ES2336097T3 - Metodo para controlar una planta o celulas vegetales modificadas geneticamente. - Google Patents
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Abstract
Un método para controlar una planta o células vegetales modificadas genéticamente, comprendiendo dicho método las etapas siguientes: (a) la provisión de una planta modificada genéticamente o de células vegetales modificadas genéticamente, conteniendo dicha planta o dichas células vegetales un ácido nucleico heterólogo que codifica un primer polipéptido que contiene o que consta de un primer fragmento de una proteína, (b) la introducción de un segundo polipéptido en las células de dicha planta modificada genéticamente o en dichas células vegetales modificadas genéticamente de tal manera que no se introduzcan ácidos nucleicos que codifiquen dicho segundo polipéptido o una parte funcional del mismo, conteniendo dicho segundo polipéptido (i) un segundo fragmento de dicha proteína y (ii) una secuencia peptídica que permita la introducción de dicho segundo polipéptido en las células de dicha planta modificada genéticamente o en las células vegetales modificadas genéticamente, por lo que dicho primer fragmento y dicho segundo fragmento generan conjuntamente una función predeterminada de dicha proteína únicamente cuando están presentes conjuntamente y por lo que las células de dicha planta contienen un ácido nucleico heterólogo adicional que está controlado por dicha función predeterminada.
Description
Método para controlar una planta o células
vegetales modificadas geneticamente.
La presente invención se refiere a un método
para controlar una planta o células vegetales modificadas
genéticamente, en particular a un método para controlar un proceso
celular de interés en una planta o en células vegetales modificadas
genéticamente. El método de la invención tiene una seguridad
biológica excepcional. La invención se refiere además a una planta
modificada genéticamente adaptada para dicho método y a una planta
modificada genéticamente que ha sido controlada de acuerdo con el
método de la invención. Además, la presente invención se refiere a
un método para producir un producto en una planta modificada
genéticamente mediante el control de un proceso celular de interés.
El método de la invención permite el control selectivo de la
expresión de un transgén en una planta modificada genéticamente de
manera transitoria o de manera estable, mediante lo cual un proceso
celular de interés no operativo previamente en la planta puede ser
activado selectivamente a cualquier tiempo predeterminado.
Uno de los problemas principales de la
biotecnología vegetal es la consecución de un control fiable sobre
la expresión de transgenes. Un estrecho control de la expresión
génica en plantas es esencial si un producto corriente abajo de la
expresión del transgén es inhibidor del crecimiento o tóxico, como
por ejemplo plásticos biodegradables (Nawrath, Poirier y
Somerville, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci., 91,
12760-12764; John y Keller, 1996, Proc. Natl.
Acad. Sci., 93, 12768-12773; US6103956;
US5650555) o toxinas proteicas (US6140075). Las tecnologías
existentes para controlar la expresión génica en plantas están
basadas normalmente en promotores específicos de tejido e
inducibles y prácticamente todos ellos adolecen de una actividad de
expresión basal incluso cuando no son inducidos, esto es, hay
"fugas". Los promotores específicos de tejido (US05955361;
WO09828431) representan una herramienta poderosa pero su uso está
limitado a áreas de aplicaciones muy específicas, por ejemplo para
producir plantas estériles (WO09839462) o para expresar genes de
interés en semillas (WO00068388; US05608152). Los promotores
inducibles pueden ser divididos en dos categorías de acuerdo con sus
condiciones de inducción: aquéllos inducidos por factores abióticos
(temperatura, luz, sustancias químicas) y aquéllos que pueden ser
inducidos por factores bióticos, por ejemplo, por patógenos o por el
ataque de una plaga. Ejemplos de la primera categoría son los
promotores inducibles por calor (US05187287) y los inducibles por
frío (US05847102), un sistema inducible por cobre (Mett y col.,
1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90,
4567-4571), sistemas inducibles por esteroides
(Aoyama y Chua, 1997, Plant J., 11,
605-612; McNellis y col., 1998, Plant J.,
14, 247-257; US06063985), un sistema
inducible por etanol (Caddick y col., 1997, Nature Biotech.,
16, 177-180; WO09321334) y un sistema
inducible por tetraciclina (Weinmann y col., 1994, Plant J.,
5, 559-569). Uno de los últimos desarrollos
en el área de los sistemas inducibles químicamente para plantas es
un promotor quimérico que puede ser activado por el glucocorticoide
dexametasona y desactivado por tetraciclina (Bohner y col., 1999,
Plant J., 19, 87-95). Para una
revisión de sistemas inducibles químicamente ver: Zuo y Chua (2000,
Current Opin. Biotechnol., 11,
146-151). Otros ejemplos de promotores inducibles
son promotores que controlan la expresión de genes relacionados con
la patogénesis (PR) en plantas. Estos promotores pueden ser
inducidos por el tratamiento de la planta con ácido salicílico, un
componente importante de las rutas de generación de señales en
plantas en respuesta al ataque de un patógeno, u otros compuestos
químicos (benzo-1,2,3-tiadiazol o
ácido isonicotínico) que son capaces de desencadenar la expresión
de genes PR (US05942662).
Existen informes de sistemas de expresión de
transgenes controlables utilizando ARN/ARN polimerasa vírica
proporcionada por una infección vírica (ver, por ejemplo, US6093554;
US5919705). En estos sistemas, una secuencia de ADN recombinante de
la planta incluye secuencias de nucleótidos del genoma vírico
reconocidas por ARN/ARN polimerasa vírica. La eficacia de estos
sistemas es limitada debido a la baja capacidad de las polimerasas
víricas para proporcionar funciones en trans y a su incapacidad para
controlar procesos distintos de la amplificación del ARN. Otra
forma es desencadenar un proceso de interés en un planta transgénica
mediante la utilización de un virus modificado genéticamente que
proporciona un ácido nucleico heterólogo que codifica un interruptor
proteico para un proceso bioquímico en una planta genéticamente
modificada (WO02068664, WO0071701 y WO0052146).
Los sistemas anteriormente descritos tienen un
interés significativo como oportunidades para obtener patrones
deseados de expresión transgénica, pero no permiten un estrecho
control de los patrones de expresión, ya que los agentes inductores
(cobre) o sus análogos (brassinoesteroides en el caso de sistemas
controlables por esteroides) pueden estar presentes en los tejidos
de la planta a niveles suficientes para producir una expresión
residual. Adicionalmente, la utilización de antibióticos y
esteroides como inductores químicos no es deseable o no es factible
económicamente para aplicaciones a gran escala. Cuando se utilizan
promotores de genes PR o ARN/ARN polimerasas víricas como medio de
control de los transgenes, no se cumplen tampoco los requisitos de
un estrecho control sobre la expresión del transgén, ya que una
infección patógena casual o un estrés fortuito pueden producir la
expresión. Los promotores específicos de tejido o de órgano están
limitados a áreas de aplicación muy estrechas, ya que confinan la
expresión a un órgano específico o a una etapa específica del
desarrollo de la planta, pero no permiten que el transgén sea
activado a voluntad. Los interruptores víricos recombinantes, según
se describe en WO02/068664 abordan todos estos problemas, pero no
garantizan los estrictos requisitos de seguridad medioambiental, ya
que el ácido nucleico heterólogo del vector vírico puede
recombinarse.
Existe una abundante literatura, incluyendo
solicitudes de patente, que describe el diseño de plantas
resistentes a virus por la expresión de genes víricos o de formas
mutadas de ARN vírico (por ejemplo, US5792926; US6040496). Sin
embargo, existe un riesgo medioambiental asociado con la utilización
de tales plantas debido a la posibilidad de que se formen nuevos
virus por la recombinación entre el virus de desafío y el ARN o el
ADN vírico transgénico (Adair y Kearney, 2000, Arch. Virol.,
145, 1867-1883).
Hooykaas y colaboradores (2000, Science,
290, 979-982; WO01/89283) describen la
utilización de una fusión traduccional de la recombinasa Cre con
fragmentos del gen vir para la translocación de la
recombinasa mediada por Agrobacterium en células vegetales.
Los acontecimientos de recombinación in planta mediados por
Cre tenían como resultado un fenotipo seleccionable. La
translocación de la recombinasa Cre es la primera utilización de
una proteína translocada como "interruptor" para desencadenar
un proceso de interés en células vegetales. Sin embargo, a pesar de
que la translocación no está acompañada necesariamente por la
transferencia de ADN, este procedimiento no garantiza un nivel de
seguridad elevado, ya que el microorganismo fitopatógeno modificado
genéticamente (Agrobacterium) posee una secuencia
codificadora completa del interruptor proteico recombinasa Cre.
Además, el proceso de interés puede ser desencadenado únicamente en
las células que reciban el interruptor proteico. Si van a tratarse
grandes conjuntos de células, la proporción de células que reciben
el interruptor proteico con respecto al número total de células
resulta muy pequeña. Por tanto, el método de Hooykaas no puede ser
aplicado a plantas completas. En su lugar, su utilidad está limitada
a células en cultivo de tejidos o cultivo de células. Además, como
este método está limitado a cultivos celulares (a escala de
laboratorio), no surgen los problemas de seguridad medioambiental
que aparecen en las aplicaciones a gran escala o de campos de
cultivo.
Es por tanto un objeto de la invención
proporcionar un método medioambientalmente seguro para activar un
proceso celular de interés en plantas, mediante el cual el proceso
celular puede ser activado selectivamente a cualquier tiempo
determinado. Es otro objeto de esta invención proporcionar un método
para activar un proceso celular de interés en plantas completas. Es
otro objeto de esta invención proporcionar un método para producir
un producto en una planta transgénica, en el que la producción del
producto puede ser activada selectivamente una vez que la planta
haya crecido hasta una etapa deseada, por lo que el proceso es
medioambientalmente seguro en cuanto a que el material genético
necesario para dicho proceso celular y el material genético que
codifica la función de control no se propagan juntos al medio
ambiente.
Los objetos anteriores se consiguen mediante un
método para controlar una planta o células vegetales modificadas
genéticamente, comprendiendo dicho método las etapas siguientes:
- (a)
- la provisión de una planta o células vegetales modificadas genéticamente, conteniendo dicha planta o dichas células vegetales un ácido nucleico heterólogo que codifica un primer polipéptido que contiene o que consta de un primer fragmento de una proteína,
- (b)
- la introducción de un segundo polipéptido en células de dicha planta modificada genéticamente o en dichas células vegetales modificadas genéticamente de tal manera que no se introduzcan ácidos nucleicos que codifiquen dicho segundo polipéptido o una parte funcional del mismo, conteniendo dicho segundo polipéptido
- (i)
- un segundo fragmento de dicha proteína y
- (ii)
- una secuencia peptídica que permite la introducción de dicho segundo polipéptido en células de dicha planta modificada genéticamente o en las células vegetales modificadas genéticamente,
mediante lo cual dicho primer fragmento y dicho
segundo fragmento generan conjuntamente una función predeterminada
de dicha proteína únicamente cuando están presentes juntos.
Preferiblemente, este método de lleva a cabo con plantas en vez de
con células vegetales.
La invención proporciona también una planta o
células vegetales modificadas genéticamente que contienen un ácido
nucleico heterólogo que codifica un primer polipéptido que contiene
o que consta de un primer fragmento de una proteína, donde dicha
planta o dichas células vegetales modificadas genéticamente y dicho
primer fragmento de una proteína están adaptados para generar una
función predeterminada de dicha proteína a partir de dicho primer
fragmento y un segundo fragmento de dicha proteína, donde dicho
segundo fragmento puede ser proporcionado a las células de dicha
planta modificada genéticamente o a dichas células vegetales
modificadas genéticamente mediante la introducción de un segundo
polipéptido que contenga o que conste de dicho segundo
fragmento.
Además, la invención proporciona un sistema para
controlar una planta o células vegetales modificadas genéticamente,
que comprende una planta o células vegetales modificadas
genéticamente según se definió anteriormente y un segundo
polipéptido según se definió anteriormente, donde dicha planta o
dichas células vegetales modificadas genéticamente y dicho segundo
polipéptido son diseñados de tal manera que dicho primer fragmento y
dicho segundo fragmento son capaces de generar conjuntamente una
función predeterminada de dicha proteína.
\newpage
La presente invención proporciona un método para
controlar una planta modificada genéticamente o células de la
misma, que es eficaz en plantas completas y que al mismo tiempo es
medioambientalmente seguro incluso cuando es utilizado a gran
escala como en un invernadero o en un campo de cultivo. La presente
invención permite controlar una planta modificada genéticamente o
células de la misma mediante la introducción de un segundo
polipéptido en células que contienen un ácido nucleico heterólogo
que codifica un primer polipéptido que contiene o que consta de un
primer fragmento de una proteína. Dicho segundo polipéptido contiene
un segundo fragmento de dicha proteína, por lo que dicho primer
fragmento y dicho segundo fragmento generan conjuntamente una
función predeterminada de dicha proteína solamente cuando están
presentes juntos. Dicha función predeterminada de dicha proteína
puede ser cualquier función de la proteína. Preferiblemente, dicha
función es una actividad enzimática. Dicha función predeterminada
se produce únicamente si dicho primer polipéptido y dicho segundo
polipéptido están presentes juntos en la planta, preferiblemente en
al menos una célula de dicha planta. Dicha función predeterminada
de dicha proteína no se genera si dicho segundo polipéptido es
introducido en una planta o en células vegetales que no contengan
dicho ácido nucleico heterólogo que codifica dicho primer
polipéptido. Además, dicha función predeterminada de dicha proteína
no se genera en plantas que contienen dicho ácido nucleico
heterólogo que codifica dicho primer polipéptido a no ser que dicho
segundo polipéptido sea introducido en células de dicha planta.
En la etapa (a) del método de la invención, se
proporciona una planta modificada genéticamente o células vegetales
modificadas genéticamente. Se prefieren las plantas. Las más
preferidas son las plantas superiores, en particular plantas
superiores de cultivo. Dicha planta está modificada genéticamente en
cuanto a que células de dicha planta contienen un ácido nucleico
heterólogo que está implicado en el control de dicha planta
modificada genéticamente. Dicha planta proporcionada en la etapa
(a) puede ser una planta transgénica, por lo que la mayoría o todas
las células de dicha planta contienen dicho ácido nucleico
heterólogo integrado de manera estable en el genoma de dichas
células. Dicho ácido nucleico heterólogo puede estar integrado de
manera estable en el genoma nuclear o en el genoma de orgánulos
tales como mitocondrias o, preferiblemente, plástidos. La
integración de dicho ácido nucleico heterólogo en el genoma
plastídico es ventajosa en términos de seguridad biológica. El
método de la invención se lleva a cabo preferiblemente con plantas
transgénicas. Alternativamente, sin embargo, dicha planta puede
estar modificada de manera transitoria y/o dicho ácido nucleico
heterólogo puede estar presente en una fracción de células pero no
en otras células. Un ácido nucleico heterólogo en una planta
modificada de manera transitoria puede estar integrado de manera
estable en el genoma de dicha fracción de células o bien puede
estar presente episómicamente. La incorporación de dicho ácido
nucleico heterólogo en una fracción de células de dicha planta
puede ser conseguida transfectando de manera transitoria dicho
organismo, por ejemplo utilizando transfección vírica o
transformación mediada por
Agrobacterium.
Agrobacterium.
Dicho ácido nucleico heterólogo codifica dicho
primer polipéptido de la invención. Dicho primer polipéptido
contiene o consta de un primer fragmento de una proteína. Dicho
primer polipéptido tiene que ser expresable a partir de dicho ácido
nucleico heterólogo. Para este fin, dicho ácido nucleico heterólogo
debe tener un promotor para expresar dicho primer polipéptido y
otros elementos de control necesarios para la expresión. Dicho
promotor puede ser inducible, específico de tejido o bien un
promotor constitutivo. Si es un promotor constitutivo, dicha
función predeterminada puede ser generada después de la realización
de la etapa (b). Si el promotor es inducible, puede necesitarse una
señal adicional además de dicho segundo polipéptido para generar
dicha función predeterminada. Además, puede hacerse que la expresión
de dicho primer polipéptido sea dependiente de más elementos, por
lo que la seguridad medioambiental del método de la invención puede
ser incrementada adicionalmente.
En la etapa (b) del método de la invención,
dicho segundo polipéptido es introducido en las células de dicha
planta modificada genéticamente o en las células vegetales
modificadas genéticamente. Preferiblemente, es introducido en
células de dicha planta que contienen dicho ácido nucleico
heterólogo. Si dicha planta es transgénica, dicho segundo
polipéptido puede ser aplicado en principio a cualquier parte o a
cualquier célula de la planta. Sin embargo, se prefiere la
aplicación a las hojas. Si solamente una fracción de las células de
dicha planta contiene dicho ácido nucleico heterólogo, dicho
segundo polipéptido es aplicado a la planta de tal manera que dicho
segundo polipéptido pueda llegar a las células que contienen dicho
ácido nucleico heterólogo.
Dicho segundo polipéptido contiene (i) un
segundo fragmento de dicha proteína. Además, dicho segundo
polipéptido contiene (ii) una secuencia peptídica que permite la
introducción de dicho segundo polipéptido en células de dicha
planta modificada genéticamente o en las células vegetales
modificadas genéticamente. Las secuencias peptídicas de los puntos
(i) y (ii) pueden solaparse.
Dicho segundo polipéptido es introducido muy
preferiblemente de tal manera que no se introduzcan ácidos nucleicos
que codifiquen dicho segundo polipéptido o partes funcionales del
mismo en las células de dicha planta modificada genéticamente en la
etapa (b). Una parte de dicho segundo polipéptido es funcional si es
capaz de generar dicha función predeterminada conjuntamente con
dicho primer polipéptido. Dicho segundo polipéptido puede ser
aplicado directamente a las células de dicha planta. Aplicación
directa significa la aplicación de dicho segundo polipéptido de tal
manera que ningún ácido nucleico que codifique dicho segundo
polipéptido o partes funcionales del mismo esté contenido en la
composición utilizada en la etapa (b) para aplicar dicho segundo
polipéptido.
La introducción directa de dicho segundo
polipéptido puede ser realizada mediante (i) bombardeo de partículas
(microproyectiles), (ii) la aplicación de dicho polipéptido en al
menos una parte de dicha planta o (iii) mediante inyección de una
solución que contenga dicho polipéptido en un tejido de dicha
planta. En los métodos (ii) y (iii), dicho polipéptido está
contenido típicamente en una composición líquida (o solución),
preferiblemente acuosa, que es aplicada a partes de la planta. Tal
composición puede ser aplicada, por ejemplo, pulverizando dicha
planta con dicha composición que contiene el polipéptido. Además,
dicha composición puede ser inyectada de acuerdo con (iii).
Para los métodos (ii) y (iii), dicho segundo
polipéptido contiene preferiblemente una secuencia de translocación
membranal (MTS) como secuencia peptídica que permite la introducción
de dicho segundo polipéptido en células de dicha planta modificada
genéticamente o en las células vegetales modificadas genéticamente.
Dicha secuencia de translocación membranal puede estar unida
covalentemente o no covalentemente a dicho segundo polipéptido.
Preferiblemente, está unida covalentemente a dicho polipéptido.
Dicha secuencia de translocación membranal puede ser un péptido que
proporcione a dicho segundo polipéptido la capacidad de atravesar la
membrana plasmática de células de dicha planta. En la técnica se
conocen muchas de tales secuencias de translocación membranal. Con
frecuencia, contienen varios aminoácidos básicos, particularmente
argininas. El tamaño de las secuencias de translocación membranal
puede variar enormemente, sin embargo, pueden tener típicamente de 3
a 100 aminoácidos, preferiblemente de 5 a 60 aminoácidos. Dicho
segundo polipéptido puede ser producido mediante técnicas estándar
de expresión de proteínas en, por ejemplo, E. coli.
Preferiblemente, se realiza la purificación de dicho segundo
polipéptido después de su expresión, en particular la eliminación o
la destrucción de los ácidos nucleicos que codifican dicho
polipéptido. Los ácidos nucleicos pueden ser eliminados o destruidos
mediante hidrólisis, catalizada preferiblemente por un enzima como
una desoxirribonucleasa (DNasa) o una ribonucleasa (RNasa). Además,
o adicionalmente, pueden emplearse técnicas cromatográficas para
eliminar ácidos nucleicos de dicho segundo polipéptido. Dicho
segundo polipéptido puede ser aplicado a la planta mediante, por
ejemplo, la pulverización de dicha planta con una composición
líquida, preferiblemente una solución acuosa, que contenga dicho
segundo polipéptido. Preferiblemente, se toman medidas para
facilitar la entrada de dicho segundo polipéptido a las células de
la planta, en particular medidas que permitan atravesar la pared de
las células vegetales y/o la capa externa de la planta. Un ejemplo
de tales medidas es la producción de ligeras heridas en partes de la
superficie de la planta mediante, por ejemplo, excoriación
mecánica. Otro ejemplo es la utilización de enzimas que degraden
celulosa para debilitar o perforar la pared de las células
vegetales.
vegetales.
Una técnica más que puede ser utilizada para
introducir dicho segundo polipéptido en las células durante la
etapa (b), utiliza un microorganismo patógeno que tenga un sistema
secretor capaz de suministrar un polipéptido a una célula huésped.
Igual que en dichos métodos directos, dicho segundo polipéptido es
introducido de tal manera que no se introduzcan ácidos nucleicos
que codifiquen dicho segundo polipéptido o una parte funcional del
mismo. Dicho segundo polipéptido puede estar codificado de manera
expresable en los ácidos nucleicos de dicho microorganismo
patógeno, de tal manera que dicho segundo polipéptido pueda ser
expresado en dicho microorganismo y ser suministrado a una célula
de dicha planta. Un ejemplo preferido de tal microorganismo patógeno
es un Agrobacterium virulento o no virulento, en el cual
dicho segundo polipéptido no está codificado en el
ADN-T de un plásmido Ti, preferiblemente dicho
segundo polipéptido no está codificado en un plásmido Ti del
Agrobacterium empleado. Ejemplos de una secuencia peptídica
bien estudiada que permite la introducción de dicho segundo
polipéptido en células de dicha planta modificada genéticamente o en
las células vegetales modificadas genéticamente utilizando
microorganismos patógenos, son las proteínas virE2 y virF de
Agrobacterium o sus fragmentos requeridos para la
translocación de las proteínas desde la célula bacteriana a la
célula vegetal (Vergunst y col., 2000, Science, 290,
979-982; WO0189283). Además, pueden utilizarse
microorganismos patógenos de los géneros Bordetella, Erwinia,
Pseudomonas, Xanthomonas, Yersinia. Un sistema secretor basado
en Yersinia está descrito en, por ejemplo, WO9952563.
Mediante la realización de la etapa (b) del
método de la invención según se describió anteriormente, se consigue
un nivel muy elevado de seguridad biológica, ya que la planta no
entra en contacto con material genético que podría generar dicha
función predeterminada. En lugar de ello, se proporciona
preferiblemente a la planta al menos un componente necesario para
dicha función predeterminada como es dicho segundo polipéptido (por
tanto, sin material genético codificador).
Después de llevar a cabo la etapa (b) del método
de la invención, dicho primer fragmento de dicho primer polipéptido
y dicho segundo fragmento de dicho segundo polipéptido generan
conjuntamente dicha función predeterminada de dicha proteína cuando
están presentes juntos. La generación de dicha función
predeterminada puede ser conseguida mediante la formación de
enlaces covalentes o no covalentes entre dichos polipéptidos o
fragmentos. La formación de enlaces no covalentes puede ser
favorecida al tener dichos polipéptidos una afinidad específica
entre sí. Preferiblemente, dicho primer polipéptido y dicho segundo
polipéptido generan conjuntamente dicha función predeterminada
mediante ayuste en trans mediado por inteína o mediante interacción
de afinidad mediada por inteína. Dicha función predeterminada puede
posteriormente activar un proceso celular de interés. Por tanto, la
proteína que tiene la función predeterminada generada es referida
también en la presente como "interruptor proteico". Dicha
función predeterminada de dicho interruptor proteico puede ser, por
ejemplo, una actividad de unión o una actividad enzimática que
pueda actuar sobre otros componentes para controlar dicho proceso
celular de interés. Funciones o actividades predeterminadas
adicionales de dicho interruptor proteico están descritas más
adelante.
Dicho primer fragmento y dicho segundo fragmento
son generalmente fragmentos de una proteína una de cuyas funciones
va a ser (re)generada en el método de la invención. La
realización del método de la invención requiere típicamente la
producción de ácidos nucleicos que codifiquen dicho primer
polipéptido (particularmente para llevar a cabo la etapa (a)) y
dicho segundo polipéptido. Una secuencia que codifique dicho primer
polipéptido está por tanto codificada en dicho ácido nucleico
heterólogo de la etapa (a). Dicho segundo polipéptido puede ser
expresado separadamente en, por ejemplo, bacterias como E.
coli.
La producción de ácidos nucleicos que codifiquen
dicho primer y dicho segundo fragmento puede comprender la división
de una secuencia de nucleótidos que codifique dicha proteína en dos
o más fragmentos. Preferiblemente, dicha secuencia de nucleótidos
que codifica dicha proteína es dividida en dos fragmentos,
obteniendo así una parte 5' y una parte 3' de la secuencia de
nucleótidos. Dicha parte 5' puede corresponder esencialmente a
dicho primer fragmento. Dicha parte 3' puede corresponder
esencialmente a dicho segundo fragmento. Dicha parte 5' y dicha
parte 3' pueden contener también secuencias reguladoras que pueden
derivar de un gen que codifique dicha proteína. Dicha secuencia de
nucleótidos es típicamente una secuencia codificadora (o un marco de
lectura abierto) de la proteína que tiene la función
predeterminada. Para obtener dichos fragmentos, dicha secuencia de
nucleótidos es preferiblemente dividida de tal manera que cada
fragmento obtenido, después de la expresión, sea incapaz de generar
dicha función predeterminada en ausencia del otro fragmento. Cada
fragmento contiene una porción de secuencia necesaria para la
función de la proteína que tiene la función predeterminada. Por
ejemplo, si dicha proteína es un enzima, cada fragmento contiene
preferiblemente aminoácidos necesarios para la catálisis o para la
unión al sustrato del enzima. La proteína que tiene dicha función
predeterminada puede ser dividida en dichos fragmentos de muchas
formas diferentes, siempre que la generación de dicha función
predeterminada requiera todos los dichos fragmentos. La información
estructural y funcional conocida sobre dicha proteína puede ser de
ayuda para encontrar un lugar adecuado de división de dicha
secuencia de nucleótidos. En cualquier caso, se puede probar
fácilmente de forma experimental si un fragmento generado por la
división en un lugar elegido aleatoriamente es capaz de expresar la
función predeterminada codificada por dicha secuencia de
nucleótidos.
Si la generación de la función predeterminada se
realiza mediante ayuste en trans mediado por inteína, las
secuencias de nucleótidos que codifican dicho primer y dicho segundo
fragmento son posteriormente unidas a ácidos nucleicos que
codifiquen fragmentos de inteína. Como resultado, se obtiene un
ácido nucleico que codifica dicho primer polipéptido y un ácido
nucleico que codifica dicho segundo polipéptido. Dichos polipéptidos
serán capaces de ayuste en trans de la proteína. Mediante dicho
ayuste en trans, dicho primer y dicho segundo fragmento son unidos
mediante la formación de un enlace peptídico. Las inteínas de ayuste
en trans para ser utilizadas en esta invención pueden ser
seleccionadas de los genomas nucleolares y de orgánulos de
diferentes organismos incluyendo eucariotas, arqueobacterias y
eubacterias. Las inteínas que pueden ser utilizadas para llevar a
cabo esta invención está enumeradas en
http://www.neb.com/neb/inteins.html. Puede utilizarse también una de
las inteínas mencionadas en las referencias citadas en la presente.
La elección de la inteína puede depender de las secuencias consenso
así como de las condiciones requeridas para un ayuste en trans
eficaz.
Dicho proceso celular de interés puede requerir
frecuentemente uno o más ácidos nucleicos heterólogos adicionales
en las células de dicha planta en las que dicho proceso celular va a
ser controlado o activado (cf. Fig. 8). Dicha función
predeterminada de dicha proteína puede actuar sobre dicho ácido
nucleico heterólogo adicional, activando así dicho proceso celular
de interés. Dicho ácido nucleico heterólogo adicional puede estar
presente en todas las células o en una fracción de células de dicha
planta. Puede estar incorporado de manera estable en los genomas
nucleares o de orgánulos de células de dicho organismo. Lo que se ha
dicho en relación a dicho ácido nucleico heterólogo de la invención
aplica también en general a dicho ácido nucleico heterólogo
adicional. Preferiblemente, dicha planta es transgénica en lo que
se refiere a dicho ácido nucleico heterólogo adicional y en lo que
se refiere a dicho ácido nucleico heterólogo. Dicho ácido nucleico
heterólogo y dicho ácido nucleico heterólogo adicional pueden haber
sido introducidos en dicha planta o en dichas células vegetales
juntos en la etapa (a) de la invención, por ejemplo en una
construcción heteróloga grande que contenga ambos.
Con respecto a dicho proceso celular de interés,
no existen limitaciones particulares y la invención tiene una
aplicabilidad muy amplia. Dicho proceso celular de interés puede ser
o puede comprender la formación de un ADN, de un ARN o de una
proteína de interés a partir de dicho ácido nucleico heterólogo
adicional o implicar a dicho ácido nucleico heterólogo adicional.
Existen numerosas posibilidades para lograr la formación de dicho
ADN, de dicho ARN o de dicha proteína de interés. Dicha proteína que
tiene la función predeterminada generada puede contener, por
ejemplo, un segmento que tenga actividad para unirse a dicho ácido
nucleico heterólogo adicional, por ejemplo a un promotor. Dicho
segmento puede posteriormente actuar, por ejemplo, como un factor
de transcripción que induzca la transcripción de dicho ácido
nucleico heterólogo, desencadenando así la formación de un ARN y de
la proteína de interés.
Preferiblemente, dicha proteína tiene un
segmento con actividad enzimática capaz de desencadenar la formación
de dicho ADN, de dicho ARN o de la proteína de interés. Ejemplos de
tales actividades son actividades modificadoras de ADN o de ARN
como la actividad de una recombinasa específica de sitio, de una
flipasa, de una resolvasa, de una integrasa, de una polimerasa o de
una transposasa. Dicha actividad enzimática puede modificar dicho
ácido nucleico heterólogo adicional dando lugar a la expresión de
una proteína de interés mediante, por ejemplo, recombinación. En
una realización en la que dicha proteína (dicho interruptor
proteico) tiene actividad polimerasa, dicho segmento puede ser una
ARN polimerasa dependiente de ADN que actúe sobre un promotor de
dicho ácido nucleico heterólogo adicional. Dicho promotor,
preferiblemente, no es reconocido por las polimerasas nativas de
dicha planta. Ejemplos de tales sistemas de
promotor-polimerasa son sistemas de promotor
bacteriano, vírico o de un bacteriófago-polimerasa
como el promotor de T7-polimerasa de T7. Además,
dicho proceso celular de interés puede dar lugar a la formación de
un operón expresable procedente de dicho ácido nucleico heterólogo
adicional o de un producto de expresión del ARN de dicho ácido
nucleico heterólogo adicional.
Además, dicho ADN, dicho ARN o dicha proteína de
interés formados a partir de dicho ácido nucleico heterólogo
adicional pueden ser capaces de propagarse a otras células de dicha
planta (por ejemplo un vector vírico de ADN o ARN). Un ejemplo
importante de tal proceso celular es la formación de un amplicón
expresable a partir de dicho ácido nucleico heterólogo adicional o
a partir de un producto de expresión del ARN de dicho ácido
nucleico heterólogo adicional. Dicho amplicón es capaz de
amplificarse dentro de las células de su activación o formación
(vector de amplificación). Dicho amplicón puede ser un amplicón
expresable que contenga un gen de interés para ser expresado en
dicho proceso celular de interés. Además, dicho amplicón puede ser
capaz de movimiento célula a célula o de movimiento sistémico en la
planta de la invención. El amplicón puede estar basado en un virus
de ADN o ARN de plantas. Se prefieren virus de ARN de plantas como
los tobamovirus. Las propiedades de amplificación de dicha proteína
de interés capaz de propagarse (ver más adelante) y de dicho
amplicón pueden comportarse de forma sinérgica, permitiendo así que
un proceso celular de interés extremadamente potente se propague a
partes significativas de dicha planta (dando lugar por ejemplo a la
expresión extremadamente potente de una proteína de interés a
partir de dicho amplicón). La producción de amplicones basados en
tobamovirus es conocida en la técnica (ver, por ejemplo, Dawson y
col., 1989, Virology, 172, 285-293;
Yusibov y col., 1999, Curr. Top. Microbiol. Immunol.,
240, 81-94; para una revisión, ver "Genetic
Engineering With Plant Viruses", 1992, eds. Wilson and Davies,
CRC Press, Inc.).
Dicha proteína que tiene dicha función
predeterminada puede inducir la formación de un ADN, un ARN o una
proteína de interés a partir de dicho ácido nucleico heterólogo
adicional según sigue. Una porción de la secuencia de dicho ácido
nucleico heterólogo adicional puede ser unible operativamente a un
promotor de la transcripción por la acción de dicha proteína, lo
cual permite inducir, por ejemplo, la expresión de una proteína de
interés o la transcripción de un amplicón vírico de ARN a partir de
dicho ácido nucleico heterólogo adicional, por ejemplo uniendo
operativamente una secuencia que codifique dicha proteína de interés
o un amplicón de ARN con un promotor. Existen varias formas de
llevar esta realización a la práctica. Una opción es separar, en
dicho ácido nucleico heterólogo adicional, la secuencia que codifica
un amplicón de ARN (o la secuencia que codifica una proteína de
interés) y un promotor mediante un bloque de secuencias que impida
una unión operativa entre los mismos. Dicho bloque de secuencias
puede estar flanqueado por sitios de recombinación, de tal manera
que dicho bloque pueda ser cortado por una función recombinasa de
dicha proteína que tiene dicha función predeterminada, por lo que
la recombinasa puede reconocer dichos sitios de recombinación. De
este modo, puede establecerse la unión operativa para la
transcripción de la secuencia que codifica el amplicón de ARN y
puede inducirse la expresión. Otra opción es tener una porción de
una secuencia necesaria para la transcripción (por ejemplo un
promotor o la porción de un promotor) en orientación invertida y
flanqueada por sitios de recombinación. Después de la generación de
dicha proteína que tiene una función recombinasa predeterminada
adecuada, dicha recombinasa puede invertir de nuevo dicha porción
de la secuencia a su orientación correcta, mediante lo cual puede
establecerse una unión operativa.
En una realización principal de la invención,
dicho proceso celular de interés implica la formación de una
proteína de interés a partir de dicho ácido nucleico heterólogo
adicional, donde dicha proteína de interés es capaz de propagarse
dentro de la planta, esto es, es capaz de dejar la célula en la que
se ha formado y entrar en otras células de dicha planta
("proteína propagadora"; si la proteína propagadora puede
ejercer una función de interruptor, el término "interruptor
proteico" aplica también a la proteína propagadora). En otras
células, dicha proteína (proteína propagadora) puede activar un
proceso celular de interés, en particular mediante el control de un
ácido nucleico heterólogo adicional. Dicha acción de dejar una
célula y entrar en otras células comprende preferiblemente un
movimiento célula a célula o un movimiento sistémico en dicha planta
o en una parte de la misma. Dicha proteína (interruptor proteico)
contiene preferiblemente una porción proteica que permite dicha
acción de dejar una célula y entrar en otras células a dicho
interruptor proteico. Dicha porción proteica puede ser un dominio
de una proteína de movimiento vírica o de una proteína de la
cubierta vírica. Además, dicha porción proteica puede ser un factor
de transcripción vegetal o animal, o un dominio de un factor de
transcripción vegetal o animal capaz de movimiento célula a célula o
de movimiento sistémico. Además, dicha porción proteica puede ser
un mensajero intercelular peptídico vegetal o animal, o un dominio
de un mensajero intercelular peptídico vegetal o animal. Además,
dicha porción proteica puede ser un péptido artificial capaz de
facilitar el movimiento célula a célula o el movimiento sistémico.
Preferiblemente, sin embargo, dicha porción proteica es, o
comprende, una proteína de movimiento vírica o una proteína de la
cubierta vírica, o un dominio de una proteína de movimiento vírica
o de una proteína de la cubierta vírica.
Cuando dicho interruptor proteico capaz de
propagarse entra en otras células que contienen dicho ácido nucleico
heterólogo o dicho ácido nucleico heterólogo adicional, es
preferiblemente capaz de activar (inducir) la expresión de dicha
proteína a partir de un ácido nucleico heterólogo (adicional) (cf.
Fig. 8). Mediante la utilización de esta proteína (interruptor
proteico), el método de la invención permite amplificar y propagar
la señal de activación proporcionada externamente con dicho segundo
polipéptido en dicha planta. Particularmente, si el número de
células alcanzado inicialmente por dicho segundo polipéptido es
pequeño, la señal de activación es llevada eficazmente a más
células de dicha planta. Existen varias formas para hacer que dicho
interruptor proteico pueda controlar su propia expresión a partir
de dicho ácido nucleico heterólogo. Estas formas corresponden a las
que pueden ser empleadas para dicho polipéptido de la etapa (b)
dadas anteriormente.
Aparte de la capacidad de controlar su propia
expresión, el interruptor proteico (dicha proteína que tiene dicha
función predeterminada o dicha proteína expresada a partir de dicho
ácido nucleico heterólogo adicional) tiene preferiblemente la
capacidad de activar un proceso celular de interés. Aunque se
prefiere la activación de un proceso celular, está claro para los
expertos en la técnica que el resultado final del proceso celular
que fue activado puede ser también la supresión o la inactivación de
un proceso en las células de la planta. Para poder activar dicho
proceso celular de interés, dicho interruptor proteico puede tener
un segmento que sea capaz de controlar dicho proceso celular. Dicho
segmento puede tener actividad de unión o una actividad enzimática
que controle un ácido nucleico (en particular un ácido nucleico
heterólogo adicional) necesario para dicho proceso celular de
interés. En el método de la invención, dicho interruptor proteico
puede llevar a cabo la activación de dicho proceso celular de
manera análoga al control de su propia expresión a partir de un
ácido nucleico heterólogo adicional. Para este fin, dicho
interruptor proteico puede tener un segmento para controlar dicho
proceso celular y un segmento para producir dicha expresión de dicha
proteína, donde los mecanismos de control de dichos dos segmentos
pueden ser diferentes. Preferiblemente, los dos mecanismos de
control son similares o idénticos, donde un segmento de dicha
proteína de control puede ser suficiente para activar dicho proceso
celular y para controlar la expresión de dicha proteína. De este
modo, para simplificar, dicho interruptor proteico contiene muy
preferiblemente dicho segmento y una porción que confiere a dicha
proteína la capacidad de abandonar una célula y entrar en otras
células de dicha planta.
El proceso celular de interés que fue inducido
según se describe en la presente no tiene que afectar, sin embargo,
a toda la planta. En lugar de ello, dicho proceso celular de interés
puede estar limitado a una parte de dicha planta como las semillas
o las hojas. Preferiblemente, sin embargo, el proceso celular de
interés afecta a partes sustanciales de dicha planta. La parte de
la planta en la que dicho proceso celular es inducido depende
inter alia del(los) lugar(es) de aplicación de
dicho segundo polipéptido.
En general, dicho proceso celular de interés
puede ser muy potente en las proximidades del lugar de aplicación
de dicho segundo polipéptido y puede disminuir al aumentar la
distancia a dicho lugar. Dicha disminución puede ser en general
anisotrópica y depender de la estructura del tejido de dicha planta
en el que se aplicó dicho segundo polipéptido. Si, por ejemplo, se
va a inducir un proceso celular de interés (por ejemplo se va a
inducir la expresión de un gen de interés) y dicho segundo
polipéptido es aplicado a una fracción de una hoja de la planta,
dicho proceso celular de interés tiene lugar típicamente en dicha
fracción de dicha hoja y en las proximidades de dicha fracción de
dicha hoja. Preferiblemente, dicho proceso celular de interés tiene
lugar en la parte principal de dicha hoja. Más preferiblemente,
dicho proceso celular de interés tiene lugar también en los brotes
y en otras hojas. Muy preferiblemente, dicho proceso celular de
interés tiene lugar en la parte principal de dicha planta. El grado
de dicho proceso celular de interés (por ejemplo la expresión de un
gen de interés) puede variar en dicha planta con, por ejemplo, el
tipo de célula o el tipo de tejido. Obviamente, la aplicación de
dicho segundo polipéptido no está limitada normalmente a un solo
punto de la superficie
de la planta. Preferiblemente, dicho segundo polipéptido es aplicado a varias partes de dicha planta (ver más adelante).
de la planta. Preferiblemente, dicho segundo polipéptido es aplicado a varias partes de dicha planta (ver más adelante).
El proceso celular de acuerdo con la invención
puede comprender o dar lugar a una cascada bioquímica completa de
interés, como una ruta biosintética de múltiples etapas, en las
células de la planta. El proceso celular, o la cascada bioquímica,
de interés no es operativo en la planta antes de la exposición a
dicho segundo polipéptido. El método de la invención puede
proporcionar el control sobre un proceso celular o sobre una cascada
bioquímica de interés con una precisión técnica y una seguridad
medioambiental hasta ahora inalcanzables. De este modo, están
disponibles nuevas aplicaciones en biotecnología en general, y
específicamente en biotecnología de plantas, para solucionar
problemas que no pueden ser resueltos mediante las tecnologías
convencionales como la actividad basal de expresión transgénica en
una planta, particularmente cuando se producen sustancias tóxicas o
polímeros biodegradables. Además, el control preciso de acuerdo con
la invención permite cultivar una planta transgénica hasta una
etapa deseada en la que, por ejemplo, la planta sea muy adecuada
para llevar a cabo el proceso celular de interés sin cargar a la
planta con una actividad de expresión basal que ralentice el
crecimiento de la planta. Una vez que la planta esté lista para
llevar a cabo eficazmente el proceso celular de interés, puede
inducirse el proceso celular de interés y llevarse a cabo con una
alta eficacia. Por consiguiente, el método de la invención permite
desacoplar de manera segura la fase de crecimiento y la fase de
producción de un organismo multicelular, específicamente de una
planta transgénica. Además, es posible diseñar sistemas de múltiples
componentes para múltiples procesos celulares o cascadas
bioquímicas de interés, donde uno o más procesos deseados o
cascadas deseadas pueden ser inducidos selectivamente.
La Fig. 1 es un esquema del método de acuerdo
con la invención.
La Fig. 2 es un esquema que muestra
realizaciones para generar un interruptor proteico activo a partir
de fragmentos proteicos inactivos en una célula vegetal. A:
generación de un interruptor proteico activo mediante ayuste en
trans mediado por inteína de fragmentos proteicos. B: generación de
un interruptor proteico activo mediante la unión por afinidad de
fragmentos proteicos.
La Fig. 3 es un esquema que muestra el
ensamblaje de una proteína funcional (AB) a partir de los fragmentos
proteicos A y B no funcionales mediante ayuste en trans mediado por
inteína (Fig. 3A) o mediante interacción por afinidad (Fig. 3B). El
fragmento A es el segundo polipéptido de la invención que es
introducido en la célula. El fragmento B es expresado internamente
a partir de un ácido nucleico heterólogo.
La Fig. 4 es un esquema general que muestra la
activación de un proceso celular de interés a través de un
interruptor proteico que es capaz de moverse intercelularmente y
producir su propia expresión en otras células. PS significa
interruptor proteico, TP significa proteína movible capaz de moverse
intercelularmente (esto es, de abandonar una célula y entrar en
otras células), PS:TP significa una proteína de fusión
PS-TP, hNA significa un ácido nucleico heterólogo
adicional.
(A) representa un ácido nucleico heterólogo que
codifica PS:TP y un ácido nucleico heterólogo adicional hNA. No se
ha introducido ningún polipéptido externo (segundo), por lo que el
interruptor proteico no es expresado y no se activa ningún proceso
celular de interés.
(B) un polipéptido externo (permeable a la
célula) es introducido produciendo la expresión del interruptor
proteico PS:TP. El interruptor proteico puede controlar un proceso
celular actuando sobre el hNA en la célula de su expresión. Además,
el interruptor proteico puede abandonar la célula que había sido
activada por dicho polipéptido introducido externamente y entrar en
otras células. En otras células, el interruptor proteico puede
inducir su propia expresión y controlar también el proceso celular
actuando sobre el hNA.
La Fig. 5 representa las construcciones pICH9302
y pICH9311 diseñadas para el ayuste en trans mediado por inteína de
la proteína GUS.
La Fig. 6 representa las construcciones
pICH10181, pICH1065, pICH10666 y pICH9303 diseñadas para
experimentos de ayuste en trans mediado por inteína in
planta con la administración mediada por Agrobacterium de
uno de los componentes proteicos (codificado por pICH10655)
necesario para el ayuste en trans.
La Fig. 7 representa en (A) la construcción
pICHGFPinv que contiene un provector no funcional basado en TMV y
en (B) un derivado funcional de dicha construcción resultante de
recombinación mediada por integrasa. Las flechas de la parte
inferior indican los ARNs y ARNs subgenómicos (sg), incluyendo su
orientación, que pueden ser formados a partir de la construcción
mostrada en (B). Las siglas sgp significan promotor subgenómico.
La Fig. 8 representa una realización en la cual
el fragmento del interruptor proteico suministrado por bacterias
(INT-C:REC fr.) desencadena acontecimientos de
recombinación en las células diana después de la formación de un
interruptor proteico activo (recombinasa) mediante ayuste en trans
mediado por inteína con un fragmento codificado internamente (REC
fr.:INT-N). Dichos acontecimientos dan lugar a la
síntesis de un interruptor proteico intracelular capaz de moverse
intercelularmente (recombinasa:TP). El interruptor proteico
intracelular puede además desencadenar acontecimientos de
recombinación que dan lugar a la reordenación de un provector
basado en un virus vegetal, lo cual tiene como resultado la
expresión del gen de interés (GOI). MTS: secuencia de translocación
membranal; TP: proteína capaz de moverse intercelularmente; SM:
marcador seleccionable; RS: sitio de recombinación reconocido por
una recombinasa de ADN específica de sitio/integrasa; ter1 y ter2:
regiones de terminación de la transcripción; PROM: promotor activo
en plantas; RdRp: ARN polimerasa vírica dependiente de ARN; MP:
proteína de movimiento; 3'NTR: región 3' no traducida de un virus de
ARN vegetal. Las flechas muestran la orientación de las secuencias
codificadoras y reguladoras.
La Fig. 9 representa los vectores binarios
pICBV2, pICBV12, pICBV33 y pICBV39.
La Fig. 10 representa los vectores pICH8983 y
pICH8901.
La Fig. 11 representa los vectores pICH8912 y
pICH9723.
La Fig. 12 representa los vectores pICH15099,
pICH15085 y pICH15085-INT. Pact2-i -
promotor de la transcripción con el primer intrón del gen ACTIN2 de
Arabidopsis thaliana; PhiC31-N - parte
N-terminal de la integrasa phiC31;
PhiC31-C - parte C-terminal de la
integrasa phiC31; inteína-N - parte
N-terminal de la inteína DnaE de Synechocystis
sp. PCC6803; inteína-C - parte
C-terminal de la inteína DnaE de Synechocystis
sp. PCC6803; NLS - señal de localización nuclear; virE -
secuencias del operón virE agrobacteriano.
La Fig. 13 representa la región de
ADN-T del vector pICH10921. SM - marcador
seleccionable (gen NPTII);
RdRp - ARN polimerasa vírica dependiente de ARN; MP - proteína de movimiento; 3'NTR - región 3' no traducida de un virus de ARN de plantas; Pnos - promotor de la transcripción de la sintasa de nopalina; Tnos - región de terminación de la transcripción de la sintasa de nopalina; Pact2 - promotor de la transcripción del gen ACTIN2 de Arabidopsis thaliana; IRESmp75(cr) - IRES de la proteína de movimiento de la cepa de TMV de crucíferas; Attp y AttB - sitios de recombinación reconocidos por la integrasa phiC31.
RdRp - ARN polimerasa vírica dependiente de ARN; MP - proteína de movimiento; 3'NTR - región 3' no traducida de un virus de ARN de plantas; Pnos - promotor de la transcripción de la sintasa de nopalina; Tnos - región de terminación de la transcripción de la sintasa de nopalina; Pact2 - promotor de la transcripción del gen ACTIN2 de Arabidopsis thaliana; IRESmp75(cr) - IRES de la proteína de movimiento de la cepa de TMV de crucíferas; Attp y AttB - sitios de recombinación reconocidos por la integrasa phiC31.
En la base de esta invención está la utilización
de la administración, preferiblemente mediada por una bacteria, de
fragmentos de un interruptor proteico a células vegetales sin
administrar la secuencia de ácido nucleico que codifica dichos
fragmentos proteicos. El principio general de esta invención está
mostrado en la Figura 1.
En la presente, una proteína con función de
interruptor según se describió anteriormente es referida como
interruptor proteico. Así, varias proteínas aquí descritas son
referidas como interruptores proteicos, por ejemplo dicha proteína
con dicha función predeterminada que es generada conjuntamente por
dicho primer y dicho segundo fragmento, o dicha proteína de interés
expresada a partir de dicho ácido nucleico heterólogo adicional.
Las funciones de interruptor de estos interruptores proteicos pueden
ser diferentes (por ejemplo, la actividad enzimática puede ser
diferente). Preferiblemente, las funciones de interruptor pueden ser
las mismas (por ejemplo, todos los interruptores proteicos pueden
tener una actividad recombinasa específica), ya que un proceso de
interés puede ser entonces controlado muy eficazmente. En
particular, las funciones de interruptor de los interruptores
proteicos pueden por tanto actuar en común, esto es, en paralelo en
lugar de consecutivamente.
Existe un número incontable de procesos
celulares de interés que pueden ser activados de manera irreversible
por dicha función predeterminada o por dicha proteína o interruptor
proteico de la invención. El interruptor proteico puede, por
ejemplo, controlar la expresión de un transgén de interés de muchas
formas diferentes. Por ejemplo, puede activar la recombinación o la
transcripción de ADN, el procesamiento o la traducción de ARN,
modificaciones post-traduccionales de la proteína,
etc. Además, puede ser activada por un transgén tras su
administración a la célula vegetal y ser capaz después de esto de
funcionar como interruptor. En la invención, puede formarse un
interruptor proteico activo mediante interacciones de afinidad entre
un fragmento del interruptor proteico suministrado por
Agrobacterium (dicho segundo fragmento) y otro fragmento de
dicho interruptor proteico codificado por la célula vegetal (dicho
primer fragmento). Dicha interacción puede restaurar la actividad
del interruptor proteico con (Figuras 2A y 3A) o sin (Figuras 2B y
3B) la formación de un enlace peptídico entre dichos fragmentos.
Obviamente, la elección del interruptor proteico depende del
diseño/elección del proceso celular que va a ser controlado en
dicha planta. Dicho proceso celular puede ser controlado, en
particular activado, por la reordenación o la modificación del
ácido nucleico en células en las cuales está presente dicho
interruptor proteico o en células que han sido invadidas por dicho
interruptor proteico. En tal caso, el interruptor proteico puede
comprender un enzima modificador de ADN o de ARN como una
endonucleasa específica de sitio, una recombinasa, una metilasa,
una integrasa, una transposasa, una polimerasa, etc.
Otras posibles funciones predeterminadas de un
interruptor proteico de esta invención incluyen la activación de
reacciones tales como la restricción de ADN y/o la replicación de
ADN. Un ejemplo de una cascada bioquímica que puede ser activada
por restricción es un sistema de dos componentes en el que una
secuencia de ADN que contiene un origen de replicación y que está
integrada en un genoma nuclear es cortada específicamente y
convertida en un plásmido de replicación autosómica por un enzima
de restricción de corte poco frecuente que sirve como interruptor
proteico, desencadenando así la cascada.
Existen numerosas reacciones (funciones
predeterminadas) que afectan a las moléculas de ARN y que pueden ser
utilizadas como dispositivo activador eficaz para los procesos
celulares de acuerdo con la presente invención. Éstas incluyen,
inter alia, reacciones tales como la replicación del ARN,
transcripción inversa, edición, silenciamiento o traducción.
Existen abundantes técnicas anteriores que describen con detalle
cómo, por ejemplo, una recombinasa específica de sitio, una
integrasa o una transposasa pueden activar un proceso de interés
mediante la escisión, la inversión o la inserción de ADN en células,
en particular en células vegetales (Zuo, Moller y Chua, 2001,
Nat. Biotech., 19, 157-161; Hoff,
Schnorr y Mundy, 2001, Plant Mol. Biol., 45,
41-49; US5225341; WO9911807; WO9925855; US5925808;
US6110736; WO0140492; WO0136595). Recombinasas específicas de
sitio/integrasas de bacteriófagos y levaduras son ampliamente
utilizadas para manipular ADN in vitro y en plantas y
animales. Recombinasas-sitios de recombinación
preferidos para ser utilizados en esta invención son los
siguientes: recombinasa Cre-sitio de recombinación
de LoxP, recombinasa FLP-sitios de
recombinación de FRT, recombinasa R-sitios
de recombinación de RS, integrasa del fago C31 que reconoce
sitios de attP/attB, etc. Los transposones son ampliamente
utilizados para el descubrimiento de una función génica en plantas.
Sistemas de transposones preferidos para ser utilizados en la
presente invención incluyen Ac/Ds, En/Spm,, transposones
pertenecientes a la familia "mariner", etc.
Pueden utilizarse también en un interruptor
proteico de acuerdo con la invención factores de transcripción
heterólogos y ARN polimerasas. Por ejemplo, la administración de
polimerasa de T7 a las células de una planta portadoras de un
transgén bajo el control del promotor de T7 puede inducir la
expresión de tal transgén.
La expresión de un transgén vegetal de interés
que esté bajo el control de un promotor de bacteriófago (por
ejemplo, T3, T7, SP6, K11) con la correspondiente ADN/ARN polimerasa
ensamblada en las células de la planta, puede ser otro
procedimiento eficaz para el desarrollo de los interruptores
proteicos contemplados en esta invención. Otro procedimiento útil
puede ser la utilización de promotores heterólogos o quiméricos u
otros promotores artificiales que requieran para su activación
factores de transcripción heterólogos o construidos. Los factores
de transcripción heterólogos pueden ser utilizados también para
inducir la expresión del transgén de interés bajo el control de
dicho promotor reconocible por el factor de transcripción. Ejemplos
de tales factores de transcripción pueden ser, pero sin limitarse
a, el factor de transcripción ACE1 de levaduras sensible a metales
que se une a secuencias específicas del promotor MT (metalotioneína)
de levaduras (Mett y col., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci.,
90, 4567-4571), diferentes factores de
transcripción quiméricos que tengan un dominio de unión a ADN
específico de secuencia y un dominio de activación, como un factor
de transcripción que tenga una proteína de fusión de seis dedos de
zinc 2C7 y el dominio de activación del factor de transcripción
VP16 del virus del herpes simple (Ordiz, Barbas y Beachy, 2002,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99,
13290-13295), un factor de transcripción que tenga
un represor 434 de longitud completa y los 80 aminoácidos
C-terminales del activador transcripcional VP16
(Wilde y col., 1994, Plant Mol. Biol., 24,
381-388), un factor de transcripción utilizado en
sistemas inducibles por esteroides (Aoyama y Chua, 1997, Plant
J., 11, 605-612, McNellis y col., 1998,
Plant J., 14, 247-257; US06063985) o
un sistema inducible por tetraciclinas (Weinmann y col., 1994,
Plant J., 5, 559-569). En algunos
casos, pueden utilizarse los sistemas inducibles existentes para la
expresión de transgenes. Alternativamente, los factores de
transcripción heterólogos pueden ser modificados de tal manera que
no se requiera ningún
ligando-inductor-activador para
llevar al factor de transcripción al estado activo. Los factores de
transcripción quiméricos son ventajosos para ser utilizados en esta
invención, ya que permiten combinar dominios de unión a ADN muy
específicos de secuencia y dominios de activación muy eficaces,
permitiendo así un efecto deseado máximo después de la
administración de tal factor a la célula vegetal.
Otro interruptor proteico contemplado bajo la
invención puede llevar a cabo una modificación
post-traduccional de uno o más producto(s)
de expresión de un ácido nucleico heterólogo, lo cual puede dar
lugar a la activación del producto de expresión. Existen muchas
aplicaciones posibles de tales interruptores proteicos que pueden
operar controlando etapas tales como el plegamiento de polipéptidos,
la formación de oligómeros, la eliminación de señales de
vectorización, la conversión de un proenzima en un enzima, el
bloqueo de la actividad enzimática, etc. Por ejemplo, la
administración a las células de una planta de una proteasa
específica de sitio puede activar un proceso celular de interés si
un huésped manipulado genéticamente corta específicamente un
proenzima, convirtiendo el mismo de este modo en un enzima activo,
si un producto es dirigido a un compartimento celular particular
debido a la capacidad del huésped para cortar o modificar un motivo
diana, o si un producto es movilizado específicamente debido a la
eliminación de una secuencia de unión específica. El corte de una
proteína de fusión traduccional puede ser llevado a cabo a través
de una secuencia peptídica reconocida por una proteasa vírica
específica de sitio o a través de un péptido catalítico (Dolja y
col., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89,
10208-10212; Gopinath y col., 2000, Virology,
267, 159-173; US5162601; US5766885;
US5491076). Otros ejemplos de proteasas específicas de sitio
aplicables a esta invención son enteroquinasas de mamífero, por
ejemplo, la cadena ligera de la enteroquinasa humana que reconoce la
secuencia DDDK-I (Kitamoto y col., 1994, Proc.
Natl. Acad. Sci., 91, 7588-7592) y corta
específicamente los enlaces Lys-Ile; proteasas
víricas como Hc-Pro (Carrington, J.C. y Herndon,
K.L., 1992, Virology, 187, 308-315)
que cataliza la proteolisis entre el dipéptido
Gly-Gly pero que requiere 4 aminoácidos para el
reconocimiento del sitio de corte; la proteasa específica de sitio
del Virus del Bosque Semliki (Vasilijeva y col., 2001, J. Biol.
Chem., 276, 30786-30793); y proteasas
implicadas en el procesamiento de la poliubiquitina, hidrolasas
carboxi-terminales de la ubiquitina (Osava y col.,
2001, Biochem. Biophys. Res. Commun., 283,
627-633).
Los patógenos de plantas tienen sistemas muy
eficaces para suministrar a las células vegetales proteínas
efectoras. Muchas bacterias patógenas de plantas y animales
utilizan sistemas de secreción especializados para suministrar
proteínas efectoras directamente a las células huésped. Existen
muchas descripciones en la literatura de tales sistemas secretores,
por ejemplo el sistema de secreción de tipo III de las bacterias
Gram negativas (Binet y col., 1997, Gene, 192,
7-11; Thanassi y Hultgren, 2000, Curr. Opin. Cell
Biol., 12, 420-430; Buttner y Bonas,
2002, Trends Microbiol., 10, 186-192;
Buttner y Bonas, 2003, Curr. Opin. Plant Biol., 6,
312-319), el sistema de secreción de tipo II de
proteobacterias (Sandkwist, 2001, Mol. Microbiol., 40,
271-283). Múltiples rutas de secreción de proteínas
por bacterias están descritas en la revisión de Thanassi y Hultgren
(2000, Curr. Opin. Cell Biol., 12,
420-430). Los sistemas de secreción de tipo III de
diferentes bacterias fitopatógenas pueden ser utilizados para la
administración de una proteína heteróloga de interés a células
vegetales. Por ejemplo, el grupo de genes Hrp (secreción de
proteínas de tipo III) fue clonado a partir de Erwinia
chrysanthemi (Ham y col., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 95, 10206-10211); el sistema de
secreción de Pseudomonas syringae está descrito con
suficiente detalle para ser utilizado en esta invención (para una
revisión ver Jin y col., 2003, Microbes Infect., 5,
301-310); el sistema secretor de Xanthomonas
campestris está siendo estudiado intensamente (Marois y col.,
2002, Mol. Plant Microbe Interact., 15,
637-646; Szurek y col., 2002, Mol.
Microbiol., 46, 13-23).
Preferiblemente, para la presente invención se
utilizan fitopatógenos que produzcan poco daño a las plantas
huésped. Más preferiblemente, se manipulan fitopatógenos de tal
manera que sean capaces de transferir una proteína heteróloga de
interés sin causar ningún efecto nocivo a la planta huésped. Algunas
bacterias no patógenas pueden ser manipuladas de tal manera que
posean solamente aquella parte del sistema de secreción de tipo III
que es necesaria para la administración de la proteína heteróloga de
interés a la célula vegetal. Algunas bacterias
Gram-negativas, como Agrobacterium
tumefaciens y Agrobacterium rhizogenes, están bien
estudiadas y son utilizadas ampliamente para introducir ADN
recombinante en las células vegetales (Zambryski, 1988, Annu.
Rev. Genet., 22, 1-30; Hiei, Komari y
Kubo, 1997, Plant Mol. Biol., 35,
205-18; Newell, 2000, Mol. Biotechnol.,
16, 53-65). Son capaces de administrar
ADN-T a los núcleos de muchas especies vegetales y
el mecanismo de tal transporte está razonablemente bien estudiado
(Hooykaas y Beijersbergen, 1994, Annu. Rev. Phytopathol.,
32, 157; Zupan y Zambryski, 1995, Plant Physiol.,
107, 1041-1047; Hansen y Chilton, 1996,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93,
14978-14983). Las agrobacterias son posiblemente las
más adecuadas para ser utilizadas en esta invención. La publicación
del grupo de Hooykaas (2000, Science, 290,
979-982) demuestra la posibilidad de transferencia
mediada por Agrobacterium a la célula huésped de la proteína
heteróloga recombinasa Cre. La transferencia se consiguió
utilizando la fusión traduccional de Cre con proteínas de virulencia
o sus partes implicadas en la translocación de proteínas a la
célula vegetal durante el contacto con Agrobacterium. La
administración de recombinasa Cre no estaba acoplada con la
transferencia del ADN codificador de dicha recombinasa, sino que
era suficientemente eficaz para desencadenar acontecimientos de
recombinación en células diana manipuladas. El proceso de
administración a la célula vegetal de un polipéptido (dicho segundo
polipéptido) mediada por una bacteria requiere la disponibilidad de
células bacterianas manipuladas portadoras del gen de dicha
proteína (WO0189283). Tal proceso es suficientemente eficaz para
desencadenar cambios seleccionables en las células vegetales
afectadas, pero tiene algunas desventajas serias que limitan
significativamente la aplicabilidad de dicha invención. En primer
lugar, no proporciona control sobre la segregación del transgén, ya
que está presente la secuencia codificadora completa de dicho
polipéptido en las bacterias fitopatógenas. En segundo lugar, no es
lo suficientemente eficaz para tener aplicaciones prácticas, ya que
los cambios desencadenados por el interruptor proteico están
limitado a las células que eran los receptores primarios de dicho
polipéptido.
Por tanto, se requiere un método muy eficaz para
administrar dicho segundo polipéptido a cada una o a la mayor parte
de las células de la planta diana o la propagación eficaz de los
acontecimientos desencadenados por el interruptor proteico, o bien
la combinación de ambos procedimientos. Además, para hacer que el
sistema del interruptor proteico sea seguro, se desea un control
estricto sobre el ácido nucleico heterólogo que codifica dicho
interruptor proteico. Esto puede ser conseguido utilizando la
aplicación directa del polipéptido (por ejemplo tratando las
plantas con la solución que contiene dicho segundo polipéptido), o
bien utilizando la administración bacteriana de dicho segundo
polipéptido, donde solamente una parte de dicho interruptor proteico
es suministrada por la bacteria, pero la otra parte (dicho primer
polipéptido) está codificada por la célula vegetal diana.
Con el fin de tratar estos temas, se propone en
la presente utilizar un procedimiento de "genes divididos" (o
"proteínas divididas") para controlar la segregación del
transgén que codifica dicho interruptor proteico, en particular de
la proteína que tiene dicha función predeterminada. En esta
realización, un interruptor proteico activo (funcional) es
ensamblado mediante ayuste en trans de la proteína mediado por
inteína (Fig. 2A y Fig. 3A) o por interacción de afinidad (Fig. 2B
y Fig. 3B) a partir de dicho primer y dicho segundo fragmento de
dicho primer y dicho segundo polipéptido, respectivamente. Éste es
un tema especialmente importante para la administración mediada por
fitopatógenos de una proteína con función de interruptor.
En el Ejemplo 1 de esta invención, nosotros
demostramos la eficacia del ayuste en trans de GUS mediado por
inteína in planta en células vegetales utilizando las
construcciones mostradas en la Fig. 5. El ayuste en trans restaura
muy eficazmente la actividad GUS, que es comparable con la de los
experimentos control. En el Ejemplo 2 de esta invención,
demostramos la eficacia de este procedimiento administrando una
parte de la proteína GUS a la célula vegetal como una fusión
traduccional con el extremo C-terminal de la
proteína virF (Fig. 6). La administración de tales fusiones con la
ayuda de un sistema secretor agrobacteriano da lugar a la formación
de una proteína GUS funcional mediante ayuste en trans mediado por
inteína, si otro fragmento de la proteína GUS está codificado en la
célula vegetal por ADN-T integrado de manera estable
o incluso coadministrado con otra cepa de Agrobacterium. En
ambos casos, el interruptor proteico no existe como una secuencia de
ADN continua y su utilización está mucho mejor controlada y es
biológicamente segura.
El ayuste en trans de proteínas mediado por
inteína con restauración de su actividad es conocido en la técnica
anterior y está descrito con detalle en muchas publicaciones. La
interacción por afinidad de proteínas y/o el ayuste en trans pueden
ser realizados utilizando inteínas construidas (Fig. 2A). Las
inteínas fueron identificadas por vez primera como secuencias
proteicas incluidas en marco en un precursor de la proteína y
escindidas durante el proceso de maduración de la proteína (Perler
y col., 1994, Nucleic Acids Res., 22,
1125-1127; Perler, F.B., 1998, Cell,
92, 1-4). Toda la información y los grupos
catalíticos necesarios para llevar a cabo una reacción de
autoayuste residen en la inteína y en dos aminoácidos flanqueantes.
El mecanismo químico del ayuste de proteínas está descrito con
detalle por Perler y colaboradores (1997, Curr. Opin. Chem.
Biol., 1, 292-299) y por Shao y Kent
(1997, Chem. Biol., 4, 187-194). Las
inteínas tienen normalmente regiones de ayuste N- y
C-terminales y una región central de endonucleasa
direccional ("homing") o una pequeña región adaptadora. Hasta
ahora se conocen más de 100 inteínas que están distribuidas entre
los genomas nucleares y de los orgánulos de diferentes organismos
incluyendo eucariotas, arqueobacterias y eubacterias
(http://www.neb.com/neb/inteins.html). Se demostró que las inteínas
eran capaces de ayuste en trans. La eliminación de la región de
endonucleasa direccional ("homing") central no tiene ningún
efecto sobre el autoayuste de las inteínas. Esto hizo posible el
diseño de sistemas de ayuste en trans, en los cuales los fragmentos
N-terminal y C-terminal de una
inteína son coexpresados como fragmentos separados y, cuando son
fusionados a exteínas (fragmentos proteicos que están ligados entre
sí con la ayuda de la inteína), pueden llevar a cabo un ayuste en
trans in vivo (Shingledecker y col., 1998, Gene,
207, 187-195). Se demostró también con los
fragmentos N- y C-terminal de la inteína RecA de
Mycobacterium tuberculosis, que el ayuste en trans de la
proteína puede tener lugar in vitro (Mills y col., 1998,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95,
3543-3548). Este fenómeno fue identificado también
para la proteína DnaE de Synechocystis sp. cepa PCC6803 (Wu y
col., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95,
9226-9231). Dos genes diferentes situados a más de
700 kpb de distancia en hebras de ADN opuestas codifican esta
proteína. Se demostró también que dos secuencias de inteína
codificadas por esos genes reconstituían una miniinteína dividida y
eran capaces de mediar la actividad de ayuste en trans de la
proteína cuando se ensayaron en células de Escherichia coli.
Se utilizó una inteína del mismo origen (inteína DnaE de
Synechocystis sp. cepa PCC6803) para producir sintasa II de
acetolactato resistente a herbicidas funcional a partir de dos
fragmentos no unidos (Sun y col., Appl. Environ. Microbiol.,
67, 1025-29) y
5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato
sintasa (EPSPS) (Chen y col., 2001, Gene, 263,
39-48) en E. coli.
El ayuste en trans de fragmentos proteicos
(incluyendo la formación de enlaces covalentes entre exteínas) no
se requiere necesariamente para restaurar la función original de la
proteína dividida. En muchos casos, la interacción por afinidad
entre fragmentos proteicos sin la formación de un enlace peptídico
es suficiente para restaurar la función de la proteína (Fig. 2B).
Este procedimiento tiene mucho éxito (como en el caso del ayuste en
trans mediado por inteína) con proteínas que tienen dos o más
dominios funcionales. En este caso, los dominios pueden ser
separados entre sí dividiendo la secuencia codificadora entre dos
vectores de transcripción y reunidos mediante interacciones de
afinidad mediadas por la proteína (Fig. 3B). Los dominios proteicos
pueden interaccionar sin la necesidad de utilizar inteínas
interactivas. Existe un ejemplo de reconstitución de la actividad
de la transposasa IS10 que consta de dos dominios estructurales
conectados por una región adaptadora sensible a proteolisis (Kwon,
Chalmers y Kleckner, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
92, 8234-8238). Cada uno de los dominios
separadamente es incapaz de proporcionar la función transposasa.
Cuando son añadidos juntos, sin embargo, son capaces de
proporcionar transposiciones incluso sin estar conectados por una
región adaptadora. Existen muchos otros ejemplos de reconstitución
de una proteína funcional a partir de fragmentos aislados sin la
formación de enlaces peptídicos. Se consiguió el ensamblaje eficaz
de un sitio de unión del receptor de insulina funcional mezclando
sencillamente fragmentos no funcionales (Kristensen y col., 2002,
J. Biol. Chem., 277, 18340-18345). Se
demostró la reconstitución de proteínas activas mezclando
simplemente dos fragmentos peptídicos inactivos para la leucina
deshidrogenasa (Oikawa y col., 2001, Biochem. Biophys. Res.
Commun., 280, 1177-1182), para la
proteína de unión a Ca^{2+} calbindina D28k (Berggard y col.,
2000, Protein Sci., 9, 2094-2108;
Berggard y col., 2001, Biochemistry, 40,
1257-1264), para el regulador del desarrollo COP1
de Arabidopsis (Stacey y col., 2000, Plant Physiol.,
124, 979-990), para el receptor de diopamina
D (Scarselli y col., 2000, Eur. J. Pharmacol., 397,
291-296), para el microplasminógeno (De Los Santos,
Wang y Reich, Ciba Found. Symp., 212,
76-83) y para muchas otras.
Los dominios cremallera de leucina tienen
especial interés para formar heterodímeros proteicos una vez
fusionados a fragmentos proteicos de interés (Riecker y Hu, 2000,
Methods Enzymol., 328, 282-296; Liu y
col., 2001, Curr. Protein Pept. Sci., 2,
107-121). Un ejemplo interesante es el control de la
interacción proteína-proteína con una molécula
pequeña. Por ejemplo, la recombinasa Cre fue manipulada de tal
manera que, cuando se dividió en dos fragmentos inactivos, fue
capaz de restaurar el 100% de su actividad recombinasa en presencia
de la molécula pequeña rapamicina que desencadenaba la
complementación de la actividad a través de heterodimerización
entre dos fragmentos inactivos (Jullien y col., 2003, Nucleic
Acids Res., 31, e131). La rapamicina y sus análogos no
tóxicos pueden ser utilizados también para el ayuste condicional de
la proteína, por el cual desencadenan una reacción de ayuste en
trans (Mootz y col., 2003, J. Am. Chem. Soc., 125,
10561-10569). Procedimientos similares para la
regulación de interacciones proteína-proteína con la
ayuda de moléculas pequeñas tales como rapamicina o análogos de
rapamicina, están descritos en varias publicaciones (Amara y col.,
1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94,
10618-10623; Pollock y col., 2000, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 97, 13221-13226; Pollock
y col., 2002, Nat. Biotechnol., 20,
729-733). Pueden utilizarse otros muchos
dimerizantes químicos tales como dexametasona y metotrexato para
ensamblar homo o heterodímeros activos a partir de fragmentos
proteicos inactivos (para una revisión ver: Pollock y Clackson,
2002, Curr. Opin. Biotechnol., 13,
459-467).
Pueden crearse eficazmente interacciones por
afinidad mediante la utilización de dominios proteicos que
interaccionen existentes en la naturaleza o mediante la
identificación de tales dominios con la ayuda de sistemas de dos
híbridos (Fields y Son, 1989, Nature, 340,
245-246; Chien y col., 1991, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 88, 9578-9582; Yeast
Protocol Handbook, Clontech Laboratories, Inc., 2000) o sistemas
de presentación en fagos. Por ejemplo, puede utilizarse la
presentación en fagos para seleccionar un oligopéptido
5-12-mero con una alta afinidad por
un fragmento proteico de interés. Varios de tales sistemas están
actualmente disponibles comercialmente. La presentación en fagos es
una técnica de selección en la cual un oligopéptido corto
5-12-mero variable es insertado en
una proteína de revestimiento de un bacteriófago. La secuencia que
codifica este oligopéptido variable es incluida en el gen
correspondiente de la proteína de revestimiento del bacteriófago.
Normalmente, una biblioteca de presentación en fagos
7-meros tiene al menos 10^{9} clones
independientes portadores de diferentes combinaciones de
aminoácidos 7-meros en oligopéptidos variables. La
presentación en fagos ha sido utilizada para crear complejos de
afinidad entre un bacteriófago y una proteína de interés,
permitiendo una identificación rápida de ligandos peptídicos para
una proteína diana dada mediante un proceso de selección in
vitro denominado "reconocimiento y selección de fagos
recombinantes" ("panning") (Parmley, Smith, 1988,
Gene, 73, 305-318; Cortese y col.,
1995, Curr. Opin. Biotechnol., 6,
73-80). El complejo fago-proteína
creado después del procedimiento de "panning" puede ser
disociado y puede amplificarse un fago con afinidad por una
proteína diana. Normalmente, se necesitan tres ciclos de
"panning" para conseguir un bacteriófago con alta afinidad.
Después de tres ciclos, pueden caracterizarse clones individuales
mediante secuenciación de la región variable del ADN genómico.
Dicho sistema puede ser adoptado eficazmente para identificar
oligopéptidos cortos que interaccionen y utilizar los mismos como
marcas de afinidad con el fin de unir fragmentos proteicos.
Otro procedimiento incluye la utilización de
dominios de interacción existentes de forma natural como son las
repeticiones ricas en leucina (Kobe y Deisenhofer, 1994, Trends
Biochem. Sci., 19, 415-421; Kobe y
Kajava, 2001, Curr. Opin. Struct. Biol., 11,
725-732), dedos de zinc (Grossley, Merika y Orkin,
1995, Mol. Cell Biol., 15,
2448-2456), repeticiones de anquirina (Thompson,
Brown y McKnight, 1991, Science, 253,
762-768), dominios de cromo (Paro y Hogness, 1991,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88,
263-267; Singh y col., 1991, Nucleic Acids
Res., 19, 789-793) y muchos otros
implicados en las interacciones proteína-proteína.
Sin embargo, debe tenerse en cuenta la posibilidad de implicar en
las interacciones proteína-proteína no sólo los
fragmentos proteicos construidos que contienen las fusiones de
motivos, sino también proteínas endógenas.
La utilización de las interacciones
proteína-proteína para activar un proceso celular de
interés, como la expresión génica, tiene inter alia las
ventajas siguientes: En primer lugar, puede hacerse que el sistema
sea altamente específico, ya que la función de interés es el
resultado de una interacción proteína-proteína o
proteína-ácido nucleico altamente específica, que se caracteriza por
un estado no inducido a nivel cero y por la ausencia de escapes no
específicos. Esto contrasta con los sistemas de la técnica anterior
tales como interruptores basados en moléculas pequeñas que son
inherentemente menos específicas y muestran invariablemente un
cierto grado de escapes. En segundo lugar, un interruptor proteico o
un fragmento del mismo puede ser suministrado directamente a las
células de una planta sin un vector de ácido nucleico que codifique
dicha proteína o dicho fragmento, permitiendo así la dosificación
precisa de dicha proteína. Esto hace que la administración directa
de un interruptor proteico a la célula sea comparable con las
ventajas de la utilización de pequeñas moléculas para desencadenar
en las células un proceso requerido. En tercer lugar, el sistema es
inherentemente más seguro para el medio ambiente que los sistemas
de la técnica anterior que contienen la información genética
completa para la proteína de interés o para el interruptor proteico
(ya sea en forma de ácido nucleico lineal o de fragmentos de dicho
ácido nucleico), ya que permite que el organismo en cuestión no
contenga la información genética completa necesaria para la
expresión de una proteína funcional. De acuerdo con el dogma central
de la biología molecular, los sistemas biológicos no pueden
traducir de manera inversa proteínas a ácidos nucleicos. Por tanto,
la "manipulación inversa" de la información genética suficiente
para la expresión de un rasgo funcional por un organismo vivo es
imposible. En cuarto lugar, el sistema proporciona un bloqueo
específico que podría ser utilizado para prohibir el uso no
autorizado del sistema. La utilización de un interruptor proteico
(en particular de dicho segundo polipéptido) como componente de un
extracto proteico bruto de un organismo que exprese dicho
polipéptido o dicho fragmento proteico hace que sea prácticamente
muy difícil identificar el componente activo de dicho extracto.
En la presente, se proporciona un procedimiento
para solventar el problema del bajo número de células de una planta
que pueden ser alcanzadas por el segundo polipéptido aplicado
externamente: dicho segundo polipéptido puede dar lugar en las
células de la planta a la formación de una molécula de interruptor
proteico capaz de moverse célula a célula o de movimiento
sistémico. Además, dicho segundo polipéptido puede dar lugar a la
formación de un vector basado en un virus (amplicón) que exprese un
gen de interés o una parte del mismo y que sea capaz de moverse
célula a célula o de moverse de forma sistémica en dicha planta. En
estos procedimientos, el movimiento de los vectores víricos o de
las moléculas de interruptor proteico o de ambos, puede dar lugar a
la propagación de un proceso celular y/o de una cascada bioquímica a
partes significativas de dicha planta e incluso a toda planta
modificada genéticamente.
En el Ejemplo 3 de esta invención, el
interruptor proteico contiene una integrasa phiC31 para convertir un
vector precursor de un vector vírico en el vector vírico. La
integrasa es dividida en dos fragmentos inactivos que forman
proteínas funcionales debido al ayuste en trans mediado por inteína
de los dos fragmentos de la integrasa. Uno de dichos fragmentos es
administrado a la célula vegetal como una proteína de fusión con el
fragmento virE2 (pICH15085-INT, Fig. 12) con la
ayuda de un sistema de translocación de proteínas agrobacteriano,
mientras que el otro (pICH15099, Fig. 12) está codificado por la
célula vegetal. El vector vírico es capaz de amplificación, de
movimiento célula a célula y de movimiento sistémico. La
recombinación mediada por la integrasa entre los sitios de attP y
attB de pICHGFPinv (Fig. 7A) o pICH10921 (Fig. 13), da lugar a la
inversión de un fragmento de ADN flanqueado por dichos sitios de
recombinación y a la formación de un vector vírico capaz de
amplificar y expresar el gen de interés (GFP) (Fig. 7B). Esto se
consigue como resultado de la colocación de los componentes víricos
(3'NTR - región 3' no traducida; CP - proteína de la cubierta)
necesarios para la amplificación del vector y el transporte
sistémico, en orientación sentido con relación a un promotor activo
en la planta en cuestión, como el promotor de la actina 2 en este
ejemplo. De este modo, junto con los demás componentes del vector
vírico (RdRp y CP) forma un ADNc que después de la transcripción
dirigida por el promotor de la actina 2 forma un vector vírico de
ARN capaz de amplificación, de movimiento célula a célula y de
movimiento sistémico. Opcionalmente, dicho vector puede ser
modificado adicionalmente mediante la eliminación del gen CP
(proteína de la cubierta). Tal vector carente del gen CP será
todavía capaz de moverse célula a célula.
La construcción de sistemas de expresión basados
en virus de plantas para la expresión de genes no víricos en
plantas ha sido descrita en varios artículos (Dawson y col., 1989,
Virology, 172, 285-293; Brisson y
col., 1986, Methods in Enzymology, 118, 659;
MacFarlane y Popovich, 2000, Virology, 267,
29-35; Gopinath y col., 2000, Virology,
267, 159-173; Voinnet y col., 1999, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14147-14152) y
revisiones (Porta y Lomonossoff, 1996, Mol. Biotechnol.,
5, 209-221; Yusibov y col., 1999, Curr.
Top. Microbiol. Immunol., 240, 81-94) y
puede llevarse a cabo fácilmente por los expertos en la técnica.
Los sistemas de expresión basados en vectores víricos ofrecen un
rendimiento del producto transgénico significativamente más elevado
en comparación con los transgenes nucleares de plantas. Por ejemplo,
el nivel de proteína codificada transgénicamente puede alcanzar el
5-10% del contenido total de proteínas vegetales
celulares cuando se expresa a partir de un vector vírico (Kumagai y
col., 2000, Gene, 245, 169-174;
Shivprasad y col., 1999, Virology, 255,
312-323). Los virus de ARN son los más adecuados, ya
que ofrecen un nivel de expresión más elevado en comparación con
los virus de ADN. Existen varias patentes publicadas que describen
vectores víricos adecuados para la expresión sistémica de material
transgénico en plantas (US5316931; US5589367; US5866785). En
general, estos vectores pueden expresar un gen foráneo como una
fusión traduccional con una proteína vírica (US5491076; US5977438),
a partir de un promotor subgenómico adicional (US5466788; US5670353;
US5866785), o a partir de ARN vírico policistrónico utilizando
elementos IRES (sitio interno de entrada al ribosoma) para la
traducción de proteínas independientes (Solicitud de Patente Alemana
DE 10049587). El primer procedimiento - fusión traduccional de una
proteína recombinante con una proteína estructural vírica (Hamamoto
y col., 1993, BioTechnology, 11,
930-932; Gopinath y col., 2000, Virology,
267, 159-173; JP6169789; US5977438) produce
un rendimiento significativo del producto proteico recombinante. Sin
embargo, la utilidad de este procedimiento es limitada, ya que la
proteína recombinante no puede ser separada fácilmente de la
proteína vírica. Una alternativa de este procedimiento emplea un
fusión traduccional a través de una secuencia peptídica reconocida
por una proteasa vírica específica de sitio o a través de un péptido
catalítico (Dolja y col., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
89, 10208-10212; Gopinath y col., 2000,
Virology, 267, 159-173; US5162601;
US5766885; US5491076). Los procesos de expresión que utilizan
vectores víricos añadidos a promotores subgenómicos heterólogos
proporcionan el nivel de producción de proteína más elevado hasta la
fecha (US5316931). La desventaja más seria de los vectores víricos
y de muchos otros es su capacidad limitada con respecto al tamaño
del ADN que va a ser amplificado. Normalmente, las construcciones
estables acomodan insertos de no más de un kb. En algunas áreas de
la genómica funcional de plantas esto puede no ser tal limitación
seria, ya que G. della-Cioppa y col. (WO993651)
describieron la utilización de vectores víricos basados en TMV para
expresar bibliotecas de ADNc de plantas con el fin de silenciar
genes endógenos. Sistemas de amplificación de dos componentes que
utilizan virus cooperadores pueden ofrecer una capacidad ligeramente
mejor (US5889191). Otros sistemas basados en casetes de expresión
que están integrados de manera estable en el genoma de la planta
contienen el potente promotor de 35S que dirige la expresión de
amplicones basados en vectores víricos. Estos sistemas están
normalmente sometidos a la silenciación
post-transcripcional de genes (PTGS) (Angell y
Baulcombe, 1997, EMBO J., 16,
3675-3684). La utilización de supresores de PTGS es
necesaria para solventar tal silenciación (WO0138512). Requiere
realizar cruces entre plantas portadoras del amplicón silenciado y
plantas portadoras de la fuente del supresor de PTGS (Mallory y
col., 2002, Nature Biotechnol., 20,
622-625) para conseguir la producción a gran escala
de una proteína de interés con la ayuda de tal sistema.
Evidentemente, tal sistema no tiene un control flexible y estrecho
sobre la expresión del transgén y está limitado a la producción de
proteínas que no comprometan el crecimiento ni el desarrollo de la
planta.
Nuestro procedimiento permite solventar las
limitaciones de los sistemas de vectores víricos anteriormente
descritos, específicamente su capacidad limitada por el tamaño del
gen que va a ser expresado y la falta de flexibilidad para
controlar la expresión. En nuestra invención, el precursor del
vector vírico (o provector) está presente preferiblemente en cada
célula de la planta transgénica. En el caso de la expresión de genes
grandes (mayores de 1 kb), se prefiere el movimiento del
interruptor proteico al movimiento del vector vírico. Los vectores
víricos pueden amplificarse eficazmente en células y el tamaño del
inserto de un vector vírico afecta principalmente a la capacidad de
movimiento célula a célula y de movimiento sistémico. Por tanto, la
provisión de un interruptor proteico capaz de activar un vector
vírico movible a muchas células o incluso a todas las células de la
planta huésped, solucionará el problema anteriormente mencionado.
Adicionalmente, para proporcionar a un sistema una función de
interruptor eficaz que sea capaz de activar la amplificación de tal
vector vírico en la mayor parte de las células, si no en todas, de
la planta huésped, se utilizan en la presente invención
interruptores proteicos capaces de movimiento célula a
célula/sistémico.
Para este fin, el interruptor proteico puede
contener una porción proteica que haga que dicha proteína sea capaz
de movimiento célula a célula y/o sistémico. Ejemplos de tales
porciones proteicas capaces de moverse intercelularmente son
conocidos en la técnica anterior. Existen pruebas de que factores de
transcripción de plantas, proteínas relacionadas con la defensa y
proteínas víricas pueden moverse a través de los plasmodesmos (para
una revisión ver: Jackson y Hake, 1997, Curr. Opin. Genet.
Dev., 7, 495-500; Ding, B., 1998,
Plant Mol. Biol., 38, 279-310;
Jorgensen, R.A., 2000, Sci. STKE, 58, PE2; Golz y
Hudson, 2002, Plant Cell, 14,
S277-S288). Se demostró que la fusión de una
proteína de movimiento 3a del virus del mosaico del pepino con GFP
puede moverse hacia las células vecinas a través de los plasmodesmos
(Itaya y col., 2002, Plant Cell, 14,
2071-2083). Tal fusión mostró también movimiento a
través del floema desde el rizoma transgénico al vástago no
transgénico. La proteína de movimiento del virus del mosaico del
tabaco (TMV), P30, se mueve entre las células a través de los
plasmodesmos y, al influir sobre el tamaño de los plasmodesmos,
facilita el movimiento de muchas otras macromoléculas grandes no
especificadas para tal movimiento (Citovsky y col., 1999, Phil.
Trans. R. Soc. London B Biol. Sci., 354,
637-643; Ding, Itaya y Woo, 1999, Int. Rev.
Cytol., 190, 251-316). La fusión P30:GFP
mostró movimiento entre las células independientemente de las
condiciones fisiológicas, mientras que la difusión no vectorizada
de GFP a través de los plasmodesmos depende en gran parte del
estado fisiológico de las células de la planta (Crawford y
Zambryski, 2001, Plant Physiol., 125,
1802-1812). La fusión de GFP con el factor de
transcripción knotted 1 mostró también capacidad de movimiento
intercelular. La proteína de fusión GFP:KN1 demostró movimiento
desde los tejidos internos de la hoja hacia la epidermis, entre
células epidérmicas y hacia el meristemo apical de los brotes de la
planta del tabaco (Kim y col., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 99, 4103-4108). Los plasmodesmos
desempeñan una función importante en tal movimiento y su estado
fisiológico y su estructura son importantes para la eficacia de tal
movimiento. Por ejemplo, los plasmodesmos simples permiten el
tráfico no específico de proteínas en hojas de tabaco en
desarrollo, mientras que los ramificados no lo permiten (Oparka y
col., 1999, Cell, 98, 5-8). El
permitir el tráfico de macromoléculas, incluyendo proteínas, parece
ser una función normal de los plasmodesmos que ha sido utilizada
por los virus de las plantas para su propagación célula a célula
(Fujiwara y col., 1993, Plant Cell, 5,
1783-1794). En general, es evidente que los
plasmodesmos y el floema desempeñan una función importante en el
transporte y el suministro de macromoléculas de información
(proteínas y ácidos nucleicos) (Ruiz-Medrano y
col., 2001, Curr. Opin. Plant Biol., 4,
202-209). Las proteínas de la savia del floema de
Cucurbita maxima y Ricinum communis tienen la
capacidad de moverse célula a célula a través de los plasmodesmos
(Balachandran y col., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
94, 14150-14155).
La Figura 8 muestra esquemáticamente las
posibilidades para conseguir el movimiento intercelular del
interruptor proteico de la invención. Un fragmento del interruptor
proteico suministrado externamente (esto es, dicho segundo
polipéptido) y el interruptor proteico sintetizado en una célula
pueden ser fusiones de los mismos o de diferentes segmentos
proteicos para señales de translocación o movimiento. En nuestro
ejemplo (Fig. 8) el mismo segmento proteico, por ejemplo una
recombinasa o un fragmento de la misma, es fusionado con un
fragmento de inteína para mediar el ayuste en trans o con una
porción proteica (TP) que proporciona el movimiento intercelular.
Es muy probable que con proteínas pequeñas (como GFP y más
pequeñas), la fusión con TP pueda no ser necesaria, ya que pueden
ser capaces de un movimiento célula a célula muy eficaz mediante
difusión simple. Sin embargo, para interruptores proteicos más
grandes, la fusión con una TP o con un fragmento activo de la misma
es ventajosa. Es evidente que entre todas las proteínas implicadas
en el movimiento intercelular, las proteínas víricas son las mejor
estudiadas. Son los candidatos más preferidos para ser incluidos en
un interruptor proteico. Según está mostrado en la Fig. 8, un
fragmento de un interruptor proteico suministrado externamente,
después de la complementación funcional por el fragmento
intracelular del interruptor proteico, desencadena la expresión de
un transgén que codifica un interruptor proteico que tiene la misma
actividad enzimática pero que es capaz de moverse intercelularmente
(recombinasa:TP). Dicho interruptor proteico capaz de moverse
desencadena la expresión del interruptor proteico en todas las
células afectadas, lo cual representa una reacción en cadena. La
disponibilidad de tal interruptor proteico en la célula es un
prerrequisito para desencadenar la expresión de un gen de interés
(GOI) en las células mediante reordenación del ADN, produciendo la
formación de un amplicón basado en el vector vírico. El tamaño del
gen de interés expresado a partir de tal amplicón no es un factor
limitante para la expresión eficaz del GOI, ya que la estabilidad
del amplicón y el movimiento célula a célula no son necesarios en
este sistema: el provector vírico puede estar presente en cada
célula de la planta y la propagación del interruptor proteico puede
desencadenar la expresión del gen de interés en cada una de
estas células. Preferiblemente, sin embargo, la propagación del amplicón contribuye a una expresión eficaz del GOI.
estas células. Preferiblemente, sin embargo, la propagación del amplicón contribuye a una expresión eficaz del GOI.
El fin último del sistema del interruptor
proteico contemplado en la presente es el control operativo de un
proceso celular de interés o de una cascada de reacciones
bioquímicas de interés en el sistema de producción de una planta.
Una cascada bioquímica es una cadena de reacciones bioquímicas en un
sistema de producción del huésped que finalmente da lugar a un
producto, un efecto o un rasgo de interés específico.
Los procedimientos descritos en la presente,
además de ser versátiles y a prueba de escapes, proporcionan un
método eficaz de control de la producción. El proceso de dos
componentes anteriormente descrito es en esencia un sistema de
"llave-cerradura", mediante el cual una
compañía puede controlar eficazmente el acceso a la producción
vendiendo el componente interruptor proteico.
Las plantas preferidas para ser utilizadas en
esta invención incluyen cualquier especie de planta, dándose
preferencia a las especies importantes desde el punto de vista
agronómico y hortícola. Las plantas de cultivo comunes para ser
utilizadas en la presente invención incluyen alfalfa, cebada,
alubias, cánola, arveja de vaca, algodón, maíz, trébol, loto,
lentejas, lupino, mijo, avena, guisantes, cacahuetes, arroz,
centeno, trébol dulce, girasol, guisante de olor, soja, sorgo
triticale, judías de ñame, judías terciopelo, arveja, trigo,
glicina y plantas de nuez. Las especies de plantas preferidas para
la práctica de esta invención incluyen, pero no se limitan a:
especies representativas de Gramineae, Compositeae,
Solanaceae y Rosaceae.
Adicionalmente, las especies preferidas para ser
utilizadas en la invención, además de las especificadas
anteriormente, son plantas de los géneros: Arabidopsis,
Agrostis, Allium, Antirrhinum, Apium, Arachis, Asparagus, Atropa,
Avena, Bambusa, Brassica, Bromus, Browaalia, Camellia, Cannabis,
Capsicum, Cicer, Chenopodium, Chichorium, Citrus, Coffea, Coix,
Cucumis, Cucurbita, Cynodon, Dactylis, Datura, Daucus, Digitalis,
Dioscorea, Elaeis, Eleusine, Festuca, Fragaria, Geranium, Glycine,
Helianthus, Heterocallis, Hevea, Hordeum, Hyoscyamus, Ipomoea,
Lactuca, Lens, Lilium, Linum, Lolium, Lotus, Lycopersicon, Majorana,
Malus, Mangifera, Manihot, Medicago, Nemesia, Nicotiana,
Onobrychis, Oryza, Panicum, Pelargonium, Pennisetum, Petunia, Pisum,
Phaseolus, Phleum, Poa, Prunus, Ranunculus, Raphanus, Ribes,
Ricinus, Rubus, Saccharum, Salpiglossis, Secale, Senecio, Setaria,
Sinapis, Solanum, Sorghum, Stenotaphrum, Theobroma, Trifolium,
Trigonella, Triticum, Vicia, Vigna, Vitis, Zea y las
Olyreae, las Pharoideae y muchas otras.
Dentro del ámbito de esta invención, las
especies de plantas que no están incluidas en las cadenas de
alimentos o piensos son preferidas específicamente para la
producción de proteínas farmacéuticas y técnicas. Entre ellas, las
especies de Nicotiana son las más preferidas, ya que estas
especies son fáciles de transformar y cultivar con sistemas de
vectores de expresión bien desarrollados (especialmente vectores
víricos).
Los genes de interés, sus fragmentos
(funcionales o no funcionales) y sus derivados artificiales que
pueden ser expresados como el proceso celular de interés y aislados
utilizando la presente invención incluyen, pero no se limitan a:
enzimas modificadores del almidón (sintasa de almidón, enzima de
fosforilación del almidón, enzima desrramificador del almidón,
enzima ramificador del almidón, enzima ramificador del almidón II,
sintasa del almidón unida a los gránulos), sintasa de fosfaro de
sacarosa, fosforilasa de sacarosa, poligalactouronasa, polifructán
sucrasa, ADP glucosa pirofosforilasa, ciclodextrin
glucosiltransferasa, fructosil transferasa, sintasa de glucógeno,
esterasa de pectina, aprotinina, avidina, levansucrasa bacteriana,
proteína gIgA de E. coli, MAPK4 y ortólogos, enzima de
asimilación/metabolismo del nitrógeno, sintasa de glutamina,
osmotina vegetal, albúmina 2S, taumatina, recombinasa específica de
sitio/integrasa (FLP, Cre, recombinasa R, Int, Integrasa R de SSVI,
Integrasa phiC31, o un fragmento activo o variante de las mismas),
isopentenil transferasa, Sca M5 (calmodulina de soja), toxina de
tipo coleóptero o un fragmento insecticidamente activo, proteínas
de fusión del enzima de conjugación de ubiquitina (E2), enzimas que
metabolizan lípidos, aminoácidos, azúcares, ácidos nucleicos y
polisacáridos, superóxido dismutasa, forma proenzimática inactiva de
una proteasa, toxinas proteicas de plantas, rasgos que alteran la
fibra en las plantas productoras de fibra, toxina activa frente a
coleópteros de Bacillus thuringiensis (toxina Bt2, proteína
cristalina insecticida (ICP), toxina CryIC, endotoxina delta,
toxina polipeptídica, protoxina, etc.), toxina específica contra
insectos AaIT, enzimas que degradan celulosa, celulasa E1 de
Acidothermus celluloticus, enzimas modificadoras de lignina,
cinamoil alcohol deshidrogenasa, sintasa de
trehalosa-6-fosfato, enzimas de la
ruta metabólica de citoquininas, HMG-CoA reductasa,
pirofosfatasa inorgánica de E. coli, proteína de
almacenamiento de las semillas, sintasa de licopeno de Erwinia
herbicola, ACC oxidasa, proteína codificada por pTOM36, fitasa,
cetohidrolasa, acetoacetil CoA reductasa, sintasa de PHB
(polihidroxibutanoato), proteína transportadora de acilo, napina,
EA9, sintasa de fitoeno de plantas no superiores, proteína
codificada por pTOM5, ETR (receptor de etileno), piruvato fosfato
diquinasa plastídica, proteína de los poros transmembranales
inducible por nematodos, rasgo que incrementa la función
fotosintética o plastídica de la célula vegetal, sintasa de
estilbeno, un enzima capaz de hidroxilar fenoles, catecol
dioxigenasa, catecol 2,3-dioxigenasa, cloromuconato
cicloisomerasa, sintasa de antranilato, proteína AGL15 de
Brassica, fructosa 1,6-bifosfatasa (FBPasa),
RNA3 de AMV, replicasa de PVY, replicasa de PLRV, proteína de
revestimiento de potivirus, proteína de revestimiento de CMV,
proteína de revestimiento de TMV, replicasa de luteovirus, ARN
mensajero de MDMV, replicasa geminivírica mutante,
acil-ACP tioestererasa con preferencia por C12:0 de
Umbellularia californica, acil-ACP
tioesterasa de plantas con preferencia por C10 o C12:0,
acil-ACP tioesterasa con preferencia por C14:0
(luxD), factor A de la sintasa vegetal, factor B de la sintasa
vegetal, D6-desaturasa, proteína con actividad
enzimática en la b-oxidación peroxisómica de los
ácidos grasos en las células vegetales, acil-CoA
oxidasa, 3-cetoacil-CoA tiolasa,
lipasa, acetil-CoA carboxilasa del maíz, sintasa de
5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato
(EPSP), fosfinotricin acetil transferasa (BAR, PAT), proteína CP4,
ACC desaminasa, proteína con un sitio de corte
post-traduccional, gen DHPS que confiere resistencia
a sulfonamidas, nitrilasa bacteriana,
2,4-D-monooxigenasa, sintasa de
acetolactato o sintasa de acetohidroxiácido (ALS, AHAS),
poligalactouronasa, polimerasa Taq, nitrilasa bacteriana, muchos
otros enzimas de bacterias o fagos incluyendo endonucleasas de
restricción, metilasas, ADN y ARN ligasas, ADN y ARN polimerasas,
transcriptasas inversas, nucleasas (ADNasas y ARNasas), fosfatasas,
transferasas, etc.
Nuestra invención puede ser utilizada también
con el fin de producción y purificación molecular de proteínas
comercialmente valiosas y farmacéuticamente importantes, incluyendo
enzimas industriales (celulasas, lipasas, proteasas, fitasas, etc.)
y proteínas fibrosas (colágeno, proteína de la seda de araña, etc.).
Cualquier proteína para la salud humana o animal puede ser
expresada y purificada utilizando los métodos descritos en nuestro
abordaje de la invención. Ejemplos de tales proteínas de interés
incluyen, inter alia, proteínas de la respuesta inmune
(anticuerpos monoclonales, anticuerpos de una sola cadena,
receptores de células T, etc.), antígenos incluyendo los derivados
de microorganismos patógenos, factores estimulantes de colonias,
relaxinas, hormonas polipeptídicas incluyendo somatotropina (HGH) y
proinsulina, citoquinas y sus receptores, interferones, factores de
crecimiento y factores de coagulación, enzima lisosómico
enzimáticamente activo, polipéptidos fibrinolíticos, factores de
coagulación de la sangre, tripsinógeno,
a1-antitripsina (AAT), seroalbúmina humana,
glucocerebrosidasas, toxina B colérica nativa, así como proteínas
conservadoras de la función como fusiones, versiones mutantes y
derivados sintéticos de las proteínas anteriores.
DE 102 54 166 y DE 102 54 165 y las solicitudes
de patente PCT derivadas de las mismas, publicadas como
WO2004/046360 y WO2004/046361, respectivamente, contienen ejemplos
y descripciones adicionales que están relacionados con la presente
invención.
El extremo 5' del gen GUS fue amplificado por
PCR utilizando los cebadores gusint5 (atg gaa gca gta ctc gac gtc
gcc taa aga gag gtt a) y guspr3 (ggc ctg tgg gca ttc agt ctg) a
partir del plásmido pICBV33 (35S-líder de
omega-secuencia codificadora de
gus-terminador de nos en el vector binario pICBV2 de
Icon Genetics (Fig. 9)). El extremo 3' del gen GUS fue amplificado
por PCR utilizando los cebadores gusint6 (gtc gag tac tgc ttc cat
ggc aaa gaa ctg tac agc g) y nosterrev (tca tcg caa gac cgg caa cag
g) a partir del plásmido pICBV33 (Fig. 9). Estos fragmentos fueron
combinados y se llevó a cabo una segunda amplificación por PCR
utilizando los cebadores guspr3 y nosterrev. El producto de esta
PCR fue digerido con BspHI y XbaI y clonado en pICBV33 teniendo
como resultado el plásmido pICH8983 (Anexo 2). En este plásmido, los
aminoácidos nativos Ile370 - Pro376 fueron sustituidos por la
secuencia
Asp-Val-Glu-Tyr-Cys-Phe-His-Gly
derivada de DnaE de Synechocystis, se introdujeron uniones
exteína-inteína y sitios de AatII y NcoI al
principio y al final de esta modificación, respectivamente.
Un fragmento de ADN que contenía el extremo
N-terminal de la inteína DnaE de
Synechocystis fue amplificado por PCR a partir de ADN
genómico (Cepa PCC6803 del American Type Culture Center) utilizando
los cebadores intNpr1 (gc aagctt gacgtc aag ttt gcg gaa tat tgc ctc
agt) e intNpr2 (tcc ctgcag tta ttt aat tgt ccc agc gtc aag). El
producto de la PCR fue clonado como un fragmento
HindIII-PstI en pUC19, teniendo como resultado el
plásmido pICH8901. La parte C-terminal de la inteína
fue amplificada utilizando los cebadores intCpr1 (gg tctaga atcgat
g gtt aaa gtt atc ggt cgt cg) e intCpr2 (cg ctgcag ccatgg tt aaa aca
att ggc ggc gat cgc) y fue clonada como un fragmento
PstI-XbaI en pUC19 (pICH8912, ver la Fig. 11).
La fusión de la N-inteína a la
parte 5' del gen GUS fue realizada mediante el clonaje del fragmento
AatII-XbaI de pICH8901 en pICH8983 (Fig. 10) dando
el plásmido pICH9303 (Fig. 5). La C-inteína fue
fusionada a la parte 3' de GUS como un fragmento
ClaI-NcoI, teniendo como resultado el plásmido
pICH9311 (Fig. 5). Ambas construcciones fueron coexpresadas de
manera transitoria en hojas de Nicotiana benthamiana
utilizando expresión transitoria mediada por Agrobacterium
(Vaquero y col., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96,
11128-11133). La expresión de gus fue detectada
mediante tinción de las hojas con una solución que contenía el
sustrato cromogénico X-gluc
(5-bromo-4-cloro-3-indolil
glucurónido) (Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep.,
5, 387-405). El color azul indicaba que la
actividad GUS era visible únicamente cuando se coexpresaban ambas
construcciones, pero no cuando las construcciones se expresaban
individualmente.
La división del gen GUS y la fusión con la
inteína DnaE dividida de Synechocystis se llevaron a cabo
según se describió anteriormente. Se introdujo un sitio de XhoI
precediendo al codón de parada en la fusión
inteínaC-GUS3' en pICH9723 (Anexo 3). Se sintetizó
el ADN que codificaba los 37 aminoácidos
C-terminales de la proteína virF de
Agrobacterium tumefaciens utilizando los dos oligos
solapantes virFpr3 (gct ctc gag gtt atg gca gaa gtt cgg ccc ata gcc
cga tcc att aaa acg gct cac gac gat gcg cga gcg ga) y virFpr4 (cac
gga tcc tca tag acc gcg cgt tga tcg agg tct gtc cgc cga cat taa ttc
cgc tcg cgc atc gtc gtg ag). El fragmento fue digerido con
XhoI-BamHI y ligado en marco a la fusión
inteínaC-GUS3', teniendo como resultado el plásmido
pICH10181.
El fragmento HindIII (romo)-XbaI
de pICH10181 (Fig. 6) (prom de 35S
inteínaC-GUS3'-virF) fue clonado en
XhoI (romo)-XbaI de pICBV12 (Fig. 9), teniendo como
resultado el plásmido pICH10655 (Fig. 6), un vector binario pequeño
que no contiene ninguna secuencia de ADN-T. Lo mismo
se realizó para la inteínaC-GUS3' sin secuencias de
virF como control negativo (pICH10666, ver la Fig. 6).
Los pICH10655 (Fig. 6) y pICH10666 fueron
transformados mediante electroporación en la cepa de
Agrobacterium GV3101. Ambas construcciones fueron
agroinfiltradas en hojas de Nicotiana benthamiana (Vaquero y
col., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96,
11128-11133) junto con pICH9303 (prom de 35S
GUS5'-inteínaN terminador de nos entre los límites
del ADN-T, ver la Fig. 6). Por tanto, el resto
GUS5'-inteínaN es suministrado como ADN y es
expresado en la célula vegetal y el resto
inteínaC-GUS3'-virF es suministrado
como proteína. El ayuste de la proteína mediado por inteína tiene
lugar en la célula vegetal y reconstituye un enzima GUS funcional.
La expresión de GUS fue detectada mediante tinción de las hojas con
una solución que contenía el sustrato cromogénico
X-gluc
(5-bromo-4-cloro-3-indolil
glucurónido) (Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep.,
5, 387-405). El color azul indicaba que la
actividad GUS era visible únicamente cuando ambas construcciones 5'-
y 3'-GUS eran coinfiltradas, pero no cuando las
construcciones eran expresadas individualmente o cuando se utilizó
la construcción control negativo (pICH10666).
El vector binario pICHFPinv (Fig. 7) portador de
ADN-T con dos partes de provectores fue diseñado
utilizando técnicas estándar de biología molecular (Maniatis y
col., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring
Harbor Laboratory, New York). La descripción de elementos
provectores y los principios básicos de su construcción y
funcionamiento están descritos con detalle en las solicitudes de
patente PCT/EP02/03476 (WO0288369) y en DE 101 21 283. El vector
lleva un marcador de la transformación (gen NPTII), el extremo 5' de
TMV precedido por el promotor vegetal del gen de la actina 2 de
Arabidopsis (An y col., 1996, Plant J., 10,
107-121) y contiene una ARN polimerasa dependiente
de ARN (RdRp) y una proteína de movimiento (MP) seguida por un
promotor subgenómico. El vector contiene también el extremo 3' del
provector que contiene un gen de interés (GFP), la proteína de
revestimiento (CP) vírica que proporciona el movimiento sistémico y
la región 3' no traducida del vector vírico (3'NTR). El provector
3' junto con dos señales de terminación de la transcripción está
flanqueado por sitios de recombinación reconocidos por la integrasa
del fago phiC31 (Thomason, Calendar y Ow, 2001, Mol. Genet.
Genomics, 265, 1031-1038).
La integrasa phiC31 fue dividida en dos partes
en la posición de la primera cisteína y fusionada a partes de la
inteína DnaE. Un sitio de inserción de la inteína que introducía dos
sitios de BsaI con diferentes salientes fue clonado en la integrasa
de una construcción original (Thomason, Calendar y Ow, 2001, Mol.
Genet. Genomics, 265, 1031-1038) por PCR
precediendo inmediatamente al codón para la Cys-405.
Los sitios de BsaI correspondientes fueron también introducidos en
la inteína-N DnaE (Fig. 10) y en la
inteína-C (Fig. 11). La inteína-N
fue fusionada a la integrasa-N como un fragmento
BsaI-BamHI (pICH15085, Fig. 12) y la
inteína-C fue fusionada a la
integrasa-C como un fragmento
SmaI-BsaI en PstI (hecho romo con polimerasa de
T4)-BsaI (pICH15099, Fig. 12).
El operón virE completo de A. tumefaciens
cepa GV3101 (Nº de Acceso del Gene Bank 003065) fue amplificado por
PCR y clonado como un fragmento XhoI-XbaI en pICBV39
(Fig. 9), un vector binario sin secuencias limítrofes, impidiendo
así la transferencia de ADN (construcción pICH15530). Se
introdujeron sitios de restricción para el clonaje de la integrasa
dividida al mismo tiempo en el inicio (NcoI) y cerca del extremo
(BsrGI) de virE2. Se introdujeron también mediante PCR los sitios
de restricción correspondientes en ambas partes de las
construcciones integrasa dividida-inteína. Las
partes de la integrasa dividida fueron clonadas en este vector dando
lugar a una fusión con los 47 aminoácidos
C-terminales de la proteína virE2 que son necesarios
para la transferencia de la proteína.
La secuencia de la región de
ADN-T de otro vector, pICH10921 (Fig. 13), utilizada
en los experimentos, está mostrada en el ANEXO 1 como SEC ID
Nº:1.
Se obtuvieron plantas transgénicas de
Nicotiana benthamiana y N. tabacum que contenían el
ADN-T de pICHGFPinv, pICH10921 y
pICH15085-INT mediante transformación mediada por
Agrobacterium de discos de hoja, según está descrito por
Horsch y col. (1985, Science, 227,
129-131). Discos de hoja fueron incubados durante
30 minutos con la cepa de Agrobacterium GV3101 transformada
con la construcción pICH1754. Después de tres días de incubación en
medio (medio MS, 0,1 mg/l de NAA, 1 mg/l de BAP) sin agente
selectivo, se llevó a cabo la selección de los transformantes en el
mismo medio MS suplementado con 100 mg/l de kanamicina. Con el fin
de reducir el crecimiento de Agrobacterium, el medio fue
suplementado también con 300 mg/l de carbenicilina y 300 mg/l de
cefataxima. Los regenerantes fueron incubados en medio MS selectivo
sin hormonas suplementado con la misma concentración de los agentes
selectivos con el fin de inducir la producción de raíces. La
presencia del transgén en las poblaciones T2 segregantes fue
confirmada mediante análisis por PCR.
La exposición de las hojas de las plantas
transgénicas a integrasa permeable a las células produce la
recombinación específica de sitio entre los sitios de attP y attB.
Tal recombinación conduce a la reversión del provector 3', creando
así un ADNc completo de un amplicón vírico bajo el control del
promotor de la actina 2 (Fig. 7, B). El amplicón de ARN basado en
TMV que expresa GFP es capaz de movimiento célula a célula y de
movimiento sistémico. Las hojas de la progenie híbrida entre
plantas transgénicas transformadas con pICH10921 y pICH15099 fueron
infiltradas con agrobacterias portadoras de la construcción
pICH15085-INT. La expresión de GFP en plantas de
N. benthamiana puede ser detectada fácilmente utilizando una
lámpara UV o analizando el tejido de la planta bajo un sistema de
microcopio fluorescente estéreo de LEICA (excitación a
450-490 nm, emisión a 500-550 nm).
La GFPs utilizada en nuestros experimentos puede ser excitada por
luz azul y por luz UV.
ANEXO 1: SEC ID Nº 1: Secuencia de
ADN de la región del ADN-T del vector
pICH10921.
Claims (30)
1. Un método para controlar una planta o células
vegetales modificadas genéticamente, comprendiendo dicho método las
etapas siguientes:
- (a)
- la provisión de una planta modificada genéticamente o de células vegetales modificadas genéticamente, conteniendo dicha planta o dichas células vegetales un ácido nucleico heterólogo que codifica un primer polipéptido que contiene o que consta de un primer fragmento de una proteína,
- (b)
- la introducción de un segundo polipéptido en las células de dicha planta modificada genéticamente o en dichas células vegetales modificadas genéticamente de tal manera que no se introduzcan ácidos nucleicos que codifiquen dicho segundo polipéptido o una parte funcional del mismo, conteniendo dicho segundo polipéptido
- (i)
- un segundo fragmento de dicha proteína y
- (ii)
- una secuencia peptídica que permita la introducción de dicho segundo polipéptido en las células de dicha planta modificada genéticamente o en las células vegetales modificadas genéticamente,
por lo que dicho primer fragmento y dicho
segundo fragmento generan conjuntamente una función predeterminada
de dicha proteína únicamente cuando están presentes conjuntamente
y
por lo que las células de dicha planta contienen
un ácido nucleico heterólogo adicional que está controlado por
dicha función predeterminada.
2. El método de la reivindicación 1, en el que
una parte de dicho segundo polipéptido es funcional si es capaz de
generar dicha función predeterminada conjuntamente con dicho primer
polipéptido.
3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el
que dicha función predeterminada controla un proceso celular de
interés.
4. El método de la reivindicación 1, en el que
dicha función predeterminada da lugar a la formación de un ARN y/o
un producto de expresión proteico a partir de dicho ácido nucleico
heterólogo adicional.
5. El método de la reivindicación 1, en el que
dicha función predeterminada da lugar a la formación de un operón
expresable a partir de dicho ácido nucleico heterólogo adicional o a
partir de un producto de expresión del mismo.
6. El método de la reivindicación 1, en el que
dicha función predeterminada da lugar a la formación de un amplicón
expresable a partir de dicho ácido nucleico heterólogo adicional o a
partir de un producto de expresión del mismo.
7. El método de la reivindicación 1 ó 6, en el
que dicha función predeterminada de dicha proteína da lugar a la
formación de un amplicón de ADN o de ARN a partir de dicho ácido
nucleico heterólogo adicional, donde dicho amplicón tiene una o más
de las capacidades siguientes: replicación, expresión de proteínas,
movimiento célula a célula, movimiento sistémico, ensamblaje de
partículas infectivas, infectividad, supresión de la capacidad de
silenciación de genes vegetales, modificación de la condición
fisiológica de la planta.
8. El proceso de una de las reivindicaciones 1 a
7, en el que dicho ácido nucleico heterólogo adicional está
integrado de manera estable en el genoma nuclear o plastídico de
dicha planta o de dichas células vegetales.
9. El método de una de las reivindicaciones 1 a
8, en el que la generación de dicha función predeterminada de dicha
proteína incluye la interacción no covalente de dicho primer y dicho
segundo fragmento.
10. El método de la reivindicación 9, en el que
dicha interacción no covalente está facilitada por polipéptidos con
afinidad específica entre sí.
11. El método de la reivindicación 9, en el que
dicha interacción no covalente está facilitada por polipéptidos con
cremallera de leucina fusionados a dicho primer y a dicho segundo
fragmento.
12. El método de la reivindicación 9, en el que
dicha interacción no covalente está facilitada por polipéptidos
dimerizantes fusionados a dicho primer y a dicho segundo fragmento y
está regulada por moléculas dimerizantes tales como rapamicina o
análogos de rapamicina.
13. El método de una de las reivindicaciones 1 a
10, en el que la generación de dicha función predeterminada de
dicha proteína incluye la formación de enlaces covalentes entre
dicho primer y dicho segundo fragmento.
14. El método de la reivindicación 13, en el que
dicha formación de enlaces covalentes incluye la unión o el ayuste
en trans basados en inteína entre dicho primer y dicho segundo
fragmento.
15. El método de una de las reivindicaciones 1 a
14, en el que dicha secuencia peptídica del punto (b, ii) es o
contiene una secuencia de translocación membranal para facilitar la
introducción de dicho segundo polipéptido en dichas células
vegetales o en células de dicha planta modificada genéticamente.
16. El método de una de las reivindicaciones 1 a
14, en el que dicha introducción de dicho segundo polipéptido es
realizada utilizando un microorganismo patógeno que tenga un sistema
para la administración de un polipéptido a una célula huésped.
17. El método de la reivindicación 16, en el que
dicho microorganismo patógeno es un Agrobacterium virulento
o no virulento.
18. El método de la reivindicación 16, en el que
dicho microorganismo patógeno es fitopatógeno y es una bacteria
virulenta o no virulenta dotada con un sistema de secreción de tipo
III.
19. El método de la reivindicación 18, en el que
dicho microorganismo fitopatógeno es una bacteria virulenta o no
virulenta de uno de los géneros siguientes: Bordetella, Erwinia,
Pseudomonas, Xanthomonas, Yersinia,
20. El método de una de las reivindicaciones 1 a
19, en el que dicho segundo polipéptido contiene uno o más péptidos
de tránsito o señal para transferir dicho segundo polipéptido a
orgánulos de la célula seleccionados del grupo siguiente: núcleo,
plástidos, mitocondrias, sistema de Golgi, vacuolas.
21. El método de una de las reivindicaciones 1 a
20, en el que dicha función predeterminada de dicha proteína es
seleccionada del grupo siguiente: replicación de ADN, recombinación
de ADN, transcripción, recombinación de ARN, amplificación,
traducción.
22. El método de una de las reivindicaciones 1 a
21, en el que dicha proteína es capaz de moverse célula a célula o
de movimiento sistémico en dicha planta o en una parte de dicha
planta.
23. El método de la reivindicación 22, en el que
dicha proteína contiene un dominio de una proteína de movimiento
vírica, un dominio de una proteína de revestimiento vírica o un
dominio de un factor de transcripción vegetal o animal capaz de
movimiento célula a célula o sistémico.
24. El método de la reivindicación 23, en el que
dicho dominio capaz de movimiento célula a célula o sistémico es un
polipéptido diseñado artificialmente.
25. El método de una de las reivindicaciones 1 a
24, en el que dicha planta proporcionada en la etapa (a) es una
planta transgénica que contiene dicho ácido nucleico heterólogo
integrado de manera estable en el genoma nuclear de las
células.
26. El método de una de las reivindicaciones 1 a
24, en el que dicha planta proporcionada en la etapa (a) es una
planta transgénica que contiene dicho ácido nucleico heterólogo
integrado de manera estable en el genoma plastídico de las
células.
27. El método de una de las reivindicaciones 1 a
24, en el que las células de dicha planta proporcionada en la etapa
(a) son transformadas de manera transitoria con dicho ácido nucleico
heterólogo.
28. Una planta o células vegetales modificadas
genéticamente que contienen un ácido nucleico heterólogo que
codifica un primer polipéptido que contiene o que consta de un
primer fragmento de una proteína, donde dicha planta o dichas
células vegetales modificadas genéticamente contiene(n) un
segundo polipéptido que contiene (i) un segundo fragmento de dicha
proteína y (ii) una secuencia peptídica que facilita la introducción
de dicho segundo polipéptido en las células de dicha planta
modificada genéticamente o en las células vegetales modificadas
genéticamente;
por lo que dicho primer fragmento y dicho
segundo fragmento generan conjuntamente una función predeterminada
de dicha proteína únicamente cuando dicho primer y dicho segundo
fragmento están presentes conjuntamente;
no teniendo dicha planta o dichas células
vegetales ácidos nucleicos que codifiquen dicho segundo polipéptido
o una parte funcional del mismo; y
donde dicha planta o dichas células vegetales
modificadas genéticamente contiene(n) además un ácido
nucleico heterólogo adicional que está controlado por dicha función
predeterminada.
29. Un sistema para controlar una planta o
células vegetales modificadas genéticamente, que comprende
- (i)
- una planta o células vegetales modificadas genéticamente que contienen un ácido nucleico heterólogo que codifica un primer polipéptido que contiene o que consta de un primer fragmento de una proteína, conteniendo además dicha planta o dichas células vegetales modificadas genéticamente un ácido nucleico heterólogo adicional, y
- (ii)
- una composición que contiene un segundo polipéptido que contiene un segundo fragmento de dicha proteína y una secuencia peptídica que permite la introducción de dicho segundo polipéptido en las células de dicha planta modificada genéticamente o en las células vegetales modificadas genéticamente, no conteniendo dicha composición ácidos nucleicos que codifiquen dicho segundo polipéptido o una parte funcional del mismo;
por lo que dicha planta o dichas células
vegetales modificadas genéticamente y dicho segundo polipéptido
están diseñados de tal manera que dicho primer fragmento y dicho
segundo fragmento son capaces de generar conjuntamente una función
predeterminada de dicha proteína tras la inserción de dicho segundo
polipéptido en dicha planta o en dichas células vegetales; donde
dicho ácido nucleico heterólogo adicional está controlado por dicha
función predeterminada.
30. Un sistema para controlar una planta o
células vegetales modificadas genéticamente, que comprende
- (i)
- una planta o células vegetales modificadas genéticamente que contienen un ácido nucleico heterólogo que codifica un primer polipéptido que contiene o que consta de un primer fragmento de una proteína, conteniendo además dicha planta o dichas células vegetales modificadas genéticamente un ácido nucleico heterólogo adicional, y
- (ii)
- un Agrobacterium patógeno que codifica en los ácidos nucleicos del mismo un segundo polipéptido que contiene un segundo fragmento de dicha proteína y una secuencia peptídica que permite la introducción de dicho segundo polipéptido en las células de dicha planta modificada genéticamente o en las células vegetales modificadas genéticamente, por lo que dicho segundo polipéptido no está codificado en el ADN-T de un plásmido Ti del Agrobacterium;
por lo que dicha planta o dichas células
vegetales modificadas genéticamente y dicho segundo polipéptido
están diseñados de tal manera que dicho primer fragmento y dicho
segundo fragmento son capaces de generar conjuntamente una función
predeterminada de dicha proteína tras la inserción de dicho segundo
polipéptido en dicha planta o en dichas células vegetales; donde
dicho ácido nucleico heterólogo adicional está controlado por dicha
función predeterminada.
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