 in vitro (Figura 6).

Cabe destacar que D9.2 tambien fue capaz de inhibir la actividad biologica de IL-25 humana. D9.2 inhibio la secretion de IL-8 dependiente de IL-25 a traves de celulas TK-19 humanas dependiendo de la dosis (Figura 7).

Se investigo mejor la combination de estas propiedades en sistemas in vivo para demostrar la utilidad en el tratamiento de asma. Otros experimentos adicionales demostraron la eficacia del tratamiento de IBD.

Ejemplo 3: Modelo experimental de asma alergica

En primer lugar se sensibilizo ratones BALB/c con antlgeno OVA, antes de desafiarlos con OVA aerosolizado. Los ratones BALB/c sensibilizados y desafiados desarrollaron un fenotipo de asma distintivo, caracterizado por un aumento de AHR tras la exposition al agente provocador metacolina, infiltration de eosinofilos de las vlas respiratorias, hiperplasia de celula caliciforme y secrecion de IgG en suero, en comparacion con los ratones BALB/c de control desafiados con PBS.

Empleando este modelo, se trataron los ratones BALB/c en la fase de desaflo o bien con IgG anti-c-myc de control isotipo (clon 9E10.2) o bien con clon D9.2 anti-IL-17BR. Cabe destacar que la administration de D9.2 redujo los niveles de IL-13 producidos tras el desaflo con antlgeno e IL-5 producida tras la reestimulacion con antlgeno a niveles similares a los encontrados en ausencia de desafio con antlgeno o en ratones con deficit de IL-17BR (Figuras 8a y b). Asimismo se redujo el numero de celulas productoras de IL-13 en los pulmones de los ratones desafiados con antlgeno a esos niveles (Figura 8c). De modo similar, se observo tambien el bloqueo de la expansion de linfocitos T gamma /delta relacionada con la enfermedad tras el tratamiento con D9.2 (Figura 8d). Jin et al. (2007, J Immunol.) han demostrado que la ausencia de linfocitos T gamma/delta conduce a una incapacidad para desarrollar AHR, lo que sugiere que el anticuerpo anti-IL-17BR puede inhibir dos rutas conocidas como esenciales para el desarrollo del asma - la produccion de IL-13 y la capacidad de respuesta de linfocito T gamma/delta. Asimismo, el tratamiento con D9.2 redujo la hiperreactividad de las vlas respiratorias, una caracterlstica clave del asma humano, en un modelo de asma de raton.

Ejemplo 4: Modelo experimental de enfermedad inflamatoria intestinal (IBD)

En primer lugar, se sensibilizo ratones BALB/c con hapteno oxazolona (OXA) antes de desafiarlos por inyeccion intra-rectal con la misma sustancia qulmica. Los ratones sensibilizados y desafiados desarrollaron un fenotipo IBD distintivo, caracterizado por perdida de peso, acortamiento del colon e inflamacion en el intestino grueso, acompanado de heces sanguinolentas (en comparacion con los controles con etanol solamente).

Empleando este modelo, se trataron los ratones BALB/c antes de la sensibilization y el desaflo con OXA o bien con IgG1 anti-KLH de control isotipo o bien con anti-IL_17BR (clon D9.2). La administracion de D9.2 redujo el Indice patologico de los animales, con el resultado de una menor tasa de mortalidad (Figura 9(a) y mejoro la puntuacion cllnica, es decir, redujo los signos cllnicos de IBD, manifestados como una perdida de peso, as! como la conducta y el aspecto de los animales Figura 9(b)). Asimismo, D9.2 protegio contra el acortamiento del colon como

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consecuencia de la inflamacion y la hemorragia (Figura 9(c)) y los colones de ratones tratados con D9.2 presentaron una menor inflamacion y hemorragia en comparacion con los ratones que recibieron anticuerpo de control anti-KLH.

Ejemplo 5: Clonacion y secuenciacion de D9.2

Para clonar la secuencia de inmnoglobulina de D9.2, se aislo ARN del clon celular D9.2 y se preparo ADNc por reaccion de transcription inversa.

Se amplifico el ADNc (IgH) de cadena pesada de inmunoglobulina por PCR utilizando un cebador de region VH 5' conservado, MHV2 (SEQ ID NO: 11) en combination con un cebador de region constante IgG1 MHCG1 (SEQ ID NO:12).

De manera similar, se amplifico la cadena ligera de inmunoglobulina (IgK) utilizando cebadores de region IgK 5' conservados MKV3 (SEQ ID NO: 13) en combinacion con el cebador de region constante kappa MKC (SEQ ID NO: 14).

Se utilizo la polimerasa termoestable Phusion (NEB F-531L) para todas las reacciones PCR.

Se ligaron directamente los productos de amplification D9.2 de VH2 + MHCG1 en el vector pCRII®Blunt-TOPO® utilizando un kit TOPO-blunt cloning® (Cat 45-0245), al igual que los productos de amplificacion de la reaccion de amplificacion de cadena ligera. Se clonaron las construcciones de bacteria TOP10 de E. coli transformadas con el vector pCRII-blunt ligado sobre placas de agar LB-ampicilina-XGal, recogiendo colonias blancas en una rejilla de agar y hacia la mezcla de cribado de PCR. Se amplificaron por PCR los insertos de plasmido clonados. Se sometieron a electroforesis en gel los productos de amplificacion y se identificaron los productos predichos. Se procesaron durante toda la noche cultivos (5 ml) de cada clon dando lugar al producto de amplificacion por PCR del tamano correcto utilizando el protocolo del kit QIAprep Spin Miniprep Kit Protocol (cat 27106), para producir mini- preparaciones de plasmido de ADN. Se secuencio cada plasmido seleccionado en ambas direcciones utilizando cebadores directos e inversos M13.

Se repitio el ciclo completo de RT-PCR, clonacion y analisis de secuencia de ADN para obtener dos grupos completamente independientes de information de secuencia para cada cadena de inmunoglobulina.

La secuencia de nucleotidos deducida completa de genes VH y Vkappa se muestra como SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3 respectivamente. Estas secuencias incluyen las secuencias llder al comienzo de cada segmento de gen variable que codifica una secuencia de senal que se utiliza para transportar las cadenas de anticuerpo recien sintetizadas en el retlculo endoplasmico; no estan presentes en las cadenas pesada y ligera finales.

Inmunologia y reactivos biologicos moleculares

Articulo

Proveedor R.U. Numero de catalogo Numero de lote

Celulas E. coli 103 competentes

NEB C3019H

Agarosa (UltraPure™)

Invitrogen 15510-027 3048948

Albumina bovina (BSA)

Sigma A7030 086K1230

Ampicillina

Sigma A-9518 63H0992

IL-25 (murina)

R&D Systems

IL-25 (humana)

R&D Systems

Oligonucleotidos

Sigma n.a.

Oxazolona

Sigma E0753

Comprimidos PBS

Sigma P4417 017K8212

Kit Miniprep QIAprep Spin

Qiagen 27106 127150290

Kit ELISA IL-13 Quantikine Murino

R&D Systems M1300CB

Kit Quick Ligation

NEB M2200s

Kit Mutagenesis dirigida sitio II XL QuikChange®

Stratagene 200522-5 0870486

Perlas dynabeads marcadas con estreptavidina

Invitrogen

Mancha de gel de ADN SYBR Safe

Invitrogen 33102 55081A

kit TOPO-blunt cloning®

Invitrogen 45-0245 1311906

X-Gal

Promega V394A 20965701

rhIL-17RD (Sef)

R&D Systems 2275-IL NBR015031

rmIL-17RD.(Sef)

R&D Systems 2276-ML NAF014111

rhIL-17RC

R&D Systems 2269-IL NCJ0208081

rmIL-17RC

R&D Systems 2270-ML

rhIL-17BR-Fc

R&D Systems 1207-BR

rmIL-17BR-Fc

R&D Systems 1040-BR

rhIL-17RA-Fc

R&D Systems 177-IR

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R&D Systems 4481-MR

Kit ELISA CXCL1/KC raton Quantikine

R&D Systems MKC00B

Kit ELISA CXCL8/IL-8 Humano Quantikine

R&D Systems D8000C

Abreviaturas:

AHR

°C

bp

CD

CDR

DMEM

DNA

ELISA

FACS

FCS

g

h

HRP

IBD

Ig

i.p.

KLH

mAb

min

NBNT

nm

OD

OVA

OXA

PBS

PCR

RENCA

RH

RK

TMB

UC

VH

VL

VK

Secuencias

Hiperreactividad de las vlas respiratorias

Centlgrado

Pares de bases

Enfermedad de Crohn

Region determinante de complementariedad

Medio de Eagle modificado con Dulbecco

Acido desoxirribonucleico

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

Separacion de celulas activadas por fluorescencia

Suero fetal bovino

Gramos

Hora

Peroxidasa de rabano rusticano Enfermedad inflamatoria intestinal Inmunoglobulina Intraperitoneal

Hemocianina de lapa californiana Anticuerpo monoclonal Minuto

Celulas no linfocitos B/ No linfocitos aisladas de ganglio linfatico mesenterico de raton

Nanometro

Densidad optica

Ovoalbumina

Oxazolona

Solucion salina tamponada con fosfato Reaccion en cadena de la polimerasa Carcinoma renal Cadena pesada recombinante Cadena kappa recombinante 3,3',5,5' tetrametilbenzidina Colitis ulcerosa

Region variable de cadena pesada de inmunoglobulina Region variable de cadena ligera de inmunoglobulina Region variable de cadena ligera kappa de inmunoglobulina

SEQ ID NO: 1 secuencia de nucleotidos que codifica VH D9.2

Cttcttcttagcaacacctac:atgtgtccactcecaggtccaattgcagcagectggggetgagetggt gaggcctggggcttcagtgaagctgtcctgcaagacttctggcLauacgtLcatcagt‘^dttggatgaa ctgggt-aagcaggggcctgagcaaggccttgagtggattggaagaattgatccttacgatagtgaaat tcagtacaatcaaaagttcaaggacaaggccatattgactgtagacaaatcctcoagcgcagcctaeat gcaactcatcagcctgacatctgaggactctgcggtctattactgtgcasgstcggggggtttcgactg gtttgcgtaatggggccaagggactctggtcsctgtctctgcagccaaaacgacacceccatcagtcta tccactgaagggcgaat Lccagcacactggcggccgttac

SEQ ID NO: 2 secuencia de aminoacidos VH D9.2

F FLAT ?T C VH S GVQLQQ P GAELVR F GASVKLSC KTSGYT FIS ¥WMNWVKQGGP EQGLEWIG RID PY DS E IQYNQKFKDKAILTVDKSS SAAYMQLIS LTSED5AVYYCARSGGFDWFAYWGQGTLVTVS

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SEQ ID NO: 3 secuencia de nucleotidos que codifica VL D9.2

atgagtgtgctcaotcaggtCCtggcgttgctgctgctgtggcttacagatgccagatgtgacatccag atgac t cagtct ccagcfctc ect a tc tgtat ctgt gg gagaaactgt cac ca tea ca tgtcgagcaagt gagaatattaacagtaatt’cagcatggtatcagcagaaaaaaggaaaatctcctcagctcctggtetat gatgtascaaacttagcagatggtgtgccatcaaggttcagtggcagtggatcaggcacacaatattcc ctcaagatcaacagcctgcagtetgaagHttttgggagttattactgtcaacatttttggcgtcctccg tacacgttcggaggggggaccaatctggaaataaaa

SEQ ID NO: 4 secuencia de aminoacidos VL D9.2

MSVLTQVLALL L LWLT DARC DIQMTQ 5 PA 3 L S'VSVGET VTITCPA 5 EH1MS NLAWYQQKRGKS PQLLVY D VTNLADGVPSR FSG3 GS GTQYS LKINS LQS E D FG S YYCQHFWR P PYT FGGGTNLEIK

SEQ ID NO: 5 secuencia de aminoacidos CDR1 VH D9.2 SYWMN

SEQ ID NO: 6 secuencia de aminoacidos CDR2 VH D9.2 RIDPYDSEIQYNQKFKD

SEQ ID NO: 7 secuencia de aminoacidos CDR3 VH D9.2 SGGFDWFAY

SEQ ID NO: 8 secuencia de aminoacidos CDR1 VL D9.2 RASENINSNLA

SEQ ID NO: 9 secuencia de aminoacidos CDR2 VL D9.2 DVTNLAD

SEQ ID NO: 10 secuencia de aminoacidos CDR3 VL D9.2 QHFWRPPYT

SEQ ID NO: 11 secuencia de cebador MHV2 atgggatggagctrtatcatsytctt (r=a/g, s=c/g, y=t/c)

SEQ ID NO: 12 secuencia de cebador MHCG1

cagtggatagacagatggggg

SEQ ID NO: 13 secuencia de cebador MKV3

atgagtgtgctcactcaggtcctggsgttg

SEQ ID NO: 14 secuencia de cebador MKC

actggatggtgggaagatgg

Referencias

1. Angkasekwinai, P., et al., J Exp Med 204, 1509-1517 (2007)

2. Ballantyne, S. J., et al., J Allergy Clin Immunol (2007)

3. Fallon, P. G., et al., J Exp Med 203, 1105-1116 (2006).

4. Fort, M. M., et al., Immunity 15, 985-995 (2001).

5. Lajoie-Kadoch, S., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 290, L1238-46.

6. Lee, J., et al. , J Biol Chem 276, 1660-1664 (2001).

7. Moseley, T. A., et al., Cytokine Growth Factor Rev 14, 155-174 (2003).

8. Owyang, A. M., et al., (2006) J Exp Med 203, 843-849.

9. Pan, G., et al., J Immunol 167, 6559-6567 (2001).

10. Shi, Y., et al., J Biol Chem 275, 19167-19176 (2000).

11. Tian, E., et al., Oncogene 19, 2098-2109 (2000).

12. Wang, Y. H., et al., J Exp Med 204, 1837-1847 (2007).

13. Rickel E. A., et al., J Immunol 181, 4299-4310 (2008).

14. Sayers T. J., et al., Cancer Res 50,. 5414-5420 (1990).

15. Jin N., et al., J Immunol 179, 2961-2968 (2007).

16. Heller, F., et al., Immunity 17:629-638 (2002).

17. Fichtner-Feigl, S., et al., Mucosal Immunology 1 Suppl 1:S24-27 (2008).

18. Buning, C., et al. Eur J Immunogenet 30:329-333 (2003).

19. Hanauer, S.B., Alimentary pharmacology & therapeutics 27 Suppl 1:15-21 (2008).

20. Wang, X., et al., Chinese Journal of Digestive Diseases 5, 165-168 (2004)

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   REIVINDICACIONES

   1. Una molecula de anticuerpo que se une especlficamente al IL-17BR murino y/o humano y que comprende:

   un dominio VH que comprende una CDR1 que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 5, una CDR2 que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 6 y una CDR3 que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:7; y,

   un domino VL que comprende una CDR1 que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 8, una CDR2 que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 9 y una CDR3 que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 10.
2. 2. La molecula de anticuerpo de la reivindicacion 1, en la que el dominio VH comprende:

   (a) una region marco humana; o

   (b) SEQ ID NO: 2
3. 3. La molecula de anticuerpo de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el anticuerpo es reactivo en reaccion cruzada tanto con IL-17Br humano como con IL-17BR murino.
4. 4. La molecula de anticuerpo de la reivindicacion 4, en donde el dominio VL comprende:

   (a) una region marco humana; o

   (b) SEQ ID NO: 4.
5. 5. La molecula de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es un fragmento de anticuerpo Fab, F(ab')2, scFv.
6. 6. La molecula de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende una region constante de anticuerpo.
7. 7. La molecula de anticuerpo de la reivindicacion 6:

   (a) en la que la region constante es una region constante de IgG1 o IgG4; o

   (b) que comprende un anticuerpo completo.
8. 8. Un acido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica la molecula de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
9. 9. Un metodo para producir una molecula de anticuerpo, comprendiendo el metodo el cultivo de celulas huesped que llevan un vector de expresion para la expresion de la molecula de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, comprendiendo el vector de expresion el acido nucleico de la reivindicacion 8, unido operativamente a un promotor, en condiciones para la produccion de dicha molecula de anticuerpo,

   en donde el metodo comprende ademas opcionalmente el aislamiento de dicha molecula de anticuerpo

   en donde el metodo comprende ademas opcionalmente la formulacion de la molecula de anticuerpo en una

   composicion que incluye al menos un componente adicional.
10. 10. Una composicion que comprende la molecula de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y un vehlculo farmaceuticamente aceptable, en donde la composicion se presenta opcionalmente en forma de un polvo liofilizado.
11. 11. Una molecula de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o la composicion de la reivindicacion 10, para su uso en el tratamiento o la prevencion de:

    (a) asma;

    (b) enfermedad inflamatoria intestinal

    (c) enfermedad inflamatoria intestinal que es colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn.