CN108085320B - 水稻显性早熟基因Ef-cd及其应用 - Google Patents

Abstract

水稻显性早熟基因Ef‑cd及其应用，涉及一种水稻基因Ef‑cd及其应用。本发明的目的是提供一种水稻显性早熟基因Ef‑cd及其应用，用于促进水稻早熟且不影响产量，从而进一步提高杂交稻产量和适应高纬度地区的短生育期条件。该水稻显性早熟基因Ef‑cd的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。水稻显性早熟基因Ef‑cd在促进植物早熟中的应用。本发明的Ef‑cd突变体可以用于促进水稻早熟且不影响产量，从而进一步提高杂交稻产量和适应高纬度地区的短生育期条件，同时也满足现代轻简栽培所需求的早熟特性。

Description

水稻显性早熟基因Ef-cd及其应用

技术领域

本发明涉及一种水稻基因Ef-cd及其应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是人类赖以生存的重要粮食作物，全世界一半以上的人口以大米为主食。中国是世界稻谷生产大国和稻作历史古国，是最大的水稻生产基地之一，水稻总产量居世界第一。近年来，随着世界人口的增长、老龄化的加剧、城市化建设的加快，以及部分地区植被破坏导致环境恶化等问题的出现，使得如何在有限的人力和环境资源条件下提高水稻的产量和品质、保证粮食安全成为关系国计民生的重大问题。

提高单位面积粮食产量同时扩大种植面积能有效地解决持续人口增长对粮食需求。首先，提高单位面积粮食产量最有效的方法就是一年多季，缩短生育期。按照自然规律，作物想要增产需要通过较长时间的光合作用来积累碳水化合物。例如，由IRRI育成第一代品种IR20、IR24、IR26以及由国内育成的商业化杂交稻品种汕优1和汕优2都需要160 天或更长时间成熟或收获。这些品种虽然产量高，但生育期很长，种植在热带或亚热带地区也只能一年一季，严重阻碍了产量提高。另一方面，在我国北方有大量水源充足的种植区，但由于积温低，霜冻来临早可种植的品种非常少，土地利用很低，因而培育早熟高产的水稻品种缩短生育期，扩大种植面积成为当下育种研究的重点。而在水稻育种中，高产和早熟是长期存在的矛盾，即高产品种往往晚熟，因此培育优良的早熟品种满足多种生态地区和生产季节的需要，并获得高产稳产对水稻生产来说是一个巨大的挑战，也具有十分重要的意义。

水稻育种家一直在努力培育早熟品种用于杂交稻生产。1976年IRRI发布的IR36的成熟期是110天，IR50是105天，IR58是100天。国内育种家培育的测64是早熟恢复系，其衍生品种和汕优64是可以一年两季的作物。1991-2010年，另一个早熟恢复系优势品种明辉77及其衍生品种的种植面积达7,446,700公顷。而控制这些品种早熟高产特性的基因，及开发可利用于育种的标记成为水稻科学家和育种家研究的热点。

水稻的早熟性，一般认为是由1-2对主基因控制的隐性性状或多基因控制的数量性状，在育种研究的过程中发现或定位了多个影响生育期(抽穗期)或成熟数量性状位点(QTL)。日本水稻基因组基因(RGP)对水稻抽穗期QTL的定位进行了***而深入的研究，该计划对Nipponbare/Kasalath衍生群体进行分析定位了14个抽穗期QTLs (Hd1-Hd14)，后来研究人员又定位了Hd15-17，目前已图位克隆Hd1、Hd3a(Hd3位点分为Hd3a和Hd3b)、Hd6等基因。研究发现水稻开花主要由成花素基因Hd3a和Hd3a 的同源基因RFT1调控，其中短日条件下由Hd3a控制，而长日照条件下则是通过 OsSOC1/OsMADS50促进Ehd1和RFT1的表达来调控的。此外又报道了29个抽穗期基因及其修饰基因，感光基因及修饰基因18个，其中非感光基因如显性早熟基因Ef-1、Ef-x(t)、 Ef-y(t)、Ef-cd(t)，隐性迟熟基因有ef-3(t)、ef-4(t)、lf-3(t)；修饰基因有m-Ef-1、w-Ef-1(t)、 Su-Ef-ed(t)等。

根据育种实践和杂种优势的遗传基础，即单基因控制的杂种优势效应和显性作用占主导地位的理论，选育早熟杂交稻要求不育系为显性早熟或恢复系为隐性迟熟才能达到较好的效果。水稻早熟基因的发现和利用将有助于解决早熟与丰产难以兼顾的矛盾，也有利于克服籼粳亚种间超亲迟熟的障碍。因此，发掘和鉴定水稻抽穗期基因包括，开展抽穗期基因定位、克隆及回交转育等方面的研究，特别是利用分子标记辅助和农艺性状选择相结合，在传统遗传育种的基础上深入研究抽穗期基因的育种利用，具有重要的理论意义和应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种水稻显性早熟基因Ef-cd及其应用，用于促进水稻早熟且不影响产量，从而进一步提高杂交稻产量和适应高纬度地区的短生育期条件。

本发明水稻显性早熟基因Ef-cd，来自籼稻不育性系6442S-7，该基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

Ef-cd对应的日本晴等位基因的登录号为Os03g0122500，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。

本发明克隆的水稻显性早熟基因Ef-cd突变体是长非编码RNA(long noncodingRNA, lncRNA)，来自于OsSOC1基因的反义链，通过正调控OsSOC1基因的表达控制水稻早熟。该突变序列是包括在Os03g0122500启动子区4个缺失、1个***、22个SNPs，以及基因内部分别位于第一和第二内含子中的1个***和一个SNP突变。存在变异的Ef-cd可以显著促进水稻早熟。通过对不同品种的基因型分析也发现，在1479个栽培品系中，共有 72个品种含有该显性早熟基因变异，其中有29个来自于国际水稻所(International Rice ResearchInstitute，IRRI)；在中国的1,439份进入大田生产的优良杂交水稻中，有299份含有杂合的基因型和16分纯合的基因型，都显著的促进了水稻的抽穗。

本发明的Ef-cd突变体可以用于促进水稻早熟且不影响产量，从而进一步提高杂交稻产量和适应高纬度地区的短生育期条件，同时也满足现代轻简栽培所需求的早熟特性。

附图说明

图1为Ef-cd近等基因系D248与轮回亲本蜀恢881(SH881)的表型；

图2为Ef-cd精细定位区间；

图3为D248与蜀恢881(SH881)比对的Os03g0122500基因序列；

图4为Os03g0122500基因T-DNA***突变体ef-cd-1和ef-cd-2的表型；

图5为Os03g0122500基因的RNAi突变系表型；

图6为RNAi突变系Os03g0122500基因表达鉴定；

图7为Ef-cd-Cas9敲除突变体表型；

图8为Os03g0122500基因结构示意图；敲除位点为Os03g0122500启动子区；

图9为在原生质体中比较D248及其轮回亲本SH881中Os03g0122500启动子调控的荧光素酶活性，**显著性p<0.01；

图10为播种后15-60天Ef-cd在D248和SH881中的相对表达量；

图11为播种后15-60天OsSOC1在D248和SH881中的相对表达量；

图12为为播种后45天Ef-cd和OsSOC1在野生型和ef-cd-2突变体(PFG_2A-10486.R) 相对表达量；

图13为播种后45天Ef-cd和OsSOC1在野生型和Ossoc1突变体(PFG_3A-05349.L)相对表达量；

图14为播种后30天短日照处理Hd3a和RFT1在D248和SH881中的相对表达量；

图15为播种后40天短日照处理Hd3a和RFT1在D248和SH881中的相对表达量；

图16为不同基因型的早熟和晚熟品种中OsSOC1基因的相对表达量，^*表示p<0.05；^**表示p<0.01；NS为不显著；

图17为不同基因型的早熟和晚熟品种中Ef-cd基因的相对表达量。^*表示p<0.05；^**表示p<0.01；NS为不显著；

图18为北京(39°54’N)轮回亲本抽穗期比较；

图19为四川成都(30°42’N)轮回亲本抽穗期比较；

图20为海南陵水(18°22’N)轮回亲本抽穗期比较；

图21为Ef-cd近等基因系杂交稻ZS97A/D330与对照杂交稻ZS97A/MH63抽穗成熟期比较；

图22为Ef-cd近等基因系杂交稻E-II-32A/FH838与对照杂交稻II-32A/FH838抽穗成熟期比较；

图23为北京杂交稻SY63、E-SY63、II-You838、E-II-You838产量数据比较；

图24为嘉兴杂交稻SY63、E-SY63、II-You838、E-II-You838产量数据比较；

图25为成都杂交稻SY63、E-SY63、II-You838、E-II-You838产量数据比较；

图26为福州杂交稻SY63、E-SY63、II-You838、E-II-You838产量数据比较；

图27为D248的谱系信息；

图28为用122500indel-1标记(与36bp的***/缺失基因位点邻近)分析Ef-cd基因在水稻品种中的普及度；

图29为用122500indel-1标记分析Ef-cd基因在水稻品种中的普及度；

图30为三亚地区水稻品种Ef-cd的表型和基因型相互作用分析；

图31为杭州地区水稻品种Ef-cd的表型和基因型相互作用分析。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式水稻显性早熟基因Ef-cd，来自籼稻不育性系6442S-7，该基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

具体实施方式二：本实施方式Ef-cd对应的日本晴等位基因的登录号为Os03g0122500，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。

具体实施方式三：本实施方式在促进植物早熟中的应用。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式三不同的是：所述植物为水稻。其它与具体实施方式三相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式三不同的是：所述促进植物早熟具体为促进水稻抽穗。其它与具体实施方式三相同。

下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：水稻Ef-cd基因精细定位

Ef-cd作为显性早熟的位点，最早在籼稻雄性不育系6442S-7中发现，并定位于水稻的3号染色体上。为了精细定位Ef-cd基因，利用蜀恢881(SH881)为轮回亲本与不育系6442S-7连续回交，然后自交选择，构建了BC₅F₁₁近等基因系D248，BC₅F₁₁近等基因系 D248与轮回亲本蜀恢881(SH881)进行杂交获得F₁种子，F₁自交获得F₂。从F₂代群体中筛选鉴定4,800株晚花个体提取DNA，利用已发表的水稻SSR标记及根据SH881和 6442S-7中Ef-cd侧翼基因组DNA序列开发Indel标记(表1)精细定位Ef-cd基因。

采用CTAB法提取DNA作为PCR反应模板，PCR反应体系的总体积为10μl，水稻基因组DNA模版1μl(约200ng)、2×Master Mix 5μl、10μM引物各0.5μl，加ddH₂O到 10μl。反应程序：94℃变性5min；94℃30s；58℃30s；72℃20s，35个循环；72℃延伸 10min。

表1图位克隆分子标记序列信息

结果如图1和图2所示，近等基因系D248抽穗期明显早于轮回亲本蜀恢881(图1)；利用F₂群体筛选鉴定到多个Indel标记，将Ef-cd定位到12.9Kb的区间内，该候选区域内包含开花激活子Os03g0122600(OsSOC1/OsMADS50/DTH3)和Os03g0122500基因(图2)。所述抽穗期是指从播种到穗子抽出剑叶叶鞘的时间。

为缩短定位区间，更精细定位突变基因，利用TRIzol(Invitrogen,USA)提取SH881与D248的叶片的总RNA，利用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix(Toyobo,Japan)反转录 1μg总RNA合成cDNA，PCR分别扩增SH881与D248的OsSOC1和Os03g0122500基因的全长cDNA序列，回收PCR产物进行克隆测序。PCR反应体系的总体积为50μl，水稻基因组DNA模版1μl(约200ng)、2XPCR buffer for KOD Fx 25μl、2mM dNTP 10μl、 KOD Fx(1U/μl)1μl、10μM引物各1.5μl，加ddH2O到50μl。反应程序：98℃变性 2min；98℃10s；60℃90s；68℃2min，30个循环；78℃延伸10min。回收PCR产物，克隆进行Sanger测序分析。

对测序结果进行比对发现，来自SH881与D248的OsSOC1基因的cDNA序列并不存在SNP的差异，而由OsSOC1的反义链转录而来的Os03g0122500属于lncRNA，数据库(https://shigen.nig.ac.jp/rice/oryzabase/)登录号为AK242050，在其启动子区和内含子区均存在差异。与SH881比较发现，D248在Os03g0122500启动子区存在4个大片段的缺失 (其中包含一个36bp和一个267bp大缺失突变)，1个单碱基***和22个SNPs；以及分别在基因内的第一个和第二个内含子一个***和一个SNP(图3)。

为了验证候选基因功能，从水稻T-DNA***突变体库 (http://signal.salk.edu/cgi-bin/RiceGE)获得Os03g0122500基因的两个突变体命名为 ef-cd-1(PFG-1D-05526.R)和ef-cd-2(PFG-2A-10486.R)。ef-cd-1和ef-cd-2的T-DNA***位点分别位于Os03g0122500基因第一个内含子和启动子区(突变区域与D248相同)，二者且都呈现抽穗期延迟的表型(图4)。以上结果说明了Os03g0122500启动子区和内含子区变异影响了水稻的生育期，Os03g0122500可能为Ef-cd的候选基因。

实施例2：启动子功能分析

(1)RNAi载体构建

以D248的Ef-cd全长基因为模版扩增Os03g0122500基因的5’区168bp，扩增引物序列为RNAiP forward primer:5’-GTCGACTCAAAGCGATCTGTCACCTGAA-3’；RNAiP reverseprimer:5’-GGATCCTACTTGTACTCCTGCTTG-3’，利用XhoI/BglII和SalI/BamHI 双酶切连接的方法构建到pUCRNAi载体上。最后将茎环克隆到pCAMBIA2301载体上。利用农杆菌介导法转化水稻日本晴。利用半定量的方法检测Ef-cd基因的表达量。

(2)CRISP/Cas9载体构建

Ef-cd-Cas9突变体由Biogle公司构建(中国杭州)。构建过程如下：对Os03g0122500 启动子区分别设计两个不同的sgRNA靶点:sg1213:5’-GTCGATTCGGTGCGTGATAA-3’和sg1214:5’-GTCATATACAACAGGGGTAC-3’。将这两个sgRNAs构建到含有Cas9蛋白的BGK032-DSG载体上，转化农杆菌EHA105，再遗传转化水稻日本晴。转基因植株敲除检测：提取转基因植株基因组DNA，利用靶点附近引物Efcd-cas9，PCR扩增并测序分析敲除片段。

Efcd-cas9 forward primer:5’-TCAGACTCCAGAGTTGGAAAA-3’

Efcd-cas9 reverse primer:5’-TGCGAAATGCTAGACGCATA-3’。

结果如图5-9所示，利用RNA干扰技术作用于Os03g0122500启动子区序列，导致Os03g0122500基因表达量下降后，呈现抽穗期延迟的现象(图5和图6)。利用CRISP/Cas9 技术构建的Os03g0122500基因敲除Ef-cd-Cas9突变体，测序分析Os03g0122500的启动子区存在158bp敲除，突变体呈现晚花表型(图7和图8)。这些结果也说明Ef-cd (Os03g0122500)基因启动子区变异影响水稻生育期，导致晚熟的表型。

(3)LUC assays荧光素酶活性检测

Os03g0122500启动子区存在许多核苷酸位点的变异，因此推测这些变异可能影响该基因启动子的活性。

分别从D248及其轮回亲本SH881中分别克隆了该基因上游2050个碱基的启动子序列，通过Clontech公司的In-Fusion试剂盒将该序列***目的载体pGWB535中，与萤火虫荧光素酶编码序列融合。用Promega公司的双荧光素酶试剂盒测检测了报告基因荧光素酶的活性。

结果如图9所示，pD248::LUC的荧光素酶活性比pSH881::LUC的荧光素酶活性高出7.34倍，表明在D248中Ef-cd的启动子具有更强的活性。

实施例3：QPCR比较分析Ef-cd与OsSOC1表达变化

(1)D248和SH881中Ef-cd与OsSOC1表达变化

利用TRIzol(Invitrogen,USA)提取播种后15-60天水稻叶片总RNA。利用ReverTraAce qPCR RT Master Mix(Toyobo,Japan)反转录1μg总RNA合成cDNA，设计qPCR引物：

Ef-cdQ forward primer:5’-ACTCCTCCTTTCGTCTTCCT-3’，

Ef-cdQ reverse primer:5’-GCTTGATTGTGGCTTGGTATTT-3’，

OsSOC1Q forward primer:5’-CTGCGTTGAGAAAGGAGATGAT-3’，

OsSOC1Q reverse primer:5’-CATGGACGACAATACGGGTAAG。

根据SYBR Green Real-Time PCR Master Mix reagent(Toyobo,Japan)混合qPCR反应体系，qPCR反应的条件：95℃2min；95℃15s；60℃30s；Goto step2 40循环，95℃1min，55℃1min，95℃30s。以水稻OsActin为内参，引物序列如下所示：

OsActin1Q forward primer:5’-ACCATTGGTGCTGAGCGTTT-3’，

OsActin1Q reverse primer:5’-CGCAGCTTCCATTCCTATGAA-3’。

QPCR采用比较CT法(^ΔΔCT)计算基因表达量，以水稻OsActin基因为内参基因，以未经处理的样品作为对照。目标基因表达差异通过经过处理的样本相对于每个时间点未经处理的样本的倍数来表示。每个样品包括3次生物学重复和3次技术重复，数据取3 次生物学重复的平均值，如果有一个数值的偏差比较大则取两个数据的平均值。原始数据经标准化处理。标准化处理后的数据经T检验进行差异显著性分析。相对表达量计算方法：2^-ΔΔCT＝2^{-(ΔCT处理-ΔCT对照)}＝2^{-[(CT处理目的基因-CT处理内参基因)-(CT对照目的基因-CT对照内参基因)]}。

结果如图10-13所示：Ef-cd在D248幼苗发育的第30天开始升高，第60天达到最大值，而在SH881幼苗发育过程中在表达变化不大(图10，其中曲线1表示SH881，曲线 2表示D248)；OsSOC1在D248和SH881幼苗发育的15-60天都呈现表达量上升，而在 D248中表达量更高，特别是在30-60天表达量上升更显著(图11，其中曲线1表示SH881，曲线2表示D248)。ef-cd突变体(ef-cd-2)中OsSOC1表达量显著降低(图12)；而在Ossoc1 突变体中(PFG_3A-05349.L)Ef-cd表达量降低不明显(图13)。以上结果说明Ef-cd和 OsSOC1在D248表达量更高，特别是播种后30-60天Ef-cd调控OsSOC1的表达。

(2)D248和SH881中成花素基因Hd3a和RFT1相对表达量

OsSOC1通过调控下游成花素基因Hd3a和RFT1基因表达影响水稻生育期，因此利用qPCR的方法分析Ef-cd的变异是否影响Hd3a和RFT1基因相对表达量。

提取播种后30天短日照和40天长日照条件下D248和SH881在幼苗叶片总RNA，反转录及qPCR分析Hd3a和RFT1基因相对表达量，分析步骤同实施例3(1)，Hd3a和 RFT1的引物序列如下：

Hd3aQ forward primer:5’-TCGAGGTCGGCGGCAATGAC-3’

Hd3aQ reverse primer:5’-CCTCGCGCTGGCAGTTGAAGTAGAC-3’；

RFT1Q forward primer:5’-CCATTCGTCCGGATCACTAACCTCA-3’，

RFT1Q reverse primer:5’-CGCGCTGGCAGTTGAAGTAGAC-3’。

研究如图14和15所示：幼苗在播种后30天短日照和40天长日照条件下，Hd3a和RFT1在D248中的表达均显著高于SH881，说明无论长日或短日条件下Ef-cd的变异均促进了Hd3a和RFT1基因的表达。

(3)不同基因型抽穗期品种中Ef-cd与OsSOC1表达变化

dth3和Hd9是定位于3号染色体的抽穗期基因，分别来自非洲稻和日本品种Kasalath，不同于IRRI来源及其衍生系品种的基因型。近等基因系dth3-NIL(非洲稻╳轮回亲本 Dianjingyou1，DJY1)，Hd9-NIL(Kasalath╳轮回亲本Nipponbare,Nip)均为晚熟表型。

提取以下不同的早熟和晚熟材料的总RNA，反转录成cDNA后qPCR分析Ef-cd与OsSOC1基因相对表达量，步骤同实施例3(1)。

表2不同生育其基因型材料及其对照材料

早熟	晚熟
		DJY1	dth3-NIL(非洲稻╳轮回亲本DJY1)
Nip	Hd9-NIL(Kasalath╳轮回亲本Nip)
		Zaohui89(IR50╳轮回亲本IR24)	IR24
D330	明恢63(MH63)

qPCR分析结果如图16和17所示，Ef-cd与OsSOC1基因在早熟品种中的相对表达量明显高于晚熟品种；序列分析发现Ef-cd序列在dth3-NIL存在30个SNPs和3个大片段***，Hd9-NIL存在11Kb的大片段的缺失。而早恢89、D330与D248基因型相同； IR24、明恢63与SH881基因型相同。以上结果说明，不同基因型的品种中早熟的特性与 Ef-cd和OsSOC1表达量呈正相关关系。

实施例4、Ef-cd基因型与水稻早熟性状紧密连锁

根据家系资料，推断D248的Ef-cd基因型是来自国际水稻研究所研制品种IR9761-19，其后代的育种品种中均可以检测到(图27)。

使用122500indel-1标记检测Ef-cd基因型(和晚熟基因型相比Ef-cd的启动子区有一个36碱基的缺失)。研究表明，国际水稻所后期培育的早熟品种(IR30、IR36、IR50、IR58、 IR64和IR74)像测64一样均含有Ef-cd位点(如图28，早熟品种Ce64、IR30、IR36、IR50、 IR58、IR64及IR74均含有Ef-cd基因位点，但晚熟品种IR24和IR29不含Ef-cd基因位点)；同时在中国主要的早熟恢复系中均含有Ef-cd早熟基因，比如测64-7(20世纪80年代)，明恢77(20世纪90年代)，R402(21世纪初)和To463(现代)，但是在晚熟恢复系比如明恢63、9311、蜀恢881和福恢838中却不存在(如图29，Ef-cd基因位点在中国主要的早熟恢复系品种中均有存在，比如Ce64-7,明恢77(MH77),R402及To463。但在中国主要的晚熟恢复系品种中均不存在，比如明恢63(MH63),9311,蜀恢881(SH881)及福恢 838(FH838))。

通过对1495种优质杂交水稻品种的基因组分析发现，在三亚和杭州抽穗期的变化相关的主要QTL为Ef-cd-OsSOC1基因位点。因此，利用122500indel-1标记分析了在三亚和杭州1439种优质杂交水稻品种(籼稻-籼稻杂交)的抽穗期。结果如图30和31所示，在三亚(a)和杭州(b)，SNP标记vf0301285586鉴定出的早熟D248纯合基因型(AA)及杂合基因型(AT)杂交品种普遍比野生SH881基因型(TT)品种早抽穗。**显著性p<0.01，NS 指不显著。所有具有纯合或杂合Ef-cd基因型的杂交品种都抽穗较早。这些结果也说明 Ef-cd基因对水稻的早熟紧密连锁。

实施例5：Ef-cd基因的生育期效应与产量效应试验应用

(1)Ef-cd近等基因系抽穗期明显缩短抽穗期

2015年种植在水稻种植区采用随机区组的方式种植于中国科学院遗传与发育研究所 (39°54’N，北京)、嘉兴农业科学院(30°75’N，浙江嘉兴)、四川农业大学(30°42’N，四川成都)、福建农业科学院(26°08’N，福建福州)、海南陵水(18°22’N)。水稻种植行距26cm，间距17cm。田间管理遵循如下正常的农业施肥经验(每公顷)：50kg氮，60kg磷和95kg 钾作为基本肥料；分孽期氮素90kg；抽穗期氮素30kg。所有的水稻材料均在相同的培养条件下种植。区组实验3次重复。抽穗期为从播种到剑叶上方出现第一个花序的天数，每天记录抽穗期。

结果如图18、19和20所示，高世代的近等基因系(表3)表型与轮回亲本相似，但抽穗期提前。当种植在海南陵水(18°22’N)、四川成都(30°42’N)和北京(39°54’N)等3个不同光周期水稻种植区时，近等基因系的抽穗期要比野生型要缩短8.9-19.7天。

表3

Recurrent parents	NILs	Combination	Generation
				Shuhui881	D248	6442S-7/SH881	BC<sub>5</sub>F<sub>11</sub>
Minghui63	D330	6442S-7/MH63	BC<sub>9</sub>F<sub>12</sub>
				Shuhui527	D488	6442S-7/SH527	BC<sub>9</sub>F<sub>12</sub>
Mianhui725	D439	6442S-7/MH725	BC<sub>13</sub>F<sub>10</sub>
				Yihui577	D374	6442S-7/YH1577	BC<sub>10</sub>F<sub>9</sub>
II-32B	B3115	6442S-7/II-32B	BC<sub>6</sub>F<sub>14</sub>

(2)Ef-cd突变基因型早熟而不减产

2015年种植水稻于中国科学院遗传与发育研究所(39°54’N,北京)、嘉兴农业科学院(30°75’N,浙江嘉兴)、四川农业大学(30°42’N,四川省成都)、福建农业科学院(26°08’N,福建福州)，种植方式同实施例5中(1)所示。

种植材料为早熟近等基因系D248和D330及相应的晚熟亲本SH881和MH63；南方品种杂交稻汕优63(ZS97AXMH63)、II-You838(II-32AXFH838)；利用近等基因系将 Ef-cd导入上述杂交稻中：ZS97A/D330，其中D330是MH63导入Ef-cd基因的近等基因系、E-II-You838(E-II-32A/FH838)，其中E-II-32A是II-32A导入Ef-cd基因的近等基因系。

比较早熟近等基因系(D248、D330)和相应的晚熟亲本(SH881、MH63)的产量相关性状包括穗数、粒数、结实率和千粒重显示没有显著差异，说明Ef-cd基因并不影响产量。

为近一步检测Ef-cd是否可以导入杂交稻中来缩抽穗期且不影响产量，调查发现四个地点所有含Ef-cd近等基因系的杂交稻抽穗和成熟期均早于相对应的杂交稻6.9-15.9天(图 21和22)，穗数、株高、粒数、结实率和千粒重显示没有显著差异。比较Ef-cd基因型的杂交稻与相应对照杂交稻的产量发现，北京两个Ef-cd基因型的杂交稻产量均比对照杂交稻要高(图23)，在嘉兴只有一个Ef-cd基因型的杂交稻E-II-You838(E-II-32A/FH838)产量比对照高(图24)，其他地点产量都是相同的(图25和26)。这些结果有力的说明 Ef-cd-OsSOC1位点可以应用于杂交稻不育系或恢复系中促进杂交稻早熟且不影响产量。 (图23-图26中，**表示p<0.01；NS表示不显著)。

序 列 表

<110> 中国科学院东北地理与农业生态研究所

<120> 水稻显性早熟基因Ef-cd及其应用

<160> 18

<210> 1

<211>2327

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<220>

<223> 水稻显性早熟基因Ef-cd

<400> 1

attggttgtg aagagaatgt tagtggagaa gttgttatat tttagaacag agggagtaat 60

aattaaaata ctcaacttta tgaaatatcg atacagttat tcttttcttt gtatacttcc 120

aatgcattta tatcctaatt tcacaaactt cgatataata attgtttgag aaagaactta 180

ttttagaaca agtcgtataa gggttaaaaa caaacttatt taagatggag gtatttaggt 240

ggtgtttggt tggagggact aaagtggggc taaactttag tccctctcac aaaaacataa 300

gtctctagtt atatttttgt gagagggact aaatttagtc cctagttacc aaacaccccc 360

ttaagatgga gctagtaccc tgcatgacgg ccatgtgcta gtttatctct cgcctcggga 420

gtttgtgggc catatgctac gtagatgttg ggccatcttc gtgggctcag gctccaccag 480

cacgtccgct cacggcgcat gggatgcacg cggcgccatt tgttccccac actcccgtgg 540

gccgcatact acccaggacg gtggcgcgtt gggccgtatc gtccccaagc ccatcacggc 600

ttttgcccta catcgcctcg atcgcgtttg ggcccgctag tccatgctag tatacgcgac 660

agcgacgtgt acgtacgtct ccaacgcgaa tacaacacct ccacgtggcg tacttgcatg 720

tgaggcagtc ttcaacgtat gtttccctgt caaaattcta ccgattcctg cggtttcctg 780

catccttttt gcctctaatt gcgtgtgacc actagctttt cgcctatgtt cccttccgtg 840

cctccgcgtg acacgagctg tttgagcagc agtgtatatc aactgaacat cgaataaata 900

ctacttcatc cgtttcataa tataagttat tctagcattt ttcacattca tattgattat 960

atatatatat atatatatat atgagaaacg gagggagtaa tgatttatta ctaccatgta 1020

tactcgctgt aaagagaaat atactactac ttcagactcc agagttggaa aaatcacatc 1080

gcggctttgc aagcaaaaac cgttatcacg caccgaatcg agggatacta ctagaagcga 1140

tggggattag ggtccagaaa tctcctcggc ttccactgcc caatcgacac gtcgaccaca 1200

ggtagcattc aagagatcga aacgtcgacc aataccagca tagcgcgtca tatacaacag 1260

gggtacaggt caaagcgatc tgtcacctga atgtactccc tccctcttta aaactcctcc 1320

tttcgtcttc ctcccgttcc ggccttgtgc agagaatctc aacagagata tgttcagcat 1380

atgtttgctc caacatcaca tcaaatacca agccacaata aagcaggagt acaagtacgc 1440

acttgagatc tctcgattta gatttagatg ggtagtggag tctgccgatc gaagggtttc 1500

tgcctggtgg tgctgaatgg gtgggtgcat gcgtctagca tttcgcatcc atggacgaca 1560

atacgggtaa gtaaaatata cagcgtggtc tgtttttagg atggtttggt gtcattgcat 1620

gcctagctat catctccttt ctcaacgcag agatccagct tattcctggc ctgttactta 1680

agaatggggc atcgcttggc tatcttctgc agcaccgccg ctggagcgac ttctgccagg 1740

cagccctatg aatagctcag tttcgacatc catgttgtcg ttggtggtgt tgatgttacg 1800

gtccgggttc tcatcttcag cccggacagt caaaggagca gacaagggag gctgattctt 1860

acactgcaca aagttcatga tcaagggaag caaatcaggt gagttgatct ttcagtgtcg 1920

cagaaaattc tcggcattta tattggtgtg cacataagat atcgcacgaa ttagctcaaa 1980

taatcatatg ctaggctggg cgatcgactt aagctggctg ctggtgtctt ctcggcagta 2040

aaagtttcac tcgtcttacc ttttcgcgta actcttcatt gtccttgcgc agcttcatct 2100

cctggtcgat gttaatgcaa aaaagagaca aacacgacat taggaacaga tgattggtcc 2160

tgcgtttcag gttatatata tatttattta tttatagtaa gtacgaagtt ggtgaggtac 2220

cttctctctc agtttggcaa cctgctcctc aagcagcttt gtctagtatg cagagaattg 2280

gttgtaagtt tgtgcacatc atatatatag ataaattaat tgctgat 2327

<210> 2

<211>2633

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<220>

<223> Ef-cd对应的日本晴等位基因

<400> 2

attggttgtg aagagaatgt tagtggagaa gttgttatat tttaggacaa atcctgagag 60

ttaaaagttg ttatatttta gaacagaggg agtaataatt aaaatactca actttatgaa 120

attttgatac agttattctt ttctttgtat acttccaatg catttatatc ctaatttcac 180

aaacttcgat ataataattg tttgagaaag aacttatttt agaacaaatc gtaaaagggt 240

taaaaacaaa cttatttaag atggaggtat ttaggtggtg tttggttcga gggactaaag 300

tggggctaaa ctttagtccc tctcataaaa acataaatcc ctagttatat ttttgtgaga 360

gagactaaat ttagtcccta gttaccaaac acccccttaa gatggagcta gtactctgca 420

tgacggccat gtgctagttt atctctcgcc acgggagttt gtgggccata tgctacgtag 480

atgttgggcc atcttcgtgg gctcaggctc caccagcacg tccgctcacg gcgcatggga 540

tgcacgcggc gccgtttgtt cccccacact cccgtggccg catactaccc aggacggtgg 600

cgcgttgggc cgtatcgtcc ccaagcccat cacggctttt gccctacatc gcctcgatcg 660

cgtttgggcc cgctagtcca tgctagtata cgcgacagcg acgtgtacgt acatctccaa 720

cgcgaataca acacctccac gtggcgtact tgcatgtgag gcagtcttca acgtatgttt 780

ccctgtcaaa attctaccga ttcctgcggt ttcctgcatc ctttttgcct ctaattgcgt 840

gtgaccacta gcttttcgcc tatgttccct tccgtgcctc cgcgtgacac gagctgtttg 900

agcagcagtg tgtatcaact gaacatcgaa taaatactac ttcatccatt tcataatata 960

agttattcta acatttttca cattcatatt gatcatatat atatatatat atgtatatgt 1020

atatatgtat gtatatatgt atgtatgtat atatgtatat atgtatatat atgtatatat 1080

atgtatatat gtatatatat gtatatatat gtatatgtat atatatatat atatgtatat 1140

atatatatat atatgtatat atatatatat gtatatatat atatgtatat atatatatat 1200

gtatgtatat atatatatgt atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat 1260

atatatatat atatatatat atatatatga aacggagtga gtaatgattt attactacca 1320

tatatactcg ctgtaaagag aaatatactg ctactacttc agactccaga gttggaaaaa 1380

tcacatcgcg gctttgcaag caaaaaccgt tatcacgcac cgaatcgagg gatactacta 1440

gaagcgatgg ggattagggt ccagaagtct cctcggcttc cactgcccaa tcgacacgtc 1500

gaccacaggt agcattcaag agatcgaaac gtcgaccaat accagcatag cgcgccatat 1560

acaacagggg tacaggtcaa agcgatctgt cacctgaatg tactccctcc ctctttaaaa 1620

ctcctccttt cgtcttcctc ccgttccggc cttgtgcaga gaatctcaac agagatatgt 1680

tcagcatatg tttgctccaa catcacatca aataccaagc cacaataaag caggagtaca 1740

agtacgcact tgagatctct cgatttagat ttagatgggt agtggagtct gccgatcgaa 1800

gggtttctgc ctggtggtgc tgaatgggtg ggtgcatgcg tctagcattt cgcatccatg 1860

gacgacaata cgggtaagta aaatatacag cgtggtctgt ttttaggatg gtttggtgtc 1920

attgcatgcc tagcatcatc tcctttctca acgcagagat ccagcttatt cctggcctgt 1980

tacttaagaa tggggcatcg cttggctatc ttctgcagca ccgccgctgg agcgacttct 2040

gccaggcagc cctatgaata gctcagtttc gacatccatg ttgtcgttgg tggtgttgat 2100

gttacggtcc gggttctcat cttcagcccg gacagtcaaa ggagcagaca agggaggctg 2160

attcttacac tgcacaaagt tcatgatcaa gggaagcaaa tcaggtgagt tgatctttca 2220

gtgtcgcaga aaattctcgg catttatatt ggtgtgcaca taagatatcg cacgaattag 2280

ctcaaataat catatgctag gctgggcgat cgacttaagc tggctgctgg tgtcttctcg 2340

gcagtaaaag tttcactcat cttacctttt cgcgtaactc ttcattgtcc ttgcgcagct 2400

tcatctcctg gtcgatgtta atgcaaaaaa gagacaaaca cgacattagg aacagatgat 2460

tggtcctgcg tttcaggtta tatatatatt tatttattta tagtaagtac gaagttggtg 2520

aggtaccttc tctctcagtt tggcaacctg ctcctcaagc agctttgtct agtatgcaga 2580

gaattggttg taagtttgtg cacatcatat atatagataa attaattgct gat 2633

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> RNAiP forward primer

<400> 3

gtcgactcaaagcgatctgtcacctgaa 28

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> RNAiP reverse primer

<400> 4

ggatcctacttgtactcctgcttg 24

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> sg1213

<400> 5

gtcgattcggtgcgtgataa 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> sg1214

<400> 6

gtcatatacaacaggggtac 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> Efcd-cas9 forward primer

<400> 7

tcagactccagagttggaaaa 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> Efcd-cas9 reverse primer

<400> 8

tgcgaaatgctagacgcata 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> Ef-cdQ forward primer

<400> 9

actcctcctttcgtcttcct 20

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> Ef-cdQ reverse primer

<400> 10

gcttgattgtggcttggtattt 22

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> OsSOC1Q forward primer

<400> 11

ctgcgttgagaaaggagatgat 22

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> OsSOC1Q reverse primer

<400> 12

catggacgacaatacgggtaag 22

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> OsActin1Q forward primer

<400> 13

accattggtgctgagcgttt 20

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> OsActin1Q reverse primer

<400> 14

cgcagcttccattcctatgaa 21

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> Hd3aQ forward primer

<400> 15

tcgaggtcggcggcaatgac 20

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> Hd3aQ reverse primer

<400> 16

cctcgcgctggcagttgaagtagac 25

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> RFT1Q forward primer

<400> 17

ccattcgtccggatcactaacctca 25

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> RFT1Q reverse primer

<400> 18

cgcgctggcagttgaagtagac 22

Claims (4)

1.水稻显性早熟基因Ef-cd，其特征在于该水稻显性早熟基因Ef-cd，来自籼稻不育性系6442S-7，该基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述水稻显性早熟基因Ef-cd对应的日本晴等位基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。

3.权利要求1所述水稻显性早熟基因Ef-cd在促进水稻早熟中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述促进水稻早熟具体为促进水稻抽穗。

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