ES2325034T3 - Nueva epo carbamilada y metodo para su produccion. - Google Patents

Abstract

Un método para producir una proteína eritropoyetina carbamilada que tiene menos de aproximadamente 40% de proteína agregada y menos de aproximadamente 40% en peso de proteína hipocarbamilada e hipercarbamilada, medida por espectrometría de masa ESI, comprendiendo dicho método poner en contacto una cantidad de eritropoyetina con una cantidad de cianato a una temperatura, un pH y durante un periodo de tiempo suficiente para que los grupos amino en las lisinas y en los aminoácidos del extremo N-terminal de la eritropoyetina, se carbamilen al menos en aproximadamente un 90%.

Description

Nueva EPO carbamilada y método para su producción.

Introducción

La presente invención se dirige a un método para producir un compuesto de EPO carbamilada. El compuesto, eritropoyetina carbamilada (CEPO), que se caracteriza por estar carbamilado en todas o en la mayoría de las aminas primarias de las lisinas y en el aminoácido N-terminal de la molécula, y además este compuesto posee un bajo nivel de carbamilación de las aminas primarias de otros aminoácidos en la molécula. Adicionalmente, este compuesto está exento de proteínas agregadas y es adecuado para el uso en composiciones farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades, por ejemplo, en el sistema nervioso central o periférico y en otros tejidos que expresan el receptor central de EPO. Otra ventaja sorprendente del presente método de producción, es que el método proporciona un producto que contiene menos proteína agregada y menos polímeros que los productos logrados con otros métodos de carbamilación conocidos, descritos para la eritropoyetina.

Antecedentes de la invención

La alteración de la actividad biológica hematopoyética de la EPO carbamilada ha sido mostrada por Satake, R. y col. (1990) Biochimica et Biophysica Acta; 1038: 125-129 y Mun, K-C. y Golper, T.A. (2000) Blood Purif.; 18: 13-17. Brines y col. 2003, en el documento de solicitud de patente de EE.UU. 20030072737, mostraban que la pérdida de la actividad hematopoyética no interfería con las propiedades protectoras del tejido de la EPO.

La carbamilación de proteínas es ampliamente conocida como un efecto colateral del uso de urea en la purificación de proteínas y como resultado de altos niveles de urea en el suero. Esto es provocado por la descomposición espontánea de la urea en cianato. El cianato es responsable de la carbamilación de las aminas primarias de la proteína, en consecuencia, el extremo N-terminal y las lisinas de una proteína son susceptibles de carbamilación (Figura 1). Adicionalmente, otros residuos de aminoácidos potenciales susceptibles a la carbamilación son arginina, cisteína, tirosina, ácido aspártico, ácido glutámico e histidina; sin embargo la reacción es dependiente del pH y no procede igual de fácil que como con el extremo N-terminal y el residuo de lisina.

Las investigaciones para revelar si la carbamilación de proteínas podía mejorar o impedir la actividad biológica de las proteínas, han sido realizadas por Hörkkö, S. y col. (1992) Kidney International.; 41: 1175-1181, Plapp, B.V. y col. (1971) Jour. Biol. Chem.; 246(4): 939-945, Satake, R. y col. (1990) Biochimica et Biophysica Acta; 1038: 125-129 y Mun, K-C. y Golper, T.A. (2000) Blood Purif.; 18: 13-17. Investigaron el efecto biológico de la carbamilación de proteínas, empleando KCNO como fuente de cianato. Todos ellos observaron una disminución o un cambio en la actividad biológica, como resultado de la mayor carbamilación. La determinación del grado de carbamilación se basó en dos métodos analíticos:

1.

Medición de la disminución de grupos amino libres, usando un ensayo con ácido trinitrobenzosulfónico (TNBS) y

2.

Análisis de los aminoácidos determinando las lisinas convertidas en residuos de homocitrulina.

Hörkkö, S. y col. (1992), carbamilaron una lipoproteína de baja densidad durante un máximo de 6 horas, a 37º con KCNO 2 M, pero no obtuvieron una proteína completamente carbamilada, conforme a la medición con el ensayo de TNBS.

Plapp, B.V. y col. (1971), investigaron el efecto del tiempo y obtuvieron una desoxirribonucleasa A pancreática bovina, casi completamente carbamilada, después de un tratamiento de 24 horas con KCNO 1 M a 37ºC.

Mun, K-C. y Golper, T.A. (2000) investigaron el efecto del tiempo con un máximo de 6 horas de tiempo de reacción, usando KCNO 2 M. También investigaron el efecto del aumento de la concentración de KCNO, en un periodo de tiempo de 6 horas, en donde todas las reacciones estaban a 37ºC. Mun, K-C. y Golper, T.A. (2000) no pudieron verificar, a partir del diseño experimental, el grado exacto de carbamilación (véase la referencia en la página 16, líneas 33-35).

Nosotros hemos observado ahora en la presente invención, que la carbamilación de EPO producía polímeros y agregados que, por tanto, la volvían poco adecuada como agente biofarmacéutico. Además, hallamos que la formación de estos polímeros y agregados era dependiente de las condiciones del procedimiento para la carbamilación. Por lo tanto, era necesario el desarrollo de un procedimiento con parámetros óptimos en relación con el pH, el tiempo, la concentración de cianato, la temperatura, la concentración de proteína y, principalmente, el grado de polimerización de la proteína. La presente invención comprende un procedimiento óptimo para la carbamilación, que logra un producto con un bajo grado de polimerización y agregación, y además de manera sorprendente, hallamos que se obtenía una EPO completamente carbamilada que se dirigía al extremo N-terminal y a todos los residuos de lisina (esto último se produce en un intervalo de pH específico). Se realizó una etapa posterior del método de la invención, a fin de eliminar los polímeros y los agregados formados.

Se ha descrito previamente que el grado de carbamilación depende de la concentración de cianato y del tiempo. Sin embargo, no se ha descrito la manera de obtener un procedimiento de carbamilación que se pueda adaptar a escala, para la producción de un agente biofarmacéutico.

La presencia de agregados mediante la producción subóptima, se ha relacionado con la introducción de anticuerpos. Y la presencia de agregados logra, por tanto, un agente biofarmacéutico no adecuado para el uso en humanos.

El procedimiento de carbamilación y purificación descrito en la presente invención, conduce a una proteína
caracterizada por estar completamente carbamilada, con la menor formación posible de polímeros o agregados y con la mínima pérdida de producto final. Por ello, se logra que el procedimiento sea una etapa económicamente
viable.

Con el procesamiento adicional de la proteína carbamilada, se logra un producto útil como agente biofarmacéutico que sólo tiene un riesgo mínimo de generación de respuesta inmunológica a la proteína, debido a los agregados y los polímeros.

Los métodos analíticos para determinar la carbamilación completa son, además del análisis de aminoácidos; TNBS para grupos amino primarios libres, y finalmente, una caracterización del producto y del producto digerido mediante MALDI-TOF.

El compuesto resultante que es eritropoyetina completamente carbamilada en los grupos amino libres en el extremo N-terminal y en las lisinas de la molécula, y que además, no está agregada ni polimerizada hasta un contenido de más del 2,5%, y que contiene un mínimo de eritropoyetina hipocarbamilada o hipercarbamilada, se puede emplear para la producción de composiciones farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades sensibles a los efectos neuroprotectores de la eritropoyetina natural.

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Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento de carbamilación de proteínas que se puede adaptar a escala, para la producción de agentes biofarmacéuticos.

El procedimiento de carbamilación y purificación descrito en la presente solicitud conduce a una proteína caracterizada por estar completamente carbamilada, con la menor formación posible de polímeros o agregados, y con la mínima pérdida de producto final.

El procedimiento de carbamilación se ha optimizado a fin de obtener una proteína carbamilada, con la menor cantidad posible de polímero y agregados, lo que lo convierte en un procedimiento económicamente viable. El producto final contiene adicionalmente cantidades limitadas de isoformas de eritropoyetina hipercarbamilada y/o hipocarbamilada (menos de 9 o más de 9 carbamilaciones por molécula). La EPO hipocarbamilada podría contener menos de 9 residuos de carbamilo, es decir, no están carbamiladas las ocho lisinas y el extremo N-terminal. La EPO hipocarbamilada puede tener sólo 5 residuos de carbamilo e incluso no poseer actividad eritropoyética clásica, por lo que es adecuada para el uso en la presente invención. La EPO hipercarbamilada tiene más de 9 residuos de carbamilo y tendrá carbamilaciones en aminoácidos diferentes de los ocho residuos de lisina y el extremo N-terminal. La CEPO puede tener hasta 15 residuos de carbamilo y aún poseer el efecto deseado, es decir, no presentar actividad eritropoyética clásica. Al menos aproximadamente 90%, y más probablemente 95% de las isoformas de CEPO están carbamiladas sólo en los 8 residuos de lisina y en el extremo N-terminal.

El procesamiento adicional de la proteína carbamilada elimina el producto agregado y polimerizado hasta un nivel máximo de 3% o 2,5%, y en consecuencia, se logra un producto útil como agente biofarmacéutico, que tiene sólo un riesgo mínimo de generación de respuesta inmunológica a la proteína, debido a los agregados y los
polímeros.

Los métodos analíticos para determinar la carbamilación son, además del análisis de aminoácidos; TNBS para los grupos amino primario libres y una caracterización del producto y del producto digerido mediante MALDI-TOF y LC-MS/MS.

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Descripción detallada de la invención Método de preparación

El método de carbamilación de las proteínas consiste en seis etapas:

1.

Concentración por ultrafiltración

2.

Modificación por carbamilación

3.

Desalación por filtración en gel

4.

Purificación por intercambio aniónico

5.

Concentración e intercambio de tampón mediante ultrafiltración y diafiltración

6.

Filtración a través de 0,22 \mum

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El material de partida del presente procedimiento de carbamilación es EPO humana purificada de modo conveniente, aunque puede ser cualquier forma de EPO de tipo animal o humano; ejemplos no limitantes son EPO humana sintética, recombinante o EPO humana modificada biológica o químicamente, tal como la asialo-EPO, mutantes de EPO humana, es decir, una molécula en la que se introducen cambios en la secuencia de aminoácidos, fragmentos de EPO, péptidos de EPO, otras proteínas o una mezcla de proteínas, si se desea carbamilar varias proteínas.

La primera etapa del procedimiento implica un ajuste de la concentración de proteína por ultrafiltración, en donde la concentración de proteína se ajusta con el fin de mantener un bajo volumen del procedimiento. La concentración de proteína de 0,05-10 mg/ml o 0,05-8 mg/ml es una realización preferida. Una realización más preferida es
0,05-7 mg/ml y la más preferida es 2-5 mg/ml. Si la concentración se incrementa, se forman más agregados. La ultrafiltración se realiza mediante un BioMax (Millipore) con un MWCO (umbral de peso molecular) de 5 kDa. Se pueden aplicar otros filtros. Además, la solubilidad de la proteína se puede ajustar agregando estabilizadores.

Después de completarse la etapa de la concentración, la solución de proteína se mezcla con K-borato tetrahidratado, K-cianato con un pH de 7-11 o un pH de 7-10. En una realización preferida, el pH es de 8-10, y más preferentemente de 9,0. Los intervalos de temperatura oscilan entre 0º-60ºC o 0º-50ºC o 0º-40ºC o 0º-< 37ºC, si bien, en una realización preferida el intervalo de temperatura es de 30-34ºC, preferentemente 32ºC, para un margen de tiempo de 10 minutos-30 días o 30 minutos-30 días o 1 hora-30 días o 1 hora-20 días o 1 hora-10 días o 1 hora-5 días o 1 hora-2 días o 1 hora-26 horas o 18-26 horas o preferentemente, 22 horas-26 horas, y más preferentemente 24 horas. Sin embargo, estos intervalos preferidos podrían cambiarse si se cambian otros parámetros del procedimiento, es decir, la temperatura, la concentración de cianato y la concentración de proteína.

Si la temperatura es inferior a los límites, el rendimiento será bajo, ya que la carbamilación será lenta e ineficaz. Si se exceden los límites de temperatura, el rendimiento será bajo debido a la mayor agregación. Otro parámetro crucial es el tiempo, ya que la carbamilación no se completará si se disminuye el tiempo; o si se aumenta el tiempo, se observará la formación de agregados y se obtendrá un menor rendimiento.

Por lo tanto, se presenta un procedimiento con parámetros coherentes; es decir, si se disminuye la temperatura, la menor reacción de carbamilación podrá compensarse aumentando la concentración de cianato y/o el tiempo de la reacción. Adicionalmente, si se disminuye el tiempo de la reacción, la menor reacción de carbamilación se podrá compensar aumentando la temperatura y/o la concentración de cianato. Finalmente, en un procedimiento con menor concentración de cianato, la reacción de carbamilación disminuida se puede compensar incrementando el tiempo de reacción y/o la temperatura.

Por lo tanto, en conclusión, un cambio significativo de un parámetro crucial (tiempo, temperatura, concentración de cianato y concentración de proteína) implicará un cambio en uno o en varios de los otros parámetros cruciales, a fin de obtener una molécula completamente carbamilada, con baja formación de agregados y polímeros.

La concentración de tampón borato puede ser de 0,05-2 M, aunque en una realización preferida, es de 0,1-1 M y más preferentemente de 0,5 M, ya que el cianato se hidroliza de forma inherente y se polimeriza con la absorción de protones y la falta de una capacidad tamponadora produce una desviación del pH de la solución.

Además, se prefiere una concentración de cianato en el intervalo de 0,05-10 M o 0,05-8 M o 0,05-6 M o 0,05-4 M o 0,05-2 M, siendo una realización preferida 0,05-1 M y lo más preferible de 0,5 M.

Es necesaria una concentración de tampón borato de 0,5 M para controlar la desviación del pH causada por la absorción de protones, de la concentración de cianato de 0,5 M empleada. Se puede emplear un procedimiento que utilice otras sales de cianato y borato. Adicionalmente, se pueden emplear otros tampones de la reacción, diferentes del borato, por ejemplo, un tampón de carbonato o un tampón de fosfato.

La desalación de la mezcla de reacción de la proteína y cianato se realiza mediante una filtración en gel cromatográfica. Se emplea la matriz G-25 Fine (Amersham Biosciences). El tiempo de retención antes de la aplicación de la muestra en la columna, se controla y no debe exceder las 2 horas, de lo contrario, se producirá una carbamilación adicional y una formación de polímero. La desalación y el cambio de tampón de las proteínas se pueden realizar mediante diálisis, dia-ultrafiltración o mediante filtración en gel cromatográfica. Se pueden aplicar otras matrices de filtración en gel, tales como matrices de polisacáridos reticulados o polisacáridos mixtos reticulados, poliacrilamida, poliestireno o matrices de naturaleza cerámica. Además, en esta etapa puede variarse la altura de la columna.

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La etapa de carbamilación se puede ajustar para obtener un producto con menos de 40% de agregados y polímeros o menos de 30% o menos de 25% o menos de 20% o menos de 15% o menos de 12,5% o menos de 10% o menos de 8% o menos de 7%.

La eliminación de los agregados y los polímeros se realiza mediante una etapa de purificación empleando intercambio aniónico. Se observa que se puede separar EPO carbamilada de los restos del material de partida y de los agregados y polímeros. El tampón del proceso A es: 0,3% de Tris (25 mM), 0,3% (50 mM) de NaCl, pH 8,5 \pm 0,2, y el tampón de elución B: 0,3% de Tris (25 mM), 5,8% (1 M) de NaCl, pH 8,5 \pm 0,2. El gradiente se lleva a cabo con 0-30% en 20 volúmenes de columna, para obtener la separación deseada. Con la etapa de purificación se puede lograr un producto con menos de 3% de agregados y polímeros o menos de 2,5% o menos de 2% o menos de 1,5% o menos de 1% o menos de aproximadamente 0,5%.

La elución, la recogida y el agrupamiento del pico de EPO carbamilada influyen en la distribución de la heterogeneidad, es decir, las isoformas de la proteína eluida. En otras palabras, las cantidades de CEPO hipercarbamilada e hipocarbamilada variarán según el procedimiento de recogida y de agrupamiento. Un agrupamiento limitado conducirá a la disminución del contenido de eritropoyetina hipercarbamilada y/o hipocarbamilada. El aumento de la longitud del gradiente permitirá la selección de un producto más definido, por ejemplo, descartando algunas especies.

Una composición de EPO carbamilada con menos de aproximadamente 40% de isoformas hipercarbamiladas e hipocarbamiladas en peso, medida por espectrometría de masa ESI, es un resultado de la invención. Un aspecto más preferido es una CEPO con menos de aproximadamente 35% de isoformas hipocarbamiladas e hipercarbamiladas en peso, medida por espectrometría de masa ESI. Un aspecto aún más preferido, es una CEPO con menos de aproximadamente 30% de isoformas hipocarbamiladas e hipercarbamiladas en peso, medida por espectrometría de masa ESI. Un aspecto aún más preferido, es una CEPO con menos de aproximadamente 25% de isoformas hipocarbamiladas e hipercarbamiladas en peso, medida por espectrometría de masa ESI. Un aspecto incluso más preferido, es una CEPO con menos de aproximadamente 20% de isoformas hipocarbamiladas e hipercarbamiladas en peso, medida por espectrometría de masa ESI. Un aspecto aún más preferido, es una CEPO con menos de aproximadamente 15% de isoformas hipocarbamiladas e hipercarbamiladas en peso, medida por espectrometría de masa ESI. Un aspecto aún más preferido, es una CEPO con menos de aproximadamente 10% de isoformas hipocarbamiladas e hipercarbamiladas en peso, medida por espectrometría de masa ESI. Un aspecto aún más preferido, es una CEPO con menos de aproximadamente 5% de isoformas hipocarbamiladas e hipercarbamiladas en peso, medida por espectrometría de masa ESI. Un aspecto aún más preferido, es una CEPO con menos de aproximadamente 2% de isoformas hipocarbamiladas e hipercarbamiladas en peso, medida por espectrometría de masa ESI. El aspecto más preferido, es una CEPO con menos de aproximadamente 1% de isoformas hipocarbamiladas e hipercarbamiladas en peso, medida por espectrometría de masa ESI.

Además de influir en el contenido general de las isoformas, la recogida y el agrupamiento del pico de EPO carbamilada, influyen sobre la distribución de la CEPO hipercarbamilada. Se prefiere que la cantidad de isoformas de CEPO hipercarbamilada sea inferior a aproximadamente 35% en peso, medida por espectrometría de masa ESI. Se prefiere aún más que la cantidad de CEPO hipercarbamilada sea menos de aproximadamente 30% en peso, medida por espectrometría de masa ESI, e incluso más preferentemente, se prefiere que la cantidad de CEPO hipercarbamilada sea menor de aproximadamente 25% en peso, y aún más preferentemente, menor de aproximadamente 20%, y aún más preferentemente menor de aproximadamente 15%. Con mayor preferencia, la cantidad de EPO hipercarbamilada no debería ser superior a aproximadamente 10%, aproximadamente 5% o aproximadamente 1% en peso de la CEPO total.

Se pueden emplear otros tampones del proceso y de la elución, igual que se pueden emplear otras matrices de intercambio aniónico y filtros cargados. Ejemplos no limitantes de matrices son polisacáridos reticulados o polisacáridos mixtos reticulados, poliacrilamida, poliestireno o matrices de naturaleza cerámica.

Además, para la purificación se puede utilizar incluso cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de fase inversa, cromatografía de afinidad y cromatografía de exclusión por tamaño.

En la siguiente etapa para el ajuste de la concentración y el tampón, se utiliza una unidad de filtración de flujo tangencial de dia/ultrafiltración. La EPO carbamilada se ajusta a una concentración de > 0,5 mg/ml y el tampón se cambia a un tampón citrato 20 mM, NaCl 100 mM. El cambio de concentración y de tampón se realiza con un BioMax (Millipore) con un valor discriminatorio del peso molecular (MWCO) de 5 kDa. Se pueden aplicar otros filtros.

Finalmente, una sustancia purificada del fármaco biofarmacéutico se filtra a través de 0,22 \mum, usando un instrumento Millipak (Millipore) para reducir los gérmenes. Se puede emplear cualquier filtro de 0,22 \mum.

Empleando el método se obtiene una EPO completamente carbamilada con menos de 3%, o preferentemente menos de 2,5% de agregados, tal y como se mide con SEC-HPLC. La carbamilación completa de los 8 residuos de lisina se verificó usando análisis de aminoácidos, por medio de la determinación de las lisinas convertidas en homocitrulina. Adicionalmente, se siguió la carbamilación mediante un ensayo de TNBS para la determinación de aminas primarias, mostrando de este modo la carbamilación completa de las lisinas y el extremo N-terminal.

Además, una caracterización completa usando MALDI-TOF determinó el cambio en la masa intacta, tanto de la proteína tratada con PNGasa, como de la proteína con los N-glicanos. Además de MALDI-TOF, el análisis digital de masa peptídica/el análisis LC-MS/MS, mostraron que las ocho lisinas y el extremo N-terminal estaban carbamilados. No se detectaron otros aminoácidos carbamilados, ni modificaciones de los glicanos. Aún más, se obtuvo un menor contenido de formas hipercarbamilada e hipocarbamiladas de EPO, en el producto final.

Un aspecto, tal y como se describe en esta memoria, es la composición obtenida después de la etapa de carbamilación, pero antes de la purificación mediante intercambio aniónico, que comprende EPO carbamilada, con menos de aproximadamente 40% en peso de agregados y polímeros, o menos de aproximadamente 30%, o menos de aproximadamente 25%, o menos de aproximadamente 20%, o menos de aproximadamente 15%, o menos de aproximadamente 12,5%, o menos de aproximadamente 10%, o menos de aproximadamente 8% o menos de aproximadamente 7%, y una cantidad de cianato.

Otro aspecto adicional es la composición obtenida después de la purificación mediante intercambio aniónico, que comprende una EPO carbamilada con menos de aproximadamente 3% en peso de agregados y polímeros, o menos de aproximadamente 2,5%, o menos de aproximadamente 2%, o menos de aproximadamente 1,5%, o menos de aproximadamente 1% o menos de aproximadamente 0,5%. Además, esta composición comprende isoformas que consisten en EPO hipercarbamilada o hipocarbamilada en cantidades menores de aproximadamente 40% en peso de la EPO total carbamilada, o más preferentemente en menos de aproximadamente 35%, o menos de aproximadamente 30%, o menos de aproximadamente 25%, o menos de aproximadamente 20%, o menos de aproximadamente 15%, o menos de aproximadamente 10%, o menos de aproximadamente 7,5%, o menos de aproximadamente 5%, o menos de aproximadamente 2%, y con mayor preferencia menos de aproximadamente 1%. Además, la cantidad de EPO hipercarbamilada o hipocarbamilada en la composición puede ser inferior a aproximadamente 35% en peso de la EPO total carbamilada, o más preferentemente inferior a aproximadamente 30%, o menos de aproximadamente 25%, o menos de aproximadamente 20%, o menos de aproximadamente 15%, o menos de aproximadamente 10%, o menos de aproximadamente 7,5%, o menos de aproximadamente 5%, o menos de aproximadamente 2%, y con mayor preferencia, menos de aproximadamente 1%.

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Composiciones farmacéuticas

Un aspecto es el uso de los compuestos tal y como se describen en esta memoria, que son el resultado del método de la invención, para la producción de composiciones farmacéuticas para ser utilizadas en humanos o en mamíferos, para el tratamiento de los estados que se describen más adelante.

Un aspecto es una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de EPO carbamilada, con menos de aproximadamente 3% en peso de agregados y polímeros, o más preferentemente menos de aproximadamente 2,5%, o menos de aproximadamente 2%, o menos de aproximadamente 1,5%, o menos de aproximadamente 1%, y con mayor preferencia, menos de aproximadamente 0,5% y además, esta composición comprende isoformas que consisten en EPO hipercarbamilada o hipocarbamilada en cantidades menores de aproximadamente 40% en peso de la EPO carbamilada total, o más preferentemente, en menos de aproximadamente 35%, o menos de aproximadamente 30%, o menos de aproximadamente 25%, o menos de aproximadamente 20%, o menos de aproximadamente 15%, o menos de aproximadamente 10%, o menos de aproximadamente 5%, o menos de aproximadamente 3%, o menos de aproximadamente 2%, y con mayor preferencia menos de aproximadamente 1%. Además, la cantidad de EPO hipercarbamilada o hipocarbamilada en la composición puede ser inferior a aproximadamente 35% en peso de la EPO carbamilada total, o más preferentemente inferior a aproximadamente 30%, o menos de aproximadamente 25%, o menos de aproximadamente 20%, o menos de aproximadamente 15%, o menos de aproximadamente 10%, o menos de aproximadamente 5%, o menos de aproximadamente 3%, o menos de aproximadamente 2%, y con mayor preferencia, inferior a aproximadamente 1%.

En la práctica de un aspecto, una composición farmacéutica tal y como se ha descrito anteriormente, que contiene el compuesto tal y como se ha descrito en esta memoria que es el resultado el método inventivo, se puede administrar a un mamífero a través de cualquier vía que proporcione un nivel suficiente del compuesto tal y como se ha descrito en esta memoria que es el resultado el método inventivo, en el sistema vascular, para permitir la traslocación a través de una barrera celular endotelial y efectos beneficiosos sobre las células sensibles. Cuando se emplea con el fin de perfundir un tejido o un órgano, se desean resultados similares. En el caso en el que las células o el tejido no estén vascularizados, y/o la administración sea por medio del baño de las células o del tejido con la composición, la composición farmacéutica proporciona una cantidad beneficiosa de células eficaces y sensibles, de un compuesto tal y como se describe en esta memoria, que es el resultado del método de la invención. Las barreras celulares endoteliales a través de las cuales el compuesto tal y como se describe en esta memoria, que es el resultado del método de la invención, se puede traslocar, incluyen uniones herméticas, uniones perforadas, uniones fenestradas y cualquier otro tipo de barrera endotelial presente en un mamífero. Una barrera preferida es una unión hermética entre células
endoteliales.

El compuesto mencionado anteriormente, tal y como se describe en esta memoria, que es el resultado del método de la invención, es útil en general para el tratamiento terapéutico o profiláctico de enfermedades humanas del sistema nervioso central o del sistema nervioso periférico, que tienen principalmente síntomas neurológicos o siquiátricos, enfermedades oftálmicas; enfermedades cardiovasculares, enfermedades cardiopulmonares; enfermedades respiratorias; enfermedades renales, enfermedades del sistema urinario o reproductor, enfermedades gastrointestinales y anormalidades endocrinas y metabólicas. En particular, tales estados y enfermedades incluyen estados hipóxicos que afectan de manera adversa a los tejidos excitables, tales como los tejidos excitables en el tejido del sistema nervioso central, el tejido del sistema nervioso periférico o el tejido cardiaco o de la retina, como por ejemplo, el cerebro, el corazón o la retina/ojo. Por lo tanto, el compuesto tal y como se describe en esta memoria, que es el resultado del método de la invención, se puede emplear para tratar o para prevenir daños en el tejido excitable, como resultado de estados hipóxicos en una variedad de afecciones y circunstancias. Ejemplos no limitativos de tales estados y circunstancias se proporcionan en la tabla que se presenta más adelante.

En el ejemplo de la protección de patologías de tejido neuronal que se pueden tratar tal y como se describen en esta memoria, tales patología incluyen las resultantes de una oxigenación reducida de los tejidos neuronales. Cualquier estado que reduzca la disponibilidad de oxígeno en el tejido neuronal, produce como resultado estrés, daño y finalmente la muerte de las células neuronales, se puede tratar según los métodos descritos en esta memoria. Los estados que en general se denominan hipoxia y/o isquemia, abarcan, sin estar limitados a los mismos, el ictus, la oclusión vascular, la privación de oxígeno prenatal o posnatal, el sofoco, el ahogo, el ahogo por llenado pulmonar con líquidos, el envenenamiento con monóxido de carbono, la inhalación de humo, el traumatismo que incluye cirugía y radioterapia, la asfixia, la epilepsia, la hipoglucemia, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, el enfisema, el síndrome de insuficiencia respiratoria de adulto, el choque hipotenso, el choque séptico, el choque anafiláctico, el choque insulínico, la crisis drepanocítica, el paro cardiaco, la arritmia, la narcosis con nitrógeno y los déficits neurológicos causados por procedimientos de derivación de corazón-pulmón.

En un aspecto, por ejemplo, las composiciones farmacéuticas específicas que comprenden la composición, se pueden administrar para evitar lesiones o daños de los tejidos debido al riesgo de lesión o de daño tisular durante procesos quirúrgicos, tal como por ejemplo, resecciones de tumores o reparación de aneurismas. Otras patologías causadas o que son el resultado de hipoglicemia, que se pueden tratar con los métodos descritos en esta memoria, incluyen la sobredosis de insulina, también denominada hiperinsulinemia iatrogénica, insulinoma, deficiencia de hormona de crecimiento, hipocortisolismo, sobredosis de drogas y ciertos tumores.

Otras patologías resultantes del daño del tejido neuronal excitable, incluyen trastornos de aparición repentina, tales como la epilepsia, las convulsiones o trastornos de aparición repentina crónicos. Otros estados y enfermedades tratables incluyen sin estar limitados a los mismos, enfermedades tales como el ictus (ictus isquémico, hemorragia subaracnoidea, hemorragia intracerebral), esclerosis múltiple, hipotensión, paro cardiaco, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, parálisis cerebral, traumatismo cerebral o de la médula espinal, demencia por SIDA, pérdida de la función cognitiva relacionada con la edad, pérdida de la memoria, esclerosis lateral amiotrófica, trastornos de aparición repentina, alcoholismo, isquemia retiniana, lesión del nervio óptico debido a glaucoma, y pérdida neuronal.

La composición específica tal y como se describe en esta memoria y los métodos de la presente invención, se pueden utilizar para tratar la inflamación resultante de estados patológicos o de diversos traumatismos, tales como la inflamación inducida física o químicamente. Tales traumatismos podrían incluir vasculitis, bronquitis crónica, pancreatitis, osteomielitis, artritis reumatoide, glomerulonefritis, neuritis óptica, arteritis temporal, encefalitis, meningitis, mielitis transversal, dermatomiositis, polimiositis, fascitis necrosante, hepatitis y enterocolitis necrosante.

Las pruebas han mostrado que los astrocitos activados pueden ejercer una función citotóxica frente a las neuronas, produciendo neurotoxinas. Se libera óxido nítrico, especies reactivas con oxígeno y citocinas se liberan desde los neurogliocitos, como respuesta a la isquemia cerebral (véase, Becker, K.J. 2001. "Targeting the central nervous system inflammatory response in ischemic stroke". Curr Opinion Neurol 14:349-353 y Mattson, M.P., Culmsee, C., y Yu, Z.F. 2000. "Apoptotic and Antiapoptotic mechanisms in stroke". Cell Tissue Res 301:173-187). Los estudios han mostrado además, que en modelos de neurodegeneración, la activación neuroglial y la posterior producción de citocinas inflamatorias, dependen de la lesión neuronal primaria (véase, Viviani, B., Corsini, E., Galli, C.L., Padovani, A., Ciusani, E. y Marinovich, M. 2000. "Dying neural cells activate glia through the release of a protease product". Glia 32:84-90 y Rabuffetti, M., Scioratti, C., Tarozzo, G., Clementi, E., Manfredi, A.A. y Beltramo, M. 2000. "Inhibition of caspase-1-like activity by Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-chloromethyl ketone includes long lasting neuroprotection in cerebral ischemia through apoptosis reduction and decrease of proinflammatory cytokines". J Neurosci 20:4398-4404). La activación y la inflamación neuroglial son comunes a diferentes formas de trastornos neurodegenerativos, entre ellos, la isquemia cerebral, el traumatismo cerebral y la encefalomielitis alérgica experimental, trastornos en los cuales la eritropoyetina ejerce un efecto neuroprotector. La inhibición de la producción de citocinas por la eritropoyetina podría, al menos en parte, mediar en su efecto protector. Sin embargo, a diferencia de las citocinas anti-inflamatorias "clásicas", tales como IL-10 e IL-13, que inhiben directamente la producción del factor de necrosis tumoral, la eritropoyetina parece estar activa, sólo en presencia de muerte neuronal.

Si bien no se desea una limitación a ninguna teoría particular, parece que esta actividad anti-inflamatoria puede explicarse hipotéticamente a través de varias teorías no limitantes. En primer lugar, debido a que la eritropoyetina evita la apoptosis, se evitarían los sucesos inflamatorios desencadenados por la apoptosis. Además, la eritropoyetina puede evitar la liberación de señales moleculares procedentes de neuronas moribundas que estimulan los neurogliocitos, reduciendo su reacción con estos productos. Otra posibilidad es que la eritropoyetina apunte a miembros más próximos de la cascada inflamatoria (por ejemplo, la caspasa 1, compuestos intermediarios reactivos con oxígeno o nitrógeno), que desencadenan tanto la apoptosis como la inflamación.

Adicionalmente, la eritropoyetina parece que proporciona una protección anti-inflamatoria, sin el efecto de rebote asociado típicamente con otros compuestos anti-inflamatorios, tales como la dexametasona. Una vez más, sin deseos de limitarse a ninguna teoría particular, parece que esto pueda ser debido al efecto de la eritropoyetina sobre neurotoxinas polivalentes, tales como el óxido nítrico (NO). Si bien los astrocitos activados y la microglía producen cantidades neurotóxicas de NO como respuesta a varios traumatismos, el NO sirve de forma polivalente en el organismo, incluyendo la modulación de funciones fisiológicas esenciales. Por lo tanto, aunque el uso de un anti-inflamatorio puede aliviar la inflamación suprimiendo NO u otras neurotoxinas, si el anti-inflamatorio tiene una semivida demasiado larga, también puede interferir con las funciones de estos agentes químicos en la reparación del daño resultante del traumatismo que produjo la inflamación. Se supone que el compuesto de la presente invención es capaz de aliviar la inflamación, sin interferir con la capacidad restauradora de las neurotoxinas, tales como NO.

Las composiciones y los métodos específicos se pueden emplear para tratar estados y lesiones del tejido retiniano. Tales trastornos incluyen, sin estar limitados a los mismos, la isquemia retiniana, la degeneración macular, el desprendimiento de retina, la retinitis pigmentosa, la retinopatía arteriosclerótica, la retinopatía hipertensa, el bloqueo de la arteria retiniana, el bloqueo de la vena retiniana, la hipotensión y la retinopatía diabética.

En otra realización, los métodos y los principios se pueden emplear para proteger o tratar lesiones resultantes del daño por radiación o el daño inducido por la quimioterapia, en el tejido excitable. En un ejemplo no limitante, se pueden emplear para proteger de los daños provocados por compuestos como taxanos, cisplatino y otros productos quimioterapéuticos con potencial para inducir neuropatías periféricas. Otra utilidad de los métodos es en el tratamiento del envenenamiento con neurotoxinas, tal como la intoxicación con mariscos con ácido domoico, el neurolatirismo y la enfermedad de Guam, la esclerosis lateral amiotrófica y la enfermedad de Parkinson.

Tal y como se ha mencionado anteriormente, también se describe un método para potenciar la función de tejidos excitables en un mamífero, mediante la administración periférica de un compuesto tal y como se ha descrito anteriormente. Con este método se pueden tratar diversas enfermedades y estados y además, este método es útil para potenciar la función cognitiva en ausencia de cualquier enfermedad o estado. Estos usos se describen con mayor detalle a continuación, e incluyen la mejora del aprendizaje y el entrenamiento, tanto en humanos como en mamíferos no humanos.

Los estados y las enfermedades que se pueden tratar con los métodos de este aspecto, dirigidos al sistema nervioso central, comprenden sin estar limitados a los mismos, trastornos de ansiedad, depresión, autismo, trastornos de hiperactividad y déficit de atención y disfunción cognitiva. Estos estados se benefician con el aumento de la función neuronal. Otros trastornos que se pueden tratar de acuerdo con las presentes enseñanzas incluyen, por ejemplo, las alteraciones del sueño, la apnea del sueño y trastornos relacionados con viajes; sangrados subaracnoideos y aneurísmicos; el choque hipotenso, la lesión por conmoción, el choque séptico, el choque anafiláctico, y secuelas de diversas encefalitis y meningitis bacterianas, por ejemplo, cerebritis bacteriana relacionada con la enfermedad del tejido conectivo, tal como lupus. Otros usos incluyen la prevención o la protección frente al envenenamiento con neurotoxinas, tales como la intoxicación con mariscos con ácido domoico, el neurolatirismo y la enfermedad de Guam, la esclerosis lateral amiotrófica, la enfermedad de Parkinson; el tratamiento postoperatorio para lesiones embólicas o isquémicas; la radiación cerebral total; la crisis drepanocítica; y la eclampsia.

Otro grupo de estados que se pueden tratar con los métodos, incluyen la disfunción mitocondrial de naturaleza hereditaria o adquirida, que es la causa de una variedad de enfermedades neurológicas tipificadas por lesión y muerte neuronal. Por ejemplo, la enfermedad de Leigh (encefalopatía necrosante subaguda) se caracteriza por la pérdida visual progresiva y la encefalopatía, debida a la pérdida neuronal y la miopatía. En estos casos, el metabolismo mitocondrial defectuoso no proporciona suficientes sustratos de alta energía para abastecer el metabolismo de las células excitables. Un modulador de la actividad del receptor de la eritropoyetina optimiza la función defectuosa en una variedad de enfermedades mitocondriales. Tal y como se ha mencionado anteriormente, los estados hipóxicos afectan negativamente a los tejidos excitables. Los tejidos excitables incluyen, sin estar limitados a los mismos, el tejido del sistema nervioso central, el tejido del sistema nervioso periférico y el tejido cardiaco. Además de los estados descritos anteriormente, los métodos son útiles para el tratamiento de envenenamiento por inhalación, tal como la inhalación de monóxido de carbono y la inhalación de humos; el asma grave; el síndrome de insuficiencia respiratoria de adulto; el ahogo; y el ahogo por llenado pulmonar con líquidos. Otros estados que crean estados hipóxicos, o que inducen de otro modo la lesión del tejido excitable, incluyen la hipoglucemia que puede aparecer con una dosificación inadecuada de insulina, o con neoplasmas productores de insulina (insulinoma).

Se cree que diversos trastornos neurosicológicos que se originan por la lesión del tejido excitable, se pueden tratar con los métodos presentes. Los trastornos crónicos en los cuales está implicada la lesión neuronal y para los que se proporciona el tratamiento, incluyen trastornos relacionados con el sistema nervioso central y/o el sistema nervioso periférico, entre ellos, la pérdida de la función cognitiva relacionada con la edad y la demencia senil, los trastornos de aparición repentina crónicos, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la demencia, la pérdida de la memoria, la esclerosis lateral amiotrófica, la esclerosis múltiple, la esclerosis tuberosa, la enfermedad de Wilson, la parálisis supranuclear progresiva y cerebral, la enfermedad de Guam, la demencia de cuerpos de Lewy, las enfermedades priónicas, tales como las encefalopatías espongiformes, por ejemplo, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, la enfermedad de Huntington, la distrofia miotónica, la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, la ataxia de Friedrich y otras ataxias, así como el síndrome de Gilles de la Tourette, trastornos de aparición repentina, tales como la epilepsia, el trastorno de aparición repentina crónico, ACV, el traumatismo cerebral o de la médula espinal, la demencia por SIDA, el alcoholismo, el autismo, la isquemia retiniana, el glaucoma, los trastornos de la función autónoma, tales como la hipertensión y los trastornos del sueño, y trastornos neurosiquiátricos que comprenden, sin estar limitados a los mismos, la esquizofrenia, el trastorno esquizoafectivo, el trastorno de hiperactividad y déficit de atención, el trastorno distímico, el trastorno depresivo mayor, la manía, el trastorno obsesivo-compulsivo, los trastornos por uso de sustancias psicoactivas, la ansiedad, el trastorno de pánico, así como también trastornos afectivos unipolares y bipolares. Otros trastornos neurosiquiátricos y neurodegenerativos comprenden, por ejemplo, los que se citan en el American Psychiatric Association's Diagnostic y Statistical Manual of Mental Disorders (DSM), en su versión más actual, IV, incorporado a la presente memoria a modo de referencia en su totalidad.

En otro aspecto, se pueden emplear moléculas de toxinas quiméricas recombinantes que comprenden un compuesto tal y como se describe en esta memoria, como resultado del método inventivo, para el suministro terapéutico de toxinas para tratar un trastorno proliferativo, tal como un cáncer, o un trastorno vírico, tal como la panencefalitis esclerosante subaguda.

La Tabla 1 cita otras indicaciones ejemplares, que no son limitantes, en relación con diversos estados y enfermedades que se pueden tratar con los compuestos mencionados anteriormente tal y como se describen en esta memoria, que son el resultado del método inventivo.

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TABLA 1

1

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6

Tal y como se ha mencionado anteriormente, estas enfermedades, trastornos o estados, son meramente ilustrativos del abanico de beneficios proporcionados por el presente compuesto. Por tanto, en esta memoria se describen en general el tratamiento terapéutico o profiláctico de las consecuencias del traumatismo mecánico o de enfermedades humanas. Se prefiere el tratamiento terapéutico o profiláctico de enfermedades, trastornos o estados del SNC y/o del sistema nervioso periférico. Se proporciona un tratamiento terapéutico o profiláctico para enfermedades, trastornos o estados que tienen un componente psiquiátrico. Se proporciona un el tratamiento terapéutico o profiláctico para enfermedades, trastornos o estados que incluyen, sin estar limitadas a los mismos, los que tienen un componente oftálmico, cardiovascular, cardiopulmonar, respiratorio, renal, urinario, reproductor, gastrointestinal, endocrino o metabólico.

En un aspecto, dicha composición farmacéutica que comprende el compuesto tal y como se describe en esta memoria, que es el resultado del método inventivo, se puede administrar sistémicamente para proteger o potenciar las células, el tejido o el órgano diana. Dicha administración puede ser por vía parenteral, mediante inhalación, o por vía transmucosal, por ejemplo, oral, nasal, rectal, intravaginal, sublingual, submucosal o transdérmica. Preferentemente, la administración es parenteral, p. ej., por vía intravenosa o mediante inyección intraperitoneal, y también incluye, sin estar limitada a las mismas, la vía intraarterial, intramuscular, intradérmica y subcutánea.

Para otras vías de administración, tales como mediante perfusión, inyección en un órgano u otra administración local, se proporcionará una composición farmacéutica con la que se logren niveles similares del compuesto tal y como se describe en esta memoria, que es el resultado del método inventivo. Se prefiere un nivel de aproximadamente 0,01 pM - 30 nM.

Las composiciones farmacéuticas tal y como se describen en esta memoria, que son el resultado del método inventivo, pueden comprender una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto, y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En una realización específica, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa que dicho compuesto está aprobado por una agencia reguladora del gobierno nacional o estatal, o que está citado en la Farmacopea de los Estados Unidos o en otra farmacopea extranjera, generalmente reconocida para uso en animales y más particularmente en humanos. El término "excipiente" se refiere a un diluyente, un coadyuvante o un vehículo con el que se administra el agente terapéutico. Tales excipientes farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como soluciones salinas en agua y aceites, que incluyen los de origen animal, vegetal, sintético o de hidrocarburos, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Una solución salina es un excipiente preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. Las soluciones salinas y las soluciones de glicerol y dextrosa acuosas también se pueden emplear como excipientes líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, creta, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propilenglicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponadores del pH. Estas composiciones pueden adoptar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, pastillas, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. La composición se puede formular como un supositorio, con aglutinantes y excipientes convencionales, tales como triglicéridos. Los compuestos de la invención se pueden formular como formas neutras o salinas. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las formadas con grupos amino libres, tales como las derivadas del ácido clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y las formadas con grupos carboxilo libres, tales como las derivadas de hidróxidos férricos, de sodio, de potasio, de amonio, de calcio, isopropilamina, trietilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína, etc. Ejemplos de excipientes farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E.W. Martin. Tales composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto, preferentemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de excipiente, a fin de proporcionar la forma para la administración adecuada al paciente. La formulación debe adecuarse al modo de administración.

Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración oral, pueden proporcionarse como cápsulas o comprimidos; como polvos o gránulos; como soluciones, jarabes o suspensiones (en líquidos acuosos o no acuosos); como batidos o espumas comestibles; o como emulsiones. Los comprimidos o las cápsulas de gelatina dura pueden comprender lactosa, almidón o sus derivados, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, ácido esteárico o sus sales. Las cápsulas de gelatina blanda pueden comprender aceites vegetales, ceras, grasas, polioles semisólidos o líquidos, etc. Las soluciones y los jarabes pueden comprender agua, polioles y azúcares.

Un agente activo propuesto para la administración oral puede revestirse o mezclarse con un material que demore la desintegración y/o la absorción del agente activo en el tracto gastrointestinal (por ejemplo, se puede emplear monoestearato de glicerol o diestearato de glicerol). Por lo tanto, se puede lograr la liberación sostenida de un agente activo durante muchas horas y, si es necesario, el agente activo se puede proteger contra la degradación en el estómago. Las composiciones farmacéuticas para la administración oral se pueden formular de modo que faciliten la liberación de un agente activo en una región gastrointestinal particular, debido a las condiciones enzimáticas o de pH específicas.

Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración transdérmica pueden proporcionarse como parches separados, para permanecer en contacto íntimo con la epidermis del receptor, durante un periodo de tiempo prolongado. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración tópica, pueden proporcionarse como ungüentos, cremas, suspensiones, lociones, polvos, soluciones, pastas, geles, pulverizaciones, aerosoles o aceites. Para la administración tópica sobre la piel, boca, ojos u otros tejidos externos, se emplea preferentemente un ungüento o una crema tópica. Cuando se formula en forma de ungüento, el ingrediente activo se puede emplear con una base de ungüento parafínica o miscible en agua. Alternativamente, el ingrediente activo se puede formular en una crema, con una base de aceite-en-agua o una base de agua-en-aceite. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración tópica en el ojo, comprenden gotas oculares. En estas composiciones, el ingrediente activo se puede disolver o suspender en un excipiente adecuado, p. ej., en un disolvente acuoso. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración por vía tópica en la boca, incluyen comprimidos para disolución bucal, pastillas y lavados bucales.

Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración nasal y pulmonar pueden comprender excipientes sólidos, tales como polvos (preferentemente con un tamaño de partícula en el intervalo de 20 a 500 micras). Los polvos se pueden administrar mediante aspiración por la nariz, es decir, mediante una rápida inhalación a través de la nariz, desde un recipiente con el polvo que se mantiene cerca de la nariz. Alternativamente, las composiciones adoptadas para la administración nasal pueden comprender excipientes líquidos, por ejemplo, pulverizaciones nasales o gotas nasales. Alternativamente, la inhalación directa hacia los pulmones se puede realizar mediante inhalación profunda, o instalando una boquilla en la orofaringe. Estas composiciones pueden comprender soluciones acuosas u oleosas del ingrediente activo. Las composiciones para administrar mediante inhalación pueden proporcionarse en dispositivos especialmente adaptados, entre ellos, pero sin limitarse a los mismos, aerosoles a gran presión, nebulizadores o insufladores que se pueden construir de forma que proporcionen unas dosificaciones predeterminadas del ingrediente activo. En un aspecto preferido, las composiciones farmacéuticas se administran directamente en la cavidad nasal o en los pulmones a través de la cavidad nasal o la orofaringe.

Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración rectal se pueden proporcionar como supositorios o enemas. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración por vía vaginal se pueden proporcionar como óvulos, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones de pulverización.

Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración por vía parenteral incluyen suspensiones o soluciones inyectables acuosas y no acuosas, estériles que pueden contener antioxidantes, tampones, agentes bacteriostáticos y solutos que sirven para que las composiciones sean sustancialmente isotónicas con la sangre del receptor propuesto. Otros componentes que pueden estar presentes en tales composiciones incluyen, por ejemplo, el agua, alcoholes, polioles, glicerina y aceites vegetales. Las composiciones adaptadas para la administración parenteral pueden presentarse en recipientes de dosis unitarias o de dosis múltiples, por ejemplo, ampollas y frascos sellados, y se pueden almacenar en forma seca por congelación (liofilizada), requiriendo sólo la adición de un excipiente líquido estéril, por ejemplo, una solución salina estéril para inyecciones, inmediatamente antes del uso. Las soluciones y las suspensiones para inyección improvisada, se pueden preparar a partir de polvos estériles, gránulos y comprimidos. En un aspecto, se puede proporcionar un autoinyector que comprende una solución inyectable de un compuesto descrito en esta memoria que es el resultado del método de la invención, para el uso de emergencia en ambulancias, salas de emergencias y situaciones de hospitales móviles, e incluso para la autoadministración en un establecimiento doméstico, en particular, cuando exista la posibilidad de amputación traumática, tal como con el uso imprudente de una cortadora de césped. La probabilidad de que las células y los tejidos en un pie o en un dedo del pie amputado, sobrevivan después de unirlo de nuevo, puede aumentar administrando un compuesto, tal y como se describe en esta memoria que es el resultado del método inventivo, en múltiples sitios en la parte seccionada tan pronto como sea posible, aún antes de la llegada al lugar del personal médico o de la llegada del individuo afectado con el dedo del pie seccionado, a la sala de emergencias.

En un aspecto preferido, la composición se formula de acuerdo con procedimientos rutinarios, como una composición farmacéutica adaptada para la administración intravenosa a seres humanos. Típicamente, las composiciones para la administración intravenosa son soluciones en tampón acuoso isotónico y estéril. Cuando sea necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local, tal como lidocaína para aliviar el dolor en el sitio de la inyección. Generalmente, los ingredientes se proporcionan bien por separado o en mezcla en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o un concentrado exento de agua, en un recipiente sellado herméticamente, tal como una ampolla o un sobre que indica la cantidad de ingrediente activo. Cuando la composición debe administrarse por infusión, se puede preparar en una botella de infusión que contiene solución salina o agua con grado farmacéutico estéril. Cuando la composición se debe administrar por inyección, se puede proporcionar una ampolla de solución salina estéril, de manera que los ingredientes se puedan mezclar antes de la administración.

Los supositorios contienen en general ingrediente activo en el intervalo de 0,5% a 10% en peso; las formulaciones orales contienen de 10% a 95% de ingrediente activo.

Se puede proporcionar una composición de perfusión para uso en baños de órganos trasplantados, para perfusión in situ o para administrar en la vasculatura de un donante de órganos, antes de extirpar el órgano. Tales composiciones farmacéuticas pueden comprender niveles del compuesto, tal y como se describe en esta memoria que es el resultado del método inventivo, que no sean adecuadas para la administración aguda o crónica, local o generalizada, a un individuo, aunque cumplirán las funciones propuestas en esta memoria en un cadáver, baño de órgano, perfusión de órgano o perfusión in situ antes de eliminar o reducir los niveles del compuesto tal y como se describe en esta memoria que es el resultado del método inventivo, allí contenidos, previamente a la exposición o la devolución del tejido o del órgano tratado en la circulación regular.

También se describe un paquete farmacéutico o un equipo de reactivos que comprende uno o varios recipientes que contienen uno o varios de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas. Opcionalmente, junto con el recipiente o con los recipientes, se puede presentar un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental, que regule la elaboración, uso o venta de productos biológicos o farmacéuticos; dicho aviso refleja la aprobación de la agencia para la elaboración, uso o venta con fines de administración a seres humanos.

En otro aspecto, por ejemplo, el compuesto tal y como se describe en esta memoria que es el resultado del método inventivo, se puede suministrar en un sistema de liberación controlada. Por ejemplo, el polipéptido se puede administrar empleando una infusión intravenosa, una bomba osmótica implantable, un parche transdérmico, liposomas, u otros modos de administración. En un aspecto, se puede emplear una bomba (véase Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald y col., 1980, Surgery 88:507; Saudek y col., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). En otro aspecto, el compuesto se puede suministrar en una vesícula, en particular un liposoma (véase Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat y col., en "Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer", Lope-Berestein y Fidler (compiladores.), Liss, Nueva York, págs. 353-365 (1989); documento WO 91/04014; documento de Patente de EE.UU. Nº 4.704.355; Lopez-Berestein, ibid., págs. 317-327; ver generalmente ibid.). En otra realización, se pueden emplear materiales polímeros (véase "Medical Applications of Controlled Release", Langer y Wise (compiladores), CRC Press: Boca Raton, Florida, 1974; "Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance", Smolen y Ball (compiladores), Wiley: Nueva York (1984); Ranger y Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61, 1953; véase también Levy y col., 1985, Science 228:190; During y col., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard y col., 1989, J. Neurosurg. 71:105).

En aún otro aspecto, se puede colocar un sistema de liberación controlada en las proximidades de la diana terapéutica, es decir, las células, el tejido o el órgano diana, y por lo tanto sólo se necesitará una fracción de la dosis sistémica (véase, p. ej., Goodson, págs. 115-138 en "Medical Applications of Controlled Release", vol. 2, supra, 1984). Otros sistemas de liberación controlada se analizan en la reseña de Langer (1990, Science 249:1527-1533).

En otro aspecto, el compuesto tal y como se describe en esta memoria que es el resultado del método inventivo, formulado de forma adecuada, se puede administrar por vía nasal, oral, rectal, vaginal o sublingual.

En un aspecto específico, puede ser deseable administrar las composiciones de forma local en la zona que necesite tratamiento; esto se puede efectuar, por ejemplo, y no a modo de limitación, mediante infusión local durante la cirugía; aplicación tópica, por ejemplo, junto con un vendaje para heridas después de la cirugía; por inyección; por medio de un catéter; por medio de un supositorio; o por medio de un implante; siendo dicho implante de material poroso, no poroso o gelatinoso, por ejemplo, membranas tales como membranas silásticas, o fibras.

La selección de la dosis eficaz preferida la determinará el experto en la técnica, basándose en diversos factores conocidos en la técnica. Dichos factores incluyen la forma particular del compuesto tal y como se describe en esta memoria que es el resultado del método inventivo, y sus parámetros farmacocinéticos, tales como biodisponibilidad, metabolismo, semivida, etc. que se habrán establecido en los procedimientos de desarrollo de rutina, empleados habitualmente para obtener la aprobación de las agencias reguladoras para un compuesto farmacéutico. Otros factores que deben considerarse al establecer la dosis, incluyen el estado o la enfermedad que se va a tratar o el beneficio que se va a conseguir en un individuo normal, la masa corporal del paciente, la vía de administración, si la administración es crónica o aguda, las medicaciones concomitantes y otros factores bien conocidos que se sabe que afectan sobre la eficacia de los agentes farmacéuticos administrados. Por tanto, la dosificación precisa debe decidirse conforme al juicio del médico y de las circunstancias de cada paciente, por ejemplo, según la afección y el estado inmunológico del paciente individual, y de acuerdo con técnicas clínicas convencionales.

En otro aspecto, se proporciona una solución de perfusión o perfundido para la perfusión y el almacenamiento de los órganos para trasplante, incluyendo la solución de perfusión una cantidad del compuesto tal y como se describe en esta memoria que es el resultado del método inventivo, que sea eficaz para proteger las células sensibles y las células, tejidos u órganos asociados. El trasplante incluye, sin estar limitado a los mismos, el xenotrasplante, en donde un órgano (incluyendo las células, el tejido u otra parte corporal) se extirpa de un donante y se trasplanta en un receptor diferente; y el autotrasplante, en donde el órgano se toma de una parte del cuerpo y se coloca en otra parte, lo que incluye procedimientos quirúrgicos de laboratorio, en los que se puede extirpar un órgano y, ex vivo, se puede reseccionar, reparar o manipular de otro modo, tal como para la extirpación de tumores, y a continuación volver a la ubicación original. En un aspecto, la solución de perfusión es la solución de la Universidad de Wisconsin (UW) (documento de patente de EE.UU. nº 4.798.824) que contiene desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 25 U/ml de eritropoyetina, 5% de hidroxietil almidón (que tiene un peso molecular desde aproximadamente 200.000 hasta aproximadamente 300.000 y está sustancialmente exento de etilenglicol, etilenclorhidrina, cloruro de sodio y acetona); KH_{2}PO_{4} 25 mM; glutatión 3 mM; adenosina 5 mM; glucosa 10 mM; tampón HEPES 10 mM; gluconato de magnesio 5 mM; CaCl2 1,5 mM; gluconato sódico 10 mM; 200.000 unidades de penicilina; 40 unidades de insulina; 16 mg de dexametasona; 12 mg de rojo de fenol; y tiene un pH de 7,4-7,5 y una osmolaridad de aproximadamente 320 mOSm/l. La solución se emplea para mantener los riñones y los páncreas de cadáveres antes del trasplante. Con el uso de la solución, la conservación se puede extender más allá del límite de 30 horas, recomendado para la conservación de riñones de cadáveres. Esta perfusión particular es sólo ilustrativa de una cantidad de dichas soluciones que pueden adaptarse para el uso presente, agregando una cantidad eficaz del compuesto tal y como se describe en esta memoria que es el resultado del método inventivo. En otro aspecto, la solución de perfusión contiene desde aproximadamente 0,01 pg/ml hasta aproximadamente 400 ng/ml del compuesto de la invención, o desde aproximadamente 40 hasta aproximadamente 300 ng/ml del compuesto tal y como se describe en esta memoria que es el resultado del método inventivo.

Si bien el receptor preferido de un compuesto tal y como se describe en esta memoria que es el resultado del método inventivo, para los fines de esta memoria, es un ser humano, los métodos de esta memoria se aplican igualmente a otros mamíferos, particularmente animales domésticos, ganado, animales de compañía y de zoológico. Sin embargo, la invención no se limita a éstos, y los beneficios se pueden aplicar a cualquier animal.

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Usos terapéuticos y preventivos de los presentes compuestos

Tal y como se indica en el Ejemplo 1, a continuación, la presencia de receptores de eritropoyetina en el endotelio humano capilar del cerebro, indica que las dianas de los compuestos, tal y como se describen en esta memoria que son el resultado del método inventivo, están presentes en el cerebro humano, y que los estudios en animales sobre estos compuestos tal y como se describen en esta memoria que son el resultado del método inventivo, se pueden aplicar directamente en el tratamiento o la profilaxis de seres humanos.

En otro aspecto, los métodos y las composiciones para potenciar la viabilidad de las células, los tejidos o los órganos que no se han aislado de la vasculatura mediante una barrera celular endotelial, se proporcionan a través de la exposición de las células, los tejidos o los órganos directamente a una composición farmacéutica que comprende un compuesto tal y como se describe en esta memoria que es el resultado del método inventivo, o administrando o poniendo en contacto un compuesto tal y como se describe en esta memoria que es el resultado del método inventivo, que contiene una composición farmacéutica en el sistema vascular del tejido o del órgano. Una actividad potenciada de las células sensibles en el tejido o el órgano tratado, es responsable de los efectos positivos ejercidos.

Tal y como se ha descrito anteriormente, la presente descripción se basa, en parte, en el descubrimiento de que las moléculas de eritropoyetina se pueden transportar desde la superficie luminal hasta la superficie de la membrana basal de las células endoteliales de los capilares de órganos con uniones herméticas de las células endoteliales, que incluyen, por ejemplo, el cerebro, la retina y los testículos. Por tanto, las células sensibles a través de la barrera, son dianas susceptibles para los efectos beneficiosos de un compuesto tal y como se describe en esta memoria que es el resultado del método inventivo, y de otros tipos celulares o tejidos u órganos que contienen y dependen en su totalidad o en parte de las células sensibles, por ello son dianas para los métodos presentes. Si bien no se desea una limitación a ninguna teoría en particular, después de la transcitosis de un compuesto tal y como se describe en esta memoria que es el resultado del método inventivo, el compuesto tal y como se describe en esta memoria que es el resultado del método inventivo, puede interaccionar con un receptor de eritropoyetina sobre una célula sensible, por ejemplo, una célula neuronal, retiniana, muscular, cardíaca, pulmonar, hepática, renal, del intestino delgado, de la corteza suprarrenal, de la médula suprarrenal, capilar endotelial, testicular, ovárica pancreática, ósea, dérmica o endometrial, y la unión con el receptor, puede iniciar una cascada de transducción de señales que provoca la activación de un programa de expresión genética dentro del tejido o de la célula sensible, lo que ofrece una protección a la célula, al tejido o al órgano, frente a la lesión, tal como la lesión por toxinas, agentes quimioterapéuticos, terapia con radiación, hipoxia, etc. En consecuencia, se describen métodos para proteger un tejido que contiene células sensibles frente a la lesión o el estrés hipóxico, y potenciar la función de dicho tejido tal y como se describe con más detalle a continuación. Tal y como se ha mencionado anteriormente, los métodos son igualmente aplicables a humanos como a otros animales.

En la práctica de un aspecto, un paciente mamífero se somete a quimioterapia generalizada para el tratamiento de cáncer, incluyendo el tratamiento con radiación, que tiene generalmente efectos adversos, tales como lesiones nerviosas, pulmonares, cardíacas, ováricas o testiculares. La administración de una composición farmacéutica que comprende un compuesto tal y como se describe en esta memoria que es el resultado del método inventivo, tal y como se ha descrito anteriormente, se realiza antes y durante la quimioterapia y/o la terapia con radiación, para proteger diversos tejidos y órganos de la lesión con el agente quimioterapéutico, así como para proteger los testículos. El tratamiento se puede continuar hasta que los niveles circulantes del agente quimioterapéutico desciendan por debajo de un nivel potencial peligroso para el organismo del mamífero.

En la práctica de otro aspecto, se planeó realizar la ablación multiorgánica de una víctima de accidente automovilístico, para trasplantar a diversos receptores, en donde para algunos de los cuales se necesitó el transporte para una distancia larga y durante periodos de tiempo prolongados. Antes de la ablación de los órganos, la víctima fue infundida con una composición farmacéutica que comprendía un compuesto tal y como se describe en esta memoria que es el resultado del método inventivo, tal y como se ha descrito en esta memoria. Los órganos extirpados para transportar, se perfundieron con una perfusión que contenía un compuesto tal y como se describe en esta memoria y se almacenaron en un baño que comprendía un compuesto tal y como se describe en esta memoria que es el resultado del método inventivo. Ciertos órganos se perfundieron de manera continua con un dispositivo de perfusión pulsátil, utilizando una perfusión que contenía un compuesto. Se produjo un deterioro mínimo de la función orgánica durante el transporte y después del implante y la reperfusión de los órganos in situ.

En otro aspecto, fue necesaria la cardioplejía temporal y la oclusión arterial para un procedimiento quirúrgico para arreglar una válvula cardíaca. Antes de la intervención, el paciente fue infundido con 4 \mug de un compuesto, por kg de peso corporal. Dicho tratamiento evitaba la lesión celular isquémica e hipóxica, particularmente después de la reperfusión.

En otro aspecto, en cualquier procedimiento quirúrgico, tal como en una cirugía de derivación cardiopulmonar, se puede emplear un compuesto tal y como se describe en esta memoria que es el resultado del método inventivo. En una realización, la administración de una composición farmacéutica que comprende un compuesto tal y como se describe en esta memoria que es el resultado del método inventivo, tal y como se ha descrito anteriormente, se realiza antes, durante y/o después del proceso de derivación, a fin de proteger la función del cerebro, del corazón y de otros órganos.

En los ejemplos anteriores, en los que un compuesto tal y como se describe en esta memoria que es el resultado del método inventivo, se emplea para aplicaciones ex vivo o para tratar células sensibles, tales como las del tejido neuronal, tejido retiniano, células o tejido cardiaco, pulmonar, hepático, renal, del intestino delgado, de la corteza suprarrenal, de la médula suprarrenal, capilar endotelial, testicular, ovárico o endometrial, se proporciona una composición farmacéutica en una forma de dosificación unitaria, adaptada para la protección o la potenciación de células, tejidos u órganos sensibles, distales a la vasculatura, que comprende por unidad de dosificación, una cantidad eficaz no tóxica, dentro del intervalo desde aproximadamente 0,01 pg a 5 mg, 1 pg a 5 mg, 500 pg a 5 mg, 1 ng a 5 mg, 500 ng a 5 mg, 1 \mug a 5 mg, 500 \mug a 5 mg, o 1 mg a 5 mg de compuesto de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En un aspecto preferido, la cantidad de un compuesto tal y como se describe en esta memoria que es el resultado del método inventivo, está dentro del intervalo desde aproximadamente 1 ng a 5 mg.

En otro aspecto, se observó que la administración de EPO restauraba la función cognitiva en animales que habían sufrido traumatismo cerebral. Los compuestos tal y como se describen en esta memoria que son el resultado del método inventivo, se espera que tengan los mismos efectos protectores celulares que la EPO. Después de un retraso de 5 días o 30 días, la EPO aún podía restaurar la función, en comparación con los animales tratados con un sustituto, lo que indicaba la capacidad de una EPO para regenerar o restaurar la actividad cerebral. Por tanto, la descripción también se dirige al uso de un compuesto tal y como se describe en esta memoria que es el resultado del método inventivo, para preparar una composición farmacéutica para el tratamiento de traumatismo cerebral y de otras disfunciones cognitivas, incluso para el tratamiento después de haber pasado un tiempo desde la lesión (por ejemplo, tres días, cinco días, una semana, un mes o más tiempo). La descripción también se dirige a un método para tratar una disfunción cognitiva después de una lesión, administrando una cantidad eficaz de un compuesto tal y como se describe en esta memoria que es el resultado del método inventivo. Cualquier compuesto tal y como se describe en esta memoria que es el resultado del método inventivo, tal y como se describe en esta memoria, se puede utilizar para este aspecto.

Además, este aspecto restaurador se dirige al uso de cualquiera de los compuestos tal y como se describen en esta memoria que son el resultado del método inventivo, para la preparación de una composición farmacéutica para restaurar una disfunción celular, tisular u orgánica, en donde el tratamiento se inicia después, y bastante tiempo después, del ataque inicial responsable de la disfunción. Aún más, el tratamiento que emplea un compuesto tal y como se describe en esta memoria que es el resultado del método inventivo, se puede extender a lo largo del curso de la enfermedad o del estado durante la fase aguda, así como en la fase crónica.

En el caso en el que un compuesto tenga actividad eritropoyética, el compuesto se puede administrar sistémicamente con una dosificación entre aproximadamente 1 \mug y aproximadamente 100 \mug /kg de peso corporal, preferentemente aproximadamente 5-50 \mug/kg de peso corporal, lo más preferible aproximadamente 10-30 \mug/kg de peso corporal, por administración. Esta dosis eficaz debe ser suficiente para lograr niveles séricos del compuesto superiores a aproximadamente 10.000,15.000 o 20.000 mU/ml de suero después de la administración del compuesto. Tales niveles de suero se pueden conseguir en aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 horas después de la administración. Tales dosificaciones se pueden repetir si es necesario. Por ejemplo, la administración se puede repetir diariamente, siempre que sea clínicamente necesario, o después de un intervalo apropiado, cada 1 a 12 semanas, pero preferentemente cada 1 a 3 semanas. La cantidad eficaz de compuesto y un excipiente farmacéuticamente aceptable, se pueden envasar en un frasco de dosis única o en otro recipiente. El compuesto tal y como se describe en esta memoria que es el resultado del método inventivo, sin embargo, no es eritropoyético, es decir, es capaz de ejercer las actividades descritas en esta memoria sin provocar un aumento de la concentración de hemoglobina o del hematocrito. Un compuesto tal, no eritropoyético se prefiere especialmente en los casos en los que los métodos no se pretenden administrar de forma crónica. En otro aspecto, un compuesto tal y como se describe en esta memoria que es el resultado del método inventivo, se suministra con una dosis superior a una dosis correspondiente (p/p) de eritropoyetina natural, la cual sería necesaria para estimular al máximo la eritropoyesis. Como ya se ha indicado anteriormente, un compuesto tal y como se describe en esta memoria que es el resultado del método inventivo, no tiene actividad eritropoyética y, por lo tanto, las dosificaciones mencionadas, expresadas en unidades, son sólo ejemplares para cantidades correspondientes de eritropoyetina natural; en la presente memoria se proporcionan los equivalentes molares superiores para las dosificaciones, que son aplicables a cualquier compuesto de la invención.

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Ejemplos

La presente invención puede comprenderse mejor por referencia a los siguientes ejemplos no restrictivos, que se proporcionan a modo de ejemplo de la invención. Los siguientes ejemplos se presentan a fin de ilustrar con mayor detalle las realizaciones preferidas de la invención. Sin embargo, no deben interpretarse de modo alguno como un límite del amplio alcance de la invención.

Ejemplo 1

Producción de eritropoyetina carbamilada

El material de partida del procedimiento en este ejemplo era EPO humana recombinante, purificada.

En primer lugar, la concentración de proteína se ajustó mediante ultrafiltración con el fin de mantener un bajo volumen de proceso. La concentración de proteína se ajustó a 3 mg/ml. La ultrafiltración se realizó mediante un BioMax (Millipore) con un MWCO de 5 kDa.

Después de completar la etapa de concentración, la solución de EPO se mezcló con K-borato tetrahidratado 0,5 M, K-cianato 0,5 M a pH 9,0; la solución se incubó a 32ºC durante 24 horas.

La desalación de la mezcla de reacción de EPO y cianato se realizó por filtración en gel. La proteína se desaló con un tampón de Tris 25 mM, NaCl 50 mM, pH 8,5. Se empleó una resina G-25 Fine (Amersham Biosciences).

Usando un caudal de 90 cm/h en una columna de aproximadamente 15 cm de alto, se aplicó una carga de la muestra de aproximadamente 20% del volumen de la columna.

La EPO carbamilada desalada se recogió para realizar un procesamiento adicional.

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En este punto, el contenido en polímero/agregado era del 7,3%.

La siguiente etapa fue la eliminación de los agregados y los polímeros, efectuada mediante una etapa de purificación, empleando intercambio aniónico. Se empleó una resina SOURCE 30Q (Amersham Biosciences) para la purificación. Aproximadamente 4,5 mg/ml de la EPO carbamilada se aplicaron sobre la columna. El tampón A del proceso era: Tris 25 mM, NaCl 50 mM pH 8,5, y el tampón de elución B: Tris 25 mM, NaCl 1 M pH 8,5. El gradiente se efectuó con 0-30% en 20 volúmenes de columna; se recogió el pico mayor de EPO carbamilada y se reunió.

La reunión de la etapa de purificación se ajustó a una concentración de > 0,5 mg/ml y el tampón se cambió a un tampón de citrato 20 mM, NaCl 100 mM empleando una unidad de filtración de flujo tangencial de dia/ultrafiltración. La concentración y el cambio de tampón se realizaron en un BioMax de 0,1 m^{2} (Millipore) con un MWCO de 5 kDa.

Finalmente, la sustancia del fármaco biofarmacéutico purificada se filtró a través de 0,22 \mum, empleando un filtro Millipak (Millipore) para reducir los gérmenes.

El procedimiento logró una EPO carbamilada con propiedades que la volvían útil como agente biofarmacéutico;

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El contenido en polímero/agregado era del 0,5%, tal y como se determinó por SEC-HPLC

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Las lisinas carbamiladas eran el 100%, tal y como se determinó mediante el análisis de aminoácidos

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La concentración era > 0,5 mg/ml

Se efectuó la caracterización empleando MALDI-TOF para la determinación del cambio de la masa intacta, tanto para la proteína tratada con PNGasa como para la proteína con los N-glicanos. Además de MALDI-TOF, se efectuó el análisis de la huella de masa peptídica/análisis LC-MS/MS, del modo siguiente:

1. CEPO y EPO se purificaron en una columna R1 de POROS (material de columna de fase inversa R1 de POROS, PerSeptive Biosystems (1-1259-06)). El material de columna se almacenó en 50% de HiPerSolv para HPLC VWR 152525R, antes del uso. La columna R1 se equilibró y se lavó en ácido fórmico al 5% (33015, Riedl de Haën). Las muestras se eluyeron de la columna con solución de matriz de calidad Agilent MALDI HCCA (G2037A). La masa intacta se determinó mediante el análisis con un instrumento Bruker Reflex IV MALDI-TOF.

2. Se trataron 0,3 pmol de CEPO y/o EPO durante una noche, con 1 unidad de PNGasa F y PNGasa F/O-glicosidasa. La masa total se determinó empleando MALDI-TOF.

3. CEPO y EPO (1,5 pmol) se redujeron en solución con 50 \mul de DTT 10mM, NH_{4}CO_{3} 50 mM y posteriormente se alquilaron en 50 \mul de yodoacetamida 55 mM, NH_{4}CO_{3} 50 mM. Las muestras se purificaron en una columna R1 de POROS, antes de la digestión con tripsina. Una fracción de la muestra digerida se purificó en una columna R2 de POROS, antes del análisis MALDI-TOF (POROS 50 R2 PerSeptive Biosystems (1-1159-05)). La columna R2 se equilibró y se lavó en ácido trifluoroacético al 0,1% (grado espectrométrico 99+%, Aldrich 3 02031-100 ml). Las muestras se eluyeron de la columna con solución de matriz de calidad Agilent MALDI HCCA (G2037A). La reunión de péptidos obtenida mediante la digestión con tripsina se trató con PNGasa F y se purificó en columnas R2 de POROS y se caracterizó mediante MALDI-TOF.

4. CEPO y EPO se redujeron en solución con DTT y se alquilaron con yodoacetamida. Las muestras se purificaron en una columna R1 de POROS, antes de la digestión con Glu-C. Una fracción de la muestra digerida se purificó en columnas R2 de POROS, antes del análisis MALDI-TOF. La reunión de péptidos obtenida con la digestión con Glu-C, se trató con PNGasa F y se purificó en columnas R2 de POROS.

5. Para excluir la posibilidad de tener CEPO parcialmente carbamilada, se digirieron EPO y CEPO intactas con Lys-C. Las muestras se analizaron empleando MALDI-TOF.

Como conclusión puede extraerse que las 8 lisinas y el extremo N-terminal estaban carbamilados. No se detectaron otros aminoácidos carbamilados, ni modificaciones de los glicanos.

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Referencias Identificación de proteína general mediante MS

Mann M, Hojrup P, Roepstorff P. (1993) "Use of mass spectrometric molecular weight information to identify proteins in sequence databases", Biol Mass Spectrom 22, 338-345

Yates, J R, Speicher S, Griffin P R, Hunkapiller T. (1993) "Peptide mass maps: a highly informative approach to protein identification", Anal Biochem 214, 397-408

Masa intacta

Laugesen S, Roepstorff P. (2003) "Combination of two matrices results in improved performance of MALDI MS for peptide mass mapping and protein analysis". J Am Soc Mass Spectrom. 14(9), 992-1002.

Digestión/Grafito

Larsen MR, Hojrup P, Roepstorff P. (2005) "Characterization of gel-separated glycoproteins using two-step proteolytic digestion combined with sequential microcolumns and mass spectrometry". Mol Cell Proteomics. 4(2), 107-19

Se realizaron estudios adicionales para determinar el grado y la homogeneidad de la carbamilación de EPO, la especificidad de la carbamilación y la identidad de los sitios de carbamilación, la presencia de potenciales modificaciones inespecíficas, debidas a reacciones colaterales del proceso de carbamilación y purificación. Las muestras se analizaron mediante análisis de la masa total de muestras de proteínas desglicosiladas y por cartografiado de los péptidos empleando endoproteasas LysC y tripsina para la digestión y análisis LC/MS para la evaluación de los péptidos.

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Ejemplo 2

Análisis de la masa total

El análisis se realizó en tres muestras de EPO carbamiladas, empleando el método del Ejemplo 1. Las tres muestras se purificaron después de la reacción de carbamilación, empleando intercambio aniónico, tal y como se ha descrito en el Ejemplo 1. Una de las muestras de CEPO (denominada CEPO-CMC) fue preparada mediante CMC Biotech, a partir de una escala de producción de 1 gramo (concentración: 0,82 mg/ml; tampón: Na-citrato 20 mM, ácido cítrico 0,3 mM, NaCl 0,1 M, pH 6,9-7,3). Las dos muestras restantes, denominadas CEPO-1 y CEPO-2, se prepararon a partir de una escala de producción de laboratorio de 70 mg (concentración: 1,1 mg/ml; tampón: Tris 25 mM, NaCl 0,2 M, pH 8,3-8,7). Estas muestras de CEPO se compararon con EPO no modificada o de partida (concentración: 0,82 mg/ml; tampón: Na-citrato 2 mM, ácido cítrico 0,3 mM, NaCl 0,1 M, pH 6,9-7,3) y CEPO de imitación (EPO que se ha sometido al proceso de carbamilación, sin la adición de K-cianato) (concentración: 0,38 mg/ml; tampón: Na-citrato 20 mM, ácido cítrico 0,3 mM, NaCl 0,1 M, pH 6,9-7,3).

Espectrometría de masa ESI

Antes del análisis de la masa total, las muestras de desglicosilaron enzimáticamente. Cada muestra se incubó durante una noche con 50 \mug de N-glicosidasa F (Prozyme de Glyko), neuraminidasa recombinante de A. ureafaciens y O-glicosidasa con una concentración de proteína de 0,5 mg/ml. La finalización de la reacción de desglicosilación se controló mediante SDS-PAGE, cargando 3 \mug de cada una de las muestras sobre geles de Tris-glicina al 12%. El material restante de cada una de las muestras se empleó para el análisis de masa.

Las muestras desglicosiladas se llevaron a una concentración de 4-5 M de clorhidrato de guanidinio, añadiendo el volumen adecuado de solución de carga de clorhidrato de guanidinio, y a continuación se desalaron en un tampón que contenía ácido fórmico al 2% y acetonitrilo al 40%. El clorhidrato de guanidinio se añadió para asegurar una recuperación alta de EPO y CEPO desglicosiladas, para el análisis de espectrometría de masa. La medición de la masa se efectuó con un espectrómetro de masa de Waters ESI-Q-Tof o un espectrómetro de masa de Waters ESI-LCT, provisto con una fuente de ionización de ESI-nanopulverización. La evaluación de los datos se realizó mediante desconvolución automática y mediante evaluación manual de los picos de interés específicos, con un programa informático Mass Lynx 4.0. La cuantificación de las proporciones relativas de las especies de CEPO carbamiladas de manera diferente, se realizó mediante el cálculo de las proporciones relativas basándose en las intensidades de la señal, registradas en el espectro m/z.

La desglicosilación de las muestras logró la eliminación completa de los azúcares ligados a N. Sin embargo, la liberación de los azúcares ligados a O, fue incompleta, especialmente para las muestras de CEPO.

Como se esperaba, debido a la carbamilación, las muestras de CEPO mostraban espectros de masa diferentes, en comparación con las muestras de EPO y CEPO de imitación. Tal y como se muestra en la Tabla 2, la desconvolución de los espectros produjo masas para los picos mayores, tal y como se esperaba teóricamente para las diversas muestras. En todas las muestras de CEPO, sólo se hallaron moléculas de CEPO altamente carbamiladas, en donde la isoforma principal era la isoforma completamente carbamilada, con la carbamilación completa de las 8 lisinas y el extremo N-terminal, es decir, 9 residuos de carbamilo. Las muestras de CEPO mostraban heterogeneidad en relación con el contenido de isoformas adicionales correspondientes a 8,10 y 11 residuos de carbamilo fijados a la CEPO. La especie que contenía 8 residuos de carbamilo se designará hipocarbamilada, y carece al menos de un residuo de carbamilo. La especie con 10 y 11 residuos de carbamilo se denominará hipercarbamilada, en donde los residuos de carbamilo extra fijados, se unirán de forma inespecífica a un aminoácido distinto de lisina. Hubo algunas señales menores en los espectros de todas las muestras, pero ninguna se consideró que fuera una especie modificada de forma no específica. Algunas de las señales menores se hallaron en ambas muestras, EPO y CEPO, y se consideraron contaminantes ya presentes en la EPO inicial.

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TABLA 2 Masas desconvolucionadas (del inglés, "deconvolved") de muestras de CEPO y EPO desglicosiladas obtenidas en el análisis de masa total

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La Tabla 3 muestra las proporciones relativas de varias isoformas. La CEPO hipocarbamilada varía desde aproximadamente 1,5 hasta 5,5% de la CEPO total, dependiendo de la muestra y la CEPO hipercarbamilada varía desde aproximadamente 11 hasta 22% dependiendo de la muestra. CEPO-1 y CEPO-2 tienen una distribución similar de las isoformas, mientras que CEPO-CMC tiene menos especies hipocarbamiladas, en comparación con las otras dos muestras. Las diferentes escalas de producción lograron productos con diferente distribución, aunque tal y como se muestra en la Tabla 3, para la escala de producción de laboratorio, la producción puede repetirse con un resultado similar. Tal y como se ha descrito anteriormente, a una escala de producción cualquiera, la distribución puede adaptarse, ajustando la reunión de la columna de intercambio aniónico.

Los números de la Tabla 3 representan una proporción mínima de CEPO hipocarbamilada e hipercarbamilada. La razón para de ello, es que el grado de carbamilación (8 a 11 veces) no puede especificar el grado exacto de CEPO hipocarbamilada, completa e hipercarbamilada. Por ejemplo, una molécula de CEPO que contiene 8 residuos de carbamilo, según lo que se ha determinado por el análisis de la masa, puede tener sólo 7 grupos carbamilo ligados específicamente a lisinas y el residuo de carbamilo restante estaría fijado inespecíficamente a otro aminoácido. Esta situación se consideraría sólo como hipocarbamilada, incluso cuando haya grupos carbamilo unidos de forma no específica. De manera inversa, una molécula de CEPO que contiene 10 residuos de carbamilo, puede tener fijados sólo 8 residuos de manera específica y dos unidos de forma no específica. En esta situación, la isoforma de CEPO se considera solo hipercarbamilada, aún cuando ninguna de todas las lisinas esté carbamilada.

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TABLA 3 Grado de heterogeneidad de la carbamilación: Proporciones relativas de especies de CEPO carbamiladas de manera diferente

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* n=2 **n=1

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Ejemplo 3

Cartografiado de péptidos con LysC

El análisis del cartografiado de los péptidos de las muestras de EPO y CEPO se realizó empleando las endoproteasas LysC y tripsina para la fragmentación. Todos los análisis de cartografiado de péptidos se llevaron a cabo con péptidos desglicosilados. La desglicosilación enzimática de los péptidos se realizó simultáneamente con la digestión con la endoproteasa.

Las muestras de EPO y CEPO (aproximadamente 150 \mug de cada una) se desnaturalizaron y se redujeron mediante incubación con clorhidrato de guanidinio y DTT. Los grupos sulfhidrilo libres se alquilaron con ácido yodoacético. Las muestras alquiladas se desalaron y el tampón se cambió por el tampón adecuado, usando columnas de filtración en gel de un solo uso.

La endoproteasa, la N-glicosidasa y la neuraminidasa se añadieron simultáneamente a las muestras de EPO y CEPO alquiladas. Las muestras se incubaron durante una noche a 37ºC. Después de incubar, se aplicaron aproximadamente 5 \mug de cada digestión para un análisis RP-HPLC/MS, empleando una columna Jupiter, C18 RP de Phenomenix, acoplada a un instrumento ESI-LCT de Waters. Se registró la señal UV a 220 nm y el recuento iónico total (TIC) en el espectrómetro de masa. Para identificar y cuantificar los péptidos obtenidos, se evaluó el TIC.

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Debido a que LysC no era capaz de disociar lisinas carbamiladas, se esperó que no se formaran fragmentos por digestión con LysC, si todas las lisinas estaban carbamiladas, indicando la especificidad de la carbamilación. En el caso de hipocarbamilación, deben formarse fragmentos específicos de CEPO. La Tabla 4 cita los fragmentos formados teóricamente a partir de la digestión con LysC de EPO, CEPO completa e hipercarbamilada y CEPO hipocarbamilada.

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TABLA 4 Cartografiado de péptidos LysC: Listas de péptido/fragmentos formados teóricamente a partir de la digestión con LysC de EPO, CEPO completa e hipercarbamilada y CEPO hipocarbamilada

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Tal y como se esperaba, el patrón de péptidos con LysC obtenido para las muestras de EPO y CEPO digeridas con LysC era completamente diferente. La digestión de EPO inicial y de CEPO de imitación con LysC, produjo el patrón de péptidos esperado. En ambas muestras, se pudieron identificar todos los péptidos K1 a K9. Los péptidos K5 y K1 se disociaron en forma parcial de manera inespecífica, tanto en EPO como en CEPO de imitación. No se pudieron identificar picos adicionales significativos, ni picos perdidos en el mapa con LysC de CEPO de imitación, en comparación con EPO inicial. A partir de esta información, se puede concluir que no se produjeron modificaciones covalentes no específicas, significativas de la proteína EPO, durante el proceso de carbamilación y de purificación.

Los mapas peptídicos de las muestras de CEPO tenían un patrón peptídico diferente de la EPO inicial. Sólo había un pico principal aislado y varios picos secundarios. Tal y como se muestra en la Tabla 5, las masas obtenidas a partir de los picos, se correlacionaron bien con las masas esperadas, bien para la CEPO sin disociar como para los fragmentos procedentes de la escisión con LysC de la CEPO hipocarbamilada. El pico principal (A) contenía CEPO intacta, desglicosilada, completamente carbamilada (9x carbamilos) y CEPO hipercarbamilada (10x carbamilos) (Tabla 5). Los cuatro picos secundarios (B-E) contenían CEPO hipocarbamilada (8x carbamilos), los diferentes picos que contenían CEPO hipocarbamilada no estaban carbamilados en ciertas lisinas. Los picos B y C contenían CEPO hipocarbamilada que carecía específicamente de carbamilación en Lys45, mientras que los picos D y E contenían CEPO hipocarbamilada que carecía específicamente de carbamilación en Lys97 (Tabla 5).

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 5 Cartografiado de péptidos con LysC: Asignación de masas obtenidas experimentalmente para fragmentos de CEPO que se habían obtenido teóricamente a partir de CEPO hipocarbamilada

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Había algunas diferencias en las proporciones relativas de los picos para las diferentes muestras de CEPO. Las muestras de CEPO 1 y 2 tenían picos D y E más prominentes que CEPO-CMC, lo que indicaba que contenían más especies de CEPO hipocarbamilada.

Era difícil cuantificar los picos secundarios en relación con el pico principal, debido a las limitaciones técnicas. Sin embargo, usando las áreas pico de la detección con UV, como una indicación en bruto de las proporciones relativas de las distintas especies, se puedo calcular que la CEPO hipocarbamilada puede representar menos del 10% de las isoformas de CEPO en la muestra y que la CEPO-1 y la CEPO-2 tienen el doble de isoformas hipocarbamiladas que la CEPO-CMC. Empleando el mismo procedimiento que el utilizado para el análisis de masa total, la cuantificación de las especies hipercarbamiladas ubicadas en el pico A, fue aproximadamente 21% para CEPO-CMC y 12% para CEPO-1 y CEPO-2.

En general, los datos procedentes del cartografiado de los péptidos con LysC concuerda en gran medida con el análisis de masa total descrito en el Ejemplo 2. CEPO-CMC contenía menos isoformas de CEPO hipocarbamiladas, mientras que CEPO-1 y CEPO-2 contenían más isoformas de CEPO hipercarbamiladas. Este cartografiado de péptidos también indicaba que la lisina 45 y la lisina 97 pueden representar sitios de hipocarbamilación.

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Ejemplo 4

Cartografiado de péptidos con tripsina

La digestión de la muestra empleando tripsina se describe en el Ejemplo 3.

La digestión de EPO y de CEPO de imitación con tripsina dio como resultado un patrón peptídico tal y como se esperaba. En ambas muestras, se pudo identificar la mayoría de los péptidos (T1 a T21) esperados de la digestión con tripsina, excepto algunos di- y tripéptidos pequeños (tal como T21). Véase la Tabla 6. Como en el caso de la digestión con LysC, no había picos adicionales significativos, ni picos perdidos de la CEPO de imitación, en comparación con la EPO inicial. A partir de estos datos, se llegó a la conclusión de que no había modificaciones covalentes inespecíficas de la proteína EPO durante el proceso de carbamilación y de purificación.

Los patrones peptídicos de las muestras de CEPO eran diferentes de los de la EPO no modificada. La tripsina normalmente corta la lisina y la arginina, por lo tanto, se esperaría que en el caso de la EPO completamente carbamilada sólo tuviera lugar la fragmentación por el corte de las argininas. En consecuencia, después de obtener el patrón peptídico con tripsina, se pudieron identificar los sitios de carbamilación específicos y los péptidos carbamilados inespecíficamente. Los péptidos esperados de una digestión con tripsina de las moléculas de CEPO, dando por hecho que sólo se escindían las argininas (R), se exponen en la Tabla 6.

TABLA 6 Lista de péptidos esperados para EPO y CEPO digeridas con tripsina

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Todos los péptidos esperados de la escisión con tripsina se identificaron como picos principales en todas las muestras de CEPO, con la excepción del péptido R13 C-terminal. Este péptido tampoco se encontró en la EPO inicial o en la CEPO de imitación. Los picos de R1 a R12 resultantes de la digestión específica sólo de argininas, representaban la gran mayoría de los péptidos detectados en las muestras de CEPO. Además, todos los péptidos que contenían lisina se detectaron casi exclusivamente en la forma totalmente carbamilada. Estos datos indican un alto grado de carbamilación específica en las lisinas y en el extremo N-terminal.

Además del péptido principal, también se detectaron seis péptidos secundarios en todas las muestras de CEPO. Tres de los péptidos secundarios se identificaron por análisis de masa, como el resultado de la escisión con tripsina de la CEPO hipercarbamilada y los tres restantes como resultado de la CEPO hipocarbamilada.

La Tabla 7 cita todos los péptidos identificados en los mapas con tripsina de las tres muestras de CEPO analizadas. Los péptidos abundantes, R1 a R12, formados a partir de EPO completa y específicamente carbamilada, están en letras normales; también se presenta la EPO correctamente carbamilada con letra en negrita. Los péptidos que se formaron lo más probable por escisión de la CEPO hipocarbamilada, se presentan con letra en negrita y los péptidos formados por escisión de la CEPO hipercarbamilada se presentan con letras subrayadas.

TABLA 7 Mapa peptídico con tripsina: Lista de péptidos identificados en el mapa peptídico con tripsina de CEPO

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En relación con la Tabla 7, los picos secundarios T9 y T10 que contienen los péptidos R6_a1 y R6_b1, respectivamente, se obtienen con mayor probabilidad de la escisión de moléculas de CEPO hipocarbamiladas que no están carbamiladas en Lys97. El péptido R4_b1+1xcarb se forma si el aminoácido Lys45 no está carbamilado. El péptido R6_a1 (pico T9) es más abundante en las muestras de CEPO-1 y de CEPO-2 que en CEPO-CMC, indicando que las primeras pueden tener el doble de la cantidad de CEPO hipocarbamilada. Los péptidos R6_b1 y R4_b1+1xcarb estaban presentes en cantidades iguales en todas las muestras de CEPO.

El cálculo del contenido relativo de CEPO hipocarbamilada procedente de estos datos era difícil debido a limitaciones técnicas. Sin embargo, tomando todas las observaciones en conjunto, se estimó que la especie hipocarbamilada era aproximadamente el 10%, tal y como se dedujo a partir del análisis de masa total y del cartografiado de péptidos con LysC.

De los otros tres péptidos secundarios que coeluían con otros péptidos, se interpretó por la masa que contenían, un residuo de carbamilo extra, es decir, CEPO hipercarbamilada. Los péptidos R10_2xcarb y R7_1xcarb se detectaron en cantidades mínimas, hallándose que R12_3xcarb tenía intensidades de señal significativas. CEPO-CMC tenía un contenido dos veces superior de la especie de CEPO hipercarbamilada que CEPO-1 y CEPO-2. Esto concuerda con los resultados obtenidos del análisis de masa total. También se podría concluir a partir de estos datos que la secuencia de aminoácidos desde 151-62 de EPO es un sitio para carbamilación inespecífica.

Nuevamente, por las mismas razones que para la cuantificación de la hipocarbamilación, la cuantificación de especies hipercarbamiladas fue difícil. Sin embargo, asumiendo que la eficacia de la ionización de los péptidos que sólo difieren en el grado de carbamilación, es similar, se calculó con el recuento iónico relativo de los derivados de R12, que aproximadamente 3-7% de la CEPO era una especie hipercarbamilada. Esto es inferior a la cantidad de isoformas hipercarbamiladas calculada por el análisis de masa total.

En general, se puede concluir lo siguiente a partir del análisis de masa total y de la información del cartografiado peptídico de la EPO y la CEPO.

A partir del análisis de masa total, las muestras de CEPO parecían carbamilarse en un grado bastante alto. Aproximadamente el 95-98% de todas las moléculas estaban totalmente carbamiladas y contenían al menos 9 residuos de carbamilo (véase la Tabla 3). El cartografiado con LysC y tripsina confirma que el alto grado de carbamilación en sitios específicos y que lo más probable, más del 95% de las moléculas de CEPO estaban totalmente carbamiladas en las 8 lisinas y el extremo N-terminal.

Los datos también mostraban que se hallaron cuatro isoformas de CEPO. Se detectaron especies con 8, 9, 10 y 11 residuos de carbamilo en las muestras de CEPO analizadas, siendo la isoforma con 9 carbamilos la especie dominante. Una porción menor de las moléculas de CEPO contenían 8 residuos de carbamilo en lugar de 9 y se consideraron hipocarbamiladas. Para CEPO-1 y CEPO-2 estas isoformas eran aproximadamente el 5% del total y para CEPO-CMC, esta isoforma formaba aproximadamente el 1,5% de las moléculas de CEPO totales.

Una porción más significativa de las moléculas de CEPO estaba hipercarbamilada, es decir, contenían 10 o 11 residuos de carbamilo. La CEPO hipercarbamilada variaba desde aproximadamente 11% para CEPO-1 y CEPO-2 hasta aproximadamente 22% en CEPO-CMC.

Los datos procedentes del cartografiado de los péptidos, mostraban un alto grado de especificidad de la carbamilación en las 8 lisinas y en el extremo N-terminal. Además, el cartografiado de los péptidos confirmaba generalmente los resultados del análisis de masa total. Por lo menos, aproximadamente 90-95% de las moléculas de CEPO parecían estar modificadas específicamente con residuos de carbamilo en todas las lisinas y en el extremo N-terminal. Sin embargo, esta información también mostraba la hipercarbamilación y la hipocarbamilación de especies de CEPO. Debido a algunas limitaciones técnicas, la relación exacta de especies hipocarbamiladas fue difícil de establecer, pero se estimó que estaba en el intervalo de hasta aproximadamente 10%, lo que concuerda con los números hallados en el análisis de masa total. Además, se identificaron dos posiciones diferentes sobre la EPO, Lys45 y Lys97, en las que la probabilidad de que no tuviera lugar la carbamilación era más alta.

En ambos grupos cartográficos peptídicos, se hallaron también especies hipercarbamiladas. Nuevamente, debido a limitaciones técnicas, la cantidad exacta de especies hipercarbamiladas fue difícil de cuantificar. A partir de los datos obtenidos, se podía especular que se detectaron muy pocas especies hipercarbamiladas en el cartografiado de los péptidos. Sólo de un tercio a la mitad de la cantidad de especies hipercarbamiladas, se identificó con el cartografiado peptídico, en comparación con el análisis de masa total. Una explicación razonable de esta discrepancia es que no se identificaron todos los péptidos hipercarbamilados o que no se identificaron en la cantidad correcta. En el mapa de LysC, se detectó una especie de CEPO sin digerir que contenía 10 residuos de carbamilo en cantidades significativas y en el cartografiado con tripsina se detectaron tres péptidos que contenían un residuo de carbamilo extra. Dos de estos fragmentos se detectaron sólo en cantidades mínimas. El tercer péptido, los aminoácidos 152-162 del péptido CEPO, próximo al extremo C-terminal, parece representar un tercio de la hipercarbamilación, y puede tratarse de un sitio para la carbamilación no específica en EPO.

No se detectaron cantidades significativas de otras modificaciones no específicas (no relacionadas con carbamilo) en las muestras de CEPO o en las muestras de CEPO de imitación, con ninguno de los análisis realizados.

Claims (75)

1. Un método para producir una proteína eritropoyetina carbamilada que tiene menos de aproximadamente 40% de proteína agregada y menos de aproximadamente 40% en peso de proteína hipocarbamilada e hipercarbamilada, medida por espectrometría de masa ESI, comprendiendo dicho método poner en contacto una cantidad de eritropoyetina con una cantidad de cianato a una temperatura, un pH y durante un periodo de tiempo suficiente para que los grupos amino en las lisinas y en los aminoácidos del extremo N-terminal de la eritropoyetina, se carbamilen al menos en aproximadamente un 90%.

2. El método según la reivindicación 1, en el que la proteína eritropoyetina carbamilada es eritropoyetina humana.

3. El método según la reivindicación 1, en el que la proteína eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 30% de proteína agregada.

4. El método según la reivindicación 1, en el que la proteína eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 20% de proteína agregada.

5. El método según la reivindicación 1, en el que la proteína eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 10% de proteína agregada.

6. El método según la reivindicación 1, en el que la proteína eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 30% en peso de proteína hipercarbamilada e hipocarbamilada.

7. El método según la reivindicación 1, en el que la proteína eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 20% en peso de proteína hipercarbamilada e hipocarbamilada.

8. El método según la reivindicación 1, en el que la proteína eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 10% en peso de proteína hipercarbamilada e hipocarbamilada.

9. El método según la reivindicación 1, en el que la proteína eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 30% en peso de proteína hipercarbamilada.

10. El método según la reivindicación 1, en el que la proteína eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 20% en peso de proteína hipercarbamilada.

11. El método según la reivindicación 1, en el que la proteína eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 10% en peso de proteína hipercarbamilada.

12. El método según la reivindicación 1, en el que la concentración de proteína eritropoyetina puesta en contacto con el cianato es desde aproximadamente 0,05 mg/ml hasta aproximadamente 10 mg/ml.

13. El método según la reivindicación 1, en el que la concentración de proteína eritropoyetina puesta en contacto con el cianato es desde aproximadamente 2 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml.

14. El método según la reivindicación 1, en el que la concentración del cianato es desde aproximadamente 0,05 M hasta aproximadamente 10 M.

15. El método según la reivindicación 1, en el que la concentración del cianato es desde aproximadamente 0,05 M hasta aproximadamente 2 M.

16. El método según la reivindicación 1, en el que la temperatura varía desde aproximadamente 0ºC hasta aproximadamente 60ºC.

17 El método según la reivindicación 1, en el que la temperatura varía desde aproximadamente 30ºC hasta aproximadamente 34ºC.

18. El método según la reivindicación 1, en el que el pH es desde aproximadamente 7 hasta aproximadamente 11.

19. El método según la reivindicación 1, en el que el pH es desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 10.

20. El método según la reivindicación 1, en el que el periodo de tiempo es desde aproximadamente 10 minutos hasta aproximadamente 30 días.

21. El método según la reivindicación 1, en el que el periodo de tiempo es desde aproximadamente 1 hora hasta aproximadamente 5 días.

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22. El método según la reivindicación 1, en el que la proteína eritropoyetina se pone en contacto con el cianato en presencia de un tampón.

23. El método según la reivindicación 22, en el que el tampón es borato.

24. El método según la reivindicación 22, en el que la concentración del tampón es desde aproximadamente 0,05 M hasta aproximadamente 2 M.

25. El método según la reivindicación 22, en el que la concentración del tampón es desde aproximadamente 0,1 M hasta aproximadamente 1 M.

26. El método según la reivindicación 22, en el que la concentración del tampón es de aproximadamente 0,5 M.

27. El método según la reivindicación 1, en el que la concentración de la proteína eritropoyetina que se ha puesto en contacto con el cianato es desde aproximadamente 0,05 mg/ml hasta aproximadamente 10 mg/ml, la concentración del cianato es desde aproximadamente 0,05 M hasta aproximadamente 10 M, la temperatura varía desde aproximadamente 0ºC hasta aproximadamente 60ºC, el pH es desde aproximadamente 7 hasta aproximadamente 11, y el tiempo es desde aproximadamente 10 minutos hasta treinta días.

28. El método según la reivindicación 1, en el que la concentración de la proteína eritropoyetina que se ha puesto en contacto con el cianato es desde aproximadamente 2 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, la concentración del cianato es desde aproximadamente 0,05 M hasta aproximadamente 2 M, la temperatura varía desde aproximadamente 30ºC hasta aproximadamente 34ºC, el pH es desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 10, y el tiempo es desde aproximadamente 1 hora hasta 5 días.

29. El método según la reivindicación 1, en el que la concentración de proteína eritropoyetina que se ha puesto en contacto con el cianato es aproximadamente 3 mg/ml, la concentración del cianato es aproximadamente 0,5 M, la temperatura es aproximadamente 32ºC, el pH es aproximadamente 9,0, y el periodo de tiempo es de aproximadamente 24 horas.

30. Un método para producir una proteína eritropoyetina carbamilada que tiene menos de aproximadamente 3% de proteína agregada y menos de aproximadamente 40% en peso de proteína hipercarbamilada e hipocarbamilada, tal y como se mide con espectrometría de masa ESI, que comprende purificar la eritropoyetina carbamilada empleando intercambio aniónico, intercambio catiónico, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de fase inversa, cromatografía de afinidad o cromatografía de exclusión por tamaño.

31. El método según la reivindicación 30, en el que la proteína eritropoyetina carbamilada es eritropoyetina humana.

32. El método según la reivindicación 30, en el que al menos aproximadamente 90% de los residuos de amina en las lisinas y en el aminoácido N-terminal de la eritropoyetina están carbamilados.

33. El método según la reivindicación 30, en el que la proteína eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 2,5% de proteína agregada.

34. El método según la reivindicación 30, en el que la proteína eritropoyetina carbamilada tiene aproximadamente 0,5% o menos de proteína agregada.

35. El método según la reivindicación 30, en el que la proteína eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 30% en peso de proteína hipercarbamilada e hipocarbamilada.

36. El método según la reivindicación 30, en el que la proteína eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 20% en peso de proteína hipercarbamilada e hipocarbamilada.

37. El método según la reivindicación 30, en el que la proteína eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 10% en peso de proteína hipercarbamilada e hipocarbamilada.

38. El método según la reivindicación 30, en el que la proteína eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 30% en peso de proteína hipercarbamilada.

39. El método según la reivindicación 30, en el que la proteína eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 20% en peso de proteína hipercarbamilada.

40. El método según la reivindicación 30, en el que la proteína eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 10% en peso de proteína hipercarbamilada.

41. Un método para producir una proteína eritropoyetina carbamilada que tiene menos de aproximadamente 3% de proteína agregada y menos de aproximadamente 40% en peso de proteína hipercarbamilada e hipocarbamilada, tal y como se mide con espectrometría de masa ESI, cuyo método comprende:

(a) poner en contacto una proteína eritropoyetina con una cantidad de cianato a una temperatura, un pH y durante un periodo de tiempo suficiente para que se carbamile al menos aproximadamente 90% de los residuos con grupos amino en la lisina y en los aminoácidos del extremo N-terminal de la eritropoyetina; y

(b) purificar la proteína eritropoyetina carbamilada empleando cromatografía de intercambio aniónico, de intercambio catiónico, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de fase inversa, cromatografía de afinidad o cromatografía de exclusión por tamaño.

42. El método según la reivindicación 41, en el que la proteína eritropoyetina carbamilada es eritropoyetina humana.

43. El método según la reivindicación 41, en el que la proteína eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 2,5% de proteína agregada.

44. El método según la reivindicación 41, en el que la proteína eritropoyetina carbamilada tiene aproximadamente 0,5% o menos de proteína agregada.

45. El método según la reivindicación 41, en el que la proteína eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 30% en peso de proteína hipercarbamilada e hipocarbamilada.

46. El método según la reivindicación 41, en el que la proteína eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 20% en peso de proteína hipercarbamilada e hipocarbamilada.

47. El método según la reivindicación 41, en el que la proteína eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 10% en peso de proteína hipercarbamilada e hipocarbamilada.

48. El método según la reivindicación 41, en el que la proteína eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 30% en peso de proteína hipercarbamilada.

49. El método según la reivindicación 41, en el que la proteína eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 20% en peso de proteína hipercarbamilada.

50. El método según la reivindicación 41, en el que la proteína eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 10% en peso de proteína hipercarbamilada.

51. El método según la reivindicación 41, en el que la concentración de proteína eritropoyetina puesta en contacto con el cianato es desde aproximadamente 0,05 mg/ml hasta aproximadamente 10 mg/ml.

52. El método según la reivindicación 41, en el que la concentración de proteína eritropoyetina puesta en contacto con el cianato es desde aproximadamente 2 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml.

53. El método según la reivindicación 41, en el que la concentración de la proteína eritropoyetina que se pone en contacto con el cianato es de aproximadamente 3 mg/ml.

54. El método según la reivindicación 41, en el que la concentración del cianato es desde aproximadamente 0,05 M hasta aproximadamente 10 M.

55. El método según la reivindicación 41, en el que la concentración del cianato es desde aproximadamente 0,05 M hasta aproximadamente 2 M.

56. El método según la reivindicación 41, en el que la concentración del cianato es de aproximadamente 0,5 M.

57. El método según la reivindicación 41, en el que la temperatura varía desde aproximadamente 0ºC hasta aproximadamente 60ºC.

58. El método según la reivindicación 41, en el que la temperatura varía desde aproximadamente 30ºC hasta aproximadamente 34ºC.

59. El método según la reivindicación 41, en el que la temperatura es de aproximadamente 32ºC.

60. El método según la reivindicación 41, en el que el pH es desde aproximadamente 7 hasta aproximadamente 11.

61. El método según la reivindicación 41, en el que el pH es desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 10.

62. El método según la reivindicación 41, en el que el pH es aproximadamente 9.

63. El método según la reivindicación 41, en el que el periodo de tiempo es desde aproximadamente 10 minutos hasta aproximadamente 30 días.

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64. El método según la reivindicación 41, en el que el periodo de tiempo es desde aproximadamente 1 hora hasta aproximadamente 5 días.

65. El método según la reivindicación 41, en el que el periodo de tiempo es aproximadamente 24 horas.

66. El método según la reivindicación 41, en el que la proteína eritropoyetina se pone en contacto con el cianato en presencia de un tampón.

67. El método según la reivindicación 66, en el que el tampón es borato.

68. El método según la reivindicación 66, en el que la concentración del tampón es desde aproximadamente 0,05 M hasta aproximadamente 2 M.

69. El método según la reivindicación 66, en el que la concentración del tampón es desde aproximadamente 0,1 M hasta aproximadamente 1 M.

70. El método según la reivindicación 66, en el que la concentración del tampón es de aproximadamente 0,5 M.

71. El método según la reivindicación 41, en el que la concentración de la proteína eritropoyetina que se ha puesto en contacto con el cianato es desde aproximadamente 0,05 mg/ml hasta aproximadamente 10 mg/ml, la concentración del cianato es desde aproximadamente 0,05 M hasta aproximadamente 10 M, la temperatura varía desde aproximadamente 0ºC hasta aproximadamente 60ºC, el pH es desde aproximadamente 7 hasta aproximadamente 11, y el tiempo es desde aproximadamente 10 minutos hasta treinta días.

72. El método según la reivindicación 41, en el que la concentración de la proteína eritropoyetina que se ha puesto en contacto con el cianato es desde aproximadamente 2 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, la concentración del cianato es desde aproximadamente 0,05 M hasta aproximadamente 2 M, la temperatura varía desde aproximadamente 30ºC hasta aproximadamente 34ºC, el pH es desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 10, y el tiempo es desde aproximadamente 1hora hasta 5 días.

73. El método según la reivindicación 34, en el que la concentración de proteína eritropoyetina que se ha puesto en contacto con el cianato es aproximadamente 3 mg/ml, la concentración del cianato es aproximadamente 0,5 M, la temperatura es aproximadamente 32ºC, el pH es aproximadamente 9,0, y el periodo de tiempo es de aproximadamente 24 horas.

74. Un método para producir una proteína eritropoyetina carbamilada que tiene menos de aproximadamente 40% de proteína agregada y menos de aproximadamente 40% en peso de proteína hipercarbamilada e hipocarbamilada, comprendiendo dicho método poner en contacto una cantidad de eritropoyetina con una cantidad de cianato a una temperatura, un pH y durante un periodo de tiempo suficiente para que los grupos amino de las lisinas y de los aminoácidos N-terminales de la eritropoyetina se carbamilen al menos aproximadamente un 90% y en donde la eritropoyetina se pone en contacto con el cianato en presencia de borato potásico.

75. Un método para producir una proteína eritropoyetina carbamilada que tiene menos de aproximadamente 40% de proteína agregada y menos de aproximadamente 40% en peso de proteína hipercarbamilada e hipocarbamilada, comprendiendo dicho método poner en contacto una cantidad de eritropoyetina con una cantidad de cianato a una temperatura de 30ºC a 34ºC, un pH, y durante un periodo de tiempo suficiente para que los grupos amino en las lisinas y en los aminoácidos N-terminales de la eritropoyetina se carbamilen al menos aproximadamente un 90%.

76. Un método para producir una proteína eritropoyetina carbamilada que tiene menos de aproximadamente 40% de proteína agregada y menos de aproximadamente 40% en peso de proteína hipercarbamilada e hipocarbamilada, comprendiendo dicho método poner en contacto una cantidad de eritropoyetina con una cantidad de cianato a una temperatura, un pH, y durante un periodo de tiempo suficiente para que los grupos amino en las lisinas y en los aminoácidos N-terminales de la eritropoyetina se carbamilen al menos aproximadamente un 90%, y en donde la proteína eritropoyetina carbamilada se purifica empleando cromatografía de intercambio aniónico, mientras que el pH del tampón del proceso y del tampón de elución se mantiene a 8,5 \pm 0,2.