ES2322809T3

ES2322809T3 - Metodo de transformacion de plantas con ensamblaje in vivo de un tratamiento.

Info

Publication number: ES2322809T3
Application number: ES04706637T
Authority: ES
Inventors: Anatoly Giritch; Sylvestre Marillonnet; Victor Klimyuk; Yuri Gleba
Original assignee: Icon Genetics AG; Icon Genetics Inc
Current assignee: Icon Genetics AG; Icon Genetics Inc
Priority date: 2003-01-31
Filing date: 2004-01-30
Publication date: 2009-06-29
Anticipated expiration: 2024-01-30
Also published as: AU2004207177A1; AU2004207177B2; DE602004020180D1; US9856484B2; US20070124831A1; ATE426672T1; WO2004067748A1; CA2513311A1; EP1587932B1; EP1587932A1; DK1587932T3; CA2513311C

Abstract

Un proceso para dotar a una planta o a células vegetales de un rasgo de interés mediante la expresión de una secuencia de ARN de interés, comprendiendo dicho proceso: la provisión mediante cotransformación a la planta o a las células de dicha planta de un primer vector y un segundo vector y la selección de las células dotadas de dicho rasgo de interés, donde dicho primer vector contiene una primera secuencia de nucleótidos con un primer segmento que codifica, en dirección 5'' a 3'': - una parte 5'' de dicha secuencia de ARN de interés y - una parte 5'' de un intrón; y dicho segundo vector contiene una segunda secuencia de nucleótidos con un segundo segmento que codifica, en dirección 5'' a 3'': - una parte 3'' de un intrón y - una parte 3'' de dicha secuencia de ARN de interés.

Description

Método de transformación de plantas con ensamblaje in vivo de un tratamiento.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un proceso para dotar a una planta o a células vegetales de un rasgo de interés. Además, la invención se refiere a un proceso para seleccionar secuencias de nucleótidos por un fenotipo deseado en plantas. La invención se refiere también a plantas transgénicas y a bibliotecas de plantas o de semillas de plantas obtenidas u obtenibles de acuerdo con los procesos de la invención. Además, la invención se refiere a vectores para estos procesos y a plantas o células vegetales transformadas con los mismos.

Antecedentes de la invención

Los métodos actualmente utilizados para la transformación estable de plantas emplean normalmente la administración directa (bombardeo con microproyectiles, electroporación o tratamiento de protoplastos mediado por PEG, para una revisión ver: Gelvin, S.B., 1998, Curr. Opin. Biotechnol., 9, 227-232; Hansen & Wright, 1999, Trends Plant Sci., 4, 226-231) o la administración mediada por Agrobacterium de vectores de ADN de interés preconstruidos a las células de la planta. Las manipulaciones con dichos vectores de ADN in planta se limitan a simplificar la resolución de patrones de integración complejos (US6114600; Srivastava & Ow, 2001, Plant Mol. Biol., 46, 561-566; Srivastava y col., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 11117-11121) o a la eliminación de secuencias de ADN auxiliares de vectores integrados de manera estable en el ADN cromosómico. Los métodos para la integración estable en células vegetales de regiones de ADN-T mediada por Agrobacterium, utilizan una secuencia de ADN deseada que va a ser integrada flanqueada por secuencias limitantes izquierda (LB) y derecha (RB) necesarias para la transferencia del ADN-T y la integración en el ADN cromosómico del huésped (US4940838; US5464763; EP0224287; US6051757; US5731179; WO9400977; EP0672752). En la mayoría de los casos, los procedimientos están dirigidos a la integración de una región de ADN-T específica en el ADN cromosómico, menos frecuentemente los procedimientos están diseñados para la cointegración de dos o más regiones de ADN-T diferentes (US4658082). Este último procedimiento es utilizado para segregar diferentes ADN-Ts en la progenie con diferentes fines. Por ejemplo, Komari y colaboradores (US5731179) describen un método para transformar simultáneamente células vegetales con dos ADN-Ts, uno de ellos portador de un marcador seleccionable funcional en plantas, mientras que el otro ADN-T contiene una secuencia de ADN deseada que va a ser introducida en las células vegetales. Esto permite segregar en la progenie plantas transgénicas sin un marcador seleccionable.

La integración de un gen de interés en el ADN cromosómico para expresar dicho gen puede ser llevada a cabo también con la ayuda de vectores que no contengan promotores transcripcionales funcionales, sino elementos reguladores de la traducción (WO0246440) denominados IRESs (sitios internos de entrada de ribosomas). Tales vectores pueden proporcionar la expresión del gen de interés tras la integración en la región transcripcionalmente activa del ADN cromosómico. Otro procedimiento para proporcionar la expresión de un gen sin promotor o de un gen con un promotor mínimo, depende también de la integración en regiones transcripcionalmente activas (Stangeland y col., 2003, J. Exp. Bot., 54, 279-290; Baxter-Burrell y col., 2003, Ann. Bot. (Lond), 91, 129-141) o muy próximas a intensificadores transcripcionales potentes (Baxter-Burrell y col., 2003, Ann. Bot. (Lond), 91, 129-141).

En general, las regiones de ADN diseñadas para la integración estable en células vegetales son preconstruidas in vitro empleando técnicas estándar de biología molecular (Sambrook, Fritsch & Maniatis, 1989, Molecular cloning: A laboratory manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor, NY: CSH Laboratory Press). Además, se utiliza la ingeniería in vivo en células bacterianas con el fin de, por ejemplo, ensamblar un vector binario con la ayuda de recombinación homóloga (US5731179). Las manipulaciones con ADN-T in planta están limitadas a regiones de ADN-T preintegradas en un cromosoma. Tales manipulaciones fueron realizadas para eliminar ciertas secuencias del ADN-T, por ejemplo secuencias que codifican marcadores seleccionables que incluyen genes que inducen una anormalidad morfológica. La eliminación de fragmentos de ADN indeseables de las regiones del ADN-T fue intentada con la ayuda de recombinación específica de sitio (WO9742334; Endo y col., 2002, Plant J., 30, 115-122) o por medio de transposición (US5792924). Aunque la escisión de ADN específica de sitio mediada por recombinasa/integrasa es más eficaz que la integración, la selección por acontecimientos de escisión es una necesidad que da lugar a una etapa adicional más de cultivo de tejidos o de selección de la progenie por los acontecimientos de recombinación deseados. En resumen, todos los procesos de manipulación con ADN-Ts integrados de manera estable en los cromosomas de plantas requieren mucho tiempo, son inflexibles y en general se limitan a una simple escisión (con menor eficacia a la integración) de los fragmentos de ADN deseados. Además, estos procesos están normalmente muy limitados en cuanto a diversidad combinatoria, ya que se limitan a simples manipulaciones con un número limitado de genes y elementos reguladores conocidos.

Frecuentemente, las regiones de ADN-T se cointegran en el mismo locus (Jorgensen y col., 1987, Mol. Gen. Genet., 207, 471-477; Castle y col., 1993, Mol. Gen. Genet., 241, 504-514; Cluster y col., 1996, Plant. Mol. Biol., 32, 1197-1203; DeNeve y col., 1997, Plant J., 11, 15-29) formando multímeros de regiones de ADN-T. Sin embargo, tales acontecimientos de integración complejos son normalmente indeseables en cualquier aspecto, ya que tales ordenamientos complejos están acompañadas por la inactivación del transgén (Cluster y col., 1996, Plant Mol. Biol., 32, 1197-1203; Jorgensen y col., 1996, Plant Mol. Biol., 31, 957-973). La transformación de plantas con dos regiones diferentes de ADN-T, una de ellas portadora de una secuencia codificadora de un marcador de la transformación, fue utilizada para generar plantas transgénicas libres de marcador de la transformación (Komari y col., 1996, Plant J., 10, 165-174). La cointegración de dos copias de ADN-Ts, una de ellas portadora de un promotor y la otra portadora del gen de la fosfotransferasa de neomicina sin promotor, fue utilizada para estudiar el patrón de cointegración del ADN-T (Krizkova & Hrouda, 1998, Plant J., 16, 673-680).

Los métodos descritos anteriormente presentan varios inconvenientes. En el método de Krizkova y Hrouda, no se selecciona por la cointegración de ambos vectores (o de ambas copias del mismo vector). En su lugar, se selecciona por la transformación expresable del gen de la fosfotransferasa de neomicina, que puede ser debida a la inserción fortuita del gen de la fosfotransferasa de neomicina sin promotor en una región cromosómica transcripcionalmente activa. Además, en los métodos que utilizan un único vector de transformación, se requieren procedimientos de clonaje complejos y de larga duración, por ejemplo si las células vegetales van a ser transformadas con una combinación compleja de secuencias de interés (por ejemplo, más de un gen a ser expresado junto con elementos específicos como sitios de recombinación, secuencias reguladoras, secuencias de transposones, etc.). Además, los métodos anteriores no son adecuados para métodos de ingeniería in vivo como la redistribución de genes (o de dominios proteicos) o la evolución dirigida. Además, los métodos anteriores no permiten obtener plantas transgénicas biológicamente seguras, por lo que el transgén de dichas plantas transgénicas se pierde o se convierte en no funcional en la progenie de dichas plantas transgénicas.

Por tanto, es un objeto de la invención proporcionar un proceso eficaz, rápido y muy versátil para producir una planta transgénica o células vegetales transgénicas. Es otro objeto de la invención proporcionar un método de selección por la cointegración de dos o más vectores transformados en células vegetales. Es otro objeto de la invención proporcionar un proceso para la producción de plantas transgénicas transformadas en un cromosoma, mediante el cual las secuencias de ADN de interés serán construidas in planta (por ejemplo para reducir el trabajo de clonaje o para transformar una secuencia de interés que tenga efectos tóxicos sobre las bacterias que se utilizan para el clonaje). Es otro objeto de la invención proporcionar un proceso para la transformación genética estable de células vegetales, que permita la producción de una biblioteca de rasgos o funciones y/o la selección por un rasgo (o función) deseado a partir de la biblioteca de rasgos (o funciones). Es un objeto adicional de la invención proporcionar un proceso para producir plantas transgénicas medioambientalmente seguras, que transfieran la función o el rasgo transgénico a la progenie con una baja probabilidad.

Descripción general de la invención

Los objetos anteriores se consiguen mediante un proceso para dotar a una planta o a células vegetales de un rasgo de interés mediante la expresión de una secuencia de ARN de interés, comprendiendo dicho proceso:

el suministro a la planta o a células de dicha planta de un primer vector y un segundo vector y la selección de las células dotadas de dicho rasgo de interés, en el cual

dicho primer vector contiene una primera secuencia de nucleótidos con un primer segmento que codifica, en dirección 5' a 3':

-: una parte 5' de dicha secuencia de ARN de interés y

-: una parte 5' de un intrón; y

dicho segundo vector contiene una segunda secuencia de nucleótidos con un segundo segmento que codifica, en dirección 5' a 3':

-: una parte 3' de un intrón y

-: una parte 3' de dicha secuencia de ARN de interés,

según se define en la reivindicación 1.

\vskip1.000000\baselineskip

La invención proporciona además células vegetales, plantas o partes de las mismas, tales como semillas, que están dotadas de un rasgo de interés de acuerdo con el proceso anterior. Además, se proporciona una biblioteca de plantas o de semillas de plantas. Preferiblemente, los miembros de dicha biblioteca están dotados de diferentes rasgos de interés. Además, se proporciona un kit de partes que contiene dicho primer y dicho segundo vector de la invención. Preferiblemente, dicho primer y/o dicho segundo vector de dicho kit de partes no contiene un lugar de recombinación específica de sitio para prevenir la recombinación específica de sitio entre dicho primer vector y dicho segundo vector.

La invención está basada en el hallazgo sorprendente de que puede conseguirse un ensamblaje eficaz de secuencias transcritas, en particular de una secuencia codificadora que codifica o tiene como resultado un rasgo de interés, mediante la transformación de células vegetales con dos o más vectores, portando cada uno de ellos un segmento que codifica una parte de una secuencia transcrita o una parte de dicha secuencia codificadora. El proporcionar, mediante cotransformación, a células vegetales dicho primer y dicho segundo vector, tiene como resultado una elevada probabilidad de integración de dichos vectores cerca uno de otro en un cromosoma de dichas células vegetales.

De este modo, puede formarse en dicho cromosoma una unidad de transcripción funcional que contenga secuencias de ambos (diferentes) vectores y seleccionarse por la misma. La colocación adecuada de partes 5' y 3' de un intrón permite el procesamiento mediante el ayuste ("splicing") de intrones de un transcrito primario derivado de dicha unidad de transcripción, mediante lo cual se forma dicha secuencia de ARN de interés. Fue sorprendente encontrar la elevada eficacia con la cual células vegetales o plantas dotadas con un rasgo de interés pueden ser obtenidas mediante el proceso de la invención, no sólo si dicho primer vector y dicho segundo vector están integrados en un cromosoma de manera contigua, sino también si secuencias cromosómicas del huésped separan las secuencias de los vectores integrados. Dicha eficacia es comparable a la de una transformación estándar con un único vector mediada por Agrobacterium. El hallazgo más sorprendente fue la capacidad de las secuencias de los vectores cointegradas (en particular de ADN-Ts) para expresar una proteína de interés (como dicho rasgo de interés) en dichas células vegetales, cuando la secuencia que codifica dicha proteína de interés es dividida en partes y cada parte es proporcionada a dichas células con un vector diferente.

El proceso de la invención permite producir plantas o células vegetales transgénicas que están transformadas de manera estable en un cromosoma con secuencias que derivan al menos de un primer vector y un segundo vector. La transformación estable de un cromosoma indica la integración en dicho cromosoma, de tal manera que dicha secuencia de ADN de interés se replique junto con dicho cromosoma. Preferiblemente, dicha secuencia de ADN de interés puede ser heredada durante la división celular y la reproducción del organismo durante varias generaciones.

En el proceso de la invención, se dota a una planta o a células vegetales de un rasgo de interés. Ejemplos de rasgos de interés incluyen la expresión de una proteína de interés (por ejemplo un marcador seleccionable, una proteína que confiera resistencia frente a, por ejemplo, insectos, pesticidas, herbicidas, calor o una proteína que vaya a ser producida con fines industriales o farmacéuticos) o la disminución regulada de un gen nativo de las células huésped mediante, por ejemplo, interferencia con el ARN. Dicho rasgo de interés requiere la expresión de dicha secuencia de ARN de interés. La traducción de dicha secuencia de ARN de interés puede dar lugar a la expresión de una proteína de interés, por lo que dicha parte 5' de dicha secuencia de ARN de interés puede codificar la parte N-terminal de dicha proteína de interés, y dicha parte 3' de dicha secuencia de ARN de interés puede codificar la parte C-terminal de dicha proteína de interés. Además, dicha parte 5' o dicha parte 3' de dicha secuencia de ARN de interés puede ser o puede contener un elemento regulador para la traducción de una parte de dicha secuencia de ARN de interés en una proteína de interés. Alternativamente, dicha secuencia de ARN de interés puede producir dicha disminución regulada de un gen nativo de las células huésped. Dicho primer vector contiene una primera secuencia de nucleótidos con un primer segmento que codifica, en dirección 5' a 3', una parte 5' de dicha secuencia de ARN de interés y una parte 5' de un intrón. Dicho segundo vector contiene una segunda secuencia de nucleótidos con un segundo segmento que codifica, en dirección 5' a 3', una parte 3' de un intrón y una parte 3' de dicha secuencia de ARN de interés. Dicha primera y dicha segunda secuencia de nucleótidos son introducidas en dichas células vegetales por dicho primer y dicho segundo vector. Dicha primera y dicha segunda secuencia de nucleótidos son adaptadas de tal manera que dichas plantas o dichas células puedan ser dotadas preferiblemente con dicho rasgo de interés si, y sólo si, a dichas células vegetales se les proporciona dicho primer vector y dicho segundo vector. Dicha secuencia de ARN de interés, preferiblemente, no puede ser expresada y dichas células vegetales no pueden ser dotadas de dicho rasgo de interés si a dichas células vegetales o a dicha planta se les proporciona únicamente dicho primer vector o únicamente dicho segundo vector. Sin embargo, el proceso de la invención puede ser llevado a cabo de tal manera que se requiera adicionalmente un tercer vector (o vectores adicionales) para expresar dicha secuencia de ARN de interés (cf. Fig. 1 II).

De acuerdo con la invención, dichos vectores tienen una elevada probabilidad de formar una unidad de transcripción que contenga dicha primera y dicha segunda secuencia de nucleótidos. Tal unidad de transcripción puede ser formada mediante cointegración de dichos vectores en una región transcripcionalmente activa de un cromosoma. Sin embargo, preferiblemente, está incluido un promotor de la transcripción en dicha primera secuencia de nucleótidos corriente arriba de dicho primer segmento.

En la primera etapa del proceso de la invención, se proporciona a células vegetales o a una planta al menos dicho primer y dicho segundo vector. Puede proporcionarse a las células vegetales dichos al menos dos vectores diferentes en cultivo de tejidos, en particular en tejido de fragmentos de hojas o en cultivo de tejidos de protoplastos de células vegetales. Además, pueden proporcionarse dicho primer y dicho segundo vector a explantes (por ejemplo explantes de raíz, discos de hoja) de una planta. Además, pueden proporcionarse dichos vectores a plantas completas o a partes de plantas completas. Preferiblemente, dicho primer vector y dicho segundo vector son proporcionados de tal manera que se integren en un cromosoma de dichas células vegetales. Dicho cromosoma puede ser un cromosoma nuclear o un cromosoma de un orgánulo (plastídico o mitocondrial). Preferiblemente, dicho primer vector y dicho segundo vector se integran en un cromosoma nuclear. En cualquier caso, dichos vectores deben integrarse en el mismo cromosoma, en particular en el mismo cromosoma nuclear, lo cual puede ser conseguido mediante una selección adecuada según se describe posteriormente.

Dichos vectores pueden ser proporcionados a dichas células vegetales mediante cualquier método de transformación conocido, ejemplos de los cuales son el bombardeo de partículas, la electroporación y la transformación mediada por Agrobacterium. Sin embargo, con el fin de conseguir una elevada probabilidad de integración de dicho primer vector y dicho segundo vector próximos entre sí en dicho cromosoma, se prefiere enormemente proporcionar dichos vectores mediante transformación mediada por Agrobacterium. En este caso, dicho primer vector y dicho segundo vector pueden derivar de un plásmido Ti y dicha primera y dicha segunda secuencia de nucleótidos residirán cada una de ellas entre las secuencias del límite izquierdo y del límite derecho del ADN-T. Dichas secuencias del límite izquierdo y del límite derecho pueden proporcionar posteriormente la integración de dichos ADN-Ts en dicho cromosoma. Dicho primer vector y dicho segundo vector pueden ser proporcionados a dichas células de manera consecutiva. Sin embargo, la eficacia del proceso disminuye al aumentar el tiempo entre el suministro de dichos vectores. Preferiblemente, se proporcionan por tanto dicho primer y dicho segundo vector a dicha planta o a dichas células vegetales en un procedimiento de una sola etapa, esto es mediante cotransformación. En el caso de la administración directa de los vectores, esto significa que se utilizan preferiblemente mezclas de dichos vectores. En el caso de la administración de ADN-T mediada por Agrobacterium, pueden utilizarse mezclas de cepas (o células) de Agrobacterium, por lo que cada célula o cepa contendrá un plásmido Ti diferente con dicho primer vector o dicho segundo vector (y opcionalmente con un tercer vector). El suministrar a dichas células vegetales o a dichas plantas dichos vectores en un procedimiento de una sola etapa, en particular de manera simultánea, es eficaz y proporciona una buena eficacia total del proceso de la invención.

La selección de las células vegetales dotadas de dicho rasgo de interés puede ser realizada de acuerdo con métodos generalmente conocidos. El método de selección depende en general del método de transformación. Dicha primera o dicha segunda secuencia de nucleótidos puede contener un marcador seleccionable. Preferiblemente, dicho rasgo de interés es la resistencia frente a un agente selectivo, permitiendo la selección de las células transformadas en las que ha tenido lugar con éxito el proceso de la invención.

En el proceso de la invención, pueden ponerse en contacto secuencias transcritas codificadas por diferentes vectores en dicha secuencia de ARN de interés para producir dicho rasgo de interés. Ejemplos de tales secuencias transcritas son secuencias que codifican una proteína de interés y secuencias implicadas en la regulación de la transcripción (como un elemento IRES, una secuencia 5' no traducida o una región 3' no traducida) y una secuencia de ARN para interferencia con el ARN. Los promotores no son secuencias transcritas. En una realización básica, el proceso de la invención comprende la traducción de dicha secuencia de ARN de interés para producir una proteína de interés. Dicho rasgo de interés puede ser debido a dicha proteína de interés. En este caso, dicha proteína de interés puede ser expresada preferiblemente únicamente si a dichas células vegetales se les ha proporcionado dicho primer vector y dicho segundo vector, lo cual puede ser realizado de varias formas. Dicho primer segmento o dicho segundo segmento pueden codificar, por ejemplo, un elemento regulador de la traducción (como un sitio interno de entrada de ribosomas IRES, o una región 5' no traducida o una región 3' no traducida) y el otro segmento puede codificar dicha proteína de interés. Preferiblemente, sin embargo, dicho primer segmento codifica una parte 5' de dicha proteína de interés y dicho segundo segmento codifica una parte 3' de dicha proteína de interés, preferiblemente de tal manera que dicho rasgo de interés sea producido únicamente si dicho primer vector y dicho segundo vector son proporcionados a dichas células vegetales o a dicha planta. Uno o ambos de dichos segmentos puede contener además un elemento regulador de la traducción u otras secuencias no traducidas.

Si dicho rasgo de interés es debido a una proteína de interés, dicho ARN de interés puede ser traducido en dichas células para expresar dicha proteína de interés. La expresión de dicha proteína de interés demuestra que dicha secuencia de ARN de interés ha sido expresada. La expresión de la proteína de interés requiere el ayuste de intrones de un transcrito primario para formar dicha secuencia de ARN de interés por medio de dicha parte 5' y dicha parte 3' del intrón. Dichas partes del intrón deben ser adaptadas de tal manera que el ayuste del transcrito primario de lugar a una secuencia de ARN de interés con el marco de lectura correcto para la expresión de una proteína de interés funcional. Para este fin, dicha parte 5' de dicha secuencia de ARN de interés está preferiblemente contigua a la parte 5' de un intrón y dicha parte 3' de un intrón está preferiblemente contigua a la parte 3' de dicha secuencia de ARN de
interés.

Dicha parte 5' de un intrón y dicha parte 3' de un intrón están codificadas por dicho primer segmento y dicho segmento, respectivamente. Las secuencias que codifican las partes del intrón pueden ser tomadas de un intrón conocido. Dicho intrón puede ser un intrón de autoayuste, por ejemplo un intrón del grupo I o del grupo II. Alternativamente, dicho intrón puede ser un intrón de un pre-ARNm nuclear para el ayuste mediado por ayustosomas ("spliceosomes"). Los más preferidos son los intrones de un pre-ARNm nuclear para el ayuste mediado por ayustosomas. Una secuencia de ADN que codifica un intrón puede ser dividida en secuencias que codifiquen dichas partes 5' y 3' del intrón e incorporadas, respectivamente, en dicho primer segmento y en dicho segundo segmento. Tal división tiene que ser de tal manera que dichas partes 5' y 3' del intrón sean funcionales como un intrón, lo cual puede ser analizado experimentalmente. Un intrón existente de forma natural puede ser modificado siempre que dichas partes del intrón permanezcan funcionales como un intrón. Las secuencias que codifican dichas partes del intrón pueden ser también, por supuesto, sintetizadas artificialmente e incorporadas a dicho primer segmento y a dicho segundo segmento (ver los
ejemplos).

Una realización básica de la invención está ejemplificada en la Fig. 10 y en la Fig. 11. De acuerdo con la Fig. 10, dicho primer vector contiene una primera secuencia de nucleótidos (mostrada en A) con un primer segmento que codifica la parte 5' de un marcador seleccionable y la parte 5' de un intrón. Dicho segundo vector contiene una segunda secuencia de nucleótidos (mostrada en B) con un segundo segmento que codifica la parte 3' de un intrón y la parte 3' de un marcador seleccionable. La aplicación de un agente selectivo a las células transformadas con dicho primer vector y dicho segundo vector permite la selección por tal modo de cointegración, en la cual dichos vectores forman una unidad de transcripción funcional (representada en C). Un transcrito primario producido en células vegetales bajo el control de un promotor corriente arriba de dicho primer segmento da lugar a un transcrito primario que contiene, en dirección 5' a 3', la parte 5' de dicho marcador seleccionable, la parte 5' de dicho intrón, posiblemente secuencias derivadas del cromosoma del huésped, la parte 3' de dicho intrón y la parte 3' de dicho marcador seleccionable. Dichas partes del intrón permiten el ayuste del intrón de dicho transcrito primario para formar dicha secuencia de ARN de interés. La traducción de dicha secuencia de ARN de interés proporciona a dichas células resistencia a dicho agente selectivo como rasgo de interés. Según se muestra en la Fig. 11, el marcador seleccionable puede ser cualquier gen de interés. De acuerdo con el conocimiento general, dicha parte 5' de un intrón y dicha parte 3' de un intrón pueden ser adaptadas de tal manera que dicha secuencia de ARN de interés contenga el marco de lectura correcto para que una proteína sea expresada.

Dicha primera o dicha segunda secuencia de nucleótidos puede contener genes o secuencias codificadoras de interés adicionales, opcionalmente con elementos reguladores como un promotor, un elemento IRES, etc., para dotar a dichas células de un rasgo de interés adicional. De esta forma, pueden expresarse dos, tres o más proteínas o rasgos de interés. Además, secuencias de nucleótidos complejas pueden ser cointegradas en un cromosoma, mediante lo cual pueden obtenerse patrones de integración complejos según está ejemplificado en la Fig. 12C. El clonaje de vectores como los mostrados en la Fig. 12A y B es mucho más fácil que el clonaje de un vector que contenga todos los elementos mostrados en la Fig. 12C, lo cual constituye una importante ventaja en el proceso de la
invención.

En una realización adicional (ver la Fig. 1 II), se proporciona además a dichas células vegetales o a dicha planta un tercer vector conteniendo una tercera secuencia de nucleótidos que codifica, en dirección 5' a 3':

-: una parte 3' de un intrón funcional con dicha parte 5' de un intrón de dicha primera secuencia de nucleótidos,

-: una parte central de dicha secuencia de ARN de interés, y

-: una parte 5' de un intrón funcional con dicha parte 3' de un intrón de dicha segunda secuencia de nucleótidos.

\vskip1.000000\baselineskip

En este caso, la expresión de dicho rasgo de interés requiere preferiblemente la formación de una unidad de transcripción en el cromosoma de la planta que contenga secuencias de los tres vectores.

En una realización adicional, el método de la invención puede ser utilizado para someter a selección un conjunto de primeros vectores y un conjunto de segundos vectores por una combinación de un primer y un segundo vector, dando lugar dicha combinación a plantas o a células vegetales dotadas de un rasgo deseado. Esta realización del proceso de la invención comprende las etapas (A) y (B) siguientes:

(A): el suministro a plantas o a células vegetales de una mezcla de

(i): un conjunto de m primeros vectores que tienen cada uno de ellos una primera secuencia de nucleótidos con un primer segmento que codifica una parte 5' de dicha secuencia de ARN de interés, siendo seleccionada dicha parte 5' de dicha secuencia de ARN de interés del conjunto (a_{1}, a_{2}, ..., a_{m}) y

(ii): un conjunto de n segundos vectores que tienen cada uno de ellos una segunda secuencia de nucleótidos con un segundo segmento que codifica una parte 3' de dicha secuencia de ARN de interés, estando seleccionada dicha parte 3' de dicha secuencia de ARN de interés del conjunto (b_{1}, b_{2}, ..., b_{n}),

\quad: donde

\quad: m y n son independientes uno de otro y son ambos números enteros >1,

\quad: dichos primeros vectores y dichos segundos vectores están adaptados para producir diferentes secuencias de ARN de interés,

(B): la selección de las plantas o células vegetales transformadas dotadas de un rasgo de interés.

\vskip1.000000\baselineskip

Dicho conjunto de primeros vectores y dicho conjunto de segundos vectores pueden ser bibliotecas de primeras o segundas secuencias de nucleótidos, respectivamente, en dichos vectores. Para m=3 y n=2, como ejemplo, pueden obtenerse células vegetales que expresen las secuencias de ARN de interés a_{1}b_{1}, a_{1}b_{2}, a_{2}b_{1}, a_{2}b_{2}, a_{3}b_{1} y a_{3}b_{2} las cuales, por traducción, pueden dar lugar a diferentes proteínas de interés o diferentes rasgos de interés. Cada célula vegetal o planta que expresa una secuencia de ARN de interés particular representa un miembro de una biblioteca de plantas obtenidas mediante la invención. Pueden producirse semillas de tales plantas para obtener una biblioteca de semillas de plantas. En la forma de semillas, la biblioteca puede ser fácilmente almacenada y la biblioteca puede ser mantenida o propagada, si es necesario. La etapa (B) de las realizaciones anteriores puede ser posteriormente llevada a cabo independientemente de la etapa (A), por ejemplo mucho tiempo después de llevar a cabo la etapa (A). Esta realización es particularmente útil para redistribuir y seleccionar por una combinación de dominios proteicos de una proteína con múltiples dominios.

En el método de selección anterior, puede formarse la variedad combinatoria de rasgos de interés más grande (y por tanto de plantas o de células vegetales transgénicas). Una realización más especial comprende las etapas (A) y (B) siguientes:

(A): el suministro a plantas o a células vegetales de una mezcla de

(i): un primer vector que tiene una primera secuencia de nucleótidos con un primer segmento que codifica una parte 5' de dicha secuencia de ARN de interés a_{1} y

(ii): un conjunto de n segundos vectores que tienen cada uno de ellos una segunda secuencia de nucleótidos con un segundo segmento que codifica una parte 3' de dicha secuencia de ARN de interés seleccionada del conjunto (b_{1}, b_{2}, ..., b_{n}),

\quad: donde

\quad: n es un número entero >1,

\quad: dicho primer vector y dichos segundos vectores están adaptados para expresar secuencias de ARN de interés del tipo (a_{1}b_{1}, a_{1}b_{2}, ..., a_{1}b_{n}) o del tipo (b_{1}a_{1}, b_{2}a_{1}, ..., b_{n}a_{1}),

\vskip1.000000\baselineskip

Pueden posteriormente formarse diferentes secuencias de ARN de interés, conteniendo cada una de ellas una porción de la secuencia de dicho primer segmento y una porción de la secuencia de un segundo segmento.

El primer vector puede proporcionar, por ejemplo, secuencias reguladoras de la traducción que conviertan en traducibles las porciones de las secuencias de los segundos vectores después del ensamblaje de una secuencia de ARN de interés que contenga una porción de la secuencia de dicho primer vector y una porción de la secuencia de un vector de dicho conjunto de segundos vectores.

El proceso total de la invención tiene suficiente eficacia para permitir aplicaciones rutinarias del proceso de la invención. Por ejemplo, el proceso de selección de bibliotecas de ADN por un rasgo útil puede ser llevado a cabo in planta con un peligro bajo de perder miembros de la biblioteca que no sean compatibles con los sistemas procarióticos utilizados para el clonaje en los procedimientos tradicionales. Esto permite combinar los procesos de producción de vectores (por ejemplo con fines de genómica funcional o de evolución dirigida) con la creación de transformantes estables, acelerando así significativamente el proceso de selección por las combinaciones deseadas de los elementos genéticos que estén siendo analizados. Tiene también una característica ventajosa adicional, ya que permite incluir elementos reguladores residentes en el proceso de selección mediante atrapamiento entre las secuencias intrónicas 5' y 3', por ejemplo durante el proceso de "intronización".

El proceso de la invención tiene variabilidad combinatoria a nivel de los transformantes primarios, permitiendo de este modo combinar en un experimento la evolución dirigida de secuencias codificadoras de interés (por ejemplo la redistribución de dominios de una proteína de interés con múltiples dominios) y la generación y selección de transformantes primarios que presenten el rasgo de interés.

El proceso tiene muchas aplicaciones importantes, entre las cuales pueden mencionarse su utilización en procesos de selección de bibliotecas de ADN, el análisis de la función génica y la genómica funcional y la evolución dirigida incluyendo la redistribución de genes. Además, las secuencias de ADN de interés complejas y/o grandes que van a ser introducidas en el cromosoma de una planta pueden ser ensambladas in planta a partir de precursores más pequeños (ver la Fig. 12). El proceso de la invención puede ser también utilizado, sin embargo, con el fin de introducir un gen para que sea expresado en un cromosoma de una célula vegetal o de una planta. En una realización importante, todos los genes y/o secuencias codificadoras y/o secuencias expresables de dicha secuencia de ADN de interés integrados en un cromosoma son de origen vegetal, por lo que no pueden cruzarse secuencias no naturales procedentes de las plantas transgénicas de la invención a otros organismos.

Una aplicación importante más de la invención es en procesos para conseguir plantas medioambientalmente seguras que tengan dos secuencias transgénicas en los mismos loci de cromosomas homólogos. Según se describe en WO03/102197 (PCT/EP03/02986), tal combinación de dos secuencias transgénicas pueden dar lugar juntas a un rasgo de interés, pero dicho rasgo de interés tiene una baja probabilidad de ser transferido a la progenie, ya que dichas dos secuencias transgénicas se segregarán en la progenie. Las Figs. 12 y 13 ejemplifican la utilización de la presente invención en un proceso para producir plantas medioambientalmente seguras.

\newpage

\global\parskip0.900000\baselineskip

Realizaciones preferidas

Un proceso para dotar a una planta o a células vegetales de un rasgo de interés mediante la expresión de una secuencia de ARN de interés, comprendiendo dicho proceso:

la transformación de células vegetales o de una planta mediante transformación mediada por Agrobacterium con un primer ADN-T y un segundo ADN-T y la selección de las células dotadas de dicho rasgo de interés, donde

dicho primer ADN-T contiene una primera secuencia de nucleótidos con un promotor transcripcional y un primer segmento que codifica en dirección 5' a 3':

-: una parte 5' de dicha secuencia de ARN de interés y

-: una parte 5' de un intrón; y

dicho segundo ADN-T contiene una segunda secuencia de nucleótidos con un segundo segmento que codifica en dirección 5' a 3':

-: una parte 3' de un intrón y

-: una parte 3' de dicha secuencia de ARN de interés.

\vskip1.000000\baselineskip

En un proceso preferido de la invención, dicho rasgo de interés es producido por la expresión de una proteína de interés. Tal proceso preferido puede ser un proceso para dotar a una planta o a células vegetales de un rasgo de interés mediante la expresión de una proteína de interés, comprendiendo dicho proceso:

el suministro a células vegetales o a una planta de un primer vector y de un segundo vector y la selección de las células dotadas de tal rasgo de interés, donde

dicho primer vector contiene una primera secuencia de nucleótidos con un primer segmento que codifica en dirección 5'a 3':

-: una parte N-terminal de dicha proteína de interés y

-: una parte 5' de un intrón; y

dicho segundo vector contiene una segunda secuencia de nucleótidos con un segundo segmento que codifica en dirección 5' a 3':

-: una parte 3' de un intrón y

-: una parte C-terminal de dicha proteína de interés.

\vskip1.000000\baselineskip

En las realizaciones preferidas de la invención, dicho primer vector y dicho segundo vector son incapaces de recombinarse entre sí mediante recombinación específica de sitio. La incapacidad de recombinación puede ser debida a la falta de un lugar de recombinación específica de sitio en dicho primer vector o en dicho segundo vector, o puede ser debida a la ausencia de una recombinasa específica de sitio que pueda reconocer lugares de recombinación específica de sitio en dichos vectores.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 muestra esquemáticamente tres realizaciones generales del proceso de la invención. A la izquierda, se representan (como recuadros) secuencias de nucleótidos (A, B, C) de un primer, un segundo y, opcionalmente, un tercer vector proporcionadas a células vegetales que están integradas de manera estable en el cromosoma de una planta. Las secuencias de nucleótidos integradas están representadas por recuadros conectados por una línea que indica el ADN cromosómico del huésped. SD y SA significan sitios donantes de ayuste y aceptadores de ayuste, respectivamente. I5' y I3' indican las partes 5' y 3' de un intrón.

I - ensamblaje por transcripción y ayuste de una secuencia de ARN de interés (AB) que contiene secuencias codificadas por una primera (A) y una segunda (B) secuencia de nucleótidos de un primer vector y un segundo vector, respectivamente.

II - ensamblaje por transcripción y ayuste de una secuencia de ARN de interés (ACB) a partir de tres secuencias de nucleótidos diferentes de tres vectores (A, C y B). El tercer vector C contiene una tercera secuencia de nucleótidos con un tercer segmento que codifica en dirección 5' a 3':

-: una parte 3' de un intrón preferiblemente funcional con dicha parte 5' de un intrón de dicha primera secuencia de nucleótidos,

\global\parskip1.000000\baselineskip

-: una parte central de dicha secuencia de ARN de interés y

-: una parte 5' de un intrón preferiblemente funcional con dicha parte 3' de un intrón de dicha segunda secuencia de nucleótidos.

III - ensamblaje por transcripción y ayuste de varias secuencias de ARN de interés (A_{n}B_{n}) a partir de una biblioteca de los vectores A y de una biblioteca de vectores B, donde n es el número de vectores de la biblioteca.

La Fig. 2 representa esquemáticamente las regiones de ADN-T de los vectores binarios pICBV19 y pICH10605.

GUS - gen de la beta-glucuronidasa; P35S - promotor de CaMV35S; BAR - gen de la acetiltransferasa de fosfinotricina (pICH10605 tiene secuencias codificadoras de BAR que alteran el intrón); PNOS - promotor del gen de la sintasa de nopalina de Agrobacterium; TNOS - región de terminación de la transcripción del gen de la sintasa de nopalina de Agrobacterium; TOCS - región de terminación de la transcripción del gen de la sintasa de octopina.

La Fig. 3 representa esquemáticamente la región del ADN-T del vector binario pICH7410.

GFP - gen que codifica la proteína fluorescente verde; NPT - gen de la fosfotransferasa II de neomicina que confiere resistencia a kanamicina; POCS - región promotora del gen de la sintasa de octopina de Agrobacterium; NTR - región 3' no traducida del ARN del virus del mosaico del tabaco (TMV); AttB - lugar de recombinación.

La Fig. 4 representa esquemáticamente las regiones de ADN-T de los plásmidos pICH11140 y pICH11150.

PACT2-i - promotor del gen de actina2 de Arabidopsis con el primer intrón.

La Fig. 5 representa las regiones de ADN-T de los vectores binarios pICBV16 y pICH8430.

PACT2 - promotor del gen de actina2 de Arabidopsis; polimerasa de TVCV - ARN polimerasa dependiente de ARN del virus del aclaramiento de las venas del nabo (TVCV); MP - proteína de movimiento tobamovírica; IRESmp75 - IRES de la proteína de movimiento de crTMV.

La Fig. 6 representa esquemáticamente las regiones de ADN-T de los vectores binarios pICH11160 y pICH11170.

La Fig. 7 representa esquemáticamente las regiones de ADN-T resultantes de (A) la cointegración y (B) la recombinación específica de sitio entre los ADN-Ts de pICH11150 y pICH11170. La región del ADN-T lleva un gen BAR interrumpido por un intrón que contiene un sitio de AttR. El ayuste del intrón después de la transcripción permite la expresión de una proteína BAR funcional.

La Fig. 8 representa esquemáticamente las regiones del ADN-T de los vectores binarios pICH12022 y pICH12031 diseñados para la transformación de plantas monocotiledóneas. PUBQ - promotor del gen de la ubiquitina del maíz; PACT1 - promotor del gen de actina1 del arroz; IPT - gen que codifica la isopentenil transferasa.

La Fig. 9 representa esquemáticamente las regiones de ADN-T resultantes de (A) la cointegración y (B) la recombinación específica de sitio entre las regiones del ADN-T de los vectores binarios pICH12022 y pICH12031. La región lleva un gen BAR funcional interrumpido por un intrón bajo el control del promotor PACT1 del gen de la actina1 del arroz.

La Fig. 10 representa un esquema de cointegración de dos ADN-Ts (A y B) que incluye el ensamblaje de un gen marcador seleccionable funcional a partir de fragmentos de dicho gen marcador seleccionable denominados "Seleccionable" y "marcador". Simultáneamente, un intrón (denominado "INTRÓN") es ensamblado a partir de los fragmentos intrónicos denominados "INT" y "RON". P - promotor; T - región de terminación de la transcripción; IRES - sitio interno de entrada de ribosomas. La selección por la cointegración funcional puede ser realizada mediante la aplicación de un antibiótico adecuado para dicho marcador seleccionable.

La Fig. 11 representa un esquema de cointegración de dos ADN-Ts (A y B) incluyendo el ensamblaje de un gen funcional de interés a partir de fragmentos de dicho gen de interés denominados "Gen de" e "Interés". Dicha cointegración ensambla también un intrón funcional a partir de una parte 5' ("INT") y una parte 3' ("RON") de dicho intrón. El fragmento de ADN cromosómico del huésped (indicado por líneas que conectan los recuadros "INT" y "RON") y las partes de los vectores pueden ser eliminados mediante ayuste en cis del ARN procedente de un transcrito formado bajo el control del promotor "P". Un marcador seleccionable bajo el control transcripcional de un elemento IRES es convertido en expresable mediante la transcripción bajo el control del promotor. P - promotor; T - región de terminación de la transcripción; IRES - sitio interno de entrada de ribosomas.

La Fig. 12 representa esquemáticamente la cointegración in planta de los vectores A y B para dar lugar al patrón de cointegración C. Las plantas o las células vegetales que contienen C pueden ser utilizadas para obtener plantas transgénicas medioambientalmente seguras (ver la Fig. 13) que tienen secuencias transgénicas en localizaciones alélicas, esto es una secuencia transgénica en un locus de un cromosoma y otra secuencia transgénica en el mismo locus de un cromosoma homólogo (alélico). P - promotor; T - región de terminación de la transcripción; CSM - marcador contraseleccionable; IRES - sitio de interno de entrada de ribosomas; Ds (3' o 5') - extremos de un elemento transponible no autónomo (Ds) reconocidos por la Ac transposasa; dSpm (3' o 5') - extremos de un elemento transponible no autónomo (dSpm) reconocidos por la Spm transposasa; GOI - gen de interés.

La Fig. 13 representa esquemáticamente un método para generar plantas o células vegetales transgénicas medioambientalmente seguras con secuencias transgénicas en localizaciones alélicas. La Fig. 13(A) representa un ADN-T integrado en un cromosoma de acuerdo con la Fig. 12. El tratamiento de las células que contienen el ADN-T mostrado en (A) con Ac transposasa permite obtener células que contienen el ADN-T mostrado en (B). El tratamiento de las células que contienen el ADN-T mostrado en (A) con la Spm transposasa permite obtener células que contienen el ADN-T mostrado en (C). La hibridación de células o plantas que contienen (B) con células o plantas que contienen (C), da lugar a células o plantas con los ADN-Ts (A) y (B) en localizaciones alélicas. P - promotor; T- región de terminación de la transcripción; CSM - marcador contraseleccionable; IRES - sitio interno de entrada de ribosomas; Ds (3' o 5') - extremos de un elemento transponible no autónomo (Ds) reconocidos por la Ac transposasa; dSpm (3' o 5') - extremos de un elemento transponible no autónomo (dSpm) reconocidos por la Spm transposasa; GOI - gen de interés.

La Fig. 14 representa los patrones de cointegración del ADN-T que pueden proporcionar el ensamblaje del transcrito de BAR funcional (ver el Ejemplo 4). Las posiciones de los cebadores pr1-4, que fueron utilizados para el análisis mediante PCR, están mostradas por flechas. Las regiones amplificadas mediante PCR están mostradas por una línea gruesa. Las representaciones y orientaciones esquemáticas de las regiones del ADN-T en (a), (b) y (c) están indicadas por flechas, donde la flecha oval representa la posición del límite derecho (RB) del ADN-T.

La Fig. 15 muestra los resultados del análisis mediante PCR de líneas de tabaco resistentes a PPT cotransformadas con las construcciones pICH11140 y pICH11170. Se utiliza la combinación de los cebadores Pr1 y Pr2 para analizar el patrón de integración del ADN-T mostrado en (a). Calles 1-26 - análisis mediante PCR de las líneas resistentes a PPT cotransformadas con pICH11140 y pICH11170; nc - control negativo (planta de tipo salvaje); pc - control positivo, ADN de la planta transformada con pICBV19.

Descripción detallada de la invención

En esta invención describimos un proceso para el ensamblaje rápido, barato, in planta de un rasgo de interés a partir de secuencias derivadas de al menos dos vectores integrados de manera estable en el cromosoma de una planta. Este procedimiento permite, inter alia, la optimización rápida de las secuencias que van a ser expresadas mediante el análisis de diferentes unidades de transcripción o traducción, de unidades con diferentes fusiones de proteínas o con una vectorización de proteínas o una modificación post-traduccional diferentes, etc. Puede ser utilizado eficazmente para someter a selección bibliotecas de secuencias codificadoras o reguladoras de interés. Otra aplicación de la invención es el diseño de plantas transgénicas medioambientalmente seguras que son incapaces de transferir la secuencia transgénica de interés a otras plantas a través de la transferencia del gen ilícito. Además, puede evitarse el clonaje difícil durante el diseño de regiones de ADN complejas (por ejemplo que muestren inestabilidad durante los procedimientos de clonaje en células bacterianas) para una transformación nuclear estable, ya que dos o más fragmentos de ADN complejos pueden ser ligados funcionalmente in planta después de su integración en un cromosoma de la planta. Además, la invención ofrece también la posibilidad de introducir dos o más ADN-Ts diferentes en el mismo locus mediante la selección por regiones cointegradas de ADN-T que tienen como resultado el ensamblaje mediado por un intrón de una secuencia de ARN de interés que codifica un marcador seleccionable. De este modo, pueden seleccionarse los acontecimientos de cointegración. Posteriormente, una de las dos regiones de ADN-T cointegradas, o partes de las mismas, pueden ser eliminadas mediante, por ejemplo, transposición o recombinación específica de sitio (cf. Fig. 13), proporcionando dos regiones de ADN-T diferentes en posiciones isoalélicas.

Dicha parte 5' y dicha parte 3' del intrón pueden derivar de un intrón natural y de derivados del mismo. Existen diferentes grupos/clases de intrones que son clasificados según su organización interna y su mecanismo de ayuste. Los intrones nucleares tienen en común la posesión de dinucleótidos GT-AG en los extremos 5' y 3' y, normalmente, requieren la formación de ayustosomas para su ayuste. Los intrones del grupo I y del grupo II fueron denominados por los intrones encontrados en diferentes genes mitocondriales fúngicos. Se clasifican según su organización interna, pero tienen en común la capacidad de autocatalizar su propio ayuste (intrones de autoayuste). Existen diferentes grupos de intrones y diferentes reacciones de ayuste de ARN. Algunos intrones requieren factores adicionales para ser funcionales, mientras que otros no (como los intrones de autoayuste). Hay intrones que pueden llevar a cabo un ayuste en cis e intrones que llevan a cabo reacciones de ayuste en trans.

El ayuste de los intrones nucleares se lleva a cabo a través de un mecanismo mediado por sn-RNP (mediado por ayustosomas). Existe una abundante literatura que describe los mecanismos de ayuste en cis, incluyendo el ayuste alternativo de genes nucleares en diferentes organismos eucarióticos (para una revisión ver Adams y col., 1996, Curr. Opin. Cell Biol., 8, 331-339; Hastings & Krainer, 2001, Curr. Opin. Cell Biol., 13, 302-309). Se ha descrito un ayuste en trans que tiene lugar de forma natural con la implicación de un mecanismo mediado por snRNP para la unión de ARN SL (líder ayustado) al extremo 5' de ARNms en tripanosomas (Agabian, N., 1990, Cell, 61, 1157-1160; Luo y col., 1999, J. Biol. Chem., 274, 31947-31954) y Caenorhabditis elegans (Hirsh & Huang, 1990, Mol. Biol. Rep., 14, 115). Estos pequeños ARNs "líder ayustado" constan de un exón 5' fusionado a secuencias que pueden sustituir funcionalmente al ARNsn U1 en extractos de ayuste por snRNP en mamíferos. Se ha observado también en cordados un ayuste en trans similar del ARN SL.

Los intrones de grupo I y II tienen la capacidad de ayustarse ellos mismos para salir del pre-ARNm. Esta reacción puede ser realizada in vitro por el ARN solo. Tales ARNs con actividad catalítica son denominados generalmente ribozimas. Los intrones del grupo I y del grupo II son ambos capaces de ayustarse (incluyendo ayuste en trans) en sistemas artificiales (Been y col., 1986, Cell, 47, 207-216; Jacquier y col., 1986, Science, 234, 1099-1194; Jarrell y col., 1988, Mol. Cell Biol., 8, 2361-2366). Se encontró también ayuste en trans en intrones del grupo II en genes divididos de cloroplastos (Kohchi y col., 1988, Nucl. Acids Res., 16, 10025-10036) y en un intrón del grupo I en un gen dividido artificial de Escherichia coli (Galloway-Salvo y col., 1990, J. Mol. Biol., 211, 537-549). Los intrones del grupo I fueron descubiertos por vez primera en ARNr de Tetrahymena thermophila (Cech, T.R., 1990, Ann. Rev. Biochem., 59, 543-568). Los mismos requieren un U en la secuencia diana inmediatamente 5' del sitio de corte y se unen a 4-6 nucleótidos en el lado 5' del sitio de corte. Hasta el momento existen más de 75 miembros conocidos de este grupo. Se encontraron también en mitocondrias fúngicas y de plantas (Richard & Dujon, 1997, Curr. Genet., 32, 175-181; Cho y col., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 14244-14249), en cloroplastos (Turmel y col., 1993, J. Mol. Biol., 232, 446-46), en el fago T4 (Galloway y col., 1990, J. Mol. Biol., 211, 537-549), en algas verdiazules y en otros organismos.

Se han desarrollado varios procedimientos para utilizar intrones y ribozimas construidos que pueden ser utilizados para la práctica de esta invención (referencias anteriormente citadas). Los mismos cubren los todos los tipos conocidos de intrones para la creación de acontecimientos de ayuste en células eucarióticas. Los ribozimas construidos sobre la base de intrones de Tetrahymena del grupo I (US6.015.794; Ayre y col., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 3507-3512), mediados por ayustosomas (Puttaraju y col., 1999, Nature Biotech., 17, 246-252; Liu y col., 2001, Nature Biotech., 20, 47-52; US6.083.702) o por ayuste en trans mediado por intrones del grupo II (Mikheeva & Jarrell, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 7486-7490; US5.498.531) pueden ser utilizados para la presente invención.

Como el ayuste en cis, según se utiliza en la presente invención, es más eficaz que el ayuste en trans, se prefieren en la presente los intrones de ayuste en cis, siendo los más preferidos los intrones para el ayuste en cis mediado por ayustosomas. Tales intrones pueden ser modificados mediante la inserción de secuencias heterólogas adicionales sin pérdida de la funcionalidad, lo cual es de particular importancia para esta invención, ya que pueden estar presentes secuencias cromosómicas del huésped entre dicha parte 5' de un intrón y dicha parte 3' de un intrón después de la integración de dichos vectores.

Pueden utilizarse muchos intrones nucleares en la práctica de esta invención. Ejemplos de tales intrones incluyen los intrones de los genes del arroz tpi Act1 y salT (Rethmeier y col., 1997, Plant J., 12, 895-899; Xu y col., 1994, Plant Physiol, 100, 459-467; McElroy y col., 1990, Plant Cell, 2, 163-171); de los genes Adh1, GapA1, de la actina y Bz1 del maíz (Callis y col., 1987, Genes Dev., 1, 1183-11200; Donath y col., 1995, Plant Mol. Biol., 28, 667-676; Maas y col., 1991, Plant Mol. Biol., 16, 199-207; Sinibaldi & Mettler, 1992, en W.E. Cohn, K. Moldave, eds., Progress in Nucleic Acids Research and Molecular Biology, vol. 42, Academic Press, New York, pp. 229-257), del gen SSU301 de la petunia rubisco (Dean y col., 1989, Plant Cell, 1, 201-208), de los genes A1 EF1\alpha, UBQ10, UBQ3, PAT1 de Arabidopsis (Curie y col., 1993, Mol. Gen. Genet., 228, 428-436; Norris y col., 1993, Plant Mol. Biol., 21, 895-906; Rose & Last, 1997, Plant J., 11, 455-464) y muchos otros. No existen requisitos específicos concernientes a la división de una secuencia que codifica un intrón para obtener dicha parte 5' y dicha parte 3'. Sin embargo, se prefiere dividir el intrón en un lugar que esté a una distancia similar del extremo 5' y del extremo 3' del intrón con el fin de no alterar la capacidad de ayuste del intrón. Pueden utilizarse para practicar esta invención intrones de diferente tamaño (tan pequeños como de 50 pb y tan grandes como de varias kpb). Los intrones más pequeños utilizables pueden estar limitados a los sitios donantes y aceptores de ayuste que flanquean normalmente las secuencias internas del intrón. El origen del intrón, su estructura y su tamaño pueden ser seleccionados individualmente dependiendo de la naturaleza del rasgo o proteína de interés. Pueden utilizarse experimentos de expresión transitoria para analizar la eficacia de un intrón seleccionado o de las partes del intrón correspondientes.

La utilización de un intrón en la invención tiene la ventaja adicional de que la introducción de intrones en regiones codificadoras da lugar normalmente a un incremento de la eficacia de la expresión de transgenes en organismos eucarióticos, incluyendo plantas (Rethmeier y col., 1997, Plant J., 12, 895-899; Bourdon y col., 2001, EMBO Rep., 2, 394-398; Rose & Beliakoff, 2000, Plant Physiol., 122, 535-542; para una revisión ver Le Hir y col., 2003, Trends Biochem. Sci., 28, 215-220).

Los métodos actuales para la expresión transitoria o constitutiva de transgenes en plantas emplean normalmente la introducción en las células de la planta de vector(es) ensamblado(s) con el(los) gen(es) de interés. Esta invención, preferiblemente, no tiene que ver con la expresión transitoria de una secuencia de interés. Las diferencias entre la expresión transitoria y constitutiva de transgenes están muy bien ejemplificadas, por ejemplo dentro del marco de trabajo de la genómica funcional en plantas, cuando la utilización de vectores víricos puede proporcionar de manera relativamente rápida cierta información inicial sobre una posible función de un transgén en algunos casos (WO993651; Kumagai y col., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1679-1683). En muchos otros casos, no se obtiene ninguna información ni ningún artefacto. Además, la utilización de vectores víricos no permite un estudio posterior de la función del transgén, por ejemplo durante el desarrollo de la planta, etc. Además, los vectores de Agrobacteria o víricos pueden producir como tales cambios importantes en las células de la planta, haciendo de este modo difícil estudiar, por ejemplo, las funciones de los genes implicados en las interacciones planta-patógeno. Se requieren plantas transgénicas transformadas de manera estable con diferentes patrones de expresión (por ejemplo una compartimentalización intercelular o intracelular, una expresión específica de un tejido, un órgano o una célula) para el estudio detallado de un gen de interés. De acuerdo con la presente invención, el ensamblaje, la optimización y la identificación de una secuencia de ARN o de un rasgo de interés pueden llevarse a cabo con una elevada eficacia in planta, por lo que pueden combinarse por tanto con la transformación de la planta como un procedimiento de una sola etapa.

En la Figura 1 se muestra es esquema general del ensamblaje de un rasgo de interés a partir de dos o más vectores mediante cointegración. La realización más sencilla de la invención es la creación de una secuencia de ARN de interés AB a partir de dos vectores A y B cointegrados (Fig. 1, I). Tales acontecimientos de cointegración deben ser seleccionables. Esto puede conseguirse si, por ejemplo, la cointegración tiene como resultado la expresión de un marcador para la selección.

En una realización de la invención, una región de ADN-T (Fig. 7) es ensamblada a partir de dos vectores representados por otras dos regiones de ADN-T (Figs. 4 y 6, parte inferior) utilizando recombinación mediada por la integrasa de PhiC31. La región de ADN-T ensamblada puede contener un gen BAR funcional que esté ausente en dichos vectores, permitiendo de este modo la selección por acontecimientos de recombinación. La integrasa necesaria para el ensamblaje de la región de ADN-T puede ser proporcionada de manera transitoria por uno de los vectores, pICH11150 (Fig. 4). Debido a la irreversibilidad de las reacciones catalizadas por la integrasa de PhiC31, dicha integrasa puede ser también expresada constitutivamente por una planta o por una célula vegetal producidas mediante ingeniería genética. Al analizar los transformantes primarios transformados con dichos vectores, encontramos sorprendentemente que la mayoría de los transformantes contenían dicha región de ADN-T representada en la Fig. 7-A en lugar del producto de recombinación representado en la Fig. 7-B. La selección de los transformantes que tenían el patrón de integración de la Fig. 7-A por resistencia a Basta fue posible a pesar de la gran distancia entre las dos partes de las secuencias que codificaban BAR. Este fenómeno es el resultado de un ayuste en cis eficaz de la región "intronizada" (región flanqueada por las partes 5' y 3' del intrón) que incluía otros casetes de transcripción y secuencias de ADN del huésped y preparó el terreno para el desarrollo de esta invención.

Otra realización preferida de la invención comprende la generación de un producto de cointegración, en particular para plantas monocotiledóneas (Fig. 9), a partir de un primer y un segundo vector (Fig. 8). Dichos vectores son similares a los descritos anteriormente para la transformación de plantas dicotiledóneas, pero contienen elementos reguladores de la transcripción específicos de monocotiledóneas. Las plantas transformadas proporcionaban la expresión de BAR, lo cual puede tener lugar no sólo por recombinación específica de sitio entre dicho primer y dicho segundo vector (Fig. 9-B), sino también debido a cointegración sin que tengan lugar eventos de recombinación (Fig. 9-A).

Pueden utilizarse diferentes métodos para proporcionar a una célula vegetal dichos primer y segundo (o más) vectores. Dichos vectores pueden ser transformados en las células vegetales por un vector plasmídico Ti portado por Agrobacterium (US5.591.616; US4.940.838; US5.464.763) o por bombardeo de partículas o microproyectiles (US05100792; EP00444882B1; EP00434616B1). Pueden utilizarse también otros métodos de transformación de plantas como microinyección (WO09209696; WO09400583A1; EP175966B1), electroporación (EP00564595B1; EP00290395B1; WO08706614A1) o transformación de protoplastos mediada por PEG, etc. La elección del método para el suministro de los vectores puede depender de la especie de planta que vaya a ser transformada. Por ejemplo, se prefiere generalmente el bombardeo de microproyectiles para la transformación de monocotiledóneas, mientras que para dicotiledóneas la transformación mediada por Agrobacterium produce en general mejores resultados.

En la realización anteriormente descrita, nosotros utilizamos la administración de vectores mediada por Agrobacterium a células de Nicotiana. Sin embargo, dichos vectores pueden ser introducidos en las plantas de acuerdo con cualquiera de las técnicas estándar adecuadas para la transformación estable de la especie de planta de interés. La técnicas de transformación de dicotiledóneas son bien conocidas en el oficio e incluyen técnicas basadas en Agrobacterium y técnicas que no requieren Agrobacterium. Las técnicas que no requieren Agrobacterium implican la captación del material genético exógeno directamente por protoplastos o células. Estas técnicas incluyen la captación mediada por PEG o por electroporación, la administración mediada por bombardeo de partículas y la microinyección. Ejemplos de estas técnicas están descritos en Paszkowski y col., EMBO J., 3, 2717-2722 (1984), Potrykus y col., Mol. Gen. Genet., 199, 169-177 (1985), Reich y col., Biotechnology, 4, 1001-1004 (1986) y Klein y col., Nature, 327, 70-73 (1987). En cada caso, las células transformadas son regeneradas para dar lugar a plantas completas utilizando técnicas estándar.

La transformación mediada por Agrobacterium es una técnica preferida para la transformación de dicotiledóneas debido a su elevada eficacia de transformación y a su amplia utilidad con muchas especies diferentes. Las muchas especies de cultivo que pueden ser transformadas de manera rutinaria por Agrobacterium incluyen tabaco, tomate, girasol, algodón, colza, patata, soja, alfalfa y chopo (EP0317511 (algodón), EP0249432 (tomate), WO87/072299 (Brassica), Patente de EE.UU. 4.795.855 (chopo)). La transformación con Agrobacterium implica típicamente la transferencia del vector binario portador del ADN foráneo de interés a una cepa de Agrobacterium apropiada, lo cual puede depender del complemento de genes vir que lleve la cepa huésped de Agrobacterium en un plásmido co-residente o bien cromosómicamente (Uknes y col., Plant Cell, 5, 159-169 (1993)). La transferencia del vector binario recombinante a Agrobacterium puede ser llevada a cabo mediante un procedimiento de apareamiento triparental utilizando E. coli portadora del vector binario recombinante, una cepa de E. coli cooperadora que lleve un plásmido tal como pRK2013, que es capaz de movilizar el vector binario recombinante hacia la cepa de Agrobacterium diana. Alternativamente, el vector binario recombinante puede ser transferido a Agrobacterium mediante transformación del ADN (Höfgen y Willmitzer, Nucl. Acids Res., 16, 9877 (1988)).

La transformación de la especie de planta diana por Agrobacterium recombinante implica normalmente el cocultivo de Agrobacterium con explantes de la planta siguiendo protocolos conocidos en la técnica. El tejido transformado portador de un marcador de resistencia a un antibiótico o a un herbicida presente entre los límites del ADN-T del plásmido binario puede ser regenerado en medio seleccionable. Las técnicas de transformación preferidas para monocotiledóneas incluyen la transferencia directa de genes a los protoplastos utilizando PEG o técnicas de electroporación y el bombardeo de partículas en tejido calloso.

Las solicitudes de patente EP0292435, EP0392225 y WO93/07278 describen técnicas para la preparación de callos y protoplastos de maíz, la transformación de protoplastos utilizando PEG o electroporación y la regeneración de plantes de maíz a partir de los protoplastos transformados. Gordon-Kamm y col., Plant Cell, 2, 603-618 (1990) y Fromm y col., Biotechnology, 11, 194-200 (1993), describen técnicas para la transformación de líneas endogámicas de élite del maíz mediante bombardeo de partículas.

La transformación del arroz puede ser llevada a cabo también mediante técnicas de transferencia génica directa utilizando protoplastos o bombardeo de partículas. La transformación mediada por protoplastos ha sido descrita para los tipos Japonica e Indica (Zhange y col., Plant Cell Rep., 7, 739-384 (1988); Shimamoto y col., Nature, 338, 274-277 (1989); Datta y col., Biotechnology, 8, 736-740 (1990)). Ambos tipos son también transformables de forma rutinaria utilizando bombardeo de partículas (Christou y col., Biotechnology, 9, 957-962 (1991). Es también aplicable la transformación del arroz mediada por Agrobacterium (Chan y col., 1993, Plant Mol. Biol., 22, 491-506).

EP0332581 describe técnicas para la generación, transformación y regeneración de protoplastos de Pooideae. Además, la transformación del trigo está descrita por Vasil y col., Biotechnology, 10, 667-674 (1992) utilizando bombardeo de partículas en células de callos regenerables de larga duración de tipo C, Vasil y col., Biotechnology, 11, 1553-1558 (1993) y Weeks y col., Plant Physiol., 102, 1077-1084 (1993) describen el bombardeo con partículas de embriones inmaduros y de callos derivados de embriones inmaduros.

La transformación de células de monocotiledóneas tales como Zea mays puede ser conseguida poniendo en contacto las células de la monocotiledónea con una multiplicidad de cuerpos similares a agujas sobre los cuales estas células pueden ser ensartadas, produciéndose una ruptura de la pared celular y permitiendo de este modo la entrada del ADN transformante en las células (ver la Patente de EE.UU. 5.302.523). Técnicas de transformación aplicables a monocotiledóneas y dicotiledóneas están también descritas en las Patentes de EE.UU. siguientes: 5.240.855 (pistola de partículas); 5.204.253 (microproyectiles acelerados por un choque de gas frío); 5.179.022 (aparato biolístico); 4.743.548 y 5.114.854 (microinyección); y 5.149.655, 5.120.257 (transformación mediada por partículas aceleradas); 5.066.587 (acelerador de microproyectiles dirigido por gas); 5.015.580 (transformación de plantas de soja mediada por partículas); 5.013.660 (transformación mediada por rayos láser); 4.849.355 y 4.663.292.

Las células vegetales transgénicas o el tejido vegetal transgénico transformados mediante uno de los métodos anteriormente descritos por al menos dicho primer vector y dicho segundo vector, pueden cultivarse posteriormente para dar plantas completas de acuerdo con técnicas estándar. Pueden obtenerse semillas transgénicas de plantas con flores transgénicas de acuerdo con técnicas estándar. De igual modo, plantas sin flores tales como la patata o la remolacha azucarera pueden ser propagadas mediante una variedad de procedimientos conocidos. Ver, por ejemplo, Newell y col., Plant Cell Rep., 10, 30-34 (1991) (que describe la transformación de la patata mediante cultivo del tallo).

En una realización preferida, se utiliza una mezcla de un conjunto de primeros vectores y/o y un conjunto de segundos vectores para ensamblar varias secuencias de ARN de interés. Dichas secuencias de ARN de interés pueden ser el resultado de acontecimientos de cointegración aleatorios entre dos conjuntos de vectores (conjunto A_{m} y conjunto B_{n}, Fig. 1, III) seguido por transcripción. Un conjunto de secuencias de ARN de interés del tipo a_{m}b_{n} puede ser generado en un conjunto de células vegetales mediante cointegración aleatoria de un conjunto de primeros vectores (A_{1}, A_{2}, ..., A_{m}) con un conjunto de segundos vectores (B_{1}, B_{2}, ..., B_{n}), donde m y n son el número de primeros vectores A diferentes y segundos vectores B diferentes, respectivamente. Se necesitan al menos tres vectores diferentes para dotar a la célula de al menos dos secuencias de ARN de interés diferentes.

Ejemplos de partes 5' y 3' de dicha secuencia de ARN de interés que son unidas pueden ser secuencias codificadoras o partes de las mismas o cualquier elemento genético transcrito. En la presente, tal elemento genético (o elemento regulador) puede ser cualquier elemento de la secuencia que tenga una función genética característica preferiblemente a nivel de ARN. Ejemplos de tales elementos genéticos incluyen: intensificadores transcripcionales, intensificadores traduccionales, lugares de recombinación, secuencias de terminación de la transcripción, lugares internos de entrada de ribosomas (IRESes), sitios de restricción, secuencias de replicación autónoma u orígenes de replicación.

En esta invención, la secuencia de ARN de interés puede derivar de componentes procedentes de más de dos vectores. En la Fig. 1, II, se muestra el ensamblaje de tal secuencia de ARN de interés que contiene porciones de secuencias de tres vectores diferentes, A, B y C. Sin embargo, la eficacia del ensamblaje de tal secuencia de ARN de interés será menor que en el caso de dos vectores diferentes (Fig. 1, I).

El ensamblaje de dicha secuencia de ARN de interés permite la selección de células vegetales que tengan dicho primer vector y dicho segundo vector integrados adecuadamente de acuerdo con la invención. Un posible mecanismo de selección es el ensamblaje de un marcador seleccionable funcional a nivel de ARN, según se describe con detalle en los Ejemplos 1-3 y se muestra de manera general en la Figura 10. El ensamblaje de dicha secuencia de ARN de interés que codifica una proteína funcional de interés puede ser una ventaja, por ejemplo cuando la proteína de interés (o el gen que la codifica) es tóxica para células bacterianas. El marcador seleccionable en tales casos puede ser una parte de una construcción bicistrónica bajo el control de un elemento IRES (Figura 11). La cointegración de dichos vectores (A y B en la Fig. 11) puede dar lugar a la formación de una unidad de transcripción (C en la Fig. 11) que lleve la construcción bicistrónica funcional con el gen de interés seguido por un gen marcador seleccionable controlado por un IRES. La utilización de elementos IRES en plantas es conocida en la técnica anterior (WO9854342; WO0246440; Dorokhov y col., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 5301-5306) y puede ser practicada de manera rutinaria en combinación con la presente invención.

El ensamblaje de vectores complejos in planta a partir de vectores precursores que tienen una estructura más sencilla puede ser una ventaja adicional, permitiendo evitar etapas de clonaje y/o manipulación complejas con estructuras de ADN inestables en células bacterianas. El ensamblaje de la secuencia de interés para generar diferentes vectores derivados en posición alélica unos respecto de otros está mostrado en la Fig. 12. Dicha secuencia de ADN de interés (Fig. 12, C) integrada de manera estable en el ADN cromosómico de la planta puede ser expuesta posteriormente a una transposasa de elección (Ac o Spm, Fig. 13), permitiendo la eliminación de las secuencias diana (flanqueadas por las secuencias Ds para Ac o por las secuencias dSpm para Spm). Los vectores derivados B y C finales (Fig. 13) están en relación alélica entre sí y codifican diferentes partes de un gen de interés (GOI) que pueden ser ensambladas mediante ayuste en trans mediado por inteína. Este procedimiento aborda un tema de bioseguridad, por ejemplo el control de la segregación del transgén, ya que los dos fragmentos del mismo gen que proporcionan el rasgo de interés se segregarán siempre a diferentes gametos debido a su posición alélica.

En la realización más preferida de esta invención, no se utilizó recombinasa en el proceso de la invención para ensamblar dicha secuencia de ARN de interés. Según se mencionó anteriormente, la función de interés se expresaba (resistencia a PPT) incluso cuando dichos dos vectores, después de la integración en un cromosoma, estaban separados por largos tramos de regiones cromosómicas del huésped y/o regiones de ADN-T interferentes (Ejemplo 4; Figura 14). Nosotros estudiamos la organización de los sitios de integración del ADN-T de plantas resistentes a PPT mediante la utilización de PCR (Figura 15) y encontramos, sorprendentemente, que la longitud del ADN cromosómico del huésped que separaba dicha primera y dicha segunda secuencia de nucleótidos no interfería significativamente con la expresión de dicho rasgo de interés, por ejemplo resistencia a PPT. La explicación más probable de este fenómeno es la formación y el procesamiento eficaz de transcritos largos que contenían dos fragmentos de secuencias codificadoras del gen BAR.

Las plantas o las células vegetales transgénicas producidas de acuerdo con la invención pueden ser utilizadas para muchas finalidades diferentes según se mencionó anteriormente. En otra aplicación, las células vegetales que tienen integrados dicho primer vector y dicho segundo vector pueden ser también utilizadas a su vez como precursoras para procesos corriente abajo.

Las secuencias (o vectores) integradas pueden ser inducidas, por ejemplo, para que formen un ADN extracromosómico como un vector episómico mantenido independientemente. Esta inducción puede ser conseguida, por ejemplo, cruzando una planta transgénica obtenida mediante el proceso de la invención con otra planta que proporcione un factor capaz de ejercer la función inductora o de activar la formación de dicho ADN extracromosómico/episómico. Alternativamente, la formación de tal ADN episómico puede ser producida, por ejemplo, por la expresión transitoria de un factor (por ejemplo una transposasa, una replicasa vírica, etc.) capaz de activar la formación del ADN extracromosómico/episómico a partir de dichas secuencias integradas. Dicho ADN episómico puede ser capaz de reintegrarse posteriormente (por ejemplo, puede ser o puede tener propiedades de un elemento transponible) o puede ser capaz de mantenerse independientemente durante las divisiones celulares (derivado de un vector vírico de
ADN).

La presente invención es preferiblemente llevada a cabo con plantas superiores, multicelulares. Las plantas preferidas para ser utilizadas en esta invención incluyen cualquier especie de planta, dándose preferencia a las especies importantes desde el punto de vista agronómico y hortícola. Plantas de cultivo comunes para ser utilizadas en la presente invención incluyen alfalfa, cebada, alubias, canola, arveja de vaca, algodón, maíz, trébol, loto, lentejas, altramuz, mijo, avena, guisantes, cacahuetes, arroz, centeno, trébol dulce, girasol, guisante de olor, soja, sorgo triticale, jícama, frijol terciopelo, arveja, trigo, vistaria y plantas de nuez. Las especies de plantas preferidas para practicar esta invención están incluidas en, pero no limitadas a:

Plantas representativas de Gramineae, Compositeae, Solanaceae y Rosaceae.

Adicionalmente, las especies preferidas para ser utilizadas en la invención, además de las especificadas anteriormente, son plantas de los géneros: Arabidopsis, Agrostis, Allium, Antirrhinum, Apium, Arachis, Asparagus, Atropa, Avena, Bambusa, Brassica, Bromus, Browaalia, Camellia, Cannabis, Capsicum, Cicer, Chenopodium, Chichorium, Citrus, Coffea, Coix, Cucumis, Cucurbita, Cynodon, Dactylis, Datura, Daucus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Eleusine, Festuca, Fragaria, Geranium, Glycine, Helianthus, Heterocallis, Hevea, Hordeum, Hyoscyamus, Ipomoea, Lactuca, Lens, Lilium, Linum, Lolium, Lotus, Lycopersicon, Majorana, Malus, Mangifera, Manihot, Medicago, Nemesia, Nicotiana, Onobrychis, Oryza, Panicum, Pelargonium, Pennisetum, Petunia, Pisum, Phaseolus, Phleum, Poa, Prunus, Ranunculus, Raphanus, Ribes, Ricinus, Rubus, Saccharum, Salpiglossis, Secale, Senecio, Setaria, Sinapis, Solanum, Sorghum, Stenotaphrum, Theobroma, Trifolium, Trigonella, Triticum, Vicia, Vigna, Vitis, Zea y las Olyreae, Pharoideae y muchas otras.

Dentro del ámbito de esta invención, se prefieren específicamente las especies de plantas que no están incluidas en la cadena alimenticia o de forrajes para la producción de proteínas farmacéuticas y técnicas. Entre ellas, las especies de Nicotiana son las más preferidas, ya que son especies fáciles de transformar y cultivar con sistemas de vectores de expresión bien desarrollados (especialmente vectores víricos).

Genes de interés, sus fragmentos (funcionales o no funcionales) y sus derivados artificiales que pueden ser expresados en plantas o en células vegetales utilizando la presente invención incluyen, pero no se limitan a: enzimas modificadores del almidón (sintasa del almidón, enzima para la fosforilación del almidón, enzima desramificador, enzima ramificador del almidón, enzima ramificador del almidón II, sintasa de almidón unida a gránulos), fosfato sintasa de sacarosa, fosforilasa de sacarosa, poligalacturonasa, polifructán sucrasa, pirofosforilasa de ADP glucosa, glucosil transferasa de ciclodextrina, transferasa de fructosilo, sintasa de glucógeno, esterasa de pectina, aprotinina, avidina, levansucrasa bacteriana, proteína glgA de E. coli, MAPK4 y ortólogos, enzima para la asimilación/metabolismo del nitrógeno, sintasa de glutamina, osmotina vegetal, albúmina 2S, taumatina, recombinasa/integrasa específica de sitio (FLP, Cre, recombinasa R, Int, integrasa R de SSVI, integrasa de PhiC31 o un fragmento activo o variantes de las mismas), enzimas modificadores de aceites (como las desaturasas de ácidos grasos, elongasas, etc.), transferasa de isopentenilo, Sca M5 (calmodulina de soja), toxina de tipo coleóptero o un fragmento insecticidamente activo, proteínas de fusión del enzima conjugador de ubiquitina (E2), enzimas que metabolizan lípidos, aminoácidos, azúcares, ácidos nucleicos y polisacáridos, superóxido dismutasa, la forma de proenzima inactivo de una proteasa, toxinas proteicas vegetales, rasgos que alteran la fibra en las plantas productoras de fibra, la toxina activa contra coleópteros de Bacillus thuringiensis (toxina Bt2, proteína cristalina insecticida (ICP), toxina CrylC, endotoxina delta, toxina polipeptídica, protoxina, etc.), la toxina AalT específica de insectos, enzimas que degradan celulosa, celulasa E1 de Acidothermus celluloticus, enzimas modificadores de lignina, alcohol deshidrogenasa de cinnamoilo, sintasa de trehalosa-6-fosfato, enzimas de la ruta metabólica de citoquininas, HMG-CoA reductasa, pirofosfasa inorgánica de E. coli, proteína de almacenamiento de semillas, sintasa de licopeno de Erwinia herbicola, oxidasa ACC, proteína codificada por pTOM36, fitasa, cetohidrolasa, acetoacetil CoA reductasa, sintasa de PHB (polihidroxibutanoato), enzimas implicados en la síntesis de polihidroxialcanoatos (PHA), proteína transportadora de acilo, napina, EA9, sintasa de fitoeno de plantas no superiores, proteína codificada por pTOM5, ETR (receptor de etileno), piruvato fosfato diquinasa plastídica, proteína del poro transmembranal inducible por nematodos, un rasgo que incremente la función fotosintética o plastídica de la célula vegetal, sintasa de estilbeno, un enzima capaz de hidroxilar fenoles, catecol dioxigenasa, catecol 2,3-dioxigenasa, cicloisomerasa de cloromuconato, sintasa de antranilato, proteína AGL15 de Brassica, fructosa 1,6-bifosfatasa (FBPasa), ARN3 de AMV, replicasa de PVY, replicasa de PLRV, proteína del revestimiento de potivirus, proteína de revestimiento de CMV, proteína de revestimiento de TMV, replicasa de luteovirus, ARN mensajero de MDMV, replicasa geminivírica mutante, acil-ACP tioesterasa de preferencia C12:0 de Umbellularia californica, acil-ACP tioesterasa vegetal de preferencia C10 o C12:0, acil-ACP tioesterasa de preferencia C14:0 (luxD), factor A de la sintasa vegetal, factor B de la sintasa vegetal, desaturasa D6, proteína con actividad enzimática en la \beta-oxidación peroxisómica de ácidos grasos en células vegetales, acil-CoA oxidasa, 3-cetoacil-CoA tiolasa, lipasa, acetil-CoA-carboxilasa del maíz, sintasa de 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato (EPSP), acetil transferasa de fosfinotricina (BAR, PAT), proteína CP4, desaminasa de ACC, proteína con un sitio de corte post-traduccional, gen DHPS que confiere resistencia a sulfonamidas, nitrilasa bacteriana, 2,4-D-monooxigenasa, sintasa de acetolactato o sintasa de acetohidroxiácido (ALS, AHAS), poligalacturonasa, polimerasa Taq, nitrilasa bacteriana, muchos otros enzimas de bacterias o fagos incluyendo endonucleasas de restricción, metilasas, ADN y ARN ligasas, ADN y ARN polimerasas, transcriptasas inversas, nucleasas (ADNasa y ARNasa), fosfatasas, transferasas, etc.

La presente invención puede ser también utilizada con el fin de la producción molecular y la purificación de proteínas valiosas desde el punto de vista comercial e importantes desde el punto de vista farmacéutico, incluyendo enzimas industriales (celulosas, lipasas, proteasas, fitasas, etc.) y proteínas fibrosas (colágeno, proteína de la seda de araña, etc.). Proteínas para la salud humana o animal pueden ser expresadas y purificadas utilizando los métodos descritos en el procedimiento de nuestra invención. Ejemplos de tales proteínas de interés incluyen, inter alia, proteínas de la respuesta inmune (anticuerpos monoclonales, anticuerpos de una sola cadena, receptores de células T, etc.), antígenos, incluyendo los derivados de microorganismos patógenos, factores estimuladores de colonias, relaxinas, hormonas polipeptídicas incluyendo somatotropina (HGH) y proinsulina, citoquinas y sus receptores, interferones, factores de crecimiento y factores de coagulación, enzima lisosómico enzimáticamente activo, polipéptidos fibrinolíticos, factores de coagulación sanguínea, tripsinógeno, antitripsina a1 (AAT), seroalbúmina humana, glucocerebrosidasas, toxina B nativa del cólera, así como proteínas conservadoras de la función como fusiones, versiones mutantes y derivados sintéticos de las proteínas anteriores.

Las proteínas anteriores y otras pueden ser optimizadas para una finalidad deseada mediante la introducción de mutaciones aleatorias en su secuencia codificadora o mediante métodos de redistribución de genes. La selección de una proteína que tenga propiedades optimizadas para el fin deseado puede ser realizada posteriormente utilizando el proceso de la presente invención.

Ejemplos

Los ejemplos siguientes se presentan para ilustrar la presente invención. Las personas expertas será capaces de modificar los ejemplos siguientes de tal manera que no pueda tener lugar una recombinación específica de sitio entre dichos vectores, por ejemplo haciendo que el gen de la integrasa no sea expresable o no sea funcional, o bien eliminando los lugares de recombinación específica de sitio.

Ejemplo 1 Diseño de vectores para la transformación estable de plantas dicotiledóneas con un gen BAR dividido Diseño de pICH11150

Esta construcción fue producida sobre la base del vector binario pICBV-19 (Figura 2). Como una primera etapa del clonaje, se introdujeron sitios de restricción de BsaI dianas para la inserción del intrón en el gen BAR (construcción pICH10605, Figura 2). El enzima BsaI corta el ADN fuera del sitio de reconocimiento, haciendo que sobresalgan 4 nucleótidos. En el caso de pICH10605, el enzima BsaI fue utilizado para introducir sitios aceptores y donantes de ayuste para la inserción posterior del intrón. Como etapa siguiente, un fragmento de PCR amplificado sobre la construcción pICH7410 (Figura 3) con los oligos int-ad-9 (5'-tttttggtc cgacctgcaa caataagaac aaaaagtcat aaatt-3') y attbpr11 (5'-tttaagcttg agctctttcc taggctcgaa gccgcggtgc gggtg-3') fue insertado en pICH10605 utilizando los sitios de restricción de BsaI y HindIII. El fragmento de PCR que contenía AttB y la parte 3' del intrón, además de sitios de restricción de AvrII y SacI, sustituyó al casete de expresión de GUS y a la parte 5' del casete de expresión de BAR. La parte de ADN-T de la construcción resultante (pICH11140, Figura 4) contenía la parte 3' del casete de expresión de BAR: AttB, parte 3' del intrón, parte 3' del gen BAR y el terminador de OCS, además de sitios de restricción de AvrII y SacI. Como etapa final del clonaje de la construcción 3', un casete de expresión de la integrasa de PhiC31 que contenía el promotor de actina 2 de Arabidopsis, la integrasa de PhiC31 y el terminador de NOS, fue introducido en pICH11140 utilizando los sitios de restricción de AvrII y SacI. La construcción final pICH11150 que contenía una parte 3' del gen BAR con AttB, un lugar de recombinación junto con el extremo 3' del intrón, además del casete de expresión de la integrasa de PhiC31, está mostrada en la Figura 4.

Diseño de pICH11170

Esta construcción fue producida sobre la base del vector binario pICBV-16 (Figura 5). El fragmento amplificado por PCR de pICH8430 (Figura 5) con los oligos int-ad-10 (5'-tttaagcttg aattcttttg gtctcaggta agtttcattt tcataattac aca-3') y attppr14 (5'-tttttcaatt ggagctccta cgcccccaac tgagagaac-3') fue cortado con los enzimas de restricción HindIII y MfeI e introducido en pICBV16 digerido con HindIII y EcoRI. El fragmento de PCR que contenía la parte 5' de un intrón y AttP, además de sitios de restricción de BsaI y EcoRI, sustituyó al casete de expresión de GUS en la construcción intermedia pICH11160 (Figura 6). Como etapa final del clonaje, un fragmento EcoRI/BsaI de pICH10605 (Fig. 2), que contenía un promotor de NOS y la parte 5' del gen BAR, fue insertado en pICH11160. La región de ADN-T de la construcción final pICH11170 está mostrada en la Figura 6.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2 Transformación mediada por Agrobacterium de Nicotiana tabacum (cv Petit Havana) con una región de ADN-T ensamblada in planta

Las construcciones pICH11150 y pICH11170 fueron inmovilizadas en A. tumefaciens (GV3101) y utilizadas para la transformación mediada por Agrobacterium de discos de hoja de plantas de Nicotiana (Horsh y col., 1985, Science, 227, 1229-1231) utilizando 10 mg/l de fosfinotricina (PPT) como marcador seleccionable. Plantas de tabaco regeneradas fueron analizadas mediante PCR para detectar la presencia de una región de ADN-T ensamblada in planta integrada de manera estable en el ADN cromosómico (Figura 7) y para detectar la ausencia de regiones de ADN-T de pICH11150 y pICH11170.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3 Diseño de vectores y transformación mediada por Agrobacterium de plantas monocotiledóneas con el gen BAR dividido

Para el diseño de construcciones utilizando un gen BAR dividido con el fin de monitorizar el ensamblaje de una región de ADN-T deseada in planta, se utilizaron las construcciones originales pICH11150 y pICH11170 (ver el Ejemplo 1). La construcción pICH11150 fue modificada sustituyendo el promotor de la actina2 de Arabidopsis (PACT2-i) por el promotor de la actina1 del arroz (PACT1) (McElroy, D. y col., 1991, Mol. Gen Genet., 231, 150-160) produciendo la construcción pICH12022 (Figura 8). La construcción pICH11170 fue modificada sustituyendo el promotor de la sintasa de nopalina (PNOS), que dirige la expresión del fragmento del gen BAR, por el promotor de la actina1 del arroz (PACT1) y el casete de expresión de NPTII por el casete de expresión de IPT (transferasa de isopentenilo, Nº de Acceso del Gene Bank: X14410) bajo el control del promotor del gen de la ubiquitina del maíz (PUBQ) (Christensen, A.H. & Quail, P.H., 1996, Transgenic Res., 5, 213-218) produciendo la construcción pICH12031 (Figura 8). Todas las manipulaciones para el diseño de las construcciones fueron llevadas a cabo utilizando procedimientos estándar de clonaje (Sambrook, Fritsch & Maniatis, 1989, Molecular cloning: A laboratory manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor, NY: CSH Laboratoy Press).

Se utilizó la línea PEN3 de Pennisetum glaucum para la transformación mediada por Agrobacterium con los plásmidos pICH12022 y pICH12031. Alícuotas de la cepa AGL1 de Agrobacterium tumefaciens portadora de pICH12022 o de pICH12031 fueron mezcladas en iguales proporciones y utilizadas para la transformación según se describe a continuación.

El medio de cultivo incluía sales de Murashige y Skoog (MS) y vitaminas: (Referencia: Murashige, T. & Skoog, F.A., 1962, Physiol. Plant., 15, 473-497) con 2,0 mg/l de 2,4-D, que es ácido 2,4-diclorofenoxiacético, 30 g/l de sacarosa y un 0,3% de gelrita. El medio de regeneración contenía sales MS de fuerza iónica media y vitaminas con 20 g/l de maltosa, 1 mg/l de IAA, 1 mg/l de Zeatina y un 0,6% de gelrita.

El medio de infección (IM) contenía sales MS de fuerza iónica media y vitaminas con 2 mg/l de 2,4-D, 10 g/l de glucosa, 60 g/l de maltosa, 50 mg/l de ácido ascórbico, 1 g/l de MES (ácido 2-N-morfolinoetanosulfónico) y 40 mg/l de Acetosiringona (AS). El pH del medio fue ajustado a 5,2 con KOH 1 N. El medio de cocultivo (CM) fue el mismo que el IM (excluyendo el ácido ascórbico) y fue solidificado mediante la adición de un 0,6% de gelrita. El medio de infección fue esterilizado por filtración, mientras que todos los demás medios fueron autoclavados. Después de la esterilización se añadió AS disuelta en DMSO (400 mg/ml).

Se hicieron crecer cultivos de agrobacterias (cepas AGL1, EHA105, A4, etc.) con los plásmidos binarios apropiados durante 3 días a temperatura ambiente en placas de LB2N (medio LB con 2 g/l de NaCl y un 1,5% de agar) suplementado con los antibióticos apropiados. Las bacterias fueron extraídas de las placas mediante rascado y resuspendidas en IM en tubos Falcon de 50 ml. Los tubos fueron fijados horizontalmente a una plataforma agitadora y agitados a baja velocidad durante 4 a 5 horas a temperatura ambiente. Se midió la densidad óptica de la suspensión y se ajustó la DO600 a 1,0.

Se incubaron fragmentos de callos en la suspensión de agrobacterias durante 3 horas a temperatura ambiente y se transfirieron al CM solidificado con gelrita con 60 g/l de maltosa.

Después de 3 días de cultivo en CM, los callos fueron lavados cinco veces con medio conteniendo MS de fuerza iónica media con 60 g/l de sacarosa y transferidos al CM solidificado con gelrita con 60 g/l de sacarosa y 5 mg/l de fosfinotricina (PPT) y, en algunos casos, con 150 mg/l de Timentina. Los callos resistentes a fosfinotricina desarrollados bajo selección fueron sembrados en el medio de regeneración con 5 mg/l de PPT.

Los tejidos de las plantas PPT^{R} que se regeneraban fueron inicialmente analizados visualmente para detectar la ausencia de un gen IPT funcional que originara la formación adventicia de brotes en medio sin hormonas (Ooms y col., 1983, Theor. Appl. Genet., 66, 169-172; Smigocki, A.C. & Owens, L.D., 1989, Plant Physiol., 91, 808-811, Smigocki, A.C. & Owens, L.D., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5131-5135). Se llevó a cabo un proceso de selección secundario para seleccionar plantas portadoras de la región de ADN-T ensamblada in planta (Figura 9) y para seleccionar por la ausencia de regiones de ADN-T procedentes de pICH12022 y pICH12031, mediante la utilización de análisis por PCR del tejido de las plantas PPT^{R} para determinar la presencia de secuencias del gen de la integrasa de PhiC31 y del gen IPT.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4 Transformación mediada por Agrobacterium de Nicotiana tabacum (sv Petit Havana) para el ensamblaje de rasgos mediado por cointegración

Las construcciones pICH11140 y pICH11170 (Fig. 14) fueron inmovilizadas en A. tumefaciens (GV3101) y utilizadas para la transformación mediada por Agrobacterium de discos de hojas de plantas de Nicotiana tabacum (Horsh y col., 1985, Science, 227, 1229-1231) utilizando 10 mg/l de fosfinotricina (PPT) como agente selectivo. Las plantas de tabaco regeneradas fueron analizadas mediante PCR para detectar la presencia de distintos ADN-Ts cointegrados en el ADN cromosómico en orientación cabeza-con-cola (Figura 14). Se analizaron tres patrones de integración que podían proporcionar el ensamblaje del transcrito de BAR funcional. La presencia del patrón (A) en el que el LB del ADN-T 5' (pICH11170) está flanqueado por el RB del ADN-T 3' (pICH11140) sin ningún espacio o con un espacio relativamente pequeño entre los límites del ADN-T, fue comprobada mediante PCR con los oligos Pr1 (138directo-bar: 5'-ccg tac cga gcc gca gga ac-3') y Pr2 (581inverso-bar: 5'-cag atc tcg gtg acg ggc agg ac-3'). Este patrón de integración fue encontrado en el 60% de las plantas analizadas (29 de 48). La presencia del patrón (B) en el que los ADN-Ts 5' y 3' están separados por la inserción de ADN-T 5' en orientación invertida fue analizada con los oligos Pr2 (581inverso-bar: 5'-cag atc tcg gtg acg ggc agg ac-3') y Pr3 (barpr2: 5'-gac cgt gct tgt ctc gat gta g-3'). Este patrón de integración fue encontrado en el 8% de las plantas analizadas (4 de 48). La presencia del patrón (C), en el que los ADN-Ts 5' y 3' están separados por la inserción de ADN-T 3' en orientación invertida, fue analizada con los oligos Pr1 (138directo-bar: 5'-ccg tac cga gcc gca gga ac-3') y Pr4 (barpr4: 5'-ggt ttc tgg cag ctg gac ttc-3'). Este patrón de integración no se encontró entre las plantas analizadas. En conjunto, cualquiera de estos patrones fue detectado en el 69% de las plantas resistentes a PPT analizadas (33 de 48).

Claims

1. Un proceso para dotar a una planta o a células vegetales de un rasgo de interés mediante la expresión de una secuencia de ARN de interés, comprendiendo dicho proceso:

la provisión mediante cotransformación a la planta o a las células de dicha planta de un primer vector y un segundo vector y la selección de las células dotadas de dicho rasgo de interés,

donde

-: una parte 5' de dicha secuencia de ARN de interés y

-: una parte 5' de un intrón; y

-: una parte 3' de un intrón y

-: una parte 3' de dicha secuencia de ARN de interés.

\vskip1.000000\baselineskip

2. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho primer vector y dicho segundo vector son adaptados para la integración de dichos vectores o de partes de dichos vectores en un cromosoma de dichas células
vegetales.

3. El proceso de la reivindicación 2, en el que dicho cromosoma es un cromosoma nuclear.

4. El proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, mediante el cual dicha parte 5' de un intrón y dicha parte 3' de un intrón son adaptadas para formar dicha secuencia de ARN de interés mediante el ayuste de un transcrito primario que contiene dicha parte 5' de dicha secuencia de ARN de interés, dicha parte 5' de un intrón, dicha parte 3' de un intrón y dicha parte 3' de dicha secuencia de ARN de interés, formándose de este modo dicha secuencia de ARN de interés como un transcrito secundario.

5. El proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, en que dicho primer vector y/o dicho segundo vector deriva de un plásmido Ti.

6. El proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha primera y dicha segunda secuencia de nucleótidos son proporcionadas a dichas células vegetales como ADN-T.

7. El proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho primer vector y dicho segundo vector son proporcionados a dichas células vegetales mediante transformación mediada por Agrobacterium.

8. El proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha primera secuencia de nucleótidos contiene un promotor transcripcional corriente arriba de dicho primer segmento.

9. El proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende la traducción de dicha secuencia de ARN de interés para producir una proteína de interés.

10. El proceso de la reivindicación 9, en el que dicho primer segmento codifica una parte 5' de dicha proteína de interés y dicho segundo segmento codifica una parte 3' de dicha proteína de interés.

11. El proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho primer segmento o dicho segundo segmento codifica un elemento regulador de la traducción.

12. El proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho rasgo de interés es resistencia frente a un agente selectivo para permitir la selección de las células vegetales o de las plantas que tengan dicho primer vector y dicho segundo vector cointegrados en un cromosoma.

13. El proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicha primera y/o dicha segunda secuencia de nucleótidos contiene un gen que va a ser expresado para dotar a dicha o a dichas células vegetales de un rasgo de interés adicional.

\newpage

14. El proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 13, en el que a dichas células vegetales o a dicha planta se les proporciona además un tercer vector que contiene una tercera secuencia de nucleótidos que codifica, en dirección 5' a 3':

-: una parte central de dicha secuencia de ARN de interés, y

\vskip1.000000\baselineskip

15. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que dicho primer vector o dicho segundo vector no pueden recombinarse entre sí mediante recombinación específica de sitio.

16. El proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 14, en el que

-: dicha primera secuencia de nucleótidos contiene corriente abajo de dicho primer segmento un lugar de recombinación para recombinación específica de sitio,

-: dicha segunda secuencia de nucleótidos contiene corriente arriba de dicho segundo segmento un lugar de recombinación para recombinación específica de sitio,

mediante lo cual dichos lugares de recombinación son adaptados para recombinarse entre sí, opcionalmente en presencia de una recombinasa específica de sitio.

\vskip1.000000\baselineskip

17. El proceso de acuerdo con la reivindicación 16, en el que dicha primera o dicha segunda secuencia de nucleótidos contiene un gen de una recombinasa específica de sitio funcional con dichos lugares de recombinación.

18. El proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 17, en el que se proporcionan tres o más vectores diferentes a las células vegetales y en el que se obtienen dos o más células vegetales o plantas transgénicas diferentes, expresando dichas células vegetales o plantas transgénicas diferentes secuencias de ARN de interés diferentes.

19. El proceso de una de las reivindicaciones 1 a 18, que comprende las etapas (A) y (B) siguientes:

(A): la provisión a plantas o a células vegetales de una mezcla de

(i): un conjunto de m primeros vectores que tienen cada uno de ellos una primera secuencia de nucleótidos con un primer segmento que codifica una parte 5' de dicha secuencia de ARN de interés seleccionada del conjunto (a_{1}, a_{2}, ..., a_{m}) y

\quad: donde

\quad: dichos primeros vectores y dichos segundos vectores son adaptados para producir diferentes secuencias de ARN de interés,

\vskip1.000000\baselineskip

20. El proceso de una de las reivindicaciones 1 a 19, que comprende las etapas (A) y (B) siguientes:

(A): la provisión a plantas o a células vegetales de una mezcla de

\quad: donde

\quad: n es un número entero >1,

\vskip1.000000\baselineskip

21. El proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 20, en el que dicha primera y dicha segunda secuencia de nucleótidos son adaptadas de tal manera que dichas plantas o dichas células pueden ser dotadas de dicho rasgo de interés si, y sólo si, a dichas células vegetales se les proporciona dicho primer vector y dicho segundo vector.

22. El proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicha secuencia de ARN de interés produce dicho rasgo de interés causando la degradación o la supresión de un ARN mensajero de dichas células vegetales.

23. Células vegetales, plantas o partes transformadas de las mismas como semillas producidas o producibles de acuerdo con el proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22.

24. Las células vegetales, las plantas o partes de las mismas como semillas de acuerdo con la reivindicación 23, en las que todas las secuencias expresables de dicha primera o dicha segunda secuencia de nucleótidos son de origen vegetal.

25. Una biblioteca de plantas o de semillas de plantas obtenida u obtenible de acuerdo con una de las reivindicaciones 19 ó 20.

26. Un kit de partes que contiene dicho primer y dicho segundo vector según se definieron en una de las reivindicaciones 1 a 22.