JP2006526984A - ハイブリッド種子における目的産物の安全な産生 - Google Patents
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Abstract
Description
1. 通常、目的産物の収率が低い。例は薬用タンパク質、酵素、他のタンパク質、ポリマー、糖、多糖類などである。低収率とは、精製/後処理費用が高いことを意味する。
2. 遺伝子改変植物と非トランスジェニック亜種又は野生型相対物との自由な交雑、及び収穫後の農場における「自生」植物の存在による遺伝子汚染。植物は自己複製生物であるため、又はヒトの過ち若しくは故意の行動のため、そのようなイベントは自然発生的に容易に起こる。
これらの目的は、F1種子において目的産物を産生する方法によって達成され、この方法は、第1及び第2のトランスジェニック親植物のハイブリダイゼーションによってF1種子を得ることを含み、ハイブリダイゼーションは、F1種子において第1及び第2のトランスジェニック親植物の第1及び第2の部分的遺伝子供与を組み合わせることによって、F1種子において産生のための遺伝子供与物を生ずる。次に目的産物をF1種子から単離するか又はF1種子を蒔くことができる。
本発明の発明者らは、驚くべきことに、高率細胞***は、少なくとも双子葉植物の胚におけるウイルス複製を提供するのに単独では十分でなく、その上、胚発育期に依存し、通常、種子発育のより後期にシフトするすることを発見した。他の驚くべき発見は、染色体DNAに安定に組み込まれたウイルスに基づくレプリコン前駆体がトランスジェニック種子(F1種子)における活性化によって複製する能力である。我々の知る限りでは、この現象について記載する先行技術ない。
(a) ウイルスベクターは、種子発育のより後期及び種子発芽の初期に植物種子において複製可能であるが、特に双子葉植物では、種子形成の初期段階には全く又はほとんど不可能である;
(b) 染色体DNAに安定に組み込まれたウイルスベクター前駆体は、アクチベーター配列を提供する植物との交雑によって、ハイブリッド種子内で効率的に活性化されることができる。
DNAウイルス:
環状2本鎖DNAウイルス:科:カリモウイルス科、属:バドナウイルス属、基準種:ツユクサ黄斑ウイルス、属:カリモウイルス属、基準種:カリフラワーモザイクウイルス、属:“SbCMV様ウイルス”、基準種:ダイズchlorotic mottleウイルス、属:“CsVMV様ウイルス”、基準種:キャッサバ葉脈モザイクウイルス、属:“RTBV様ウイルス”、基準種:イネtungro bacilliformvirus、属:“ペユニア葉脈clearing様ウイルス”、基準種:ペチュニア葉脈clearingウイルス;
環状1本鎖DNAウイルス:科:ジェミニウイルス科、属:Mastrevirus(サブグループI ジェミニウイルス)、基準種:トウモロコシ条斑ウイルス、属:Curtovirus(サブグループII ジェミニウイルス)、基準種:ビートカーリートップウイルス、属:ベゴモウイルス属(サブグループIII ジェミニウイルス)、基準種:インゲンマメモザイクウイルス;
RNAウイルス:
1本鎖RNAウイルス:科:ブロモウイルス科、属:アルファモウイルス属、基準種:アルファルファモザイクウイルス、属:イラルウイルス属、基準種:タバコ条斑ウイルス、属:ブロモウイルス属、基準種:ブロムモザイクウイルス、属:ククモウイルス属、基準種:キュウリモザイクウイルス;
科:クロステロウイルス科、属:クロステロウイルス属、基準種:ビート黄斑ウイルス、属:クリニウイルス属、基準種:レタス伝染性黄斑ウイルス、科:コモウイルス科、属:コモウイルス属、基準種:ササゲモザイクウイルス、属:ファバウイルス属、基準種:ソラマメ壊疽ウイルス1、属:ネポウイルス属、基準種:タバコ輪点ウイルス;
科:ポティウイルス科、属:ポティウイルス属、基準種:ジャガイモYウイルス、属:ライモウイルス属、基準種:ライグラスモザイクウイルス、属:バイモウイルス属、基準種:オオムギ縞萎縮ウイルス;
科:セキウイルス科、属:セキウイルス属、基準種:パースニップyellow fleckウイルス、属:ワイカウイルス属、基準種:イネtungro sphericalウイルス;科:トンブスウイルス科、属:カルモウイルス属、基準種:カーネーション斑紋ウイルス、属:ダイアントウイルス属、基準種:カーネーション輪点ウイルス、属:マクロモウイルス属、基準種:トウモロコシchlorotic mottleウイルス、属:ネクロウイルス属、基準種:タバコ壊死ウイルス、属:トンブスウイルス属、基準種:トマトbushy stuntウイルス、
属が未分類の1本鎖RNAウイルス、属:カピロウイルス科、基準種:リンゴstem groovingウイルス;
属:カーラウイルス属、基準種:カーネーション潜在ウイルス;属:エナモウイルス属、基準種:エンドウひだ葉モザイクウイルス、
属:フロウイルス属、基準種:土壌伝染性コムギモザイクウイルス、属:ホルデイウイルス属、基準種:オオムギ斑葉モザイクウイルス、属:イダエオウイルス属、基準種:ラズベリーbushy dwarfウイルス;
属:ルテオウイルス属、基準種:オオムギ黄萎ウイルス;属:マラフィウイルス属、基準種:トウモロコシrayado finoウイルス;属:ポテクスウイルス属、基準種:ジャガイモXウイルス;属:ソベモウイルス属、基準種:Southern bean モザイクウイルス、属:テヌイウイルス属、基準種:イネ縞葉枯ウイルス、
属:トバモウイルス属、基準種:タバコモザイクウイルス、
属:トブラウイルス属、基準種:タバコ茎壊疽ウイルス、
属:トリコウイルス属、基準種:リンゴchlorotic leaf spotウイルス;属:ティモウイルス属、基準種:カブ黄斑モザイクウイルス;属:アンブラウイルス属、基準種:ニンジンmottleウイルス;マイナス1本鎖RNAウイルス:目:モノネガウイルス目、科:ラブドウイルス科、属:サイトラブドウイルス属、基準種:レタス壊死性黄変病ウイルス、属:ヌクレオラブドウイルス属、基準種:ジャガイモ黄萎病ウイルス;
マイナス1本鎖RNAウイルス:科:ブニヤウイルス科、属:トスポウイルス属、基準種:トマト黄化壊疽ウイルス;
2本鎖RNAウイルス:科:パーティティウイルス科、属:アルファクリプトウイルス属、基準種:シロツメクサcrypticウイルス1、属:ベータクリプトウイルス属、基準種:シロツメクサcrypticウイルス2、科:レオウイルス科、属:フィジーウイルス属、基準種:フィジー病ウイルス、属:ファイトレオウイルス属、基準種:創傷 腫瘍ウイルス、属:オリザウイルス属、基準種:イネragged stuntウイルス;
未分類ウイルス:ゲノム1本鎖DNA:種:バナナbunchy topウイルス、種:ココナッツfoliar decayウイルス、種:サブタレニアン・クローバー矮化ウイルス、
ゲノム:2本鎖DNA、種:キュウリ葉脈黄化ウイルス;ゲノム:2本鎖RNA、種:タバコ矮化ウイルス、
ゲノム:1本鎖RNA、種:ニンニクウイルスA、B、C、D、種:grapevine fleckウイルス、種:トウモロコシwhite lineモザイクウイルス、種:オリーブ潜在ウイルス2、種:ourmia メロンウイルス、種:ペラルゴニウムzonate spotウイルス;
サテライト及びウイロイド:サテライト:1本鎖RNAサテライトウイルス:サブグループ2 サテライトウイルス、基準種:タバコ壊死サテライト、
サテライトRNA、サブグループ2 B型mRNAサテライト、サブグループ3 C型線状RNAサテライト、サブグループ4 D型環状RNAサテライト、
ウイロイド、基準種:ジャガイモやせいも病ウイロイド。
GFPを有するジェミニウイルス複製ベクターのクローニング:
pUC19 DNAを、dnaapr7プライマー(aac tgc agt cta gac tgg ccg tcg ttt tac aac)及びdnaapr8プライマー(aac tgc aga aca att gct cga ggc gta atc atg gtc a)を用いて増幅し、増幅断片をPstIで消化し、再連結した。得られたプラスミドpICH1144は、pUC19に類似するが、ポリリンカーがXhoI、MfeI、及びPstIで置換されている。ドイツ微生物・培養細胞コレクション(DSMZ、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)から入手したインゲンゴールデンモザイクウイルス(BGMV)単離物DSMZ PV−0094を感染させたインゲンマメ組織から、DNAを抽出した。BGMV共通領域を包含するゲノムの断片(CR;BGMVの複製起点を含有)を、dnaapr3プライマー(ggg aat tca cta gta aag atc tgc cgt cga ctt gga att g)及びdnaapr4プライマー(caa tgc atc atg gcg cat cac gct tag g)を用いてPCRで増幅し、MfeI及びPstIで消化したpICH1144中にEcoRI−NsiI断片としてクローニングし、プラスミドpICH1156を得た。pICH1156中のBGMV挿入物を配列決定した。他の2つのBGMV DNAAゲノム断片を、BGMVを感染させたインゲンマメDNAから、dnaapr9プライマー(aag ctg cag aag gat cct ctg gac tta cac gtg gaa tgg)/dnaapr13プライマー(cgc tcg agg ccg tcg act tgg aat tgt c)ペア、及びdnaapr5プライマー(gaa gat ctg caa gag gag gtc agc a)/dnaapr10プライマー(aag ctg cag atc tat ttc tat gat tcg ata acc)ペアを用いて増幅させた。これらの断片の合計は、コートタンパク質のない完全長BGMVゲノムになる。これらの断片をそれぞれXhoI/PstI及びPstI/BglIIで消化し、XhoI及びBglIIで消化したpICH1156に、3通りの連結法でクローニングした。得られたプラスミドは、重複したBGMV DNAA共通領域に隣接するコートタンパク質遺伝子のない1つの完全長BGMV DNAAゲノムを含有する。試験のために3つのクローン:pICH1663、1664及び1667を保存した。コートタンパク質遺伝子がBamHI及びPstIを含有するマルチクローニング部位に置換されている。pIC011(pUC18内にHbtプロモーター−合成GFPコード配列−Nosターミネーター)由来の合成GFP(SGFP)コード配列を、pICH1663、pICH1664及びpICH1667のBamHI−PstI部位にBamHI−PstI断片としてクローニングし、プラスミドpICH1693、pICH1694及びpICH1697を得た。GFPをコートタンパク質プロモーターの制御下に置く。クローンpICH1693、pICH1694及びpICH1697の機能性に関して試験するために、ベンサミアナタバコ及びインゲンマメの切除葉に、遺伝子銃粒子送達システム1000/HE(バイオラッド)を用いて照射した。翌日、3つの構築体全てに関し、両方の種の葉においてGFP発現上皮細胞が検出されるであろう。
pICH1694のXhoI−NarI断片を、XhoI及びClaIで消化したpICBV11にサブクローニングすることによって、pICH1694のプロレプリコン部分を含有するバイナリーベクターを作製した。得られたクローンpICH4300(図2)は、BGMVコートタンパク質プロモーターの制御下にあるGFP遺伝子、及び重複CR間にAL1/2/3遺伝子を含有する。
pICH7300はpICH4300に類似するが、いくつかの制限酵素部位(SalI、NcoI、MfeI、及びBglII)が、制限部位が重複する変異プライマーを用いたPCRで除去されている。レプリカーゼの部分と共通領域うちの1つを含有する断片の転置によって複製不可能なクローンpICH1500(図3)を作製するための開始点としてpICH7300を用いた。AttP及びAttB組換え部位を転置の先端に置き、インテグラーゼを提供することによって転置領域の反転を可能にし、それにより機能性ベクターを得る。AttB及びAttB部位は人工イントロン配列に隣接しており、インテグラーゼ介在性組換えによって生ずるAttR配列の、AL1転写物からのスプライシングを可能にする。
pICH4300プラスミドDNAを一連の植物組織に照射した。インゲンマメの葉、成熟種子、水分補給したマメの子葉及び発芽苗、並びに未成熟胚において明るい蛍光細胞が検出されるであろう。GFP蛍光によってアッセイしたように、胚発育期の全てにおいてジェミニウイルスの複製を起こしやすいわけではない。長さ4〜5mmまでの子葉がある小さな白い胚にはGFP発現細胞がなかった。逆に、より緑色したより大きな子葉はジェミニウイルスの複製に非常に適していた。
pICP1010は、シロイヌナズナ アクチン2プロモーター(プロモーター、第1エクソン、第1イントロン、及びアクチン2遺伝子の第1エクソンの10ヌクレオチドを含有する1344ヌクレオチド断片)に融合したストレプトミセスファージC31インテグラーゼ(David Owより、植物遺伝子発現センター、米国農務省−農業研究サービス、アルバニー、CA94710、USA)を含有するバイナリーベクターである。核へのインテグラーゼの輸送を増加させるために、SV40 T抗原由来の核局在シグナル(Pro−Lys−Lys−Lys−Arg−Lys−Val、Andreasら、2002、Nucleic Acids Res.、30、2299−2306)を、φC31インテグラーゼのC末端に融合させた。c31pr1プライマー(gca cgc cga agg cga cga ag)及びNLS配列を含有する伸長部を含有するPCRプライマー(31nls1:gga tcc taa acc ttc ctc ttc ttc tta ggc gcc gct acg tct tcc gtg)を用いたpICP1010からのPCR増幅によってNLS配列をインテグラーゼ配列に付加し、BspEI−BamHI断片としてpICP1010にサブクローニングし、プラスミドpICH10881(図6)を得た。異なるプロモーターを容易にサブクローニングするために、pICH10881からインテグラーゼ及びNosターミネーターをPstI/ApaI断片としてpICH13901へサブクローニングし、プラスミドpICH13901(示していない)を得た。このベクターは、Nosプロモーター−NptIIコード配列−Nosターミネーター 選択カセット及びポリリンカーKpnI−XhoI−PstI−ApaI−HindIIIを含有するアイコン・ジェネティクスのバイナリーベクターである。適当な種のゲノムDNAから、遺伝子特異的プライマーを用いていくつかのプロモーターを増幅し、KpnI/XhoI断片としてpICH13901にクローニングした。前記プロモーターを更にEcoRI/XhoI断片としてpIC01にサブクローニングし(図6)、発育種子への微粒子銃によってGUSレポーター遺伝子との融合物としてそれらの活性について試験した(示していない)。
ベンサミアナタバコの葉ディスクを、構築体pICH1500、pICH4550及びpICH4540(インテグラーゼ)で形質転換し、各構築体について独立した形質転換体を得た。pICH1500の10個の形質転換体を、各インテグラーゼ構築体の少なくとも5つの形質転換体と交雑させた。未成熟発育種子を切開し、GFP蛍光を顕微鏡を用いて青色光下で観察した。
ドイツ微生物・培養細胞コレクション(DSMZ、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)から入手したコムギ萎縮ウイルス(WDV)を感染させたコムギ葉サンプルからDNAを抽出した。互いに逆向きでゲノムのユニークEcoRI部位が重複するプライマーを用いて、WDVの完全長ゲノム(ca.2.8kb)をPCRで増幅させた:
FwdvE1 aGAATTCacaccgatgggctc
RewdvE1 tGAATTCtgcacactcccacg
増幅断片をpGEM−Tベクター(プロメガ)にクローニングした。2つのクローンについて塩基配列を決定した。BLAST解析は、増幅配列が、EMBL/Genbankデータベースに存在する完全に配列決定した4つのWDV株(GEWDVXX、WDVGNS、WDW311031、NC 003326)とは著しく異なるが、ハンガリーで単離された部分的に配列決定した(1.2kb)ウイルス(AJ311038;Arch.Virol.147(1):205−216、2002)とは密接に適合することを示した。
pICH10830をコムギ及びトウモロコシの発育胚に照射した。胚に強力なGFP蛍光を発する細胞が観察されたが、胚乳でも検出されるであろう(図8)。
BGMVベクターに関して記載したのと同一のストラテジーを用いて、「反転した」WDVベクターpICH14520を作製した(図9)。このクローンが複製開始可能になるのは、φC31インテグラーゼに曝露して反転させた後のみである。このクローンの機能性を試験するため、トウモロコシの胚に単独で、又はインテグラーゼクローンpICH14530若しくはpICH14560とともに照射した。pICH14520をインテグラーゼとともに照射したときのみGFP蛍光細胞が検出されるであろう。
pICH14520及びインテグラーゼクローンでトウモロコシを形質転換した。
両方の構築体に由来する選択した形質転換体を両方向で交雑させ、さまざまな発育期で未成熟種子を切開し、顕微鏡又は携帯UVランプを用いて青色光下で観察した。
GFPを有するcr−TMV複製ベクターのクローニング:
pICH4351(図10)はcr−TMV、アブラナ感染トバモウイルス(Dorokhovら、1994、FEBS Letters、350、5−8)に基づいたウイルスベクターである。pICH4351は、Cr−TMVの5’非翻訳配列、続いてRdRp及びMPを含有し(Genbank受託番号Z29370のヌクレオチド1〜5629、MPの最後の16アミノ酸を、MP機能を喪失することなく切断し、Z29370中の5605位のTをCに変異させた)、シロイヌナズナ アクチン2プロモーター(787ヌクレオチド断片、転写開始の5’側、Genbank受託番号U41998、Anら、1996、Plant J.、10、107−121)に融合している。MPの後にLoxP部位が続く。この部位は、この構築体の使用に関して機能的に意味がなく、それを構築するために用いたプラスミドにも存在しているために存在している。LoxPの後にはcr−TMV由来のIRES配列(Genbank 受託番号Z29370のヌクレオチド4804〜4873)、及びGFP ORFが続く。GFP発現を増加させるための翻訳エンハンサーとしてIresをこの位置にクローニングした。GFPの後にはcr−TMV 3’非翻訳配列(Genbank 受託番号Z29370のヌクレオチド6083〜6312)、アグロバクテリウム Nosターミネーターが続く。この構築体を、植物でカナマイシン選択するためのカセットを有するアイコン・ジェネティクスのバイナリーベクターpICBV10にクローニングする(Nosプロモーター−NPTIIコード配列s−Nosターミネーター)。この構築体では、GFPはMPの末端に局在するCPサブゲノムプロモーターから発現される。照射又はアグロインフィルトレーション(agroinfiltration)による核への送達後、核においてアクチン2プロモーターから作製された第1転写物は、複製が起こる細胞質へ輸送される。
pICH10921はpICH4351から作製したウイルスプロベクターである(図11)。これは、IresからNosターミネーターまで伸びたDNA断片が逆方向に反転して構築体を複製不可能にしているという事実によってpICH4351とは異なっている。この断片の反転を可能にするために、φC31のAttP部位(gta gtg ccc caa ctg ggg taa cct ttg agt tct ctc agt tgg ggg cgt aga)及びAttB部位(tcg aag ccg cgg tgc ggg tgc cag ggc gtg ccc ttg ggc tcc ccg ggc gcg tac tcc acc tca ccc atc)を転置の末端に位置付ける。
pICH10921、pICH10881、pICH14540及びplCH14550で、ベンサミアナタバコを葉ディスク形質転換によって個別に形質転換し、50mg/Lのカナマイシンを形質転換体の選択に用いた(Horshら、1985、Science、227、1229−1231)。両構築体に由来する選択した形質転換体を両方向で交雑させ、未成熟種子を切開し、顕微鏡を用いて青色光下で観察した。ハイブリッド種子においてGFP発現が検出された。
トウモロコシのユビキチンプロモーターの制御下で、ハイグロマイシン ホスホトランスフェラーゼ遺伝子(HPT)を単子葉植物形質転換のための選択可能マーカーとして用いた(図12)。選択薬剤としてハイグロマイシンBを25〜100mg/lの濃度で適用した。
A188株、Hill株などの成熟及び未成熟胚からカルス培養を誘導した。培地はChu(N6)塩及びビタミンに基づいている(Chuら、Scientia Sinica、18(5):659−68,1975)。
カルス誘導培地及び繁殖培地には30g/lのショ糖、600mg/lのL−プロリン、2.0mg/lの2,4−D及び0.3%ゲルライトが添加されている。
プレ再生培地は使用しなかった。再生培地は、N6塩及びビタミン、30g/lのショ糖、2mg/lのゼアチン及び0.05mg/lの2,4−Dを含有する。再生培地にはチオ硫酸銀が0.01〜0.06mMの濃度で含まれている。
遺伝子銃PDS−1000/He粒子送達システム(バイオラッド)を用いて微粒子銃を実施した。細胞を、900〜1100psiで、マクロキャリアー発射点から停止スクリーンまで15mmの距離で、及び停止スクリーンから標的組織まで60mmの距離で照射した。破裂ディスクとマクロキャリアーの発射点との距離は12mmであった。細胞を、4時間の浸透圧前処理後に照射した。
プラスミドで大腸菌株DH10Bを形質転換し、LB培地中でmaxi prepを増殖させ、キアゲンキットを用いてDNAを精製した。
安定な形質転換実験のために、処置細胞を有するフィルターを、ろ過滅菌した適当な選択薬剤(150mg/L ハイグロマイシンB(Duchefa))、3%ショ糖を有する固形MS2培地上に移して遮光した。7日毎に材料を新鮮な選択培地に移した。プレートを暗所保存し、およそ6週間後、植物材料を再生培地及び適当な選択薬剤(150mg/L ハイグロマイシンB)の入ったペトリ皿に移した。ペトリ皿を強い光度でインキュベートした。日照時間16時間。
バルナーゼ遺伝子を、ラン藻PCC6803 DnaB インテインを用いて分割した。適当な制限部位に隣接したバルナーゼのN端部分及びC端部分のDNA断片を営利なDNA合成会社で化学的に合成した。
5’gcaatcgatg gcacaggtta tcaacacgtt tgacggggtt gcggattatc ttcagacata tcataagcta cctgataatt acattacaaa atcagaagca caagccctcg gctgggacgt ccgc3’。
5’cgccatgggg tggcatcaaa agggaacctt gcagacgtcg ctccggggaa aagcatcggc ggagacatct tctcaaacag ggaaggcaaa ctcccgggca aaagcggacg aacatggcgt gaagcggata ttaactatac atcaggcttc agaaattcag accggattct ttactcaagc gactggctga tttacaaaac aacggaccat tatcagacct ttacaaaaat cagataagga tccgc3’。
Claims (37)
- 第1と第2のトランスジェニック親植物のハイブリダイゼーションによって得られるF1種子において目的産物を産生する方法であって、ハイブリダイゼーションは、F1種子において第1及び第2のトランスジェニック親植物の第1及び第2の部分的遺伝子供与を組み合わせることによって、F1種子において産生のための遺伝子供与物を生じ、続いて目的産物をF1種子から単離するか又はF1種子を蒔く、前記方法。
- 第1と第2のトランスジェニック親植物のハイブリダイゼーションによって得られるF1種子において目的産物を産生する方法であって、ハイブリダイゼーションは、F1種子において第1及び第2のトランスジェニック親植物の第1及び第2の部分的遺伝子供与を組み合わせることによって、F1種子において産生のための遺伝子供与物を生じ、目的産物は第1又は第2の親植物では発現せず、続いて目的産物をF1種子から単離するか又はF1種子を蒔く、前記方法。
- 目的産物がRNA、タンパク質、酵素、又は前記酵素がその合成に関与しているポリマーのような化学化合物である、請求項1又は2に記載の方法。
- 第1と第2のトランスジェニック親植物のハイブリダイゼーションによって得られるF1種子において目的産物を産生する方法であって、ハイブリダイゼーションは、F1種子において第1及び第2のトランスジェニック親植物の第1及び第2の部分的遺伝子供与を組み合わせることによって、F1種子において産生のための遺伝子供与物を生じ、目的産物は第1又は第2の親植物では発現せず、目的産物は目的タンパク質であり、続いて目的産物をF1種子から単離するか又はF1種子を蒔く、前記方法。
- 遺伝子供与物が、目的産物の産生に関与する複製DNA又は複製RNAを含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 第1と第2のトランスジェニック親植物のハイブリダイゼーションによって得られるF1種子において目的産物を産生する方法であって、ハイブリダイゼーションは、F1種子において第1及び第2のトランスジェニック親植物の第1及び第2の部分的遺伝子供与を組み合わせることによって、F1種子において産生のための遺伝子供与物を生じ、遺伝子供与物は目的産物の産生に関与する複製DNA又は複製RNAを含み、続いて目的産物をF1種子から単離するか又はF1種子を蒔く、前記方法。
- 複製DNA又は複製RNAが目的産物をコードする、請求項5又は6に記載の方法。
- 複製DNA又は複製RNAが、F1種子において第1の部分的遺伝子供与成分と第2の部分的遺伝子供与成分から生ずる、請求項5〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 複製DNAが、ハイブリダイゼーションによって生ずるか又は複製をもたらすDNAウイルスレプリコンである、請求項5〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 複製DNAがDNA部位特異的組換えによって生ずる、請求項5〜8のいずれか1項に記載の方法。
- DNA部位特異的組換えが、リコンビナーゼ、インテグラーゼ、又はフリッパーゼによって触媒される、請求項10に記載の方法。
- 複製DNAが、F1種子において、第1親植物由来の部位特異的リコンビナーゼと第2親植物由来の複製DNAの前駆体とを組み合わせることによって生ずる、請求項10〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 複製DNAが自律的プラスミドである、請求項5〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 複製RNAが、ハイブリダイゼーションによって生ずるか又は複製をもたらすRNAウイルスレプリコンである、請求項5〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 複製RNAが、第1の部分的遺伝子供与成分と第2の部分的遺伝子供与成分からRNA特異的組換えによって生ずる、請求項5〜8又は14のいずれか1項に記載の方法。
- 複製RNAが第1の部分的遺伝子供与のDNAの転写によって生じ、転写は第2の部分的遺伝子供与の成分又は発現産物によって引き起こされる、請求項15に記載の方法。
- 複製RNAがハイブリダイゼーションに関与する雌性親植物によってコードされている、請求項16に記載の方法。
- 複製DNA又はRNAの形成に必要なRNA又はタンパク質の転写が、構成的プロモーター、種子特異的プロモーター、又は化学的に調節されるプロモーターによって制御される、請求項5〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 複製DNA又は複製RNAが植物ウイルスを起源とする、請求項5〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 複製DNAがジェミニウイルスに基づいている、請求項5〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 複製RNAが1本鎖の+鎖RNAウイルスに基づいている、請求項5〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 複製RNAがトバモウイルスに基づいている、請求項21に記載の方法。
- トバモウイルスがタバコモザイクウイルスである、請求項22に記載の方法。
- 複製DNA又はRNAの複製が、有性生殖不可能なF1種子の植物生長をもたらす、請求項5〜23のいずれか1項に記載の方法。
- F1種子から生長した植物の有性生殖は損なわれており、好ましくは排除されており、より好ましくはF1種子は不稔である、請求項1〜24のいずれか1項に記載の方法。
- 第1及び第2のトランスジェニック親植物のハイブリダイゼーションによって得られるF1種子において目的産物を産生する方法であって、ハイブリダイゼーションは、F1種子において第1及び第2のトランスジェニック親植物の第1及び第2の部分的遺伝子供与を組み合わせることによって、F1種子において産生のための遺伝子供与物を生じ、F1種子は有性生殖不可能であり、続いて目的産物をF1種子から単離するか又はF1種子を蒔く、前記方法。
- F1種子から生長した植物が、生殖生長期に達する前に植物の発育をブロックするために有性生殖不可能である、請求項24〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 植物発育のブロックは、正常な植物の発育を妨げる毒性物質又はタンパク質の組織特異的発現によって達成される、請求項27に記載の方法。
- タンパク質が、バルナーゼ、志賀タンパク質、植物転写因子、又は植物のホルモン状態を制御する酵素から成る群より選択される、請求項28に記載の方法。
- 目的産物が、発育胚、胚乳、子葉又は発芽種子の中に蓄積する、請求項1〜29のいずれか1項に記載の方法。
- 植物が単子葉植物又は双子葉植物である、請求項1〜30のいずれか1項に記載の方法。
- ハイブリダイゼーションの雌性親植物が雄性不稔である、請求項1〜31のいずれか1項に記載の方法。
- 目的産物が、ハイブリダイゼーションの雌性親植物によって提供される部分的遺伝子供与物によってコードされ、目的産物は好ましくは目的タンパク質である、請求項1〜32のいずれか1項に記載の方法。
- 種子における目的産物の産生が、遺伝子供与を生ずることによって誘発される、請求項1〜33のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜34のいずれか1項に記載の方法にしたがって得られる又は得ることが可能な産物。
- 請求項1〜34のいずれか1項に記載の方法にしたがって産生される又は産生可能な種子。
- 種子から生長した植物の有性生殖が損なわれており、好ましくは植物は性的に不稔である、請求項36に記載の種子。
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