ES2346224T3 - Sistema de expresion de planta derivado de virus de arn. - Google Patents
Sistema de expresion de planta derivado de virus de arn. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2346224T3 ES2346224T3 ES04797791T ES04797791T ES2346224T3 ES 2346224 T3 ES2346224 T3 ES 2346224T3 ES 04797791 T ES04797791 T ES 04797791T ES 04797791 T ES04797791 T ES 04797791T ES 2346224 T3 ES2346224 T3 ES 2346224T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- plant
- rna
- sequence
- replicon
- sequences
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8203—Virus mediated transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
Una planta, parte de planta o cultivo de células de planta, transformada de manera estable, que contiene en el núcleo de la célula un ADN heterólogo que tiene una secuencia que codifica un replicón de ARN unido operativamente a un promotor de la transcripción, en el que la secuencia que codifica un replicón de ARN contiene: (i) secuencias para la función de replicón del replicón de ARN, codificando dichas secuencias una ARN polimerasa dependiente de ARN y derivándose de una secuencia de virus de ARN de planta, y (ii) una secuencia de interés para expresarse a partir de ese replicón de ARN, comprendiendo dichas secuencias, para la función de replicón, cerca o dentro de ubicaciones ricas en A/U de dichas secuencias para la función del replicón, la inserción de uno o más intrones nucleares, siendo las ubicaciones ricas en A/U segmentos de secuencia de al menos 20 nucleótidos de longitud con al menos el 55% de contenido en A/U o segmentos de secuencia de 6-19 nucleótidos en una hilera de secuencias que únicamente contienen A/U.
Description
Sistema de expresión de planta derivado de virus
de ARN.
La presente invención se refiere a plantas,
partes de plantas o cultivos de células de plantas que tienen un
ADN heterólogo que codifica un replicón de ARN para expresar una
secuencia de interés. La invención también proporciona un proceso
para expresar una secuencia de interés en plantas, partes de plantas
o cultivos de células de plantas. El proceso y los vectores
proporcionan las células de planta con una frecuencia aumentada de
formación de ARN de replicón de ARN derivado de virus. Este ADN
heterólogo o parte (partes) del mismo puede incorporarse de manera
estable en el ADN cromosomal o episomal nuclear de la planta o
suministrarse de manera transitoria. La invención también
proporciona procesos de transformación de plantas mediados por
Agrobacterium con vectores virales (ARN) o replicones virales
(ARN).
Entre los sistemas de expresión de transgénicos
de planta, la expresión de un transgénico bajo el control de un
promotor heterólogo ha estado en uso durante varios años. Aparte de
esos sistemas de expresión de planta convencionales, pueden usarse
los sistemas de expresión basados en virus para la producción rápida
de proteína en plantas (para repaso, ver: Porta & Lomonossoff,
1996, Mol. Biotechnol., 5, 209-221; Yusibov
et al., 1999, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 240,
81-94) y son una herramienta poderosa para los
estudios de genómicos funcionales (Dalmay et al., 2000,
Plant Cell, 12, 369-379; Ratcliff et
al., 2001, Plant J., 25, 237-245;
Escobar et al., 2003, Plant Cell, 15,
1507-1523). Numerosas publicaciones y Patentes en
el campo describen sistemas basados en vectores virales de ADN y ARN
(Kumagai et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
90, 427-430; Mallory et al., 2002, Nature
Biotechnol. 20, 622-625; Mor et al.,
2003, Biotechnol. Bioeng., 81, 430-437;
US5316931; US5589367; US5966785; US5491076; US5977438; US981236;
WO02088369; WO02097080; WO9854342). Los sistemas existentes de
vector viral están usualmente restringidos a un estrecho rango de
huésped en términos de su mejor desempeño y aún del nivel de
expresión de esos vectores en su huésped más favorable está muy por
debajo de los límites biológicos superiores del sistema. Una
cuestión importante de los sistemas basados en virus es el método
de suministro del replicón viral a una célula de planta. El método
más ampliamente aplicado de suministro para la producción a gran
escala (producción simultánea en diversas plantas, por ejemplo, en
un terreno de granja o un invernadero) es el uso de copias
infecciosas de vectores virales de ARN (Kumagai et al.,
1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92,
1679-1683). Debido a una tendencia relativamente
alta de los vectores recombinantes de ARN viral para perder los
insertos heterólogos durante los ciclos de su replicación, el
método requiere la transcripción in vitro de moldes de ADN, y
como resultado es ineficaz y costoso. Otro enfoque para resolver el
problema del suministro podría ser la presencia de un precursor de
replicón de ARN viral en cada célula de una planta transgénica, de
modo que pudiera liberarse al activar el proceso de replicación
complementando una función del vector viral (por ejemplo usando un
virus auxiliar - Patente US5965794) o usando otros sistemas de
intercambio regulados (por ejemplo la recombinación específica en
sitio - Patente US6632980).
A pesar de las muchas publicaciones en el campo
que incluyen tecnologías patentadas, aún no hay sistemas de
producción a gran escala basados en virus que funcionen con eficacia
suficiente y rindan para la producción comercial de alto
rendimiento, predominantemente debido a dos razones principales:
- En primer lugar, los sistemas de expresión de plantas transitorias basados en virus generalmente se restringen a huéspedes específicos, que pueden no ser adecuados para el cultivo a gran escala debido a su susceptibilidad a los factores ambientales. Además, generalmente están restringidos a ciertas partes de un huésped de planta, excluyendo por lo tanto la mayoría de la biomasa de la planta del proceso de producción, y como resultado se minimiza la producción relativa del producto recombinante por unidad de biomasa de planta por debajo de un nivel comparable al que se logra con un promotor de transcripción convencional en una planta transgénica;
- En segundo lugar, los intentos para el cambio de escala del sistema de producción basado en virus a través de generar huéspedes de planta transgénicos que tengan el precursor de replicón viral establemente integrado en cada célula tampoco han proporcionado una solución, en particular debido al bajo desempeño de los replicones en esa posición, a la "escapatoria" del gen de interés para expresarse de ese replicón y a la falta de un sistema de intercambio eficaz para esos vectores. Se logró cierto progreso con los vectores basados en PVX usando supresores del silenciamiento de PTGS como activadores de la formación del replicón de ARN (Mallory et al., 2002, Nature Biotechnol., 20, 622-625), pero el sistema es todavía impráctico, ya que no se proporciona una solución para un control eficaz del intercambio (supresor de PTGS) que activa la replicación del vector viral. Sin embargo, este sistema proporcionó un nivel de expresión del gen GUS que alcanzó el 3% de la proteína soluble total (TSP, siglas en inglés), que es el mejor que se conoce hasta ahora para este tipo de sistema, pero que aún no es mejor que un sistema convencional de expresión transgénica bajo el control de un promotor fuerte. Otro sistema de inducción basado en un virus de planta de ARN tripartita (Mori et al., 2001, Plant J., 27, 79-86), el Virus del Mosaico del Bromo (BMV, siglas en inglés), dio una producción muy baja de la proteína de interés (3-4 \mug/g de peso fresco), que es comparable con las producciones proporcionadas por los promotores transcripcionales convencionales.
\newpage
Los bajos niveles de expresión hasta ahora
logrados con los sistemas de expresión de planta son una razón
principal del por qué estos sistemas son duramente competitivos con
otros sistemas de expresión como los sistemas de expresión de
células bacterianas, fúngicas o de insecto. Los niveles de expresión
bajos dan lugar a costes muy altos aguas abajo para el aislamiento
de la proteína y la purificación en un entorno amplio del material
de planta. Por lo tanto, los costes para el procesamiento aguas
abajo disminuyen rápidamente, a medida que se incrementa la
producción de la proteína o del producto de interés por unidad de
biomasa de planta.
Actualmente no hay un sistema de expresión
transgénica de planta a gran escala cuya producción y cuya eficacia
pudieran ser suficientemente altas como para competir en el mercado
con otros sistemas de expresión a gran escala tales como los
sistemas de expresión de células bacterianas, fúngicas o de insecto.
Una expresión de planta así debería cumplir lo mejor posible con los
siguientes criterios:
(i) alta producción, incluyendo la expresión de
la proteína de interés en tantos tejidos de planta como fuera
posible y en muchas células de esos tejidos.
(ii) para prevenir un efecto nocivo de la
expresión de la proteína en el crecimiento de la planta, la
expresión de la proteína o del producto de interés debería ser
intercambiable de modo que la expresión pueda ser intercambiada en
un punto deseado en el tiempo.
(iii) el intercambio debería ser tal que la
expresión pueda intercambiarse simultáneamente o casi
simultáneamente en todos los tejidos o células de una planta y, al
mismo tiempo, en todas las plantas de un grupo de plantas
seleccionado, por ejemplo, en todas las plantas de un lote de
plantas seleccionado. Típicamente, la proteína o el producto de
interés se acumula en cada célula que produce ese producto o
proteína hasta un cierto punto. Sin embargo, durante la acumulación
se establecen con frecuencia procesos degradantes que tienden a
reducir la producción o la calidad de la proteína o del producto de
interés. Por lo tanto, hay un punto óptimo en el tiempo después del
intercambio de la expresión, en el que el producto o la proteína de
interés debería recogerse. Este punto óptimo en el tiempo debería
alcanzarse al mismo tiempo en todos los tejidos o células de una
planta y en todas las plantas de un lote seleccionado, para hacer el
proceso general eficiente y provechoso.
Por lo tanto, un objetivo de la presente
invención es proporcionar una planta, parte de planta o cultivo de
célula de planta para un sistema de expresión de planta de alta
producción. Otro objetivo es el proporcionar un proceso para
expresar transitoriamente una secuencia de interés en una de planta,
parte de planta o cultivo de célula de planta. Otro objetivo de la
invención es el proporcionar un proceso eficaz para expresar una o
más secuencias de interés en una planta, parte de planta o cultivo
de célula de planta, por medio del cual el proceso pueda usarse con
eficacia a gran escala. Además, un objetivo de la invención es el
proporcionar un método para controlar la expresión de la
secuencia(o secuencias) de ácido nucleico de interés en una
planta, parte de planta o cultivo de célula de planta, que sea de
seguridad ecológica y biológica mejorada.
Los objetivos anteriores se logran transformado
una planta, parte de una planta o un cultivo de célula de planta
que contenga en el núcleo de la célula un ADN heterólogo con una
secuencia que codifique un replicón de ARN, estando esa secuencia
unida o pudiendo unirse operativamente a un promotor de
transcripción, en el que la secuencia que codifica un replicón de
ARN contiene:
(i) secuencias para la función de replicón de
ese replicón de ARN, procediendo esas secuencias de una secuencia de
un virus de ARN de planta, y
(ii) una secuencia de interés para expresarse a
partir de ese replicón de ARN,
por lo tanto las secuencias para la función del
replicón corresponden a las secuencias del virus de ARN de planta y
muestran en las posiciones seleccionadas de la secuencia del virus
de ARN de planta diferencias conservadoras de la función de la
secuencia del virus de ARN de planta. Esas diferencias pueden causar
una frecuencia incrementada de formación del replicón en comparación
con un replicón de ARN que no muestre esas diferencias.
Preferiblemente, la planta, parte de la planta o cultivo de célula
de planta se transforma de manera estable con el ADN heterólogo.
Además, los objetivos anteriores se logran a
través de un proceso de expresión de una secuencia de interés en una
planta, parte de planta o cultivo célula de planta, que
comprende:
(a) proporcionar una planta, parte de planta o
cultivo de célula de planta que contenga en el núcleo de la célula
un ADN heterólogo como se definió anteriormente, y
(b) producir la expresión de la secuencia de
interés.
Las células de esa planta, parte de planta o
cultivo de célula de planta pueden transformarse de manera estable o
transitoria con el ADN heterólogo.
\newpage
La invención también proporciona un proceso para
producir una planta transgénica establemente transformada en un
cromosoma nuclear con un ADN heterólogo como se definió
anteriormente, que comprende transformar una planta o una parte de
planta con un vector que contenga al ADN heterólogo, seleccionar el
tejido de la planta que contenga en un cromosoma nuclear el ADN
heterólogo, y regenerar la planta transgénica a partir de ese
tejido.
La invención también proporciona un proceso para
expresar transitoriamente una secuencia de interés en una planta,
parte de planta o cultivo de célula de planta, que comprende:
transformar una planta, parte de planta o
cultivo de célula de planta con un ADN heterólogo que tenga una
secuencia que codifique un replicón de ARN unido o que puede unirse
operativamente a un promotor de transcripción,
en el que la secuencia que codifica un replicón
de ARN contiene:
(i) secuencias para la función de replicón de
ese replicón de ARN, procediendo esas secuencias derivadas de una
secuencia de un virus de ARN de planta,
(ii) una secuencia de interés,
por lo que las secuencias para la función del
replicón muestran, en posiciones seleccionadas de las secuencias del
virus de ARN de planta las diferencias conservadoras de la función
de la secuencia de ese virus de ARN de planta, como se define además
en la reivindicación 25. Esas diferencias pueden causar una
frecuencia incrementada de formación del replicón en comparación con
un replicón de ARN que no muestre esas deferencias.
La invención también proporciona una molécula de
ácido nucleico para producir la planta, parte de planta o cultivo
de célula de planta de la invención o para llevar a cabo el proceso
de la invención. La molécula de ácido nucleico es como se define en
las reivindicaciones y como se define además en la descripción más
adelante con referencia a la planta, parte de planta o cultivo de
célula de planta y al proceso de la invención.
Cuando los inventores de la presente invención
introdujeron un ADN heterólogo que codificaba los replicones
virales de ARN en los cromosomas nucleares de las plantas o las
partes de planta para expresar una proteína de interés codificada
en ese replicón de ARN, encontraron que la frecuencia con la que
aparecían los replicones de ARN en el citosol era muy baja y
ocurría sólo en una pequeña fracción de las células que contenía al
ADN heterólogo. De acuerdo con ello, el nivel de expresión de la
proteína de interés también era muy bajo. Se consideraron muchas
razones posibles para este problema, incluyendo efectos de posición
del cromosoma, elementos inadecuados de regulación de la
transcripción, silenciamiento de gen, transporte defectuoso del
replicón desde el núcleo hacia el citosol, un efecto nocivo de la
secuencia de interés en la transcripción, función de procesamiento
del ARN o el replicón, etc. Entonces, sorprendentemente, se encontró
que ciertas porciones de la secuencia ricas en A/T(U) en el
replicón eran las responsables de la baja frecuencia de formación
del replicón en el citosol. Cuando se suprimió el efecto nocivo de
esas porciones de la secuencia ricas en A/T(U), la frecuencia
de formación del replicón en el citosol creció con fuerza, dando
como resultado una producción fuertemente incrementada de la
proteína de interés.
La eficacia de la presente invención es tal que
se logra una nueva dimensión en los sistemas de expresión de
planta. Los niveles de expresión que se alcanzan con la presente
invención son tales que los gastos para el procesamiento aguas
abajo (incluyendo la separación y la purificación de la proteína de
interés) son lo suficientemente bajos para hacer al proceso de la
invención competitivo con otros sistemas de expresión a gran
escala. En los sistemas de expresión de la técnica anterior que usan
plantas establemente transformadas, el nivel de expresión es bajo
aún si se usan vectores basados en virus, dado que los replicones se
producen en una pequeña fracción de las células. Los replicones que
se propagan en la planta no pueden remediar este problema, ya que
la propagación es baja, notablemente a través de grandes distancias.
Por lo tanto, la expresión no procede de manera uniforme en la
planta y la degradación de la proteína de interés ya habrá tenido
lugar en algunas partes de la planta mientras en otras la expresión
de la proteína aún no se ha iniciado. La invención permite activar
la expresión de manera uniforme a través de la planta. Los
replicones de las células vecinas pueden invadir rápidamente la
pequeña fracción de células que no produce un replicón La invención
proporciona el primer sistema de expresión de planta de alta
producción que puede usarse a gran escala. La invención permite
inclusive producir dos o más replicones en la misma célula, con lo
cual la probabilidad de tener ambos replicones en las mismas
células es aún muy alta. Además, la eficacia del sistema de
expresión de la invención es tal que se reduce de otra forma la
especificidad limitante de planta de los virus de ARN.
La eficacia mejorada como se describe
anteriormente puede lograrse en combinación con la transformación
estable así como con la transformación transitoria de las plantas,
partes de planta o células de planta.
La planta, parte de planta o cultivo de célula
de planta transformada (opcionalmente de manera estable) y la
molécula de ácido nucleico tienen un ADN heterólogo que codifica un
replicón de ARN. La secuencia que codifica un replicón de ARN
contiene:
(i) secuencias para la función de replicón del
replicón de ARN, procediendo esas secuencias de una secuencia de un
virus de ARN de planta, y
(ii) una secuencia de interés a expresarse a
partir de ese replicón de ARN.
La secuencia que codifica un replicón de ARN
contiene una secuencia de interés que se expresará desde el replicón
(ii) de ARN. La secuencia de interés que se expresará puede
conducir a la formación de un ARN de interés, como un ARN para la
interferencia de ARN para suprimir una función de la planta.
Preferiblemente, sin embargo, la secuencia de interés codifica una
proteína de interés y contiene secuencias reguladoras para trasladar
la proteína de interés, por ejemplo, a partir del replicón de ARN o
a partir del ARN subgenómico del replicón de ARN. La secuencia de
interés puede incluir una codificación de secuencia para una señal
diana para dirigir la proteína de interés hacia un compartimiento
en particular de la célula o para secretar la secuencia de interés.
También pueden codificarse las secuencias de aminoácido para separar
la proteína de interés a partir de una señal de direccionamiento.
La secuencia de interés es una secuencia que es heteróloga a
cualesquiera secuencias del virus de ARN de planta, es decir, el
proceso de la invención no comprende un caso restringido para la
transformación de un virus de ARN de planta de tipo silvestre dentro
de plantas u hojas de plantas. Por lo tanto, la proteína de interés
no es una proteína codificada por el virus de ARN de planta del que
se derivan las secuencias para la función del replicón.
Las secuencias para la función (i) del replicón
del replicón de ARN corresponden a las secuencias del virus de ARN
de planta, entre otras, en que el primero puede ser una copia de ADN
del último. Las secuencias para la función del replicón
proporcionan el replicón de ARN con la función para replicar en el
citosol. Las secuencias para la función del replicón codifican una
polimerasa de ARN (replicasa) dependiente del ARN. Las secuencias
para la función del replicón pueden codificar además las funciones
de un replicón de ARN como una o más proteínas implicadas en la
propagación célula a célula o sistémica de un virus de ARN en una
planta, como una proteína de movimiento o una proteína de cubierta.
Las secuencias para la función del replicón derivan preferiblemente
de una secuencia de un virus de ARN de planta, dado que los virus de
ARN de planta son una fuente fácilmente accesible para las
funciones del replicón. "Que derivan" significa que las
secuencias para la función del replicón son esencialmente una copia
del ADN de las correspondientes secuencias del virus de ADN y la
copia de ADN constituye una parte del ADN heterólogo contenido, o
que será introducido, en el núcleo de la célula. "Que derivan"
significa también que las secuencias para la función del replicón no
son una copia exacta del ADN de la correspondiente secuencia de ARN
del virus de ARN, sino que muestran diferencias de conservación de
la función como se describe más adelante. Dado que esas diferencias
son de conservación de la función, las secuencias para la función
del replicón codifican preferiblemente proteínas capaces de realizar
las funciones de replicón de manera similar a como lo hacen para el
virus de ARN. Esas diferencias de conservación de la función pueden
sin embargo, dar como resultado diferencias cuantitativas en la
funcionalidad de las proteínas virales codificadas, en comparación
con un caso en el que esas diferencias de conservación de la función
estén ausentes. En una realización, el ADN heterólogo y las
secuencias para la función del replicón no codifican una proteína
requerida para el movimiento de larga distancia como una proteína de
cubierta (en particular una proteína de cubierta tobamoviral). En
otra realización, el ADN heterólogo carece de una proteína de
movimiento. Por lo tanto, las secuencias para la función del
replicón del ADN heterólogo no tienen que codificar todas las
funciones del virus de ARN a partir del cual se derivan las
secuencias para la función del replicón.
Las secuencias para la función del replicón
muestran, en ubicaciones seleccionadas de la secuencia del virus de
ARN de planta, diferencias de conservación de la función con
respecto a la secuencia del virus de ARN de planta, causando esas
diferencias una frecuencia incrementada de formación de replicón en
comparación con un replicón de ARN que no muestre las diferencias.
Esas diferencias son causales para la frecuencia incrementada de
formación del replicón en las células de las plantas, una vez que el
proceso general ha sido activado (véase más adelante). La conexión
causal entre la frecuencia incrementada de formación del replicón y
dichas diferencias puede ensayarse experimentalmente comparando la
frecuencia de formación del replicón entre las secuencias para la
función del replicón que tienen las diferencias y las secuencias
para la función del replicón que no tienen las diferencias. La
comparación experimental puede hacerse por ejemplo, contando los
protoplastos que expresan la secuencia de interés como se describe
en los ejemplos. Preferiblemente, para este propósito se usa una
secuencia de interés que codifica una proteína indicadora fácilmente
detectable como la proteína verde fluorescente (GFP, siglas en
inglés). Como además se describe mas adelante, también es preferible
realizar la comparación experimental con replicones de ARN que no
pueden propagarse de célula a célula.
Las diferencias de conservación de la función se
introducen en las secuencias para la función del replicón en
ubicaciones seleccionadas de la secuencia del virus de ARN de
planta. Las ubicaciones seleccionadas son las ubicaciones en las
secuencias para la función del replicón del virus de ARN de planta
que son responsables de una baja probabilidad de que aparezca en el
citosol, como un replicón funcional, un replicón de ARN trascrito
en el núcleo. Preferiblemente, esas ubicaciones seleccionadas tienen
un alto contenido de A/T(U), es decir, un alto contenido de
A y/o un alto contenido de T (un alto contenido de U a nivel del
ARN), o tienen sitios crípticos de corte y empalme, es decir,
partes de secuencia que puede reconocer la maquinaria de corte y
empalme nuclear como sitios de corte y empalme. Las ubicaciones
seleccionadas pueden identificarse en un virus de ARN en el cual
está basado un replicón de ARN analizando el perfil de ARN del virus
de ARN como se ejemplifica más adelante. Además, las ubicaciones
seleccionadas pueden identificarse experimentalmente analizando el
ARN formado en una célula de planta después de la transformación
con un ADN heterólogo que codifique un replicón de ARN que no
muestre las diferencias (de conservación de la función) de acuerdo
con la invención. Este análisis experimental puede hacerse por
RT-PCR, preferiblemente junto con la secuenciación
de los productos de RT-PCR. En el ensayo
RT-PCR, la replicasa se vuelve preferiblemente
vuelta disfuncional por ejemplo por una mutación de desplazamiento
de fase para impedir que se amplifiquen los replicones de ARN que
alcanzan el citoplasma; esa amplificación puede conducir a la
contaminación de transcritos de ARN con el virus de tipo silvestre o
a una sobre representación de los replicones de ARN amplificados en
el citoplasma. De esta manera, pueden identificarse productos de
corte y empalme no deseados que indican eventos de corte y empalme
destruyendo el replicón de ARN. Además, los sitios exactos de corte
y empalme no deseados pueden identificarse y después remediarse
introduciendo las diferencias de conservación de la función en las
ubicaciones
seleccionadas.
seleccionadas.
Por lo tanto, la invención también proporciona
un proceso para expresar una secuencia de interés en una planta,
parte de planta o cultivo de célula de planta, en el que: (A) se
proporciona la planta, parte de planta o cultivo de célula de
planta con un ADN heterólogo como se define en este documento, pero
carente de las diferencias de conservación de la función; (B) se
ensaya el ARN derivado del ADN heterólogo para los productos de
corte y empalme no deseados en las secuencias para la función del
replicón (por ejemplo, por RT-PCR); (C) se
identifica (por ejemplo en la secuencia de un producto de
RT-PCR), una ubicación seleccionada como una
ubicación de un evento de corte y empalme no deseado; (D) se
introduce una diferencia de conservación de la función (por ejemplo,
un intrón) de acuerdo con la invención dentro de, o cerca de, la
ubicación seleccionada identificada en la etapa (C) dentro del ADN
heterólogo de la etapa (A) para producir el ADN heterólogo de la
invención, y expresar una secuencia de interés en una planta, parte
de planta o cultivo de célula de planta de acuerdo con la invención,
por ejemplo a partir de una planta estable y transitoriamente
transformada con el ADN heterólogo de la invención.
Las diferencias de conservación de la función
causan una frecuencia incrementada de formación del replicón de ARN
suprimiendo el efecto nocivo de las ubicaciones seleccionadas en la
frecuencia de formación del replicón de ARN. Las diferencias de
conservación de la función pueden comprender una reducción de un
alto contenido de A/U en el replicón de ARN, reduciendo un alto
contenido de A/T en las secuencias para la función del replicón de
la secuencia que codifica el replicón de ARN. El alto contenido de
A/U puede reducirse con la eliminación al menos parcial o el
reemplazo al menos parcial a través de bases G/C (por ejemplo.,
usando la degeneración del código genético), siempre que esas
diferencias sean conservadoras de la función. Además, pueden
eliminarse los sitios de corte y empalme crípticos que flanquean
las regiones ricas en A/U de esas secuencias derivadas del virus de
ARN de planta. Las diferencias conservadas de la función pueden
introducirse en una o, preferiblemente, en varias ubicaciones
seleccionadas.
En la presente invención, las diferencias de
conservación de la función comprenden la inserción de uno o más
intrones, cerca o dentro de las ubicaciones ricas en A/U de las
secuencias que derivan de las secuencias del virus de ARN de
planta. Sorprendentemente, se ha encontrado que la introducción de
intrones en o cerca de las ubicaciones ricas en A/U da como
resultado una frecuencia incrementada de la formación del replicón
de ARN. Pueden introducirse varios intrones y en este documento se
proporcionan ejemplos para diversos números de intrones
introducidos. Los efectos de más de un intrón son acumulativos.
Además, la inserción del intrón puede combinarse con otras
diferencias de conservación de la función en otras ubicaciones
seleccionadas.
También se describen diferencias de conservación
de la función que comprenden la inserción de una o más secuencias
que pueden formar intrones nucleares cerca o dentro de las
ubicaciones ricas en A/U de las secuencias que derivan de las
secuencias del virus de ARN de planta. La Figura 8 muestra un
ejemplo para la introducción de secuencias que pueden formar un
intrón nuclear, aunque se vaya a expresar en el gen de interés. En
el ejemplo de la Figura 8, el intrón se forma a partir de dos
mitades de intrón al giro catalizado de recombinasa de una parte
del ADN heterólogo. Este principio también puede aplicarse a las
secuencias para la función del replicón del replicón de ARN. En una
realización en la que se forman dos replicones de ARN diferentes en
la misma célula, la recombinación entre los dos diferentes
replicones puede dar como resultado la formación de un intrón a
partir de dos mitades de intrón presentes en replicones diferentes.
Además, un replicón de ARN puede formarse a través de la
recombinación entre dos precursores, ninguno de los cuales es un
replicón. También en este caso, puede ensamblarse un intrón a
partir de dos mitades de intrón derivadas de diferentes moléculas
precursoras.
La planta, parte de planta o cultivo de célula
de planta de la invención puede transformarse de manera estable con
el ADN heterólogo. Transformarse de manera estable significa que
contienen el ADN heterólogo en el núcleo de la célula de modo que
el ADN heterólogo se mantiene en el núcleo de la célula como se
mantienen los cromosomas nucleares. El ADN heterólogo puede
contenerse en o puede ser un elemento episomal. Sin embargo,
preferiblemente el ADN heterólogo se incorpora de manera estable en
un cromosoma nuclear de tal modo que las células de la progenie o
las plantas progenie pueden heredarlo. Los métodos de producción de
plantas, partes de plantas o cultivos de células de plantas que
están transformados de manera estable se conocen en la técnica de la
biotecnología de plantas. Estos métodos usualmente requieren la
selección de transformantes para la transformación estable usando un
agente selectivo y un gen marcador seleccionable.
Preferiblemente, todas las plantas, partes de la
planta o cultivos de células de plantas contienen en su núcleo al
ADN heterólogo para dar una alta producción de una proteína de
interés. Más preferiblemente, las células contienen el ADN
heterólogo integrado de manera estable en un cromosoma nuclear. En
el caso de una planta, esto significa que la planta es una planta
transgénica.
El ADN heterólogo que tiene la secuencia que
codifica al replicón de ARN está unido o puede unirse operativamente
a un promotor de transcripción. Como alternativa, la secuencia que
codifica el replicón de ARN está unida o puede unirse
operativamente a un promotor de transcripción. Si el ADN heterólogo
o la secuencia están unidos operativamente con el promotor de
transcripción, el promotor de transcripción es preferiblemente un
promotor regulado, como un promotor inducible, específico de tejido
o regulado evolutivamente para hacer regulable la expresión de la
secuencia de interés. Más preferiblemente, el promotor es inducible
o regulado evolutivamente, lo que permite inducir la expresión en
un momento deseado o activar la expresión cuando la planta alcanza
un estado de desarrollo definido, respectivamente. Por ejemplo, la
expresión de la secuencia de interés puede activarse en las
semillas de las plantas si el promotor es un promotor específico de
semillas. La invención es de gran valor para proporcionar tejidos
específicos (por ejemplo, tejidos de semillas) con replicones de
ARN, con lo que esos tejidos pueden estar menos adaptados a la
propagación de célula a célula del replicón que, por ejemplo, el
tejido foliar. Los más preferibles son los promotores químicamente
regulados, dado que permiten activar la expresión a voluntad en
todos o en la mayoría de los tejidos de una planta. Aún más
importante, los promotores químicamente inducibles son los
promotores de elección para aplicaciones a gran escala, dado que el
inductor químico puede aplicarse a un gran número de plantas al
mismo tiempo. Los ejemplos de promotores regulados se conocen en la
técnica. Las aplicaciones a gran escala son aplicaciones en las que
una secuencia de interés seleccionada se expresa conjuntamente en
muchas plantas. La aplicación a gran escala puede realizarse en un
invernadero.
La secuencia que codifica un replicón de ARN
puede estar, como alternativa, unida operativamente a un promotor
de transcripción, lo que permite activar la expresión de la
secuencia de interés uniendo operativamente con un promotor la
secuencia que codifica un replicón de ARN. Hay varias formas de
abreviar esta realización en la práctica. Una opción es separar, en
el ADN heterólogo, a la secuencia que codifica el replicón de ARN y
al promotor, a través de un bloque de secuencia que impide un enlace
operativo entre el promotor y el ADN heterólogo. Este bloque de
secuencia puede estar flanqueado por sitios de recombinación de modo
una recombinasa que reconoce esos sitios de recombinación puede
cortar el bloque. Por lo tanto puede establecerse el enlace
operativo para la transcripción de la secuencia que codifica el
replicón de ARN y puede activarse la expresión. Otra opción es
tener una parte de una secuencia necesaria para la transcripción
(por ejemplo, un promotor o parte del promotor) en orientación
girada y flanqueada por sitios de recombinación. El proporcionar una
recombinasa adecuada puede volver a girar la parte de la secuencia
a la orientación correcta, con lo que puede establecerse un enlace
operativo.
En una realización de la invención, la secuencia
que codifica un replicón de ARN tiene uno o más segmentos que
codifican juntos ese replicón de ARN, es decir, un ADN continuo no
codifica el replicón de ARN. En vez de ello, dos o más segmentos
codifican de manera discontinua el replicón de ARN, por lo que esos
segmentos pueden estar presentes en el mismo cromosoma,
preferiblemente contiguos entre sí. La formación del replicón de
ARN puede requerir entonces la transposición de los segmentos, por
ejemplo, por recombinación. Como un ejemplo, una parte de una
secuencia para la función del replicón (por ejemplo, una parte de
una secuencia que codifica una replicasa) puede estar presente en
el ADN heterólogo en una orientación girada con relación a otras
partes de esa secuencia. La parte girada puede estar flanqueada por
sitios de recombinación. Entonces el trascrito del ADN heterólogo
no será un replicón, dado que la función del replicón no puede
proporcionarse (por ejemplo, porque el transcrito no codifica una
replicasa funcional). Al proporcionar una recombinasa específica
del sitio que reconozca los sitios de recombinación, puede girarse
de nuevo uno de los segmentos de tal modo que una función del
replicón se codifica continuamente. En esta realización, el
proporcionar la recombinasa puede funcionar como un activador para
activar la formación del replicón y la expresión de una secuencia de
interés (véase más adelante). Esta realización se realiza
preferiblemente en conexión con plantas, partes de planta o cultivos
de células de planta transformadas de manera estable.
De manera alternativa, los segmentos pueden
estar presentes en diferentes cromosomas. La formación de un
replicón de ARN requerirá entonces la transcripción de ambos
segmentos y el trans-corte y empalme de ambos
transcritos para ensamblar el replicón de ARN. Esta realización
puede usarse para segregar rápidamente los segmentos que codifican
juntos al replicón de ARN en las plantas o células de la progenie,
como se describe con detalle en la Patente PCT/EP03/02986.
El proceso de la invención puede comprender las
etapas (a) y (b). La etapa (a) puede comprender la transformación
estable o transitoria de una planta, parte de planta o cultivo de
célula de planta con el ADN heterólogo de la invención. Como se ha
indicado anteriormente, se prefiere la transformación estable de un
cromosoma nuclear. Preferiblemente, el proceso de la invención es
un proceso para expresar una proteína de interés codificada por la
secuencia de interés. La etapa (b) comprende causar la expresión de
la secuencia de interés, por ejemplo, activando la expresión. Ya se
han mencionado diversos métodos para causar o activar la expresión.
Los ejemplos incluyen inducir un promotor inducible unido
operativamente al ADN heterólogo; llevar ese ADN heterólogo bajo la
unión operativa de un promotor usando la recombinación; establecer
la codificación continua de una secuencia para la formación del
replicón usando la recombinación, etc. Si se usa una recombinasa
para activar el proceso de la invención, esa recombinasa puede
proporcionarse de manera transitoria a la planta, parte de planta o
cultivo de célula de planta, lo que actuaría como un intercambio
para la etapa (b). Alternativamente, la recombinasa puede
codificarse de manera estable en las células, y expresar la
recombinasa bajo el control de un promotor inducible,
preferiblemente regulado. La inducción de la expresión de la
recombinasa induciendo el promotor puede causar entonces la
expresión en la etapa (b). En el caso de la transformación
transitoria, la etapa (b) puede lograrse automáticamente al realizar
el paso (a).
Preferiblemente, el proceso de la invención se
realiza con muchas plantas en paralelo, proporcionando muchas
plantas de acuerdo con (a) y produciendo la expresión de la
secuencia de interés de acuerdo con (b) con todas las plantas en una
etapa, por ejemplo, aplicando un inductor químico para un promotor
químicamente inducible a todas las plantas, por ejemplo por
aspersión.
En una realización importante del proceso de la
invención, la planta o las partes de la planta (por ejemplo, las
hojas) se transforman de manera transitoria con el ADN heterólogo de
la invención para la expresión transitoria de la secuencia de
interés. El término "transformación transitoria" significa la
introducción del ADN heterólogo sin la selección de las células
transformadas para la incorporación estable del ADN heterólogo en el
cromosoma de una planta. La transformación transitoria usualmente
proporciona la expresión transitoria del(los) gen(es)
codificado(s) por el ADN heterólogo. La transformación
transitoria puede lograrse a través de cualquiera de los métodos de
transformación proporcionados más adelante. Sin embargo.
preferiblemente se realiza a través de transformación transitoria
mediada por Agrobacterium del T-ADN que
contiene el ADN heterólogo de la invención. Un método preferible de
transformación transitoria mediada por Agrobacterium es la
agroinfiltración. La agroinfiltración
(agro-inoculación) es la más preferible. Los más
rápidos y más altos niveles de expresión de la secuencia de interés
pueden obtenerse si se transforman por agroinfiltración las plantas
completas (es decir, aéreas que incluyen todas las hojas). Esto
puede lograrse sumergiendo las plantas hacia abajo en la suspensión
de Agrobacterium, aplicando vacío, y liberando rápidamente
el vacío.
el vacío.
En una realización preferida del proceso de
expresión transitoria de una secuencia de interés, la secuencia que
codifica el replicón de ARN está unida operativamente a un promotor
transcripcional, preferiblemente un promotor transcripcional
constitutivo. En otra realización preferida, la planta pertenece al
género Nicotiana y las secuencias para la función del
replicón derivan de un tobamovirus, preferiblemente del virus del
mosaico del tabaco. En una realización particularmente preferida,
las plantas de tabaco que incluyen el tallo y todas las hojas se
transforman transitoriamente por agroinfiltración. Esta última
realización puede usarse para aplicaciones a gran escala del
proceso de la invención. En las aplicaciones a gran escala, el
proceso se aplica de forma simultánea a muchas plantas (al menos a
5, preferiblemente al menos a 10, más preferiblemente al menos a 100
plantas).
La presente invención puede aplicarse
principalmente a cualquier planta para la cual existen virus de ARN
infecciosos. Los pares adecuados de planta/virus de ARN pueden
derivarse de la lista de virus de ARN que se proporciona más
adelante. Debido a la altísima eficacia de la formación del replicón
de acuerdo con la invención, la especificidad de especies de planta
de los virus de plantas es mucho menos pronunciada cuando se
practica esta invención. De manera similar, la presente invención
puede usarse con replicones de ARN basados en cualquier virus de
ARN. Los virus de ARN han evolucionado generalmente fuera del núcleo
de la célula de sus plantas huéspedes, y habrán elegido ubicaciones
que hacen ineficaz a un replicón basado en ese virus cuando el
replicón se produce dentro del núcleo de la célula, principalmente
si el replicón está codificado de manera estable en un cromosoma
nuclear. La invención puede aplicarse a todos los virus de ARN,
aunque el nivel de mejora puede variar entre virus de ARN de
diferentes plantas. Los virus de ARN de planta más preferidos sobre
los que puede basarse la invención son los tobamovirus,
principalmente el virus del mosaico del tabaco, y los Potexvirus
tales como el virus X de la patata. En el caso del virus del mosaico
del tabaco, será generalmente la proteína de cubierta la que se
reemplaza por la secuencia a expresar. La proteína de movimiento
puede eliminarse o reemplazarse por una secuencia a expresar.
Preferiblemente, sin embargo, un replicón de ARN derivado del virus
del mosaico del tabaco debería codificar la proteína de movimiento y
la proteína de movimiento reemplazarse por la secuencia a expresar.
Es altamente preferible que el ADN heterólogo carezca de al menos un
marco de lectura abierto del virus de ARN de planta, como una
proteína de cubierta o una proteína de desplazamiento.
La aplicación principal de la presente invención
es la producción de una proteína de interés en plantas, partes de
plantas o cultivos de célula de plantas. La proteína de interés es
codificada por la secuencia de interés. La secuencia de interés es
preferiblemente heteróloga al virus de ARN de planta. En cualquier
caso, la secuencia de interés no es una secuencia que tenga o que
codifique funciones del virus de ARN.
Si el proceso de la invención se realiza en
plantas, son preferibles las plantas que no entren en la cadena
alimentaria humana o animal, como las especies Nicotiana (por
ejemplo, Nicotiana benthamiana, Nicotiana tabacum). Las
partes de plantas son, por ejemplo, órganos de plantas o tejidos
específicos de plantas, como hojas o semillas. En este documento,
las semillas se consideran como partes de la planta si el proceso de
la invención se realiza en las semillas que están creciendo o que
están unidas a una planta parental. Sin embargo, las semillas
también se consideran como plantas aunque en una determinada etapa
del desarrollo de una planta. Más preferiblemente, las plantas de
la invención se comercializan o distribuyen como semillas, las
semillas crecen como plantas, y la expresión de la secuencia de
interés se induce o se activa en un punto deseado de esas
plantas.
Muchas especies de plantas, como Nicotiana
tabacum o Beta vulgaris han sido hasta ahora imposibles
de transformar con un vector viral o un replicón por medio de
transformación mediada con Agrobacterium. Puede suponerse
que la razón para esta imposibilidad fue la activación de los
mecanismos de defensa de la planta en respuesta a un doble reto de
la planta con dos patógenos, en concreto Agrobacterium y el
vector viral. Ahora, los inventores han encontrado que el uso de
suspensión altamente diluida de Agrobacteria para la transformación
mediada por Agrobacterium permite lograr una mayor eficacia
de transformación con los vectores virales. Por lo tanto, la
invención logra una amplia aplicabilidad de transformación del
vector viral mediada por Agrobacterium para muchas especies
de plantas. La suspensión altamente diluida de Agrobacteria para
esta realización, tiene una concentración de células de la
Agrobacteria que corresponde a una densidad óptica calculada a 600
nm a lo sumo de 0,04, preferiblemente a lo sumo de 0,01, más
preferiblemente a lo sumo de 0,004, y más preferible, a lo sumo de
0,001, en la que las densidades ópticas calculadas se definen por
una dilución de al menos 25 veces, preferiblemente al menos 100
veces, más preferiblemente al menos 250 veces y más preferiblemente
al menos 1000 veces, respectivamente, de una suspensión de la
Agrobacteria de una DO de 1,0 a 600 nm. La especie de planta más
preferiblemente transformada de acuerdo con esta realización es
Nicotiana tabacum.
\newpage
La eficacia de transformación de la
transformación del vector viral (ARN) mediada por
Agrobacterium puede mejorarse adicionalmente usando en el
T-ADN el ADN heterólogo de acuerdo con la invención.
Por lo tanto, la invención proporciona un proceso para expresar una
secuencia de interés en una planta, parte de planta o cultivo de
célula de planta, que comprende:
transformar una planta, parte de planta o
cultivo de célula de planta con una suspensión de Agrobacteria,
conteniendo la Agrobacteria en el T-ADN un ADN
heterólogo con una secuencia que codifica un replicón
(preferiblemente un replicón de ARN) unida o que puede unirse
operativamente a un promotor de la transcripción,
en la que la secuencia que codifica un replicón
contiene:
(i) secuencias para la función del replicón de
ese replicón, derivándose las secuencias de una secuencia de un
virus de planta (preferiblemente un virus de ARN de planta),
(ii) una secuencia de interés a expresar,
en la que dicha suspensión de Agrobacteria tiene
una concentración de células de la Agrobacteria correspondiente a
una densidad óptica calculada a 600 nm de a lo sumo de 0,04,
preferiblemente a lo sumo de 0,01, más preferiblemente a lo sumo de
0,004, y más preferiblemente a lo sumo de 0,001, en la que las
densidades ópticas calculadas se definen por una dilución de al
menos un 25 veces, preferiblemente al menos 100 veces, más
preferiblemente al menos 250 veces y más preferiblemente al menos
1000 veces, respectivamente, de una suspensión de la Agrobacteria de
una DO de 1,0 a 600 nm.
Los inventores han encontrado que este proceso
no solamente disminuye la probabilidad de que las células de la
cepa de Agrobacterium se propaguen en el ambiente, mejorando
por lo tanto la seguridad biológica de este proceso. El proceso
también mejora la eficacia de la expresión de la proteína,
presumiblemente disminuyendo la exposición y el estrés para esa
planta u hojas de planta después de la infección con una cepa de
Agrobacterium que es patógena para esa planta.
Sorprendentemente, los inventores han encontrado que la eficacia del
proceso aumenta, dentro de ciertos límites, con la disminución de
la concentración de las suspensiones de Agrobacterium usadas
para transformar o transfectar las plantas o las partes de planta.
Principalmente, la capacidad de los replicones para el
desplazamiento de célula a célula, generado en las células de la
planta, mejora con la disminución de la concentración de las
suspensiones de Agrobacteria. Las razones de este fenómeno
inesperado aún no se han identificado. Se especula que este
fenómeno se debe a una respuesta de la planta a la infección por
Agrobacteria y que esta respuesta no ocurre (u ocurre a un menor
grado) con menores concentraciones de Agrobacteria. En los procesos
de transformación de la técnica anterior que usan Agrobacteria, se
usaban concentraciones mucho mayores de Agrobacteria, generalmente
en el intervalo de una DO de 0,5 a 1,0 a 600 nm.
La planta u hojas de la planta se infiltran
preferiblemente con una suspensión de células de la cepa
Agrobacterium, teniendo la suspensión una concentración de
células de Agrobacteria que se obtiene diluyendo una suspensión de
células de la cepa Agrobacterium de una DO (densidad óptica)
de 1,0 a 600 nm de al menos 25 veces, preferiblemente al menos de
100 veces, más preferiblemente al menos de 250 veces, y más
preferiblemente al menos de 1000 veces. Esas diluciones conducen
por lo tanto a que las suspensiones de Agrobacteria tengan valores
de DO calculados a 600 nm a lo sumo de 0,04, preferiblemente a lo
sumo de 0,01, más preferiblemente a lo sumo de 0,004, y más
preferible, a lo sumo de 0,001, respectivamente.
Este proceso de usar suspensiones de
Agrobacteria con valores de DO calculados por debajo de 0,04, puede
combinarse con otras realizaciones descritas en esta invención. La
infiltración o la agroinfiltración pueden definirse como un método
de transformación o transfección usando una suspensión de
Agrobacteria, en la que se usa una diferencia de presión para
introducir a la Agrobacteria a presión en un tejido de planta
(espacio intercelular).
La Figura 1 representa el principio general de
la invención, basado en la frecuencia incrementada de formación del
replicón basada en el virus de ARN.
La Figura 2 muestran el perfil de predicción del
intrón de la región transcrita del vector plCH8543. Los números de
nucleótidos se proporcionan en el eje horizontal. El eje vertical
muestra la probabilidad para la correspondiente región de
secuencia/secuencia que va a ser una secuencia codificante (de
codificación), para servir como un sitio donante (Donante) o un
sitio aceptor (Aceptor). Las partes rodeadas con círculo
corresponden a las ubicaciones seleccionadas en la que deberían
introducirse las diferencias de conservación de la función.
La Figura 3 muestra el perfil de predicción del
intrón de la primera mitad de la región transcrita del vector
plCH15466. Las regiones rodeadas con círculo se modificaron
(comparar con la Figura 2A) con las diferencias de conservación de
la función de acuerdo con la invención.
La Figura 4 muestra el perfil de predicción del
intrón de la segunda mitad de la región transcrita del plCH1590. Las
regiones rodeadas con círculo se modificaron (comparar con la Figura
2B) con las diferencias de conservación de la función de acuerdo con
la invención.
La Figura 5 muestra el perfil de predicción del
intrón de la región transcrita del plCH15499. Las regiones rodeadas
con círculo corresponden a seis intrones nucleares de la planta
insertados.
La Figura 6A y B son representaciones
esquemáticas de las regiones de T-ADN de vectores
con y sin diferencias de conservación de la función de acuerdo con
la invención.
La Figura 7 muestra la expresión de GFP después
de la agroinfiltración de las construcciones virales en hojas de
Nicotiana benthamiana y Nicotiana tabacum. Se indica
el número de identificación del vector (plCH) para cada área
infiltrada.
7A - Nicotiana benthamiana, 8 días
después de la agroinfiltración;
7B - Nicotiana tabacum, 8 días después de
la agroinfiltración;
7C - Protoplastos de Nicotiana
benthamiana aislados 5 días después de la agroinfiltración.
Muchos puntos claros en la imagen derecha indican una frecuencia
extremadamente alta de formación de replicón y de expresión GFP.
La Figura 8 es una representación esquemática de
un precursor de replicón basado en virus de ARN diseñado de acuerdo
con la presente invención, que da nivel de expresión cero del gen de
interés (GFP, indicado con G) en el estado no inducido.
P - promotor de transcripción; T - región de
terminación de transcripción; SM - gen marcador seleccionable; Ac2 -
promotor del gen ACTIN2 de Arabidopsis; RdRp ARN polimerasa
dependiente del ARN viral; MP - proteína viral de desplazamiento;
NTR - región viral 3' no traducida.
La Figura 9 muestra un perfil de predicción de
intrón para el gen AtDMC1 específico de la meiosis de Arabidopsis
thaliana (Acceso a GenBank Nº: U76670), usando la cadena directa
(+ cadena). Las regiones de codificación del intrón están rodeadas
con un círculo.
La Figura 10 (A y B) muestra la predicción de
posibles regiones problemáticas (rodeadas con un círculo) dentro de
la cadena directa (+ cadena) del genoma del virus X de la patata
(PVX) (Acceso a GenBank Nº: AF172259).
Las Figuras 11A, 11B y 11C muestran la
predicción de posibles regiones problemáticas (rodeadas con círculo)
de la cadena directa (+ cadena) de los genomas de ARN1, (Acceso a
GenBank Nº: K02703), ARN2 (Acceso a GenBank Nº: K02702) y ARN3
(Acceso a GenBank Nº: L00163), del virus del mosaico de la alfalfa,
respectivamente.
La Figura 12 representa las regiones
T-ADN de las construcciones plCH12691 y
plCH16888.
P - promotor de transcripción; T - región de
terminación de transcripción; SM - gen marcador
seleccionable;
Ac2 - promotor del gen ACTIN2 Arabidopsis; RdRp ARN polimerasa dependiente del ARN viral; MP - proteína viral de desplazamiento; NTR - región viral 3' no traducida.
Ac2 - promotor del gen ACTIN2 Arabidopsis; RdRp ARN polimerasa dependiente del ARN viral; MP - proteína viral de desplazamiento; NTR - región viral 3' no traducida.
La Figura 13 muestra hojas bajo luz UV de
diferentes líneas de N. benthamiana transformadas de manera
estable portadoras de las regiones T-ADN de
cualquiera de plCH12691 ó plCH16888. Las hojas se agroinfiltraron
con vectores (plCH10881 ó plCH14313) proporcionando integrasa.
La Figura 14 muestra hojas de Beta
vulgaris una semana después de la agroinfiltración con plCH18711
a la luz del día (izquierda) y con iluminación UV (derecha). Los
parches de luz en la fotografía derecha indican fluorescencia GFP.
Los intrones (recuadros punteados) en la construcción que se muestra
en la parte inferior están numerados.
Sorprendentemente, se ha descubierto que la
incorporación de intrones de planta dentro de ciertas regiones de
vectores de ARN viral de planta y la eliminación o el reemplazo de
los intrones crípticos dentro de las secuencias para la función del
replicón pueden aumentar drasticamente (al menos x10^{2} veces) la
eficacia de la aparición de los replicones de ARN en el citoplasma
de las plantas huéspedes. Este aumento en la eficacia se reflejó en
al menos un parámetro medible: la proporción relativa de células que
mostraron replicación del vector, por ejemplo, en la frecuencia
aumentada de la formación del replicón. Esta optimización del inicio
de la formación del replicón de ARN condujo a la capacidad de
activación sincronizada de la expresión de una secuencia de interés
en una planta completa, dando como resultado una producción
drasticamente incrementada de la proteína recombinante de interés
en un tiempo menor que para un vector no modificado.
A pesar de las publicaciones concernientes al
incremento de la expresión nuclear transgénica por la incorporación
de intrones en las regiones de codificación del ADN recombinante
(Mascarenhas et al., 1990, Plant Mol. Biol., 15,
913-920; Bourdon et al., 2001, EMBO
Reports, 2, 394-398; Rose, AB., 2002,
RNA, 8, 1444-1453; Patente US 5,955,330), no
hay indicio en la técnica anterior que muestre que la incorporación
de intrones dentro de los replicones de ARN viral tuvieran ningún
efecto positivo en la frecuencia de la formación del replicón viral
y subsecuentemente, en el nivel de expresión de una secuencia de
interés proporcionada por el replicón. Este efecto es sorprendente,
considerando que la transcripción del ARNm nuclear y la replicación
del ARN viral tienen lugar en diferentes compartimientos
subcelulares. Incluso si la copia del ADNc de un replicón viral se
coloca en el núcleo, sólo la primera copia del precursor del
replicón viral se produce en el núcleo y luego se amplifica en el
citoplasma en condiciones diferentes a las del núcleo. En la técnica
anterior, se describió el uso de intrones para prevenir el efecto
citotóxico de la expresión "de escape" de los genes virales en
E. coli durante la clonación con los ADNc de virus tipo
silvestre (Johansen, I.E. 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
93, 12400-12405; Yang et al., 1998, Arch.
Virol., 143, 2443-2451;
Lopez-Moya & Garcia, 2000, Virus Res.,
68, 99-107). No hay indicio de que la inclusión del
intrón pueda incrementar la frecuencia de formación del replicón a
partir de un clon de ADNc viral. Los resultados obtenidos para los
virus de ARN de tipo silvestre y sus copias de ADNc no pueden
compararse con los vectores de expresión derivados de virus
diseñados para la expresión de una secuencia heteróloga de interés
en plantas, predominantemente a expensas de otras propiedades de
virus de tipo silvestre como la infectividad y estabilidad de estos
virus. La infectividad no es un tema de la presente invención.
Precisamente, la infectividad no es un tema en un proceso de
expresión de una secuencia de interés en una planta transformada de
manera estable. La infectividad de un vector de ADN viral o de su
transcrito tampoco es un tema cuando una planta que contiene el
vector de ADN en el T-ADN se transforma con
Agrobacteria.
La presente invención proporciona un método para
incrementar fundamentalmente la frecuencia de formación del
replicón derivado de virus de ARN, estos replicones se derivan de la
transcripción del precursor de ADN y se diseñan para la expresión
de secuencias de interés. Este método supera las limitaciones de los
sistemas existentes de expresión basados en vectores viral, tales
como la limitación de tamaño para las secuencias heterólogas a
expresar y la alta inestabilidad de los vectores. Además, el método
ofrece mejores características de bioseguridad, permite diseñar
control a prueba de escape sobre la expresión transgénica (nivel
cero de expresión en el estado no inducido), ya que este diseño
puede ser una parte integrada de la estrategia para el diseño del
replicón derivado de virus de ARN. Al proporcionar alta frecuencia
de formación de replicón derivado de virus de ARN, el enfoque
descrito en este documento permite un rápido inicio de la expresión
de una secuencia de interés en una planta completa, parte de planta
o cultivo de célula de planta que contenga en el núcleo de la
célula un ADN heterólogo que codifique al replicón de ARN. En la
realización práctica de la invención, el rendimiento de
prácticamente cualquier replicón derivado de virus de ARN diseñado
para la expresión de una secuencia heteróloga de interés, puede
mejorarse significativamente a través del incremento drástico de la
frecuencia de formación del replicón.
Los virus de ARN que pertenecen a diferentes
grupos taxonómicos son adecuados para construir los replicones de
ARN de acuerdo con esta invención. Más adelante se presenta una
lista de virus de ARN a los que puede aplicarse esta invención. Los
nombres de los taxones entre comillas (y no en cursiva) indican que
este taxón no tiene un nombre ICTV internacional aprobado. Los
nombres de las especies (vernáculas) se dan en letra normal. Se
indican los virus sin asignación formal al género o la familia.
Virus de ARNmc (monocatenarios): Familia:
Bromoviridae, Género: Alfamovirus, Especie tipo: virus
del mosaico de la alfalfa, Género: Ilavirus, Especie tipo:
virus de la raya del tabaco, Género: Bromovirus, Especie
tipo: virus del mosaico del bromo, Género: Cucumovirus, Especie
tipo: virus del mosaico del pepino;
Familia: Closteroviridae, Género:
Closterovirus, Especie tipo: virus amarillo de la remolacha,
Género: Crinivirus, Especie tipo: virus amarillo infeccioso
de la lechuga, Familia: Comoviridae, Género: Comovirus,
Especie tipo: virus del mosaico del guisante pinto, Género:
Fabavirus, Especie tipo: virus 1 marchitador del haba,
Género: Nepovirus, Especie tipo: virus de mancha de anillo
del tabaco;
Familia: Potyviridae, Género:
Potyvirus, Especie tipo: Virus Y de la patata, Género:
Rymovirus, Especie tipo: virus del mosaico amarillo del
ballico;
Familia: Sequiviridae, Género:
Sequivirus, Especie tipo: virus de la mancha amarilla de la
chirivía, Género: Waikavirus, Especie tipo: virus tungro
esférico del arroz; Familia: Tombusviridae, Género:
Carmovirus, Especie tipo: virus jaspeado del clavel, Género:
Dianthovirus, Especie tipo: virus de mancha de anillo del
clavel, Género: Machlomovirus, Especie tipo: virus clorótico
jaspeado del maíz, Género: Necrovirus, Especie tipo: virus de
la necrosis del tabaco, Género: Tombusvirus, Especie tipo:
virus de la atrofia del arbusto de tomate, Géneros no asignados de
virus ARNmc, Género: Capillovirus, Especie tipo: virus
acanalador del tallo del manzano;
Género: Carlavirus, Especie tipo: virus
latente del clavel, Género: Enamovirus, Especie tipo: virus
del mosaico enanizante del guisante,
Género: Furovirus, Especie tipo: virus
del mosaico del trigo portado en el suelo, Género: Hordeivirus,
Especie tipo: virus rayado del mosaico de la cebada, Género:
Idaeovirus, Especie tipo: virus achicador del arbusto de
frambuesa;
Género: Luteovirus, Especie tipo: virus
amarillo achicador de la cebada; Género: Marafivirus, Especie
tipo: virus rayado fino del maíz; Género: Potexvirus, Especie
tipo: virus X de la papa; Género: Sobemovirus, Especie
tipo: virus del mosaico de la habichuela del sur, Género:
Tenuivirus, Especie tipo: virus rayado del arroz,
Género: Tobamovirus, Especie tipo: virus
del mosaico del tabaco,
Género: Tobravirus, Especie tipo: virus
cascabel del tabaco,
Género: Trichovirus, Especie tipo: virus
de la mancha de hoja clorótica del manzano; Género: Tymovirus,
Especie tipo: virus del mosaico amarillo del nabo; Género:
Umbravirus, Especie tipo: virus jaspeado de la zanahoria;
Virus de ARNmc Negativo: Orden: Mononegavirales, Familia:
Rhabdoviridae, Género: Cytorhabdovirus, Especie tipo:
virus necrótico amarillo de la lechuga, Género: Nucleohabdovirus,
Especie tipo: virus amarillo achicador de la patata;
Virus de ARNmc (monocatenario) negativo:
Familia: Bunyaviridae, Género: Tospovirus, Especie
tipo: virus moteado marchitador del tomate;
Virus ARNbc (bicatenarios): Familia:
Partitiviridae, Género: Alphacryptovirus, Especie
tipo: virus 1 críptico del trébol blanco, Género:
Betacryptovirus, Especie tipo: virus 2 críptico del trébol
blanco, Familia: Reoviridae; Género: Fijivirus, Especie
tipo: virus de la enfermedad de Fiji, Género: Pitorreo virus,
Especie tipo: virus de herida de tumor, Género: Oryzavirus,
Especie tipo: virus de la atrofia desigual del arroz;
Genoma: ARNmc, Especie virus A,B,C,D, del
ajo, Especie virus de la mancha de la vid, Especie virus del mosaico
de la línea blanca del maíz, Especie virus 2 latente del olivo,
Especie: virus del melón de Ourmia, Especie virus de mancha
zonificada del Pelargonium.
En la Figura 1 se muestra el principio general
de la invención. Se sabe que los virus de ARN de planta (una
excepción son los viroides -pequeños ARN no codificantes que
amplifican en el núcleo de la célula de la planta- para un repaso,
véase Diener T.O., 1999, Arch. Virol. Suppl., 15,
203-220; Flores, R., 2001, CR Acad. Sci.
Ill, 324, 943-952) nunca se producen en el
núcleo de la planta, sino en el citoplasma. Por lo tanto, las
secuencias de los virus de ARN pueden no estar adaptadas para
soportar los eventos de procesamiento del ARN nuclear debido a la
presencia de motivos que pueden estar implicados en series complejas
de etapas del procesamiento, incluyendo el transporte del ARN
procesado en el citoplasma, en el que están implicados los
precursores pre-ARNm, ARNr y ARNt. Los eventos de
procesamiento, tales como la terminación en el extremo 5', el corte
y empalme, la generación del extremo 3', la poliadenilación,
degradación, la modificación de bases y azúcares, así como la
corrección (en plastidios y mitocondrias) se estudian
intensivamente. Sin embargo, muchos elementos de esos eventos aún
permanecen poco claros. Los cambios más drásticos para el
pre-ARNm en el núcleo suceden durante el corte y
empalme del pre-ARNm, el proceso por el cual las
secuencias de ARN que intervienen (intrones) se eliminan del
transcrito inicial y los exones se ligan simultáneamente. El
espliceosoma media el corte y empalme, una compleja estructura que
comprende partículas pequeñas de ribonucleoproteína ricas en
uridilato. El espliceosoma realiza la reacción de corte y empalme en
dos etapas consecutivas: la primera -la escisión en el sitio de
corte y empalme 5' aguas arriba de la unión exón/intrón que conduce
a la formación del bucle, y una segunda etapa -la escisión en el
sitio de corte y empalme 3' de la unión intrón/exón aguas abajo
seguido por ligamiento de exones aguas arriba y aguas abajo (para
repaso ver: Kramer, A., 1996, Annu. Rew. Biochem., 65,
367-409; Simpson, GG. & Filipowicz, W. 1996,
Plant. Mol. Biol., 32, 1-41). Los
dinucleótidos 5' y 3' del sitio de corte y empalme (5'/GU; AG/3')
que flanquean las secuencias intrónicas están muy conservados en
plantas superiores y una sola sustitución G podría abandonar la
actividad de corte y empalme en el sitio en cuestión lo que
sorprende a pesar de una alta conservación de los sitios de corte y
empalme entre plantas y animales, los intrones heterólogos en las
plantas usualmente no se cortan y empalman o no se cortan y
empalman incorrectamente (van Santen, VL. et al., 1987,
Gene, 56, 253-265; Wiebauer, K., Herrero,
J.J., Filipowicz, W. 1988, Mol. Cel. Biol., 8,
2042-2051). Considerando que los ARN virales de
planta no estuvieran bajo presión evolutiva para resistir la
maquinaria de procesamiento del ARN nuclear, posiblemente estos ARN
se someterían mucho a este procesamiento, incluyendo el corte y
empalme una vez que están colocados en el ambiente nuclear. Esta
situación es completamente diferente de la de los transcritos de
ARN codificados por los genes nucleares, ya que los últimos
transcritos están adaptados evolutivamente para conservar su
funcionalidad, a pesar de las series de modificaciones del ARN que
tienen lugar en el núcleo. Sin embargo, esas modificaciones pueden
tener consecuencias drásticas para la formación del replicón de ARN
viral. La remodificación por ingeniería genética del virus de
planta, para hacer vectores de expresión para los genes
heterólogos, puede agregar más a la inestabilidad de los replicones
basados en virus de ARN, ya que añadiría otros elementos que
podrían interaccionar con las secuencias de ARN de origen viral,
produciendo ARN defectuoso que sea incapaz de replicar. La
invención aborda estos problemas sometiendo al vector de expresión
a modificaciones que incrementan significativamente la frecuencia de
la formación del replicón de ARN funcional, cuando el vector de
expresión se introduce como un precursor de ADN en plantas o células
de plantas, para proporcionar la expresión transitoria o la
integración estable en el ADN cromosomal de la planta. Se cree que
las modificaciones de las secuencias derivadas de virus deben ser la
solución más profunda para aumentar la eficacia de los replicones
basados en virus de ARN. Esta invención se centró predominantemente
en las modificaciones (las diferencias conservadoras de la función)
dentro de las secuencias derivadas del virus de ARN de planta, ya
que estas son cruciales para aumentar la eficacia de la formación
del replicón de ARN.
Sorprendentemente, el primer intento para
encontrar pruebas de que existen las regiones potencialmente
problemáticas tuvo éxito y, aún más sorprendente, se obtuvo la
confirmación experimental al encontrar inesperadamente una mejora
de órdenes de magnitud. Un análisis de la secuencia derivada del
virus de ARN del vector de expresión plCH8543 (Ejemplo 1, Figura
6A) usando el programa del servidor Netgenell
(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/) para detectar la
presencia de intrones crípticos y sitios de corte y empalme de ARN,
mostró la presencia de regiones parecidas a intrones que la
maquinaria de procesamiento del ARN nuclear podrían cortar y
empalmar (ver las regiones rodeadas por un circulo en la Fig. 2).
Hay muchos otros programas que pueden usarse para identificar las
regiones potencialmente problemáticas (las ubicaciones
seleccionadas) dentro de las secuencias de ARN viral de planta,
tales como el programa de predicción de exón/intrón
(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html), o el programa de predicción de
señal de corte y empalme
(http://125.itba.mi.cnr.it/\simwebgene/www.spliceview.html), para
diversos organismos.
Considerando que ninguno de los programas
existentes son ideales y todos están sujetos a errores, las regiones
problemáticas potenciales también pueden determinarse
experimentalmente. Esto puede hacerse analizando los transcritos
derivados de un vector de ADN sometido a ensayo en un entorno
nuclear con la ayuda de técnicas rutinarias tales como la
RT-PCR (Frohman, MA., 1989, Methods Enzymol., 218,
340-356) o su versión más avanzada adecuada para la
cuantificación exacta de la concentración de diferentes transcritos,
denominada PCR en tiempo real (Gibson et al., 1996,
Genome Res., 6, 995-1001), preferiblemente
seguida por la secuenciación de los productos PCR amplificados. Las
diferencias de conservación de la función de la invención cambian
drásticamente el perfil del ARN, por ejemplo sustituyendo
secuencias de tipo intrón con las de tipo exón, por ejemplo,
introduciendo mutaciones silenciosas con sustitución de regiones
ricas en A/U (de tipo intrón) con regiones ricas en G/C (de tipo
exón) (ver Figura 3, regiones rodeadas con un circulo). Los intrones
de las plantas, a diferencia de los exones, son usualmente ricos en
A/T(U) (Lorkovic, ZJ. et al., 2000, Trends Plant
Sci., 5, 160-167; Brown, JW & Simpson, CG.
1998, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant. Mol. Biol., 49,
77-95; Csank, C. et al., 1990, Nucl. Acid
Res., 18, 5133-5141; Goodall & Filipowicz,
1989, Cell, 58, 473-483), pero hay
excepciones, por ejemplo, cuando en las plantas monocotiledóneas se
encontraron intrones ricos en G/C (Goodall & Filipowicz, 1989,
Cell, 58, 473-483; Goodall & Filipowicz,
1991, EMBOJ., 10, 2535-2644). Para la
realización práctica de esta invención, las ubicaciones
seleccionadas de alto contenido de A/T(U) son segmentos de
secuencia de al menos 20 nucleótidos de longitud con un contenido de
A/T(U) de al menos el 55%, preferiblemente al menos el 65%,
más preferiblemente el 80% o superior, u otros segmentos más cortos
("islas") de 6-19 nucleótidos en una fila de
secuencias conteniendo puramente A/T(U). En este documento,
las ubicaciones de alto contenido A/U incluyen secuencias que son
más ricas en A que en U, secuencias que son ricas en A, secuencias
que son más ricas en U que en A, y secuencias que son ricas en U.
Adicionalmente, cualquier secuencia transcrita de interés puede
ensayarse para las modificaciones
pos-transcripcionales que causan un cambio en las
secuencias de ácidos nucleicos (por ejemplo corte y empalme de ARN)
a través de RT-PCR (Frohman, MA. 1989, Methods
Enzymol., 218, 340-356). Para los familiarizados
con la técnica el uso de la RT-PCR es una tarea
obvia para detectar en el ARN regiones sometidas a modificaciones
post-transcripcionales, como deleciones de
secuencias del transcrito de ARN original. En el Ejemplo 2 se
demuestra que la modificación de la región rica en A/U aumenta al
menos 10 veces el número de células que expresan GFP. Esto se
demuestra claramente en la Fig. 7 comparando las áreas
agroinfiltradas con plCH15466 (vector modificado, Fig.6A) y
plCH14833 (vector de control, Figura 6A). Eliminando la proteína de
desplazamiento (MP) se permite un recuento exacto de las células
primarias que poseen replicones de ARN funcionales, ya que no se
realiza el desplazamiento de célula a célula desde el sitio de
infección primario hacia las células circundantes. En el Ejemplo 3,
se realizó la modificación de otra región de tipo intrón rica en U
que contiene muchos sitios crípticos de corte y empalme (Fig. 2B) y
que incluye el promotor subgenómico de la proteína de desplazamiento
(MP) (Figura 4, rodeada por un circulo). Esta modificación produjo
un efecto drástico en el aumento de la frecuencia de formación de
replicón a partir del vector viral plCH1590. Como se estableció en
los experimentos de recuento de protoplasto (Ejemplo 3), el aumento
fue aproximadamente de 100 veces en comparación con el vector
plCH14833 no modificado para las dos especies de Nicotiana
ensayadas - N. benthamiana y N. tobacco (véanse las
áreas infiltradas correspondientes en la Figura 7, A, B). En
general, usando los enfoques descritos en esta invención, la
frecuencia de formación de replicón de ARN puede aumentarse
aproximadamente 300 veces, por ejemplo, aumentando la proporción de
células con replicones funcionales desde aproximadamente el 0,2%
(vector de control) hasta más de 50% (vector modificado). Se cree
que este no es el límite, y que es muy realista el alcanzar una
frecuencia del 100%.
Esta alta eficacia de formación del replicón
abre la puerta para expresar dos o más genes diferentes a partir de
dos replicones de ARN diferentes con la misma célula de planta, por
ejemplo, k.o.-expresando genes diferentes usando vectores basados
en virus de ARN de planta. El logro de la liberación sincronizada de
dos o más replicones al mismo tiempo en la misma célula es crucial
para esa co-expresión, ya que el principio
"primero en llegar, primero en servirse" es especialmente
cierto para los vectores virales. El desplazamiento sistémico o de
célula a célula no ayuda, ya que los diferentes vectores virales
normalmente no se solapan en sus áreas de distribución, o dicho
solapado no es significativo. Cálculos simples demuestran la
importancia de la tecnología descrita en esta invención para lograr
la co-expresión de dos secuencias de interés en la
misma célula de planta a partir de dos replicones. En el caso de un
vector viral no optimizado con una frecuencia de formación de
replicón funcional de sólo el 0,2% de todas las células, la
proporción de células que co-expresan dos genes a
partir de dos replicones de ARN diferentes será de 0,2x0,2=0,04%,
mientras que para la construcción con la frecuencia aumentada de
formación de replicón de ARN funcional (el 50%, ó 1/2 de todas las
células), esa proporción de células será de 0,5x0,5=0,25, por
ejemplo, aproximadamente 625 veces mayor. Con algunos de los
vectores con mejor rendimiento (por ejemplo, el plCH16191, Fig.
7C), la proporción de células que tiene el replicón funcional
alcanza aproximadamente el 90% (Fig. 7C, parte superior derecha).
Esto significa que al usar ese vector para expresar dos secuencias
de interés diferentes a partir de dos replicones independientes, la
co-expresión puede tener lugar aproximadamente en
el 80% de todas las células. Parece muy posible que la tecnología
pueda mejorarse más y que pueda alcanzarse el 100% de
co-expresión.
Cabe señalar que las diferencias de conservación
de la función en las secuencias heterólogas de interés a expresar a
partir del replicón de ARN también podrían usarse para aumentar la
frecuencia de formación del replicón de ARN, particularmente en
combinación con diferencias en las secuencias para la función del
replicón. Por ejemplo, pueden introducirse dentro de esas
secuencias de interés las modificaciones que son necesarias para la
formación y/o el procesamiento del replicón.
En una realización importante de esta invención,
la frecuencia de formación del replicón se mejora insertando
intrones nucleares en las secuencias para la formación del replicón
(Ejemplo 4). La incorporación de intrones dentro de la región de
codificación de la polimerasa de ARN dependiente del ARN viral
(RdRP) (Ejemplos 4 y 8) resultó en un aumento significativo (al
menos de 50 veces) en la frecuencia de formación del replicón a
partir de (FIGURA 7 A, B) vectores que portaban las diferencias de
conservación de la función como se definen en este documento
(plCH15034, plCH15025, plCH15499, en la Fig. 6, A, B). El perfil de
ARN para un vector que contenía insertados 6 intrones de
Arabidopsis se muestra en la Fig. 5. En otro ejemplo (Ejemplo 7), la
inserción de intrones en las secuencias MP aumenta la frecuencia de
formación del replicón al menos 100 veces.
Para llevar a cabo la realización práctica de la
invención pueden usarse muchos intrones nucleares. Los ejemplos de
esos intrones incluyen, pero sin limitación, los intrones
tpiAct1 del arroz, y los genes salT (Rethmeier et
al., 1997, Plant J.,12, 895-899; Xu et
al., 1994, Plant Physiol., 100, 459-467;
McElroy et al., 1990, Pnat Cell, 2,
163-171); los Adh1, GapA1 del maíz, genes actin y
Bz1 (Callis et al., 1987, Genes Dev., 1,
1183-11200; Donath et al., 1995, Plant
Mol. Biol., 28, 667-676; Maas et al.,
1991, Plant Mol. Biol., 16, 199-207;
Sinibaldi & Mettler, 1992, en WE Cohn, K Moldave, eds,
Progress in Nucleic Acids Research and Molecular Biology,
vol 42, Academic Press, New York, págs: 229-257),
del gen SSU301 ribisco de la petunia (Dean et al., 1989,
Plant Cell, 1, 201-208), los genes A1
EF1\alpha, UBQ10, UBQ3, PAT1 de Arabidopsis (Curie et
al., 1993, Mol. Gen. Genet. 228, 428-436;
Norris et al., 1993, Plant Mol. Biol., 21,
895-906; Rose & Last, 1997, Plant J., 11,
455-464), y muchos otros. También pueden usarse
intrones sintéticos para esta invención. Los intrones más pequeños o
sus partes que pueden usarse pueden estar limitados para el corte y
empalme de los sitios donante y aceptor que usualmente flanquean
las secuencias intrónicas internas. Preferiblemente, los intrones
deberían tener un tamaño de al menos 50 nucleótidos (nt), más
preferiblemente un tamaño de 100 a 200 nt., pero en realidad no hay
limitaciones respecto al tamaño de los intrones. Sin embargo, el
tamaño de la construcción debería mantenerse adecuado para las
manipulaciones. El origen del intrón, su estructura y su tamaño
pueden seleccionarse de forma individual dependiendo de la
naturaleza del vector. Los experimentos de expresión
transitoria pueden usarse para probar la eficacia de un intrón seleccionado o de las correspondientes partes del intrón.
transitoria pueden usarse para probar la eficacia de un intrón seleccionado o de las correspondientes partes del intrón.
Las modificaciones descritas anteriormente
tienen un efecto acumulativo, por ejemplo, si la(s)
inserción(es) intrónica se combina con una modificación del
promotor subgenómico MP, el incremento en la frecuencia de formación
del replicón puede ser de aproximadamente 300 veces (Ejemplo 5).
Las regiones preferibles para la inserción del intrón, con objeto
de tener un incremento en la frecuencia de formación del replicón de
ARN, se denominan en este documento ubicaciones seleccionadas. Esas
ubicaciones pueden contener estructuras "de tipo intrón". Esto
se confirma con la inserción de intrones en el MP, de hecho en
proximidad cercana con una región problemática como el promotor
subgenómico MP (Ejemplo 7). Se observó un incremento en 100 veces en
la frecuencia de formación del replicón. La inserción de intrones
dentro de regiones "de tipo exón" no tiene un efecto tan
pronunciado como la inserción en las regiones de tipo intrón
(Ejemplo 6).
Los experimentos descritos anteriormente se
realizaron con sistemas de expresión transitoria basados en el
suministro del precursor de ADN mediado con Agrobacterium dentro de
las células de la planta. Sin embargo, la aplicación más útil de
esta invención será para las plantas transgénicas con un precursor
de ADN del replicón de ARN incorporado de manera estable dentro de
un cromosoma nuclear de la planta. Esto permite superar muchas
limitaciones de los sistemas basados en el vector viral de planta,
tales como las restricciones para el tamaño máximo de las
secuencias heterólogas que pueden tolerar los vectores virales. Dado
que el precursor de ADN estará presente en cada célula de la planta
transgénica, no hay requerimiento absoluto para el desplazamiento
sistémico o para el desplazamiento de célula a célula del replicón
de ARN (propagación del replicón). Esto puede compensarse con la
alta eficacia de formación y transporte de los replicones de ARN de
la invención dentro del citoplasma. Sin embargo, la capacidad del
vector para el movimiento de célula a célula puede ser de valor
adicional, ya que la formación del replicón de ARN no siempre ocurre
en todas las células.
Pueden usarse diferentes métodos para
proporcionar una célula de planta con el ADN heterólogo. Los
vectores pueden transformarse en células de planta a través de un
vector Ti de plásmido portado por Agrobacterium (documentos
US 5,591,616; US 4,940,838; US 5,464,763) o por bombardeo de
partículas o microproyectiles (documentos US 05100792; EP
00444882B1; EP 00434616B1). También pueden usarse otros métodos de
transformación de la planta tales como microinyección (documentos
WO 09209696; WO 09400583A1; EP 175966B1), electroporación
(documentos EP00564595B1; EP00290395B1; WO 08706614A1) o
transformación de protoplastos mediada con PEG, etc. La elección
del método para suministrar el vector puede depender de la especie
de planta a transformar. Por ejemplo, el bombardeo de
microproyectiles se prefiere generalmente para la transformación de
monocotiledóneas, mientras que para las dicotiledóneas da por lo
general mejores resultados la transformación mediada por
Agrobacterium.
En los ejemplos descritos más adelante, se usa
el suministro de vectores mediado con Agrobacterium (dichos ADN
heterólogos) dentro de células de Nicotiana. Sin embargo, los
vectores pueden introducirse en las plantas de acuerdo con
cualquiera de las técnicas convencionales adecuadas para la
transformación estable o transitoria de la especie de planta de
interés. Las técnicas de transformación para las dicotiledóneas son
muy conocidas en la técnica e incluyen las técnicas basadas en
Agrobacterium y las técnicas que no requieren
Agrobacterium. Las técnicas sin Agrobacterium implican
la captación del material genético exógeno directamente por los
protoplastos o las células. Estas técnicas incluyen la captación
mediada con PEG o electroporación, el suministro mediado por
bombardeo y la microinyección. Los ejemplos de estas técnicas se
describen en Paszkowski et al., EMBO J 3,
2717-2722 (1984), Potrykus et al., Mol. Gen.
Genet. 199, 169-177 (1985), Reich et
al., Biotechnology 4:1001-1004 (1986), y Klein
et al., Nature 327, 70.73 (1987). En cada caso, las células
transformadas se regeneran a plantas completas usando técnicas
convencionales.
La transformación mediada con
Agrobacterium es una técnica preferible para la
transformación de las dicotiledóneas debido a su alta eficacia de
transformación y su amplia utilidad con muchas especies diferentes.
Las muchas especies de cultivos que pueden transformarse de manera
rutinaria con Agrobacterium incluyen tabaco, tomate,
girasol, algodón, semilla de colza, patata, frijol de soja, alfalfa
y álamo (documentos EP 0 317 511 (algodón), EP 0 249 432 (tomate) WO
87/07299 (Brassica), US 4,795,855 (álamo)).
La transformación con Agrobacterium
implica típicamente la transferencia del vector binario que porta
el ADN extraño de interés dentro de una cepa adecuada de
Agrobacterium que puede depender del complemento de genes
vir portados por la cepa huésped Agrobacterium ya sea
en un plásmido co-residente o cromosómicamente
(Uknes et al., Plant Cell 5:159-169
(1993). La transferencia del vector binario recombinante a
Agrobacterium puede lograrse por un procedimiento de
acoplamiento triparental usando E. coli portadora del vector
binario recombinante, una cepa auxiliar de E. coli que porte
un plásmido tal como el pRK2013, que es capaz de movilizar al
vector binario recombinante hacia la cepa diana de
Agrobacterium. Alternativamente, el vector binario
recombinante puede transferirse a Agrobacterium por
transformación del ADN (Höfgen & Willmitzer, Nucl. Acids Res.
16, 9877 (1988)).
La transformación de la especie diana de planta
por Agrobacterium recombinante usualmente implica el
co-cultivo de Agrobacterium con explantes de
la planta siguiendo los protocolos conocidos en la técnica. El
tejido transformado que porta un marcador de resistencia a un
antibiótico o un herbicida presente entre los bordes del
T-ADN del plásmido binario puede regenerarse en el
medio seleccionable. Esto permite la generación de plantas
transgénicas transformadas de manera estable en un cromosoma nuclear
con un T-ADN que contenga el ADN heterólogo de la
invención.
En los ejemplos de esta invención, en paralelo
con la agro-transformación estable, se usa la
agro-inoculación, un método de suministro mediado
con Agrobacterium del T-ADN para la expresión
transitoria del gen (o los genes) de interés (Vaqueo et al.,
1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96,
11128-11133). La agro-inoculación
es una herramienta extremadamente útil no sólo para los sistemas de
producción de pequeña a mediana escala de proteína recombinante,
sino como un elemento de un sistema de optimización de vector, que
permite obtener resultados rápidos con diferentes variantes de
construcciones.
La invención también puede usarse para la
producción industrial a gran escala de proteínas recombinantes. En
los experimentos se usan cultivos de Agrobacterium durante una
noche. El cultivo durante una noche se preparó por
agro-infiltración, como se describe en la técnica
anterior (Marillonnet et al., 2004, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 101, 6853-6857). Usualmente, un
cultivo de una noche alcanza una densidad óptica (D.O.) de
3-3,5 unidades a una longitud de onda de 600 nm y se
diluye 3-5 veces antes de la
agro-infiltración, produciendo en general
5-9 x 10^{9} unidades formadoras de colonias
(Turpen et al. 1993, J. Virol. Methods, 42,
227-240). Se ha observado que una dilución de
10^{2}, preferiblemente de 10^{3} y más preferiblemente de
10^{4} veces de un cultivo de una noche funciona de modo muy
eficaz, especialmente en combinación con secuencias para la función
del replicón que tengan las diferencias de conservación de la
función como se describe en este documento. Sorprendentemente, los
vectores en las hojas de tabaco infiltradas mejoraron más su
rendimiento dando una mejor producción de GFP con diluciones
crecientes de la Agrobacteria transformante. Por ejemplo, una
dilución de 10^{3} veces dio mejor resultado que una dilución de
10^{2} veces. Una dilución de 10^{2} veces proporciona mejor
producción de GFP que una dilución de 10 veces. Una posible
explicación para este fenómeno es el efecto negativo de la
suspensión altamente concentrada de Agrobacterium en la
función de un vector viral, por ejemplo, en el desplazamiento de
célula a célula, posiblemente como resultado de una respuesta de la
planta a las altas concentraciones de la bacteria patógena. Este
fenómeno es de especial valor para los procesos industriales a gran
escala de expresión de la proteína, ya que permite reducir la
cantidad de agrobacteria necesaria para la producción de la
proteína recombinante mediante la agroinfiltración en al menos un
orden de magnitud en comparación con los procesos de la técnica
anterior.
En el Ejemplo 9 de esta invención, un precursor
de ADN de un replicón inactivado basado en ARN viral se incorpora
de manera estable en el ADN cromosomal. El replicón se optimiza de
acuerdo con la invención. Además, el replicón contiene una
estructura que impide la expresión de la secuencia de interés. La
expresión, así como la formación del replicón de ARN funcional,
puede activarse invirtiendo una parte de la construcción con la
ayuda de la recombinación específica del sitio. Esta inversión
puede conducir a la formación de dos intrones así como al
ensamblaje de una secuencia funcional de interés. El sistema
descrito en el Ejemplo 9 no solo muestra la optimización de un
vector viral, sino también la solución para evitar el "escape"
de construcciones establemente integradas en el ADN cromosomal,
incluyendo la expresión "de escape" del gen de interés a partir
de esa construcción. En muchas aplicaciones, es crucial tener nivel
cero de expresión en el estado no inducido, especialmente para las
proteínas citotóxicas o para alcanzar altos estándares de
bioseguridad con los sistemas de expresión de planta para expresar
proteínas técnicas o farmacéuticas.
La transcripción del ADN heterólogo y/o de la
recombinasa puede estar bajo el control de un promotor inducible o
de cualquier otro regulable (por ejemplo, regulado en términos del
desarrollo). Los promotores inducibles pueden ser divididos en dos
categorías de acuerdo con sus condiciones de inducción: los
inducidos por factores abióticos (temperatura, luz, sustancias
químicas) y los que pueden inducirse por factores bióticos, por
ejemplo, ataque de patógenos o plagas. Los ejemplos de la primera
categoría son promotores inducibles por calor (documento US
05187287) e inducibles por frío (documento US 05847102), un sistema
inducible por cobre (Mett et al., 1993, Proc. Natl. Acad.
Sci., 90, 4567-4571), sistemas inducibles por
esteroides (Aoyama & Chua, 1997, Plant J., 11,
605-612; McNellis et al., 1998, Plant
J., 14, 247-257; documento US 06063985), y
sistema inducible por etanol (Caddick et al., 1997,
Nature Biotech., 16, 177-180; documento WO
09321334), y un sistema inducible por tetraciclina (Weinmann et
al., 1994, Plant J., 5, 559-569). Uno de
los más recientes desarrollos en el área de los sistemas
químicamente inducibles para plantas es un promotor quimérico que
puede activarse por dexametasona glucocorticoide y desactivarse por
tetraciclina (Bohner et al., 1999, Plant J., 19,
87-95). Para un repaso sobre los sistemas
químicamente inducibles ver: Zuo y Chua (2000, Current Opin.
Biotechnol., 11, 146-151) y Padidam, M (2003,
Curr. Opin. Plant Biol., 6, 169-177). Otros
ejemplos de promotores inducibles son los promotores que controlan
la expresión de los genes relacionados con la patogénesis (PR) en
plantas. Estos promotores pueden inducirse a través del tratamiento
de una planta con ácido salicílico, un componente importante de las
rutas de señalización de la planta en respuesta al ataque patógeno,
o de otros compuestos químicos
(benzo-1,2,3-tiadiazol o ácido
isonicotínico) que son capaces de desencadenar la expresión del gen
PR (documento US 05942662).
Esta invención no se limita a los vectores
basados en TMV que se describen en los ejemplos 1-9,
sino que puede extenderse a los replicones basados en otros virus
de ARN de planta. El análisis de otras secuencias de ARN viral de
la planta (Ejemplo 10, Figuras 10, 11) muestra ubicaciones
seleccionadas muy similares a las descritas para el TVM y las
secuencias de los genes nucleares pre-ARNM de planta
(Fig. 9). Esta es una fuerte evidencia que soporta la sugerencia de
que, usando los enfoques descritos en esta invención, prácticamente
cualquier replicón derivado de virus de ARN de planta puede
mejorarse, fundamentalmente eliminando/sustituyendo las regiones
problemáticas y/o insertando intrones nucleares.
La presente invención se realiza preferiblemente
con plantas multicelulares superiores, partes de las mismas o
cultivos celulares de las mismas. Las plantas para el uso en esta
invención incluyen cualquier especie de planta, dando preferencia a
las especies agronómica y horticulturalmente importantes. Las
plantas de cultivo comunes para uso en la presente invención
incluyen alfalfa, cebada, judías, colza, guisante, algodón, maíz,
trébol, loto, lenteja, altramuz, mijo, avena, guisantes, cacahuetes,
arroz, centeno, trébol dulce, girasol, guisante dulce, semilla de
soja, triticale de sorgo, judías de hilo, judía aterciopelada,
algarrobo, trigo, glicina y plantas con nuez. Las especies de
plantas preferibles para la realización práctica de esta invención
incluyen, pero no se restringen a, las representativas de las
Gramíneas, las Compuestas, las Solanáceas y las Rosáceas.
Otras especies preferidas para el uso en esta
invención son las plantas de los siguientes géneros: Arabidopsis,
Agrostis, Allium, Apium, Arachis, Asparagus, Atropa, Avena, Bambusa,
Brassica, Bromus, Browaalia, Camellia, Cannabis, Capsicum, Cicer,
Chenopodium, Chichorium, Citrus, Coffea, Coix, Cucumis, Curcubita,
Cynodon, Dactylis, Datura, Daucus, Digitalis, Dioscores, Elaeis,
Eleusine, Festuca, Fragaria, Geranium, Glycine, Helianthus,
Heterocallis, Hevea, Hordeum, Hyoscyamus, Ipomoea, Lactuca, Lens,
Lilium, Linum, Lolium, Lotus, Lycopersicon, Majorana, Malus,
Mangifera, Manihot, Medicago, Nemesia, Nicotiana, Onobrychis, Oryza,
Panicum, Pelargonium, Pennisetum, Petunia, Pisum, Phaseolus,
Phleum, Poa, Prunus, Ranunculus, Raphanus, Ribes, Ricinus, Rubus,
Saccharum, Salpiglossis, Secale, Senecio, Setaria, Sinapis,
Solanum, Sorghum, Stenotaphrum, Theobroma, Trifolium, Trigonella,
Triticum, Vicia, Vigna, Vitis, Zea, y las Olireae, las Pharoideae, y
muchas otras.
Las plantas más preferidas para esta invención
son plantas que no entran en la cadena alimenticia animal o humana,
como especies de Nicotiana, por ejemplo, Nicotiana
benthemiana y Nicotiana tabacum.
Las proteínas de interés, sus fragmentos
(funcionales o no funcionales) y sus derivados artificiales que
pueden expresarse en plantas o en células de plantas usando la
presente invención incluyen, pero no se limitan a, enzimas
modificadoras de almidón (sintasa de almidón, enzima de
fosforilación de almidón, enzima de desrramificación, enzima
ramificadora del almidón, enzima II ramificado ra de almidón,
sintasa de almidón unida a gránulos), sintasa de fosfato de
sacarosa, fosforilasa de sacarosa, poligalacturonasa, polifructano
sacarasa, fosforilasa ADP de glucosa, ciclodextrin
glucosiltransferasaa, fructosil transferasa, glucógeno sintasa,
pectin esterasa, aprotinina, avidina, levansucrasa bacteriana,
proteína glgA, MAP4 y ortólogos de E. coli, enzima del
metabolismo/asimilación de nitrógeno, glutamina sintasa, osmotina
de planta, albúmina 2S, taumatina, recombinasa/integrasa específica
del sitio (FLP, Cre, recombinasa R, Int, Integrasa R SSVI, Integrasa
phiC31, o un fragmento activo o variante de la misma), enzimas
modificadoras de aceite (como desaturasas de ácidos grasos,
elongasas, etc.), isopentenil transferasa, Sca M5 (calmodulina de
semilla de soja), toxina de tipo coleopterana o un fragmento
insecticidamente activo, proteínas de fusión de la enzima de
conjugación a ubiquitina (E2), enzimas que metabolizan lípidos,
aminoácidos, azúcares, ácidos nucleicos y polisacáridos, superóxido
dismutasa, forma inactiva de proenzima de una proteasa, toxinas de
proteína de planta, características que modifican la fibra en las
plantas productoras de fibra, toxina activa de Coleopterana de
Bacillus thurinigiensis (toxina Bt2, proteína de cristal
insecticida (ICP), toxina CryIC, endotoxina delta, toxina
polipeptídica, protoxina, etc.), toxina AaIT específica de insecto,
enzimas de degradación de la celulosa, celulasa E1 de
Acidothermus celluloticus, enzimas modificadoras de lignina,
cinnamoil alcohol deshidrogenada,
trehalosa-6-fosfato sintasa, enzimas
de la ruta metabólica de la citoquinina, reductasa
HMG-CoA, pirofosfatasa inorgánica de E. Coli,
proteína de almacenamiento de semilla, sintasa licopeno de
Erwinia herbicola, oxidasa ACC, proteína codificada por
pTOM36, fitasa, quetohidrolasa, acetoacetil reductasa CoA, sintasa
PHB (polihidroxibutanoato), enzimas implicadas en la síntesis de los
polihidroxilalcanoatos (PHA), proteína portadora de acilo, napina,
EA9, sintasa fitoena de planta no superior, proteína pTOM5
codificada, ETR (receptor de etileno), diquinasa plastídica de
piruvato fosfato, proteína de poro de transmembrana inducible por
nematodos, características que potencian la función fotosintética o
plastidial de la célula de planta, estilbeno sintasa, una enzima
capaz de hidroxilar fenoles, catecol dioxigenasa, catecol
2,3-dioxigenasa, cloromuconato cicloisomerasa,
antranilato sintasa, proteína AGL15 de Brassica, fructosa
1,6-bifosfatasa (FBPasa), ARN3 de AMV, replicasa
PVY, replicasa PLRV, proteína de cubierta de potivirus, proteína de
cubierta de CMV, proteína de cubierta de TMV, replicasa de
luteovirus, ARN mensajero de MDMV, replicasa mutante germiniviral,
C12:0 de Umbellularia californica, prefiriendo
acil-ACP tioesterasa, C10 ó C12:0 de planta
prefiriendo acil-ACP tioesterasa, C14:0 prefiriendo
acil-ACP tioesterasa (luxD), factor A de sintasa de
planta, factor B de sintasa de planta, desaturasa D6, proteínas que
tengan una actividad enzimática en la biosíntesis y modificaciones
de los ácidos grasos, p. ej. la \beta-oxidación
peroxisomal de los ácidos grasos en las células de planta,
acil-CoA oxidasa,
3-quetoacil-CoA tiolasa, lipasa,
acetil-CoA carboxilasa del maíz, etc.;
5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato
sintasa (EPSP), fosfinotricin acetil transferasa (BAR, PAT),
proteína CP4, deaminasa ACC, proteína que tenga sitio de escisión
post-traduccional, gen DHPS que confiera resistencia
a la sulfonamida, nitrilasa bacteriana, 2,4-D
monooxigenasa, acetolactato sintasa o acetohidroxiácido sintasa
(ALS, AHAS), poligalacturonasa, Taq polimerasa, nitrilasa
bacteriana, muchas otras enzimas de origen bacteriano o de fagos
incluyendo las endonucleasas, metilasas, ligasas de ADN y ARN,
polimerasas de ADN y ARN, transcriptasas inversas, nucleasas (DNasas
y RNasas), fosfatasas, transferasas, etc.
de restricción.
de restricción.
La presente invención puede usarse para el
propósito de cultivo y purificación molecular de proteínas
comercialmente valiosas y farmacéuticamente importantes incluyendo
enzimas industriales (celulasas, lipasas, proteasas, fitasas, etc.)
y proteínas fibrosas (colágeno, proteína de la seda de arañas,
etc.). La proteína de la salud humana o animal puede expresarse y
purificarse usando el enfoque descrito en esta invención. Los
ejemplos de esas proteínas de interés incluyen, entre otras, las
proteínas de respuesta inmune (anticuerpos monoclonales, anticuerpos
monocatenarios, receptores de células T, etc.), antígenos
incluyendo los derivados de microorganismos patógenos, factores
estimulantes de colonias, relaxinas, hormonas polipeptídicas
incluyendo somatotropina (HGH) y proinsulina, citocinas y sus
receptores, interferones, factores de crecimiento y factores de
coagulación, enzima lisosomal enzimáticamente activa, polipéptidos
fibrinolíticos, factores de coagulación sanguínea, tripsina,
tripsinógeno, a1-antitripsina (AAT), albúmina de
suero humana, glucocerebrosidasas, toxina B nativa del cólera,
trombina, lipasa gástrica humana, factor estimulante de colonias de
macrófagos-granulocitos (GM-CMF),
serpina, lactoferrina, lisozima, oleosina, protrombina,
alfa-galactosidasa, así como proteínas conservadoras
de funciones como fusiones, versiones mutantes y derivados
sintéticos de las proteínas anteriores.
\vskip1.000000\baselineskip
Para ilustrar la presente invención se presentan
los siguientes ejemplos. Pueden hacerse modificaciones y
variaciones, sin apartarse del espíritu y alcance de la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron los ADNc clonados del tobamovirus
infeccioso de crucíferas (cr-TMV; Dorokhov et
al., 1994, FEBBS Lett. 350, 5-8) y del
virus aclarador de la vena del nabo (TVCV; Lartey et al.,
1994, Arch. Virol.138, 287-298), del
Profesor Atabekov de la Universidad de Moscú, Rusia. Se fabricó, en
varias etapas de clonación, un vector viral que contenía una
proteína de fluorescencia verde (GFP). La construcción resultante,
plCH8543) (Fig. 6A), contiene en orden secuencial: un fragmento de
787 pb (pares de bases) del promotor actina 2 de Arabidopsis
(ACT2, ref. An et al., 1996, acceso a GenBank
AB026654, de 57962 a 58748 pb), el extremo 5' del TCVC (acceso a
GenBank BRU03387, de 1 a 5455 pb), un fragmento de
cr-TMV (acceso a GenbBank Z29370, 5457 a 5677 pb,
con timina 5606 cambiada a citosina para eliminar el codón de inicio
de la proteína de cubierta, CP), las secuencias "taa tcg ata act
cga g", un gen sintético de GFP (sGFP), región 3' no traducida
de cr-TMV (3'NTR; acceso a GenBank Z29370, 6078 a
6312 pb), y finalmente el terminador de nopalina sintasa (Nos). El
fragmento completo se clonó entre los bordes izquierdo (LB) y
derecho (RB) del T-ADN del plCBV10, un vector
binario derivado del Carb^{R} pBIN19. El plCH8543 se transformó en
la cepa GV3101 de Agrobacterium y se infiltró en una hoja de
Nicotiana benthamiana. Los focos de fluorescencia de GFP que
aparecieron a 3 dpi crecieron y se volvieron confluentes.
Sorprendentemente, aunque la mayoría de las células en el área
infiltrada finalmente expresaron la GFP debido a la replicación
viral y al desplazamiento, sólo una fracción de las células
iniciaron la replicación, como se detectó mediante varios focos que
expresaban GFP independientemente. Resultó claro que el factor
limitante no es el suministro de ADN a las células de la planta,
dado que la infiltración de las hojas de Nicotiana
benthamiana con un gen de GFP bajo control del promotor 35S
conduce a la expresión de GFP en casi todas las células en el área
infiltrada (no mostrado).
Para confirmar esta observación, se fabricó una
construcción de vector viral que contenía una mutación en el MP.
Esta construcción, denominada plCH14833, es similar al plCH8543 pero
difiere por una deleción del pb 389 en el gen MP, aguas arriba del
sitio EcoRI presente en el MP. La secuencia del fragmento NcoI para
EcoRI que incluye esta deleción se proporciona en el anexo como SEC
ID Nº: 1. Toda la construcción viral (desde el promotor ACT2 hasta
el terminador Nos) se clonó entre los bordes izquierdo y derecho
del T-ADN del plCBV49, un vector binario Kan^{R}
derivado de pBIN19. Debido a la deleción en el MP, los replicones
producidos a partir de esta construcción no pueden desplazarse de
célula a célula, pero pueden replicarse de manera autónoma dentro
de una célula. El desplazamiento de célula a célula puede
restablecerse cuando se proporciona MP en trans, por ejemplo, a
partir de un promotor constitutivo tal como el promotor 35S del
virus del mosaico de la coliflor.
Para fabricar una construcción de expresión de
MP, el gen TVCV de MP se amplificó por PCR a partir del ADNc del
TVCV clonado (acceso a GenBank Z29370, de 4802 a 5628 pb) y se
subclonó en un vector binario bajo el control del promotor 35S. La
construcción resultante, llamada plCH10745 (no mostrada), y el
plCH14833 se transformaron en la cepa GV3101 de
Agrobacterium y diversas diluciones de un cultivo durante una
la noche se infiltraron en hojas de Nicotiana benthamiana
como lo describen English y colegas (1997, Plant J., 12,
597-603), excepto en que el medio de infiltración
carecía de acetosiringona. La infiltración del plCH14833 solo,
condujo a la aparición de unas cuantas células de expresión de GFP
dentro del área infiltrada. Al realizar el recuento de los
protoplastos preparados procedentes del área infiltrada, se observó
que sólo de uno a tres protoplastos expresaban GFP de un total de
500 protoplastos (del 0,2 a 0,6%). La
co-infiltración de plCH14833 y plCH10745 condujo a
la formación de focos de expresión de la GFP que creció a partir de
cada célula inicial de expresión de GFP. Finalmente, debido al
deslazamiento de célula a célula, una gran proporción de células en
el área infiltrada expresaron GFP (Fig. 7A).
Los virus de ARN tales como los tobamovirus se
replican en el citoplasma y nunca entran al núcleo. Por lo tanto,
han evolucionado en un medio en el que no están expuestos a la
maquinaria de procesamiento del pre-ARNm nuclear.
Como resultado, no es sorprendente que los transcritos del replicón
de ARN generados en el núcleo a partir de las construcciones
virales artificiales no puedan reconocerse ni procesarse
correctamente por la maquinaria de procesamiento del ARN. Además,
los replicones de ARN procedentes de vectores virales son muy
grandes: aproximadamente de 7,000 nt en el caso del replicón basado
en TMV. Muy pocos genes de plantas tienen un tamaño tan grande y la
mayoría de esos genes que contienen intrones que facilitan el
procesamiento de los pre-ARNm, se exportan desde el
núcleo, y mejoran la estabilidad de los transcritos procesados. Por
lo tanto, se estableció la hipótesis de que las modificaciones de
los pre-ARNm que aumentarían la eficacia del
procesamiento exacto y de la exportación de los transcritos
correctamente procesados desde el núcleo hacia el citosol,
conducirían a un aumento del número de células que iniciarían la
replicación viral. Resultó que hay dos enfoques que pueden usarse
para fabricar vectores basados en virus de ARN que pueden iniciar de
modo más eficaz la replicación viral después del suministro de ADN
al núcleo: (1) un enfoque es la eliminación de las características
de secuencia que pueden inducir eventos de procesamiento no deseados
(tales como eventos alternativos de corte y empalme usando sitios
crípticos de corte y empalme, o eventos de terminación prematuros);
(2) un segundo enfoque es la adición de intrones para aumentar la
cantidad de transcritos procesados correctamente, para mejorar la
exportación del ARN desde el núcleo hacia el citoplasma, y/o para
mejorar la estabilidad de los transcritos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2 (ejemplo de
referencia)
Se analizó la secuencia del replicón de ARN del
plCH4351 usando el programa del servidor Netgenell
(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/) y se observaron diversas representaciones de secuencias de tipo intrón que podrían inducir eventos alternativos de corte y empalme. Una de esas características es una región de 0,6 kb rica en uridina (correspondiente a los nt 827 a 1462 en el acceso a GenBank BRU03387) al inicio del RdRP (Fig. 2A). Esta región se sustituyó en el plCH14833 por una secuencia mutagenizada por PCR que difiere de la secuencia original por una sustitución del nucleótido 54 (secuencia que se proporciona en el anexo como SEC ID Nº: 2; véase la Fig. 3). Las sustituciones del nucleótido 52 se hicieron para reemplazar las secuencias ricas en T por más secuencias ricas en GC. Todas las sustituciones de nucleótidos se hicieron silenciosas para no cambiar la secuencia de la proteína RdRP. Este fragmento mutagenizado también contiene dos sustituciones nucleotídicas (en la posición 829 y en la 1459; coordenadas con respecto al acceso a GenBank BRU03387) que se introdujeron para eliminar los supuestos sitios donantes de corte y empalme crípticos y los del aceptor, respectivamente). Para ensayar el efecto de estas mutaciones, el clon plCH15466 resultante (Fig. 6A) se agroinfiltró en hojas de N. benthamiana con o sin el plCH10745 (proteína de desplazamiento en trans). Ocho días después de la infiltración, se observó un aumento de 10 veces en el número de células de expresión de GFP en el área infiltrada con el plCH15466 (comparado con el plCH14833, Fig. 7). Esto sugiere que la eliminación de las secuencias de tipo intrón del amplicón viral impide los eventos indeseados de corte y empalme alternativos y da como resultado un inicio más eficaz de la replicación viral. La co-infiltración del plCH15466 y el plCH10745 conduce al desplazamiento de célula a célula del replicón modificado a una velocidad similar a la del replicón no modificado. Esto muestra que la modificación de la secuencia de ARN no afectó el desplazamiento de célula a célula del vector viral.
(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/) y se observaron diversas representaciones de secuencias de tipo intrón que podrían inducir eventos alternativos de corte y empalme. Una de esas características es una región de 0,6 kb rica en uridina (correspondiente a los nt 827 a 1462 en el acceso a GenBank BRU03387) al inicio del RdRP (Fig. 2A). Esta región se sustituyó en el plCH14833 por una secuencia mutagenizada por PCR que difiere de la secuencia original por una sustitución del nucleótido 54 (secuencia que se proporciona en el anexo como SEC ID Nº: 2; véase la Fig. 3). Las sustituciones del nucleótido 52 se hicieron para reemplazar las secuencias ricas en T por más secuencias ricas en GC. Todas las sustituciones de nucleótidos se hicieron silenciosas para no cambiar la secuencia de la proteína RdRP. Este fragmento mutagenizado también contiene dos sustituciones nucleotídicas (en la posición 829 y en la 1459; coordenadas con respecto al acceso a GenBank BRU03387) que se introdujeron para eliminar los supuestos sitios donantes de corte y empalme crípticos y los del aceptor, respectivamente). Para ensayar el efecto de estas mutaciones, el clon plCH15466 resultante (Fig. 6A) se agroinfiltró en hojas de N. benthamiana con o sin el plCH10745 (proteína de desplazamiento en trans). Ocho días después de la infiltración, se observó un aumento de 10 veces en el número de células de expresión de GFP en el área infiltrada con el plCH15466 (comparado con el plCH14833, Fig. 7). Esto sugiere que la eliminación de las secuencias de tipo intrón del amplicón viral impide los eventos indeseados de corte y empalme alternativos y da como resultado un inicio más eficaz de la replicación viral. La co-infiltración del plCH15466 y el plCH10745 conduce al desplazamiento de célula a célula del replicón modificado a una velocidad similar a la del replicón no modificado. Esto muestra que la modificación de la secuencia de ARN no afectó el desplazamiento de célula a célula del vector viral.
\vskip1.000000\baselineskip
Una segunda región posiblemente problemática
corresponde al promotor subgenómico de MP (Fig. 2B). Esta región es
muy rica en T y es muy parecida a las secuencias intrónicas. Como
consecuencia, se predicen muchos sitios donantes y aceptores de
corte y empalme crípticos en las secuencias cercanas a través de
programas de predicción de intrones. Por desgracia, en esta región
no pueden hacerse fácilmente modificaciones sin afectar la función
del promotor subgenómico. Se decidió mutagenizar completamente la
región completa sin considerar el promotor subgenómico, y
proporcionar MP en trans para compensar la pérdida esperada de la
expresión de MP. Como la MP no se expresará a partir de esta
construcción, también se delecionó la mayoría de la secuencia de MP
excepto las secuencias 3' que contenían el promotor subgenómico CP
que es necesario para dirigir la expresión del gen de interés. Por
lo tanto, se sustituyó un fragmento de 383 pb en el plCH14833 (de
4584 a 5455 pb en el acceso a GenBank BRU03387) por un fragmento
mutagenizado de 297 pb (SEC ID Nº: 3). La construcción plCH15900
resultante (Fig. 6A) se infiltró en hojas de Nicotiana
benthamiana con o sin el plCH10745. De forma interesante, se
detectó un fuerte incremento en el número de células que iniciaron
la replicación en comparación con las áreas de la hoja infiltradas
por el plCH14833. Al realizar el recuento de los protoplastos que
expresaban GFP preparados a partir de las áreas infiltradas de la
hoja, se estimó que esta modificación da como resultado un aumento
de 80 a 100 veces el número de células que iniciaron la replicación
viral, en comparación con el plCH14833 no modificado. El plCH15900
se co-infiltró con el plCH10745 (casete de expresión
MP de p35S) y se detectó un incremento en la fluorescencia GFP
debido al desplazamiento de célula a célula. Este aumento fue sin
embargo muy limitado debido a tantas células que ya expresaban GFP
aún en ausencia del desplazamiento de célula a célula. Una dilución
de 1000 veces (correspondiente aproximadamente a una DO calculada de
0,004 a 600 nm) de la suspensión de agrobacteria que contenía
plCH1500 co-infiltrado con una suspensión diluida
en 5 veces de agrobacteria que contenía plCH10745 (correspondiente
aproximadamente a una OD calculada de 0,8 a 600 nm) dio lugar al
focos separados de expresión de GFP. Los focos fluorescentes eran
tan brillantes y del mismo tamaño que los focos de control
obtenidos con el plCH14833. Esto confirma que la modificación en el
plCH15900 y el suministro de MP en trans no compromete la
funcionalidad del replicón referente al nivel de replicación, a la
expresión del gen de interés y al desplazamiento de célula a célula.
Las mismas construcciones (plCH14933 y plCH15900, con o sin el
plCH10745) se co-infiltraron a hojas de Nicotiana
tabacum. Las modificaciones en el plCH15900 condujeron a un
incremento similar en el número de células que iniciaron la
replicación (en comparación con el plCH14833) del que tuvieron en
N. benthamiana.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ensayó si la adición de intrones dentro de
las secuencias del pro-replicón viral incrementaría
la frecuencia del inicio de la replicación. Se fabricaron dos
construcciones, plCH15025 y plCH15034 (Fig. 6A), cada una
conteniendo tres diferentes intrones de Arabidopsis thaliana
en dos regiones diferentes del RdRP. El plCH15025 se diseñó para
contener intrones en el medio del RdRP, mientras que el plCH15034
contiene los intrones en el extremo 3' del RdRP, aguas arriba del
promotor subgenómico de MP. Los intrones se amplificaron por PCR a
partir de ADN genómico de Arabidopsis y se incorporaron en las
secuencias virales usando PCR con cebadores que solapaban las
uniones intrón/exón planeadas. Los fragmentos que contenían los
intrones se subclonaron en plCH14833 como un fragmento Aval HindIII
(SEC ID Nº: 4 en el anexo) para fabricar el plCH15025 o como un
fragmento Pst1 NcoI (SEC ID Nº: 5 en el anexo) para fabricar el
plCH15034.
Ambas construcciones se agroinfiltraron por
separado en hojas de N. benthamiana y se compararon con el
plCH14833. Ambas construcciones aumentaron de manera significativa
el número de células que iniciaron la replicación viral (Fig. 7A).
Se estimó que este aumento era del orden de una mejora de 50 veces
en relación con el plCH14833. Ambas construcciones también se
co-infiltraron con un clon de expresión de MP, y se
encontró que el desplazamiento de célula a célula era idéntico al
de los clones sin intrones. Ambas construcciones se probaron también
en N. tabacum, y se observó una mejora similar a la de N.
benthamiana (Fig. 7B).
Se fabricó un tercer clon, plCH15499, que
contenía los 6 intrones (Figuras 5, 6B, 7A, 7B). Esta construcción
se ensayó en N. benthamiana y en N. tabacum. Esta
construcción fue más eficaz que cada construcción individual con 3
intrones, pero sin embargo la mejora fue menos que aditiva.
\vskip1.000000\baselineskip
Al eliminar características de tipo intrón y
añadir intrones adicionales en una construcción se mostró que ambos
tipos de modificaciones pueden contribuir a mejorar el inicio de la
replicación viral. Se subclonaron los 6 intrones del plCH15499
dentro del plCH15900, que contenía la región mutagenizada del
promotor subgenómico de MP. El clon plCH15860 resultante se infiltró
en hojas de N. benthamiana y se encontró que operaba
significativamente mejor que cualquiera de los clones parentales
dentro del intervalo de aproximadamente el 50% al 90% de todos los
protoplastos que expresaban GFP (Fig. 7). La construcción con mejor
rendimiento contenía intrones en la región RdRP y en la región
modificada del promotor subgenómico de MP (plCH16191, Fig. 7C). En
comparación con un clon sin ninguna modificación, esto representa
una mejora de 80 a 300 veces. Esta construcción también se
co-infiltró con una construcción de expresión de MP
(plCH10745) y se encontró que las modificaciones no comprometían el
desplazamiento de célula a célula o la replicación.
\newpage
Se insertaron dos intrones diferentes de
Arabidopsis al principio del RdRP, dando como resultado el
clon plCH15477 (la secuencia de esta región se muestra como SEC ID
Nº: 6 en el anexo). La secuencia en esta región ya se ve muy "de
tipo intrón" (por ejemplo, rica en GC sin sitios crípticos de
corte y empalme) antes de la adición de los intrones. Con esta
construcción no se vio mejora en la replicación del inicio viral.
Por lo tanto, no cualquier adición de un intrón dará como resultado
una mejora del vector viral. Parece que la posición elegida para la
inserción del intrón o mutagénesis es un parámetro importante. Por
ejemplo, todas las inserciones intrónicas o sustituciones de
nucleótidos que se hicieron en las regiones cerca de estructuras
problemáticas tales como el promotor subgenómico MP, dieron como
resultado grandes mejoras, mientras que las inserciones de los
intrones en las secuencias que ya son "de tipo exón" no lo
hicieron.
\vskip1.000000\baselineskip
Primero se realizó un cambio de fase en la MP
por digestión con la enzima de restricción AvrII, se rellenó y se
volvió a ligar. Después, se insertaron dos intrones en la MP. El
clon resultante plCH16422 (Fig. 6B) se infiltró en hojas de
Nicotiana benthemiana. Se detectó un aumento de
aproximadamente 100 veces en el número de células que contenían el
replicón viral funcional.
\vskip1.000000\baselineskip
Se subclonó un fragmento Kpn1 de EcoR1 del
plCH15499 en el plCH8543. El clon resultante, 16700 (Fig. 6B),
contenía un vector viral completo con 6 intrones en el RdRP. Este
clon se infiltró en una hoja de N. benthamiana e inició la
replicación de manera eficaz. Este clon también puedo desplazarse de
célula a célula sin la necesidad de proporcionar MP adicional en
trans.
\vskip1.000000\baselineskip
En las plantas transgénicas también es posible
transformar de manera estable las construcciones de vectores
virales que contiene intrones. Para evitar la replicación viral
nociva que inhibiría el crecimiento de la planta, puede fabricarse
un clon inactivo (pro-replicón) teniendo una parte
del vector presente en orientación antisentido (Fig. 8). La
incorporación de los sitios de recombinación y de las secuencias
intrónicas en los extremos del fragmento invertido permite que este
fragmento se "invierta" en la orientación correcta usando una
recombinasa apropiada. Los sitios de recombinación se eliminarán
completamente del replicón por corte y empalme. En el
pro-replicón los intrones permiten un inicio eficaz
de la replicación después de la recombinación y la transcripción.
En un ejemplo específico, los sitios de recombinación están
localizados dentro del gen de interés y aguas abajo del
pro-replicón. Esa configuración impide cualquier
expresión del gen antes de la recombinación. Pueden considerarse
otras configuraciones en las que los sitios de recombinación estén
ubicados en otras áreas del pro-replicón tal como
en el RdRP y aguas arriba del promotor. Las secuencias intrónicas
en el sitio de recombinación tienen la ventaja de que permiten
eliminar por completo el sitio de recombinación del replicón, pero
también aumentan la eficacia de la replicación viral, como se ha
descrito anteriormente.
La parte invertida puede localizarse en el
extremo 3' del vector (como se muestra en la Fig. 8), en el medio o
en el extremo 5', como se muestra en la Fig. 12. Se fabricaron dos
construcciones, plCH12691 (que contenía sólo un intrón en el sitio
de recombinación) y plCH16888 que contenía 6 intrones adicionales en
el RdRP. La secuencia de toda la región T-ADN de
plCH12691 se proporciona en la SEC ID Nº: 7. La construcción
plCH16888 es similar a la plCH12691, pero contiene además los tres
intrones descritos anteriormente en plCH15025 (SEC ID Nº: 4) y los
tres intrones descritos en plCH15034 (SEC ID Nº: 5) insertados en la
misma posición que en esas construcciones, respectivamente. Las dos
construcciones plCH12691 y plCH16888 se transformaron de manera
estable en Nicotiana benthamiana usando selección de
Kanamicina de la siguiente manera. Las construcciones plCH12691 y
plCH16888 se inmovilizaron por separado en A. tumefaciens
(GV3101) y se usaron por separado para la transformación de discos
foliares mediada con Agrobacterium de plantas de
Nicotiana como describen Horsh y colegas (1985, Science,
227, 1229-1231) con menos modificaciones. Los discos
foliares se co-cultivaron durante 30 min en una
suspensión agrobacteriana en medio basal Murashige y Skoog (MS)
complementado con 1 mg/l de ácido
alfa-naftalenoacético (NAA), 0,5 mg/l de
6-benzaminopurina (BAP), 200 microM de
acetosirengona (AS), pH 5,5-5,6. Después, los
discos foliares se colocaron en papel filtro estéril Whatman® para
eliminar el exceso de líquido y se transfirieron a un medio sólido
de co-cultivo (0,8% de agar preparado en MS
complementado como se ha descrito anteriormente) durante 48 horas
de cultivo en la oscuridad a 22-23ºC. Después del
co-cultivo, los discos foliares se colocaron en un
medio de regeneración selectivo (0,8% de agar preparado en MS
complementado con 1 mg/l de BAP, 0,1 mg/l de NAA, 1 mg/l de MES (pH
5,7-5,8), 300 mg/l de cefataxim, 50 mg/l de
kanamicina). Después de 3-6 semanas de cultivo en
el medio de regeneración, los brotes regenerados a partir de las
células de planta resistentes a kanamicina se transfirieron a un
medio de enraizado selectivo (0,8% de agar preparado en MS,
complementado con 300 mg/l de cefotaxim, 200 mg/l de timentina para
facilitar la eliminación de agrobacterium, 50 mg/l de kanamicina,
pH 5,7-5,8). Los transformantes regenerados se
transfirieron a un invernadero y se ensayaron por infiltración con
una jeringa sin aguja con una suspensión de agrobacterium que
contenía una construcción de expresión de integrasa (plCH10881:
promotor actina 2-integrasa PhiC31; ó plCH14313:
promotor de Spm elemento reversible de Zea
maize-integrasa PhiC31). Más transformantes
plCH16888 mostraron focos de replicación viral después de la
infiltración con la construcción de integrasa que los transformantes
del plCH12691 (Fig. 13). Además, los transformantes del plCH16888
mostraron más focos de infiltración viral por infiltración.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó el análisis del perfil de ARN de los
virus de ARN de planta seleccionados, así como de un gen de planta
bien caracterizado (AtDMC1), usando el programa
(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/) del servidor Netgenell.
El perfil de ARN que se muestra en la Fig. 9 para el AtDMC1 refleja
claramente la presencia de 14 intrones (rodeados con círculo),
previamente identificados comparando las secuencias de ADNc y de ADN
genómico. Es obvio que los perfiles de ARN de dos virus de planta
tienen regiones (véase las Figuras 10, 11) que pueden causar
problemas para la estabilidad del ARN, si se colocan en el medio
nuclear de la planta. Se han analizado los perfiles de ARN de otros
virus diversos de ARN de plantas representativos (no mostrados),
tales como el Virus del Mosaico del Bromo, diferentes cepas del
TMV, y muchos otros. Todos ellos tienen posibles regiones
problemáticas que pueden comprometer la eficacia de la formación del
replicón basado en virus de ARN de planta si se suministran dentro
de la célula de planta como precursores de ADN.
\vskip1.000000\baselineskip
Se fabricó una construcción completamente
optimizada que contenía la región mutagenizada (descrita en el
plCH15466) y 16 intrones (incluyendo los seis intrones del
plCH15860, los dos intrones del plCH16422 y ocho intrones
adicionales). En suma, esta construcción contenía los intrones
insertados en las siguientes posiciones (proporcionadas en relación
con la secuencia TVCV, acceso a GenBank BRU03387): nt 209, nt 828,
nt 1169, nt 1378, nt 1622, nt 1844, nt 2228, nt 2589, nt 2944, nt
3143, nt 3381, nt 3672, nt 3850, nt 4299, nt 5287, nt 5444.
Esta construcción se ensayó para la expresión en
Beta vulgaris. La infiltración de toda la planta se realizó
como se describe a continuación. Se inoculó Agrobacteria portadora
de plCH18711 a 300 ml de LB que contenía 50 \mug/ml de Rifampicina
y 50 \mug/ml de Kanamicina (selección para el vector binario) y se
cultivó hasta la saturación. Las bacterias se sedimentaron a 4800 g
durante 10 min y se resuspendieron en 3 l de tampón de infiltración
(MES 10 mM, pH 5,5, MgSO_{4} 10 mM) para conseguir una dilución de
10 veces con relación al cultivo saturado de Agrobacterium. Un vaso
de precipitado conteniendo la solución de infiltración se colocó en
un desecador (30 mm de diámetro), con las partes aéreas de una
planta sumergidas en la solución. Se aplicó vacío durante dos
minutos usando una bomba de tipo PM 16763-860.3 de
KNF Neuberger (Freiburg, Alemania), alcanzando desde 0,5 hasta 0,9
bares. Las plantas se llevaron de nuevo al invernadero en
condiciones convencionales.
La expresión de GFP fue alta en las hojas de las
plantas infiltradas con plCH18711 (Fig. 14). A diferencia, sólo unos
cuantos puntos pequeños pudieron observarse en las plantas de
control infiltradas con plCH16700 que no contenía intrón (no se
muestra).
\newpage
Anexo
SEC ID Nº: 1 (fragmento
NcoI-EcoRI del plCH14833):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 2 (parte del plCH15466):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 3 (parte del plCH15900):
\newpage
SEC ID Nº: 4 (parte del plCH15025) (contiene 3
intrones mostrados en cursiva y subrayados):
\newpage
SEC. ID Nº: 5 (parte del plCH15034) (contiene 3
intrones que se muestran en cursiva y subrayados):
\newpage
SEC ID Nº: 6 (fragmento del plCH15477, que
contiene 1 intrón mostrado en cursiva y subrayado):
SEC ID Nº: 7: región T-ADN del
plCH12691, en la que los segmentos de la secuencia tienen la
siguiente función:
Nucleótidos 1 a 25: borde izquierdo (cadena
opuesta),
Nucleótidos 86 a 1484: promotor Nos - secuencia
de codificación NPTII - terminador Nos (en la cadena opuesta),
Nucleótidos 1506 a 1552: sitio de recombinación
AttP (cadena opuesta),
Nucleótidos 1553 a 1599: parte 5'del intrón
(cadena opuesta),
Nucleótidos 1600 a 2022: extremo 5' de TVCV RdRP
(cadena opuesta),
Nucleótidos 2023 a 2809; promotor actin 2 de
Arabidopsis (cadena opuesta),
Nucleótidos 2836 a 2903: sitio de recombinación
AttB,
Nucleótidos 2904 a 2959: parte 3' del
intrón,
Nucleótidos 2960 a 7991: parte 5' de MP de parte
3' de TVCV RdRP,
Nucleótidos 7992 a 8168: extremo 3'
cr-TMV MP,
Nucleótidos 8248 a 8967: secuencia de
codificación GFP,
Nucleótidos 8961 a 9215: región no traducida 3'
de cr-TMV,
Nucleótidos 9234 a 9497: terminador Nos,
\newpage
Nucleótidos 9549 a 9473: borde derecho del
T-ADN (cadena opuesta):
Claims (33)
1. Una planta, parte de planta o cultivo de
células de planta, transformada de manera estable, que contiene en
el núcleo de la célula un ADN heterólogo que tiene una secuencia que
codifica un replicón de ARN unido operativamente a un promotor de la
transcripción,
en el que la secuencia que codifica un replicón
de ARN contiene:
(i) secuencias para la función de replicón del
replicón de ARN, codificando dichas secuencias una ARN polimerasa
dependiente de ARN y derivándose de una secuencia de virus de ARN de
planta, y
(ii) una secuencia de interés para expresarse a
partir de ese replicón de ARN,
comprendiendo dichas secuencias, para la función
de replicón, cerca o dentro de ubicaciones ricas en A/U de dichas
secuencias para la función del replicón, la inserción de uno o más
intrones nucleares, siendo las ubicaciones ricas en A/U segmentos de
secuencia de al menos 20 nucleótidos de longitud con al menos el 55%
de contenido en A/U o segmentos de secuencia de 6-19
nucleótidos en una hilera de secuencias que únicamente contienen
A/U.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Una planta, parte de planta o cultivo de
células de planta de acuerdo con la reivindicación 1, en la que
todos los núcleos de las células de la planta contienen dicho ADN
heterólogo.
3. Una planta, parte de planta o cultivo de
células de planta de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en la que
dicho ADN heterólogo está incluido en un cromosoma de dichos núcleos
de las células.
4. Una planta, parte de planta o cultivo de
células de planta de acuerdo con la reivindicación 3, en la que
todas las células de dicha planta, parte de planta o cultivo de
células de planta contienen dicho AN heterólogo en un cromosoma
nuclear.
5. Una planta, parte de planta o cultivo de
células de planta de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho virus de ARN de planta es un
tobamovirus, preferiblemente un virus del mosaico del tabaco.
6. La parte de la planta de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha parte de
la planta es una semilla.
7. Un proceso para expresar una secuencia de
interés en una planta, parte de planta o cultivo de célula de
planta, que comprende,
(a) proporcionar una planta, parte de planta o
un cultivo de célula de planta que contiene en los núcleos de las
células, un ADN heterólogo que tiene una secuencia que codifica un
replicón unido operativamente a un promotor de la transcripción,
en el que dicha secuencia codifica un replicón
de ARN que contiene
- (i)
- secuencias para la función de replicón de dicho replicón de ARN, codificando estas secuencias una ARN polimerasa dependiente de ARN y derivándose de una secuencia de un virus de ARN de planta,
- (ii)
- una secuencia de interés,
comprendiendo dichas secuencias de interés para
la función de replicón, cerca o dentro de las ubicaciones ricas en
A/U de dichas secuencias para la función del replicón, la inserción
de uno o más intrones nucleares, siendo las ubicaciones ricas en A/U
segmentos de secuencia que tienen una longitud de al menos 20
nucleótidos con un contenido en A/U de al menos el 55% o segmentos
de secuencia de 6 a 19 nucleótidos en una hilera de secuencias que
únicamente contienen A/U; y
(b) causar la expresión de dicha secuencia de
interés.
\vskip1.000000\baselineskip
8. El proceso de acuerdo con la reivindicación
7, en el que dicho ADN heterólogo se incorpora de manera estable en
un cromosoma nuclear.
9. El proceso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 7 u 8, en el que dicha secuencia de interés
codifica una proteína de interés y la etapa (b) comprende causar la
expresión de dicha proteína de interés.
10. El proceso de acuerdo con la reivindicación
9, en el que dicha expresión de dicha proteína de interés conduce a
la producción de un producto deseado en dicha planta, parte de
planta o células de planta.
11. El proceso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 7 a 10, en el que dicha secuencia que codifica
un replicón de ARN tiene dos o más segmentos que codifican juntos
dicho replicón de ARN y la etapa (b) comprende la transposición de
dichos segmentos de manera que dicho replicón de ADN pueda formarse,
en el que uno de dichos segmentos está flanqueado por sitios de
recombinación y dicha transposición comprende una recombinación
específica de sitio por una recombinasa.
12. El proceso de acuerdo con la reivindicación
11, en el que la etapa (b) comprende proporcionar una recombinasa
específica de sitio a dicha planta, parte de planta o cultivo de
células de planta.
13. El proceso de acuerdo con la reivindicación
12, en el que la recombinasa específica de sitio se proporciona por
transfección transitoria con un vector que codifica dicha
recombinasa.
14. El proceso de acuerdo con la reivindicación
12, en el que la recombinasa específica de sitio se codifica de
manera estable en un cromosoma nuclear bajo el control de un
promotor regulado y la etapa (b) comprende inducir dicho promotor
regulado.
15. El proceso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 11 a 14, en el que dicha recombinasa se
selecciona del grupo constituido por: CRE, flipasa, resolvasa, FLP,
integrasa codificada por SSV1, R recombinasa, integrasa phiC31,
integrasa Inti, recombinasa phi 80, P22, 186 y P4, resolvasa Tn3, la
recombinasa Hin, la recombinasa Cin, recombinasas xerC y xerD de
E. coli, recombinasa de Bacillus thuringiensis.
16. El proceso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 11 a 15, en el que dicha recombinasa se forma
dentro de células de planta a partir de fragmentos no funcionales de
dicha recombinasa por interacción de afinidad.
17. El proceso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 11 a 15, en el que dicha recombinasa se forma
dentro de las células de la planta a partir de fragmentos no
funcionales de dicha recombinasa, por trans-corte y
empalme de la proteína mediada por inteína.
18. El proceso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 7 a 17, en el que dicho ADN heterólogo o dicha
secuencia que codifica al replicón de ARN, está unido a un promotor
de la transcripción regulado.
19. El proceso de acuerdo con la reivindicación
18, en el que dicho promotor regulado es un promotor químicamente
inducible.
20. El proceso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 7 a 19, en el que dicha provisión de la etapa
(a) comprende la transformación de una planta, parte de planta o
células de planta con una molécula de ácido nucleico que contenga el
ADN heterólogo.
21. El proceso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 7 a 20, en el que dicha provisión de la etapa
(a) comprende la transformación transitoria de una planta, parte de
planta o células de planta con una molécula de ácido nucleico que
contenga el ADN heterólogo.
22. El proceso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 7 a 21, en el que la etapa (a) se realiza por
transformación mediada con Agrobacterium.
23. El proceso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 7 a 22, en el que la etapa (a) comprende
generar una planta transgénica transformada de manera estable con el
ADN heterólogo.
24. Un proceso de producción de una planta
transgénica transformada de manera estable en un cromosoma nuclear
con un ADN heterólogo como se define en la reivindicación 1, que
comprende transformar una planta o una parte de planta con un vector
que contenga el ADN heterólogo, seleccionar el tejido de la planta
que contenga en un cromosoma nuclear el ADN heterólogo, y regenerar
una planta transgénica a partir de ese tejido.
25. Un proceso para expresar transitoriamente
una secuencia de interés en una planta, parte de planta o cultivo de
células de planta, que comprende:
transformar una planta, parte de planta o
cultivo de células de planta con un ADN heterólogo que tenga una
secuencia que codifique un replicón de ARN unido operativamente a un
promotor de la transcripción,
en el que la secuencia que codifica un replicón
de ARN contiene:
(i) secuencias para la función de replicón de
dicho replicón de ARN, codificando dichas secuencias una ARN
polimerasa dependiente de ARN y derivándose de una secuencia de un
virus de ARN de planta,
(ii) una secuencia de interés;
en el que dichas secuencias para la función de
replicón comprenden, cerca o dentro de ubicaciones de dichas
secuencias ricas en A/U para la función de replicón la inserción de
uno o más intrones nucleares, en el que dichas ubicaciones rucas en
A/U son segmentos de secuencia de al menos 20 nucleótidos de
longitud con al menos el 55% de contenido en A/U o segmentos de
secuencia de 6 a 19 nucleótidos en una hilera de secuencias que
contienen únicamente A/U.
\vskip1.000000\baselineskip
26. El proceso de acuerdo con la reivindicación
25, en el que la transformación se realiza por transformación
transitoria mediada por Agrobacterium del
T-ADN que contiene dicho ADN heterólogo.
27. El proceso de acuerdo con la reivindicación
25 ó 26, en el que la transformación se realiza agroinfiltrando el
tallo y/o todas las hojas de plantas de Nicotiana
tabacum.
28. El proceso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 7 a 27, en el que todos los núcleos de las
células contienen dicho ADN heterólogo.
29. El proceso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 7 a 28, en el que dicha ubicación se localiza
por
(A) transformar una planta, parte de planta o
cultivo de células de planta con un ADN heterólogo como se define en
la reivindicación 7, pero que carece de dicha inserción en uno o más
intrones
(B) realizar RT-PCR en el ARN
derivado de dicha planta, parte de planta o cultivo de células de
planta a partir de dicho ADN heterólogo de la etapa (A) y secuenciar
el producto de dicha RT-PCR, y
(C) identificar en la secuencia del producto de
la RT-PCR, una ubicación seleccionada como un evento
de corte y empalme no deseado que conduce a productos de corte y
empalme no deseados.
\vskip1.000000\baselineskip
30. El proceso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 7 a 29, en el que dicho virus de ARN de planta
es un tobamovirus, preferiblemente un virus del mosaico del
tabaco.
31. El proceso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 7 a 29, en el que dicha planta, parte de planta
o cultivo de células de planta contiene dos o más ADN heterólogos
diferentes y dicho proceso comprende la formación de dos replicones
diferentes de ARN a partir de los cuales se
co-expresan dos proteínas de interés diferentes.
32. El proceso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 7 a 31, en el que dicha planta, parte de planta
o cultivo de células de planta se proporciona con dos ADN diferentes
heterólogos como se define en la reivindicación 7, en el que se
expresan dos secuencias de interés diferentes.
33. Una molécula de ácido nucleico que contiene
una secuencia de ADN que codifica un replicón de ARN unido
operativamente a un promotor de la transcripción,
en el que dicha secuencia que codifica un
replicón d ARN contiene:
(i) secuencias para la función de replicón del
replicón de ARN, codificando dichas secuencias una ARN polimerasa
dependiente de ARN y derivándose de una secuencia de un virus de ARN
de planta
(ii) una secuencia de interés para expresarse a
partir del dicho replicón de ARN; en el que dichas secuencias para
la función de replicón corresponden a secuencias de dicho virus de
ARN de planta y comprenden, cerca o dentro de las ubicaciones ricas
en A/U de dichas secuencias de dicho virus de ARN de planta, la
inserción de uno o más intrones nucleares, siendo las localizaciones
ricas en A/U segmentos de secuencia que tienen una longitud de al
menos 20 nucleótidos con al menos el 55% de contenido en A/U o
segmentos de secuencia de 6 a 19 nucleótidos en una hilera de
secuencias que únicamente contienen A/U;
en el que la secuencia de ADN que codifica un
replicón de ARN está unida operativamente al promotor de la
transcripción por
(a) una separación de dicha secuencia de ADN que
codifica un replicón de ARN y del promotor, por un bloque de
secuencia que impide el enlace operativo entre el promotor y dicha
secuencia de ADN, estando dicho bloque de secuencia flanqueado por
sitios de recombinación, pudiendo cortar dicho bloque una
recombinasa que reconoce dichos sitios de recombinación; o
(b) tener una parte de una secuencia necesaria
para la transcripción, seleccionada de un promotor y de una parte
del promotor, en orientación invertida y flanqueada por sitios de
recombinación, pudiendo una recombinasa invertir de nuevo dicha
parte de una secuencia a la posición correcta.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PCT/EP2003/012530 WO2006012906A1 (en) | 2003-11-10 | 2003-11-10 | Rna virus-derived plant expression system |
WOEP03/12530 | 2003-11-10 | ||
EP04016012 | 2004-07-07 | ||
EP04016012 | 2004-07-07 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2346224T3 true ES2346224T3 (es) | 2010-10-13 |
ES2346224T4 ES2346224T4 (es) | 2011-06-01 |
Family
ID=34621451
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES04797791T Active ES2346224T4 (es) | 2003-11-10 | 2004-11-10 | Sistema de expresión de planta derivado de virus de arn. |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10287602B2 (es) |
EP (2) | EP1682667B1 (es) |
JP (2) | JP5096743B2 (es) |
AT (1) | ATE469231T1 (es) |
CA (1) | CA2541294C (es) |
DE (1) | DE602004027403D1 (es) |
DK (1) | DK1682667T3 (es) |
ES (1) | ES2346224T4 (es) |
IL (1) | IL173859A (es) |
WO (1) | WO2005049839A2 (es) |
Families Citing this family (37)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004070016A2 (en) | 2003-02-03 | 2004-08-19 | Fraunhofer Usa Inc. | System for expression of genes in plants |
WO2005026375A2 (en) | 2003-05-22 | 2005-03-24 | Fraunhofer Usa, Inc. | Recombinant carrier molecule for expression, delivery and purification of target polypeptides |
EP1564295A1 (en) * | 2004-01-23 | 2005-08-17 | Icon Genetics AG | RNA virus-derived plant expression system |
EP1616959A1 (en) | 2004-07-07 | 2006-01-18 | Icon Genetics AG | Biological safe transient protein expression in plants |
KR101446025B1 (ko) | 2005-08-03 | 2014-10-01 | 아이바이오, 인크. | 면역글로불린의 생산을 위한 조성물 및 방법 |
EP1764414A1 (en) | 2005-09-17 | 2007-03-21 | Icon Genetics AG | Plant viral particles comprising a plurality of fusion proteins consisting of a plant viral coat protein, a peptide linker and a recombinant protein and use of such plant viral particles for protein purification |
CA2642056A1 (en) * | 2006-02-13 | 2007-08-23 | Fraunhofer Usa, Inc. | Hpv antigens, vaccine compositions, and related methods |
BRPI0707785A2 (pt) * | 2006-02-13 | 2011-05-10 | Fraunhofer Usa Inc | produÇço de Ácidos nuclÉicos estranhos e polipeptÍdeos em sistemas de planta |
KR20080109094A (ko) | 2006-04-21 | 2008-12-16 | 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 | 조류 인플루엔자 백신 및 이용방법 |
ATE546538T1 (de) * | 2006-05-29 | 2012-03-15 | Icon Genetics Gmbh | Induzierbares expressionssystem auf pflanzenvirusbasis |
KR101515044B1 (ko) * | 2006-05-29 | 2015-05-19 | 아이콘 제네틱스 지엠비에이치 | 식물 바이러스 기반 유도성 발현 시스템 |
US8936937B2 (en) | 2007-01-29 | 2015-01-20 | The Ohio State University Research Foundation | System for expression of genes in plants from a virus-based expression vector |
EP2154246B1 (en) | 2007-04-27 | 2017-03-29 | Japan Science and Technology Agency | Viral vector and use thereof |
US8404252B2 (en) | 2007-07-11 | 2013-03-26 | Fraunhofer Usa, Inc. | Yersinia pestis antigens, vaccine compositions, and related methods |
US8734803B2 (en) | 2008-09-28 | 2014-05-27 | Ibio Inc. | Humanized neuraminidase antibody and methods of use thereof |
CA2776144C (en) | 2009-09-29 | 2020-10-27 | Fraunhofer Usa, Inc. | Influenza hemagglutinin antibodies, compositions, and related methods |
EP2418283A1 (en) | 2010-08-07 | 2012-02-15 | Nomad Bioscience GmbH | Process of transfecting plants |
EP2584042A1 (en) | 2011-10-17 | 2013-04-24 | Nomad Bioscience GmbH | Production, storage and use of cell wall-degrading enzymes |
EP2647715A1 (en) | 2012-04-03 | 2013-10-09 | Nomad Bioscience GmbH | Agrobacterium for transient transfection of whole plants |
WO2013154233A1 (ko) * | 2012-04-12 | 2013-10-17 | 한국생명공학연구원 | Sycmv 유래의 재조합 바이러스 벡터 및 이의 용도 |
US20160002654A1 (en) | 2013-02-20 | 2016-01-07 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Nucleic acid molecule for expressing foreign gene in plant and method therefor |
EP2777711A1 (en) | 2013-03-11 | 2014-09-17 | Icon Genetics GmbH | Her2/Neu cancer vaccine |
ES2697324T3 (es) | 2013-05-23 | 2019-01-23 | Nomad Bioscience Gmbh | Proceso para proporcionar a las plantas resistencia al estrés abiótico |
EP3097783B1 (en) | 2015-05-26 | 2019-11-13 | Nomad Bioscience GmbH | Colicin m for the control of ehec |
EP3178313A1 (en) | 2015-12-09 | 2017-06-14 | Leibniz-Institut für Pflanzenbiochemie | Gene and protein for the synthesis of oxidized zingiberene derivatives |
EP3372091A1 (en) | 2017-03-07 | 2018-09-12 | Nomad Bioscience GmbH | Method of reducing contamination of an object with clostridium |
EP3378485A1 (en) | 2017-03-24 | 2018-09-26 | Nomad Bioscience GmbH | Bacteriocins for control of salmonella enterica |
EP3456829A1 (en) | 2017-09-18 | 2019-03-20 | Nomad Bioscience GmbH | Method of improving potexviral vector stability |
EP3752185A1 (en) | 2018-02-15 | 2020-12-23 | Icon Genetics GmbH | Immunogenic composition and vaccine for generating an immune response to norovirus |
KR20220021451A (ko) | 2019-03-12 | 2022-02-22 | 아이콘 제네틱스 지엠비에이치 | 안정성이 향상된 노로바이러스 유사 입자 |
CN114206371A (zh) | 2019-06-06 | 2022-03-18 | 诺麦生物科学有限公司 | 用于控制克雷伯氏菌属的克雷伯菌素 |
CN111349649B (zh) * | 2020-03-16 | 2020-11-17 | 三峡大学 | 一种用于双孢蘑菇的基因编辑的方法及应用 |
BR112022027078A2 (pt) | 2020-07-16 | 2023-01-31 | Nomad Bioscience Gmbh | Produtos para consumo oral com teor reduzido de açúcar |
CA3229421A1 (en) | 2021-08-20 | 2023-02-23 | Nomad Bioscience Gmbh | Sweetener blend comprising thaumatin and brazzein |
IL312479A (en) * | 2021-11-01 | 2024-06-01 | Flagship Pioneering Innovations Vii Llc | Polynucleotides for transforming organisms |
WO2023141540A2 (en) * | 2022-01-20 | 2023-07-27 | Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc | Polynucleotides for modifying organisms |
EP4248987A1 (en) | 2022-03-21 | 2023-09-27 | Nomad Bioscience GmbH | Chimeric bacteriocins and method for the control of pseudomonas |
Family Cites Families (44)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CH14313A (de) | 1897-03-13 | 1897-11-15 | Arthur Petzenbuerger | Stromzuführungsvorrichtung für elektrische Bahnen |
CH15499A (de) | 1897-11-24 | 1898-06-15 | Friedrich Scharpf | An Tischen, Stühlen etc. befestigbarer Schirm- oder Stockhalter aus Draht |
CH16888A (de) | 1898-04-22 | 1899-02-28 | M Bissinger Friedricih | Vorrichtung zur Förderung der Pökellake beim Einpökeln von Fleisch |
NL8300698A (nl) | 1983-02-24 | 1984-09-17 | Univ Leiden | Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten. |
CA1280081C (en) | 1984-09-24 | 1991-02-12 | Calgene, Inc. | Plant cell microinjection technique |
US5100792A (en) | 1984-11-13 | 1992-03-31 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method for transporting substances into living cells and tissues |
US4795855A (en) | 1985-11-14 | 1989-01-03 | Joanne Fillatti | Transformation and foreign gene expression with woody species |
EP0265502A1 (en) | 1986-04-30 | 1988-05-04 | Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. | Electric field mediated dna transformation of plant cells and organelles |
JPH01500718A (ja) | 1986-05-29 | 1989-03-16 | カルジーン,インコーポレイティド | ブラッシカの種における形質転換及び外来遺伝子の発現 |
AU7335187A (en) | 1986-06-10 | 1987-12-17 | Calgene, Inc. | Agrobacterium transformation of plant tissue |
IL86245A (en) | 1987-05-05 | 1995-01-24 | Sandoz Ag | A method for the transformation of plant materials and plants obtained by the method |
US5840557A (en) * | 1987-07-21 | 1998-11-24 | Mogen International Nv | Method for producing seeds and plants thereof involving an in vitro step |
EP0317511A3 (de) | 1987-11-18 | 1991-10-16 | Ciba-Geigy Ag | Insektizide Baumwollpflanzenzellen |
US5977438A (en) | 1988-02-26 | 1999-11-02 | Biosource Technologies, Inc. | Production of peptides in plants as viral coat protein fusions |
US5316931A (en) | 1988-02-26 | 1994-05-31 | Biosource Genetics Corp. | Plant viral vectors having heterologous subgenomic promoters for systemic expression of foreign genes |
US5614395A (en) | 1988-03-08 | 1997-03-25 | Ciba-Geigy Corporation | Chemically regulatable and anti-pathogenic DNA sequences and uses thereof |
US5955330A (en) | 1989-05-18 | 1999-09-21 | Research Corporation Technologies | Means for enhancing gene expression |
US6093554A (en) | 1989-10-03 | 2000-07-25 | Aveve N.V. | Genetics manipulations with recombinant DNA virus comprising sequences derived from RNA virus |
DE59009881D1 (de) | 1989-12-19 | 1995-12-21 | Ciba Geigy Ag | Verfahren und Vorrichtung zur genetischen Transformation von Zellen. |
CA2036935A1 (en) | 1990-02-26 | 1991-08-27 | Paul Christou | Plant transformation process with early identification of germ line transformation events |
JP3234598B2 (ja) | 1990-11-23 | 2001-12-04 | プラント・ジエネテイツク・システムズ・エヌ・ベー | 単子葉植物の形質転換方法 |
US5384253A (en) | 1990-12-28 | 1995-01-24 | Dekalb Genetics Corporation | Genetic transformation of maize cells by electroporation of cells pretreated with pectin degrading enzymes |
US5187287A (en) | 1992-02-20 | 1993-02-16 | Arco Chemical Technology, L.P. | Lower alkylene oxide purification |
WO1993021334A1 (en) | 1992-04-13 | 1993-10-28 | Zeneca Limited | Dna constructs and plants incorporating them |
AU4539593A (en) | 1992-06-23 | 1994-01-24 | South Dakota State University | Transformation of plants by direct injection of dna |
DE69334225D1 (de) | 1992-07-07 | 2008-07-31 | Japan Tobacco Inc | Verfahren zur transformation einer monokotyledon pflanze |
WO1994016089A1 (en) | 1992-12-30 | 1994-07-21 | Biosource Genetics Corporation | Viral amplification of recombinant messenger rna in transgenic plants |
US5981236A (en) | 1993-02-26 | 1999-11-09 | Calgene Inc | Geminivirus-based gene expression system |
GB9311593D0 (en) | 1993-06-04 | 1993-07-21 | Sandoz Ltd | Improvements in or relating to organic compounds |
US5491076A (en) | 1993-11-01 | 1996-02-13 | The Texas A&M University System | Expression of foreign genes using a replicating polyprotein producing virus vector |
EP0813604B1 (en) * | 1995-03-03 | 2005-04-20 | Syngenta Participations AG | Control of gene expression in plants by receptor mediated transactivation in the presence of a chemical ligand |
CA2146712C (en) | 1995-04-10 | 2002-06-25 | Jas Singh | Cold induced promoter from winter brassica napus |
US5693512A (en) * | 1996-03-01 | 1997-12-02 | The Ohio State Research Foundation | Method for transforming plant tissue by sonication |
FI972293A (fi) | 1997-05-30 | 1998-12-01 | Joseph Atabekov | Useamman kuin yhden geenin yhteisekspressiomenetelmät |
JP2001512028A (ja) * | 1997-07-31 | 2001-08-21 | サンフォード サイエンティフィック インコーポレイテッド | 穀物改良のためのtdc遺伝子を用いたトランスジェニック植物 |
PL340297A1 (en) | 1997-10-24 | 2001-01-29 | Du Pont | Binary viral expression system in plants |
US6632980B1 (en) * | 1997-10-24 | 2003-10-14 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Binary viral expression system in plants |
DE69841438D1 (de) * | 1997-11-18 | 2010-02-25 | Pioneer Hi Bred Int | Mobilisierung eines viralen genoms aus t-dna durch ortsspezifische rekombinationssysteme |
US6063985A (en) | 1998-01-28 | 2000-05-16 | The Rockefeller University | Chemical inducible promotor used to obtain transgenic plants with a silent marker |
BR0008766A (pt) | 1999-03-09 | 2002-04-09 | Large Scale Biology Corp | Sistema de vetor de rna de componente múltiplo para expressão de sequências estranhas |
DE10121283B4 (de) | 2001-04-30 | 2011-08-11 | Icon Genetics GmbH, 80333 | Verfahren und Vektoren zur Amplifikation oder Expression von gewünschten Nucleinsäuresequenzen in Pflanzen |
NZ514547A (en) * | 2001-09-28 | 2004-10-29 | Duncan Stanley | Plastid alph-amylase protein and nucleic acids encoding same and methods for altering the starch content of a plant |
AU2002314021B2 (en) | 2002-04-30 | 2008-04-10 | Icon Genetics Gmbh | Amplification vectors based on trans-splicing |
MXPA06003715A (es) | 2003-11-10 | 2006-06-23 | Icon Genetics Ag | Sistema de expresion de planta derivado de virus de arn. |
-
2004
- 2004-11-10 DK DK04797791.3T patent/DK1682667T3/da active
- 2004-11-10 AT AT04797791T patent/ATE469231T1/de active
- 2004-11-10 EP EP04797791A patent/EP1682667B1/en active Active
- 2004-11-10 CA CA2541294A patent/CA2541294C/en active Active
- 2004-11-10 DE DE602004027403T patent/DE602004027403D1/de active Active
- 2004-11-10 JP JP2006538788A patent/JP5096743B2/ja active Active
- 2004-11-10 EP EP10000553.7A patent/EP2184363B1/en active Active
- 2004-11-10 ES ES04797791T patent/ES2346224T4/es active Active
- 2004-11-10 WO PCT/EP2004/012743 patent/WO2005049839A2/en active Application Filing
-
2006
- 2006-02-21 IL IL173859A patent/IL173859A/en active IP Right Grant
-
2010
- 2010-09-21 JP JP2010211319A patent/JP2011024591A/ja active Pending
-
2016
- 2016-01-05 US US14/988,092 patent/US10287602B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ES2346224T4 (es) | 2011-06-01 |
WO2005049839A3 (en) | 2005-11-03 |
EP2184363B1 (en) | 2013-08-28 |
EP1682667A2 (en) | 2006-07-26 |
US20160208276A1 (en) | 2016-07-21 |
EP1682667B1 (en) | 2010-05-26 |
JP5096743B2 (ja) | 2012-12-12 |
JP2011024591A (ja) | 2011-02-10 |
US10287602B2 (en) | 2019-05-14 |
DE602004027403D1 (de) | 2010-07-08 |
ATE469231T1 (de) | 2010-06-15 |
DK1682667T3 (da) | 2010-08-23 |
CA2541294C (en) | 2013-06-25 |
JP2007510423A (ja) | 2007-04-26 |
CA2541294A1 (en) | 2005-06-02 |
EP2184363A1 (en) | 2010-05-12 |
IL173859A0 (en) | 2006-07-05 |
WO2005049839A2 (en) | 2005-06-02 |
IL173859A (en) | 2012-06-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2346224T3 (es) | Sistema de expresion de planta derivado de virus de arn. | |
ES2350187T3 (es) | Sistema de expresión de plantas derivado de virus de arn de dos componentes. | |
EP1763581B1 (en) | Biologically safe transient protein expression in plants | |
JP5172828B2 (ja) | 植物ウイルスに基づいた誘導性発現システム | |
AU2004291658B2 (en) | RNA virus-derived plant expression system | |
US9267143B2 (en) | RNA virus-derived plant expression system | |
JP2008505622A (ja) | 植物における生物学的に安全な一過性のタンパク質発現 | |
ES2322809T3 (es) | Metodo de transformacion de plantas con ensamblaje in vivo de un tratamiento. | |
ES2382179T3 (es) | Sistema de expresión inducible basado en virus de plantas |