ES2336097T3

ES2336097T3 - Metodo para controlar una planta o celulas vegetales modificadas geneticamente.

Info

Publication number: ES2336097T3
Application number: ES03780009T
Authority: ES
Inventors: Stefan Werner; Sylvestre Marillonnet; Victor Klimyuk; Yuri Gleba
Original assignee: Icon Genetics AG; Icon Genetics Inc
Current assignee: Icon Genetics AG; Icon Genetics Inc
Priority date: 2002-11-20
Filing date: 2003-11-20
Publication date: 2010-04-08
Anticipated expiration: 2023-11-20
Also published as: JP4795689B2; US20060037099A1; EP1563077A2; JP2006506081A; EP1563077B1; WO2004046359A3; CA2497558A1; DE60330495D1; AU2003288132A1; US8183433B2; DE10254167A1; AU2003288132B2; WO2004046359A2; ATE451465T1

Abstract

Un método para controlar una planta o células vegetales modificadas genéticamente, comprendiendo dicho método las etapas siguientes: (a) la provisión de una planta modificada genéticamente o de células vegetales modificadas genéticamente, conteniendo dicha planta o dichas células vegetales un ácido nucleico heterólogo que codifica un primer polipéptido que contiene o que consta de un primer fragmento de una proteína, (b) la introducción de un segundo polipéptido en las células de dicha planta modificada genéticamente o en dichas células vegetales modificadas genéticamente de tal manera que no se introduzcan ácidos nucleicos que codifiquen dicho segundo polipéptido o una parte funcional del mismo, conteniendo dicho segundo polipéptido (i) un segundo fragmento de dicha proteína y (ii) una secuencia peptídica que permita la introducción de dicho segundo polipéptido en las células de dicha planta modificada genéticamente o en las células vegetales modificadas genéticamente, por lo que dicho primer fragmento y dicho segundo fragmento generan conjuntamente una función predeterminada de dicha proteína únicamente cuando están presentes conjuntamente y por lo que las células de dicha planta contienen un ácido nucleico heterólogo adicional que está controlado por dicha función predeterminada.

Description

Método para controlar una planta o células vegetales modificadas geneticamente.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para controlar una planta o células vegetales modificadas genéticamente, en particular a un método para controlar un proceso celular de interés en una planta o en células vegetales modificadas genéticamente. El método de la invención tiene una seguridad biológica excepcional. La invención se refiere además a una planta modificada genéticamente adaptada para dicho método y a una planta modificada genéticamente que ha sido controlada de acuerdo con el método de la invención. Además, la presente invención se refiere a un método para producir un producto en una planta modificada genéticamente mediante el control de un proceso celular de interés. El método de la invención permite el control selectivo de la expresión de un transgén en una planta modificada genéticamente de manera transitoria o de manera estable, mediante lo cual un proceso celular de interés no operativo previamente en la planta puede ser activado selectivamente a cualquier tiempo predeterminado.

Antecedentes de la invención Sistemas de expresión de transgenes controlables en plantas

Uno de los problemas principales de la biotecnología vegetal es la consecución de un control fiable sobre la expresión de transgenes. Un estrecho control de la expresión génica en plantas es esencial si un producto corriente abajo de la expresión del transgén es inhibidor del crecimiento o tóxico, como por ejemplo plásticos biodegradables (Nawrath, Poirier y Somerville, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci., 91, 12760-12764; John y Keller, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci., 93, 12768-12773; US6103956; US5650555) o toxinas proteicas (US6140075). Las tecnologías existentes para controlar la expresión génica en plantas están basadas normalmente en promotores específicos de tejido e inducibles y prácticamente todos ellos adolecen de una actividad de expresión basal incluso cuando no son inducidos, esto es, hay "fugas". Los promotores específicos de tejido (US05955361; WO09828431) representan una herramienta poderosa pero su uso está limitado a áreas de aplicaciones muy específicas, por ejemplo para producir plantas estériles (WO09839462) o para expresar genes de interés en semillas (WO00068388; US05608152). Los promotores inducibles pueden ser divididos en dos categorías de acuerdo con sus condiciones de inducción: aquéllos inducidos por factores abióticos (temperatura, luz, sustancias químicas) y aquéllos que pueden ser inducidos por factores bióticos, por ejemplo, por patógenos o por el ataque de una plaga. Ejemplos de la primera categoría son los promotores inducibles por calor (US05187287) y los inducibles por frío (US05847102), un sistema inducible por cobre (Mett y col., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90, 4567-4571), sistemas inducibles por esteroides (Aoyama y Chua, 1997, Plant J., 11, 605-612; McNellis y col., 1998, Plant J., 14, 247-257; US06063985), un sistema inducible por etanol (Caddick y col., 1997, Nature Biotech., 16, 177-180; WO09321334) y un sistema inducible por tetraciclina (Weinmann y col., 1994, Plant J., 5, 559-569). Uno de los últimos desarrollos en el área de los sistemas inducibles químicamente para plantas es un promotor quimérico que puede ser activado por el glucocorticoide dexametasona y desactivado por tetraciclina (Bohner y col., 1999, Plant J., 19, 87-95). Para una revisión de sistemas inducibles químicamente ver: Zuo y Chua (2000, Current Opin. Biotechnol., 11, 146-151). Otros ejemplos de promotores inducibles son promotores que controlan la expresión de genes relacionados con la patogénesis (PR) en plantas. Estos promotores pueden ser inducidos por el tratamiento de la planta con ácido salicílico, un componente importante de las rutas de generación de señales en plantas en respuesta al ataque de un patógeno, u otros compuestos químicos (benzo-1,2,3-tiadiazol o ácido isonicotínico) que son capaces de desencadenar la expresión de genes PR (US05942662).

Existen informes de sistemas de expresión de transgenes controlables utilizando ARN/ARN polimerasa vírica proporcionada por una infección vírica (ver, por ejemplo, US6093554; US5919705). En estos sistemas, una secuencia de ADN recombinante de la planta incluye secuencias de nucleótidos del genoma vírico reconocidas por ARN/ARN polimerasa vírica. La eficacia de estos sistemas es limitada debido a la baja capacidad de las polimerasas víricas para proporcionar funciones en trans y a su incapacidad para controlar procesos distintos de la amplificación del ARN. Otra forma es desencadenar un proceso de interés en un planta transgénica mediante la utilización de un virus modificado genéticamente que proporciona un ácido nucleico heterólogo que codifica un interruptor proteico para un proceso bioquímico en una planta genéticamente modificada (WO02068664, WO0071701 y WO0052146).

Los sistemas anteriormente descritos tienen un interés significativo como oportunidades para obtener patrones deseados de expresión transgénica, pero no permiten un estrecho control de los patrones de expresión, ya que los agentes inductores (cobre) o sus análogos (brassinoesteroides en el caso de sistemas controlables por esteroides) pueden estar presentes en los tejidos de la planta a niveles suficientes para producir una expresión residual. Adicionalmente, la utilización de antibióticos y esteroides como inductores químicos no es deseable o no es factible económicamente para aplicaciones a gran escala. Cuando se utilizan promotores de genes PR o ARN/ARN polimerasas víricas como medio de control de los transgenes, no se cumplen tampoco los requisitos de un estrecho control sobre la expresión del transgén, ya que una infección patógena casual o un estrés fortuito pueden producir la expresión. Los promotores específicos de tejido o de órgano están limitados a áreas de aplicación muy estrechas, ya que confinan la expresión a un órgano específico o a una etapa específica del desarrollo de la planta, pero no permiten que el transgén sea activado a voluntad. Los interruptores víricos recombinantes, según se describe en WO02/068664 abordan todos estos problemas, pero no garantizan los estrictos requisitos de seguridad medioambiental, ya que el ácido nucleico heterólogo del vector vírico puede recombinarse.

Existe una abundante literatura, incluyendo solicitudes de patente, que describe el diseño de plantas resistentes a virus por la expresión de genes víricos o de formas mutadas de ARN vírico (por ejemplo, US5792926; US6040496). Sin embargo, existe un riesgo medioambiental asociado con la utilización de tales plantas debido a la posibilidad de que se formen nuevos virus por la recombinación entre el virus de desafío y el ARN o el ADN vírico transgénico (Adair y Kearney, 2000, Arch. Virol., 145, 1867-1883).

Hooykaas y colaboradores (2000, Science, 290, 979-982; WO01/89283) describen la utilización de una fusión traduccional de la recombinasa Cre con fragmentos del gen vir para la translocación de la recombinasa mediada por Agrobacterium en células vegetales. Los acontecimientos de recombinación in planta mediados por Cre tenían como resultado un fenotipo seleccionable. La translocación de la recombinasa Cre es la primera utilización de una proteína translocada como "interruptor" para desencadenar un proceso de interés en células vegetales. Sin embargo, a pesar de que la translocación no está acompañada necesariamente por la transferencia de ADN, este procedimiento no garantiza un nivel de seguridad elevado, ya que el microorganismo fitopatógeno modificado genéticamente (Agrobacterium) posee una secuencia codificadora completa del interruptor proteico recombinasa Cre. Además, el proceso de interés puede ser desencadenado únicamente en las células que reciban el interruptor proteico. Si van a tratarse grandes conjuntos de células, la proporción de células que reciben el interruptor proteico con respecto al número total de células resulta muy pequeña. Por tanto, el método de Hooykaas no puede ser aplicado a plantas completas. En su lugar, su utilidad está limitada a células en cultivo de tejidos o cultivo de células. Además, como este método está limitado a cultivos celulares (a escala de laboratorio), no surgen los problemas de seguridad medioambiental que aparecen en las aplicaciones a gran escala o de campos de cultivo.

Es por tanto un objeto de la invención proporcionar un método medioambientalmente seguro para activar un proceso celular de interés en plantas, mediante el cual el proceso celular puede ser activado selectivamente a cualquier tiempo determinado. Es otro objeto de esta invención proporcionar un método para activar un proceso celular de interés en plantas completas. Es otro objeto de esta invención proporcionar un método para producir un producto en una planta transgénica, en el que la producción del producto puede ser activada selectivamente una vez que la planta haya crecido hasta una etapa deseada, por lo que el proceso es medioambientalmente seguro en cuanto a que el material genético necesario para dicho proceso celular y el material genético que codifica la función de control no se propagan juntos al medio ambiente.

Descripción general de la invención

Los objetos anteriores se consiguen mediante un método para controlar una planta o células vegetales modificadas genéticamente, comprendiendo dicho método las etapas siguientes:

(a): la provisión de una planta o células vegetales modificadas genéticamente, conteniendo dicha planta o dichas células vegetales un ácido nucleico heterólogo que codifica un primer polipéptido que contiene o que consta de un primer fragmento de una proteína,

(b): la introducción de un segundo polipéptido en células de dicha planta modificada genéticamente o en dichas células vegetales modificadas genéticamente de tal manera que no se introduzcan ácidos nucleicos que codifiquen dicho segundo polipéptido o una parte funcional del mismo, conteniendo dicho segundo polipéptido

(i): un segundo fragmento de dicha proteína y

(ii): una secuencia peptídica que permite la introducción de dicho segundo polipéptido en células de dicha planta modificada genéticamente o en las células vegetales modificadas genéticamente,

mediante lo cual dicho primer fragmento y dicho segundo fragmento generan conjuntamente una función predeterminada de dicha proteína únicamente cuando están presentes juntos. Preferiblemente, este método de lleva a cabo con plantas en vez de con células vegetales.

La invención proporciona también una planta o células vegetales modificadas genéticamente que contienen un ácido nucleico heterólogo que codifica un primer polipéptido que contiene o que consta de un primer fragmento de una proteína, donde dicha planta o dichas células vegetales modificadas genéticamente y dicho primer fragmento de una proteína están adaptados para generar una función predeterminada de dicha proteína a partir de dicho primer fragmento y un segundo fragmento de dicha proteína, donde dicho segundo fragmento puede ser proporcionado a las células de dicha planta modificada genéticamente o a dichas células vegetales modificadas genéticamente mediante la introducción de un segundo polipéptido que contenga o que conste de dicho segundo fragmento.

Además, la invención proporciona un sistema para controlar una planta o células vegetales modificadas genéticamente, que comprende una planta o células vegetales modificadas genéticamente según se definió anteriormente y un segundo polipéptido según se definió anteriormente, donde dicha planta o dichas células vegetales modificadas genéticamente y dicho segundo polipéptido son diseñados de tal manera que dicho primer fragmento y dicho segundo fragmento son capaces de generar conjuntamente una función predeterminada de dicha proteína.

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La presente invención proporciona un método para controlar una planta modificada genéticamente o células de la misma, que es eficaz en plantas completas y que al mismo tiempo es medioambientalmente seguro incluso cuando es utilizado a gran escala como en un invernadero o en un campo de cultivo. La presente invención permite controlar una planta modificada genéticamente o células de la misma mediante la introducción de un segundo polipéptido en células que contienen un ácido nucleico heterólogo que codifica un primer polipéptido que contiene o que consta de un primer fragmento de una proteína. Dicho segundo polipéptido contiene un segundo fragmento de dicha proteína, por lo que dicho primer fragmento y dicho segundo fragmento generan conjuntamente una función predeterminada de dicha proteína solamente cuando están presentes juntos. Dicha función predeterminada de dicha proteína puede ser cualquier función de la proteína. Preferiblemente, dicha función es una actividad enzimática. Dicha función predeterminada se produce únicamente si dicho primer polipéptido y dicho segundo polipéptido están presentes juntos en la planta, preferiblemente en al menos una célula de dicha planta. Dicha función predeterminada de dicha proteína no se genera si dicho segundo polipéptido es introducido en una planta o en células vegetales que no contengan dicho ácido nucleico heterólogo que codifica dicho primer polipéptido. Además, dicha función predeterminada de dicha proteína no se genera en plantas que contienen dicho ácido nucleico heterólogo que codifica dicho primer polipéptido a no ser que dicho segundo polipéptido sea introducido en células de dicha planta.

En la etapa (a) del método de la invención, se proporciona una planta modificada genéticamente o células vegetales modificadas genéticamente. Se prefieren las plantas. Las más preferidas son las plantas superiores, en particular plantas superiores de cultivo. Dicha planta está modificada genéticamente en cuanto a que células de dicha planta contienen un ácido nucleico heterólogo que está implicado en el control de dicha planta modificada genéticamente. Dicha planta proporcionada en la etapa (a) puede ser una planta transgénica, por lo que la mayoría o todas las células de dicha planta contienen dicho ácido nucleico heterólogo integrado de manera estable en el genoma de dichas células. Dicho ácido nucleico heterólogo puede estar integrado de manera estable en el genoma nuclear o en el genoma de orgánulos tales como mitocondrias o, preferiblemente, plástidos. La integración de dicho ácido nucleico heterólogo en el genoma plastídico es ventajosa en términos de seguridad biológica. El método de la invención se lleva a cabo preferiblemente con plantas transgénicas. Alternativamente, sin embargo, dicha planta puede estar modificada de manera transitoria y/o dicho ácido nucleico heterólogo puede estar presente en una fracción de células pero no en otras células. Un ácido nucleico heterólogo en una planta modificada de manera transitoria puede estar integrado de manera estable en el genoma de dicha fracción de células o bien puede estar presente episómicamente. La incorporación de dicho ácido nucleico heterólogo en una fracción de células de dicha planta puede ser conseguida transfectando de manera transitoria dicho organismo, por ejemplo utilizando transfección vírica o transformación mediada por
Agrobacterium.

Dicho ácido nucleico heterólogo codifica dicho primer polipéptido de la invención. Dicho primer polipéptido contiene o consta de un primer fragmento de una proteína. Dicho primer polipéptido tiene que ser expresable a partir de dicho ácido nucleico heterólogo. Para este fin, dicho ácido nucleico heterólogo debe tener un promotor para expresar dicho primer polipéptido y otros elementos de control necesarios para la expresión. Dicho promotor puede ser inducible, específico de tejido o bien un promotor constitutivo. Si es un promotor constitutivo, dicha función predeterminada puede ser generada después de la realización de la etapa (b). Si el promotor es inducible, puede necesitarse una señal adicional además de dicho segundo polipéptido para generar dicha función predeterminada. Además, puede hacerse que la expresión de dicho primer polipéptido sea dependiente de más elementos, por lo que la seguridad medioambiental del método de la invención puede ser incrementada adicionalmente.

En la etapa (b) del método de la invención, dicho segundo polipéptido es introducido en las células de dicha planta modificada genéticamente o en las células vegetales modificadas genéticamente. Preferiblemente, es introducido en células de dicha planta que contienen dicho ácido nucleico heterólogo. Si dicha planta es transgénica, dicho segundo polipéptido puede ser aplicado en principio a cualquier parte o a cualquier célula de la planta. Sin embargo, se prefiere la aplicación a las hojas. Si solamente una fracción de las células de dicha planta contiene dicho ácido nucleico heterólogo, dicho segundo polipéptido es aplicado a la planta de tal manera que dicho segundo polipéptido pueda llegar a las células que contienen dicho ácido nucleico heterólogo.

Dicho segundo polipéptido contiene (i) un segundo fragmento de dicha proteína. Además, dicho segundo polipéptido contiene (ii) una secuencia peptídica que permite la introducción de dicho segundo polipéptido en células de dicha planta modificada genéticamente o en las células vegetales modificadas genéticamente. Las secuencias peptídicas de los puntos (i) y (ii) pueden solaparse.

Dicho segundo polipéptido es introducido muy preferiblemente de tal manera que no se introduzcan ácidos nucleicos que codifiquen dicho segundo polipéptido o partes funcionales del mismo en las células de dicha planta modificada genéticamente en la etapa (b). Una parte de dicho segundo polipéptido es funcional si es capaz de generar dicha función predeterminada conjuntamente con dicho primer polipéptido. Dicho segundo polipéptido puede ser aplicado directamente a las células de dicha planta. Aplicación directa significa la aplicación de dicho segundo polipéptido de tal manera que ningún ácido nucleico que codifique dicho segundo polipéptido o partes funcionales del mismo esté contenido en la composición utilizada en la etapa (b) para aplicar dicho segundo polipéptido.

La introducción directa de dicho segundo polipéptido puede ser realizada mediante (i) bombardeo de partículas (microproyectiles), (ii) la aplicación de dicho polipéptido en al menos una parte de dicha planta o (iii) mediante inyección de una solución que contenga dicho polipéptido en un tejido de dicha planta. En los métodos (ii) y (iii), dicho polipéptido está contenido típicamente en una composición líquida (o solución), preferiblemente acuosa, que es aplicada a partes de la planta. Tal composición puede ser aplicada, por ejemplo, pulverizando dicha planta con dicha composición que contiene el polipéptido. Además, dicha composición puede ser inyectada de acuerdo con (iii).

Para los métodos (ii) y (iii), dicho segundo polipéptido contiene preferiblemente una secuencia de translocación membranal (MTS) como secuencia peptídica que permite la introducción de dicho segundo polipéptido en células de dicha planta modificada genéticamente o en las células vegetales modificadas genéticamente. Dicha secuencia de translocación membranal puede estar unida covalentemente o no covalentemente a dicho segundo polipéptido. Preferiblemente, está unida covalentemente a dicho polipéptido. Dicha secuencia de translocación membranal puede ser un péptido que proporcione a dicho segundo polipéptido la capacidad de atravesar la membrana plasmática de células de dicha planta. En la técnica se conocen muchas de tales secuencias de translocación membranal. Con frecuencia, contienen varios aminoácidos básicos, particularmente argininas. El tamaño de las secuencias de translocación membranal puede variar enormemente, sin embargo, pueden tener típicamente de 3 a 100 aminoácidos, preferiblemente de 5 a 60 aminoácidos. Dicho segundo polipéptido puede ser producido mediante técnicas estándar de expresión de proteínas en, por ejemplo, E. coli. Preferiblemente, se realiza la purificación de dicho segundo polipéptido después de su expresión, en particular la eliminación o la destrucción de los ácidos nucleicos que codifican dicho polipéptido. Los ácidos nucleicos pueden ser eliminados o destruidos mediante hidrólisis, catalizada preferiblemente por un enzima como una desoxirribonucleasa (DNasa) o una ribonucleasa (RNasa). Además, o adicionalmente, pueden emplearse técnicas cromatográficas para eliminar ácidos nucleicos de dicho segundo polipéptido. Dicho segundo polipéptido puede ser aplicado a la planta mediante, por ejemplo, la pulverización de dicha planta con una composición líquida, preferiblemente una solución acuosa, que contenga dicho segundo polipéptido. Preferiblemente, se toman medidas para facilitar la entrada de dicho segundo polipéptido a las células de la planta, en particular medidas que permitan atravesar la pared de las células vegetales y/o la capa externa de la planta. Un ejemplo de tales medidas es la producción de ligeras heridas en partes de la superficie de la planta mediante, por ejemplo, excoriación mecánica. Otro ejemplo es la utilización de enzimas que degraden celulosa para debilitar o perforar la pared de las células
vegetales.

Una técnica más que puede ser utilizada para introducir dicho segundo polipéptido en las células durante la etapa (b), utiliza un microorganismo patógeno que tenga un sistema secretor capaz de suministrar un polipéptido a una célula huésped. Igual que en dichos métodos directos, dicho segundo polipéptido es introducido de tal manera que no se introduzcan ácidos nucleicos que codifiquen dicho segundo polipéptido o una parte funcional del mismo. Dicho segundo polipéptido puede estar codificado de manera expresable en los ácidos nucleicos de dicho microorganismo patógeno, de tal manera que dicho segundo polipéptido pueda ser expresado en dicho microorganismo y ser suministrado a una célula de dicha planta. Un ejemplo preferido de tal microorganismo patógeno es un Agrobacterium virulento o no virulento, en el cual dicho segundo polipéptido no está codificado en el ADN-T de un plásmido Ti, preferiblemente dicho segundo polipéptido no está codificado en un plásmido Ti del Agrobacterium empleado. Ejemplos de una secuencia peptídica bien estudiada que permite la introducción de dicho segundo polipéptido en células de dicha planta modificada genéticamente o en las células vegetales modificadas genéticamente utilizando microorganismos patógenos, son las proteínas virE2 y virF de Agrobacterium o sus fragmentos requeridos para la translocación de las proteínas desde la célula bacteriana a la célula vegetal (Vergunst y col., 2000, Science, 290, 979-982; WO0189283). Además, pueden utilizarse microorganismos patógenos de los géneros Bordetella, Erwinia, Pseudomonas, Xanthomonas, Yersinia. Un sistema secretor basado en Yersinia está descrito en, por ejemplo, WO9952563.

Mediante la realización de la etapa (b) del método de la invención según se describió anteriormente, se consigue un nivel muy elevado de seguridad biológica, ya que la planta no entra en contacto con material genético que podría generar dicha función predeterminada. En lugar de ello, se proporciona preferiblemente a la planta al menos un componente necesario para dicha función predeterminada como es dicho segundo polipéptido (por tanto, sin material genético codificador).

Después de llevar a cabo la etapa (b) del método de la invención, dicho primer fragmento de dicho primer polipéptido y dicho segundo fragmento de dicho segundo polipéptido generan conjuntamente dicha función predeterminada de dicha proteína cuando están presentes juntos. La generación de dicha función predeterminada puede ser conseguida mediante la formación de enlaces covalentes o no covalentes entre dichos polipéptidos o fragmentos. La formación de enlaces no covalentes puede ser favorecida al tener dichos polipéptidos una afinidad específica entre sí. Preferiblemente, dicho primer polipéptido y dicho segundo polipéptido generan conjuntamente dicha función predeterminada mediante ayuste en trans mediado por inteína o mediante interacción de afinidad mediada por inteína. Dicha función predeterminada puede posteriormente activar un proceso celular de interés. Por tanto, la proteína que tiene la función predeterminada generada es referida también en la presente como "interruptor proteico". Dicha función predeterminada de dicho interruptor proteico puede ser, por ejemplo, una actividad de unión o una actividad enzimática que pueda actuar sobre otros componentes para controlar dicho proceso celular de interés. Funciones o actividades predeterminadas adicionales de dicho interruptor proteico están descritas más adelante.

Dicho primer fragmento y dicho segundo fragmento son generalmente fragmentos de una proteína una de cuyas funciones va a ser (re)generada en el método de la invención. La realización del método de la invención requiere típicamente la producción de ácidos nucleicos que codifiquen dicho primer polipéptido (particularmente para llevar a cabo la etapa (a)) y dicho segundo polipéptido. Una secuencia que codifique dicho primer polipéptido está por tanto codificada en dicho ácido nucleico heterólogo de la etapa (a). Dicho segundo polipéptido puede ser expresado separadamente en, por ejemplo, bacterias como E. coli.

La producción de ácidos nucleicos que codifiquen dicho primer y dicho segundo fragmento puede comprender la división de una secuencia de nucleótidos que codifique dicha proteína en dos o más fragmentos. Preferiblemente, dicha secuencia de nucleótidos que codifica dicha proteína es dividida en dos fragmentos, obteniendo así una parte 5' y una parte 3' de la secuencia de nucleótidos. Dicha parte 5' puede corresponder esencialmente a dicho primer fragmento. Dicha parte 3' puede corresponder esencialmente a dicho segundo fragmento. Dicha parte 5' y dicha parte 3' pueden contener también secuencias reguladoras que pueden derivar de un gen que codifique dicha proteína. Dicha secuencia de nucleótidos es típicamente una secuencia codificadora (o un marco de lectura abierto) de la proteína que tiene la función predeterminada. Para obtener dichos fragmentos, dicha secuencia de nucleótidos es preferiblemente dividida de tal manera que cada fragmento obtenido, después de la expresión, sea incapaz de generar dicha función predeterminada en ausencia del otro fragmento. Cada fragmento contiene una porción de secuencia necesaria para la función de la proteína que tiene la función predeterminada. Por ejemplo, si dicha proteína es un enzima, cada fragmento contiene preferiblemente aminoácidos necesarios para la catálisis o para la unión al sustrato del enzima. La proteína que tiene dicha función predeterminada puede ser dividida en dichos fragmentos de muchas formas diferentes, siempre que la generación de dicha función predeterminada requiera todos los dichos fragmentos. La información estructural y funcional conocida sobre dicha proteína puede ser de ayuda para encontrar un lugar adecuado de división de dicha secuencia de nucleótidos. En cualquier caso, se puede probar fácilmente de forma experimental si un fragmento generado por la división en un lugar elegido aleatoriamente es capaz de expresar la función predeterminada codificada por dicha secuencia de nucleótidos.

Si la generación de la función predeterminada se realiza mediante ayuste en trans mediado por inteína, las secuencias de nucleótidos que codifican dicho primer y dicho segundo fragmento son posteriormente unidas a ácidos nucleicos que codifiquen fragmentos de inteína. Como resultado, se obtiene un ácido nucleico que codifica dicho primer polipéptido y un ácido nucleico que codifica dicho segundo polipéptido. Dichos polipéptidos serán capaces de ayuste en trans de la proteína. Mediante dicho ayuste en trans, dicho primer y dicho segundo fragmento son unidos mediante la formación de un enlace peptídico. Las inteínas de ayuste en trans para ser utilizadas en esta invención pueden ser seleccionadas de los genomas nucleolares y de orgánulos de diferentes organismos incluyendo eucariotas, arqueobacterias y eubacterias. Las inteínas que pueden ser utilizadas para llevar a cabo esta invención está enumeradas en http://www.neb.com/neb/inteins.html. Puede utilizarse también una de las inteínas mencionadas en las referencias citadas en la presente. La elección de la inteína puede depender de las secuencias consenso así como de las condiciones requeridas para un ayuste en trans eficaz.

Dicho proceso celular de interés puede requerir frecuentemente uno o más ácidos nucleicos heterólogos adicionales en las células de dicha planta en las que dicho proceso celular va a ser controlado o activado (cf. Fig. 8). Dicha función predeterminada de dicha proteína puede actuar sobre dicho ácido nucleico heterólogo adicional, activando así dicho proceso celular de interés. Dicho ácido nucleico heterólogo adicional puede estar presente en todas las células o en una fracción de células de dicha planta. Puede estar incorporado de manera estable en los genomas nucleares o de orgánulos de células de dicho organismo. Lo que se ha dicho en relación a dicho ácido nucleico heterólogo de la invención aplica también en general a dicho ácido nucleico heterólogo adicional. Preferiblemente, dicha planta es transgénica en lo que se refiere a dicho ácido nucleico heterólogo adicional y en lo que se refiere a dicho ácido nucleico heterólogo. Dicho ácido nucleico heterólogo y dicho ácido nucleico heterólogo adicional pueden haber sido introducidos en dicha planta o en dichas células vegetales juntos en la etapa (a) de la invención, por ejemplo en una construcción heteróloga grande que contenga ambos.

Con respecto a dicho proceso celular de interés, no existen limitaciones particulares y la invención tiene una aplicabilidad muy amplia. Dicho proceso celular de interés puede ser o puede comprender la formación de un ADN, de un ARN o de una proteína de interés a partir de dicho ácido nucleico heterólogo adicional o implicar a dicho ácido nucleico heterólogo adicional. Existen numerosas posibilidades para lograr la formación de dicho ADN, de dicho ARN o de dicha proteína de interés. Dicha proteína que tiene la función predeterminada generada puede contener, por ejemplo, un segmento que tenga actividad para unirse a dicho ácido nucleico heterólogo adicional, por ejemplo a un promotor. Dicho segmento puede posteriormente actuar, por ejemplo, como un factor de transcripción que induzca la transcripción de dicho ácido nucleico heterólogo, desencadenando así la formación de un ARN y de la proteína de interés.

Preferiblemente, dicha proteína tiene un segmento con actividad enzimática capaz de desencadenar la formación de dicho ADN, de dicho ARN o de la proteína de interés. Ejemplos de tales actividades son actividades modificadoras de ADN o de ARN como la actividad de una recombinasa específica de sitio, de una flipasa, de una resolvasa, de una integrasa, de una polimerasa o de una transposasa. Dicha actividad enzimática puede modificar dicho ácido nucleico heterólogo adicional dando lugar a la expresión de una proteína de interés mediante, por ejemplo, recombinación. En una realización en la que dicha proteína (dicho interruptor proteico) tiene actividad polimerasa, dicho segmento puede ser una ARN polimerasa dependiente de ADN que actúe sobre un promotor de dicho ácido nucleico heterólogo adicional. Dicho promotor, preferiblemente, no es reconocido por las polimerasas nativas de dicha planta. Ejemplos de tales sistemas de promotor-polimerasa son sistemas de promotor bacteriano, vírico o de un bacteriófago-polimerasa como el promotor de T7-polimerasa de T7. Además, dicho proceso celular de interés puede dar lugar a la formación de un operón expresable procedente de dicho ácido nucleico heterólogo adicional o de un producto de expresión del ARN de dicho ácido nucleico heterólogo adicional.

Además, dicho ADN, dicho ARN o dicha proteína de interés formados a partir de dicho ácido nucleico heterólogo adicional pueden ser capaces de propagarse a otras células de dicha planta (por ejemplo un vector vírico de ADN o ARN). Un ejemplo importante de tal proceso celular es la formación de un amplicón expresable a partir de dicho ácido nucleico heterólogo adicional o a partir de un producto de expresión del ARN de dicho ácido nucleico heterólogo adicional. Dicho amplicón es capaz de amplificarse dentro de las células de su activación o formación (vector de amplificación). Dicho amplicón puede ser un amplicón expresable que contenga un gen de interés para ser expresado en dicho proceso celular de interés. Además, dicho amplicón puede ser capaz de movimiento célula a célula o de movimiento sistémico en la planta de la invención. El amplicón puede estar basado en un virus de ADN o ARN de plantas. Se prefieren virus de ARN de plantas como los tobamovirus. Las propiedades de amplificación de dicha proteína de interés capaz de propagarse (ver más adelante) y de dicho amplicón pueden comportarse de forma sinérgica, permitiendo así que un proceso celular de interés extremadamente potente se propague a partes significativas de dicha planta (dando lugar por ejemplo a la expresión extremadamente potente de una proteína de interés a partir de dicho amplicón). La producción de amplicones basados en tobamovirus es conocida en la técnica (ver, por ejemplo, Dawson y col., 1989, Virology, 172, 285-293; Yusibov y col., 1999, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 240, 81-94; para una revisión, ver "Genetic Engineering With Plant Viruses", 1992, eds. Wilson and Davies, CRC Press, Inc.).

Dicha proteína que tiene dicha función predeterminada puede inducir la formación de un ADN, un ARN o una proteína de interés a partir de dicho ácido nucleico heterólogo adicional según sigue. Una porción de la secuencia de dicho ácido nucleico heterólogo adicional puede ser unible operativamente a un promotor de la transcripción por la acción de dicha proteína, lo cual permite inducir, por ejemplo, la expresión de una proteína de interés o la transcripción de un amplicón vírico de ARN a partir de dicho ácido nucleico heterólogo adicional, por ejemplo uniendo operativamente una secuencia que codifique dicha proteína de interés o un amplicón de ARN con un promotor. Existen varias formas de llevar esta realización a la práctica. Una opción es separar, en dicho ácido nucleico heterólogo adicional, la secuencia que codifica un amplicón de ARN (o la secuencia que codifica una proteína de interés) y un promotor mediante un bloque de secuencias que impida una unión operativa entre los mismos. Dicho bloque de secuencias puede estar flanqueado por sitios de recombinación, de tal manera que dicho bloque pueda ser cortado por una función recombinasa de dicha proteína que tiene dicha función predeterminada, por lo que la recombinasa puede reconocer dichos sitios de recombinación. De este modo, puede establecerse la unión operativa para la transcripción de la secuencia que codifica el amplicón de ARN y puede inducirse la expresión. Otra opción es tener una porción de una secuencia necesaria para la transcripción (por ejemplo un promotor o la porción de un promotor) en orientación invertida y flanqueada por sitios de recombinación. Después de la generación de dicha proteína que tiene una función recombinasa predeterminada adecuada, dicha recombinasa puede invertir de nuevo dicha porción de la secuencia a su orientación correcta, mediante lo cual puede establecerse una unión operativa.

En una realización principal de la invención, dicho proceso celular de interés implica la formación de una proteína de interés a partir de dicho ácido nucleico heterólogo adicional, donde dicha proteína de interés es capaz de propagarse dentro de la planta, esto es, es capaz de dejar la célula en la que se ha formado y entrar en otras células de dicha planta ("proteína propagadora"; si la proteína propagadora puede ejercer una función de interruptor, el término "interruptor proteico" aplica también a la proteína propagadora). En otras células, dicha proteína (proteína propagadora) puede activar un proceso celular de interés, en particular mediante el control de un ácido nucleico heterólogo adicional. Dicha acción de dejar una célula y entrar en otras células comprende preferiblemente un movimiento célula a célula o un movimiento sistémico en dicha planta o en una parte de la misma. Dicha proteína (interruptor proteico) contiene preferiblemente una porción proteica que permite dicha acción de dejar una célula y entrar en otras células a dicho interruptor proteico. Dicha porción proteica puede ser un dominio de una proteína de movimiento vírica o de una proteína de la cubierta vírica. Además, dicha porción proteica puede ser un factor de transcripción vegetal o animal, o un dominio de un factor de transcripción vegetal o animal capaz de movimiento célula a célula o de movimiento sistémico. Además, dicha porción proteica puede ser un mensajero intercelular peptídico vegetal o animal, o un dominio de un mensajero intercelular peptídico vegetal o animal. Además, dicha porción proteica puede ser un péptido artificial capaz de facilitar el movimiento célula a célula o el movimiento sistémico. Preferiblemente, sin embargo, dicha porción proteica es, o comprende, una proteína de movimiento vírica o una proteína de la cubierta vírica, o un dominio de una proteína de movimiento vírica o de una proteína de la cubierta vírica.

Cuando dicho interruptor proteico capaz de propagarse entra en otras células que contienen dicho ácido nucleico heterólogo o dicho ácido nucleico heterólogo adicional, es preferiblemente capaz de activar (inducir) la expresión de dicha proteína a partir de un ácido nucleico heterólogo (adicional) (cf. Fig. 8). Mediante la utilización de esta proteína (interruptor proteico), el método de la invención permite amplificar y propagar la señal de activación proporcionada externamente con dicho segundo polipéptido en dicha planta. Particularmente, si el número de células alcanzado inicialmente por dicho segundo polipéptido es pequeño, la señal de activación es llevada eficazmente a más células de dicha planta. Existen varias formas para hacer que dicho interruptor proteico pueda controlar su propia expresión a partir de dicho ácido nucleico heterólogo. Estas formas corresponden a las que pueden ser empleadas para dicho polipéptido de la etapa (b) dadas anteriormente.

Aparte de la capacidad de controlar su propia expresión, el interruptor proteico (dicha proteína que tiene dicha función predeterminada o dicha proteína expresada a partir de dicho ácido nucleico heterólogo adicional) tiene preferiblemente la capacidad de activar un proceso celular de interés. Aunque se prefiere la activación de un proceso celular, está claro para los expertos en la técnica que el resultado final del proceso celular que fue activado puede ser también la supresión o la inactivación de un proceso en las células de la planta. Para poder activar dicho proceso celular de interés, dicho interruptor proteico puede tener un segmento que sea capaz de controlar dicho proceso celular. Dicho segmento puede tener actividad de unión o una actividad enzimática que controle un ácido nucleico (en particular un ácido nucleico heterólogo adicional) necesario para dicho proceso celular de interés. En el método de la invención, dicho interruptor proteico puede llevar a cabo la activación de dicho proceso celular de manera análoga al control de su propia expresión a partir de un ácido nucleico heterólogo adicional. Para este fin, dicho interruptor proteico puede tener un segmento para controlar dicho proceso celular y un segmento para producir dicha expresión de dicha proteína, donde los mecanismos de control de dichos dos segmentos pueden ser diferentes. Preferiblemente, los dos mecanismos de control son similares o idénticos, donde un segmento de dicha proteína de control puede ser suficiente para activar dicho proceso celular y para controlar la expresión de dicha proteína. De este modo, para simplificar, dicho interruptor proteico contiene muy preferiblemente dicho segmento y una porción que confiere a dicha proteína la capacidad de abandonar una célula y entrar en otras células de dicha planta.

El proceso celular de interés que fue inducido según se describe en la presente no tiene que afectar, sin embargo, a toda la planta. En lugar de ello, dicho proceso celular de interés puede estar limitado a una parte de dicha planta como las semillas o las hojas. Preferiblemente, sin embargo, el proceso celular de interés afecta a partes sustanciales de dicha planta. La parte de la planta en la que dicho proceso celular es inducido depende inter alia del(los) lugar(es) de aplicación de dicho segundo polipéptido.

En general, dicho proceso celular de interés puede ser muy potente en las proximidades del lugar de aplicación de dicho segundo polipéptido y puede disminuir al aumentar la distancia a dicho lugar. Dicha disminución puede ser en general anisotrópica y depender de la estructura del tejido de dicha planta en el que se aplicó dicho segundo polipéptido. Si, por ejemplo, se va a inducir un proceso celular de interés (por ejemplo se va a inducir la expresión de un gen de interés) y dicho segundo polipéptido es aplicado a una fracción de una hoja de la planta, dicho proceso celular de interés tiene lugar típicamente en dicha fracción de dicha hoja y en las proximidades de dicha fracción de dicha hoja. Preferiblemente, dicho proceso celular de interés tiene lugar en la parte principal de dicha hoja. Más preferiblemente, dicho proceso celular de interés tiene lugar también en los brotes y en otras hojas. Muy preferiblemente, dicho proceso celular de interés tiene lugar en la parte principal de dicha planta. El grado de dicho proceso celular de interés (por ejemplo la expresión de un gen de interés) puede variar en dicha planta con, por ejemplo, el tipo de célula o el tipo de tejido. Obviamente, la aplicación de dicho segundo polipéptido no está limitada normalmente a un solo punto de la superficie
de la planta. Preferiblemente, dicho segundo polipéptido es aplicado a varias partes de dicha planta (ver más adelante).

El proceso celular de acuerdo con la invención puede comprender o dar lugar a una cascada bioquímica completa de interés, como una ruta biosintética de múltiples etapas, en las células de la planta. El proceso celular, o la cascada bioquímica, de interés no es operativo en la planta antes de la exposición a dicho segundo polipéptido. El método de la invención puede proporcionar el control sobre un proceso celular o sobre una cascada bioquímica de interés con una precisión técnica y una seguridad medioambiental hasta ahora inalcanzables. De este modo, están disponibles nuevas aplicaciones en biotecnología en general, y específicamente en biotecnología de plantas, para solucionar problemas que no pueden ser resueltos mediante las tecnologías convencionales como la actividad basal de expresión transgénica en una planta, particularmente cuando se producen sustancias tóxicas o polímeros biodegradables. Además, el control preciso de acuerdo con la invención permite cultivar una planta transgénica hasta una etapa deseada en la que, por ejemplo, la planta sea muy adecuada para llevar a cabo el proceso celular de interés sin cargar a la planta con una actividad de expresión basal que ralentice el crecimiento de la planta. Una vez que la planta esté lista para llevar a cabo eficazmente el proceso celular de interés, puede inducirse el proceso celular de interés y llevarse a cabo con una alta eficacia. Por consiguiente, el método de la invención permite desacoplar de manera segura la fase de crecimiento y la fase de producción de un organismo multicelular, específicamente de una planta transgénica. Además, es posible diseñar sistemas de múltiples componentes para múltiples procesos celulares o cascadas bioquímicas de interés, donde uno o más procesos deseados o cascadas deseadas pueden ser inducidos selectivamente.

Descripción de las figuras

La Fig. 1 es un esquema del método de acuerdo con la invención.

La Fig. 2 es un esquema que muestra realizaciones para generar un interruptor proteico activo a partir de fragmentos proteicos inactivos en una célula vegetal. A: generación de un interruptor proteico activo mediante ayuste en trans mediado por inteína de fragmentos proteicos. B: generación de un interruptor proteico activo mediante la unión por afinidad de fragmentos proteicos.

La Fig. 3 es un esquema que muestra el ensamblaje de una proteína funcional (AB) a partir de los fragmentos proteicos A y B no funcionales mediante ayuste en trans mediado por inteína (Fig. 3A) o mediante interacción por afinidad (Fig. 3B). El fragmento A es el segundo polipéptido de la invención que es introducido en la célula. El fragmento B es expresado internamente a partir de un ácido nucleico heterólogo.

La Fig. 4 es un esquema general que muestra la activación de un proceso celular de interés a través de un interruptor proteico que es capaz de moverse intercelularmente y producir su propia expresión en otras células. PS significa interruptor proteico, TP significa proteína movible capaz de moverse intercelularmente (esto es, de abandonar una célula y entrar en otras células), PS:TP significa una proteína de fusión PS-TP, hNA significa un ácido nucleico heterólogo adicional.

(A) representa un ácido nucleico heterólogo que codifica PS:TP y un ácido nucleico heterólogo adicional hNA. No se ha introducido ningún polipéptido externo (segundo), por lo que el interruptor proteico no es expresado y no se activa ningún proceso celular de interés.

(B) un polipéptido externo (permeable a la célula) es introducido produciendo la expresión del interruptor proteico PS:TP. El interruptor proteico puede controlar un proceso celular actuando sobre el hNA en la célula de su expresión. Además, el interruptor proteico puede abandonar la célula que había sido activada por dicho polipéptido introducido externamente y entrar en otras células. En otras células, el interruptor proteico puede inducir su propia expresión y controlar también el proceso celular actuando sobre el hNA.

La Fig. 5 representa las construcciones pICH9302 y pICH9311 diseñadas para el ayuste en trans mediado por inteína de la proteína GUS.

La Fig. 6 representa las construcciones pICH10181, pICH1065, pICH10666 y pICH9303 diseñadas para experimentos de ayuste en trans mediado por inteína in planta con la administración mediada por Agrobacterium de uno de los componentes proteicos (codificado por pICH10655) necesario para el ayuste en trans.

La Fig. 7 representa en (A) la construcción pICHGFPinv que contiene un provector no funcional basado en TMV y en (B) un derivado funcional de dicha construcción resultante de recombinación mediada por integrasa. Las flechas de la parte inferior indican los ARNs y ARNs subgenómicos (sg), incluyendo su orientación, que pueden ser formados a partir de la construcción mostrada en (B). Las siglas sgp significan promotor subgenómico.

La Fig. 8 representa una realización en la cual el fragmento del interruptor proteico suministrado por bacterias (INT-C:REC fr.) desencadena acontecimientos de recombinación en las células diana después de la formación de un interruptor proteico activo (recombinasa) mediante ayuste en trans mediado por inteína con un fragmento codificado internamente (REC fr.:INT-N). Dichos acontecimientos dan lugar a la síntesis de un interruptor proteico intracelular capaz de moverse intercelularmente (recombinasa:TP). El interruptor proteico intracelular puede además desencadenar acontecimientos de recombinación que dan lugar a la reordenación de un provector basado en un virus vegetal, lo cual tiene como resultado la expresión del gen de interés (GOI). MTS: secuencia de translocación membranal; TP: proteína capaz de moverse intercelularmente; SM: marcador seleccionable; RS: sitio de recombinación reconocido por una recombinasa de ADN específica de sitio/integrasa; ter1 y ter2: regiones de terminación de la transcripción; PROM: promotor activo en plantas; RdRp: ARN polimerasa vírica dependiente de ARN; MP: proteína de movimiento; 3'NTR: región 3' no traducida de un virus de ARN vegetal. Las flechas muestran la orientación de las secuencias codificadoras y reguladoras.

La Fig. 9 representa los vectores binarios pICBV2, pICBV12, pICBV33 y pICBV39.

La Fig. 10 representa los vectores pICH8983 y pICH8901.

La Fig. 11 representa los vectores pICH8912 y pICH9723.

La Fig. 12 representa los vectores pICH15099, pICH15085 y pICH15085-INT. Pact2-i - promotor de la transcripción con el primer intrón del gen ACTIN2 de Arabidopsis thaliana; PhiC31-N - parte N-terminal de la integrasa phiC31; PhiC31-C - parte C-terminal de la integrasa phiC31; inteína-N - parte N-terminal de la inteína DnaE de Synechocystis sp. PCC6803; inteína-C - parte C-terminal de la inteína DnaE de Synechocystis sp. PCC6803; NLS - señal de localización nuclear; virE - secuencias del operón virE agrobacteriano.

La Fig. 13 representa la región de ADN-T del vector pICH10921. SM - marcador seleccionable (gen NPTII);
RdRp - ARN polimerasa vírica dependiente de ARN; MP - proteína de movimiento; 3'NTR - región 3' no traducida de un virus de ARN de plantas; Pnos - promotor de la transcripción de la sintasa de nopalina; Tnos - región de terminación de la transcripción de la sintasa de nopalina; Pact2 - promotor de la transcripción del gen ACTIN2 de Arabidopsis thaliana; IRESmp75(cr) - IRES de la proteína de movimiento de la cepa de TMV de crucíferas; Attp y AttB - sitios de recombinación reconocidos por la integrasa phiC31.

Descripción detallada de la invención

En la base de esta invención está la utilización de la administración, preferiblemente mediada por una bacteria, de fragmentos de un interruptor proteico a células vegetales sin administrar la secuencia de ácido nucleico que codifica dichos fragmentos proteicos. El principio general de esta invención está mostrado en la Figura 1.

En la presente, una proteína con función de interruptor según se describió anteriormente es referida como interruptor proteico. Así, varias proteínas aquí descritas son referidas como interruptores proteicos, por ejemplo dicha proteína con dicha función predeterminada que es generada conjuntamente por dicho primer y dicho segundo fragmento, o dicha proteína de interés expresada a partir de dicho ácido nucleico heterólogo adicional. Las funciones de interruptor de estos interruptores proteicos pueden ser diferentes (por ejemplo, la actividad enzimática puede ser diferente). Preferiblemente, las funciones de interruptor pueden ser las mismas (por ejemplo, todos los interruptores proteicos pueden tener una actividad recombinasa específica), ya que un proceso de interés puede ser entonces controlado muy eficazmente. En particular, las funciones de interruptor de los interruptores proteicos pueden por tanto actuar en común, esto es, en paralelo en lugar de consecutivamente.

Elección de la proteína para la función de "interruptor"

Existe un número incontable de procesos celulares de interés que pueden ser activados de manera irreversible por dicha función predeterminada o por dicha proteína o interruptor proteico de la invención. El interruptor proteico puede, por ejemplo, controlar la expresión de un transgén de interés de muchas formas diferentes. Por ejemplo, puede activar la recombinación o la transcripción de ADN, el procesamiento o la traducción de ARN, modificaciones post-traduccionales de la proteína, etc. Además, puede ser activada por un transgén tras su administración a la célula vegetal y ser capaz después de esto de funcionar como interruptor. En la invención, puede formarse un interruptor proteico activo mediante interacciones de afinidad entre un fragmento del interruptor proteico suministrado por Agrobacterium (dicho segundo fragmento) y otro fragmento de dicho interruptor proteico codificado por la célula vegetal (dicho primer fragmento). Dicha interacción puede restaurar la actividad del interruptor proteico con (Figuras 2A y 3A) o sin (Figuras 2B y 3B) la formación de un enlace peptídico entre dichos fragmentos. Obviamente, la elección del interruptor proteico depende del diseño/elección del proceso celular que va a ser controlado en dicha planta. Dicho proceso celular puede ser controlado, en particular activado, por la reordenación o la modificación del ácido nucleico en células en las cuales está presente dicho interruptor proteico o en células que han sido invadidas por dicho interruptor proteico. En tal caso, el interruptor proteico puede comprender un enzima modificador de ADN o de ARN como una endonucleasa específica de sitio, una recombinasa, una metilasa, una integrasa, una transposasa, una polimerasa, etc.

Otras posibles funciones predeterminadas de un interruptor proteico de esta invención incluyen la activación de reacciones tales como la restricción de ADN y/o la replicación de ADN. Un ejemplo de una cascada bioquímica que puede ser activada por restricción es un sistema de dos componentes en el que una secuencia de ADN que contiene un origen de replicación y que está integrada en un genoma nuclear es cortada específicamente y convertida en un plásmido de replicación autosómica por un enzima de restricción de corte poco frecuente que sirve como interruptor proteico, desencadenando así la cascada.

Existen numerosas reacciones (funciones predeterminadas) que afectan a las moléculas de ARN y que pueden ser utilizadas como dispositivo activador eficaz para los procesos celulares de acuerdo con la presente invención. Éstas incluyen, inter alia, reacciones tales como la replicación del ARN, transcripción inversa, edición, silenciamiento o traducción. Existen abundantes técnicas anteriores que describen con detalle cómo, por ejemplo, una recombinasa específica de sitio, una integrasa o una transposasa pueden activar un proceso de interés mediante la escisión, la inversión o la inserción de ADN en células, en particular en células vegetales (Zuo, Moller y Chua, 2001, Nat. Biotech., 19, 157-161; Hoff, Schnorr y Mundy, 2001, Plant Mol. Biol., 45, 41-49; US5225341; WO9911807; WO9925855; US5925808; US6110736; WO0140492; WO0136595). Recombinasas específicas de sitio/integrasas de bacteriófagos y levaduras son ampliamente utilizadas para manipular ADN in vitro y en plantas y animales. Recombinasas-sitios de recombinación preferidos para ser utilizados en esta invención son los siguientes: recombinasa Cre-sitio de recombinación de LoxP, recombinasa FLP-sitios de recombinación de FRT, recombinasa R-sitios de recombinación de RS, integrasa del fago C31 que reconoce sitios de attP/attB, etc. Los transposones son ampliamente utilizados para el descubrimiento de una función génica en plantas. Sistemas de transposones preferidos para ser utilizados en la presente invención incluyen Ac/Ds, En/Spm,, transposones pertenecientes a la familia "mariner", etc.

Pueden utilizarse también en un interruptor proteico de acuerdo con la invención factores de transcripción heterólogos y ARN polimerasas. Por ejemplo, la administración de polimerasa de T7 a las células de una planta portadoras de un transgén bajo el control del promotor de T7 puede inducir la expresión de tal transgén.

La expresión de un transgén vegetal de interés que esté bajo el control de un promotor de bacteriófago (por ejemplo, T3, T7, SP6, K11) con la correspondiente ADN/ARN polimerasa ensamblada en las células de la planta, puede ser otro procedimiento eficaz para el desarrollo de los interruptores proteicos contemplados en esta invención. Otro procedimiento útil puede ser la utilización de promotores heterólogos o quiméricos u otros promotores artificiales que requieran para su activación factores de transcripción heterólogos o construidos. Los factores de transcripción heterólogos pueden ser utilizados también para inducir la expresión del transgén de interés bajo el control de dicho promotor reconocible por el factor de transcripción. Ejemplos de tales factores de transcripción pueden ser, pero sin limitarse a, el factor de transcripción ACE1 de levaduras sensible a metales que se une a secuencias específicas del promotor MT (metalotioneína) de levaduras (Mett y col., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90, 4567-4571), diferentes factores de transcripción quiméricos que tengan un dominio de unión a ADN específico de secuencia y un dominio de activación, como un factor de transcripción que tenga una proteína de fusión de seis dedos de zinc 2C7 y el dominio de activación del factor de transcripción VP16 del virus del herpes simple (Ordiz, Barbas y Beachy, 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 13290-13295), un factor de transcripción que tenga un represor 434 de longitud completa y los 80 aminoácidos C-terminales del activador transcripcional VP16 (Wilde y col., 1994, Plant Mol. Biol., 24, 381-388), un factor de transcripción utilizado en sistemas inducibles por esteroides (Aoyama y Chua, 1997, Plant J., 11, 605-612, McNellis y col., 1998, Plant J., 14, 247-257; US06063985) o un sistema inducible por tetraciclinas (Weinmann y col., 1994, Plant J., 5, 559-569). En algunos casos, pueden utilizarse los sistemas inducibles existentes para la expresión de transgenes. Alternativamente, los factores de transcripción heterólogos pueden ser modificados de tal manera que no se requiera ningún ligando-inductor-activador para llevar al factor de transcripción al estado activo. Los factores de transcripción quiméricos son ventajosos para ser utilizados en esta invención, ya que permiten combinar dominios de unión a ADN muy específicos de secuencia y dominios de activación muy eficaces, permitiendo así un efecto deseado máximo después de la administración de tal factor a la célula vegetal.

Otro interruptor proteico contemplado bajo la invención puede llevar a cabo una modificación post-traduccional de uno o más producto(s) de expresión de un ácido nucleico heterólogo, lo cual puede dar lugar a la activación del producto de expresión. Existen muchas aplicaciones posibles de tales interruptores proteicos que pueden operar controlando etapas tales como el plegamiento de polipéptidos, la formación de oligómeros, la eliminación de señales de vectorización, la conversión de un proenzima en un enzima, el bloqueo de la actividad enzimática, etc. Por ejemplo, la administración a las células de una planta de una proteasa específica de sitio puede activar un proceso celular de interés si un huésped manipulado genéticamente corta específicamente un proenzima, convirtiendo el mismo de este modo en un enzima activo, si un producto es dirigido a un compartimento celular particular debido a la capacidad del huésped para cortar o modificar un motivo diana, o si un producto es movilizado específicamente debido a la eliminación de una secuencia de unión específica. El corte de una proteína de fusión traduccional puede ser llevado a cabo a través de una secuencia peptídica reconocida por una proteasa vírica específica de sitio o a través de un péptido catalítico (Dolja y col., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10208-10212; Gopinath y col., 2000, Virology, 267, 159-173; US5162601; US5766885; US5491076). Otros ejemplos de proteasas específicas de sitio aplicables a esta invención son enteroquinasas de mamífero, por ejemplo, la cadena ligera de la enteroquinasa humana que reconoce la secuencia DDDK-I (Kitamoto y col., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci., 91, 7588-7592) y corta específicamente los enlaces Lys-Ile; proteasas víricas como Hc-Pro (Carrington, J.C. y Herndon, K.L., 1992, Virology, 187, 308-315) que cataliza la proteolisis entre el dipéptido Gly-Gly pero que requiere 4 aminoácidos para el reconocimiento del sitio de corte; la proteasa específica de sitio del Virus del Bosque Semliki (Vasilijeva y col., 2001, J. Biol. Chem., 276, 30786-30793); y proteasas implicadas en el procesamiento de la poliubiquitina, hidrolasas carboxi-terminales de la ubiquitina (Osava y col., 2001, Biochem. Biophys. Res. Commun., 283, 627-633).

Administración mediada por un patógeno de dicho segundo polipéptido (fragmento del interruptor proteico) a la célula vegetal

Los patógenos de plantas tienen sistemas muy eficaces para suministrar a las células vegetales proteínas efectoras. Muchas bacterias patógenas de plantas y animales utilizan sistemas de secreción especializados para suministrar proteínas efectoras directamente a las células huésped. Existen muchas descripciones en la literatura de tales sistemas secretores, por ejemplo el sistema de secreción de tipo III de las bacterias Gram negativas (Binet y col., 1997, Gene, 192, 7-11; Thanassi y Hultgren, 2000, Curr. Opin. Cell Biol., 12, 420-430; Buttner y Bonas, 2002, Trends Microbiol., 10, 186-192; Buttner y Bonas, 2003, Curr. Opin. Plant Biol., 6, 312-319), el sistema de secreción de tipo II de proteobacterias (Sandkwist, 2001, Mol. Microbiol., 40, 271-283). Múltiples rutas de secreción de proteínas por bacterias están descritas en la revisión de Thanassi y Hultgren (2000, Curr. Opin. Cell Biol., 12, 420-430). Los sistemas de secreción de tipo III de diferentes bacterias fitopatógenas pueden ser utilizados para la administración de una proteína heteróloga de interés a células vegetales. Por ejemplo, el grupo de genes Hrp (secreción de proteínas de tipo III) fue clonado a partir de Erwinia chrysanthemi (Ham y col., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 10206-10211); el sistema de secreción de Pseudomonas syringae está descrito con suficiente detalle para ser utilizado en esta invención (para una revisión ver Jin y col., 2003, Microbes Infect., 5, 301-310); el sistema secretor de Xanthomonas campestris está siendo estudiado intensamente (Marois y col., 2002, Mol. Plant Microbe Interact., 15, 637-646; Szurek y col., 2002, Mol. Microbiol., 46, 13-23).

Preferiblemente, para la presente invención se utilizan fitopatógenos que produzcan poco daño a las plantas huésped. Más preferiblemente, se manipulan fitopatógenos de tal manera que sean capaces de transferir una proteína heteróloga de interés sin causar ningún efecto nocivo a la planta huésped. Algunas bacterias no patógenas pueden ser manipuladas de tal manera que posean solamente aquella parte del sistema de secreción de tipo III que es necesaria para la administración de la proteína heteróloga de interés a la célula vegetal. Algunas bacterias Gram-negativas, como Agrobacterium tumefaciens y Agrobacterium rhizogenes, están bien estudiadas y son utilizadas ampliamente para introducir ADN recombinante en las células vegetales (Zambryski, 1988, Annu. Rev. Genet., 22, 1-30; Hiei, Komari y Kubo, 1997, Plant Mol. Biol., 35, 205-18; Newell, 2000, Mol. Biotechnol., 16, 53-65). Son capaces de administrar ADN-T a los núcleos de muchas especies vegetales y el mecanismo de tal transporte está razonablemente bien estudiado (Hooykaas y Beijersbergen, 1994, Annu. Rev. Phytopathol., 32, 157; Zupan y Zambryski, 1995, Plant Physiol., 107, 1041-1047; Hansen y Chilton, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 14978-14983). Las agrobacterias son posiblemente las más adecuadas para ser utilizadas en esta invención. La publicación del grupo de Hooykaas (2000, Science, 290, 979-982) demuestra la posibilidad de transferencia mediada por Agrobacterium a la célula huésped de la proteína heteróloga recombinasa Cre. La transferencia se consiguió utilizando la fusión traduccional de Cre con proteínas de virulencia o sus partes implicadas en la translocación de proteínas a la célula vegetal durante el contacto con Agrobacterium. La administración de recombinasa Cre no estaba acoplada con la transferencia del ADN codificador de dicha recombinasa, sino que era suficientemente eficaz para desencadenar acontecimientos de recombinación en células diana manipuladas. El proceso de administración a la célula vegetal de un polipéptido (dicho segundo polipéptido) mediada por una bacteria requiere la disponibilidad de células bacterianas manipuladas portadoras del gen de dicha proteína (WO0189283). Tal proceso es suficientemente eficaz para desencadenar cambios seleccionables en las células vegetales afectadas, pero tiene algunas desventajas serias que limitan significativamente la aplicabilidad de dicha invención. En primer lugar, no proporciona control sobre la segregación del transgén, ya que está presente la secuencia codificadora completa de dicho polipéptido en las bacterias fitopatógenas. En segundo lugar, no es lo suficientemente eficaz para tener aplicaciones prácticas, ya que los cambios desencadenados por el interruptor proteico están limitado a las células que eran los receptores primarios de dicho polipéptido.

Control sobre la segregación del transgén que codifica el interruptor proteico

Por tanto, se requiere un método muy eficaz para administrar dicho segundo polipéptido a cada una o a la mayor parte de las células de la planta diana o la propagación eficaz de los acontecimientos desencadenados por el interruptor proteico, o bien la combinación de ambos procedimientos. Además, para hacer que el sistema del interruptor proteico sea seguro, se desea un control estricto sobre el ácido nucleico heterólogo que codifica dicho interruptor proteico. Esto puede ser conseguido utilizando la aplicación directa del polipéptido (por ejemplo tratando las plantas con la solución que contiene dicho segundo polipéptido), o bien utilizando la administración bacteriana de dicho segundo polipéptido, donde solamente una parte de dicho interruptor proteico es suministrada por la bacteria, pero la otra parte (dicho primer polipéptido) está codificada por la célula vegetal diana.

Con el fin de tratar estos temas, se propone en la presente utilizar un procedimiento de "genes divididos" (o "proteínas divididas") para controlar la segregación del transgén que codifica dicho interruptor proteico, en particular de la proteína que tiene dicha función predeterminada. En esta realización, un interruptor proteico activo (funcional) es ensamblado mediante ayuste en trans de la proteína mediado por inteína (Fig. 2A y Fig. 3A) o por interacción de afinidad (Fig. 2B y Fig. 3B) a partir de dicho primer y dicho segundo fragmento de dicho primer y dicho segundo polipéptido, respectivamente. Éste es un tema especialmente importante para la administración mediada por fitopatógenos de una proteína con función de interruptor.

En el Ejemplo 1 de esta invención, nosotros demostramos la eficacia del ayuste en trans de GUS mediado por inteína in planta en células vegetales utilizando las construcciones mostradas en la Fig. 5. El ayuste en trans restaura muy eficazmente la actividad GUS, que es comparable con la de los experimentos control. En el Ejemplo 2 de esta invención, demostramos la eficacia de este procedimiento administrando una parte de la proteína GUS a la célula vegetal como una fusión traduccional con el extremo C-terminal de la proteína virF (Fig. 6). La administración de tales fusiones con la ayuda de un sistema secretor agrobacteriano da lugar a la formación de una proteína GUS funcional mediante ayuste en trans mediado por inteína, si otro fragmento de la proteína GUS está codificado en la célula vegetal por ADN-T integrado de manera estable o incluso coadministrado con otra cepa de Agrobacterium. En ambos casos, el interruptor proteico no existe como una secuencia de ADN continua y su utilización está mucho mejor controlada y es biológicamente segura.

El ayuste en trans de proteínas mediado por inteína con restauración de su actividad es conocido en la técnica anterior y está descrito con detalle en muchas publicaciones. La interacción por afinidad de proteínas y/o el ayuste en trans pueden ser realizados utilizando inteínas construidas (Fig. 2A). Las inteínas fueron identificadas por vez primera como secuencias proteicas incluidas en marco en un precursor de la proteína y escindidas durante el proceso de maduración de la proteína (Perler y col., 1994, Nucleic Acids Res., 22, 1125-1127; Perler, F.B., 1998, Cell, 92, 1-4). Toda la información y los grupos catalíticos necesarios para llevar a cabo una reacción de autoayuste residen en la inteína y en dos aminoácidos flanqueantes. El mecanismo químico del ayuste de proteínas está descrito con detalle por Perler y colaboradores (1997, Curr. Opin. Chem. Biol., 1, 292-299) y por Shao y Kent (1997, Chem. Biol., 4, 187-194). Las inteínas tienen normalmente regiones de ayuste N- y C-terminales y una región central de endonucleasa direccional ("homing") o una pequeña región adaptadora. Hasta ahora se conocen más de 100 inteínas que están distribuidas entre los genomas nucleares y de los orgánulos de diferentes organismos incluyendo eucariotas, arqueobacterias y eubacterias (http://www.neb.com/neb/inteins.html). Se demostró que las inteínas eran capaces de ayuste en trans. La eliminación de la región de endonucleasa direccional ("homing") central no tiene ningún efecto sobre el autoayuste de las inteínas. Esto hizo posible el diseño de sistemas de ayuste en trans, en los cuales los fragmentos N-terminal y C-terminal de una inteína son coexpresados como fragmentos separados y, cuando son fusionados a exteínas (fragmentos proteicos que están ligados entre sí con la ayuda de la inteína), pueden llevar a cabo un ayuste en trans in vivo (Shingledecker y col., 1998, Gene, 207, 187-195). Se demostró también con los fragmentos N- y C-terminal de la inteína RecA de Mycobacterium tuberculosis, que el ayuste en trans de la proteína puede tener lugar in vitro (Mills y col., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 3543-3548). Este fenómeno fue identificado también para la proteína DnaE de Synechocystis sp. cepa PCC6803 (Wu y col., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 9226-9231). Dos genes diferentes situados a más de 700 kpb de distancia en hebras de ADN opuestas codifican esta proteína. Se demostró también que dos secuencias de inteína codificadas por esos genes reconstituían una miniinteína dividida y eran capaces de mediar la actividad de ayuste en trans de la proteína cuando se ensayaron en células de Escherichia coli. Se utilizó una inteína del mismo origen (inteína DnaE de Synechocystis sp. cepa PCC6803) para producir sintasa II de acetolactato resistente a herbicidas funcional a partir de dos fragmentos no unidos (Sun y col., Appl. Environ. Microbiol., 67, 1025-29) y 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) (Chen y col., 2001, Gene, 263, 39-48) en E. coli.

El ayuste en trans de fragmentos proteicos (incluyendo la formación de enlaces covalentes entre exteínas) no se requiere necesariamente para restaurar la función original de la proteína dividida. En muchos casos, la interacción por afinidad entre fragmentos proteicos sin la formación de un enlace peptídico es suficiente para restaurar la función de la proteína (Fig. 2B). Este procedimiento tiene mucho éxito (como en el caso del ayuste en trans mediado por inteína) con proteínas que tienen dos o más dominios funcionales. En este caso, los dominios pueden ser separados entre sí dividiendo la secuencia codificadora entre dos vectores de transcripción y reunidos mediante interacciones de afinidad mediadas por la proteína (Fig. 3B). Los dominios proteicos pueden interaccionar sin la necesidad de utilizar inteínas interactivas. Existe un ejemplo de reconstitución de la actividad de la transposasa IS10 que consta de dos dominios estructurales conectados por una región adaptadora sensible a proteolisis (Kwon, Chalmers y Kleckner, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 8234-8238). Cada uno de los dominios separadamente es incapaz de proporcionar la función transposasa. Cuando son añadidos juntos, sin embargo, son capaces de proporcionar transposiciones incluso sin estar conectados por una región adaptadora. Existen muchos otros ejemplos de reconstitución de una proteína funcional a partir de fragmentos aislados sin la formación de enlaces peptídicos. Se consiguió el ensamblaje eficaz de un sitio de unión del receptor de insulina funcional mezclando sencillamente fragmentos no funcionales (Kristensen y col., 2002, J. Biol. Chem., 277, 18340-18345). Se demostró la reconstitución de proteínas activas mezclando simplemente dos fragmentos peptídicos inactivos para la leucina deshidrogenasa (Oikawa y col., 2001, Biochem. Biophys. Res. Commun., 280, 1177-1182), para la proteína de unión a Ca^{2+} calbindina D28k (Berggard y col., 2000, Protein Sci., 9, 2094-2108; Berggard y col., 2001, Biochemistry, 40, 1257-1264), para el regulador del desarrollo COP1 de Arabidopsis (Stacey y col., 2000, Plant Physiol., 124, 979-990), para el receptor de diopamina D (Scarselli y col., 2000, Eur. J. Pharmacol., 397, 291-296), para el microplasminógeno (De Los Santos, Wang y Reich, Ciba Found. Symp., 212, 76-83) y para muchas otras.

Los dominios cremallera de leucina tienen especial interés para formar heterodímeros proteicos una vez fusionados a fragmentos proteicos de interés (Riecker y Hu, 2000, Methods Enzymol., 328, 282-296; Liu y col., 2001, Curr. Protein Pept. Sci., 2, 107-121). Un ejemplo interesante es el control de la interacción proteína-proteína con una molécula pequeña. Por ejemplo, la recombinasa Cre fue manipulada de tal manera que, cuando se dividió en dos fragmentos inactivos, fue capaz de restaurar el 100% de su actividad recombinasa en presencia de la molécula pequeña rapamicina que desencadenaba la complementación de la actividad a través de heterodimerización entre dos fragmentos inactivos (Jullien y col., 2003, Nucleic Acids Res., 31, e131). La rapamicina y sus análogos no tóxicos pueden ser utilizados también para el ayuste condicional de la proteína, por el cual desencadenan una reacción de ayuste en trans (Mootz y col., 2003, J. Am. Chem. Soc., 125, 10561-10569). Procedimientos similares para la regulación de interacciones proteína-proteína con la ayuda de moléculas pequeñas tales como rapamicina o análogos de rapamicina, están descritos en varias publicaciones (Amara y col., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 10618-10623; Pollock y col., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 13221-13226; Pollock y col., 2002, Nat. Biotechnol., 20, 729-733). Pueden utilizarse otros muchos dimerizantes químicos tales como dexametasona y metotrexato para ensamblar homo o heterodímeros activos a partir de fragmentos proteicos inactivos (para una revisión ver: Pollock y Clackson, 2002, Curr. Opin. Biotechnol., 13, 459-467).

Pueden crearse eficazmente interacciones por afinidad mediante la utilización de dominios proteicos que interaccionen existentes en la naturaleza o mediante la identificación de tales dominios con la ayuda de sistemas de dos híbridos (Fields y Son, 1989, Nature, 340, 245-246; Chien y col., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 9578-9582; Yeast Protocol Handbook, Clontech Laboratories, Inc., 2000) o sistemas de presentación en fagos. Por ejemplo, puede utilizarse la presentación en fagos para seleccionar un oligopéptido 5-12-mero con una alta afinidad por un fragmento proteico de interés. Varios de tales sistemas están actualmente disponibles comercialmente. La presentación en fagos es una técnica de selección en la cual un oligopéptido corto 5-12-mero variable es insertado en una proteína de revestimiento de un bacteriófago. La secuencia que codifica este oligopéptido variable es incluida en el gen correspondiente de la proteína de revestimiento del bacteriófago. Normalmente, una biblioteca de presentación en fagos 7-meros tiene al menos 10^{9} clones independientes portadores de diferentes combinaciones de aminoácidos 7-meros en oligopéptidos variables. La presentación en fagos ha sido utilizada para crear complejos de afinidad entre un bacteriófago y una proteína de interés, permitiendo una identificación rápida de ligandos peptídicos para una proteína diana dada mediante un proceso de selección in vitro denominado "reconocimiento y selección de fagos recombinantes" ("panning") (Parmley, Smith, 1988, Gene, 73, 305-318; Cortese y col., 1995, Curr. Opin. Biotechnol., 6, 73-80). El complejo fago-proteína creado después del procedimiento de "panning" puede ser disociado y puede amplificarse un fago con afinidad por una proteína diana. Normalmente, se necesitan tres ciclos de "panning" para conseguir un bacteriófago con alta afinidad. Después de tres ciclos, pueden caracterizarse clones individuales mediante secuenciación de la región variable del ADN genómico. Dicho sistema puede ser adoptado eficazmente para identificar oligopéptidos cortos que interaccionen y utilizar los mismos como marcas de afinidad con el fin de unir fragmentos proteicos.

Otro procedimiento incluye la utilización de dominios de interacción existentes de forma natural como son las repeticiones ricas en leucina (Kobe y Deisenhofer, 1994, Trends Biochem. Sci., 19, 415-421; Kobe y Kajava, 2001, Curr. Opin. Struct. Biol., 11, 725-732), dedos de zinc (Grossley, Merika y Orkin, 1995, Mol. Cell Biol., 15, 2448-2456), repeticiones de anquirina (Thompson, Brown y McKnight, 1991, Science, 253, 762-768), dominios de cromo (Paro y Hogness, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 263-267; Singh y col., 1991, Nucleic Acids Res., 19, 789-793) y muchos otros implicados en las interacciones proteína-proteína. Sin embargo, debe tenerse en cuenta la posibilidad de implicar en las interacciones proteína-proteína no sólo los fragmentos proteicos construidos que contienen las fusiones de motivos, sino también proteínas endógenas.

La utilización de las interacciones proteína-proteína para activar un proceso celular de interés, como la expresión génica, tiene inter alia las ventajas siguientes: En primer lugar, puede hacerse que el sistema sea altamente específico, ya que la función de interés es el resultado de una interacción proteína-proteína o proteína-ácido nucleico altamente específica, que se caracteriza por un estado no inducido a nivel cero y por la ausencia de escapes no específicos. Esto contrasta con los sistemas de la técnica anterior tales como interruptores basados en moléculas pequeñas que son inherentemente menos específicas y muestran invariablemente un cierto grado de escapes. En segundo lugar, un interruptor proteico o un fragmento del mismo puede ser suministrado directamente a las células de una planta sin un vector de ácido nucleico que codifique dicha proteína o dicho fragmento, permitiendo así la dosificación precisa de dicha proteína. Esto hace que la administración directa de un interruptor proteico a la célula sea comparable con las ventajas de la utilización de pequeñas moléculas para desencadenar en las células un proceso requerido. En tercer lugar, el sistema es inherentemente más seguro para el medio ambiente que los sistemas de la técnica anterior que contienen la información genética completa para la proteína de interés o para el interruptor proteico (ya sea en forma de ácido nucleico lineal o de fragmentos de dicho ácido nucleico), ya que permite que el organismo en cuestión no contenga la información genética completa necesaria para la expresión de una proteína funcional. De acuerdo con el dogma central de la biología molecular, los sistemas biológicos no pueden traducir de manera inversa proteínas a ácidos nucleicos. Por tanto, la "manipulación inversa" de la información genética suficiente para la expresión de un rasgo funcional por un organismo vivo es imposible. En cuarto lugar, el sistema proporciona un bloqueo específico que podría ser utilizado para prohibir el uso no autorizado del sistema. La utilización de un interruptor proteico (en particular de dicho segundo polipéptido) como componente de un extracto proteico bruto de un organismo que exprese dicho polipéptido o dicho fragmento proteico hace que sea prácticamente muy difícil identificar el componente activo de dicho extracto.

Propagación del interruptor proteico dentro de una planta para activar un proceso celular de interés

En la presente, se proporciona un procedimiento para solventar el problema del bajo número de células de una planta que pueden ser alcanzadas por el segundo polipéptido aplicado externamente: dicho segundo polipéptido puede dar lugar en las células de la planta a la formación de una molécula de interruptor proteico capaz de moverse célula a célula o de movimiento sistémico. Además, dicho segundo polipéptido puede dar lugar a la formación de un vector basado en un virus (amplicón) que exprese un gen de interés o una parte del mismo y que sea capaz de moverse célula a célula o de moverse de forma sistémica en dicha planta. En estos procedimientos, el movimiento de los vectores víricos o de las moléculas de interruptor proteico o de ambos, puede dar lugar a la propagación de un proceso celular y/o de una cascada bioquímica a partes significativas de dicha planta e incluso a toda planta modificada genéticamente.

En el Ejemplo 3 de esta invención, el interruptor proteico contiene una integrasa phiC31 para convertir un vector precursor de un vector vírico en el vector vírico. La integrasa es dividida en dos fragmentos inactivos que forman proteínas funcionales debido al ayuste en trans mediado por inteína de los dos fragmentos de la integrasa. Uno de dichos fragmentos es administrado a la célula vegetal como una proteína de fusión con el fragmento virE2 (pICH15085-INT, Fig. 12) con la ayuda de un sistema de translocación de proteínas agrobacteriano, mientras que el otro (pICH15099, Fig. 12) está codificado por la célula vegetal. El vector vírico es capaz de amplificación, de movimiento célula a célula y de movimiento sistémico. La recombinación mediada por la integrasa entre los sitios de attP y attB de pICHGFPinv (Fig. 7A) o pICH10921 (Fig. 13), da lugar a la inversión de un fragmento de ADN flanqueado por dichos sitios de recombinación y a la formación de un vector vírico capaz de amplificar y expresar el gen de interés (GFP) (Fig. 7B). Esto se consigue como resultado de la colocación de los componentes víricos (3'NTR - región 3' no traducida; CP - proteína de la cubierta) necesarios para la amplificación del vector y el transporte sistémico, en orientación sentido con relación a un promotor activo en la planta en cuestión, como el promotor de la actina 2 en este ejemplo. De este modo, junto con los demás componentes del vector vírico (RdRp y CP) forma un ADNc que después de la transcripción dirigida por el promotor de la actina 2 forma un vector vírico de ARN capaz de amplificación, de movimiento célula a célula y de movimiento sistémico. Opcionalmente, dicho vector puede ser modificado adicionalmente mediante la eliminación del gen CP (proteína de la cubierta). Tal vector carente del gen CP será todavía capaz de moverse célula a célula.

La construcción de sistemas de expresión basados en virus de plantas para la expresión de genes no víricos en plantas ha sido descrita en varios artículos (Dawson y col., 1989, Virology, 172, 285-293; Brisson y col., 1986, Methods in Enzymology, 118, 659; MacFarlane y Popovich, 2000, Virology, 267, 29-35; Gopinath y col., 2000, Virology, 267, 159-173; Voinnet y col., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14147-14152) y revisiones (Porta y Lomonossoff, 1996, Mol. Biotechnol., 5, 209-221; Yusibov y col., 1999, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 240, 81-94) y puede llevarse a cabo fácilmente por los expertos en la técnica. Los sistemas de expresión basados en vectores víricos ofrecen un rendimiento del producto transgénico significativamente más elevado en comparación con los transgenes nucleares de plantas. Por ejemplo, el nivel de proteína codificada transgénicamente puede alcanzar el 5-10% del contenido total de proteínas vegetales celulares cuando se expresa a partir de un vector vírico (Kumagai y col., 2000, Gene, 245, 169-174; Shivprasad y col., 1999, Virology, 255, 312-323). Los virus de ARN son los más adecuados, ya que ofrecen un nivel de expresión más elevado en comparación con los virus de ADN. Existen varias patentes publicadas que describen vectores víricos adecuados para la expresión sistémica de material transgénico en plantas (US5316931; US5589367; US5866785). En general, estos vectores pueden expresar un gen foráneo como una fusión traduccional con una proteína vírica (US5491076; US5977438), a partir de un promotor subgenómico adicional (US5466788; US5670353; US5866785), o a partir de ARN vírico policistrónico utilizando elementos IRES (sitio interno de entrada al ribosoma) para la traducción de proteínas independientes (Solicitud de Patente Alemana DE 10049587). El primer procedimiento - fusión traduccional de una proteína recombinante con una proteína estructural vírica (Hamamoto y col., 1993, BioTechnology, 11, 930-932; Gopinath y col., 2000, Virology, 267, 159-173; JP6169789; US5977438) produce un rendimiento significativo del producto proteico recombinante. Sin embargo, la utilidad de este procedimiento es limitada, ya que la proteína recombinante no puede ser separada fácilmente de la proteína vírica. Una alternativa de este procedimiento emplea un fusión traduccional a través de una secuencia peptídica reconocida por una proteasa vírica específica de sitio o a través de un péptido catalítico (Dolja y col., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10208-10212; Gopinath y col., 2000, Virology, 267, 159-173; US5162601; US5766885; US5491076). Los procesos de expresión que utilizan vectores víricos añadidos a promotores subgenómicos heterólogos proporcionan el nivel de producción de proteína más elevado hasta la fecha (US5316931). La desventaja más seria de los vectores víricos y de muchos otros es su capacidad limitada con respecto al tamaño del ADN que va a ser amplificado. Normalmente, las construcciones estables acomodan insertos de no más de un kb. En algunas áreas de la genómica funcional de plantas esto puede no ser tal limitación seria, ya que G. della-Cioppa y col. (WO993651) describieron la utilización de vectores víricos basados en TMV para expresar bibliotecas de ADNc de plantas con el fin de silenciar genes endógenos. Sistemas de amplificación de dos componentes que utilizan virus cooperadores pueden ofrecer una capacidad ligeramente mejor (US5889191). Otros sistemas basados en casetes de expresión que están integrados de manera estable en el genoma de la planta contienen el potente promotor de 35S que dirige la expresión de amplicones basados en vectores víricos. Estos sistemas están normalmente sometidos a la silenciación post-transcripcional de genes (PTGS) (Angell y Baulcombe, 1997, EMBO J., 16, 3675-3684). La utilización de supresores de PTGS es necesaria para solventar tal silenciación (WO0138512). Requiere realizar cruces entre plantas portadoras del amplicón silenciado y plantas portadoras de la fuente del supresor de PTGS (Mallory y col., 2002, Nature Biotechnol., 20, 622-625) para conseguir la producción a gran escala de una proteína de interés con la ayuda de tal sistema. Evidentemente, tal sistema no tiene un control flexible y estrecho sobre la expresión del transgén y está limitado a la producción de proteínas que no comprometan el crecimiento ni el desarrollo de la planta.

Nuestro procedimiento permite solventar las limitaciones de los sistemas de vectores víricos anteriormente descritos, específicamente su capacidad limitada por el tamaño del gen que va a ser expresado y la falta de flexibilidad para controlar la expresión. En nuestra invención, el precursor del vector vírico (o provector) está presente preferiblemente en cada célula de la planta transgénica. En el caso de la expresión de genes grandes (mayores de 1 kb), se prefiere el movimiento del interruptor proteico al movimiento del vector vírico. Los vectores víricos pueden amplificarse eficazmente en células y el tamaño del inserto de un vector vírico afecta principalmente a la capacidad de movimiento célula a célula y de movimiento sistémico. Por tanto, la provisión de un interruptor proteico capaz de activar un vector vírico movible a muchas células o incluso a todas las células de la planta huésped, solucionará el problema anteriormente mencionado. Adicionalmente, para proporcionar a un sistema una función de interruptor eficaz que sea capaz de activar la amplificación de tal vector vírico en la mayor parte de las células, si no en todas, de la planta huésped, se utilizan en la presente invención interruptores proteicos capaces de movimiento célula a célula/sistémico.

Para este fin, el interruptor proteico puede contener una porción proteica que haga que dicha proteína sea capaz de movimiento célula a célula y/o sistémico. Ejemplos de tales porciones proteicas capaces de moverse intercelularmente son conocidos en la técnica anterior. Existen pruebas de que factores de transcripción de plantas, proteínas relacionadas con la defensa y proteínas víricas pueden moverse a través de los plasmodesmos (para una revisión ver: Jackson y Hake, 1997, Curr. Opin. Genet. Dev., 7, 495-500; Ding, B., 1998, Plant Mol. Biol., 38, 279-310; Jorgensen, R.A., 2000, Sci. STKE, 58, PE2; Golz y Hudson, 2002, Plant Cell, 14, S277-S288). Se demostró que la fusión de una proteína de movimiento 3a del virus del mosaico del pepino con GFP puede moverse hacia las células vecinas a través de los plasmodesmos (Itaya y col., 2002, Plant Cell, 14, 2071-2083). Tal fusión mostró también movimiento a través del floema desde el rizoma transgénico al vástago no transgénico. La proteína de movimiento del virus del mosaico del tabaco (TMV), P30, se mueve entre las células a través de los plasmodesmos y, al influir sobre el tamaño de los plasmodesmos, facilita el movimiento de muchas otras macromoléculas grandes no especificadas para tal movimiento (Citovsky y col., 1999, Phil. Trans. R. Soc. London B Biol. Sci., 354, 637-643; Ding, Itaya y Woo, 1999, Int. Rev. Cytol., 190, 251-316). La fusión P30:GFP mostró movimiento entre las células independientemente de las condiciones fisiológicas, mientras que la difusión no vectorizada de GFP a través de los plasmodesmos depende en gran parte del estado fisiológico de las células de la planta (Crawford y Zambryski, 2001, Plant Physiol., 125, 1802-1812). La fusión de GFP con el factor de transcripción knotted 1 mostró también capacidad de movimiento intercelular. La proteína de fusión GFP:KN1 demostró movimiento desde los tejidos internos de la hoja hacia la epidermis, entre células epidérmicas y hacia el meristemo apical de los brotes de la planta del tabaco (Kim y col., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 4103-4108). Los plasmodesmos desempeñan una función importante en tal movimiento y su estado fisiológico y su estructura son importantes para la eficacia de tal movimiento. Por ejemplo, los plasmodesmos simples permiten el tráfico no específico de proteínas en hojas de tabaco en desarrollo, mientras que los ramificados no lo permiten (Oparka y col., 1999, Cell, 98, 5-8). El permitir el tráfico de macromoléculas, incluyendo proteínas, parece ser una función normal de los plasmodesmos que ha sido utilizada por los virus de las plantas para su propagación célula a célula (Fujiwara y col., 1993, Plant Cell, 5, 1783-1794). En general, es evidente que los plasmodesmos y el floema desempeñan una función importante en el transporte y el suministro de macromoléculas de información (proteínas y ácidos nucleicos) (Ruiz-Medrano y col., 2001, Curr. Opin. Plant Biol., 4, 202-209). Las proteínas de la savia del floema de Cucurbita maxima y Ricinum communis tienen la capacidad de moverse célula a célula a través de los plasmodesmos (Balachandran y col., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 14150-14155).

La Figura 8 muestra esquemáticamente las posibilidades para conseguir el movimiento intercelular del interruptor proteico de la invención. Un fragmento del interruptor proteico suministrado externamente (esto es, dicho segundo polipéptido) y el interruptor proteico sintetizado en una célula pueden ser fusiones de los mismos o de diferentes segmentos proteicos para señales de translocación o movimiento. En nuestro ejemplo (Fig. 8) el mismo segmento proteico, por ejemplo una recombinasa o un fragmento de la misma, es fusionado con un fragmento de inteína para mediar el ayuste en trans o con una porción proteica (TP) que proporciona el movimiento intercelular. Es muy probable que con proteínas pequeñas (como GFP y más pequeñas), la fusión con TP pueda no ser necesaria, ya que pueden ser capaces de un movimiento célula a célula muy eficaz mediante difusión simple. Sin embargo, para interruptores proteicos más grandes, la fusión con una TP o con un fragmento activo de la misma es ventajosa. Es evidente que entre todas las proteínas implicadas en el movimiento intercelular, las proteínas víricas son las mejor estudiadas. Son los candidatos más preferidos para ser incluidos en un interruptor proteico. Según está mostrado en la Fig. 8, un fragmento de un interruptor proteico suministrado externamente, después de la complementación funcional por el fragmento intracelular del interruptor proteico, desencadena la expresión de un transgén que codifica un interruptor proteico que tiene la misma actividad enzimática pero que es capaz de moverse intercelularmente (recombinasa:TP). Dicho interruptor proteico capaz de moverse desencadena la expresión del interruptor proteico en todas las células afectadas, lo cual representa una reacción en cadena. La disponibilidad de tal interruptor proteico en la célula es un prerrequisito para desencadenar la expresión de un gen de interés (GOI) en las células mediante reordenación del ADN, produciendo la formación de un amplicón basado en el vector vírico. El tamaño del gen de interés expresado a partir de tal amplicón no es un factor limitante para la expresión eficaz del GOI, ya que la estabilidad del amplicón y el movimiento célula a célula no son necesarios en este sistema: el provector vírico puede estar presente en cada célula de la planta y la propagación del interruptor proteico puede desencadenar la expresión del gen de interés en cada una de
estas células. Preferiblemente, sin embargo, la propagación del amplicón contribuye a una expresión eficaz del GOI.

El fin último del sistema del interruptor proteico contemplado en la presente es el control operativo de un proceso celular de interés o de una cascada de reacciones bioquímicas de interés en el sistema de producción de una planta. Una cascada bioquímica es una cadena de reacciones bioquímicas en un sistema de producción del huésped que finalmente da lugar a un producto, un efecto o un rasgo de interés específico.

Los procedimientos descritos en la presente, además de ser versátiles y a prueba de escapes, proporcionan un método eficaz de control de la producción. El proceso de dos componentes anteriormente descrito es en esencia un sistema de "llave-cerradura", mediante el cual una compañía puede controlar eficazmente el acceso a la producción vendiendo el componente interruptor proteico.

Las plantas preferidas para ser utilizadas en esta invención incluyen cualquier especie de planta, dándose preferencia a las especies importantes desde el punto de vista agronómico y hortícola. Las plantas de cultivo comunes para ser utilizadas en la presente invención incluyen alfalfa, cebada, alubias, cánola, arveja de vaca, algodón, maíz, trébol, loto, lentejas, lupino, mijo, avena, guisantes, cacahuetes, arroz, centeno, trébol dulce, girasol, guisante de olor, soja, sorgo triticale, judías de ñame, judías terciopelo, arveja, trigo, glicina y plantas de nuez. Las especies de plantas preferidas para la práctica de esta invención incluyen, pero no se limitan a: especies representativas de Gramineae, Compositeae, Solanaceae y Rosaceae.

Adicionalmente, las especies preferidas para ser utilizadas en la invención, además de las especificadas anteriormente, son plantas de los géneros: Arabidopsis, Agrostis, Allium, Antirrhinum, Apium, Arachis, Asparagus, Atropa, Avena, Bambusa, Brassica, Bromus, Browaalia, Camellia, Cannabis, Capsicum, Cicer, Chenopodium, Chichorium, Citrus, Coffea, Coix, Cucumis, Cucurbita, Cynodon, Dactylis, Datura, Daucus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Eleusine, Festuca, Fragaria, Geranium, Glycine, Helianthus, Heterocallis, Hevea, Hordeum, Hyoscyamus, Ipomoea, Lactuca, Lens, Lilium, Linum, Lolium, Lotus, Lycopersicon, Majorana, Malus, Mangifera, Manihot, Medicago, Nemesia, Nicotiana, Onobrychis, Oryza, Panicum, Pelargonium, Pennisetum, Petunia, Pisum, Phaseolus, Phleum, Poa, Prunus, Ranunculus, Raphanus, Ribes, Ricinus, Rubus, Saccharum, Salpiglossis, Secale, Senecio, Setaria, Sinapis, Solanum, Sorghum, Stenotaphrum, Theobroma, Trifolium, Trigonella, Triticum, Vicia, Vigna, Vitis, Zea y las Olyreae, las Pharoideae y muchas otras.

Dentro del ámbito de esta invención, las especies de plantas que no están incluidas en las cadenas de alimentos o piensos son preferidas específicamente para la producción de proteínas farmacéuticas y técnicas. Entre ellas, las especies de Nicotiana son las más preferidas, ya que estas especies son fáciles de transformar y cultivar con sistemas de vectores de expresión bien desarrollados (especialmente vectores víricos).

Los genes de interés, sus fragmentos (funcionales o no funcionales) y sus derivados artificiales que pueden ser expresados como el proceso celular de interés y aislados utilizando la presente invención incluyen, pero no se limitan a: enzimas modificadores del almidón (sintasa de almidón, enzima de fosforilación del almidón, enzima desrramificador del almidón, enzima ramificador del almidón, enzima ramificador del almidón II, sintasa del almidón unida a los gránulos), sintasa de fosfaro de sacarosa, fosforilasa de sacarosa, poligalactouronasa, polifructán sucrasa, ADP glucosa pirofosforilasa, ciclodextrin glucosiltransferasa, fructosil transferasa, sintasa de glucógeno, esterasa de pectina, aprotinina, avidina, levansucrasa bacteriana, proteína gIgA de E. coli, MAPK4 y ortólogos, enzima de asimilación/metabolismo del nitrógeno, sintasa de glutamina, osmotina vegetal, albúmina 2S, taumatina, recombinasa específica de sitio/integrasa (FLP, Cre, recombinasa R, Int, Integrasa R de SSVI, Integrasa phiC31, o un fragmento activo o variante de las mismas), isopentenil transferasa, Sca M5 (calmodulina de soja), toxina de tipo coleóptero o un fragmento insecticidamente activo, proteínas de fusión del enzima de conjugación de ubiquitina (E2), enzimas que metabolizan lípidos, aminoácidos, azúcares, ácidos nucleicos y polisacáridos, superóxido dismutasa, forma proenzimática inactiva de una proteasa, toxinas proteicas de plantas, rasgos que alteran la fibra en las plantas productoras de fibra, toxina activa frente a coleópteros de Bacillus thuringiensis (toxina Bt2, proteína cristalina insecticida (ICP), toxina CryIC, endotoxina delta, toxina polipeptídica, protoxina, etc.), toxina específica contra insectos AaIT, enzimas que degradan celulosa, celulasa E1 de Acidothermus celluloticus, enzimas modificadoras de lignina, cinamoil alcohol deshidrogenasa, sintasa de trehalosa-6-fosfato, enzimas de la ruta metabólica de citoquininas, HMG-CoA reductasa, pirofosfatasa inorgánica de E. coli, proteína de almacenamiento de las semillas, sintasa de licopeno de Erwinia herbicola, ACC oxidasa, proteína codificada por pTOM36, fitasa, cetohidrolasa, acetoacetil CoA reductasa, sintasa de PHB (polihidroxibutanoato), proteína transportadora de acilo, napina, EA9, sintasa de fitoeno de plantas no superiores, proteína codificada por pTOM5, ETR (receptor de etileno), piruvato fosfato diquinasa plastídica, proteína de los poros transmembranales inducible por nematodos, rasgo que incrementa la función fotosintética o plastídica de la célula vegetal, sintasa de estilbeno, un enzima capaz de hidroxilar fenoles, catecol dioxigenasa, catecol 2,3-dioxigenasa, cloromuconato cicloisomerasa, sintasa de antranilato, proteína AGL15 de Brassica, fructosa 1,6-bifosfatasa (FBPasa), RNA3 de AMV, replicasa de PVY, replicasa de PLRV, proteína de revestimiento de potivirus, proteína de revestimiento de CMV, proteína de revestimiento de TMV, replicasa de luteovirus, ARN mensajero de MDMV, replicasa geminivírica mutante, acil-ACP tioestererasa con preferencia por C12:0 de Umbellularia californica, acil-ACP tioesterasa de plantas con preferencia por C10 o C12:0, acil-ACP tioesterasa con preferencia por C14:0 (luxD), factor A de la sintasa vegetal, factor B de la sintasa vegetal, D6-desaturasa, proteína con actividad enzimática en la b-oxidación peroxisómica de los ácidos grasos en las células vegetales, acil-CoA oxidasa, 3-cetoacil-CoA tiolasa, lipasa, acetil-CoA carboxilasa del maíz, sintasa de 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato (EPSP), fosfinotricin acetil transferasa (BAR, PAT), proteína CP4, ACC desaminasa, proteína con un sitio de corte post-traduccional, gen DHPS que confiere resistencia a sulfonamidas, nitrilasa bacteriana, 2,4-D-monooxigenasa, sintasa de acetolactato o sintasa de acetohidroxiácido (ALS, AHAS), poligalactouronasa, polimerasa Taq, nitrilasa bacteriana, muchos otros enzimas de bacterias o fagos incluyendo endonucleasas de restricción, metilasas, ADN y ARN ligasas, ADN y ARN polimerasas, transcriptasas inversas, nucleasas (ADNasas y ARNasas), fosfatasas, transferasas, etc.

Nuestra invención puede ser utilizada también con el fin de producción y purificación molecular de proteínas comercialmente valiosas y farmacéuticamente importantes, incluyendo enzimas industriales (celulasas, lipasas, proteasas, fitasas, etc.) y proteínas fibrosas (colágeno, proteína de la seda de araña, etc.). Cualquier proteína para la salud humana o animal puede ser expresada y purificada utilizando los métodos descritos en nuestro abordaje de la invención. Ejemplos de tales proteínas de interés incluyen, inter alia, proteínas de la respuesta inmune (anticuerpos monoclonales, anticuerpos de una sola cadena, receptores de células T, etc.), antígenos incluyendo los derivados de microorganismos patógenos, factores estimulantes de colonias, relaxinas, hormonas polipeptídicas incluyendo somatotropina (HGH) y proinsulina, citoquinas y sus receptores, interferones, factores de crecimiento y factores de coagulación, enzima lisosómico enzimáticamente activo, polipéptidos fibrinolíticos, factores de coagulación de la sangre, tripsinógeno, a1-antitripsina (AAT), seroalbúmina humana, glucocerebrosidasas, toxina B colérica nativa, así como proteínas conservadoras de la función como fusiones, versiones mutantes y derivados sintéticos de las proteínas anteriores.

DE 102 54 166 y DE 102 54 165 y las solicitudes de patente PCT derivadas de las mismas, publicadas como WO2004/046360 y WO2004/046361, respectivamente, contienen ejemplos y descripciones adicionales que están relacionados con la presente invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Ayuste en trans mediado por inteína de GUS tras la expresión transitoria en células vegetales mediada por Agrobacterium

El extremo 5' del gen GUS fue amplificado por PCR utilizando los cebadores gusint5 (atg gaa gca gta ctc gac gtc gcc taa aga gag gtt a) y guspr3 (ggc ctg tgg gca ttc agt ctg) a partir del plásmido pICBV33 (35S-líder de omega-secuencia codificadora de gus-terminador de nos en el vector binario pICBV2 de Icon Genetics (Fig. 9)). El extremo 3' del gen GUS fue amplificado por PCR utilizando los cebadores gusint6 (gtc gag tac tgc ttc cat ggc aaa gaa ctg tac agc g) y nosterrev (tca tcg caa gac cgg caa cag g) a partir del plásmido pICBV33 (Fig. 9). Estos fragmentos fueron combinados y se llevó a cabo una segunda amplificación por PCR utilizando los cebadores guspr3 y nosterrev. El producto de esta PCR fue digerido con BspHI y XbaI y clonado en pICBV33 teniendo como resultado el plásmido pICH8983 (Anexo 2). En este plásmido, los aminoácidos nativos Ile370 - Pro376 fueron sustituidos por la secuencia Asp-Val-Glu-Tyr-Cys-Phe-His-Gly derivada de DnaE de Synechocystis, se introdujeron uniones exteína-inteína y sitios de AatII y NcoI al principio y al final de esta modificación, respectivamente.

Un fragmento de ADN que contenía el extremo N-terminal de la inteína DnaE de Synechocystis fue amplificado por PCR a partir de ADN genómico (Cepa PCC6803 del American Type Culture Center) utilizando los cebadores intNpr1 (gc aagctt gacgtc aag ttt gcg gaa tat tgc ctc agt) e intNpr2 (tcc ctgcag tta ttt aat tgt ccc agc gtc aag). El producto de la PCR fue clonado como un fragmento HindIII-PstI en pUC19, teniendo como resultado el plásmido pICH8901. La parte C-terminal de la inteína fue amplificada utilizando los cebadores intCpr1 (gg tctaga atcgat g gtt aaa gtt atc ggt cgt cg) e intCpr2 (cg ctgcag ccatgg tt aaa aca att ggc ggc gat cgc) y fue clonada como un fragmento PstI-XbaI en pUC19 (pICH8912, ver la Fig. 11).

La fusión de la N-inteína a la parte 5' del gen GUS fue realizada mediante el clonaje del fragmento AatII-XbaI de pICH8901 en pICH8983 (Fig. 10) dando el plásmido pICH9303 (Fig. 5). La C-inteína fue fusionada a la parte 3' de GUS como un fragmento ClaI-NcoI, teniendo como resultado el plásmido pICH9311 (Fig. 5). Ambas construcciones fueron coexpresadas de manera transitoria en hojas de Nicotiana benthamiana utilizando expresión transitoria mediada por Agrobacterium (Vaquero y col., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 11128-11133). La expresión de gus fue detectada mediante tinción de las hojas con una solución que contenía el sustrato cromogénico X-gluc (5-bromo-4-cloro-3-indolil glucurónido) (Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep., 5, 387-405). El color azul indicaba que la actividad GUS era visible únicamente cuando se coexpresaban ambas construcciones, pero no cuando las construcciones se expresaban individualmente.

Ejemplo 2 Agro-administración de la proteína de fusión inteínaC-GUS3'

La división del gen GUS y la fusión con la inteína DnaE dividida de Synechocystis se llevaron a cabo según se describió anteriormente. Se introdujo un sitio de XhoI precediendo al codón de parada en la fusión inteínaC-GUS3' en pICH9723 (Anexo 3). Se sintetizó el ADN que codificaba los 37 aminoácidos C-terminales de la proteína virF de Agrobacterium tumefaciens utilizando los dos oligos solapantes virFpr3 (gct ctc gag gtt atg gca gaa gtt cgg ccc ata gcc cga tcc att aaa acg gct cac gac gat gcg cga gcg ga) y virFpr4 (cac gga tcc tca tag acc gcg cgt tga tcg agg tct gtc cgc cga cat taa ttc cgc tcg cgc atc gtc gtg ag). El fragmento fue digerido con XhoI-BamHI y ligado en marco a la fusión inteínaC-GUS3', teniendo como resultado el plásmido pICH10181.

El fragmento HindIII (romo)-XbaI de pICH10181 (Fig. 6) (prom de 35S inteínaC-GUS3'-virF) fue clonado en XhoI (romo)-XbaI de pICBV12 (Fig. 9), teniendo como resultado el plásmido pICH10655 (Fig. 6), un vector binario pequeño que no contiene ninguna secuencia de ADN-T. Lo mismo se realizó para la inteínaC-GUS3' sin secuencias de virF como control negativo (pICH10666, ver la Fig. 6).

Los pICH10655 (Fig. 6) y pICH10666 fueron transformados mediante electroporación en la cepa de Agrobacterium GV3101. Ambas construcciones fueron agroinfiltradas en hojas de Nicotiana benthamiana (Vaquero y col., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 11128-11133) junto con pICH9303 (prom de 35S GUS5'-inteínaN terminador de nos entre los límites del ADN-T, ver la Fig. 6). Por tanto, el resto GUS5'-inteínaN es suministrado como ADN y es expresado en la célula vegetal y el resto inteínaC-GUS3'-virF es suministrado como proteína. El ayuste de la proteína mediado por inteína tiene lugar en la célula vegetal y reconstituye un enzima GUS funcional. La expresión de GUS fue detectada mediante tinción de las hojas con una solución que contenía el sustrato cromogénico X-gluc (5-bromo-4-cloro-3-indolil glucurónido) (Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep., 5, 387-405). El color azul indicaba que la actividad GUS era visible únicamente cuando ambas construcciones 5'- y 3'-GUS eran coinfiltradas, pero no cuando las construcciones eran expresadas individualmente o cuando se utilizó la construcción control negativo (pICH10666).

Ejemplo 3 Utilización de recombinación de ADN específica de sitio para ensamblar el vector de amplificación a partir de partes de provectores integradas de manera estable en el genoma de la planta: expresión de GFP

El vector binario pICHFPinv (Fig. 7) portador de ADN-T con dos partes de provectores fue diseñado utilizando técnicas estándar de biología molecular (Maniatis y col., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York). La descripción de elementos provectores y los principios básicos de su construcción y funcionamiento están descritos con detalle en las solicitudes de patente PCT/EP02/03476 (WO0288369) y en DE 101 21 283. El vector lleva un marcador de la transformación (gen NPTII), el extremo 5' de TMV precedido por el promotor vegetal del gen de la actina 2 de Arabidopsis (An y col., 1996, Plant J., 10, 107-121) y contiene una ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp) y una proteína de movimiento (MP) seguida por un promotor subgenómico. El vector contiene también el extremo 3' del provector que contiene un gen de interés (GFP), la proteína de revestimiento (CP) vírica que proporciona el movimiento sistémico y la región 3' no traducida del vector vírico (3'NTR). El provector 3' junto con dos señales de terminación de la transcripción está flanqueado por sitios de recombinación reconocidos por la integrasa del fago phiC31 (Thomason, Calendar y Ow, 2001, Mol. Genet. Genomics, 265, 1031-1038).

La integrasa phiC31 fue dividida en dos partes en la posición de la primera cisteína y fusionada a partes de la inteína DnaE. Un sitio de inserción de la inteína que introducía dos sitios de BsaI con diferentes salientes fue clonado en la integrasa de una construcción original (Thomason, Calendar y Ow, 2001, Mol. Genet. Genomics, 265, 1031-1038) por PCR precediendo inmediatamente al codón para la Cys-405. Los sitios de BsaI correspondientes fueron también introducidos en la inteína-N DnaE (Fig. 10) y en la inteína-C (Fig. 11). La inteína-N fue fusionada a la integrasa-N como un fragmento BsaI-BamHI (pICH15085, Fig. 12) y la inteína-C fue fusionada a la integrasa-C como un fragmento SmaI-BsaI en PstI (hecho romo con polimerasa de T4)-BsaI (pICH15099, Fig. 12).

El operón virE completo de A. tumefaciens cepa GV3101 (Nº de Acceso del Gene Bank 003065) fue amplificado por PCR y clonado como un fragmento XhoI-XbaI en pICBV39 (Fig. 9), un vector binario sin secuencias limítrofes, impidiendo así la transferencia de ADN (construcción pICH15530). Se introdujeron sitios de restricción para el clonaje de la integrasa dividida al mismo tiempo en el inicio (NcoI) y cerca del extremo (BsrGI) de virE2. Se introdujeron también mediante PCR los sitios de restricción correspondientes en ambas partes de las construcciones integrasa dividida-inteína. Las partes de la integrasa dividida fueron clonadas en este vector dando lugar a una fusión con los 47 aminoácidos C-terminales de la proteína virE2 que son necesarios para la transferencia de la proteína.

La secuencia de la región de ADN-T de otro vector, pICH10921 (Fig. 13), utilizada en los experimentos, está mostrada en el ANEXO 1 como SEC ID Nº:1.

Se obtuvieron plantas transgénicas de Nicotiana benthamiana y N. tabacum que contenían el ADN-T de pICHGFPinv, pICH10921 y pICH15085-INT mediante transformación mediada por Agrobacterium de discos de hoja, según está descrito por Horsch y col. (1985, Science, 227, 129-131). Discos de hoja fueron incubados durante 30 minutos con la cepa de Agrobacterium GV3101 transformada con la construcción pICH1754. Después de tres días de incubación en medio (medio MS, 0,1 mg/l de NAA, 1 mg/l de BAP) sin agente selectivo, se llevó a cabo la selección de los transformantes en el mismo medio MS suplementado con 100 mg/l de kanamicina. Con el fin de reducir el crecimiento de Agrobacterium, el medio fue suplementado también con 300 mg/l de carbenicilina y 300 mg/l de cefataxima. Los regenerantes fueron incubados en medio MS selectivo sin hormonas suplementado con la misma concentración de los agentes selectivos con el fin de inducir la producción de raíces. La presencia del transgén en las poblaciones T2 segregantes fue confirmada mediante análisis por PCR.

La exposición de las hojas de las plantas transgénicas a integrasa permeable a las células produce la recombinación específica de sitio entre los sitios de attP y attB. Tal recombinación conduce a la reversión del provector 3', creando así un ADNc completo de un amplicón vírico bajo el control del promotor de la actina 2 (Fig. 7, B). El amplicón de ARN basado en TMV que expresa GFP es capaz de movimiento célula a célula y de movimiento sistémico. Las hojas de la progenie híbrida entre plantas transgénicas transformadas con pICH10921 y pICH15099 fueron infiltradas con agrobacterias portadoras de la construcción pICH15085-INT. La expresión de GFP en plantas de N. benthamiana puede ser detectada fácilmente utilizando una lámpara UV o analizando el tejido de la planta bajo un sistema de microcopio fluorescente estéreo de LEICA (excitación a 450-490 nm, emisión a 500-550 nm). La GFPs utilizada en nuestros experimentos puede ser excitada por luz azul y por luz UV.

ANEXO 1: SEC ID Nº 1: Secuencia de ADN de la región del ADN-T del vector pICH10921.

1

2

3

Claims

1. Un método para controlar una planta o células vegetales modificadas genéticamente, comprendiendo dicho método las etapas siguientes:

(a): la provisión de una planta modificada genéticamente o de células vegetales modificadas genéticamente, conteniendo dicha planta o dichas células vegetales un ácido nucleico heterólogo que codifica un primer polipéptido que contiene o que consta de un primer fragmento de una proteína,

(b): la introducción de un segundo polipéptido en las células de dicha planta modificada genéticamente o en dichas células vegetales modificadas genéticamente de tal manera que no se introduzcan ácidos nucleicos que codifiquen dicho segundo polipéptido o una parte funcional del mismo, conteniendo dicho segundo polipéptido

(i): un segundo fragmento de dicha proteína y

(ii): una secuencia peptídica que permita la introducción de dicho segundo polipéptido en las células de dicha planta modificada genéticamente o en las células vegetales modificadas genéticamente,

por lo que dicho primer fragmento y dicho segundo fragmento generan conjuntamente una función predeterminada de dicha proteína únicamente cuando están presentes conjuntamente y

por lo que las células de dicha planta contienen un ácido nucleico heterólogo adicional que está controlado por dicha función predeterminada.

2. El método de la reivindicación 1, en el que una parte de dicho segundo polipéptido es funcional si es capaz de generar dicha función predeterminada conjuntamente con dicho primer polipéptido.

3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha función predeterminada controla un proceso celular de interés.

4. El método de la reivindicación 1, en el que dicha función predeterminada da lugar a la formación de un ARN y/o un producto de expresión proteico a partir de dicho ácido nucleico heterólogo adicional.

5. El método de la reivindicación 1, en el que dicha función predeterminada da lugar a la formación de un operón expresable a partir de dicho ácido nucleico heterólogo adicional o a partir de un producto de expresión del mismo.

6. El método de la reivindicación 1, en el que dicha función predeterminada da lugar a la formación de un amplicón expresable a partir de dicho ácido nucleico heterólogo adicional o a partir de un producto de expresión del mismo.

7. El método de la reivindicación 1 ó 6, en el que dicha función predeterminada de dicha proteína da lugar a la formación de un amplicón de ADN o de ARN a partir de dicho ácido nucleico heterólogo adicional, donde dicho amplicón tiene una o más de las capacidades siguientes: replicación, expresión de proteínas, movimiento célula a célula, movimiento sistémico, ensamblaje de partículas infectivas, infectividad, supresión de la capacidad de silenciación de genes vegetales, modificación de la condición fisiológica de la planta.

8. El proceso de una de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho ácido nucleico heterólogo adicional está integrado de manera estable en el genoma nuclear o plastídico de dicha planta o de dichas células vegetales.

9. El método de una de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la generación de dicha función predeterminada de dicha proteína incluye la interacción no covalente de dicho primer y dicho segundo fragmento.

10. El método de la reivindicación 9, en el que dicha interacción no covalente está facilitada por polipéptidos con afinidad específica entre sí.

11. El método de la reivindicación 9, en el que dicha interacción no covalente está facilitada por polipéptidos con cremallera de leucina fusionados a dicho primer y a dicho segundo fragmento.

12. El método de la reivindicación 9, en el que dicha interacción no covalente está facilitada por polipéptidos dimerizantes fusionados a dicho primer y a dicho segundo fragmento y está regulada por moléculas dimerizantes tales como rapamicina o análogos de rapamicina.

13. El método de una de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la generación de dicha función predeterminada de dicha proteína incluye la formación de enlaces covalentes entre dicho primer y dicho segundo fragmento.

14. El método de la reivindicación 13, en el que dicha formación de enlaces covalentes incluye la unión o el ayuste en trans basados en inteína entre dicho primer y dicho segundo fragmento.

15. El método de una de las reivindicaciones 1 a 14, en el que dicha secuencia peptídica del punto (b, ii) es o contiene una secuencia de translocación membranal para facilitar la introducción de dicho segundo polipéptido en dichas células vegetales o en células de dicha planta modificada genéticamente.

16. El método de una de las reivindicaciones 1 a 14, en el que dicha introducción de dicho segundo polipéptido es realizada utilizando un microorganismo patógeno que tenga un sistema para la administración de un polipéptido a una célula huésped.

17. El método de la reivindicación 16, en el que dicho microorganismo patógeno es un Agrobacterium virulento o no virulento.

18. El método de la reivindicación 16, en el que dicho microorganismo patógeno es fitopatógeno y es una bacteria virulenta o no virulenta dotada con un sistema de secreción de tipo III.

19. El método de la reivindicación 18, en el que dicho microorganismo fitopatógeno es una bacteria virulenta o no virulenta de uno de los géneros siguientes: Bordetella, Erwinia, Pseudomonas, Xanthomonas, Yersinia,

20. El método de una de las reivindicaciones 1 a 19, en el que dicho segundo polipéptido contiene uno o más péptidos de tránsito o señal para transferir dicho segundo polipéptido a orgánulos de la célula seleccionados del grupo siguiente: núcleo, plástidos, mitocondrias, sistema de Golgi, vacuolas.

21. El método de una de las reivindicaciones 1 a 20, en el que dicha función predeterminada de dicha proteína es seleccionada del grupo siguiente: replicación de ADN, recombinación de ADN, transcripción, recombinación de ARN, amplificación, traducción.

22. El método de una de las reivindicaciones 1 a 21, en el que dicha proteína es capaz de moverse célula a célula o de movimiento sistémico en dicha planta o en una parte de dicha planta.

23. El método de la reivindicación 22, en el que dicha proteína contiene un dominio de una proteína de movimiento vírica, un dominio de una proteína de revestimiento vírica o un dominio de un factor de transcripción vegetal o animal capaz de movimiento célula a célula o sistémico.

24. El método de la reivindicación 23, en el que dicho dominio capaz de movimiento célula a célula o sistémico es un polipéptido diseñado artificialmente.

25. El método de una de las reivindicaciones 1 a 24, en el que dicha planta proporcionada en la etapa (a) es una planta transgénica que contiene dicho ácido nucleico heterólogo integrado de manera estable en el genoma nuclear de las células.

26. El método de una de las reivindicaciones 1 a 24, en el que dicha planta proporcionada en la etapa (a) es una planta transgénica que contiene dicho ácido nucleico heterólogo integrado de manera estable en el genoma plastídico de las células.

27. El método de una de las reivindicaciones 1 a 24, en el que las células de dicha planta proporcionada en la etapa (a) son transformadas de manera transitoria con dicho ácido nucleico heterólogo.

28. Una planta o células vegetales modificadas genéticamente que contienen un ácido nucleico heterólogo que codifica un primer polipéptido que contiene o que consta de un primer fragmento de una proteína, donde dicha planta o dichas células vegetales modificadas genéticamente contiene(n) un segundo polipéptido que contiene (i) un segundo fragmento de dicha proteína y (ii) una secuencia peptídica que facilita la introducción de dicho segundo polipéptido en las células de dicha planta modificada genéticamente o en las células vegetales modificadas genéticamente;

por lo que dicho primer fragmento y dicho segundo fragmento generan conjuntamente una función predeterminada de dicha proteína únicamente cuando dicho primer y dicho segundo fragmento están presentes conjuntamente;

no teniendo dicha planta o dichas células vegetales ácidos nucleicos que codifiquen dicho segundo polipéptido o una parte funcional del mismo; y

donde dicha planta o dichas células vegetales modificadas genéticamente contiene(n) además un ácido nucleico heterólogo adicional que está controlado por dicha función predeterminada.

29. Un sistema para controlar una planta o células vegetales modificadas genéticamente, que comprende

(i): una planta o células vegetales modificadas genéticamente que contienen un ácido nucleico heterólogo que codifica un primer polipéptido que contiene o que consta de un primer fragmento de una proteína, conteniendo además dicha planta o dichas células vegetales modificadas genéticamente un ácido nucleico heterólogo adicional, y

(ii): una composición que contiene un segundo polipéptido que contiene un segundo fragmento de dicha proteína y una secuencia peptídica que permite la introducción de dicho segundo polipéptido en las células de dicha planta modificada genéticamente o en las células vegetales modificadas genéticamente, no conteniendo dicha composición ácidos nucleicos que codifiquen dicho segundo polipéptido o una parte funcional del mismo;

por lo que dicha planta o dichas células vegetales modificadas genéticamente y dicho segundo polipéptido están diseñados de tal manera que dicho primer fragmento y dicho segundo fragmento son capaces de generar conjuntamente una función predeterminada de dicha proteína tras la inserción de dicho segundo polipéptido en dicha planta o en dichas células vegetales; donde dicho ácido nucleico heterólogo adicional está controlado por dicha función predeterminada.

30. Un sistema para controlar una planta o células vegetales modificadas genéticamente, que comprende

(ii): un Agrobacterium patógeno que codifica en los ácidos nucleicos del mismo un segundo polipéptido que contiene un segundo fragmento de dicha proteína y una secuencia peptídica que permite la introducción de dicho segundo polipéptido en las células de dicha planta modificada genéticamente o en las células vegetales modificadas genéticamente, por lo que dicho segundo polipéptido no está codificado en el ADN-T de un plásmido Ti del Agrobacterium;