KR20070032000A - 신규 카르바밀화된 ｅｐｏ 및 그의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규 카르바밀화된 에리스로포이에틴의 제조 방법 및 신규 카르바밀화된 에리스로포이에틴을 포함하는 조성물 및 이를 포함하는 약학적 조성물 및 그의 용도를 개시한다.

신규 카르바밀화된 에리스로포이에틴

Description

신규 카르바밀화된 ＥＰＯ 및 그의 제조 방법 {NOVEL CARBAMYLATED EPO AND METHOD FOR ITS PRODUCTION}

본 발명은 신규 화합물뿐만 아니라, 상기 화합물의 제조 방법에 관한 것이다. 신규 화합물인 카르바밀화된 에리스로포이에틴 (CEPO) 은 분자의 리신의 모든 또는 대부분의 1 차 아민 및 N-말단 아미노산 상에서 카르바밀화되어 있는 것을 특징으로 하며, 또한 상기 화합물은 분자 내에서 다른 아미노산의 1 차 아민의 카르바밀화의 수준은 낮다. 더욱이, 본 신규 화합물은 응집된 단백질 및 중합체가 없고, 예를 들어 주요 EPO 수용체를 발현하는 기타 조직 및 중추 또는 말초 신경계에서의 질환의 치료를 위한 약학적 조성물에서의 용도에 적합하다. 본 제조 방법의 하나의 다른 놀랄만한 이점은, 본 방법이 에리스로포이에틴에 대해 기술된 기타 공지된 카르바밀화 방법으로부터 달성된 생성물보다, 응집된 단백질 및 중합체를 거의 함유하지 않는 생성물을 제공한다는 사실이다.

카르바밀화된 EPO 의 생물학적 조혈 작용의 손상은 [Satake, R. 등 (1990) Biochimica et Biophysica Acta ; 1038: 125-129 및 Mun, K-C. and Golper, T.A. (2000) Blood Purif.; 18 : 13 - 17] 에 나타나 있다. Brines 등의 2003 년 미국 특허 출원 20030072737 은 조혈 작용의 손실이 EPO 의 조직 보호 특성을 방해하 지 않았음을 나타내었다.

단백질의 카르바밀화는 단백질의 정제에서 우레아를 사용한 부작용으로서 그리고 높은 우레아 혈청 농도의 결과로서 널리 알려져 있다. 이는, 우레아의 시아네이트로의 자발적인 분해에 의해 야기된다. 시아네이트는 단백질의 1 차 아민의 카르바밀화를 맡고 있어서, 단백질의 N-말단 및 리신이 카르바밀화되기 쉽다 (도 1). 추가로, 카르바밀화되기 쉬운 기타 잠재적인 아미노산 잔기는 아르기닌, 시스테인, 티로신, 아스파르트산, 글루탐산 및 히스티딘이나, 반응은 pH 의존적이고, N-말단 및 리신 잔기와 함께 쉽게 수행되지 않는다.

단백질의 카르바밀화가 단백질의 생물학적 작용을 향상 또는 손상시킬 수 있는지 알아보기 위한 연구가 [Hoerkkoe, S. 등 (1992) Kidney International.; 41 : 1175 - 1181, Plapp, B.V. 등 (1971) Jour. Biol. Chem.; 246 (4) : 939 - 945, Satake, R. 등 (1990) Biochimica et Biophysica Acta; 1038 : 125 - 129 및 Mun, K-C. and Golper, T.A. (2000) Blood Purif.; 18 : 13 - 17] 에 의해 수행되었다. 그들은 시아네이트 원으로서 KCNO 를 사용함으로써 단백질의 카르바밀화의 생물학적 효과를 연구하였다. 그들은 모두 증가된 카르바밀화의 결과로서 생물학적 작용에서의 감소 또는 변화를 관찰하였다. 카르바밀화의 정도의 평가를 2 가지 분석 방법을 바탕으로 하였다 :

1. 트리니트로벤젠술폰산 (TNBS) 어세이를 사용하여 자유 아미노기에서의 감소의 측정 및

2. 호모시트룰린 잔기로 전환된 리신을 결정하는 아미노산 분석.

Hoerkkoe S. 등 (1992) 은 2 M KCNO 로 37℃ 에서 최대 6 시간 동안 저-농도 지질단백질을 카르바밀화시켰으나, TNBS 어세이로 측정된 바와 같은 완전히 카르바밀화된 단백질을 수득하지 못했다.

Plapp, B.V. 등 (1971) 은 시간의 효과를 연구하고, 37℃ 에서 1 M KCNO 로 24 시간 처리 후 거의 완전히 카르바밀화된 소 췌장 데옥시리보뉴클레아제 A 를 수득하였다.

Mun, K-C. 및 Golper, T.A. (2000) 는 2 M KCNO 를 사용하여 최대 6 시간의 반응 시간을 사용한 시간의 효과를 연구하였다. 그들은 또한 6 시간의 모든 반응을 37℃에서 수행하고 KCNO 농도를 증가시키는 효과를 연구하였다. Mun, K-C. 및 Golper, T.A. (2000) 는 실험 디자인으로부터는 카르바밀화의 정확한 정도를 증명할 수 없었다 (페이지 16 의 33 - 35 줄 참조).

본 출원인은 이제 본 발명에서 EPO 의 카르바밀화가 중합체 및 응집체를 제공하고, 그것들을 생약학제로서 부적합하도록 만든다는 사실을 발견하였다. 또한, 본 출원인은 상기 중합체 및 응집체의 정보가 카르바밀화를 위한 공정 조건에 의존한다는 것을 발견하였다. 따라서, pH, 시간, 시아네이트 농도, 온도, 단백질 농도 및 가장 중요하게는 단백질 중합의 정도에 관한 최적의 변수를 갖는 방법의 개발이 필요하였다. 본 발명은 낮은 정도의 중합 및 응집을 갖는 생성물을 제공하는 최적의 카르바밀화 방법을 포함하고, 더욱이, 놀랍게도, 본 출원인은 N-말단 및 모든 리신 잔기 (모든 리신 잔기는 특정 pH-범위에서 발생함) 에서 목표로 하는 완전히 카르바밀화된 EPO 가 수득되었음을 발견하였다. 본 발명의 방법의 후속 단계는 형성된 응집체 및 중합체를 제거하기 위해 이루어졌다. 생성 카르바밀화된 순수한 EPO 는 신규 화합물이고, 화합물을 포함하는 약학적 조성물과 함께 본 출원에서와 같이 청구된다.

이미 카르바밀화의 정도는 시아네이트 농도 및 시간에 의존한다는 것을 예시하였다. 그러나, 생약학제의 제조를 위한 측정가능한 카르바밀화 방법을 수득하는 방법에 대해서는 기술되어 있지 않다.

차선의 제조에 의한 응집체의 존재는 항체의 유도와 연관되어 있다. 따라서, 응집체의 존재는 인간에 사용하기에 부적합한 생약학적 제조물을 초래한다.

본 발명에서 기술된 카르바밀화 및 정제 방법은 가능한 한 중합체 또는 응집체의 최저 형성을 갖는 완전히 카르바밀화되고, 최종 생성물의 최소의 손실을 갖는 것을 특징으로 하는 단백질을 초래한다. 그러므로, 경제적으로 성장할 만한 단계가 되게 한다.

카르바밀화된 단백질의 추가의 공정은, 생성물이 응집체 및 중합체로 인한 단백질에 대한 면역학적 반응의 발생 위험이 단지 최소인 생약학제로서 유용하게 되도록 한다.

완전 카르바밀화의 평가를 위한 분석 방법은 아미노산 분석 외에도 ; 자유 1 차 아미노기에 대한 TNBS 및 마침내 MALDI-TOF 에 의한 생성물 및 분해된 생성물의 특징화이다.

분자의 N-말단 및 리신에 있는 자유 아미노기 상에서 완전히 카르바밀화되며, 추가로 2.5% 초과의 함량으로 집합되지도 중합되지도 않고, 최소의 과다 (over)- 또는 하위 (under)-카르바밀화된 에리스로포이에틴을 함유하는 에리스로포이에틴인 본 발명의 신규 화합물은 고유의 에리스로포이에틴의 신경보호적 효과에 대해 반응성인 질환의 치료를 위한 약학적 조성물의 제조에 사용될 수 있다.

발명의 개요

본 발명은 생약학제의 제조를 위한 스케일있는 단백질 카르바밀화 과정에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 상기 방법의 생성물, 및 화합물을 포함하는 약학적 조성물, 및 상기 조성물의 용도에 관한 것이다.

본 출원에서 기술된 카르바밀화 및 정제 방법은 가능한 한 중합체 또는 응집체의 형성이 최저이고, 최종 생성물의 손실이 최소인 완전히 카르바밀화된 것을 특징으로 하는 단백질을 초래한다.

카르바밀화 방법은 최저량의 중합체 및 응집체로 카르바밀화된 단백질을 제공하도록 최적화되어, 상기 방법이 경제적으로 실용적인 방법이 되게 하였다. 최종 생성물은 추가로 과다- 및/또는 하위-카르바밀화된 에리스로포이에틴 (분자 당 9 개 미만 또는 초과의 카르바밀화) 의 제한된 양의 이성체 (isoform) 를 함유한다. 하위-카르바밀화된 EPO 는 9 개 미만의 카르바밀 잔기를 함유하고 있는데, 즉, 8 개의 리신 및 N-말단 모두가 카르바밀화되어 있지 않다. 하위-카르바밀화된 EPO 는 적게나마 5 개 정도의 카르바밀 잔기를 가질 수 있고, 또한 표준적인 적혈구 생성 작용은 가지지 않아서, 본 발명에서 사용하기에 적합하게 되게 한다. 과다-카르바밀화된 EPO 는 9 개 초과의 카르바밀 잔기를 갖고, 8 개의 리신 잔기 및 N-말단 이외의 아미노산에서 카르바밀화를 가질 것이다. CEPO 는 15 개만큼의 카르바밀 잔기를 가질 수 있고, 또한 목적하는 효과를 가지는데, 즉 표준적인 적혈구 생성 작용이 없을 수 있다. 약 90% 이상, 및 거의 95% 정도의 CEPO 이성체는 8 개의 리신 잔기 및 N-말단에서만 카르바밀화된다.

카르바밀화된 단백질의 추가의 공정은 집합 및 중합된 생성물을 최대 3% 또는 2.5% 수준으로 제거하고, 그로 인해 응집체 및 중합체로 인한 단백질에 대한 면역학적 반응의 발생의 위험을 단지 최소한으로 갖는 생약학제로서 유용한 생성물이 되게 한다.

카르바밀화의 평가를 위한 분석 방법은 아미노산 분석 뿐만 아니라 ; 자유 1 차 아미노기에 대한 TNBS 및 MALDI-TOF 및 LC-MS/MS 에 의한 생성물 및 분해된 생성물의 특징화이다.

발명의 상세한 설명

제조 방법

6 단계가 단백질의 카르바밀화 방법을 구성한다 :

1. 초여과에 의한 농축.

2. 카르바밀화에 의한 개질.

3. 젤여과에 의한 탈염.

4. 음이온-교환에 의한 정제.

5. 초여과 및 정용여과에 의한 농축 및 완충액 교환.

6. 0.22 ㎛ 여과.

본 카르바밀화 방법의 출발 물질은 유리하게는 정제된 인간 EPO 이나, 동물 또는 인간 유형의 임의의 EPO 형태일 수 있으며, 비-제한적 예에서는 아시알로-EPO, 인간 EPO 의 돌연변이, 즉 아미노산 서열에서의 변화가 도입된 분자, EPO 단편, EPO 펩티드, 기타 단백질, 또는 여러 단백질이 카르바밀화되길 원한다면 단백질의 혼합물과 같은 합성, 재조합 인간 EPO 이거나 또는 생물학적으로 또는 화학적으로 개질된 인간 EPO 이다.

상기 방법의 제 1 단계는 초여과에 의한 단백질 농축 조정을 포함하는데, 여기서 단백질 농축은 낮은 공정 부피를 유지하기 위해 조정된다. 0.05 - 10 mg/ml 또는 0.05 - 8 mg/ml 의 단백질 농도가 바람직한 구현예이다. 더욱 바람직한 구현예는 0.05 - 7 mg/ml 이고, 가장 바람직한 것은 2 - 5 mg/ml 이다. 농도가 증가되면, 응집체는 증가해서 형성된다. 초여과는 MWCO 가 5 kDa 인 BioMax (Millipore) 를 사용하여 수행된다. 다른 필터가 사용될 수 있다. 또한, 단백질의 용해도는 안정화제를 첨가함으로써 조정될 수 있다.

농축 단계가 완료된 후, 단백질 용액은 pH 가 7 - 11 또는 pH 가 7 - 10 인 K-보레이트 테트라 하이드레이트, K-시아네이트와 혼합된다. 바람직한 구현예에서, pH 는 8 - 10 이고, 가장 바람직하게는 9.0 이다. 10 분 - 30 일 또는 30 분 - 30 일 또는 1 시간 - 30 일 또는 1 시간 - 20 일 또는 1 시간 - 10 일 또는 1 시간 - 5 일 또는 1 시간 - 2 일 또는 1 시간 - 26 일 또는 18 - 26 일 또는 바람직하게는 22 시간 - 26 시간, 가장 바람직하게는 24 시간 동안, 온도는 0℃ 내지 60℃ 또는 0℃ 내지 50℃ 또는 0℃ 내지 40℃ 또는 0℃ 내지 37℃ 미만의 범위이나, 바람직한 구현예는 30℃ - 34℃, 바람직하게는 32℃ 의 온도 간격을 갖는다. 그러나, 다른 공정 변수, 즉, 온도, 시아네이트 농도 및 단백질 농도가 변한다면, 상기 바람직한 간격이 변할 수 있다.

온도가 한계 미만이면, 카르바밀화가 느리고 불충분하여 수율이 낮을 것이다. 온도 한계가 초과되면, 증가된 응집으로 인해 수율이 낮을 것이다. 또다른 중요한 변수는 시간인데, 이는 시간이 감소되거나 또는 시간이 증가된다면 응집체의 형성이 관찰되고 그로 인해 낮은 수율이 초래되어 카르바밀화가 완전하지 않을 것이기 때문이다.

따라서, 연접 변수 (coherent parameter) 가 있는 공정이 존재하는데, 즉 온도가 저하되면, 감소된 카르바밀화 반응은 시아네이트 농도 및/또는 반응 시간을 증가시킴으로써 보충될 수 있다. 추가로, 반응 시간이 감소되면, 감소된 카르바밀화 반응은 온도 및/또는 시아네이트 농도를 증가시킴으로써 보충될 수 있다. 마지막으로, 감소된 시아네이트 농도를 사용한 공정에서, 감소된 카르바밀화 반응은 반응 시간 및/또는 온도를 증가시킴으로써 보충될 수 있다.

따라서, 결론적으로 하나의 중요한 변수 (시간, 온도, 시아네이트 농도 및 단백질 농도) 중의 하나의 유의한 변화는 응집체 및 중합체의 형성이 낮은 완전히 카르바밀화된 분자를 수득하기 위해, 하나 이상의 다른 중요한 변수에서의 변화를 포함할 것이다.

시아네이트가 본래부터 양성자의 취득 하에 가수분해하고 중합하며, 완충액 용량이 부족하면 용액의 pH 의 이동을 초래하기 때문에, 보레이트 완충액의 농도는 0.05 - 2 M 일 수 있으나, 바람직한 구현예에서는 0.1 - 1 M 및 가장 바람직하게는 0.5 M 일 수 있다.

또한, 시아네이트 농도는 0.05 - 10 M 또는 0.05 - 8 M 또는 0.05 - 6 M 또는 0.05 - 4 M 또는 0.05 - 2 M 의 범위가 바람직하고, 바람직한 구현예는 0.05 - 1 M 이고, 가장 바람직하게는 0.5 M 이다.

0.5 M 보레이트 완충액의 농축은 사용 시 0.5 M 시아네이트 농도의 양성자 취득에 의해 야기되는 pH 이동을 조절하는데 필요하다. 시아네이트 및 보레이트의 기타 염을 사용한 방법이 사용될 수 있다. 추가로, 카르보네이트 완충액 또는 포스페이트 완충액과 같이, 보레이트가 아닌 다른 반응 완충액이 사용될 수 있다.

단백질 및 시아네이트의 반응 혼합물의 탈염은 크로마토그래피 젤여과를 사용하여 수행된다. G-25 Fine (Amersham Biosciences) 매트리스가 사용된다. 샘플을 칼럼에 적용하기 전의 유지 시간은 조절되고, 2 시간을 초과해서는 안 될 것인데, 이는 추가의 카르바밀화 및 중합체 형성을 야기할 것이기 때문이다. 단백질의 탈염 및 완충액 교환은 투석, 정용여과 또는 크로마토그래피 젤여과를 사용하여 수행될 수 있다. 기타 젤여과 매트리스는 예를 들어 가교된 폴리사카라이드 또는 가교 혼합된 폴리사카라이드, 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌의 매트리스 또는 천연 세라믹의 매트리스와 같이 사용될 수 있다. 더욱이 칼럼 높이는 본 단계에서 다양할 수 있다.

40% 미만의 응집체 및 30% 미만 또는 25% 미만 또는 20% 미만 또는 15% 미만 또는 12.5% 미만 또는 10% 미만 또는 8% 미만 또는 7% 미만의 중합체로 된 생성물을 수득하도록 카르바밀화 단계가 조정될 수 있다.

응집체 및 중합체의 제거는 음이온 교환을 사용한 정제 단계에 의해 수행된다. 출발 물질의 잔여물질 및 응집체/중합체로부터 카르바밀화된 EPO 를 분리할 수 있다는 것이 관찰된다. 진행 완충액 A 는 : 0.3% Tris (25 mM), 0.3% (50 mM) NaCl, pH 8.5 ± 0.2 이고, 용출 완충액 B 는 : 0.3% Tris (25 mM), 5.8% (1 M) NaCl, pH 8.5 ± 0.2 이다. 구배는 목적하는 분리를 수득하기 위해 20 칼럼 부피에 걸쳐 0 - 30% 로 수행된다. 정제 단계는 응집체 3% 미만 및 중합체 2.5% 미만 또는 2% 미만 또는 1.5% 미만 또는 1% 미만 또는 약 0.5% 미만으로 된 생성물을 초래할 수 있다.

카르바밀화된 EPO 피크의 용출 및 수합 및 풀링 (pooling) 은 용출된 단백질의 이성이질성, 즉, 이성체의 분포에 영향을 미친다. 즉, 과다- 및 하위-카르바밀화된 CEPO 의 양은 수합 및 풀링 과정에 따라 다양할 것이다. 협소한 풀링은 과다- 및/또는 하위-카르바밀화된 에리스로포이에틴의 함량을 저하시킬 것이다. 구배의 길이를 증가시키는 것은 일부 종을 제외시킴으로써 더욱 한정된 생성물의 선별을 허용할 것이다.

ESI-질량 분석계에 의해 측정된 바와 같이 과다- 및 하위-카르바밀화된 이성체가 약 40 중량% 미만인 카르바밀화된 EPO 의 조성물은 본 발명의 한 구현예이다. 더욱 바람직한 구현예는 ESI-질량 분석계에 의해 측정된 바와 같이, 과다- 및 하위-카르바밀화된 이성체가 약 35 중량% 미만인 CEPO 이다. 더욱 더 바람직한 구현예는 ESI-질량 분석계에 의해 측정된 바와 같이 과다- 및 하위-카르바밀화된 이성체가 약 30 중량% 미만인 CEPO 이다. 더욱 더 바람직한 구현예는 ESI-질량 분석계에 의해 측정된 바와 같이, 과다- 및 하위-카르바밀화된 이성체가 약 25 중량% 미만인 CEPO 이다. 더욱 더 바람직한 구현예는 ESI-질량 분석계에 의해 측정된 바와 같이, 과다- 및 하위-카르바밀화된 이성체가 약 20 중량% 미만인 CEPO 이다. 더욱 더 바람직한 구현예는 ESI-질량 분석계에 의해 측정된 바와 같이, 과다- 및 하위-카르바밀화된 이성체가 약 15 중량% 미만인 CEPO 이다. 더욱 더 바람직한 구현예는 ESI-질량 분석계에 의해 측정된 바와 같이, 과다- 및 하위-카르바밀화된 이성체가 약 10 중량% 미만인 CEPO 이다. 더욱 더 바람직한 구현예는 ESI-질량 분석계에 의해 측정된 바와 같이, 과다- 및 하위-카르바밀화된 이성체가 약 5 중량% 미만인 CEPO 이다. 더욱 더 바람직한 구현예는 ESI-질량 분석계에 의해 측정된 바와 같이, 과다- 및 하위-카르바밀화된 이성체가 약 2 중량% 미만인 CEPO 이다. 가장 바람직한 구현예는 ESI-질량 분석계에 의해 측정된 바와 같이,, 과다- 및 하위-카르바밀화된 이성체가 약 1 중량% 미만인 CEPO 이다.

이성체의 전체 함량에 영향을 미치는 것 외에도, 카르바밀화된 EPO 피크의 수합 및 풀링은 과다-카르바밀화된 CEPO 의 분포에 영향을 미친다. 과다-카르바밀화된 CEPO 이성체의 양이 ESI-질량 분석계에 의해 측정된 바와 같이 약 35 중량% 미만인 것이 바람직하다. 과다-카르바밀화된 CEPO 이성체의 양이 ESI-질량 분석계에 의해 측정된 바와 같이 약 30 중량% 미만인 것이 더욱 더 바람직하고, 과다-카르바밀화된 CEPO 이성체의 양이 약 25 중량% 미만인 것이 더욱 더 바람직하고, 약 20 중량% 미만인 것이 더욱 더 바람직하고, 약 15 중량% 미만인 것이 더욱 더 바람직하다. 가장 바람직하게는 과다-카르바밀화된 EPO 의 양은 총 CEPO 의 약 10 중량% 이하, 약 5 중량% 이하 또는 약 1 중량% 이하이어야 할 것이다.

다른 진행 및 용출 완충액이 다른 음이온 교환 매트리스로서 사용될 수 있고, 충전된 필터가 사용될 수 있다. 비제한적 실시예에서의 매트리스는 가교된 폴리사카라이드 또는 가교 혼합된 폴리사카라이드, 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌 또는 천연 세라믹의 매트리스이다 .

양이온 교환 외에도, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 및 크기별 배제 크로마토그래피가 정제에 사용될 수 있다.

농도 및 완충액의 조정을 위한 다음 단계에서, 정용여과/초여과 접선 유동 여과 단위 (tangential flow filtration unit) 가 사용된다. 카르바밀화된 EPO 는 농도가 > 0.5 mg/ml 로 조정되고, 완충액을 20 mM 시트레이트, 100 mM NaCl 완충액으로 변경하였다. 농도 및 완충액 변경은 MWCO 가 5 kDa 인 BioMax (Millipore) 를 사용하여 수행된다. 다른 필터가 사용될 수 있다.

마침내, 정제된 생약학적 약물 성분은 Millipak (Millipore) 를 사용하여 0.22 ㎛ 여과되어, 병원균을 감소시킨다. 임의의 0.22 ㎛ 필터가 사용될 수 있다.

상기 방법을 사용하여, 완전히 카르바밀화된 EPO 는 SEC-HPLC 에 의해 측정된 바와 같이 응집체가 3% 미만 또는 바람직하게는 2.5% 미만으로 수득된다. 8 개의 리신 잔기의 완전한 카르바밀화는 전환된 리신을 호모시크룰린으로 결정하는 아미노산 분석을 사용하여 증명된다. 더욱이, 이어서 1 차 아민의 결정을 위한 TNBS 어세이를 사용하여 카르바밀화하고, 그리하여 리신 및 N-말단의 완전한 카르바밀화를 보여주었다.

또한, MALDI-TOF 를 사용한 완전한 특징화는 PNGase 처리된 단백질 및 N-글리칸이 있는 단백질 둘 다의 고유 질량에서의 변화를 결정하였다. 또한, MALDI-TOF 펩티드 질량 지문 분석/LC-MS/MS 분석은, 모든 8 개의 리신 및 N-말단이 카르바밀화되어 있음을 보여주었다. 바로 그 카르바밀화된 아미노산이 검출되었고, 글리칸의 어떠한 개질도 검출되지 않았다. 더욱이, EPO 의 과다- 및 하위-카르바밀화된 형태가 감소된 함량으로 최종 생성물 내에서 수득된다. 본 생성물은 신규이고, 청구된다.

본 발명의 한 구현예는 카르바밀화 단계 후, 그러나 음이온 교환 정제 전에 수득되는 조성물로서, 응집체 및 중합체가 약 40 중량% 미만, 또는 약 30 중량 미만, 또는 약 25 중량% 미만, 또는 약 20 중량% 미만, 또는 약 15 중량% 미만, 또는 약 12.5 중량% 미만, 또는 약 10 중량% 미만, 또는 약 8 중량% 미만, 또는 약 7 중량% 미만인 카르바밀화된 EPO, 및 상당량의 시아네이트를 포함한다.

본 발명의 한 추가의 구현예는 응집체 및 중합체가 약 3 중량% 미만, 또는 약 2.5 중량% 미만, 또는 약 2 중량% 미만, 또는 약 1.5 중량% 미만, 또는 약 1 중량% 미만 또는 약 0.5 중량% 미만인 카르바밀화된 EPO 를 포함하는, 음이온 교환 정제 후에 수득되는 조성물이다. 추가로, 본 조성물은 총 카르바밀화된 EPO 의 약 40 중량% 미만, 또는 더욱 바람직하게는 약 35 중량% 미만, 또는 약 30 중량% 미만, 또는 약 25 중량% 미만, 또는 약 20 중량% 미만, 또는 약 15 중량% 미만, 또는 약 10 중량% 미만, 또는 약 7.5 중량% 미만, 또는 약 5 중량% 미만, 또는 약 2 중량% 미만, 및 가장 바람직하게는 약 1 중량% 미만의 양으로 과다- 또는 하위-카르바밀화된 EPO 로 이루어진 이성체를 포함한다. 추가로, 상기 조성물 내의 과다-카르바밀화된 EPO 의 양은 총 카르바밀화된 EPO 의 약 35 중량% 미만, 또는 더욱 바람직하게는 약 30 중량% 미만, 또는 약 25 중량% 미만, 또는 약 20 중량% 미만, 또는 약 15 중량% 미만, 또는 약 10 중량% 미만, 또는 약 7.5 중량% 미만, 또는 약 5 중량% 미만, 또는 약 2 중량% 미만, 및 가장 바람직하게는 약 1 중량% 미만일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물

본 발명의 한 측면은 하기 기술된 증상의 치료를 위해 인간 또는 포유류에서 사용되는 약학적 조성물의 제조를 위한 본 발명의 화합물의 용도이다.

본 발명의 한 구현예는 응집체 및 중합체를 약 3 중량% 미만, 또는 더욱 바람직하게는 약 2.5 중량% 미만, 또는 약 2 중량% 미만, 또는 약 1.5 중량% 미만, 또는 약 1 중량% 미만, 및 가장 바람직하게는 약 0.5 중량% 미만의 치료적 유효량의 카르바밀화된 EPO 를 포함하는 약학적 조성물이고, 추가로, 상기 조성물은 과다- 또는 하위-카르바밀화된 EPO 의 양이 총 카르바밀화된 EPO 의 약 40 중량% 미만, 더욱 바람직하게는 약 35 중량% 미만, 또는 약 30 중량% 미만, 또는 약 25 중량% 미만, 또는 약 20 중량% 미만, 또는 약 15 중량% 미만, 또는 약 10 중량% 미만, 또는 약 5 중량% 미만, 또는 약 3 중량% 미만, 또는 약 2 중량% 미만 및 가장 바람직하게는 약 1 중량% 미만으로 이루어진 이성체를 포함한다. 추가로, 조성물 내의 과다-카르바밀화된 EPO 의 양은 총 카르바밀화된 EPO 의 약 35 중량% 미만, 또는 더욱 바람직하게는 약 30 중량% 미만, 또는 약 25 중량% 미만, 또는 약 20 중량% 미만, 또는 약 15 중량% 미만, 또는 약 10 중량% 미만, 또는 약 5 중량% 미만, 또는 약 3 중량% 미만, 또는 약 2 중량% 미만 및 가장 바람직하게는 약 1 중량% 미만일 수 있다.

본 발명의 한 측면의 실행에서, 본 발명의 화합물을 함유하는 상기 기술된 바와 같은 약학적 조성물은, 내피 세포벽을 가로지른 전위 (translocation) 및 반응성 세포 상에 유익한 효과를 허용하기 위해 맥관 구조에 본 발명의 화합물을 충분한 농도로 제공하는 임의의 경로에 의해 포유류에 투여가능할 수 있다. 조직 또는 기관을 관류하기 위해 사용되는 경우, 유사한 결과를 목적으로 한다. 세포 또는 조직이 비-혈관생성되어 있고/있거나 또는 본 발명의 조성물로 세포 또는 조직을 씻김으로써 투여되는 경우, 약학적 조성물은 본 발명의 화합물을 효과적인 반응성 세포-유익한 양으로 제공한다. 본 발명의 화합물이 가로질러 전위할 수 있는 내피 세포벽은 밀착 연접 (tight junction), 다공 연접 (perforated junction), 유창 연접 (fenestrated junction), 및 포유류에 존재하는 내피세포 벽의 임의의 다른 유형을 포함한다. 바람직한 벽은 내피세포 밀착 연접이나, 본 발명은 그런 식으로 제한하지는 않는다.

본 발명의 전술된 화합물은 일반적으로 원발성 신경학적 또는 정신 증후군, 안질환, 심혈관 질환, 심폐 질환, 호흡기 질환, 신장, 비뇨 질환 및 산과 질환, 소화기 질환 및 내분비 이상 및 대사 이상을 갖는 인간의 중추 신경계 또는 말초 신경계 질환의 치료적 또는 예방적 치료를 위해 사용된다. 특히, 상기 증상 및 질환은 예를 들어, 뇌, 심장, 또는 망막/눈과 같은 중추 신경계 조직, 말초신경계 조직, 또는 심 조직 또는 망막 조직의 흥분성 조직과 같은 흥분성 조직에 악영향을 미치는 저산소 증상을 포함한다. 따라서, 본 발명의 화합물은 다양한 조건 및 환경에서 저산소 증상으로 인한 흥분성 조직에의 손상을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 상기 조건 및 환경의 비-제한적 예는 하기 표에서 제공된다.

본 발명에 따라 치료가능한 신경 조직 병상의 보호의 예에서, 상기 병상은 신경 조직의 감소된 산화로 인한 것들을 포함한다. 산소의 신경 조직에의 이용가능성을 감소시켜서, 스트레스, 손상, 및 마침내 신경 세포 사멸을 초래하는 임의의 증상은 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있다. 일반적으로 저산소증 및/또는 허혈증이라고 하는, 상기 증상은 발작, 혈관 폐쇄, 태아기 또는 생후 산소 부족, 질식, 숨막힘, 익수 사고, 일산화탄소 중독, 연기 흡입, 수술 및 방사선치료를 포함하여 외상, 기절, 간질, 저혈당증, 만성 폐쇄성 폐질환, 기종, 성인 호흡곤란 증후군, 저혈압 쇼크, 패혈성 쇼크, 아나플락시 쇼크, 인슐린 쇼크, 겸상 세포 발증, 심정지, 부정맥, 질소 중독, 및 심폐 바이패스 수술에 의해 야기되는 신경 결손으로부터 야기되거나 또는 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

한 구현예에서, 예를 들어, 본 발명의 조성물을 포함하는 특정 약학적 조성물은 종양 절제 또는 대동맥류 수술과 같은 외과 수술 동안에 상해 또는 조직 손상의 위험으로부터 야기되는 상해 또는 조직 손상을 예방하기 위해 투여될 수 있다. 본원에 기술된 방법에 의해 치료가능한 저혈당증에 의해 야기되는 또는 초래되는 다른 병상에는 의원성 고인슐린혈증이라고도 하는 인슐린 과다투여, 인슐린종, 성장 호르몬 부족, 코르티솔 결핍증, 약물 과다투여, 및 특정 종양이 포함된다.

흥분성 신경 조직 손상으로 인한 다른 병상에는 간질, 경련, 또는 만성 발작성 질환과 같은 발작성 질환이 포함된다. 다른 치료가능한 증상 및 질환에는,발작 (허혈성 발작, 거미막하 출혈, 뇌내 출혈), 다발성 경화증, 저혈압, 심정지, 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌성 소아마비, 뇌 척수 외상, AIDS 치매, 인지 능력의 연령-관련 상실 (age-related loss of cognitive function), 기억 상실, 근위축성 측삭 경화증, 발작성 질환, 알콜 중독, 망막 허혈, 녹내장으로 인한 안신경 손상, 및 신경 상실과 같은 질환이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 특정 조성물 및 방법은 물리적으로 또는 화학적으로 유도된 염증과 같은 질환 증상 또는 다양한 외상으로 인한 염증을 치료하는데 사용될 수 있다. 상기 외상에는 맥관염, 만성 기관지염, 췌장염, 골수염, 류마티스성 관절염, 사구체신염, 시신경염, 측두 동맥염, 뇌염, 뇌막염, 횡단성 척수염, 피부근육염, 다발성근육염, 괴사성 근막염, 간염, 및 괴사성 소장결장염이 포함될 수 있었다.

활성화된 성상세포가 신경독소를 생성함으로써 신경에 대해 세포독성 역할을 행사할 수 있다는 것이 증명되었다. 산화질소, 활성 산소종, 및 사이토카인은 뇌 허혈에 대해 반응하는 신경교세포로부터 방출된다 (Becker, K.J. 2001. Targeting the central nervous system inflammatory response in ischemic Stroke. Curr Opinion Neurol 14:349-353 및 Mattson, M.P., Culmsee, C., and Yu, Z.F. 2000. Apoptotic and Antiapoptotic mechanisms in Stroke. Cell Tissue Res 301:173-187 참조). 연구는 추가로, 신경퇴행 모델에서, 신경교세포의 활성 및 후속한 염증성 사이토카인의 생성이 1 차 신경 손상에 의존한다고 서술하였다 (Viviani, B., Corsini, E., Galli, C.L., Padovani, A., Ciusani, E., and Marinovich, M. 2000. Dying neural cells activate glia through the release of a protease product. Glia 32:84-90 and Rabuffetti, M., Scioratti, C., Tarozzo, G., Clementi, E., Manfredi, A.A., and Beltramo, M. 2000. Inhibition of caspase-1-like activity by Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-chloromethyl ketone includes long lasting neuroprotection in cerebral ischemia through apoptosis reduction and decrease of proinflammatory cytokines. J Neurosci 20:4398-4404 참조). 염증 및 신경교세포 활성은 뇌 허혈, 뇌상 및 실험 알레르기 뇌척수염, 에리스로포이에틴이 신경 보호 효과를 발휘하는 장애를 포함하여 상이한 유형의 신경 퇴행 장애에서 공통적이다. 에리스로포이에틴에 의한 사이토카인 생성의 억제는 적어도 일부 그의 보호 효과를 매개할 수 있었다. 그러나, 종양 괴사 인자 생성을 직접적으로 억제시키는 IL-10 및 IL-13 과 같은 "표준적인" 항-염증 사이토카인과는 달리, 에리스로포이에틴은 신경 사멸의 존재 하에서만 활성인 것으로 보인다.

임의의 특별한 이론에 얽매이지 않기를 바라는 한편, 상기 항-염증 작용은 다수의 비-제한적 이론에 의해 가설적으로 설명될 수 있는 것으로 보인다. 우선, 에리스로포이에틴이 세포자멸사를 예방하기 때문에, 세포자멸사에 의해 이끌어지는 염증 작용이 예방될 것이다. 추가로, 에리스로포이에틴은 신경교세포를 자극하거나 또는 상기 생성물에 대한 그의 반응을 감소시키는 신경교세포 상에 직접 작용할 수 있는 죽어가는 뉴런으로부터의 분자 신호의 방출을 예방할 수 있다. 또다른 가능성은, 에리스로포이에틴이 세포자멸사 및 염증 둘 다를 이끄는 염증 캐스캐이드 (예를 들어, 캐스페이즈 1, 활성 산소 또는 질소 중간체) 의 더욱 가까운 원 (member) 을 표적으로 하는 것이다.

더욱이, 에리스로포이에틴은 전형적으로 덱사메타손과 같은 다른 항-염증 화합물과 연관된 반동 효과 없이 항-염증 보호를 제공하는 것으로 보인다. 다시 한번, 임의의 특별한 이론에 얽매이지 않기를 바라면서, 산화질소 (NO) 와 같은 다목적성 신경 독소에 대한 에리스로포이에틴의 영향으로 인할 수 있는 것으로 보인다. 활성화된 성상세포 및 미세아교세포가 다양한 외상에 대해 반응하는 NO 를 신경독소의 양으로 생성하더라도, NO 는 필수 생리학적 작용을 조정하는 것을 포함하여 신체 내에서 많은 목적을 제공한다. 따라서, 항-염증을 사용하여 NO 또는 다른 신경 독소를 억제시킴으로써 염증을 완화시킬 수 있더라도, 항-염증이 너무 긴 반감기를 갖고 있다면 항-염증은 또한 염증을 초래하는 외상으로 인한 손상을 회복시키는 상기 화학물질의 역할을 방해할 수 있다. 본 발명의 화합물은 NO 와 같은 신경독소의 회복력을 방해하면서 염증을 완화시킬 수 있다고 가정된다.

본 발명의 특정 조성물 및 방법은 망막 조직의 증상 및 망막 조직에의 손상을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 상기 장애에는, 망막 허혈, 황반 변성, 망막 박리, 망막 색소 변형증, 동맥경화성 망막변증, 고혈압성 망막변증, 망막 동맥 차단, 망막 정맥 차단, 저혈압, 및 당뇨병성 망막변증이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

또다른 구현예에서, 본 발명의 방법 및 원리는 흥분성 조직에의 방사선 손상 또는 화학치료 유도성 손상으로 인한 손상을 보호 또는 치료하는데 사용될 수 있다. 비제한적 예에서, 말초 신경병증을 유도하는 잠재력이 있는 탁산, 시스플라틴 및 기타 화학치료제와 같은 화합물에 의해 야기되는 손상으로부터 보호하기 위해서 사용될 수 있다. 본 발명의 방법의 추가의 유용성은 도모이산 조개 중독, 뉴로래티리즘 (neurolathyrism), 및 Guam 질환, 근위축성 측삭 경화증, 및 파킨슨병과 같은 신경독소 중독의 치료에 있다.

상기 언급된 바와 같이, 본 발명은 또한 상기 기술된 바와 같은 본 발명의 화합물의 말초 투여에 의한 포유류에서의 흥분성 조직 기능의 증진 방법에 관한 것이다. 다양한 질환 및 증상이 상기 방법을 사용한 치료를 받을 수 있고, 추가로 상기 방법은 임의의 증상 및 질환이 없는 인지 작용의 증대에 유용하다. 본 발명의 상기 용도는 하기에 더욱 상세히 기술되고, 인간 및 비-인간 포유류 둘 다에서의 학습 및 훈련의 증대를 포함한다.

중추 신경계에 관한 본 발명의 상기 측면의 방법에 의해 치료가능한 증상 및 질환에는, 기분 장애, 분노 장애, 우울증, 자폐증, 주의력 부족 항진 장애, 및 인지기능 장애가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 상기 증상은 신경 작용의 확장으로부터 유익하다. 본 발명의 교시에 따라 치료가능한 기타 장애에는, 예를 들어, 수면 방해, 수면 무호흡증, 및 여행-관련 장애 ; 거미막하 및 동맥류성 출혈, 저혈압 쇼크, 진탕, 패혈성 쇼크, 아나플락시 쇼크, 및 다양한 뇌염 및 뇌수막염의 후유증, 예를 들어, 루푸스와 같은 연골 조직 질환-관련 대뇌염(cerebritides) 이 포함된다. 기타 용도는 도모이산 조개 중독과 같은 신경독소에 의한 중독, 뉴로래틸리즘, 및 Guam 질환, 근위축성 측삭 경화증, 파킨슨병 ; 색전성 또는 허혈성 손상에 대한 수술 후 치료 ; 전체 뇌 방사선조사 ; 겸상 세포 발증 ; 및 자간으로부터의 예방 또는 보호를 포함한다.

본 발명의 방법에 의해 치료가능한 증상의 추가의 군은 선천성 또는 후천성의 미토콘드리아 기능장애를 포함하는데, 이는 신경 손상 및 사멸에 의해 유형화되는 다양한 신경학적 질환의 원인이다. 예를 들어, Leigh 질환 (아급성 괴사성 뇌병증) 은 신경 드롭 아웃 (drop out) 으로 인한 급진적 시각 상실과 뇌병증 및 근질환을 특징으로 한다. 상기 경우에, 불완전한 미토콘드리아 대사 (defective mitochondrial metabolism) 는 흥분성 세포의 대사에 연료를 공급하기에 충분히 높은 에너지 기질을 제공하는데 실패한다. 에리스로포이에틴 수용체 작용 조정자는 다양한 미토콘드리아 질환에서의 작용을 실패하는 것을 최적화시킨다. 상기 언급된 바와 같이, 저산소 증상은 흥분성 조직에 악영향을 미친다. 흥분성 조직에는, 중추 신경계 조직, 말초 신경계 조직, 및 심 조직이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 상기 기술된 증상 외에도, 본 발명의 방법은 일산화탄소 및 연기 흡입과 같은 흡입 중독, 중증 천식, 성인 호흡곤란 증후군, 숨막힘, 및 익수 사고의 치료에 유용하다. 추가로, 저산소 증상을 일으키거나 또는 다른 방법에 의해 흥분성 조직 손상을 유도하는 증상에는, 부적절한 인슐린의 투여, 또는 인슐린-생성 신생종 (인슐린종) 에서 발생할 수 있는 저혈당증이 포함된다.

흥분성 조직 손상으로 인해 발생하는 것으로 믿어지는 다양한 신경정신학적 장애는 본 발명의 방법에 의해 치료가능하다. 신경 손상이 관련되고, 본 발명에 의해 치료가 제공되는 만성 장애에는 인지 기능의 연령-관련 손실 및 노인성 치매, 만성 발작성 질환, 알츠하이머병, 파킨슨병, 치매, 기억 상실, 근위축성 측삭 경화증, 다발성 경화증, 결절성 경화증, 윌슨병 대뇌 및 진핵성 핵상 마비, Guam 질환, Lewy 신체 치매, 프리온 질환, 해면성 뇌증, 예를 들어, Creutzfeldt-Jakob 질환, 헌팅턴병, 근이양증, Charcot-Marie-Tooth 질환, Freidrich's 운동실조증 및 기타 운동실조증뿐만 아니라, Gilles de la Tourette's 증후군, 간질 및 만성 발작성 질환과 같은 발작성 질환, 발작, 뇌 척수 외상, AIDS 치매, 알콜 중독, 자폐증, 망막 허혈, 녹내장, 고혈압 및 수면 장애와 같은 자율신경계 기능 장애, 및 정신분열증, 분열정동성 장애, 주의력 부족 장애 기능항진, 기분변조 장애, 주요 우울증, 조병, 강박 장애, 정신활성 물질 사용 장애, 분노, 공황 장애뿐만 아니라, 단극성 및 양극성 정동성 장애를 포함하나 이에 제한되지 않는 신경정신병적 장애를 포함하여 중추 신경계 및/또는 말초신경계 관련 장애가 포함된다.

추가의 신경정신병적 및 신경퇴행성 장애에는 예를 들어, 그 전체가 본원에서 참조로써 인용된 [American Psychiatric Association's Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (DSM), the most current version, IV] 에서 언급된 것들이 포함된다.

또다른 구현예에서, 본 발명의 화합물을 포함하는 재조합 키메라 독소 분자는 암과 같은 증식 장애, 또는 아급성 경화성 전뇌염과 같은 바이러스성 장애를 치료하기 위한 독소의 치료적 전달에 사용될 수 있다.

표 1 은 본 발명의 전술된 화합물에 의한 치료를 받을 수 있는 다양한 증상 및 질환에 관한 추가의 실례의, 비-제한적 지침을 열거한다.

상기 전술된 바와 같이, 상기 질환, 장애 또는 증상은 단지 본 발명의 화합물에 의해 제공되는 이점의 범위의 예시일 뿐이다. 따라서, 본 발명은 일반적으로 인간 질환의 물리적 외상의 결과의 치료적 또는 예방적 치료를 제공한다. CNS 및/또는 말초신경계의 질환, 장애 또는 증상의 치료적 또는 예방적 치료가 바람직하다. 정신병 치료 성분을 갖는, 질환, 장애 또는 증상의 치료적 또는 예방적 치료가 제공된다. 안과의, 심혈관의, 심폐의, 호흡기의, 신장, 비뇨기, 산과, 소화기, 내분비, 또는 대사 성분을 갖는 것들을 포함하여, 그러나 이에 제한되지 않는 질환, 장애 또는 증상의 치료적 또는 예방적 치료가 제공된다.

한 구현예에서, 본 발명의 화합물을 포함하는 상기 약학적 조성물은 표적 세포, 조직, 또는 기관을 보호 또는 증진시키기 위해 전신으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 흡입을 통해 비경구로, 또는 점막으로, 예를 들어, 경구로, 비강으로, 직장으로, 질내로, 혀밑으로, 점막내로, 또는 피내로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 투여는 예를 들어, 정맥 내 또는 복강 내 주사, 및 또한 동맥-내, 근육내, 피내, 및 피하 투여를 포함하나, 그러나 이에 제한되지 않는 비경구이다.

관류물의 사용, 기관 내로의 주입, 또는 기타 국소 투여와 같은 다른 투여 경로를 위해서는, 약학적 조성물은 상기 기술된 바와 같은 본 발명의 화합물의 유사 농도를 초래하도록 제공될 것이다. 약 0.01 pM 내지 30 nM 의 농도가 바람직하다.

본 발명의 약학적 조성물은 치료적 유효량의 화합물, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 용어 "약학적으로 허용가능한" 은 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인받거나 또는 U.S. 조제서 또는 기타 일반적으로 인정된 외국의 동물에서의 사용용, 및 더욱 특히 인간에서의 사용용 조제서에서 열거되는 것을 의미한다. 용어 "담체" 는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 아쥬반트, 부형제, 또는 비히클을 말한다. 상기 약학적 담체는 물, 및 피넛 오일, 두유, 광유, 참기름 등과 같은 석유, 동물유, 식물유, 또는 합성 기원의 오일을 포함하여 오일 중의 식염수와 같은 멸균액일 수 있다. 식염수는 약학적 조성물이 정맥 내로 투여되는 경우 바람직한 담체이다. 식염수 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 또한 특히 주입 용액용 액체 담체로서 사용될 수 있다. 적합한 약학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 말트, 쌀, 밀가루, 쵸크, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 건성 스킴 밀크, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 필요하다면, 조성물은 또한 소량의 습윤제 또는 에멀젼화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 상기 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 환약, 캡슐, 분말, 서방성 제제 등의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 전통적인 결합제 및 트리글리세리드와 같은 담체와 함께 좌제로서 제형될 수 있다. 본 발명의 화합물은 중성 또는 염 형태로서 제형될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염은 염화수소산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등의 유래의 것들과 같은 자유 아미노기로 형성된 것들, 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화 제2철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등의 유래의 것들과 같은 자유 카르복실기로 형성된 것들을 포함한다. 적합한 약학적 담체의 예에는 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin] 에 기술되어 있다. 상기 조성물은 치료적 유효량의 화합물을, 바람직하게는 정제된 형태로, 적합한 양의 담체와 함께 함유하여, 환자에 투여하기 적절한 형태를 제공할 것이다. 제제는 투여의 형태로 적합하게 되어야 할 것이다.

경구 투여에 적합하게 된 약학적 조성물은 캡슐 또는 정제로서 ; 분말 또는 과립으로서 ; 용액, 시럽 또는 현탁액 (수성 또는 비-수성 액체 중) 으로서 ; 먹을 수 있는 형태 또는 휩 (whip) 으로서 ; 또는 에멀젼으로서 제공될 수 있다. 정제 또는 경성 젤라틴 캡슐은 락토스, 전분 또는 그의 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카르보네이트, 스테아르산 또는 그의 염을 포함할 수 있다. 연성 젤라틴 캡슐은 식물유, 왁스, 지방, 준-고체, 또는 액체 폴리올 등을 포함할 수 있다. 용액 및 시럽은 물, 폴리올 및 당을 포함할 수 있다.

경구 투여용으로 고안된 활성제는 위장관로에서 활성제의 분해 및/또는 흡수를 지연시키는 물질 (예를 들어, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트가 사용될 수 있음) 로 코팅되거나 또는 그러한 물질과 혼합될 수 있다. 따라서, 서방성 활성제는 많은 시간에 걸쳐 달성될 수 있고, 필요하다면, 활성제는 위에서 분해되는 것으로부터 보호될 수 있다. 경구 투여용 약학적 조성물은 특정 pH 또는 효소적 증상으로 인해 특정 위장관 위치에서 활성제의 방출을 용이하게 하도록 제형될 수 있다.

경피 투여용으로 적합하게 된 약학적 조성물은 연장된 기간 동안에 수여자의 외피와 직접 접촉하도록 고안된 개별 패치로서 제공될 수 있다. 국소 투여용으로 적합하게 된 약학적 조성물은 연고, 크림, 로션, 분말, 용액, 페이스트, 젤, 스프레이, 아에로졸 또는 오일로서 제공될 수 있다. 피부, 입, 눈 또는 기타 외부 조직에의 국소 투여를 위해, 국소 연고 또는 크림이 바람직하게 사용된다. 연고로 제형되는 경우, 활성 성분은 파라핀계 또는 물-혼화성 연고 베이스와 함께 사용될 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 수-중-유 베이스 또는 유-중-수 베이스와 함께 크림으로 제형될 수 있다. 눈에의 국소 투여용으로 적합하게 된 약학적 조성물은 점안액을 포함한다. 상기 조성물에서, 활성 성분은 적합한 담체, 예를 들어, 수성 용매 내에서 용해 또는 현탁될 수 있다. 입에의 국소 투여용으로 적합하게 된 약학적 조성물은 론제지, 향정, 및 구강세척액을 포함한다.

비내 및 폐 투여용으로 적합하게 된 약학적 조성물은 분말 (바람직하게는 입자 크기의 범위가 20 내지 500 마이크론 범위인 분말) 과 같은 고체 담체를 포함한다. 분말은 코담배가 취해지는 방식, 즉, 코에 가깝게 위치한 분말의 용기로부터 코를 통한 급속 흡입에 의해 투여될 수 있다. 대안적으로, 비내 투여용으로 적합하게 된 조성물은 액체 담체, 예를 들어, 비내 스프레이 또는 비점액을 포함할 수 있다. 대안적으로, 폐에의 직접적인 흡입은 깊게 흡입 또는 입에 대는 부분을 통한 인두중앙부에의 설비 (installation) 에 의해 달성될 수 있다. 상기 조성물은 활성 성분의 수성 또는 유성액을 포함할 수 있다. 흡입에 의해 투여되는 조성물은 활성 성분의 예정된 투여량을 제공하도록 구축될 수 있는 가압 아에로졸, 흡입기 또는 취입기를 포함하나 이에 제한되지 않는, 특별히 적합하게 된 장치로 제공될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 비강으로 직접 또는 비내 또는 인두중앙부를 통해 폐로 투여된다.

직장 투여용으로 적합하게 된 약학적 조성물은 좌제 또는 관장제로서 제공될 수 있다. 질 투여용으로 적합하게 된 약학적 조성물은 페서리, 탐폰, 크림, 젤, 페이스트, 폼 또는 스프레이 제제로서 제공될 수 있다.

비경구 투여용으로 적합하게 된 약학적 조성물은, 조성물을 원하는 수여자의 혈액으로 실질적으로 등장성이게 하는 항산화제, 완충액, 세균발육저지제, 및 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 주사액 또는 현탁액을 포함한다. 상기 조성물에 존재할 수 있는 기타 성분은 예를 들어, 물, 알콜, 폴리올, 글리세린 및 식물유를 포함한다. 비경구 투여용으로 적합하게 된 조성물은 예를 들어, 밀봉된 앰플 및 바이알과 같은 단일-투여 또는 다중-투여 용기 내에 존재할 수 있고, 사용 직전 멸균 주사용 식염수와 같은 멸균 액체 담체의 첨가만을 필요로 하는 냉동-건조된 (동결건조된) 조건 하에 보관될 수 있다. 임시 주입 용액 및 현탁액은 멸균 분말, 과립, 및 정제로부터 제조될 수 있다. 한 구현예에서, 본 발명의 화합물의 주사용액을 포함하는 자동주입기가 앰뷸런스, 응급실, 및 전쟁 상황에 의한 긴박한 용도를 위해 제공될 수 있고, 가정생활에서, 특히 잔디깎이 기계의 무분별한 사용에 의한 것과 같은 외상의 절단의 가능성이 일어날 수 있는 가정생활 중에서 자가-투여용으로 조차 제공될 수 있다. 상태가 심각한 발 또는 발가락의 세포 및 조직이 재결합 후에 살아남을 가능성은, 의료진이 위치에 도달하기 전, 또는 상태가 심각한 발을 가지고 고민하는 개인이 응급실에 도달하기 전일지라도, 실행가능한 한 빨리, 상태가 심각한 부분 중 여러 부위에 본 발명의 화합물을 투여함으로써 증가될 수 있다.

바람직한 구현예에서, 조성물은 인간에 정맥 내 투여하기에 적합하게 된 약학적 조성물로서 일상적인 과정에 따라 제형된다. 전형적으로, 정맥 내 투여용 조성물은 멸균 등장성 수성 완충액이다. 필요한 경우, 상기 조성물은 또한 주입 위치의 통증을 완화시키기 위해 리도카인과 같은 국소 마취제 및 용해제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분은 예를 들어, 활성제의 양을 지시하는 앰플 또는 샤켓과 같은 건성 동결건조된 분말 또는 물-없는 농축물로서 밀봉-포장된 용기 내에서 단일 투여량 형태로 분리해서 또는 함께 제공된다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 그것은 멸균 약학적 등급 수 또는 식염수를 함유하는 주입 병으로 조제될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 멸균 식염수의 앰플은 활성 성분이 투여 전에 혼합될 수 있도록 제공될 수 있다.

좌제는 일반적으로 0.5 중량% 내지 10 중량% 의 범위 내에서 활성 성분을 함유하고 ; 경구 제제는 바람직하게는 활성 성분을 10% 내지 95% 로 함유한다.

관류 조성물은 이식된 기관 배스에 사용하기 위해, 그 자리에서의 관류를 위해, 또는 기관 수합 전에 기관 공여자의 맥관 구조에 투여하기 위해 제공될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 개인에의 급성 또는 만성, 국소 또는 전신 투여용에 적합하지 않은 농도의 본 발명의 화합물을 포함할 수 있으나, 처리된 기관 또는 조직을 일반적인 순환에 노출시키거나 또는 되돌려 보내기 전에 거기에 함유된 본 발명의 화합물의 농도를 제거 또는 감소시키기 전에 시체, 기관 배스, 기관 관류물, 또는 그 자리에서의 관류물 내에서 본원에서 의도된 작용을 제공할 것이다.

본 발명은 또한 본 발명의 약학적 조성물의 하나 이상의 성분으로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 약학적 팩 또는 키트를 제공한다. 상기 용기(들)와 임의로 관련된 것은 인간 투여용으로서의 제조, 용도, 또는 판매의 기관에 의한 승인을 반영하는, 약학적 또는 생물학적 제품의 제조, 용도 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 처방된 형태의 주의일 수 있다.

또다른 구현예에서, 예를 들어, 본 발명의 화합물은 서방성계에서 전달될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 정맥 내 주입, 이식가능한 삼투성 펌프, 경피 패치, 리포좀, 또는 기타 투여 형태를 사용하여 투여될 수 있다. 한 구현예에서, 펌프가 사용될 수 있다 (Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574 참조). 또다른 구현예에서, 화합물은 비히클, 특히 리포좀에서 전달될 수 있다 (Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Diseases and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); WO 91/04014; U.S. Patent No. 4,704,355; Lopez-Berestein, ibid ., pp. 317-327; see generally ibid . 참조). 또다른 구현예에서, 중합체성 물질이 사용될 수 있다 (Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Press: Boca Raton, Florida, 1974; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley: New York (1984); Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61, 1953 참조 ; 또한 Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105 참조).

더욱 또다른 구현예에서, 서방성계는 치료적 표적, 즉 표적 세포, 조직 또는 기관에 근접해서 위치할 수 있고, 따라서 전신 투여량의 일부만을 필요로 한다 (예를 들어, Goodson, pp. 115-138 in Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, supra, 1984 참조). 기타 서방성계는 Langer 에 의한 리뷰에서 토의되어 있다 (1990, Science 249:1527-1533).

또다른 구현예에서, 본 발명의 화합물은 적절하게 제형되어서, 비내, 경구, 직장, 질, 또는 혀밑 투여에 의해 투여될 수 있다.

특정 구현예에서, 치료가 필요한 영역에 국소적으로 본 발명의 조성물을 투여하는 것이 바람직할 수 있으며 ; 이는 예를 들어, 제한 없이, 수술 동안의 국소 주입, 예를 들어, 수술 후 상처 부위의 드레싱과 함께 국소 적용, 카테터, 좌제, 또는 이식체를 사용한 주입에 의해 수행될 수 있으며, 상기 이식체는 실라스틱 막과 같은 막, 또는 섬유를 포함하여, 다공성, 비-다공성, 또는 젤라틴성 물질로 되어 있다.

바람직한 유효 투여량의 선택은 당업자에게 공지될 다양한 요소를 고려하는 것을 바탕으로 숙련된 기술자에 의해 결정될 것이다. 상기 요소는 본 발명의 화합물의 특별한 형태, 및 생체이용율, 대사성, 반감기 등과 같은 그의 약동학적 변수를 포함하고, 이는 약학적 화합물의 규제적 승인을 수득하는데 전형적으로 사용되는 통상의 개발 과정 동안에 구축되었을 것이다. 투여량을 고려하는 추가의 요소는 치료되는 증상 또는 질환 또는 정상인에서 달성되는 이점, 환자의 몸 질량, 투여 경로, 투여가 급성 또는 만성이든간에, 동시수반의 약제, 및 투여되는 약학적 제제의 효능에 영향을 미치는 것으로 잘 알려져 있는 기타 요소를 포함한다. 따라서, 정확한 투여량은 주치의의 판단 및 각 환자의 상태, 예를 들어 개별 환자의 증상 및 면역 상태에 따라, 그리고 표준 임상 기술에 따라 결정되어야 할 것이다.

본 발명의 또다른 측면에서, 관류물 또는 관류액은 이식용 기관의 관류 및 저장을 위해 제공되고, 관류액은 반응성 세포 및 관련 세포, 조직, 또는 기관을 보호하기에 유효한, 본 발명의 화합물 상당량을 포함한다. 이식은, 기관 (세포, 조직 또는 기타 신체 부분을 포함) 을 한 공여자로부터 수합하고, 그것을 다른 수여자에게 이식하는 이종 기관 이식 ; 및 벤치 수술 과정을 포함하여, 기관을 한 신체의 한 일부에서 취하고, 그것을 또다른 부분에 되돌리는 동종 기관 이식 (기관이 제거될 수 있고, 한편 생체 외에서 종양 제거와 같은 절단, 복구 또는 그렇지 않다면 증식되고, 그런 다음 원래의 위치에 되돌리는 것) 을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 한 구현예에서, 관류액은 에리스로포이에틴 약 1 내지 약 25 U/ml, 5% 히드록시에틸 전분 (분자량이 약 200,000 내지 약 300,000 이고, 실질적으로 에틸렌 글리콜, 에틸렌 클로로히드린, 염화나트륨 및 아세톤이 없음) ; 25mM KH₂PO₄ ; 3mM 글루타티온 ; 5mM 아데노신 ; 10mM 글루코스 ; 10mM HEPES 완충액 ; 5mM 마그네슘 글루코네이트 ; 1.5mM CaCl₂ ; 105mM 나트륨 글루코네이트 ; 200,000 유닛 페니실린 ; 40 유닛 인슐린 ; 16mg 덱사메타손 ; 12mg 페놀 레드를 함유하고 ; pH 가 7.4-7.5 이고, 삼투성이 약 320 mOSm/l 인 University of Wisconsin (UW) 용액 (U.S. Patent No. 4,798,824) 이다. 상기 용액은 이식 전에 시체의 신장 및 췌장을 유지시키는데 사용된다. 상기 용액을 사용하여, 시체의 신장 보존 동안에 권고되는 30-시간 제한을 넘어서서 연장 보존할 수 있다. 이러한 특별한 관류물은 단지 본 발명의 화합물의 유효량을 포함하여 본 사용에 적합하게 될 수 있는 수많은 그러한 용액의 예시일 뿐이다. 추가의 구현예에서, 관류물 용액은 본 발명의 화합물 약 0.01 pg/ml 내지 약 400 ng/ml 또는 본 발명의 화합물 약 40 내지 약 300 ng/ml 을 함유할 수 있다.

본원 전체를 통해서 목적을 위한 본 발명의 화합물의 바람직한 수여자가 인간인 한편, 본원의 방법은 다른 포유류, 특히 가축, 가축류, 애완동물 및 동물원 동물에도 동등하게 적용한다. 그러나, 본 발명은 그렇게 제한하려는 것은 아니고, 유리한 점은 임의의 동물에 적용될 수 있다.

본 발명의 화합물의 치료적 및 예방적 용도

하기 실시예 1 에서 주지한 바와 같이, 인간 뇌의 모세혈관 내피세포 내에 에리스로포이에틴 수용체가 존재한다는 것은, 본 발명의 화합물의 표적이 인간 뇌에 존재하고, 본 발명의 상기 화합물에 대한 동물 연구가 직접적으로 인간의 치료 또는 예방에 옮겨질 수 있음을 지시한다.

본 발명의 또다른 측면에서, 내피세포 벽에 의해 맥관 구조로부터 단리되지 않는 세포, 조직, 또는 기관의 생존율을 증진시키기 위한 방법 및 조성물은 세포, 조직, 또는 기관을 직접 본 발명의 화합물을 포함하는 약학적 조성물에 노출시킴으로써, 또는 조직 또는 기관의 맥관 구조에 본 발명의 화합물을 함유하는 약학적 조성물을 투여 또는 접촉시킴으로써 제공된다. 처리된 조직 또는 기관 내의 반응성 세포의 증진된 작용은 발휘되는 긍정적 효과에 기여한다.

상기 기술된 바와 같이, 본 발명은 일부, 에리스로포이에틴 분자가 뇌, 망막 및 고환을 포함하여 내피 세포 밀착 연접이 있는 기관의 모세혈관의 내피 세포의 관강 표면으로부터 기저막 표면으로 수송될 수 있다는 발견을 바탕으로 한다. 따라서, 벽을 가로지르는 반응성 세포는 본 발명의 화합물의 유익한 효과를 위한 표적이 되기 쉽고, 거기에 반응성 세포 상에서 전부 또는 일부 함유하고 의존하는 다른 세포 유형 또는 조직 또는 기관은 본 발명의 방법의 표적이다. 임의의 특별한 이론에 구애받지 않는 한편, 본 발명의 화합물의 트랜스사이토시스 후에, 본 발명의 화합물은 신경, 망막, 근육, 심장, 폐, 간, 신장, 소장, 부신 피질, 부신 수질, 모세혈관 내피세포, 고환, 난소, 췌장, 뼈, 피부, 또는 자궁내 세포와 같은 반응성 세포 상에서 에리스로포이에틴 수용체를 방해할 수 있고, 수용체 결합은 반응성 세포 또는 조직 내에서 유전자 발현 프로그램의 활성화를 초래하고, 세포 또는 조직 또는 기관을 독소, 화학치료제, 방사선 치료, 저산소증 등과 같은 손상으로부터 보호하는 것을 초래하는 신호 전달 캐스캐이드를 개시할 수 있다. 따라서, 반응성 세포-함유 조직을 상해 또는 저산소성 스트레스로부터 보호하고, 상기 조직의 기능을 증진시키는 방법은 본원 하기에서 상세히 기술된다. 상기 주지된 바와 같이, 본 발명의 방법은 인간뿐만 아니라, 기타 동물에 동등하게 적용가능하다.

본 발명의 한 구현예의 실행에서, 포유류 환자는 신경, 폐, 심장, 난소 또는 전립선 손상과 같은 부작용을 공통적으로 갖는 방사선 치료를 포함한 암 치료를 위한 전신 화학치료를 받는다. 상기 기술된 바와 같은 본 발명의 화합물을 포함하는 약학적 조성물의 투여는 화학치료 및/또는 방사선 치료 전 또는 동안에 수행되어, 고환을 보호하는 것과 같이, 화학치료제에 의한 손상으로부터 다양한 조직 및 기관을 보호한다. 치료는 화학치료제의 순환 수준이 포유류의 몸에 잠재적인 위험을 주는 수준 미만으로 떨어질 때까지 계속될 수 있다.

본 발명의 또다른 구현예의 실행에서, 다양한 기관이 자동차 사고의 희생자로부터 수합되어 수많은 수여자에게 이식되도록 계획되었으며, 그 중 일부는 연장된 거리 및 기간 동안의 수송이 필요하였다. 기관 수합 전에, 희생자에게 본원에서 기술된 바와 같은 본 발명의 화합물을 포함하는 약학적 조성물로 주입하였다. 승선되는 수합된 기관을 본원에서 기술된 바와 같은 본 발명의 화합물을 함유하는 관류물로 관류시키고, 본 발명의 화합물을 포함하는 배스 내에서 보관하였다. 특정 기관은 박동성 관류 장치로 지속해서 관류시켜서, 본 발명에 따른 본 발명의 화합물을 함유하는 관류물을 사용하였다. 기관 기능의 최소의 저하가 수송 동안에 그리고 그 자리에서의 기관의 이식 및 재관류 시에 발생하였다.

본 발명의 또다른 구현예에서, 심장 판막을 복구하기 위한 외과 수술 과정은 일시적인 심정지 및 동맥 폐색을 필요로 하였다. 수술 전에, 환자에 체중 Kg 당 본 발명의 화합물 4 ㎍ 으로 주입하였다. 상기 처치는 특히 재관류 후의 저산소성 허혈성 세포 손상을 예방하였다.

본 발명의 또다른 구현예에서, 심폐 바이패스 수술에서와 같이 임의의 외과 수술 과정에서, 본 발명의 화합물이 사용될 수 있다. 한 구현예에서, 상기 기술된 바와 같이 본 발명의 화합물을 포함하는 약학적 조성물의 투여를 뇌, 심장 및 기타 기관의 기능을 보호하기 위해, 바이패스 수술 전, 동안 및/또는 후에 수행한다.

본 발명의 화합물을 생체 외 적용에 사용하거나, 또는 신경 조직, 망막 조직, 심장, 폐, 간, 신장, 소장, 부신 피질, 부신 수질, 모세 혈관 내피세포, 고환, 난소 또는 자궁내 세포와 같은 반응성 세포 또는 조직을 치료하기 위해 사용하는 경우, 본 발명은 투여량 단위 당 본 발명의 화합물 약 0.01 pg 내지 5 mg, 1 pg 내지 5 mg, 500 pg 내지 5 mg, 1 ng 내지 5 mg, 500 ng 내지 5 mg, 1 ㎍ 내지 to 5 mg, 500 ㎍ 내지 5 mg, 또는 1 mg 내지 5 mg 범위 내의 유효적 비-독성 양으로 포함하고 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 맥관 구조와 떨어져 있는 반응성 세포, 조직 또는 기관의 보호 또는 증진에 적합하도록 된 투여량 단위 형태 내에서 약학적 조성물을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 화합물의 양은 약 1 ng 내지 5 mg 의 범위 내이다.

본 발명의 추가의 측면에서, EPO 투여는 뇌 외상을 겪은 동물에 인지 기능을 복구시키는 것으로 발견되었다. 본 발명의 화합물은 EPO 로서 동일한 세포 보호 효과를 갖는 것으로 기대될 것이다. 5 일 또는 30 일의 지연 후에, EPO 는 여전히 샴-처리된 동물과 비교해 기능을 복구할 수 있었으며, 이는 뇌 기능을 재생 또는 복구시키는 EPO 의 능력을 지시한다. 따라서, 본 발명은 또한 상해 후에 잘 치료하는 것을 포함하여 (예를 들어, 3 일, 5 일, 1 주, 1 달 또는 더 길게), 뇌 외상 및 기타 인지기능 장애의 치료를 위한 약학적 조성물의 제조를 위한 본 발명의 화합물의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 유효량의 본 발명의 화합물의 투여에 의한 상해 후 인지기능 장애의 치료 방법에 관한 것이다. 본원에서 기술된 바와 같은 본 발명의 임의의 화합물은 본 발명의 이러한 측면에 사용될 수 있다.

더욱이, 본 발명의 이러한 회복 측면은 세포, 조직 또는 기관 이상의 회복용 약학적 조성물의 제조를 위한 본원 발명의 화합물 중 임의의 것의 용도에 관한 것이며, 여기서 치료는 이상을 초래하는 최초의 손상 후에 개시된다. 더욱이, 본 발명의 화합물을 사용한 치료는 급성 기 (phase) 뿐만 아니라 만성 기 동안에 질환 또는 증상의 경과를 파악할 수 있다.

화합물이 적혈구 생성 작용을 갖는 경우에, 화합물은 투여 당 약 1 ㎍ 내지 약 100 ㎍/kg (체중), 바람직하게는 약 5 ㎍ 내지 약 50 ㎍/kg (체중), 가장 바람직하게는 약 10 ㎍ 내지 약 30 ㎍/kg (체중) 의 투여량으로 전신 투여될 수 있다. 상기 유효 투여량은 화합물의 혈청 농도를 화합물 투여 후 약 10,000, 15,000, 또는 20,000 mU/ml (혈청) 보다 더 크게 달성되게 하기에 충분해야 할 것이다. 상기 혈청 농도는 투여 후 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 시간째에 달성될 수 있다. 상기 투여량은 필요한 만큼 반복될 수 있다. 예를 들어, 임상적으로 필요한 한 오랫동안, 매일, 또는 적절한 간격 후에, 예를들어 매 1 내지 12 주, 그러나 바람직하게는 매 1 내지 3 주째에 투여가 반복될 수 있다. 유효량의 화합물 및 약학적으로 허용가능한 담체는 단일 투여량 바이알 또는 기타 용기에 담아질 수 있다. 그러나, 본 발명의 화합물은 비적혈구 생성인데, 즉 헤모글로빈 농도 또는 헤마토크리트 (hematocrit) 에서의 증가를 야기하지 않으면서 본원에서 기술된 활성을 부여할 수 있다. 상기 비-적혈구 생성 화합물은 본 발명의 방법이 만성적으로 제공되게 된 경우에 특히 바람직하다. 또다른 구현예에서, 본 발명의 화합물은 적혈구 생성을 최대로 자극시키는데 필요할 자연적 에리스로포이에틴의 상응하는 투여량 (W/W) 의 것보다 더 큰 투여량으로 제공된다. 상기 주지된 바와 같이, 본 발명의 화합물은 적혈구 생성 작용을 갖지 않고, 따라서 단위로 표현되는 상기 투여량은 단지 자연적 에리스로포이에틴의 상응하는 양에 대한 실례일 뿐이며 ; 본원에서 투여량에 대한 상기 몰 당량은 본 발명의 임의의 화합물에 적용가능하게 제공된다.

본 발명은 본 발명의 실례로서 제공되는 하기 비-제한적 실시예를 참조로 더욱 잘 이해될 수 있다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 더욱 완전히 예시하기 위해 나타내어진다. 그러나, 그것들은 어떤 식으로든 본 발명의 광범위한 범주를 제한해서는 안 될 것이다.

실시예 1

카르바밀화된 에리스로포이에틴의 제조

본 실시예의 공정의 출발 물질은 정제된 재조합 인간 EPO 였다.

우선, 단백질 농도를 낮은 공정 부피를 유지하기 위해 초여과에 의해 조정하였다. 단백질 농도를 3 mg/ml 로 조정하였다. MWCO 가 5 kDa 인 BioMax (Millipore) 를 사용해 초여과를 수행하였다.

농축 단계의 완료 후, EPO 용액을 0.5 M K-보레이트 테트라 하이드레이트 0.5 M K-시아네이트와 혼합하고, pH 9.0 에서 상기 용액을 32℃ 에서 24 시간 동안 인큐베이션시켰다.

EPO 및 시아네이트의 반응 혼합물의 탈염을 젤여과에 의해 수행하였다. 단백질을 25 mM Tris, 50 mM NaCl pH 8.5 완충액으로 탈염시켰다. G-25 Fine (Amersham Biosciences) 수지를 사용하였다.

대략 15 cm 높이 칼럼 상에서 90 cm/h 의 유속을 사용해, 대략 20% 칼럼 부 피의 샘플 로딩을 사용하였다.

탈염된 카르바밀화된 EPO 를 추가의 공정을 위해 수합하였다.

이 때, 중합체/응집체 함량은 7.3% 였다.

다음 단계는 음이온 교환을 사용한 정제 단계에 의해 수행되는 응집체 및 중합체의 제거였다. SOURCE 30Q (Amersham Biosciences) 수지를 정제에 사용하였다. 카르바밀화된 EPO 를 대략 4.5 mg/ml 로 칼럼에 적용하였다. 진행 완충액 A 는 : 25 mM Tris, 50 mM NaCl pH 8.5 이었고, 용출 완충액 B 는 : 25 mM Tris, 1 M NaCl pH 8.5 이었다. 구배는, 카르바밀화된 EPO 의 주요 피크가 수합 및 풀링되는 20 칼럼 부피에 걸쳐 0-30 % 로 수행되었다.

정제 단계로부터의 풀 (pool) 은 농도 > 0.5 mg/ml 로 조정되었고, 완충액을 정용여과/초여과 접선 유동 여과 단위를 사용하여 20 mM 시트레이트, 100 mM NaCl 완충액으로 변경하였다. 농도 및 완충액 변경은 MWCO 가 5 kDa 인 0.1m² BioMax (Millipore) 상에서 수행하였다.

마침내, 정제된 생약학적 약물 성분을 Millipak 필터 (Millipore) 를 사용해 0.22 ㎛ 여과하여, 병원균을 감소시켰다.

상기 공정은 생약학제로서 유용하게 하는 특성을 가진 카르바밀화된 EPO 를 초래하였다 ;

·중합체/응집체 함량은 SEC-HPLC 에 의해 결정된 바와 같이 0.5% 였음.

·카르바밀화된 리신은 아미노산 분석에 의해 결정된 바와 같이 100% 였음.

·농도는 0.5 mg/ml 초과였음.

PNGase 처리된 단백질 및 N-글리칸이 있는 단백질 둘 다에 대한 고유 질량의 변화의 결정을 위해 MALDI-TOF 를 사용한 특징화를 수행하였다. 또한, MALDI-TOF 펩티드 질량 지문 분석/LC-MS/MS 분석을 하기와 같이 수행하였다 :

1. CEPO 및 EPO 를 POROS R1 칼럼 (POROS R1 역상 칼럼 물질, PerSeptive Biosystems (1-1259-06)) 상에서 정제하였다. 사용 전에 칼럼 물질을 HPLC VWR 152525R 용 50%　HiPerSolv 에 보관하였다. R1 칼럼을 평형화시키고, 5% 포름산 (33015, Riedl de Haeon) 중에서 세척하였다. 샘플을 Agilent MALDI HCCA 품질 매트릭스 용액 (G2037A) 을 사용해 칼럼으로부터 용출하였다. Bruker　Reflex IV MALDI-TOF 장비 상에서 분석하여 고유 질량을 결정하였다.

2. 0.3 pmol CEPO 및/또는 EPO 를 PNGase F 및 PNGase F/O-글리코시다제 1 유닛으로 밤새 처리하였다. 전체 질량을 MALDI-TOF 를 사용하여 결정하였다.

3. CEPO 및 EPO (1.5pmol) 를 50ul 10mM DTT, 50mM NH₄CO₃　가 있는 용액 내에서 환원시키고, 이어서 50ul 55 mM 요오도아세트아미드, 50mM NH₄CO₃ 중에서 알킬화된 용액으로 알킬화시켰다. 샘플을 트립신 분해 전에 POROS R1 칼럼 상에서 정제하였다. 분해된 샘플의 일부를 MALDI-TOF 분석 (POROS 50 R2 PerSeptive Biosystems (1-1159-05)) 전에 POROS R2 칼럼 상에서 정제하였다. R2 칼럼을 평형화시키고, 0.1%　트리플루오로아세트산 (99+% 스펙트럼 등급, Aldrich 302031-100ml) 중에서 세척하였다. 샘플을 Agilent MALDI HCCA 품질 매트릭스 용액 (G2037A) 으로 칼럼으로부터 용출하였다. 트립신 분해에 의해 수득된 펩티드의 풀 (pool) 을 PNGase F 로 처리하고, POROS R2 칼럼을 거쳐 정제하고, MALDI-TOF 에 의해 특징화시켰다.

4. CEPO 및 EPO 를 DTT 로 용액 중에서 환원시키고, 요오도아세트아미드로 알킬화시켰다. 샘플을 Glu-C 분해 전에 POROS R1 칼럼 상에서 정제하였다. 분해된 샘플의 일부를 MALDI-TOF 분석 (POROS 50 R2 PerSeptive Biosystems (1-1159-05)) 전에 POROS R2 칼럼 상에서 정제하였다. Glu-C 분해에 의해 수득된 펩티드의 풀 (pool) 을 PNGase F 로 처리하고, POROS R2 칼럼을 거쳐 정제하였다.

5. 부분적으로 카르바밀화된 CEPO 를 가질 가능성을 알아보기 위해, 고유의 EPO 및 CEPO 를 Lys-C 로 분해하였다. 샘플을 MALDI-TOF 를 사용해 분석하였다.

결론은, 8 개의 리신 및 N-말단이 카르바밀화되었다는 것이었다. 다른 카르바밀화된 아미노산은 검출되지 않았고, 글리칸의 개질은 검출되지 않았다.

참조 :

MS 에 의한 일반적인 단백질 규명 :

Mann M, Hojrup P, Roepstorff P. (1993) Use of mass spectrometric molecular weight information to identify proteins in sequence databases, Biol Mass Spectrom 22, 338-345

Yates, J R, Speicher S, Griffin P R, Hunkapiller T. (1993) peptide mass maps: a highly informative approach to proteins identification , Anal Biochem 214, 397-408

고유 질량 :

Laugesen S, Roepstorff P. (2003) Combination of two matrices results in improved performance of MALDI MS for peptide mass mapping and protein analysis. J Am Soc Mass Spectrom. 14(9), 992-1002.

분해/ 그래피트 :

Larsen MR, Hojrup P, Roepstorff P. (2005) Characterization of gel -separated glycoproteins using two - step proteolytic digestion combined with sequential microcolumns and mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 4(2), 107-19.

EPO 의 카르바밀화의 정도 및 균질성, 카르바밀화의 특이성 및 카르바밀화 부위의 동일성 (identity), 및 카르바밀화 및 정제 공정의 부반응으로 인한 잠재적인 비특이성 개질의 존재를 알아보기 위해 추가의 연구를 행하였다. 데글리코실화된 단백질 샘플의 총 질량 분석 및 펩티드 평가를 위한 분해 및 LC/MS 분석을 위해 엔도프로테아제 LysC 및 트립신을 사용하여 펩티드 맵핑하여 샘플을 분석하였다.

실시예 2

총 질량 분석

실시예 1 의 방법을 사용하여 카르바밀화된 3 개의 EPO 샘플 상에서 분석을 수행하였다. 모든 3 개의 샘플을 실시예 1 에서 기술된 바와 같이, 음이온 교 환을 사용한 카르바밀화 반응 후에 정제하였다. CEPO 샘플 (CEPO-CMC 로 지정함) 중 하나를 1 그램 제조 규모 (농도: 0.82 mg/ml; 완충액: 20 mM Na-시트레이트, 0.3 mM 시트르산, 0.1 M NaCl, pH 6.9-7.3) 로부터 CMC Biotech 에 의해 제조하였다. CEPO-1 및 CEPO-2 로 지정한 남은 2 개의 샘플을 70 mg 실험실 제조 규모 (농도: 1.1 mg/ml; 완충액: 25 mM Tris, 0.2.M NaCl, pH 8.3-8.7) 로부터 제조하였다. 상기 CEPO 샘플을 비개질된 또는 출발 EPO (농도: 0.82 mg/ml; 완충액: 2 mM Na-시트레이트, 0.3mM 시트르산, 0.1 NaCl, pH6.9-7.3) 및 모크 (mock) CEPO (K-시아네이트의 추가 없이 EPO 는 카르바밀화 공정을 수행) (농도: 0.38 mg/ml; 완충액: 20mM Na-시트레이트, 0.3 mM 시트르산, 0.1 M NaCl, pH 6.9-7.3) 와 비교하였다.

ESI -질량 분석계

총 질량 분석 전에, 샘플을 효소적으로 데글리코실화시켰다. 각각의 샘플을 0.5 mg/ml 의 단백질 농도에서 N-글리코시다제 F (Prozyme from Glyko), A. 우레아파시엔스 (A. ureafaciens) 로부터의 재조합 뉴라미니다제 (neuraminidase) 및 O-글리코시다제 50 ㎍ 으로 밤새 인큐베이션시켰다. 데글리코실화 반응의 완료를 12% Tris-글리신 젤 내로 각각의 샘플 3 ㎍ 을 로딩함으로써 SDS-PAGE 에 의해 체크하였다. 각각의 샘플로부터 남은 물질을 질량 분석에 사용하였다.

데글리코실화된 샘플을 적절한 양의 구아니디늄 하이드로클로라이드 저장 용액을 첨가함으로써 4-5 M 구아니디늄 하이드로클로라이드의 농도가 되게 하고, 이어서 2% 포름산 및 40% 아세토니트릴을 함유하는 완충액으로 탈염시켰다. 질량 스펙트럼 분석을 위해 데글리코실화된 EPO 및 CEPO 의 높은 회수를 보장하기 위해 구아니디늄 하이드로클로라이드를 첨가하였다. 이온화의 ESI-나노스프레이 원이 제공된 Waters ESI-Q-Tof- 또는 Waters ESI-LCT-질량 분석계를 사용해 질량 측정을 수행하였다. Mass Lynx 4.0 소프트웨어를 사용한 흥미로운 특정 피크의 자동화 데콘볼레이션 (deconvolation) 및 수동 평가에 의해 데이타의 평가를 수행하였다. 상이하게 카르바밀화된 CEPO 종의 상대 비율의 평가를 m/z 스펙트럼에서 기록된 신호 세기를 기준으로 상대 비율을 계산함으로써 수행하였다.

샘플의 데글리코실화는 완전히 제거되는 N-연결된 당을 초래하였다. 그러나, O-연결된 당의 방출은 특히 CEPO 샘플에 대해 불완전하였다.

기대된 바와 같이, 카르바밀화로 인해, CEPO 샘플은 EPO 및 모크-CEPO 샘플과 비교해 상이한 질량 스펙트럼을 보여주었다. 표 2 에서 나타낸 바와 같이, 스펙트럼의 데콘볼레이션은 다양한 샘플에 대해 이론적으로 기대된 바와 같은 주요 피크에 대한 질량을 초래하였다. 모든 CEPO 샘플에서, 단지 고도로 카르바밀화된 CEPO 분자가 발견되었고, 주요 이성체는 8 개의 리신 및 N-말단, 즉 9 개의 카르마빌 잔기가 완전히 카르바밀화된 전체적으로 카르바밀화된 이성체였다. CEPO 샘플은 CEPO 에 결합된 8, 10 및 11 개의 카르마빌 잔기에 상응하는 추가의 이성체를 함유하는 이성이질성을 보여주었다. 8 개의 카르바밀 잔기를 함유하는 종을 하위-카르바밀화되었다고 지정할 것이고, 1 개 이상의 카르바밀 잔기를 잃은 것이다. 10 및 11 개의 카르바밀 잔기가 있는 종을 과다-카르바밀화되었다고 지정할 것이고, 여분의 카르바밀 잔기는 리신 이외의 아미노산에 비-특이적 방 식으로 결합될 것이다. 샘플 모두의 스펙트럼 중에서 일부 작은 신호가 있었으나, 어느 것도 비-특이적으로 개질된 종으로 여겨지지 않았다. 작은 신호 중 일부를 EPO 및 CEPO 샘플 둘 다에서 발견하였고, 출발 EPO 에 이미 존재하고 있는 오염물질로 여겼다.

표 3 은 다양한 이성체의 상대 비율을 보여준다. 하위-카르바밀화된 CEPO 는 샘플에 따라 총 CEPO 의 약 1.5 내지 5.5% 의 범위이고, 과다-카르바밀화된 CEPO 는 샘플에 따라 약 11 내지 22% 의 범위이다. CEPO-1 및 CEPO-2 는 이성체의 유사한 분포를 갖는 한편, CEPO-CMC 는 다른 2 개의 샘플과 비교해 하위-카르바밀화된 종을 거의 갖지 않는다. 상이한 제조 규모는 상이한 분포를 가진 생성물을 발생시키나, 표 3 은 실험실 제조 규모에 대해 보여주기 때문에, 제조는 유사한 과정으로 반복될 수 있다. 이전에 토의된 바와 같이, 임의의 주어진 제조 규모에서, 음이온 교환 칼럼으로부터의 풀링을 조정함으로써 분포를 조정할 수 있다.

표 3 의 수 (number) 는 하위- 및 과다-카르바밀화된 CEPO 의 최소 비율을 나타낸다. 이에 대한 이유는, 카르바밀화 (8-배 내지 11- 배) 의 정도가 하위, 완전히 및 과다-카르바밀화된 CEPO 의 정확한 정도를 명시할 수 없어서이다. 예를 들어, 질량 분석에 의해 결정된 바와 같이 8 개의 카르바밀 잔기를 함유하는 CEPO 분자는 리신에 특이적으로 결합된 단지 7 개의 카르바밀기만을 가질 수 있고, 남은 카르바밀 잔기는 또다른 아미노산에 비-특이적으로 결합될 것이다. 이러한 상황은 비-특이적으로 결합된 카르바밀기가 있더라도, 단지 하위-카르바밀화된 것으로 여겨질 것이다. 반대로, 10 개의 카르바밀 잔기를 함유하는 CEPO 분자는 단지 8 개의 잔기에 특이적으로 결합할 수 있고, 2 개는 비-특이적으로 결합한다. 이러한 상황에서, CEPO 이성체는 모든 리신이 카르바밀화되어 있지 않더라도, 단지 과다-카르바밀화된 것으로 여긴다.

실시예 3

LysC 펩티드 맵핑

EPO 및 CEPO 샘플의 펩티드 맵 분석을 절편화를 위한 엔도프로테아제 LysC 및 트립신을 사용해 수행하였다. 모든 펩티드 맵 분석을 데글리코실화된 펩티드로 수행하였다. 펩티드의 효소적 글리코실화를 엔도프로테아제의 분해와 동시에 수행하였다.

EPO 및 CEPO 샘플 (각각 약 150 ㎍) 을 구아니디늄 하이드로클로라이드 및 DTT 로 인큐베이션시킴으로써 변성 및 환원시켰다. 자유 술피드릴기를 요오도아세트산으로 알킬화시켰다. 알킬화된 샘플을 탈염시키고, 완충액을 단일 용도 젤 여과 칼럼을 사용해 적절한 완충액으로 교환하였다.

엔도프로테아제, N-글리코시다제 및 뉴라미니다제를 알킬화된 EPO 및 CEPO 샘플에 동시에 첨가하였다. 샘플을 37℃ 에서 밤새 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 각 분해물 약 5 ㎍ 을 Water 사의 ESI-LCT 에 커플링된 Phenomenix 사의 Jupiter, C18 RP-칼럼을 시용하여 RP-HPLC/MS 분석에 사용하였다. 질량 분석계 중의 220 nM 에서의 UV 신호 및 전체 이온 수 (TIC) 를 기록하였다. 수득된 펩티드의 규명 및 정량화를 위해 TIC 를 평가하였다.

LysC 는 카르바밀화된 리신을 절단할 수 없을 것이기 때문에, 모든 리신이 카르바밀화된다면, 어떠한 절편도 LysC 와 함께 분해되어 형성되지 않을 것으로 예상되며, 이는 카르바밀화의 특이성을 지시한다. 하위-카르바밀화의 경우, CEPO 의 특정 절편이 형성해야 할 것이다. 표 4 는 EPO, 완전히 및 과다-카르바밀화된 CEPO 및 하위-카르바밀화된 CEPO 에 대해 LysC 분해로부터 이론적으로 형성된 절편을 열거한다.

예상된 바와 같이, LysC 로 분해된 EPO 및 CEPO 샘플에 대해 수득된 LysC 펩티드 패턴은 완전히 상이하였다. 출발 EPO 및 모크-CEPO 를 LysC 로 분해하면, 예상된 바와 같은 펩티드 패턴을 초래하였다. 두 샘플 모두에서, 모든 펩티드 K1 내지 K9 를 규명할 수 있었다. 펩티드 K5 및 K1 은 EPO 및 모크-CEPO 둘 다에서 부분적으로 비특이적인 방식으로 절단되었다. 유의한 추가의 피크가 규명될 수 없었고, 출발 EPO 와 비교해 모크-CEPO 의 LysC 맵에서는 손실된 피크도 없었다. 상기 데이타로부터, 카르바밀화 및 정제 공정 동안에 EPO 단백질의 유의한 비-특이적 공유 개질이 발생하지 않았다는 것을 결론내릴 수 있다.

CEPO 샘플의 펩티드 맵은 출발 EPO 와 상이한 펩티드 패턴을 가졌다. 하나의 단일 주요 피크 및 몇 개의 작은 피크가 있었다. 표 5 에서 나타낸 바와 같이, 피크로부터 수득된 질량은 하위-카르바밀화된 CEPO 의 LysC 절단으로부터의 절편 및 절단되지 않은 CEPO 에 대해 예상된 질량과 잘 관련되어 있었다. 주요 피크 (A) 는 고유의, 데글리코실화된, 완전히 카르바밀화된 CEPO (9x 카르바밀) 및 과다-카르바밀화된 CEPO (10x 카르바밀) 를 함유하였다 (표 5). 4 개의 작은 피크 (B-E) 는 특정 리신에서 카르바밀화되지 않은 하위-카르바밀화된 CEPO 를 함유하는 상이한 피크와 함께, 하위-카르바밀화된 CEPO (8x 카르바밀) 를 함유하였다. 피크 B 및 C 는 Lys45 에서 특이적으로 카르바밀화가 없는 하위-카르바밀화된 CEPO 를 함유하였고, 한편 피크 D 및 E 는 Lys97 에서 특이적으로 카르바밀화가 없는 하위-카르바밀화된 CEPO 를 함유하였다 (표 5).

상이한 CEPO 샘플에 대한 피크의 상대적 비율에서 일부 차이가 있었다. CEPO 샘플 1 및 2 는 CEPO-CMC 보다 더욱 지배적인 피크 D 및 E 를 가졌고, 이는 그것들이 더 많은 하위-카르바밀화된 CEPO 종을 함유하고 있음을 지시하였다.

기술적 제한으로 인해 주요 피크와 관련된 작은 피크를 정량화하기가 어려웠다. 그러나, 다양한 종의 상대적 비율에 대한 조 (crude) 지침으로서 UV-검출로부터 피크 영역을 사용하여, 하위-카르바밀화된 CEPO 가 샘플에서 CEPO 이성체가 10% 미만일 수 있고, CEPO-1 및 CEPO-2 가 CEPO-CMC 보다 2 배 정도의 양의 하위-카르바밀화된 이성체를 갖고 있음을 추정할 수 있었다. 총 질량 분석에 사용된 것과 동일한 과정을 사용하여, 피크 A 에 위치한 과다-카르바밀화된 종의 정량은 CEPO-CMC 에 대해서는 약 21% 및 CEPO-1 및 CEPO-2 에 대해서는 12% 였다.

결국, LysC 펩티드 맵핑으로부터의 데이타는 실시예 2 에서 기술된 총 질량 분석과 잘 일치한다. CEPO-CMC 는 하위-카르바밀화된 CEPO 이성체를 거의 함유하지 않았고, 한편 CEPO-1 및 CEPO-2 는 더 많은 과다-카르바밀화된 CEPO 이성체를 함유하였다. 본 펩티드 맵핑은 또한, 리신 45 및 리신 97 이 하위-카르바밀화의 위치를 나타낼 수 있음을 지시하였다.

실시예 4

트립신 펩티드 맵핑

트립신을 사용한 샘플의 분해를 실시예 3 에서 기술한다.

EPO 및 모크 CEPO 를 트립신으로 분해하면, 예상된 바와 같은 펩티드 패턴을 나타내었다. 두 샘플에서, 일부 작은 디- 및 트리-펩티드 (T21 과 같은) 를 제외하고는, 트립신 분해에 대해 예상된 바와 같이 대부분의 펩티드 (T1 내지 T21) 가 규명될 수 있었다. 표 6 참조. LysC 분해의 경우에서처럼, 출발 EPO 와 비교해, 유의한 추가의 피크도 없었고, 또한 모크-CEPO 로부터 손실된 피크도 없었다. 상기 데이타로부터, 카르바밀화 및 정제 공정 동안에 EPO 단백질의 비-특이적 공유 개질이 없었다고 결론내렸다.

CEPO 샘플의 펩티드 패턴은 비개질된 EPO 와 상이하였다. 트립신은 보통 리신 및 아르기닌에서 절단하고, 따라서 완전히 카르바밀화된 EPO 의 경우, 단지 절편화가 아르기닌의 절단에 의해 발생할 것으로 기대될 것이다. 따라서, 펩티드 패턴이 트립신으로 수득된 후, 특정 카르바밀화 위치 및 비특이적으로 카르바밀화된 펩티드가 규명될 수 있었다. 단지 아르기닌 (R) 에서 절단하는 것으로 예상되는 CEPO 분자의 트립신 분해로부터 예상되는 펩티드를 표 6 에 나타낸다.

트립신 절단으로부터 예상되는 모든 펩티드는 C-말단 펩티드 R13 을 제외하고는, CEPO 샘플 모두에서 주요 피크로서 규명되었다. 상기 펩티드는 또한 출발 EPO 또는 모크-CEPO 에서 발견되지 않았다. 광범위한 다수의 펩티드에 대해 설명되는 단지 아르기닌의 특이적 절단으로 인한 R1 내지 R12 의 피크가 CEPO 샘플에서 검출되었다. 더욱이, 모든 리신-함유 펩티드가 완전히 카르바밀화된 형태로 거의 배제적으로 검출되었다. 상기 데이타는, 리신 및 N-말단에서의 특이적 카르바밀화의 정도가 높음을 지시한다.

주요 펩티드 뿐만 아니라, 6 개의 작은 펩티드 또한 CEPO 샘플 모두에서 검출되었다. 작은 펩티드 중 3 가지는 과다-카르바밀화된 CEPO 의 트립신 절단의 결과로서 질량 분석에 의해 규명되었고, 나머지 3 가지는 하위-카르바밀화된 CEPO 로부터 발생되었다.

표 7 은 분석된 3 가지 CEPO 샘플의 트립신 맵에서 규명된 모든 펩티드를 열거한다. 완전히 그리고 특이적으로 카르바밀화된 EPO 로부터 형성된 고도의 풍부한 펩티드, R1 내지 R12 는 일반적인 글씨체이고, 옳게 카르바밀화된 EPO 는 추가로 굵은 형태로 나타내었다. 하위-카르바밀화된 CEPO 의 절단에 의해 대부분 거의 형성된 펩티드를 이탈릭체로 나타내고, 과다-카르바밀화된 CEPO 의 절단에 의해 형성된 펩티드를 밑줄로 나타낸다.

표 7 에 관해서, 펩티드 R6_a1 및 R6_b1 을 각각 함유하는 작은 피크 T9 및 T10 은 거의 대부분 Lys97 에서 카르바밀화되지 않는 하위-카르바밀화된 CEPO 분자의 절단으로부터 유도된다. Lys45 아미노산이 카르바밀화되지 않는다면, 펩티드 R4_b1+1xcarb 가 형성된다. 펩티드 R6_a1 (피크 T9) 은 CEPO-CMC 보다 CEPO-1 및 CEPO-2 샘플에서 더욱 풍부하고, 이는 전자가 하위-카르바밀화된 CEPO 를 2 배의 양으로 가질 수 있음을 지시한다. 펩티드 R6_b1 및 R4_b1+1xcarb 는 모든 CEPO 샘플에서 동일한 양으로 존재하였다.

상기 데이타로부터 하위-카르바밀화된 CEPO 의 상대적 함량을 계산하는 것은 기술적 제한으로 인해 어려웠다. 그러나, 모든 것을 함께 관찰하여, 하위-카르바밀화 종이 총 질량 분석 및 LysC 펩티드 맵핑으로부터 추론된 바와 같이 약 10% 임을 추정하였다.

다른 펩티드와 공동-용출된 3 가지 다른 작은 펩티드는 하나의 여분의 카르바밀 잔기, 즉, 과다-카르바밀화된 CEPO 를 함유하는 질량에 의해 방해받았다. 펩티드 R10_2xcarb 및R7_1xcarb 는 미량으로 검출되었고, 여기서 R12_3xcarb 는 유의한 신호 세기를 가졌음을 발견하였다. CEPO-CMC 는 CEPO-1 및 CEPO-2 로서 과다-카르바밀화된 CEPO 종의 2-배 더 높은 함량을 가졌다. 이는, 총 질량 분석으로부터의 결과와 일치한다. 또한, EPO 의 아미노산 서열 151-62 가 비특이적 카르바밀화 위치임을 상기 데이타로부터 결론내릴 수 있었다.

또, 하위-카르바밀화의 정량화에서와 동일한 이유에서, 과다-카르바밀화된 종의 정량화가 어려웠다. 그러나, 카르바밀화의 정도만 상이한 펩티드의 이온화 효능은 유사한 것으로 가정하여, CEPO 약 3-7% 가 과다-카르바밀화된 종인 R12-유도체의 상대적 이온 계수에 의해 계산하였다. 이는, 총 질량 분석에 의해 계산된 과다-카르바밀화된 이성체의 양보다 더 낮다.

일반적으로, 하기는 EPO 및 CEPO 의 총 질량 분석 및 펩티드 맵핑 데이타로부터 결론내어질 수 있다.

총 질량 분석으로부터, CEPO 샘플은 카르바밀화가 보다 높은 정도로 된 것으로 보였다. 모든 분자의 약 95-98% 는 완전히 카르바밀화되어 있고, 9 개 이상의 카르바밀 잔기를 함유한다 (표 3 참조). LysC 및 트립신 맵핑은 특정 위치에서의 높은 정도의 카르바밀화를 확인시키고, CEPO 분자의 95% 를 초과하는 거의 대부분이 8 개의 리신 및 N-말단에서 완전히 카르바밀화되어 있다고 확인시킨다.

데이타는 또한 발견된 4 가지 CEPO 의 이성체를 보여주었다. 8, 9, 10 및 11 개의 카르바밀 잔기를 가진 종이 분석된 CEPO 샘플에서 검출되었고, 9 개의 카르바밀 이성체가 지배적인 종이었다. 9 개 대신에 8 개의 카르바밀 잔기를 함유한 CEPO 분자의 소수 부분 (minor portion) 은 하위-카르바밀화된 것으로 여겨졌다. CEPO-1 및 CEPO-2 에 대해, 상기 이성체는 전체의 약 5% 였고, CEPO-CMC 에 대해서는, 상기 이성체는 총 CEPO 분자 중 약 1.5% 로 이루어졌다.

더욱 유의한 비율의 CEPO 분자가 과다-카르바밀화되었는데, 즉 10 또는 11 개의 카르바밀 잔기를 함유한다. 과다-카르바밀화된 CEPO 는 CEPO-1 및 CEPO-2 에 대해 약 11% 내지 CEPO-CMC 에서는 약 22% 의 범위이다.

펩티드 맵핑으로부터의 데이타는, 8 개의 리신 및 N-말단에서의 카르바밀화의 특이성의 정도가 높음을 보여주었다. 더욱이, 펩티드 맵핑은 일반적으로 총 질량 분석의 결과를 확인시켜 주었다. CEPO 분자 중 약 90-95% 이상이 리신 및 N-말단 모두에서 카르바밀 잔기에 의해 특이적으로 개질된 것으로 보였다. 그러나, 상기 데이타는 또한 하위- 및 과다-카르바밀화 CEPO 종을 보여주었다. 일부 기술적 제한으로 인해, 하위-카르바밀화된 종의 정확한 비율을 결정하기가 어려웠으나, 총 질량 분석에서 발견되는 수와 일치하는 약 10% 이하의 범위 내에 있는 것으로 추정된다. 더욱이, EPO, Lys45 및 Lys97 상에서의 2 가지 구별되는 위치를 카르바밀화의 결핍이 가장 잘 발생할 위치로서 규명하였다.

펩티드 맵핑의 2 가지 세팅 모두에서, 과다-카르바밀화된 종이 또한 발견되었다. 또, 기술적 제한으로 인해, 과다-카르바밀화된 종의 정확한 양을 정량화하기가 어려웠다. 수득된 데이타로부터, 과다-카르바밀화된 종이 펩티드 맵핑에서 거의 검출되지 않았음을 추정할 수 있었다. 단지 과다-카르바밀화된 종의 1/3 내지 1/4 만이 총 질량 분석과 비교해 펩티드 맵핑에 의해 규명되었다. 이러한 불일치에 대한 타당한 설명은, 모든 과다-카르바밀화된 펩티드가 모두 또는 정확한 양으로 규명되지 않았다는 것이다. LysC 맵에서, 10 개의 카르바밀 잔기를 함유하는 절단되지 않은 CEPO 종을 유의한 양으로 검출하였고, 트립신 맵핑에서, 3 개의 펩티드가 하나의 여분의 카르바밀 잔기를 함유하는 것으로 검출되었다. 상기 절편 중 2 개는 단지 미량으로 검출되었다. C-말단에 근접한 제 3 펩티드인 CEPO 펩티드 아미노산 152-162 는 과다-카르바밀화 1/3 을 설명하는 것으로 보이고, EPO 에서 비-특이적 카르바밀화를 위한 위치일 수 있다.

유의한 양의 다른 비-특이적 (카르바밀이 관련되지 않음) 개질은 수행된 임의의 분석에 의해 CEPO 샘플 또는 모크 CEPO 샘플에서 검출되지 않았다.

도 1 은 시아네이트와 단백질의 N-말단 및 리신 잔기와의 반응을 나타낸다.

Claims (126)

1. 에리스로포이에틴의 리신 및 N-말단 아미노산 상의 아민기가 약 90% 이상 카르바밀화되기에 충분한 온도, pH 및 기간 동안 상당량의 에리스로포이에틴을 상당량의 시아네이트와 접촉시키는 것을 포함하는, ESI-질량 분석계에 의해 측정된 바와 같은 응집된 단백질 약 40% 미만 및 과다- 및 하위-카르바밀화된 단백질 약 40 중량% 미만을 갖는 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질의 제조 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질이 인간 에리스로포이에틴인 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질이 응집된 단백질 약 30% 미만을 갖는 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질이 응집된 단백질 약 20% 미만을 갖는 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질이 응집된 단백질 약 10% 미만을 갖는 방법.
6. 제 1 항에 있어서, 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질이 과다- 및 하위-카르바밀화된 단백질 약 30 중량% 미만을 갖는 방법.
7. 제 1 항에 있어서, 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질이 과다- 및 하위-카르바밀화된 단백질 약 20 중량% 미만을 갖는 방법.
8. 제 1 항에 있어서, 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질이 과다- 및 하위-카르바밀화된 단백질 약 10 중량% 미만을 갖는 방법.
9. 제 1 항에 있어서, 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질이 과다-카르바밀화된 단백질 약 30 중량% 미만을 갖는 방법.
10. 제 1 항에 있어서, 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질이 과다-카르바밀화된 단백질 약 20 중량% 미만을 갖는 방법.
11. 제 1 항에 있어서, 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질이 과다-카르바밀화된 단백질 약 10 중량% 미만을 갖는 방법.
12. 제 1 항에 있어서, 시아네이트와 접촉하는 에리스로포이에틴 단백질의 농도가 약 0.05 mg/ml 내지 약 10 mg/ml 인 방법.
13. 제 1 항에 있어서, 시아네이트와 접촉하는 에리스로포이에틴 단백질의 농도가 약 2 mg/ml 내지 약 5 mg/ml 인 방법.
14. 제 1 항에 있어서, 시아네이트의 농도가 약 0.05 M 내지 약 10 M 인 방법.
15. 제 1 항에 있어서, 시아네이트의 농도가 약 0.05 M 내지 약 2 M 인 방법.
16. 제 1 항에 있어서, 온도가 약 0℃ 내지 약 60℃ 의 범위인 방법.
17. 제 1 항에 있어서, 온도가 약 30℃ 내지 약 34℃ 의 범위인 방법.
18. 제 1 항에 있어서, pH 가 약 7 내지 약 11 인 방법.
19. 제 1 항에 있어서, pH 가 약 8 내지 약 10 인 방법.
20. 제 1 항에 있어서, 기간이 약 10 분 내지 약 30 일인 방법.
21. 제 1 항에 있어서, 기간이 약 1 시간 내지 약 5 일인 방법.
22. 제 1 항에 있어서, 에리스로포이에틴 단백질이 완충액의 존재 하에 시아네이트와 접촉하는 방법.
23. 제 22 항에 있어서, 완충액이 보레이트인 방법.
24. 제 22 항에 있어서, 완충액의 농도가 약 0.05 M 내지 약 2 M 인 방법.
25. 제 22 항에 있어서, 완충액의 농도가 약 0.1 M 내지 약 1 M 인 방법.
26. 제 22 항에 있어서, 완충액의 농도가 약 0.5 M 인 방법.
27. 제 1 항에 있어서, 시아네이트와 접촉하는 에리스로포이에틴 단백질의 농도가 약 0.05 mg/ml 내지 약 10 mg/ml 이고, 시아네이트의 농도가 약 0.05 M 내지 약10 M 이고, 온도가 약 0℃ 내지 약 60℃ 의 범위이고, pH 가 약 7 내지 약 11 이고, 기간이 약 10 분 내지 30 일인 방법.
28. 제 1 항에 있어서, 시아네이트와 접촉하는 에리스로포이에틴 단백질의 농도가 약 2 mg/ml 내지 약 5 mg/ml 이고, 시아네이트의 농도가 약 0.05 M 내지 약 2 M 이고, 온도가 약 30℃ 내지 약 34℃ 의 범위이고, pH 가 약 8 내지 약 10 이고, 기간이 약 1 시간 내지 5 일인 방법.
29. 제 1 항에 있어서, 시아네이트와 접촉하는 에리스로포이에틴 단백질의 농도가 약 3 mg/ml 이고, 시아네이트의 농도가 약 0.5 M 이고, 온도가 약 32℃ 이고, pH 가 약 9.0 이고, 기간이 약 24 시간인 방법.
30. 음이온 교환, 양이온 교환, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 또는 크기별 배제 크로마토그래피를 사용하여 카르바밀화된 에리스로포이에틴을 정제하는 것을 포함하는, ESI-질량 분석계에 의해 측정된 바와 같은 응집된 단백질 약 3% 미만 및 과다- 및 하위-카르바밀화된 단백질 약 40 중량% 미만을 갖는 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질의 제조 방법.
31. 제 30 항에 있어서, 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질이 인간 에리스로포이에틴인 방법.
32. 제 30 항에 있어서, 에리스로포이에틴의 리신 및 N-말단 아미노산 상의 아민 잔기의 약 90% 이상이 카르바밀화되는 방법.
33. 제 30 항에 있어서, 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질이 응집된 단백질을 약 2.5% 미만으로 갖는 방법.
34. 제 30 항에 있어서, 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질이 응집된 단백질을 약 0.5% 이하로 갖는 방법.
35. 제 30 항에 있어서, 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질이 과다- 및 하위-카르바밀화된 단백질을 약 30 중량% 미만으로 갖는 방법.
36. 제 30 항에 있어서, 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질이 과다- 및 하위-카르바밀화된 단백질을 약 20 중량% 미만으로 갖는 방법.
37. 제 30 항에 있어서, 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질이 과다- 및 하위-카르바밀화된 단백질을 약 10 중량% 미만으로 갖는 방법.
38. 제 30 항에 있어서, 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질이 과다-카르바밀화된 단백질을 약 30 중량% 미만으로 갖는 방법.
39. 제 30 항에 있어서, 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질이 과다-카르바밀화된 단백질을 약 20 중량% 미만으로 갖는 방법.
40. 제 30 항에 있어서, 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질이 과다-카르바밀화된 단백질을 약 10 중량% 미만으로 갖는 방법.
41. 하기를 포함하는, ESI 질량 분석계에 의해 측정된 바와 같은 응집된 단백질 약 3% 미만 및 과다- 및 하위-카르바밀화된 단백질 약 40 중량% 미만을 갖는 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질의 제조 방법 :

    (a) 에리스로포이에틴의 리신 및 N-말단 아미노산 상의 아민 잔기의 약 90% 이상을 카르바밀화시키기에 충분한 온도, pH, 및 기간 동안 상당량의 에리스로포이에틴 단백질을 상당량의 시아네이트와 접촉시킴 ; 및

    (b) 음이온 교환, 양이온 교환, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 또는 크기별 배제 크로마토그래피를 사용하여 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질을 정제함.
42. 제 41 항에 있어서, 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질이 인간 에리스로포이에틴인 방법.
43. 제 41 항에 있어서, 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질이 응집된 단백질을 약 2.5% 미만으로 갖는 방법.
44. 제 41 항에 있어서, 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질이 응집된 단백질을 약 0.5% 이하로 갖는 방법.
45. 제 41 항에 있어서, 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질이 과다- 및 하위-카르바밀화된 단백질을 약 30 중량% 미만으로 갖는 방법.
46. 제 41 항에 있어서, 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질이 과다- 및 하위-카르바밀화된 단백질을 약 20 중량% 미만으로 갖는 방법.
47. 제 41 항에 있어서, 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질이 과다- 및 하위-카르바밀화된 단백질을 약 10 중량% 미만으로 갖는 방법.
48. 제 41 항에 있어서, 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질이 과다-카르바밀화된 단백질을 약 30 중량% 미만으로 갖는 방법.
49. 제 41 항에 있어서, 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질이 과다-카르바밀화된 단백질을 약 20 중량% 미만으로 갖는 방법.
50. 제 41 항에 있어서, 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질이 과다-카르바밀화된 단백질을 약 10 중량% 미만으로 갖는 방법.
51. 제 41 항에 있어서, 시아네이트와 접촉하는 에리스로포이에틴 단백질의 농도가 약 0.05 mg/ml 내지 약 10 mg/ml 인 방법.
52. 제 41 항에 있어서, 시아네이트와 접촉하는 에리스로포이에틴 단백질의 농도가 약 2 mg/ml 내지 약 5 mg/ml 인 방법.
53. 제 41 항에 있어서, 시아네이트와 접촉하는 에리스로포이에틴 단백질의 농도가 약 3 mg/ml 인 방법.
54. 제 41 항에 있어서, 시아네이트의 농도가 약 0.05 M 내지 약 10 M 인 방법.
55. 제 41 항에 있어서, 시아네이트의 농도가 약 0.05 M 내지 약 2 M 인 방법.
56. 제 41 항에 있어서, 시아네이트의 농도가 약 0.5 M 인 방법.
57. 제 41 항에 있어서, 온도가 약 0℃ 내지 약 60℃ 의 범위인 방법.
58. 제 41 항에 있어서, 온도가 약 30℃ 내지 약 34℃ 의 범위인 방법.
59. 제 41 항에 있어서, 온도가 약 32℃ 인 방법
60. 제 41 항에 있어서, pH 가 약 7 내지 약 11 인 방법.
61. 제 41 항에 있어서, pH 가 약 8 내지 약 10 인 방법.
62. 제 41 항에 있어서, pH 가 약 9 인 방법.
63. 제 41 항에 있어서, 기간이 약 10 분 내지 약 30 일인 방법.
64. 제 41 항에 있어서, 기간이 약 1 시간 내지 약 5 일인 방법.
65. 제 41 항에 있어서, 기간이 약 24 시간인 방법.
66. 제 41 항에 있어서, 에리스로포이에틴 단백질이 완충액의 존재 하에 시아네이트와 접촉하는 방법.
67. 제 66 항에 있어서, 완충액이 보레이트인 방법.
68. 제 66 항에 있어서, 완충액의 농도가 약 0.05 M 내지 약 2 M 인 방법.
69. 제 66 항에 있어서, 완충액의 농도가 약 0.1 M 내지 약 1 M 인 방법.
70. 제 66 항에 있어서, 완충액의 농도가 약 0.5 M 인 방법.
71. 제 41 항에 있어서, 시아네이트와 접촉하는 에리스로포이에틴 단백질의 농도가 약 0.05 mg/ml 내지 약 10 mg/ml 이고, 시아네이트의 농도가 약 0.05 M 내지 약10 M 이고, 온도가 약 0℃ 내지 약 60℃ 의 범위이고, pH 가 약 7 내지 약 11 이고, 기간이 약 10 분 내지 30 일인 방법.
72. 제 41 항에 있어서, 시아네이트와 접촉하는 에리스로포이에틴 단백질의 농도가 약 2 mg/ml 내지 약 5 mg/ml 이고, 시아네이트의 농도가 약 0.05 M 내지 약 2 M 이고, 온도가 약 30℃ 내지 약 34℃ 의 범위이고, pH 가 약 8 내지 약 10 이고, 기간이 약 1 시간 내지 5 일인 방법.
73. 제 34 항에 있어서, 시아네이트와 접촉하는 에리스로포이에틴 단백질의 농도가 약 3 mg/ml 이고, 시아네이트의 농도가 약 0.5 M 이고, 온도가 약 32℃ 이고, pH 가 약 9.0 이고, 기간이 약 24 시간인 방법.
74. ESI-질량 분석계에 의해 측정된 바와 같은 리신 및 아미노 말단 아미노산의 1 차 아민의 약 90% 이상의 카르바밀화, 응집된 단백질 약 3% 미만 및 과다- 및 하위-카르바밀화된 단백질 약 40 중량% 미만을 갖는 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질.
75. 제 74 항에 있어서, 에리스로포이에틴 단백질이 인간 에리스로포이에틴인 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질.
76. 제 74 항에 있어서, 응집된 단백질을 약 2.5% 미만으로 갖는 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질.
77. 제 74 항에 있어서, 응집된 단백질을 약 0.5% 이하로 갖는 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질.
78. 제 74 항에 있어서, 응집된 단백질의 양이 SEC-HPLC 에 의해 측정되는 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질.
79. 제 74 항에 있어서, 과다- 및 하위-카르바밀화된 단백질을 약 30 중량% 미만으로 갖는 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질.
80. 제 74 항에 있어서, 과다- 및 하위-카르바밀화된 단백질을 약 20 중량% 미만으로 갖는 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질.
81. 제 74 항에 있어서, 과다- 및 하위-카르바밀화된 단백질을 약 10 중량% 미만 으로 갖는 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질.
82. 제 74 항에 있어서, 과다-카르바밀화된 단백질을 약 30 중량% 미만으로 갖는 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질.
83. 제 74 항에 있어서, 과다-카르바밀화된 단백질을 약 20 중량% 미만으로 갖는 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질.
84. 제 74 항에 있어서, 과다-카르바밀화된 단백질을 약 10 중량% 미만으로 갖는 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질.
85. 리신 및 아미노 말단 아미노산의 1 차 아민의 약 90% 이상의 카르바밀화, 응집된 단백질 약 40% 미만, 및 상당량의 시아네이트를 갖는 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질을 포함하는 화합물.
86. 제 85 항에 있어서, 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질이 인간 에리스로포이에틴인 화합물.
87. 제 85 항에 있어서, 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질이 응집된 단백질을 약 30% 미만으로 갖는 화합물.
88. 제 85 항에 있어서, 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질이 응집된 단백질을 약 20% 미만으로 갖는 화합물.
89. 제 85 항에 있어서, 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질이 응집된 단백질을 약 15% 미만으로 갖는 화합물.
90. 제 85 항에 있어서, 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질이 응집된 단백질을 약 10% 미만으로 갖는 화합물.
91. 제 85 항에 있어서, 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질이 응집된 단백질을 약 7% 이하로 갖는 화합물.
92. 제 85 항에 있어서, 응집된 단백질의 양이 SEC-HPLC 에 의해 측정되는 화합물.
93. 하기의 단계를 포함하는 방법의 생성물인, ESI 질량 분석계에 의해 측정된 바와 같은 리신 및 아미노 말단 아미노산의 1 차 아민의 약 90% 이상의 카르바밀화, 응집된 단백질 약 3% 미만 및 과다- 및 하위-카르바밀화된 단백질 약 40 중량% 미만을 갖는 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질 :

    (a) 에리스로포이에틴 단백질의 리신 및 N-말단 아미노산 상의 아민 잔기의 약 90% 이상을 카르바밀화시키기에 충분한 온도, pH, 및 기간 동안 상당량의 에리스로포이에틴 단백질을 상당량의 시아네이트와 접촉시킴 ; 및

    (b) 음이온 교환, 양이온 교환, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 또는 크기별 배제 크로마토그래피를 사용하여 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질을 정제함.
94. 제 93 항에 있어서, 에리스로포이에틴 단백질이 인간 에리스로포이에틴인 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질.
95. 제 93 항에 있어서, 응집된 단백질을 약 2.5% 미만으로 갖는 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질.
96. 제 93 항에 있어서, 응집된 단백질을 약 0.5% 이하로 갖는 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질.
97. 제 93 항에 있어서, 응집된 단백질의 양이 SEC-HPLC 에 의해 측정되는 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질.
98. 제 93 항에 있어서, 과다- 및 하위-카르바밀화된 단백질을 약 30 중량% 미만 으로 갖는 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질.
99. 제 93 항에 있어서, 과다- 및 하위-카르바밀화된 단백질을 약 20 중량% 미만으로 갖는 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질.
100. 제 93 항에 있어서, 과다- 및 하위-카르바밀화된 단백질을 약 10 중량% 미만으로 갖는 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질.
101. 제 93 항에 있어서, 과다-카르바밀화된 단백질을 약 20 중량% 미만으로 갖는 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질.
102. 제 93 항에 있어서, 과다-카르바밀화된 단백질을 약 10 중량% 미만으로 갖는 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질.
103. 제 93 항에 있어서, 과다-카르바밀화된 단백질을 약 5 중량% 미만으로 갖는 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질.
104. 제 93 항에 있어서, 방법이, 시아네이트와 접촉하는 에리스로포이에틴 단백질의 농도가 약 3 mg/ml 이고, 시아네이트의 농도가 약 0.5 M 이고, 온도가 약 32℃ 이고, pH 가 약 9.0 이고, 기간이 약 24 시간인 것을 포함하는 카르바밀화된 에 리스로포이에틴 단백질.
105. 리신 및 아미노 말단 아미노산의 1 차 아민의 약 90% 이상의 카르바밀화, 응집된 단백질 약 3% 미만 및 과다- 및 하위-카르바밀화된 단백질 약 40 중량% 미만을 갖는 치료적 유효량의 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
106. 제 105 항에 있어서, 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질이 인간 에리스로포이에틴인 약학적 조성물.
107. 제 105 항에 있어서, 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질이 응집된 단백질을 약 2.5% 미만으로 갖는 약학적 조성물.
108. 제 105 항에 있어서, 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질이 응집된 단백질을 약 0.5% 이하로 갖는 약학적 조성물.
109. 제 105 항에 있어서, 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질이 과다- 및 하위-카르바밀화된 단백질을 약 30 중량% 미만으로 갖는 약학적 조성물.
110. 제 105 항에 있어서, 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질이 과다- 및 하 위-카르바밀화된 단백질을 약 20 중량% 미만으로 갖는 약학적 조성물.
111. 제 105 항에 있어서, 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질이 과다- 및 하위-카르바밀화된 단백질을 약 10 중량% 미만으로 갖는 약학적 조성물.
112. 제 105 항에 있어서, 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질이 과다-카르바밀화된 단백질을 약 30 중량% 미만으로 갖는 약학적 조성물.
113. 제 105 항에 있어서, 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질이 과다-카르바밀화된 단백질을 약 20 중량% 미만으로 갖는 약학적 조성물.
114. 제 105 항에 있어서, 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질이 과다-카르바밀화된 단백질을 약 10 중량% 미만으로 갖는 약학적 조성물.
115. 제 105 항에 있어서, 카르바밀화된 에리스로포이에틴 단백질이 과다-카르바밀화된 단백질을 약 5 중량% 미만으로 갖는 약학적 조성물.
116. 제 105 항에 있어서, 담체가 희석제, 아쥬반트, 또는 부형제인 약학적 조성물.
117. 제 105 항에 따른 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 만성 증상 또는 질환의 치료 방법.
118. 제 105 항에 따른 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 아만성 증상 또는 질환의 치료 방법.
119. 제 105 항에 따른 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 급성 증상 또는 질환의 치료 방법.
120. 제 105 항에 따른 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 중추 신경계 또는 말초 신경계 질환의 치료 방법.
121. 제 120 항에 있어서, 질환이 발작, 허혈성 증상, 척수 손상, 외상성 뇌 손상, 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증, 알츠하이머병, 정신분열증, 또는 화학치료 유도성 신경병증인 방법.
122. 만성 증상 또는 질환의 치료를 위한, 상기 화합물을 포함하는 약학적 조성물의 제조를 위한 제 74 항에 따른 화합물의 용도.
123. 아만성 증상 또는 질환의 치료를 위한, 상기 화합물을 포함하는 약학적 조성 물의 제조를 위한 제 74 항에 따른 화합물의 용도.
124. 급성 증상 또는 질환의 치료를 위한, 상기 화합물을 포함하는 약학적 조성물의 제조를 위한 제 74 항에 따른 화합물의 용도.
125. 중추 신경계 또는 말초 신경계 질환의 치료를 위한, 상기 화합물을 포함하는 약학적 조성물의 제조를 위한 제 74 항에 따른 화합물의 용도.
126. 제 125 항에 있어서, 질환이 발작, 허혈성 증상, 척수 손상, 외상성 뇌 손상, 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증, 알츠하이머병, 정신분열증, 또는 화학치료 유도성 신경병증인 용도.

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