ES2320920T3 - Composicion probiotica. - Google Patents

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ES2320920T3 ES06025815T ES06025815T ES2320920T3 ES 2320920 T3 ES2320920 T3 ES 2320920T3 ES 06025815 T ES06025815 T ES 06025815T ES 06025815 T ES06025815 T ES 06025815T ES 2320920 T3 ES2320920 T3 ES 2320920T3
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Toshio Fujii
Daisuke Fujiwara
Akira Saiki
Minoru Takahashi
Koichiro Yamauchi
Masami Gotou
Satoshi Nishida
Keiji Deuchi
Hideyuki Wakabayashi
Toshihiro Komeda
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Abstract

Un producto probiótico que comprende una cepa KW3110 viable de la bacteria del ácido láctico Lactobacillus paracasei o su mutante como ingrediente activo, en donde el producto probiótico es una bebida o producto alimenticio.

Description

Composición probiótica.
Campo técnico
La presente invención se refiere a un producto probiótico, a un método para dicho producto y además al uso de bacterias del ácido láctico para producir dicho producto.
Técnica anterior
La alergia es una de las enfermedades que se producen más frecuentemente en los países desarrollados. El mecanismo de desarrollo de la alergia se clasifica generalmente en cuatro clases, que es tipo I a tipo IV. La alergia de tipo I asociada a anticuerpos IgE se caracteriza por fiebre del heno, asma, urticaria, choque anafiláctico y similares. La alergia de tipo II asociada a anticuerpos IgG y anticuerpos IgM es una reacción citotóxica que activa sistemas de complemento, y a este tipo pertenecen la eritroblastosis fetal y la anemia hemolítica autoinmune. La alergia de tipo III es una lesión de tejido producida por el complejo antígeno-anticuerpo y es una reacción caracterizada por reacción de Alex, enfermedad del suero, glomerulonefritis y similares. La alergia de tipo IV es una alergia retardada (hipersensibilidad retardada) asociada a células T caracterizada por reacción a tuberculina o dermatitis por contacto. Se dice que el tipo I, II y IV entre las alergias está asociado con el desarrollo de alergia alimentaria. Por otra parte, se sabe que la alergia medioambiental, que es fiebre del heno, dermatitis atópica, asma bronquial, rinitis alérgica crónica, conjuntivitis alérgica y similares, tiene principalmente el mecanismo de desarrollo de tipo I.
La alergia de tipo I mencionada anteriormente se caracteriza por la inducción de IgE específica de alergeno, liberación de mediadores químicos tales como histamina, leucotrieno y similares. La respuesta inmunitaria se produce a partir de la interacción de diversas células, y las células T cooperadoras (Th) son uno de los tipos de células implicadas en esta reacción. Las células T cooperadoras que se clasifican en subgrupos de células T generan diversas citocinas (factores colaboradores) mediante el reconocimiento de antígenos y controlan la inducción de la respuesta inmunitaria. Las células T cooperadoras se clasifican en células Th1 y células Th2 basándose en su capacidad para producir citocinas. Las citocinas de Th2 tales como IL-4, IL-5, IL-13 y similares son necesarias, de manera que el cambio de clase de anticuerpo se produce en células B para generar anticuerpos IgE. En realidad, se sabe las células Th2 están aumentadas en linfocitos de pacientes alérgicos. En otras palabras, los alergenos que han penetrado del mundo exterior se presentan a células T en unas condiciones que una parte se une a las moléculas de clase de II de MHC mediante células presentadoras de antígeno tales como células dendríticas, macrófagos y similares, y entonces las células Th2 se activan y se diferencian. Las citocinas de Th2 liberadas por células Th2 inducen cambio de clase de células B, se generan anticuerpos IgE y los anticuerpos IgE se unen con mastocitos en los tejidos y FcR en la superficie de basófilos en la sangre. Los alergenos son reconocidos por anticuerpos IgE unidos a mastocitos o en la superficie de basófilos en el momento de la siguiente invasión y se forman enlaces cruzados entre anticuerpos IgE. Esta estimulación como un desencadenante, los mastocitos y los basófilos liberan significativamente los mediadores químicos y aparecen diversos síntomas de alergia.
En cuanto a la prevención y al tratamiento de alergia mediante IgE o mediadores químicos, ejemplos incluyen: antihistaminas que inhiben la señalización del nervio periférico mediante unión de un modo antagonista con histamina al receptor de la histamina; fármaco antialérgico para tratar de aliviar síntomas mediante la disminución de la actividad de células productoras de mediadores químicos; esteroides que alivian la inflamación mediante la disminución de la respuesta inmunitaria; terapia de hiposensibilización que induce tolerancia mediante la inyección periódica del propio alergeno. Sin embargo, los efectos secundarios están siendo un problema para todos estos, y ninguno de éstos tiene efectos definitivos.
Recientemente, está obteniendo atención un método para controlar la producción de citocina de Th2 con el fin de suprimir IgE. Se ha notificado que ciertas bacterias, tales como tubercle bacilli, estreptococo hemolítico, las bacterias del ácido láctico y similares, potencian la inmunidad de Th1 y suprimen la inmunidad de Th2 para reducir como resultado IgE (Clinical Immunology, vol. 32, p. 454; International Archives of Allergy and Immunology, vol. 115, p. 278, 1998; solicitud de patente japonesa abierta a consulta por el público nº 9-2959).
Entre éstas, las bacterias del ácido láctico, que son fáciles de aplicar a alimentos desde el punto de vista de la seguridad, son materiales útiles. Sin embargo, en cuanto a las bacterias del ácido láctico, no es apropiado decir que todas las bacterias del ácido láctico tienen un fuerte efecto para potenciar la inmunidad de Th1, y es indispensable seleccionar cepas bacterianas útiles. En cuanto a las bacterias antialérgicas del ácido láctico, la cepa LGG de L. rhamnosus es públicamente conocida y se notifica que mediante la administración a una futura madre se suprime el desarrollo de dermatitis atópica del niño (Lancet, vol. 357, p. 1076, 2001). El uso de las bacterias del ácido láctico como fármacos antialérgicos se desvela en varias gacetas de patentes. Por ejemplo, la solicitud de patente japonesa abierta a consulta por el público nº 9-2959 desvela el uso de las bacterias del ácido láctico como fármaco antialérgico siendo el nivel de producción de IgE 30 ng/ml o menos cuando las bacterias del ácido láctico tales como L. acidophilus, L. brevis, L. buchnerii, L. casei y similares se añaden a linfocitos de ratón en cultivo; la solicitud de patente japonesa abierta a consulta por el público nº 10-309178 desvela el uso de bifidobacterias tales como Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum y similares como fármaco antialérgico para tratar especialmente alergia alimentaria; y la solicitud de patente japonesa abierta a consulta por el público nº 2000-95697, el uso de bacterias del ácido láctico tales como Enterococcus faecalis, Lactobacillus leuteri y similares, como inhibidor de alergia de tipo I tal como asma bronquial alérgico, rinitis alérgica crónica, dermatitis atópica y similares.
Por otra parte, se sabe que la potenciación de la inmunidad de Th1 por las bacterias del ácido láctico y similares se refiere a la activación de la inmunidad celular tal como células de macrófago, T asesinas (células T CD8^{+}), células NK mediante la producción de IL-12, IFN \gamma y se sabe que conduce a la resistencia a infección viral o bacteriana, o al desarrollo de cáncer. Específicamente, la IL-12 producida por macrófago conduce a resistencia contra enemigos extraños, cáncer mediante la diferenciación de las células T colaboradoras que no recibieron tratamiento (Th0) en células de Th1, activación de monocitos, células de macrófago o NK. Por tanto, se sugiere que la cepa de bacterias del ácido láctico que pueda inducir una fuerte producción de IL-12 pueda usarse como inmunoadyuvante (Cancer Immunology Immunotherapy, vol. 49, p. 157, 2000; solicitud de patente japonesa abierta a consulta por el público nº 7-228536, solicitud de patente japonesa abierta a consulta por el público nº 2002-80364).
Además, se dice que las bacterias del ácido láctico deben ser resistentes al jugo digestivo tal como ácido gástrico, ácido biliar, de manera que las bacterias del ácido láctico puedan llegar vivas al tubo digestivo y sean eficaces en diversas formas (Symposium on Intestinal Flora 3, "Intestinal Flora and probiotics", Gakkai Shuppan Center, p. 41-55, editado por Tomotari Mitsuoka 1998). Además, se sabe que las bacterias del ácido láctico sumamente adhesivas al tubo digestivo son completamente eficaces quedando en el tubo digestivo. Por tanto, en el caso de ingerir las bacterias del ácido láctico por vía oral, se prefiere que las bacterias del ácido láctico lleguen vivas al tubo digestivo, además de tener una alta funcionalidad.
Recientemente hay mucha gente a la que le ha cambiado la constitución de su cuerpo, tal como dermatitis atópica o fiebre del heno, y parece que es producida por alergia. Esto se está convirtiendo en un problema social. Entre éstas personas, el tratamiento usando diversos fármacos se proporciona a pacientes que tienen síntomas particularmente graves. Sin embargo, la mayoría de los pacientes no han llegado al punto de recibir tratamiento a escala completa y, como situación actual, están recibiendo terapia sintomática para seguir su vida normal, incluyendo remedios
populares.
En vista de esta situación, recientemente se han realizado activamente muchas investigaciones dirigidas a suprimir la alergia mediante la dieta. Como resultado, se encuentran efectos antialérgicos en ingredientes de diversos alimentos o bebidas tales como aceite de albahaca japonesa, aceite de pescado, polifenol particular del té y similares, y se proporciona tratamiento usando éstos.
Como ingredientes alimentarios y bebidas que tienen efecto antialérgico, en particular efectos similares, se conocen las bacterias del ácido láctico tales como las descritas anteriormente, y algunos yogures o las bebidas de bacterias del ácido láctico que usan las bacterias del ácido láctico se usan prácticamente como alimentos o bebidas que tienen efecto antialérgico. En cuanto a la prevención o el tratamiento usando este tipo de alimentos y bebidas antialérgicos, es posible ingerirlos en condiciones seguras y suaves, pero es necesario ingerir éstos continuamente todos los días, y también es necesario que sean eficaces con la cantidad que es posible ingerir continuamente. Sin embargo, convencionalmente, debido a que no aclaró un método para obtener y seleccionar cepas microbianas con alta actividad antialérgica, no se obtuvo ninguna cepa prometedora, por tanto, no era un procedimiento satisfactorio para uso práctico. Además, en el uso convencional de las bacterias del ácido láctico, el objetivo principal era la fermentación mediante las bacterias del ácido láctico como en yogures o las bebidas de bacterias del ácido láctico y los efectos antialérgicos se trataron como efectos secundarios. Además, en el caso de los yogures y las bebidas de bacterias del ácido láctico, como es indispensable transportarlos a temperaturas de enfriamiento y muchas de éstas no mantienen la calidad durante un largo plazo, se producen problemas de que hay un límite de manipulación, no era satisfactorio como alimentos o bebidas que iban a usarse para la prevención o el tratamiento real de alergia que son posibles ingerir continuamente todos los días, y de gran eficacia. Por tanto, recientemente se solicita mucho el desarrollo de la composición antialérgica de gran eficacia que pueda resolver estos problemas y los alimentos o bebidas o similares que usan ésta.
Inoue Sayo y col., Japan Society for Bioscience, Biotechnology and Agrochemistry Taikai Koen Yoshishu, 5 de marzo de 2003, página 74, se refiere a KW3110 de Lactobacillus paracasei que tiene actividad antialérgica. Lo mismo es válido para Inoue Sayo y col., Japan Society for Bioscience, Biotechnology and Agrochemistry Taikai Koen Yoshishu, 5 de marzo de 2003, página 75, y Nikkei Biotechnology, 3 de marzo de 2003, documento XP002984615.
El objeto de la presente invención es proporcionar un producto probiótico, un método para producir un producto probiótico y el uso de la cepa KW3110 viable de la bacteria del ácido láctico Lactobacillus paracasei o su mutante para una producción tal.
"Con función antialérgica" anteriormente mencionado se refiere a que "sea eficaz para la prevención/tratamiento de alergia y/o mejorar/aliviar síntomas alérgicos".
Los presentes inventores investigaron los ingredientes activos eligiendo como diana la prevención/tratamiento de alergia medioambiental tal como fiebre del heno/dermatitis atópica, asma bronquial, rinitis alérgica crónica y similares, observaron las bacterias del ácido láctico desde el punto de vista de la seguridad, hicieron un estudio muy intenso, seleccionaron las bacterias del ácido láctico que inhibían la activación de Th2 y activaban Th1 en un equilibrio apropiado y encontraron que era posible obtener las bacterias del ácido láctico con alta actividad alérgica.
En otras palabras, un procedimiento de referencia para obtener las bacterias del ácido láctico con alta actividad alérgica se caracteriza por ser un procedimiento que se basa en el equilibrio de Th1/Th2. Los procedimientos convencionales estiman la actividad antialérgica midiendo IgE. No hay duda de que la IgE está asociada a la alergia pero, por otra parte, por ejemplo, como se entiende que hay pacientes atópicos con alta IgE o baja IgE, también es un hecho de que todo no puede explicarse con el nivel de IgE. Se sabe que diversos fenómenos, además de IgE, están completamente asociados al desarrollo de alergia, tales como un aumento de eosinófilos o la liberación de quimiocinas que inducen la invasión de linfocitos en el sitio. Por tanto, se basa en el equilibrio entre Th1/Th2 que explica completamente el aumento de IgE, el aumento de eosinófilos o las quimiocinas, y usando el equilibrio como un índice se desarrolló un método para estimar y separar cepas microbianas antialérgicas. Por tanto, las bacterias del ácido láctico con alta actividad antialérgica se obtuvieron satisfactoriamente.
Una composición antialérgica de referencia tal comprende una composición antialérgica que tiene las bacterias del ácido láctico con un equilibrio particular entre el nivel de producción de interleucina 4 (IL-4), que es un índice de la activación de la inmunidad de Th2, y la interleucina 12 (IL-12), que es un índice de la activación de la inmunidad de Th1, como ingredientes activos, mostrando igual nivel de producción de interleucina 12 en comparación a cuando se usa la cepa KW3110 de L. paracasei como bacteria de ácido láctico que va a probarse, o mostrando el 60% o más de nivel de producción de interleucina 12 en comparación a cuando se usa la cepa KW3110 de L. paracasei, y mostrando menos del 50% de nivel de producción de interleucina 4 de un control en el que no se añaden las bacterias del ácido láctico, en el caso de linfocitos derivados del bazo de ratón sensibilizados con ovoalbúmina se suspenden en un medio que contiene ovoalbúmina y se cultivan añadiendo las bacterias del ácido láctico que van a probarse. Por tanto, las bacterias del ácido láctico con actividad antialérgica pueden englobar: las bacterias del ácido láctico que muestran el 70% o más de nivel de producción de interleucina 12 en comparación con la cepa KW3110; las bacterias del ácido láctico que muestran el 70% o más de nivel de producción de interleucina 12, y menos del 40% de nivel de producción de interleucina 4 como ingredientes activos, además de las bacterias del ácido láctico que muestran actividad antialérgica igual o superior en comparación con KW3925; las bacterias del ácido láctico que muestran actividad antialérgica igual o superior en comparación con KW4110; las bacterias del ácido láctico que muestran actividad antialérgica igual o superior en comparación con KW3926, cuando se comparan con las KW4110, KW3925 y KW3926 de bacterias del ácido láctico con actividad antialérgica que se obtienen como ingredientes activos.
La cepa KW3110 de L. paracasei es el ingrediente activo de la composición antialérgica probiótica de la presente invención, es resistente a jugos digestivos, es una bacteria del ácido láctico sumamente adhesiva al tubo digestivo y muestra particularmente un efecto excelente cuando se administra por vía oral como fármaco antialérgico.
La KW3110 de L. paracasei usada como ingredientes activos de la composición antialérgica probiótica en la presente invención está depositada como FERM BP-08634 en el Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada, Depósito del Organismo de Patentes Internacionales, que es una Autoridad de Depósito Internacional, según el Tratado de Budapest sobre el depósito de microorganismos para el procedimiento de patentes.
En cuanto al uso del producto probiótico de la presente invención como alimentos o bebidas, engloba particularmente bebidas tales como bebidas de té y bebidas con función antialérgica. Las bebidas con función antialérgica de la presente invención pueden tener buen sabor y tener una larga caducidad, y es posible prepararlas como una bebida que es posible ingerir continuamente todos los días y que tiene función antialérgica que puede llegar a ser eficaz con la cantidad que es posible ingerir continuamente. En la presente invención, las bacterias del ácido láctico anteriormente mencionadas pueden usarse esterilizadas mediante un tratamiento tal como esterilización por calor. Por ejemplo, es posible comercializarlo como una bebida envasada en un recipiente cerrado que puede mantener el aroma de la propia bebida, que está estabilizado como un producto de bebida y que puede mantener la función antialérgica mediante la adición de las bacterias del ácido láctico de la presente invención después de esterilizarse mediante calentamiento, y fabricarse como una bebida en un recipiente cerrado esterilizado. Además, cuando se fabrica como una bebida en un recipiente cerrado, mediante el ajuste de la concentración de las bacterias del ácido láctico que van a usarse es posible fabricar una bebida que tiene buen sabor y larga caducidad mediante la potenciación de la función de mantener el aroma de la propia bebida, además de mantener la función antialérgica. En la presente invención, desde el punto de vista de la actividad antialérgica se prefiere el almacenamiento del producto y la estabilización para producir diversos tipos de bebidas no lácteas, es decir, refrescos no lácteos que contengan zumo o bebidas de té.
En cuanto al uso del producto probiótico de la presente invención para alimentos o bebidas, pueden usarse dos o más tipos de bacterias del ácido láctico con alta actividad antialérgica mediante combinación. En ese momento, la combinación o el contenido de las composiciones pueden ajustarse según cada alimento o debida. Además, también puede componerse o combinarse con otras composiciones antialérgicas.
Descripción de la invención
En otras palabras, la presente invención se refiere a:
1. Un producto probiótico que comprende una cepa KW3110 viable de la bacteria del ácido láctico Lactobacillus paracasei o su mutante como ingrediente activo, siendo el producto probiótico una bebida o producto alimenticio;
2. El producto probiótico según el punto 1, siendo el producto probiótico una materia prima láctea fermentada usando la cepa KW3110 de la bacteria del ácido láctico Lactobacillus paracasei o su mutante;
3. El producto probiótico según el punto 1 a 2, siendo el producto probiótico yogur;
4. El producto probiótico según el punto 1 a 3, siendo el número de bacterias del ácido láctico de la cepa KW3110 de Lactobacillus paracasei o su mutante en el producto probiótico 5 X 10^{9} o más células por ingesta diaria;
5. El producto probiótico según el punto 1 a 4, usándose el producto probiótico para prevenir y/o tratar enfermedades alérgicas;
6. Un método para producir productos probióticos, en el que una parte o la totalidad de las bacterias del ácido láctico en la bebida o alimento producido usando las bacterias del ácido láctico o la bebida o alimento que comprende las bacterias del ácido láctico se sustituye por la cepa KW3110 de la bacteria del ácido láctico Lactobacillus paracasei o su mutante;
7. Un método para producir un producto probiótico que comprende las bacterias del ácido láctico, en el que las bacterias del ácido láctico son la cepa KW3110 de Lactobacillus paracasei o su mutante;
8. Un método para producir un producto probiótico que se produce usando bacterias del ácido láctico, en el que las bacterias del ácido láctico usadas son la cepa KW3110 de Lactobacillus paracasei o su mutante;
9. El método para producir un producto probiótico según los puntos 6 a 8, siendo el producto probiótico una bebida o producto alimenticio;
10. El método para producir un producto probiótico según el punto 9, siendo el producto probiótico una materia prima láctea fermentada usando la cepa KW3110 de la bacteria del ácido láctico Lactobacillus paracasei o su mutante;
11. El método para producir un producto probiótico según los puntos 9 a 10, siendo el producto probiótico un yogur;
12. El método para producir un producto probiótico según los puntos 6 a 11, siendo el número de bacterias del ácido láctico de la cepa KW3110 de Lactobacillus paracasei o su mutante en el producto probiótico 5 X 10^{9} o más células por ingesta diaria;
13. El método para producir un producto probiótico según los puntos 6 a 12, usándose el producto probiótico para prevenir y/o tratar enfermedades alérgicas;
14. Uso de la cepa KW3110 de la bacteria del ácido láctico Lactobacillus paracasei o su mutante en la fabricación de un producto probiótico;
15. El uso de la cepa KW3110 de la bacteria del ácido láctico Lactobacillus paracasei o su mutante en la fabricación de un producto probiótico según el punto 14, siendo el producto probiótico una bebida o producto alimenticio;
16. El uso de la cepa KW3110 de la bacteria del ácido láctico Lactobacillus paracasei o su mutante en la fabricación de un producto probiótico según el punto 15, siendo el producto probiótico una materia prima láctea fermentada usando la cepa KW3110 de la bacteria del ácido láctico Lactobacillus paracasei o su mutante;
17. El uso de la cepa KW3110 de la bacteria del ácido láctico Lactobacillus paracasei o su mutante en la fabricación de un producto probiótico según los puntos 15 y 16, siendo el producto probiótico un yogur;
18. El uso de la cepa KW3110 de la bacteria del ácido láctico Lactobacillus paracasei o su mutante en la fabricación de un producto probiótico según los puntos 14 a 17, siendo el número de bacterias del ácido láctico de la cepa KW3110 de Lactobacillus paracasei o su mutante en el producto probiótico 5 X 10^{9} o más células por ingesta diaria;
19. El uso de la cepa KW3110 de la bacteria del ácido láctico Lactobacillus paracasei o su mutante en la fabricación de un producto probiótico según los puntos 14 a 18, usándose el producto probiótico para prevenir y/o tratar enfermedades alérgicas.
Bacterias del ácido láctico como ingredientes activos (ejemplo de referencia)
Las bacterias del ácido láctico con alta actividad antialérgica que son los ingredientes activos son las bacterias del ácido láctico que muestran igual o el 60% o más de nivel de producción de interleucina 12 en comparación a cuando se usa la cepa KW3110 de L. paracasei, y que muestran menos del 50% de nivel de producción de interleucina 4 de un control en el que no se añaden las bacterias del ácido láctico, en el caso de linfocitos derivados del bazo de ratón sensibilizados con ovoalbúmina (denominada en lo sucesivo "OVA") se suspenden en un medio que contiene OVA y se cultivan añadiendo las bacterias del ácido láctico que van a probarse. Los ingredientes activos más preferibles de la presente invención son, entre las bacterias del ácido láctico mencionadas anteriormente, las bacterias del ácido láctico que muestran igual o el 75% o más de nivel de producción de interleucina 12 en comparación a cuando se usa la cepa KW3110 de L. paracasei, en el caso de linfocitos derivados del bazo de ratón sensibilizados con OVA se suspenden en un medio que contiene OVA y se cultivan añadiendo las bacterias del ácido láctico que van a probarse. Los ingredientes activos más preferibles son, entre las bacterias del ácido láctico mencionadas anteriormente, las bacterias del ácido láctico que muestran menos del 40% de nivel de producción de interleucina 4 en comparación a cuando se usa el control en el que no se añaden las bacterias del ácido láctico, en el caso de linfocitos derivados del bazo de ratón sensibilizados con OVA se suspenden en un medio que contiene OVA y se cultivan añadiendo las bacterias del ácido láctico que van a probarse.
En un aspecto de referencia de las bacterias del ácido láctico con alta actividad antialérgica están las bacterias del ácido láctico que muestran igual o el 80% o más de nivel de producción de interleucina 12 en comparación a cuando se usa la cepa KW3110 de L. paracasei como las bacterias del ácido láctico que van a probarse, y que muestran menos del 30% de nivel de producción de interleucina 4 en comparación con el control en el que no se añaden las bacterias del ácido láctico, en el caso de linfocitos derivados del bazo de ratón sensibilizados con OVA se suspenden en un medio que contiene ovoalbúmina (denominada en lo sucesivo "OVA") y se cultivan añadiendo las bacterias del ácido láctico que van a probarse.
Para obtener las bacterias del ácido láctico con alta actividad antialérgica, el método para obtener las bacterias del ácido láctico con alta actividad antialérgica separando las bacterias del ácido láctico que muestran igual nivel de producción de citocinas que inducen Th1 en comparación a cuando se usa la cepa KW3110 de Lactobacillus paracasei como las bacterias del ácido láctico que van a probarse, o que muestran el 60% o más de nivel de producción de citocinas que inducen Th1 en comparación a cuando se usa la cepa KW3110 de L. paracasei cepa, y que muestran menos del 50% de nivel de producción de interleucina 4 de un control en el que no se añaden las bacterias del ácido láctico, en el caso de linfocitos derivados del bazo de ratón sensibilizados con alergeno se suspenden en un medio que contiene alergeno y se cultivan añadiendo las bacterias del ácido láctico que van a probarse. En otras palabras, pueden obtenerse usando una cepa de las bacterias del ácido láctico públicamente conocida o una cepa de las bacterias del ácido láctico recientemente separadas, suspendiendo linfocitos derivados del bazo de ratón sensibilizados con OVA en un medio que contiene OVA y se cultivan añadiendo las bacterias del ácido láctico, y generalmente separando las bacterias del ácido láctico que muestran igual nivel de producción de interleucina 12 en comparación a cuando se usa la cepa KW3110 de L. paracasei como las bacterias del ácido láctico que van a probarse o que muestran el 60% o más de nivel de producción de interleucina 12 en comparación a cuando se usa la cepa KW3110 de L. paracasei, y que muestran menos del 50% de nivel de producción de interleucina 4 de un control en el que no se añaden las bacterias del ácido láctico. Como se describe anteriormente, un experto en la materia puede seleccionar y obtener fácilmente las bacterias del ácido láctico usadas como ingredientes activos a partir de diversas bacterias del ácido láctico públicamente conocidas o recientemente separadas usando el índice de la presente invención como patrón realizando experimentos para estimar la actividad antialérgica in vitro, Los detalles se desvelarán específicamente en el ejemplo 1.
En cuanto a las bacterias del ácido láctico con alta actividad antialérgica usadas como ingredientes activos en la presente invención, la cepa KW3110 de L. paracasei puede obtenerse de Japan Dairy Technical Association como la cepa L14 de L. casei. Mientras tanto, aunque hay un declaración de la Japan Dairy Technical Association de que la cepa L14 es L. casei, cuando los presentes inventores la analizaron usando RFLP (polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción) y AFLP (polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados) usando RiboPrinter (QUALICON), se determinó que la cepa era L. paracasei, por tanto se expone como L. paracasei en la presente invención. La KW3110 de L. paracasei usada como ingredientes activos de la composición antialérgica puede obtenerse de la Japan Dairy Technical Association como se describe anteriormente, y además está depositada como FERM BP-08634 en el Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada, Depósito del Organismo de Patentes Internacionales, que es una Autoridad de Depósito Internacional, según el Tratado de Budapest sobre el depósito de microorganismos para el procedimiento de patentes.
Además, la cepa KW4110 de L. plantarum y la cepa KW3926 de L. paracasei usadas como ingredientes activos de un ejemplo de referencia pueden obtenerse de JCM (Colección de Japón de microorganismos, RIKEN) como la cepa JCM1149 de L. plantarum y la cepa JCM8132 de L. paracasei, respectivamente. La cepa KW3925 de L. paracasei puede obtenerse de NRIC (Universidad de Agricultura de Tokio) como la cepa NRIC1917 de L. paracasei.
Cuando se seleccionan las bacterias del ácido láctico usadas como ingredientes activos, también es posible seleccionar las bacterias del ácido láctico que también muestran funciones de probiótica que son convencionalmente conocidas, tales como la función que regula los intestinos, la función que disminuye el colesterol o la función hipotensora mostrada en muchas bacterias del ácido láctico, además de la función antialérgica. Además, cuando las bacterias del ácido láctico que son ingredientes activos de la presente invención se administran por vía oral, como es más eficaz que las bacterias del ácido láctico permanezcan en el tubo digestivo para ejercer completamente su efecto, pueden obtenerse unas bacterias del ácido láctico más eficaces sometiendo las bacterias del ácido láctico seleccionadas y obtenidas con el patrón mencionado anteriormente a una prueba de adhesión a la cepa de células cepa de células Caco-2 derivada del tubo digestivo humano, in vitro, para seleccionar la cepa que tiene mayor capacidad de adhesión a células. La cepa KW3110 de L. paracasei que es el ingrediente activo de la presente invención es una bacteria del ácido láctico que es resistente al jugo digestivo, sumamente adhesiva al tubo digestivo, que muestra un excelente efecto anteriormente mencionado cuando se administra por vía oral como agente antialérgico.
Las bacterias del ácido láctico que son los ingredientes activos de la presente invención se usan como ingredientes activos del producto probiótico de la presente invención mediante cultivo y proliferación apropiada en un medio para cultivar las bacterias del ácido láctico conocido para un experto tal como medio MRS (de Man, Rogosa, Sharpe) y similares, pulverizándolas mediante liofilización o mediante secado por pulverización con un pulverizador según se necesite como células viables o esterilizándolas. Además, para la gestión del procedimiento, la actividad antialérgica de la cepa de bacterias del ácido láctico obtenida puede medirse según se necesite. En otras palabras, en cuanto a un método para medir la actividad antialérgica, es posible usar el método para medir la actividad antialérgica de las bacterias del ácido láctico en el que se mide el nivel de citocina inductora de Th1 y/o citocina inductora de Th2 generada suspendiendo linfocitos derivados del bazo de animales sensibilizados con alergeno en un medio que contiene el alergeno y se cultiva añadiendo las bacterias del ácido láctico que van a probarse.
En la presente invención es posible mutar las bacterias del ácido láctico con alta actividad antialérgica obtenidas con el procedimiento anterior para preparar una cepa mutante con alta actividad antialérgica y similares y hacer uso de ésta. En cuanto a un medio para aumentar la mutación, puede llevarse a cabo mediante un medio de mutación públicamente conocido tal como UV y similares. Por ejemplo, la cepa KW3110, que son las bacterias del ácido láctico con alta actividad antialérgica, puede mutarse con medios de mutación, y usando un método para estimar la actividad antialérgica de las bacterias del ácido láctico descritas en la presente memoria descriptiva es posible obtener una cepa mutante con una característica preferible en la que aumenta la actividad antialérgica o se mutan otras características y se hace uso de éstas.
Selección de cepas derivadas
En la presente invención es posible seleccionar una cepa con diferentes características producidas a partir de la cepa de bacterias del ácido láctico obtenida en la presente invención como cepa derivada y hacer uso de ésta. El método para seleccionar la cepa microbiana puede explicarse del siguiente modo tomando KW3110 como ejemplo: la cepa KW3110 se cultiva mediante un cultivo estático hasta que alcanza un número prescrito de cepas usando un medio tal como medio MRS a una temperatura prescrita; diluir la disolución de cultivo en un medio MRS reciente; suspender el 10% de la suspensión microbiana en PBS (tableta de Dainippon Pharmaceutical disuelta a una concentración designada) en la que el pH de PBS se ajustó hasta 3,0 con ácido clorhídrico; e incubar a 37ºC durante 3 horas. La suspensión microbiana tratada con ácido se diluye con PBS, se vierte en una placa con medio MRS para formar colonias. Las colonias formadas se seleccionan tomando el tono de color y similares como índice y, además, entre estas colonias seleccionadas se selecciona una cepa basándose en el tono de color y se cultivó en un medio MRS durante 48 horas. La actividad antialérgica del cultivo se mide con el método para medir la actividad antialérgica de la presente invención (procedimiento del ejemplo 2) y se determina la actividad antialérgica de cada colonia. Usando este procedimiento, las cepas microbianas con alta actividad antialérgica se seleccionan y se obtienen de las cepas probadas. En los ejemplos de la presente invención, la cepa separada como cepa derivada de KW3110 se llamó cepa nº 90 y está depositada en el Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada, Depósito del Organismo de Patentes Internacionales, que es una Autoridad de Depósito Internacional, como FERM BP-08635, según el Tratado de Budapest sobre el depósito de microorganismos para el procedimiento de patentes.
Preparación del anticuerpo
Para controlar la calidad de productos probióticos que comprenden las bacterias del ácido láctico con alta actividad antialérgica, o para controlar el procedimiento de fabricación de tales productos de la presente invención, es necesario aislar y detectar las bacterias del ácido láctico con alta actividad antialérgica de la presente invención, y para identificar las bacterias del ácido láctico o para examinar su contenido. Es posible preparar anticuerpos que eligen como diana el aislamiento y la detección de las bacterias del ácido láctico y hacer uso de ellos. Como anticuerpo que se une específicamente a las bacterias del ácido láctico con alta actividad alérgica de la presente invención pueden ejemplificarse concretamente anticuerpos específicos para la inmunidad tales como anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales y similares, y éstos pueden prepararse mediante un procedimiento común usando las bacterias del ácido láctico anteriormente mencionadas como antígeno. Sin embargo, los anticuerpos monoclonales son más preferibles desde el punto de vista de su especificidad. En cuanto al método para producir los anticuerpos monoclonales o anticuerpos policlonales, pueden producirse con un procedimiento ya públicamente conocido. Por ejemplo, en cuanto al método para producir los anticuerpos puede hacerse referencia a Koehler, G.; C. Milstein, Nature: 256, 495-497(1975); Davis, B., R. Dulbecco, H. Eisen, H. Ginsberg; W. Wood, Principles of Microbiology and Immunology vol. 2; Harper & Row, Nueva York, 1973. En otras palabras, el anticuerpo monoclonal puede generarse, por ejemplo, a partir de células de hibridoma obtenidas inmunizando un ratón con las bacterias del ácido láctico de la presente invención y luego fusionando células esplénicas del ratón con células de mieloma del ratón. Para detectar las bacterias del ácido láctico de la presente invención usando anticuerpos que se unen específicamente a las bacterias del ácido láctico de la presente invención, puede realizarse con el procedimiento de detección inmunológica usando anticuerpos públicamente conocidos. En cuanto a los ensayos inmunológicos, pueden ejemplificarse el ensayo RIA, procedimiento de ELISA, procedimiento de anticuerpos fluorescentes y similares.
Actividad antialérgica de las bacterias del ácido láctico como ingredientes activos de la presente invención
Cuando los anticuerpos IgE se generan en respuesta a estimulación antigénica, los anticuerpos IgE se unen a receptores Fc en la superficie de los mastocitos en los tejidos o en la superficie de basófilos en la sangre, entonces los antígenos son reconocidos por anticuerpos IgE unidos en la superficie de los mastocitos o en la superficie de basófilos con la estimulación antigénica secundaria (reinvasión del alergeno) y se forman enlaces cruzados entre los anticuerpos IgE y, cuando los mastocitos o basófilos liberan enormes cantidades de mediadores químicos con esta estimulación como desencadenante, entonces aparecen los diversos síntomas de alergia.
Las bacterias del ácido láctico de la presente invención inducen fuertemente la producción de interleucina 12 (IL-12), que es el índice de inmunidad de Th1, y, al mismo tiempo, suprimen fuertemente la producción de interleucina 4 (IL-4), que es el índice de inmunidad de Th2, en un sistema in vitro usando linfocitos de ratón. Por tanto, las bacterias del ácido láctico de la presente invención tienen efectos para tratar/prevenir la alergia basados en el mecanismo de acción de que la producción de anticuerpo IgE se suprime potenciando la inmunidad de Th1 y suprimiendo la inmunidad de Th2.
Por tanto, la composición antialérgica de la presente invención llega a ser particularmente eficaz para alergia medioambiental tal como fiebre del heno, dermatitis atópica, asma bronquial, rinitis alérgica crónica/asma bronquial y similares. Además, las bacterias del ácido láctico de la presente invención también pueden comprender las funciones de probiótica que son convencionalmente conocidas, tales como la función que regula los intestinos, la función que disminuye el colesterol, la función hipotensora mostrada en muchas bacterias del ácido láctico, además de la función antialérgica mencionada anteriormente. Se confirma que la cepa KW3110, que son las bacterias del ácido láctico que son los ingredientes activos en la presente invención, es excelente no sólo por su fuerte actividad antialérgica y actividad inmunoestimuladora, sino también por su adhesividad a células del tubo digestivo, resistencia a ácido gástrico/ácido biliar, y además, se espera su efecto, también desde el punto de vista de la probiótica mencionada anteriormente.
Administración de una composición de referencia
La composición de referencia anterior puede usarse como agente antialérgico después de la formulación mezclando los ingredientes activos con vehículo, excipiente, aglutinante, diluyente y similares que son fisiológicamente aceptables. Los agentes antialérgicos pueden administrarse por vía oral o parenteralmente. En cuanto a los agentes orales pueden ejemplificarse gránulo, medicamento en polvo, comprimidos (incluyendo comprimido recubierto de azúcar), píldora, cápsula, jarabe, emulsión y agente de suspensión. En cuanto a los agentes no orales pueden ejemplificarse inyección (por ejemplo inyección subcutánea, inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal), infusión, medicamento para uso tópico (por ejemplo, agentes administrados por vía transnasal, agentes percutáneos, pomadas), supositorio (por ejemplo supositorio rectal, agente vaginal). Estas formulaciones pueden formularse según un procedimiento convencional con excipientes, aditivos farmacéuticamente aceptables. Mientras tanto, para la formulación, de manera que la composición antialérgica pueda ejercer apropiadamente su función en el momento adecuado y eficazmente in vivo, es preferible controlar el tiempo de inicio del escape, añadir la función como agentes que enmascaran el amargor o potenciar la estabilidad al oxígeno o la humedad, por ejemplo, como materiales recubiertos recubiertos con agentes de recubrimiento que tienen la pared de células de levadura descrita en la patente nº 3349677 como componentes principales, o en forma de cápsulas obtenidas encapsulando en cápsulas blandas o duras según un procedimiento común con el fin de usarse preferentemente en los campos de la medicina, alimentos naturales y similares. En cuanto a los excipientes o aditivos farmacéuticamente aceptables, pueden ejemplificarse vehículo, aglutinante, aroma, agente de tamponamiento, espesante, colorante, estabilizador, emulsionante, dispersante, agente de suspensión, conservante y similares. En cuanto a vehículos farmacéuticamente aceptables, pueden ejemplificarse carbonato de magnesio, estearato de magnesio, talco, azúcar, lactosa, pectina, dextrina, almidón, gelatina, tragacanto, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, cera de bajo punto de fusión, manteca de cacao y similares.
Estas formulaciones pueden prepararse, por ejemplo, del siguiente modo. En otras palabras, los agentes orales pueden moldearse mediante compresión añadiendo, por ejemplo, excipiente (por ejemplo, lactosa, sacarosa, almidón, manitol), disgregante (por ejemplo, carbonato cálcico, carboximetilcelulosa cálcica), aglutinante (por ejemplo \alpha-almidón, goma arábiga, carboximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, hidroxipropilcelulosa) o lubricante (por ejemplo talco, estearato de magnesio, polietilenglicol 6000), luego recubriendo, según se necesite, mediante un procedimiento públicamente conocido con el fin de enmascarar el sabor y mantener la propiedad entérica y la acción sostenida. En cuanto a agentes de recubrimiento pueden usarse, por ejemplo, etilcelulosa, hidroximetilcelulosa, polioxietilenglicol, acetatoftalato de celulosa, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa y eudragit (Rhom, Alemania; copolímero de metacrilato/acrilato) y similares.
Las inyecciones pueden prepararse disolviendo, suspendiendo o emulsionando los ingredientes activos con un dispersante (por ejemplo Tween 80 (Atlas Powder, EE.UU.), HCO 60 (Nikko Chemicals), polietilenglicol, carboximetilcelulosa, alginato de sodio y similares), conservante (por ejemplo, metilparabeno, propilparabeno, alcohol bencílico, clorobutanol, fenol), agente de isotonización (por ejemplo, cloruro sódico, glicerina, sorbitol, glucosa, azúcar invertido) y similares en un disolvente acuoso (por ejemplo, agua destilada, solución salina fisiológica, disolución de Ringer y similares) o disolvente oleaginoso (aceite vegetal tal como aceite de oliva, aceite de sésamo, aceite de semilla de algodón, aceite de maíz y similares, propilenglicol), y similares. En ese momento, si se desea, pueden añadirse aditivos tales como adyuvante de disgregación (por ejemplo salicilato de sodio, acetato sódico), estabilizador (por ejemplo albúmina de suero humano), agente balsámico (por ejemplo, cloruro de benzalconio, procaína clorhídrica) y similares.
Los agentes para uso tópico pueden prepararse preparando los ingredientes activos en una composición en forma sólida, semisólida o líquida. Por ejemplo, la composición en una forma sólida mencionada anteriormente puede prepararse por sí misma o añadiendo y mezclando excipientes (por ejemplo lactosa, manitol, almidón, celulosa microcristalina, sacarosa), espesantes (por ejemplo, gomas naturales, derivado de celulosa, polímero de ácido acrílico) y similares para prepararla en una forma de polvo. La composición en una forma líquida mencionada anteriormente puede prepararse casi del mismo modo que la inyección. En cuanto a las composiciones en forma semisólida, se prefieren agentes de gel acuoso u oleaginoso o pomadas. Además, todas estas composiciones pueden comprender controladores de pH (por ejemplo, ácido carbónico, ácido fosfórico, ácido cítrico, ácido clorhídrico, hidróxido sódico), conservante (por ejemplo, ésteres de ácido paraoxibenzoico, clorobutanol, cloruro de benzalconio) y similares. Los supositorios pueden formularse preparando los ingredientes activos en una composición acuosa u oleaginosa en forma sólida, semisólida o líquida. En cuanto a la base oleaginosa usada para las composiciones, pueden ejemplificarse glicérido de ácido graso superior (por ejemplo, aceite de cacao, Witepsols (Dynamit Nobel), ácido graso medio (por ejemplo, Migliores (Dynamit Nobel)) o aceites vegetales (por ejemplo, aceite de sésamo, aceite de soja, aceite de semilla de algodón). En cuanto a la base acuosa pueden ejemplificarse polietilenglicoles, propilenglicol. Además, en cuanto a las bases de gel acuoso pueden ejemplificarse gomas naturales, derivado de celulosa, polímero vinílico, polímero de ácido acrílico.
Uso mediante combinación con alimentos o bebidas
El producto probiótico de la presente invención se usa como alimentos o bebidas con función antialérgica mediante combinación con alimentos o bebidas. Para usar el producto probiótico de la presente invención mediante combinación con alimentos o bebidas, se añade la dosis efectiva de los ingredientes activos y el compuesto se fabrica durante la fase de fabricación del material bruto o después de que se haya fabricado el producto y similares. En este documento, el término "dosis efectiva de los ingredientes activos" se refiere al contenido en el que los ingredientes activos se ingieren dentro del siguiente intervalo cuando se ingiere la cantidad generalmente consumida de cada alimento y bebida.
En otras palabras, en cuanto a la dosificación o la ingesta de la dosis efectiva de los ingredientes activos de la presente invención para alimentos o bebidas, puede determinarse dependiendo del receptor, la edad y el peso corporal del receptor, síntomas, tiempo administrado, forma farmacéutica, procedimiento de administración, la combinación de agentes y similares. Por ejemplo, si los ingredientes activos de la presente invención se administran como medicamento por vía oral, pueden administrarse 1-3 veces por día dentro del intervalo de: 0,1-100 mg/kg de peso corporal (preferentemente 1-10 mg/kg de peso corporal) si se administra por vía oral, y 0,01-10 mg/kg de peso corporal (preferentemente 0,1-1 mg/kg de peso de corporal) si se administra parenteralmente. Los agentes que tienen otros mecanismos de acción usados mediante combinación con los ingredientes activos de la presente invención también pueden determinarse apropiadamente usando la dosificación usada clínicamente como patrón.
Si la dosificación o la ingesta de la dosis efectiva de los ingredientes activos de la presente invención para alimentos o bebidas están indicadas por el número de bacterias del ácido láctico, se prefiere que la ingesta sea 5 \times 10^{9} o más por día, más preferentemente 1 x 10^{10} o más por día, lo más preferentemente 5 x 10^{10} o más por día. Por tanto, el número de bacterias del ácido láctico que van a estar contenidas por cada alimento se determina según la cantidad de alimentos o bebidas generalmente ingeridos por día. Por ejemplo, si se ingiere como alimento (yogur), los ingredientes activos de la presente invención pueden combinarse con el alimento de manera que la ingesta esté dentro de 50-500 g por día para un adulto y preferentemente dentro de 60-200 g.
En la presente invención, los ingredientes activos de la presente invención pueden combinarse por sí mismos o en una forma de formulación descrita anteriormente con alimentos o bebidas. Más concretamente, los alimentos o bebidas de la presente invención pueden tomar diversas formas de uso combinando apropiadamente los ingredientes activos de la presente invención con materiales base, y se preparan como alimentos o bebidas por sí mismos, o combinando adicionalmente diversas proteínas, azúcares, grasas, oligoelementos, vitaminas y similares, o se preparan en una forma líquida, semilíquida o sólida, o se añaden adicionalmente a o se combinan con alimentos o bebidas generales, o similares.
En cuanto al campo de los alimentos o bebidas que usan las bacterias del ácido láctico, en líneas generales se clasifica en productos lácteos, carnes, panes, bebidas y hortalizas, basado en ejemplos de su utilización hasta ahora. Usando las bacterias del ácido láctico con alta actividad antialérgica de la presente invención como bacterias del ácido láctico en la fabricación de alimentos o bebidas usando estas bacterias del ácido láctico o como una parte de ella, o como un aditivo para alimentos o bebidas fabricadas, es posible añadir función antialérgica a los alimentos o bebidas.
Además, se prefiere que los alimentos o bebidas probióticos con alta función antialérgica de la presente invención se produzcan en forma de alimentos o bebidas envasados en un recipiente cerrado para evitar la contaminación de otros microorganismos o compuestos extraños para mantener la calidad del contenido.
Los alimentos de la presente invención pueden prepararse como alimento natural, alimento funcional, alimento natural especificado o alimento para pacientes añadiendo la función antialérgica. Además, no está particularmente limitado a la forma del alimento y puede estar en forma de bebida añadiendo la función antialérgica. Como los ingredientes activos de la presente invención tienen actividad antialérgica, es posible proporcionar alimentos que sean posibles ingerir continuamente y que tengan función de prevenir el desarrollo de alergia o tratar alergia combinando los ingredientes activos de la presente invención con alimentos ingeridos diariamente o alimentos naturales o alimentos funcionales y similares ingeridos como complementos. Usando las bacterias del ácido láctico con alta actividad antialérgica de la presente invención mediante combinación con alimentos o bebidas que no contienen componentes que inducen alergia en los alimentos o bebidas, tales como bebidas de té, bebidas o comprimidos naturales, es posible proporcionar alimentos o bebidas probióticos con función antialérgica completamente bloqueada a partir de los problemas alérgicos. Además, en la presente invención es posible preparar una bebida o alimento probiótico con alta función antialérgica reemplazando toda o una parte de las bacterias del ácido láctico de bebidas o alimentos producidos usando las bacterias del ácido láctico o que comprenden las bacterias del ácido láctico por las bacterias del ácido láctico con alta actividad antialérgica de la presente invención.
Uso en forma de formulación de alimentos o bebidas
En la presente invención, en cuanto a alimentos naturales y alimentos funcionales que combinan las bacterias del ácido láctico con alta actividad antialérgica de la presente invención, pueden ejemplificarse diversos productos, y en cuanto a la producción de estos alimentos naturales y alimentos funcionales, además de materiales alimentarios y aditivos alimentarios generalmente usados, pueden usarse en forma de formulación de alimentos o bebidas usando adyuvantes tales como excipientes, sustancia de relleno, aglutinante, disgregante, lubricante, dispersante, conservante, agente humectante, adyuvante disolvente, antiséptico, estabilizador, cápsula y similares. Ejemplos de adyuvantes que son posibles para el compuesto incluyen: lactosa, fructosa, glucosa, almidón, gelatina, carbonato de magnesio, silicato de magnesio sintético, talco, estearato de magnesio, carbonato cálcico, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, o sal de los mismos, goma arábiga, polietilenglicol, jarabe, vaselina, glicerina, etanol, propilenglicol, ácido cítrico, cloruro sódico, sulfito de sodio, fosfato de sodio, pululano, carragenina, dextrina, palatinosa reducida, sorbitol, xilitol, stevia, edulcorante artificial, ácido cítrico, ácido ascórbico, acidulante, bicarbonato sódico, éster de sacarosa, aceite vegetal hidrogenado, cloruro de potasio, aceite de alazor, cera de abeja, lecitina de soja, aroma y similares. En cuanto a la producción de tales alimentos naturales y alimentos funcionales puede hacerse referencia a libros de referencia sobre la formulación de fármacos, por ejemplo "Practical guide of Japanese Pharmacopoeia (General rule on formulation)" (Hirokawa Shoten) y similares.
En la presente invención, en cuanto a la forma particularmente adecuada de alimentos naturales y alimentos funcionales puede ejemplificarse la forma de comprimido, cápsula, gránulo, medicamento en polvo, suspensión, emulsión y, desde el punto de vista del objeto que aspira a resolver la presente invención, se prefiere que los alimentos naturales y los alimentos funcionales que combinan las bacterias del ácido láctico con alta actividad alérgica de la presente invención sean materias primas de combinación que no comprenden materia prima específica de alergia.
Ejemplos de procedimientos para producir alimentos naturales y alimentos funcionales en forma de comprimidos incluyen un procedimiento de producción en el que la mezcla que combina las bacterias del ácido láctico con alta actividad antialérgica de la presente invención se comprime en una cierta forma, o un procedimiento en el que la mezcla que está húmeda con disolvente tal como agua o alcohol se forma en una cierta forma o se vierte en un cierto molde. Ejemplos de procedimientos para producir alimentos naturales y alimentos funcionales en forma de cápsulas incluyen un procedimiento de llenado de cápsulas en el que la formulación que combina las bacterias del ácido láctico con alta actividad antialérgica de la presente invención se llena en cápsulas en forma de líquido, suspensión, pasta, polvo o gránulo, o un procedimiento de producción encapsulando y formando materiales de base de cápsulas, tales como cápsulas duras o cápsulas blandas y similares.
Combinación con alimentos
Además, en la presente invención es posible preparar alimentos con función antialérgica combinando las bacterias del ácido láctico con alta actividad antialérgica de la presente invención con alimentos. Ejemplos de estos alimentos o bebidas incluyen: pasteles tales como flan de caramelo, galleta, galleta salada, patatas fritas, bizcocho, pan, pastel, chocolate, donuts, gelatina y similares; pasteles japoneses tales como galleta de arroz, negro desteñido, daifuku (pastel de arroz relleno de pasta de jamón dulce), pastel de judías, otro bollo de jamón con judías al vapor, pastel esponjoso y similares; panes/tentempiés tales como postre frío (golosinas y similares), chicle y similares; fideos largos tales como fideos largos de trigo, fideos largos de trigo rubión, kishimen (fideos largos planos de trigo) y similares; pasteles de pescado tales como pasta de pescado al vapor, jamón, salchicha de carne de pescado y similares; productos cárnicos tales como jamón, salchicha, hamburguesa, ternera en conserva y similares; condimentos tales como sal, pimienta, pasta de soja (miso), salsa de soja, salsa, aliño, mayonesa, ketchup, edulcorante, condimentos picantes y similares; alimentos asados tales como akashiyaki (bolas de pulpo blando), takoyaki (bolas de pulpo), monjayaki (crep similar a un crep pastoso), okonomiyaki (sabroso crep), fideos largos fritos, fideos largos de trigo fritos y similares; productos lácteos tales como queso, yogur de tipo duro y similares; diversos alimentos preparados tales como sojas fermentadas, tofú prensado, tofú, pasta de ñame, bola de arroz, encurtidos, pescado cocido en salsa de soja, kop-zi, shaomai, croqueta, sándwich, pizza, hamburguesa, ensalada y similares; diversos polvos (productos cárnicos tales como ternera, cerdo, pollo y similares; productos de pesca tales como gamba, vieira, almeja de agua dulce, huiro seco y similares; hortalizas/frutas, plantas, levadura, algas y similares); productos sólidos en polvo de grasa/ingredientes aromatizantes (vainilla, limón, bonito y similares); alimentos o bebidas en polvo (café instantáneo, té en polvo, leche en polvo, sopa en polvo, sopa de miso y similares) y similares, pero no selimita a éstos.
Particularmente, cuando los ingredientes activos de la presente invención se añaden a productos lácteos, es posible producir alimentos o bebidas que contienen fermentadas las bacterias del ácido láctico tales como yogur añadiendo los ingredientes activos de la presente invención a materias primas lácteas como células viables para proliferar/fermentar bacterias.
Combinación con bebidas
En cuanto a la composición con alta actividad antialérgica de la presente invención, particularmente usándola en forma de bebida, es posible proporcionar una bebida con función antialérgica que puede ingerirse continuamente todos los días con función antialérgica que llegue a ser eficaz con la cantidad que es posible ingerir continuamente.
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Si las bacterias del ácido láctico con alta actividad antialérgica de la presente invención se combinan con la bebida, el contenido de bacterias del ácido láctico puede determinarse apropiadamente, pero generalmente la cantidad que va a combinarse se aplica de forma que la actividad antialérgica de las bacterias del ácido láctico pueda ser eficaz en una cantidad continuamente ingerible como bebida. Si la dosificación o ingesta de la dosis efectiva de los ingredientes activos de la presente invención en alimentos o bebidas se expresa mediante el número de bacterias del ácido láctico, se prefiere que la ingesta sea 5 \times 10^{9} o más células por día, más preferentemente 1 \times 10^{10} o más células por día, lo más preferentemente 5 x 10^{10} o más células por día. Por tanto, el número de bacterias del ácido láctico de la cepa que va a estar contenido por cada bebida se determina con el índice mencionado anteriormente según la cantidad de bebidas generalmente ingeridas por día. Por ejemplo, si por día se ingieren 100 g de bebida, es preferible añadir 10^{9} o más bacterias por 100 g de bebida. Por otra parte, si se considera que el aroma o el aspecto de la bebida no se daña añadiendo las bacterias del ácido láctico, se prefieren 10^{11} o menos células. Además, se prefieren 5 x 10^{10} o menos células. Por tanto, en cuanto a la concentración de bacterias del ácido láctico que tienen alta función antialérgica, y que están estabilizadas, que tienen buen sabor y buena capacidad de almacenamiento, lo más preferible es que esté dentro de 10^{9}-10^{11} células por 100 g de bebida. Mientras tanto, en cuanto a la relación entre el número de bacterias del ácido láctico y el peso de bacterias secas, por ejemplo, para la cepa KW3110 de L. paracasei, el número de 10^{12} bacterias por cepa se corresponde con 1 g de peso de cepa seca.
En la presente invención, en cuanto a la bebida que combina las bacterias del ácido láctico con alta actividad antialérgica de la presente invención, pueden ejemplificarse diversas bebidas, y para fabricar éstas puede usarse cualquiera de sacárido, aroma, zumo, aditivos alimentarios y similares usados para la formulación de bebidas generales. En cuanto a la fabricación de bebidas puede hacerse referencia a libros de referencia existentes, por ejemplo "Revised new edition: soft drinks" (Kohrin) y similares.
En la presente invención, particularmente en cuanto a bebidas adecuadas para combinar, se prefieren bebidas que no contienen componentes lácteos, en otras palabras, por ejemplo bebidas no lácteas tales como refrescos que contienen zumo o bebidas de té, particularmente en vista de la actividad antialérgica, almacenamiento/estabilización de los productos.
Ejemplos de bebidas para combinar incluyen: bebida alcohólica (güisqui, bourbon, aguardiente, licor, vino, vino de frutas, vino de arroz (sake), vino chino, aguardiente destilado, cerveza, cerveza sin alcohol con 1% o menos de graduación alcohólica, cerveza con bajo contenido de malta, chuhai (aguardiente destilado carbonatado) y similares), o bebida sin alcohol (bebida tipo yogur, zumo de manzana, naranja, uva, plátano, pera, ciruela, sandía y similares, zumos de hortalizas de tomate, zanahoria, apio, pepino y similares, refresco, leche, lecha de soja, café, cacao, diversos tés de hierbas tales como té rojo, té verde, té de cebada, té de arroz marrón, té de hojas naturales, té verde refinado, té verde tostado, té oolong, té de cúrcuma, té negro, té de rooibos, té de rosa, té de crisantemo, té de menta, té de jazmín y similares, bebida deportiva, agua mineral, bebida energética y similares).
Ejemplificando por categorías de bebida puede ejemplificarse la bebida de té, tal como té verde, té oolong, té rojo, té de cebada, mezcla de distintos tipos de té y café, bebida que contiene zumo, zumo de hortalizas, bebida deportiva, bebida energética.
Además, en cuanto a la forma del producto, es particularmente preferida la forma de bebida en un recipiente cerrado usado generalmente como forma de producto de bebidas, y en cuanto al recipiente cerrado puede usarse cualquier forma de lata, botella, botella de PET, recipiente de papel. Además, no hay limitación particular para el volumen y generalmente puede determinarse considerando la cantidad que un consumidor ingiere diariamente, el número de bacterias del ácido láctico que van a combinarse y el número de bacterias necesarias al día.
La presente invención se explicará a continuación en detalle, pero la presente invención no se limitará a éstos.
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Ejemplo 1 Bacterias del ácido láctico usadas en los ejemplos (de referencia) de la presente invención
Las bacterias del ácido láctico usadas en los ejemplos de la presente invención y el lugar del que se obtuvieron se muestran en la fig. 1 (nº 1) y la fig. 2 (nº 2). En la presente memoria descriptiva, todas las cepas se identifican por números que empiezan con KW. Como estas cepas de prueba incluyen cepas separadas independientemente, cepas usadas en productos lácteos comercialmente disponibles y cepas obtenidas de instituciones públicas o similares, por comodidad se usan nombres de identificación unificados. La relación entre cada cepa KW y el lugar del que se obtuvo se muestra en la fig. 1 (nº 1) y la fig. 2 (nº 2). Mientras tanto, para "lugar del que se obtuvo", "JCM" representa la Colección japonesa de microorganismos, Instituto de investigación física y química, "IFO" representa el antiguo Instituto de la fermentación (ahora cambió al Instituto nacional de tecnología y evaluación, Centro de investigaciones biológicas (NBCR)).
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Ejemplo 2
(Sólo de referencia)
Estimación de la actividad antialérgica del grupo de bacterias del ácido láctico in vitro 1. Muestra
Cada cepa de las bacterias del ácido láctico se cultiva en medio MRS (de Man, Rogosa, Sharpe) (OXOID) durante 48 horas, se lava con agua estéril tres veces, se suspende en agua estéril, se trata durante 30 minutos a 100ºC y se esteriliza. El cultivo se liofiliza y se suspende en PBS. Referencia a la fig. 1 (nº 1) y la fig. 2 (nº 2) para las bacterias del ácido láctico usadas.
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2. Animales experimentales, cría
Se inyectaron intraperitonealmente ratones BALB/c de siete a diez semanas de edad (Charles River) con 1 mg de ovoalbúmina (OVA) en el día 0 y en el día 6 con 2 mg de Alum que es un adyuvante. Los animales se diseccionaron en el día 13 para aislar el bazo y para preparar los linfocitos. Los experimentos se realizaron con n=6.
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3. Medición de células esplénicas IL-4, IL-12
La medición de IL-4 y IL-12 se midió usando el set de ELISA OptEIA (Becton Dickinson).
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4. Condiciones experimentales
Los linfocitos esplénicos preparados con el procedimiento descrito en la sección "2. Animales experimentales, cría" se suspendieron en RPMI 1640 (SIGMA) + 10% de SBF (Rosche) + 1 mg de medio OVA para obtener 2,5 x 10^{6} células/ml. Entonces, las bacterias del ácido láctico que iban a probarse se añadieron a 0,1 ó 1 \mug/ml. Una semana después se aisló el sobrenadante, IL-12 y IL-4 se midieron como citocina de Th1, citocina de Th2, respectivamente.
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5. Resultados
Los niveles de producción de citocina de Th1, IL-12 por cada bacteria del ácido láctico se muestran en la fig. 3 y la tabla 2. La cantidad añadida de bacterias del ácido láctico es 1 \mug/ml. Con la diferencia de la cepa, pudieron observarse diversos niveles de producción. La cepa KW3110 de L. paracasei mostró la capacidad de inducción de Th1 más fuerte entre las aproximadamente 100 cepas. Todos los datos se muestran como relación relativa respecto al nivel de producción de IL-12 por la cepa KW3110 que se tomó como el 100%. Por comodidad, la cepa que muestra el 75% o más de nivel de producción en comparación con el de la cepa KW3110 tiene una valoración A, la cepa que muestra el 50% o más hasta menos del 75% de nivel de producción tiene una valoración B, la cepa que muestra el 25% o más hasta menos del 50% de nivel de producción tiene una valoración C, la cepa que muestra el 10% o más hasta menos del 25% de nivel de producción tiene una valoración D, la cepa que muestra menos del 10% de nivel de producción tiene una valoración E.
Los niveles de producción por cada bacteria del ácido láctico de citocina de Th2 y IL-4 que son la causa de alergia se muestran en la fig. 4 y la tabla 2. La cantidad añadida de bacterias del ácido láctico es 0,1 \mug/ml. Con la diferencia de la cepa, el efecto supresor mostró diversos niveles. La cepa KW3110 de L. paracasei mostró la capacidad de supresión de Th2 más fuerte entre las aproximadamente 100 cepas. Todos los datos se muestran como relación relativa respecto al nivel de producción de IL-4 de control (sin añadir bacterias del ácido láctico) que se toma como el 100%. Por comodidad, la cepa que muestra menos del 30% de nivel de producción en comparación con el control tiene una valoración A, la cepa que muestra el 30% o más hasta el 50% de nivel de producción tiene una valoración B, la cepa que muestra el 50% o más hasta menos del 70% de nivel de producción tiene una valoración C, la cepa que muestra el 70% o más hasta menos del 100% de nivel de producción tiene una valoración D, la cepa que muestra el 100% o más de nivel de producción tiene una valoración E. En la tabla 1 y la tabla 2 se muestran la "Resultados de estimación de bacterias antialérgicas del ácido láctico" en las que la valoración A-E se resume para cada parámetro de Th1, Th2.
TABLA 1
1
TABLA 2
3
4
Cuando las cepas en las que el parámetro de Th1 es el 60% o más de la cepa KW3110 y el parámetro de Th2 es el 50% o menos del de control se determinan como bacterias antialérgicas del ácido láctico, cepas relevantes son las siguientes cinco cepas: cepa KW3110 (de la presente invención), cepa T, cepa NRIC1917, cepas JCM8132 y JCM1149. Además, cuando las cepas que muestran el 75% o más de capacidad de inducción de Th1 de la cepa KW3110 fuerte se determinan como bacterias inmunoestimulantes del ácido láctico, cepas relevantes son las siguientes seis cepas: cepa KW3110, cepa KW4510, cepa JCM1149, cepa T, cepa NRIC1917 y cepa JCM1059. Por tanto, la composición inmunoestimulante (medicamento, alimentos o bebidas), en la que las bacterias del ácido láctico, teniendo las bacterias del ácido láctico igual actividad inmunoestimulante que la cepa KW3110, teniendo las bacterias del ácido láctico igual o más actividad inmunoestimulante que la cepa JCM1059, puede fabricarse con el procedimiento según la presente descripción. Además, la cepa L-92 de L. acidophilis conocida como una bacteria antialérgica del ácido láctico muestra aproximadamente el 11,7% del nivel de producción de IL-12 de la cepa KW3110, y la cepa KW3110 muestra el 26,4% de actividad supresora de IL-4 del control (sin adición), mientras que la cepa L-92 muestra el 74,6% de actividad supresora de IL-4. Por tanto, para ambos parámetros, se sugirió que la cepa L-92 de L. acidophilis era significativamente inferior a una bacteria antialérgica del ácido láctico fuertes tal como la cepa KW3110 (fig. 5). Se midieron la actividad antialérgica de las bacterias del ácido láctico de la presente invención y la cepa de bacterias del ácido láctico como controles y los resultados se muestran en la tabla 3.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 3
5
Ejemplo 3
(Sólo de referencia)
Selección de cepas derivadas
El presente ejemplo es un ejemplo en el que se seleccionan cepas con actividad antialérgica derivadas de la cepa KW3110 de bacterias del ácido láctico. La cepa KW3110 se cultivó mediante un cultivo estático en un medio MRS a 37ºC hasta DO600 variada de 0,8 a 1,0.
La disolución de cultivo se diluyó en un medio MRS reciente para obtener DO600 = 0,5 y luego el 10% de la disolución suspendida de la cepa se suspendió en PBS (tabletas de DAINIPPON SEIYAKU disueltas a una disolución determinada) cuyo pH se ajustó con HCl, se incubó a 37ºC durante 3 horas. La suspensión bacteriana tratada con ácido se diluyó en PBS, se vertió una placa con medio MRS y las colonias se formaron a 37ºC. Se observó una colonia con tono de color pálido entre las colonias formadas. Esta colonia se seleccionó y se cultivó en medio MRS durante 48 horas. Esta cepa se llamó nº 90. La actividad antialérgica de la cepa nº 90 se midió con el procedimiento del ejemplo 2. La cepa nº 90 mostró igual capacidad de producción de IL-12 en comparación con la de la cepa de tipo salvaje (fig. 6). Mientras tanto, en las figuras, "relación de actividad (%)" muestra la capacidad de producción de IL-12 de la cepa derivada (nº 90) cuando la capacidad de producción de IL-12 de la cepa KW3110 se fijó como 100. La cepa nº 90 se depositó en el Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada, Depósito del Organismo de Patentes Internacionales, como FERM BP-08635.
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Ejemplo 4
(Sólo de referencia)
Estimación in vivo de la cepa KW3110 de alta actividad antialérgica in vitro 1. Muestra administrada
La cepa KW3110 de L. paracasei se cultivó en medio MRS durante 48 horas, se lavó con agua estéril tres veces, se suspendió en agua estéril y se trató a 100ºC durante 30 minutos para esterilizarse. La mezcla se liofilizó para preparar alimentos mezclados mezclándola con un alimento en polvo patrón AIN93 (composición patrón según el Centro americano de investigación sobre nutrición) de manera que un ratón ingiera 1 mg por día.
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2. Animales experimentales, cría
Se usaron ratones BALB/c de ocho semanas de edad. El grupo de seis ratones BALB/c se crió y se acondicionó durante una semana con ingesta libre de CE-2 (JAPAN CLEA) y agua. Después de la sensibilización del antígeno en el día 0, los grupos de control se criaron con alimento en polvo AIN93 preparado usando materiales refinados y los grupos KW3110 se criaron con alimentos en los que la cepa KW3110 se mezcló con AIN93.
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3. Medición de IgE en sangre, IL-4, IL-12 en células esplénicas
Se midieron IgE, IL-4 y IL-12 usando el set de ELISA OptEIA (Becton Dickinson).
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4. Condiciones experimentales
Como grupo experimental se fijó el grupo de control (AIN93) y los grupos en los que se añadió la cepa KW3110 a AIN93 a 1 mg/ratón/día (grupo KW3110). Todos los días se administraron 4 g de alimento en polvo empastado con agua a tanto el grupo de control como el grupo KW3110 hasta el fin del experimento (día 98). Tenían agua a su libre disposición. La sensibilización alérgica con ovoalbúmina (OVA) se realizó inyectando intraperitonealmente durante un total de cinco veces 100 \mug de OVA y 2 mg de Alum que es un adyuvante en el día 0, 14, 42, 70 y 94. Durante este periodo, la sangre se extrajo cada semana de la vena del fondo de ojo. Al final de la experimentación se extrajo la sangre completa y el bazo se extrajo para preparar los linfocitos (fig. 7). Los linfocitos esplénicos se cultivaron en RPMI1640 (SIGMA) + 10% de SBF (Rosche) + 100 \mug de medio OVA a 37ºC bajo condiciones de 5% de CO_{2} durante una semana, y se recogió el sobrenadante de cultivo. Se midieron el nivel IgE para la muestra de sangre, y IL-4 y IL-12 para la muestra sobrenadante de cultivo de linfocitos esplénicos, respectivamente.
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5. Resultados
La variación de IgE en sangre durante los 98 días del periodo experimental se muestra en la fig. 8. En cuanto a la IgE en sangre en el día 48, el grupo KW3110 mostró un nivel de IgE significativamente inferior en comparación con el grupo de control, a p < 0,05. Los niveles de IgE en sangre en el día 48 y en el día 98 en el momento de la disección se muestran en la fig. 9 mediante transferencia de puntos. En el día 98, la IgE en sangre para el grupo KW3110 también mostró un nivel de IgE significativamente inferior en comparación con el grupo de control. El nivel de producción de IL-12 en el cultivo de células esplénicas en el día 98 de la disección se muestra en la fig. 10, y el nivel de producción de IL-4 en la fig. 11, para tanto el grupo de control como el grupo KW3110. El grupo KW3110 mostró una producción de IL-12 significativamente alta en comparación con el grupo de control. En cuanto a IL-4, aunque no hubo diferencias significativas, el grupo KW3110 mostró menor tendencia hacia el grupo de control. Los resultados mencionados anteriormente sugieren que, ingiriendo la cepa KW3110, el equilibrio inmune en el cuerpo se desplaza hacia Th1 y que mejora el estado alérgico. Además, como se muestra en la fig. 12, en el día 30 se observó pérdida de pelo alrededor del hocico para el grupo de control sin excepción, mientras que no se observó pérdida de pelo para el grupo KW3110 sin excepción. En ese momento se observó frecuentemente un comportamiento de rascado del hocico para el grupo de control. Para el grupo KW3110, la pérdida de pelo alrededor del hocico o el comportamiento de rascado se observó similar al grupo de control aproximadamente en el día 60. Los resultados de la observación del comportamiento de rascado del hocico sugieren que los grupos KW3110 están realmente suprimiendo síntomas alérgicos.
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Ejemplo 5
(Sólo de referencia)
Comparación con la cepa KW4610 de bacterias antialérgicas del ácido láctico (cepa LGG de L. rhamnosus), públicamente conocida 1. Muestra administrada
La cepa KW3110, la cepa KW4610 se cultivaron en medio MRS durante 48 horas, se lavaron tres veces con agua estéril, se suspendieron en agua estéril, se trataron a 100ºC durante 30 minutos y se esterilizaron. La mezcla se liofilizó y se preparó el alimento mezclado empastando la mezcla con alimento mezclado patrón AIN93 (composición patrón según el Centro americano de investigación sobre nutrición) de manera que un ratón ingiera 1 ó 10 mg por día.
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2. Animales experimentales, cría
Se usaron ratones BALB/c de ocho semanas de edad. El grupo de seis ratones BALB/c se crió y se acondicionó durante una semana con ingesta libre de CE-2 (JAPAN CLEA) y agua. 21 días antes de la sensibilización del antígeno, a los ratones de la cepa KW3110 y la cepa KW4610 se les dio alimento mezclado o alimento en polvo AIN93.
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3. Medición de IgE en sangre
La IgE se midió usando el set de ELISA OptEIA (Becton Dickinson).
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4. Condiciones experimentales
Como grupo experimental se fijó el grupo de control (AIN93) y los grupos en los que la cepa KW3110 o la cepa KW4610 se añadió a AIN93 a 1 ó 10 mg/ratón/día (el grupo KW3110 o el grupo KW4610). Cada día se administraron 4 g de alimento en polvo empastado con agua a los grupos de control, el grupo KW3110 y el grupo KW4610 hasta el fin del experimento (día 133). Tenían agua a su libre disposición. La sensibilización alérgica con ovoalbúmina (OVA) se realizó inyectando intraperitonealmente durante un total de seis veces 100 \mug de OVA y 2 mg de Alum que es un adyuvante en el día 0, 14, 42, 70, 98 y 126. Durante este periodo, la sangre se extrajo cada semana de la vena del fondo de ojo (fig. 13). El nivel de IgE se midió de la muestra de sangre.
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5. Resultados
La variación del nivel de IgE en sangre durante el periodo experimental se muestra en la fig. 14, y el nivel de IgE en sangre por ratón individual después de la 5ª y la 6ª inyección de OVA se muestra en la fig. 15 mediante puntos. Con la sensibilización del antígeno por OVA se observó que el nivel de IgE en sangre aumentaba en todos los grupos. Sin embargo, se observó una disminución significativa del nivel de IgE en sangre para el grupo KW3110 en comparación con el control después de la 5ª administración de OVA. Por otra parte, para el grupo KW4610, no se observó disminución significativa del nivel de IgE en sangre en comparación con el control y se sugirió que la actividad antialérgica de la cepa KW3110 era más fuerte. Además, se sugirió que había un efecto de disminución de IgE más fuerte en el grupo de ingestión de 10 mg que en el grupo de ingestión de 1 mg.
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Ejemplo 6 Resistencia a ácido y a ácido biliar de bacterias del ácido láctico
Se dice que las bacterias del ácido láctico necesitan ser resistentes al jugo digestivo tal como el ácido gástrico y el ácido biliar de manera que las bacterias del ácido láctico puedan llegar vivas al tubo digestivo y mostrar efectos probióticos. Se midieron la resistencia a ácido y la resistencia a ácido biliar in vitro para investigar si la cepa KW3110 es una cepa que cumple estas condiciones.
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1. Procedimientos
La resistencia a ácido se midió del siguiente modo: las bacterias del ácido láctico se cultivaron hasta la anafase de crecimiento logarítmico y una cantidad de 1/10 de las bacterias que estaban ajustadas en PBS (pH 6,5) para tener DO600 = 0,5 se añadió a medio MRS ajustado con ácido clorhídrico para tener pH 3,0, y se incubaron a 37ºC. 1 hora, 2 horas, 3 horas después del inicio de la incubación se realizó el muestreo y se midió la relación de células viables en medio MRS agar.
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2. Resultados
La resistencia a ácido biliar se midió del siguiente modo: el ácido biliar (sales biliares OXOID) se añadió al medio líquido MRS a la concentración final del 2%, a la que se inoculó la disolución de precultivo de la cepa KW3110 al 1%, se midió DO630 usando BIOPLOTTER (Oriental Instruments) y se midió la tasa de crecimiento.
Para todos los experimentos se usó la cepa KW3317 que es la cepa tipo de L. delbruckii (cepa JCM1012) como control. Como resultado se sugirió que aproximadamente el 50% de la cepa KW3110 estuvo viva durante tres horas en la prueba de resistencia a ácidos (fig. 16). Además, en la prueba de resistencia a ácido biliar, la cepa KW3110 también mostró suficiente crecimiento en un medio que contenía el 2% de ácido biliar, y se mostró que era resistente a ácido biliar (fig. 17). Por otra parte, se sugirió que la cepa KW3117 tenía baja resistencia tanto a ácido como a ácido biliar.
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Ejemplo 7 Adhesividad de las bacterias del ácido láctico al tubo digestivo
Es necesario que las bacterias del ácido láctico que han llegado vivas al tubo digestivo permanezcan en el tubo digestivo para mostrar efectos probióticos. La prueba de adhesividad a células Caco-2 del tubo digestivo humano in vitro se usa frecuentemente como un índice de las bacterias del ácido láctico que permanecen en el tubo digestivo y que ejercen completamente sus efectos probióticos. Por tanto, se midió la capacidad de adhesividad a las células Caco-2 de la cepa KW3110.
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1. Procedimientos
Las células Caco-2 se cultivaron según el procedimiento de Coconnier y col. (Applied and Environmental Microbiology, vol. 58, p. 2034, 1992). Se cultivaron 1,2 x 10^{4} células/cm^{2} de células Caco-2 en un vidrio portaobjetos durante aproximadamente una a dos semanas hasta que fueron postconfluentes. La cepa KW3110 usada se cultivó en medio MRS durante 37ºC durante dos noches y se recogió, se lavó una vez con PBS, se ajustó a DO600 = 1,0 con PBS. El vidrio portaobjetos sobre el que se cultivaron las células Caco-2 se sumergió en 2 ml de disolución de KW3110, que se preparó poniéndola en contacto a 37ºC durante 1 hora bajo la presencia de 10% de dióxido de carbono, y luego el vidrio portaobjetos se lavó tres veces en medio DMEM (medio Eagle modificado por Dulbecco). A continuación, después de fijarse el vidrio portaobjetos con metanol, la cepa KW3110 se tiñó con tinción Gram (Medical Technology, vol. 23, p. 205, 1995). La cepa se examinó con un microscopio, se contó el número de bacterias del ácido láctico adherentes a células Caco-2 y se calculó el valor por cuatro campos visuales como número de adherentes. Además, se realizaron investigaciones similares para 15 cepas de L. paracasei, L. casei incluyendo la cepa KW3913 (cepa JCM8130) y la cepa KW3115 (cepa JCM1134), que es la cepa tipo.
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2. Resultados
Los resultados del examen de la capacidad adhesiva a células Caco-2 de cada bacteria del ácido láctico se muestran en la tabla 4. Ouwehand y col. han notificado que la capacidad adhesiva a células Caco-2 de L. paracasei, L. casei era baja (Food microbiology and safety, vol. 66, p. 856, 2001). Similarmente, en el presente experimento, cepas distintas de la cepa KW3110 mostraron baja capacidad adhesiva. Sin embargo, la cepa KW3110 mostró una capacidad adhesiva significativa alta a células Caco-2 entre las cepas de L. paracasei y L. casei, y se sugirió que era una cepa de la que puede esperarse un excelente efecto probiótico.
TABLA 4
6
7 
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Ejemplo 8
(Sólo de referencia)
Efecto de mejoría de la cepa KW3110 para la fiebre del heno/inflamación de las vías respiratorias usando antígeno del polen 1. Procedimientos Tipo de animal
Se compraron ratones hembra BDF1 de cuatro semanas de edad (Charles River).
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Grupo experimental
Experimento A: sensibilización del antígeno mediante goteo nasal (modelo con fiebre del heno)
Grupo de control: grupo al que se le administra alimento patrón (base de AIN-76)
Grupo KW: grupo al que se le administra 1 mg de KW/ratón (1 mg de KW3110/3 g de base de AIN-76)
Experimento B: sensibilización del antígeno usando un nebulizador (modelo con inflamación de las vías respiratorias)
Grupo de control: grupo al que se le administra alimento patrón (base de AIN-76)
Grupo KW: grupo al que se le administra 1 mg de KW/ratón (1 mg de KW3110/3 g de base de AIN-76)
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Reactivo/instrumentos
Extracto de polen de cedro CP (LSL)
ALUM (Sigma)
Nebulizador ultrasónico XE-U12 (OMRON)
Citocentrífuga: Cytospin4 (ThermoBioAnalysis)
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Procedimientos de estimación
Experimento A
Los ratones BDF-1 se acondicionaron durante una semana después de comprarse y se clasificaron en grupos basados en la concentración de IgE total en sangre basada en el plasma en sangre obtenido mediante extracción de sangre de la órbita (n=7). Después de la clasificación en grupos empezó a administrarse el alimento experimental. Además, después de tres semanas desde la clasificación se inyectó intraperitonealmente disolución de CP+ALUM (CP 10 \mug + ALUM 2 mg/ratón) una vez a la semana durante tres semanas. Dos semanas después de la tercera inyección de disolución de CP+ALUM que se administraba, a cada uno de los dos orificios nasales del ratón se le administró mediante goteo nasal 10 \mul de disolución de CP (1 mg/ml). Además, como modelo no estimulado (elemental) se fijaron ratones a los que se les administró solución salina para el goteo nasal. El goteo nasal se realizó durante cinco días, se contó el número de veces de estornudos durante cinco minutos después del goteo nasal (día 1, 3, 5) y el número de veces de rascado del hocico (día 3, 5).
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Experimento B
Los ratones BDF-1 se acondicionaron durante una semana después de comprarse y se clasificaron en grupos basados en la concentración de IgE total en sangre basada en el plasma en sangre obtenido mediante extracción de sangre de la órbita (n=7). Después de la clasificación en grupos empezó a administrarse el alimento experimental. Además, después de tres semanas desde la clasificación se inyectó intraperitonealmente disolución de CP+ALUM (CP 10 \mug + ALUM 2 mg/ratón) una vez a la semana durante tres semanas. Dos semanas después de la tercera inyección de disolución de CP+ALUM, se nebulizó disolución de CP (40 \mug/ml) a los ratones con un nebulizador durante 15 minutos en un recipiente cerrado. Además, como modelo no estimulado (elemental) se fijaron ratones a los que se les había nebulizado con solución salina para el goteo nasal. La nebulización se realizó durante cinco días. Además, se extrajo sangre de la órbita en el momento de la inyección intraperitoneal de CP (día 0), al inicio del nebulizador (día 35), en el momento de la disección (día 40) para medir la concentración de IgE total en sangre. En el día 5 se aisló líquido de lavado broncoalveolar (BALF) con anestesia, se contó el número de células en BALF, se identificaron las células en BALF y se midió la citocina en BALF. El BALF se aisló inyectando 2,1 ml (0,7 ml x tres veces) de solución salina con 0,1% de BSA en las vías respiratorias de ratones canulados. Después de la centrifugación se aislaron el sobrenadante y las células y se contó el número de células. Además, se preparó una muestra de extensión y las células se identificaron mediante tinción de Light Giemsa.
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2. Resultados
Experimento A
El número de veces de estornudos durante cinco minutos después del goteo nasal se estimó por los recuentos de estornudos en los periodos de 0-1 min y 1-5 min después del goteo nasal y por los recuentos de estornudos totales durante todo el periodo a considerar la influencia de la estimulación física. Como resultado, no se observó casi ningún estornudo con el goteo nasal de solución salina. Sin embargo, para el grupo de control, la frecuencia de estornudos aumentó a medida que se repitió el goteo nasal de antígeno. Por otra parte, para el grupo KW, se observó que los estornudos tenían tendencia a suprimirse (fig. 18 a, b, c).
Además, en cuanto al comportamiento de rascado del hocico, el comportamiento de rascado continuo durante cinco minutos después del goteo nasal se contó como 1 punto (número total de puntos). Además, en el caso de dividir entre rascado leve (1-4 veces de comportamiento de rascado continuo) y rascado grave (5 veces o más de rascado continuo), se estimó por el número de puntos. En comparación con el grupo de control, el comportamiento de rascado para el grupo KW se suprimió, y se observó una supresión significativa del número de puntos para los comportamientos de rascado leve en el día 5 (fig. 19 a, b).
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Experimento B
Antes de nebulizar y en el momento de la disección, el aumento de la concentración de IgE total en sangre para el grupo KW se suprimió significativamente en comparación con el grupo de control (fig. 20). Generalmente, los tipos de células en BALF son la mayoría de los casos monocitos, principalmente macrófagos. Sin embargo, mediante la realización de la estimulación del antígeno, los eosinófilos cubren aproximadamente el 65% en BALF para el grupo de control, y disminuye la relación de monocitos. Por otra parte, pareció suprimirse el aumento de la relación de eosinófilos en comparación con el grupo de control (fig. 21 a). Además, en cuanto al número de eosinófilos, se observó una tendencia similar de que el grupo KW estaba suprimiendo la invasión tópica de eosinófilos (fig. 21 b).
Además, midiendo las citocinas en el sobrenadante de BALF, el grupo KW mostró un bajo nivel de IL-5 que es la citocina de Th2 que tiene una función de proliferación/diferenciación de eosinófilos, en comparación con el grupo de control (fig. 22).
A partir de los resultados mencionados anteriormente se sugirió que existe la posibilidad de que ingiriendo KW3110 se supriman el comportamiento de estornudos y el comportamiento de rascado producidos por el antígeno del polen de cedro, que son próximos a los síntomas clínicos de fiebre del heno entre las alergias inmediatas. Además, también se encontró que KW3110 suprime la producción de IL-5 en la región pulmonar contra la inflamación de las vías respiratorias producida por la exposición a antígeno, y además suprime la invasión de eosinófilos suprimiendo el aumento de IgE. La relación entre IL-5 y la inflamación de las vías respiratorias/eosinófilos se describe en J. Allergy Clin. Immunol 88(6) 935-942, 1991, que sugiere que la administración de KW3110 es eficaz para asma alérgico, cuyos síntomas principales son la inflamación de las vías respiratorias.
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Ejemplo 9
Sólo de referencia
Efectos de mejoría de la cepa KW3110 para el modelo de ratón que tiene dermatitis atópica
Para investigar los efectos de mejoría de KW3110 se usó el modelo de dermatitis atópica aplicando cloruro de picrilo. (Referencia: OHYO YAKURI (pharmacometrics) 59(6), 123-134, 2000).
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1. Procedimientos Tipo de animal
Se compraron ratones macho NC/NgaTndCyj de cinco semanas de edad (Charles River).
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Grupo experimental
Grupo de control: grupo al que se administró alimento patrón (base de AIN-76) durante 11 semanas.
Grupo KW 1 mg-11 sem: grupo al que se administró 1 mg de KW3110/3 g de base de AIN-76 durante 11 semanas.
Grupo KW 10 mg-11 sem: grupo al que se administró 10 mg de KW3110/3 g de base de AIN-76 durante 11 semanas.
Grupo KW 1 mg-8 sem: grupo al que se administró alimento patrón durante 3 semanas, y luego 1 mg de KW3110/3 g de base de AIN-76 durante 8 semanas.
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Reactivo
Cloruro de picrilo: PCl (TOKYO KASEI KOGYO)
Disolución para la sensibilización: 5% de disolución de PCl (etanol:acetona = 4:1)
Parte ventral: 100 \mul, extremidad posterior: 25 \mul en ambas extremidades, disolución de exposición: 0,8% de disolución de PCl (aceite de oliva)
Parte del pabellón auricular: 10 \mul en cada una por ambos lados, las dos orejas (total 40 \mul), parte dorsal: 50 \mul
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Procedimiento de estimación
Se compraron ratones NC/Nga y se acondicionaron durante una semana y se clasificaron basándose en la concentración de IgE total en sangre según el suero obtenido extrayendo sangre de la órbita (n=10). Tres semanas después de iniciar la administración del alimento experimental con la clasificación, la disolución de sensibilización de PCl se aplicó a la parte ventral a la que se le había rasurado el pelo, y a ambos lados de las extremidades posteriores; entonces, como exposición, una semana después se aplicó la disolución de exposición a ambas partes del pabellón auricular y a ambos lados, y a las partes dorsales a las que se les había rasurado el pelo. Esta exposición se realizó cada dos semanas durante 77 veces en total. Además, para confirmar que no se producía engrosamiento del pabellón auricular producido por el disolvente de disolución para la exposición, el engrosamiento del pabellón auricular se midió a 0, 1, 4, 24, 72, 96, 120, 144, 168 horas después de la aplicación de aceite de oliva con un calibrador de espesores de cuadrante. Además, después de la primera y la tercera exposición, el engrosamiento del pabellón auricular se midió similarmente a 0, 1, 4, 24, 72, 96, 120, 144, 168 h con un calibrador de espesores de cuadrante para estimar edema. Además, después de la sensibilización, la sangre se extrajo de la órbita cada semana y la puntuación clínica se estimó dos veces a la semana después de la sensibilización. Una semana después de la 7ª exposición y la final, los ratones se sacrificaron y se extrajeron el suero y los tejidos del pabellón auricular. Para el suero se midió la concentración de IgE total y para
los tejidos del pabellón auricular se realizaron tinción con hematoxilina-eosina y tinción con azul de toluidina.
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Puntuación clínica
Cinco puntos, es decir, prúrito esencial, enrojecimiento/hemorragia/erosión, edema, lesión/defecto de tejidos, formación de costra/desecación de la parte del pabellón auricular; tres puntos, es decir, pérdida de pelo, reacción eritematosa/hemorragia/erosión, formación de costra/desecación de la cabeza, es decir, esto son ocho puntos en total, se puntuaron como sin síntomas (0 puntos), leves (1 punto), moderados (2 puntos), graves (3 puntos), y el total se estimó como puntuación.
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Estadística
Para la estadística se realizaron el análisis de dispersión y la prueba de comparación múltiple de Dunnett para el grupo de control, y cada punto se consideró significativamente diferente cuando el índice de riesgo era el 5% o
inferior.
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2. Resultados
La concentración de IgE total en sangre para el grupo de control aumenta significativamente a partir de aproximadamente cuatro semanas después de la exposición a PCl. Sin embargo, para todos los grupos que han ingerido KW3110, el aumento se suprimió, se suprimió significativamente a partir de la 4ª exposición para el grupo KW 10 mg-11 sem y el grupo KW 1 mg-8 sem y a partir de la 6ª exposición para el grupo KW 1 mg-11 sem (fig. 23).
Para la puntuación clínica se observó el deterioro de enfermedades para la parte del pabellón auricular y el cuero cabelludo para el grupo de control desde una fase temprana, en otras palabras, se confirmó el aumento de la puntuación. Por otra parte, el aumento se suprimió en todos grupos que habían ingerido la cepa KW3110. El aumento se suprimió significativamente después de la segunda exposición para el grupo KW 1 mg-11 sem y el grupo KW 10 mg-11 sem, y justamente a partir de la tercera exposición para el grupo KW 1 mg-8 sem. En cuanto a la puntuación clínica para sólo la parte del pabellón auricular, o sólo la parte del cuero cabelludo, similarmente se observó una diferencia significativa para todos los grupos que habían ingerido KW3110 (fig. 24, 25, 26). Además, también puede confirmarse a partir de la foto del cuero cabelludo de que la erosión/lesión de tejidos de la parte del pabellón auricular se suprime para los grupos que habían ingerido KW (fig. 27).
Para el engrosamiento del pabellón auricular producido por la exposición a PCl no se observó engrosamiento del pabellón auricular mediante la aplicación de disolvente realizada durante la fase de sensibilización, pero sí se observaron engrosamiento/enrojecimiento/edema del pabellón auricular realizando la exposición con PCl. Después de la primera exposición, para el grupo de control, la primera fase de engrosamiento, que se dice que está asociada a la reacción inmediata, se observó 1 y 4 horas después de la exposición; la segunda fase de engrosamiento, que se dice que está asociada a la reacción retardada, se observó 48 horas después de la exposición, y además la tercera fase de engrosamiento de la parte del pabellón auricular, que se dice que está asociada a la reacción inmediata, se observó 120-144 horas después de la exposición.
Por otra parte, para los tres grupos que habían ingerido KW3110 se observó una supresión significativa del engrosamiento 1, 4 horas después de la exposición que se dice que está asociada a reacción inmediata. Además, se observó una supresión significativa del engrosamiento 144 horas después de la exposición para el grupo KW 10 mg-11 sem, y 24 y 144 horas después de la exposición para el grupo KW 1 mg-8 sem. Después de la tercera exposición, el engrosamiento se observó continuamente después de la aplicación para el grupo de control, pero para el grupo que ingirió KW3110 se observó una tendencia de supresión del engrosamiento en su totalidad, y se confirmó una supresión significativa para el grupo KW 1 mg-11 sem y el grupo KW 10 mg-11 sem (fig. 28, 29).
Como resultado de la estimación patológica de la parte del pabellón auricular, para el grupo de control, la dermis y la epidermis se engrosaron y se observó inflamación tal como edema. Sin embargo, para todos los grupos que habían ingerido KW se observó que el engrosamiento se suprimió en comparación en su totalidad con el grupo de control (fig. 30). Además, de la estimación patológica mediante tinción con azul de toluidina se confirmó que el número de mastocitos de grupos que habían ingerido KW era inferior al del grupo de control (fig. 31).
De los resultados anteriores, mediante la ingestión de KW se confirmaron la supresión del aumento de la concentración de IgE total en sangre, la supresión del engrosamiento del pabellón auricular producido por la estimulación de haptenos y la supresión del deterioro de enfermedades a nivel clínico. Por tanto, se mostró que mediante la ingestión de KW3110 mejoraron los síntomas de dermatitis atópica inducida por haptenos en ratones NC/Nga.
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Ejemplo 10
(Sólo de referencia)
Efectos de la cepa KW3110 en seres humanos para fiebre del heno
Para investigar los efectos de la cepa KW3110 en seres humanos, la siguiente prueba se llevó a cabo en voluntarios que tenían fiebre del heno.
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1. Procedimientos Materiales
Prototipo de yogur preparado con la cepa B de Lactobacillus delbrueckii que se estimó como nivel E para ambos parámetros de Th1, Th2 en el ejemplo 2 o la cepa KW3110 de L. paracasei. Contiene 2 \times 10^{8} ufc/ml en cuanto al número de bacterias.
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Objetivo del examen
28 voluntarios que eran pacientes con fiebre del heno que trabajaban para una empresa. El presente examen se llevó a cabo después de obtener consentimiento informado por escrito, después de explicar en detalle a todos los sujetos de prueba el contenido y los procedimientos de la prueba según la declaración de Helsinki.
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Grupo de prueba
Los 28 sujetos de prueba se dividieron aleatoriamente en dos grupos. Un grupo ingirió yogur de la cepa B de L. delbrueckii, que es el yogur de control, y el otro grupo ingirió yogur de la cepa KW3110 de L. paracasei, 200 ml por día (correspondiente a 40 mg de cepa seca de cepa KW3110). Como resultado de la clasificación se realizó una prueba de doble ciego controlando una tercera persona la información hasta el final de la prueba.
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Periodo de prueba
Del 20 de enero de 2003 hasta el 14 de abril de 2003.
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Puntos de medición
Se extrajo sangre de los sujetos de prueba en la semana 0 (en el momento de inicio de la prueba) y en la 4ª, 8ª, 12ª semana (en el fin de la prueba). Se midieron los siguientes puntos de la sangre en Falco Biosystem Ltd.: actividad de células NK, relación entre los números de células Th1 y Th2 (relación Th1/Th2), número de eosinófilos, nivel de ECP, nivel de IgE total en sangre y nivel de IgE específica de polen de cedro en sangre.
Los datos se organizaron después del procesamiento estadístico para estos datos después de finalizar la prueba.
Además, los sujetos de prueba respondieron a un cuestionario como se muestra en la tabla en el momento de la extracción de sangre en 5 niveles (3+: alto nivel, 2+: moderado, +: leve; \pm: ligeramente; -: ninguno). 4 puntos para 3+, 3 puntos para 2+, 2 puntos para +, 1 punto para \pm, 0 puntos para -, y se calcularon para el trabajo estadístico.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 5
8
9 
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TABLA 6
10 
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2. Resultados
Comparando los resultados al inicio de la prueba con los de al finalizar, para el grupo de yogur de la cepa B de L. delbruckii (grupo de control) que es el control, como se muestra en la fig. 32, la relación Th1/Th2 mostró una disminución significativa y, como se muestra en la fig. 33, el nivel de ECP mostró un aumento significativo. Por otra parte, para el grupo de yogur de la cepa KW3110 de L. paracasei (grupo KW) no hubo cambio significativo entre antes y después de la prueba para ambos niveles. Además, como se muestra en la fig. 34, en cuanto a la puntuación de los síntomas subjetivos, para los puntos tales como picor de garganta, dolor de ojos y sensación de pesadez en los párpados, el grupo KW mostró menores niveles en comparación con el grupo de control. De los resultados anteriores también se mostró la eficacia de la cepa KW3110 para fiebre del heno humana.
A continuación se describen ejemplos en los que las bacterias del ácido láctico con actividad antialérgica se aplican para la producción de bebidas.
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Ejemplo 11
(Sólo de referencia)
Procedimientos para preparar la cepa de bacterial del ácido láctico como material que va a añadirse a bebidas
Ejemplo de preparación 1
Preparación de la cepa KW3110 de bacterias del ácido láctico
Se usó medio de cultivo (1% de glucosa, 1% de extracto de levadura S (Takeda-Kirin Foods Corporation), 50 ppm de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 50 ppm de MnSO_{4}\cdot5H_{2}O) para cultivar las bacterias del ácido láctico. El precultivo se realizó inoculando la cepa KW3110 de bacterias del ácido láctico en 10 ml de medio de cultivo y dejándola reposar a 37ºC durante 20-24 horas. Para el cultivo, 0,6 ml de la disolución de precultivo se inocularon en 120 ml de medio de cultivo y, usando un fermentador de 200 ml (modelo BMJ-25, Able), se cultivó a 28ºC. El nivel de aireación fue 0,12 l/min, la velocidad de agitación fue 500 rpm. El pH se controló usando disolución de NaOH al 25% pH para que no fuera 4,5 o inferior. Se cultivó durante 48 horas.
Después de finalizar el cultivo, las cepas se recogieron centrifugando durante 10 minutos a 8500 X g. Las cepas se suspendieron en 30 ml de agua destilada estéril y las cepas se recogieron por centrifugación a 8500 X g durante 10 minutos. El procedimiento de lavado se repitió tres veces y se eliminaron las composiciones derivadas del medio. Las cepas lavadas se suspendieron en 10 ml de agua estéril, se trataron en un autoclave a 100ºC durante 30 minutos, luego se liofilizaron. Finalmente se obtuvieron 50-70 mg de la cepa seca de bacterias del ácido láctico. Se confirmó la actividad antialérgica de la cepa de bacterias de ácido láctico.
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Ejemplo 12
(Sólo de referencia)
Preparación de bebidas de té
Se añadió agua desionizada a un extracto de té oolong, té rojo, té verde, té verde tostado y té de jazmín extraído con agua caliente a 85ºC de manera que la tasa de utilización de la hoja de té llegara a ser el 0,8% en peso. En ese momento se añadió ácido ascórbico de manera que llegó a ser el 0,025% en peso y el pH se controló usando bicarbonato sódico para que fuera fácil de beber. Además, se añadió la cepa KW3110 de bacterias del ácido láctico de manera que el número de bacterias llegara a ser 1,5 \times 10^{10}, 3 x 10^{10} por 100 g de la preparación, la esterilización UHT se llevó a cabo mediante un procedimiento común y se envasó en una botella de PET de 350 ml.
Estos diez ejemplos (5 tipos de té \times 2 fases de concentración de bacterias de ácido láctico) se sometieron a un examen sensorial por panelistas. Como resultado, todas las bebidas tenían un aroma satisfactorio y recibieron la alta evaluación de que podían beberse continuamente todos los días. Sin embargo, para las muestras en las que se añadió 3 \times 10^{10}, como las bacterias del ácido láctico son perceptibles como precipitado, se estimó que se preferían las muestras en las que se añadió 1,5 x 10^{10}.
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Ejemplo 13
(Sólo de referencia)
Preparación de té de cebada
Se extrajeron hirviendo 250 g de té de cebada perla china con 10 kg de agua hirviendo durante 30 min, se filtraron y se centrifugaron. La cepa KW3110 de bacterias del ácido láctico se añadió al extracto obtenido de manera que fuera 8 \times 10^{10}, 1,5 x 10^{10}, 3 x 10^{10} por 100 g de producto final, y además se añadieron bicarbonato sódico y ácido ascórbico para ajustar el sabor, y una vez más se añadió agua desionizada para obtener 10 kg en peso. Entonces, la esterilización UHT se realizó mediante un procedimiento común y se envasó asépticamente en una botella de PET de 500 ml PET.
Cambiando a la evaluación sensorial, todas las bebidas tenían un aroma satisfactorio y recibieron la alta evaluación de que podían beberse continuamente todos los días. Sin embargo, para las muestras en las que se añadió 3 x 10^{10}, como las bacterias del ácido láctico son perceptibles en aspecto como precipitado, se estimó que eran más preferibles las muestras en las que se añadió 1,5 x 10^{10}.
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Ejemplo 14
(Sólo de referencia)
Preparación de bebida que contiene zumo
Se añadió una cantidad prescrita de la cepa de bacterias del ácido acético a 900 g de zumo de manzana turbio y 1 g de aroma, y además se añadió agua desionizada de manera que el total llegara a ser 1 kg. Mediante un procedimiento común se envasó en caliente en una botella de vidrio de 180 ml para preparar una bebida que contenía zumo de manzana. Mientras tanto se añadió la cepa KW3110 de bacterias del ácido láctico de manera que el número de bacterias fuera 2 \times 10^{10}, o 4 \times 10^{10} por 100 g de preparación.
Como resultado de la evaluación sensorial, no hubo absolutamente ninguna sensación desagradable de aroma debida a la combinación de bacterias del ácido láctico, ni ningún problema de aspecto para todas las muestras.
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Ejemplo 15
(Sólo de referencia)
Preparación de bebida deportiva
Se añadió 0,0143% en peso de la cepa KW3110 de bacterias del ácido láctico (1,5 \times 10^{10} por 100 g de producto) a una preparación que comprendía 4,5% en peso de azúcar granulada, 0,2% en peso de ácido cítrico, 0,05% en peso de citrato de sodio y 0,1% en peso de aroma. Además, la disolución se calentó hasta 90ºC para la esterilización, en envasó en caliente en una botella de PET para preparar una bebida de tipo bebida deportiva. Como resultado de la evaluación sensorial, tanto el aspecto como el aroma fueron satisfactorios. La cepa de bacterias del ácido acético en la bebida se centrifugó, se lavó dos veces con agua purificada, luego se liofilizó para obtener la cepa seca. Los productos acabados se estimaron en los sistemas in vitro usando linfocitos de ratón, y se confirmó que se mantenía la actividad prescrita (fig. 35).
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Ejemplo 16
(Sólo de referencia)
Preparación de zumo de tomate
Después de añadir una cantidad prescrita de la cepa de bacterias del ácido acético a zumo de tomate, la preparación se envasó en una lata de 190 g, y según un procedimiento común, se realizó la esterilización en retorta. Mientras tanto, la cepa KW3110 de bacterias del ácido láctico se añadió de manera que el número de cepas fuera 2,5 \times 10^{10} ó 5 \times 10^{10} por 100 g de preparación.
Como resultado de la evaluación sensorial, no hubo absolutamente ninguna sensación desagradable de aroma debida a la combinación de bacterias del ácido láctico, ni ningún problema de aspecto para todas las muestras.
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Ejemplo 17
(Sólo de referencia)
Preparación de café
Se extrajeron granos de café tostado y molido (Colombia) con agua caliente a 95ºC y se obtuvo el extracto de café. Añadiendo agua desionizada, el extracto se diluyó de manera que el contenido de sólidos solubles llegara a ser el 1,4%. Se añadió la cepa KW3110 de bacterias del ácido láctico de manera que el número de bacterias fuera 2 \times 10^{10} ó 4 \times 10^{10} por 100 g de preparación, se envasó en una lata de 190 g y, según un procedimiento común, se llevó a cabo la esterilización en retorta.
Como resultado de la evaluación sensorial, no hubo absolutamente ninguna sensación desagradable de aroma debida a la combinación de bacterias del ácido láctico para todas las muestras. Sin embargo, cuando se vertió en vasos y similares, las bacterias del ácido láctico fueron perceptibles en aspecto como precipitado para las muestras en la que se añadió 4 \times 10^{10}, y se estimó que era más preferible la preparación en la que se añadió 1,5 \times 10^{10}. Sin embargo, no hubo problema cuando se bebió directamente de la lata.
A continuación se describen ejemplos en los que las bacterias del ácido láctico con actividad antialérgica se aplican para la producción de alimentos.
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Ejemplo 18 Preparación de yogur
Las materias primas que contienen leche (leche, leche desnatada, nata, líquido azucarado, estabilizador, aroma, agua) se mezclaron homogéneamente, se esterilizaron mediante calentamiento a 128ºC durante 15 segundos, se enfriaron hasta 40ºC o menos, se añadieron con el iniciador KW3110 de bacterias del ácido láctico y empezó la fermentación en un tanque de fermentación mantenido a 37ºC. La KW3110 de las bacterias del ácido láctico descompusieron lactosa en la mezcla para generar ácido láctico y, en aproximadamente 18 horas, el pH llegó a ser 4,6 y, mediante aglutinación isoeléctrica de la proteína de la leche, se agitó y se enfrió cuando se estabilizó la gelación. El yogur se preparó en forma de pasta mediante agitación, se envasó en un recipiente de papel, se cerró y se almacenó con enfriamiento en un refrigerador de 10ºC o menos. Después de enfriarse, mediante una evaluación sensorial se confirmó que la mezcla tenía calidad comestible y propiedades apropiadas como yogurt. La proporción combinada de materias primas para el yogur se muestra en la tabla 7. Además, la proporción de grasa y SNF (sólidos no grasos) en las materias primas y el dulzor se muestran en la tabla 8. Los productos acabados se estimaron en los sistemas in vitro usando linfocitos de ratón, y se confirmó que se mantenía la actividad prescrita (fig. 36).
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TABLA 7
11 
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TABLA 8
13
A continuación se describen ejemplos en los que las bacterias del ácido láctico con actividad antialérgica se aplican para la producción de productos alimenticios naturales.
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Ejemplo 19
(Sólo de referencia)
Preparación de alimentos naturales en comprimido
Se añadieron apropiadamente palatinosa reducida, sorbitol, xilitol y goma arábiga, que son azúcares, a 67 g de polvo seco preparado de la cepa KW3110 de bacterias del ácido láctico, mediante calentamiento y granulación, usando agua como aglutinante. El sabor se ajustó con ácido cítrico, stevia, aroma y similares, se añadieron grasa en polvo y éster de sacarosa de manera que fuera fácil formar comprimidos usando una máquina de compresión, y se obtuvo una mezcla de 1000 g. Entonces, la mezcla se comprimió para que fueran 1,5 g por comprimido y los alimentos naturales se prepararon en forma de comprimido de aroma favorable. En ese momento, la cepa KW3110 de bacterias del ácido láctico fue 5 \times 10^{10} por comprimido.
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Ejemplo 20
(Sólo de referencia)
Alimento natural en forma de cápsula dura
Se añadieron 50 g de dextrina a 100 g de polvo seco preparado de la cepa KW3110 de bacterias del ácido láctico y, después de mezclarse homogéneamente, la mezcla se envasó en materiales base de cápsula dura que comprendían pululano, aceite vegetal, carragenina, cloruro de potasio para obtener alimentos naturales de 213 mg por cápsula encapsulados con cápsulas duras. En ese momento, la cepa KW3110 de bacterias del ácido láctico estaba contenida en 5 x 10^{10} por cápsula.
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Ejemplo 21
(Sólo de referencia)
Alimento natural en forma de cápsula dura
Se añadieron 50 g de dextrina a 100 g de polvo seco preparado de la cepa KW3110 de bacterias del ácido láctico y, después de mezclarse homogéneamente, la mezcla se envasó en materiales base de cápsula dura que comprendían gelatina y glicerina para obtener alimentos naturales de 213 mg por cápsula encapsulados con cápsulas duras. En ese momento, la cepa KW3110 de bacterias del ácido láctico era 5 x 10^{10} por cápsula.
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Ejemplo 22
(Sólo de referencia)
Alimento natural en forma de cápsula blanda
Se suspendieron homogéneamente 100 kg de polvo seco preparado de la cepa KW3110 de bacterias del ácido láctico con una mezcla de 180 kg de aceite de alazor, 20 kg de cera de abeja y 5 kg de lecitina de soja, se encapsularon con material base de cápsulas que tenían como ingredientes principales carragenina, almidón y glicerina para formar una cápsula blanda que tenía una forma ovalada de 450 mg por cápsula. En ese momento, la cepa KW3110 de bacterias del ácido láctico era 5 \times 10^{10} por cápsula.
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Ejemplo 23
(Sólo de referencia)
Alimento natural en forma de cápsula blanda
Se suspendieron homogéneamente 100 kg de polvo seco preparado de la cepa KW3110 de bacterias del ácido láctico con una mezcla de 180 kg de aceite de alazor, 20 kg de cera de abeja y 5 kg de lecitina de soja, se encapsularon con material base de cápsulas que comprendían gelatina y glicerina para formar una cápsula blanda que tenía una forma ovalada de 450 mg por cápsula. En ese momento, la cepa KW3110 de bacterias del ácido láctico era 5 x 10^{10} por cápsula.
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Ejemplo 24
(Sólo de referencia)
Alimento natural en forma de gránulo
Se envasaron 100 kg de polvo seco preparado de la cepa KW3110 de bacterias del ácido láctico con un aparato de envase de barras para que fuera 1 g por barra para obtener alimento natural en el que la cepa KW3110 de bacterias del ácido láctico es 5 x 10^{11} por barra.
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Ejemplo 25
(Sólo de referencia)
Alimento natural en forma de gránulo
Se añadieron 900 kg de dextrina a 100 kg de polvo seco preparado de la cepa KW3110 de bacterias del ácido láctico y, usando agua como aglutinante, con un granulador de lecho fluidizado se llevó a cabo homogéneamente el mezclado, calentamiento y granulado para obtener 1000 kg de gránulos. Entonces, los gránulos se envasaron con un aparato de envase de barras para que fuera 1 g por barra para obtener alimentos naturales en los que la cepa KW3110 de bacterias del ácido láctico es 5 \times 10^{10} por vara. Los productos acabados se estimaron en los sistemas in vitro usando linfocitos de ratón, y se confirmó que se mantenía la actividad prescrita (fig. 37).
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Ejemplo 26
(Sólo de referencia)
Alimento natural en polvo
Se añadieron 900 kg de dextrina a 100 kg de polvo seco preparado de la cepa KW3110 de bacterias del ácido láctico y, usando agua como aglutinante, con un granulador de lecho fluidizado se llevó a cabo homogéneamente el mezclado, calentamiento y granulado para obtener 1000 kg de gránulos. Entonces, los gránulos se molieron hasta que la cantidad total pasó el polo nº 18, se envasaron con un aparato de envasado de barras para que fuera 1 g por barra para obtener alimentos naturales en polvos en los que la cepa KW3110 de bacterias del ácido láctico es 5 x 10^{10} por vara.
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Ejemplo 27
(Sólo de referencia)
Alimento natural en forma de disolución en suspensión
Se añadieron 100 g de polvo seco preparado de la cepa KW3110 de bacterias del ácido láctico a 10 kg de zumo exprimido de hoja de col rizada, se ajustó la viscosidad con 10 g de alginato de sodio de manera que las bacterias del ácido láctico pudieran dispersarse fácilmente para obtener un alimento natural en forma de disolución en suspensión.
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Ejemplo 28
(Sólo de referencia)
Alimento natural en forma de disolución en suspensión
Se mezclaron 100 g de polvo seco preparado de la cepa KW3110 de bacterias del ácido láctico con 0,7 kg de glucosa, 5 kg de agua destilada y 5 g de aroma de uva y, después de la esterilización mediante calentamiento, la mezcla se envasó asépticamente en un recipiente cerrado de 50 ml para obtener un alimento natural en forma de disolución en suspensión como jarabe. Esta preparación tuvo una buena aceptación entre los niños ya que no da una sensación desagradable.
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Breve descripción de los dibujos
La fig. 1 es una lista que muestra las bacterias del ácido láctico usadas en los ejemplos y el lugar del que se obtuvieron (nº 1);
la fig. 2 es una lista que muestra las bacterias del ácido láctico usadas en los ejemplos y el lugar del que se obtuvieron (nº 2);
la fig. 3 es una gráfica que muestra el nivel de producción de IL-12, que es citocina de Th1, por diversas bacterias del ácido láctico en los ejemplos;
la fig. 4 es una gráfica que muestra el nivel de producción de IL-4, que es citocina de Th2, por diversas bacterias del ácido láctico en los ejemplos;
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la fig. 5 es un conjunto de gráficas que muestran los resultados de la comparación de los niveles de producción de IL-12 y IL-4 in vitro usando la cepa de bacterias del ácido acético de la presente invención (KW3110) y la cepa comparativa (L-92 cepa) en los ejemplos;
la fig. 6 es una gráfica que muestra los resultados de medir la actividad antialérgica de la cepa nº 90 derivada de la cepa KW3110 seleccionada en los ejemplos;
la fig. 7 es una figura que muestra el programa de experimentos del examen para medir la capacidad antialérgica in vivo de la cepa KW3110, que es la cepa de bacterias del ácido acético que muestra alta actividad antialérgica de la presente invención, en los ejemplos;
la fig. 8 es una gráfica que muestra la variación de IgE en sangre en un experimento de 98 días para medir la capacidad antialérgica in vivo de la cepa KW3110, que es la cepa de bacterias del ácido acético que muestra alta actividad antialérgica de la presente invención, en los ejemplos;
la fig. 9 es un conjunto de gráficas que muestra el nivel de IgE en sangre mediante transferencia de puntos en el día 48 y en el día 98 en el momento de la disección en un experimento para medir la actividad antialérgica in vivo de la cepa KW3110, que es la cepa de bacterias del ácido acético que muestra alta actividad antialérgica de la presente invención, en los ejemplos;
la fig. 10 es una gráfica que muestra los niveles de producción de IL-12 del grupo de control y el grupo KW3110 en el cultivo de células esplénicas en el día 98 en el momento de la disección en un experimento para medir actividad antialérgica in vivo de la cepa KW3110, que es la cepa de bacterias del ácido acético que muestra alta actividad antialérgica de la presente invención, en los ejemplos;
la fig. 11 es una gráfica que muestra los niveles de producción de IL-4 del grupo de control y el grupo KW3110 en el cultivo de células esplénicas en el día 98 en el momento de la disección en un experimento para medir la actividad antialérgica in vivo de la cepa KW3110, que es la cepa de bacterias del ácido acético que muestra alta actividad antialérgica de la presente invención, en los ejemplos;
la fig. 12 es un conjunto de fotos que muestra los resultados de observar la pérdida de pelo alrededor del hocico del grupo de control y el grupo KW3110 en un experimento para medir la actividad antialérgica in vivo de la cepa KW3110, que es la cepa de bacterias del ácido acético que muestra alta actividad antialérgica de la presente invención, en los ejemplos.
la fig. 13 es una figura que muestra el programa de experimentos del experimento para estimar el efecto preventivo usando un alimento que contiene la cepa KW3110, que son las bacterias del ácido láctico que muestran alta actividad antialérgica de la presente invención, y un alimento que contiene la cepa KW4610, que es públicamente conocida como bacterias antialérgicas del ácido láctico, para comparar entre la cepa KW3110 y la cepa KW4610, en los ejemplos;
la fig. 14 es una gráfica que muestra la variación del nivel de IgE en sangre durante el experimento para estimar el efecto preventivo usando un alimento que contiene la cepa KW3110, que son las bacterias del ácido láctico que muestran alta actividad antialérgica de la presente invención, y un alimento que contiene la cepa KW4610, que es públicamente conocida como bacterias antialérgicas del ácido láctico, para comparar entre la cepa KW3110 y la cepa KW4610, en los ejemplos;
la fig. 15 es un conjunto de gráficas que muestra el nivel de IgE en sangre por puntos por individuo después de la 5ª y la 6ª administración de OVA en el experimento para estimar el efecto preventivo usando un alimento que contiene la cepa KW3110, que son las bacterias del ácido láctico que muestran alta actividad antialérgica de la presente invención, y un alimento que contiene la cepa KW4610, que es públicamente conocida como bacterias antialérgicas del ácido láctico, para comparar entre la cepa KW3110 y la cepa KW4610, en los ejemplos;
la fig. 16 es una gráfica que muestra los resultados de la prueba de resistencia a ácidos de la cepa KW3110, que son las bacterias del ácido láctico que muestran alta actividad antialérgica de la presente invención, en los ejemplos de la presente invención;
la fig. 17 es una gráfica que muestra los resultados de la prueba de resistencia a ácido biliar de la cepa KW3110, que son las bacterias del ácido láctico que muestran alta actividad antialérgica de la presente invención, en los ejemplos de la presente invención;
la fig. 18, la fig. 18 a, b, c son gráficas que muestran los resultados de examinar el comportamiento de estornudos de los modelos de ratón para los efectos de mejoría de la cepa KW3110 en fiebre del heno/inflamación de las vías respiratorias usando antígeno del polen, en los ejemplos;
la fig. 19, la fig. 17 a, b son gráficas que muestran los resultados de examinar el comportamiento de rascado de los modelos de ratón para los efectos de mejoría de la cepa KW3110 en fiebre del heno/inflamación de las vías respiratorias usando antígeno del polen, en los ejemplos;
la fig. 20 es una gráfica que muestra los resultados de examinar la supresión del aumento de la concentración de IgE total en sangre de modelos de ratón para los efectos de mejoría de la cepa KW3110 en fiebre del heno/inflamación de las vías respiratorias usando antígeno del polen, en los ejemplos;
la fig. 21 es un conjunto de gráficas que muestra los resultados de examinar la supresión de la tasa de aumento de eosinófilos (fig. 19 a) y la supresión de la invasión tópica de eosinófilos (fig. 19 b) del modelo de ratón para los efectos de mejoría de la cepa KW3110 en fiebre del heno/inflamación de las vías respiratorias usando antígeno del polen, en los ejemplos;
la fig. 22 es una gráfica que muestra los resultados de examinar el nivel de IL-5 en modelos de ratón para los efectos de mejoría de la cepa KW3110 en fiebre del heno/inflamación de las vías respiratorias usando antígeno del polen, en los ejemplos;
la fig. 23 es un conjunto de gráfica y tabla que muestra los resultados de examinar el aumento de la concentración de IgE total para los efectos de mejoría de la cepa KW3110 en modelos de ratón que muestran síntomas de dermatitis atópica, en los ejemplos;
la fig. 24 es un conjunto de gráfica y tabla que muestra los resultados de medición de las puntuaciones clínicas totales de modelos de ratón para los efectos de mejoría de la cepa KW3110 en modelos de ratón que muestran síntomas de dermatitis atópica, en los ejemplos;
la fig. 25 es un conjunto de gráfica y tabla que muestra los resultados de medición de las puntuaciones clínicas de modelos de ratón (parte del pabellón auricular) para los efectos de mejoría de la cepa KW3110 en modelos de ratón que tienen dermatitis atópica, en los ejemplos;
la fig. 26 es una gráfica y una tabla que muestran los resultados de medición de las puntuaciones clínicas de modelos de ratón (parte del cuero cabelludo) para los efectos de mejoría de la cepa KW3110 en modelos de ratón que tienen dermatitis atópica, en los ejemplos;
la fig. 27 es un conjunto de fotos que muestran el estado de supresión de erosión/lesión de tejidos de la parte del pabellón auricular en la cabeza de modelos de ratón para los efectos de mejoría de la cepa KW3110 en modelos de ratón que tienen dermatitis atópica, en los ejemplos;
la fig. 28 es un conjunto de gráfica y tabla que muestra los resultados experimentales del engrosamiento del pabellón auricular del modelo de ratón (fig. 26a) y la tendencia supresora del engrosamiento del pabellón auricular del modelo de ratón después de la primera exposición (fig. 26b) para los efectos de mejoría de la cepa KW3110 en modelos de ratón que tienen dermatitis atópica, en los ejemplos;
la fig. 29 es un conjunto de gráfica y tabla que muestra los resultados de examinar la tendencia supresora del engrosamiento del pabellón auricular de modelos de ratón después de la tercera exposición para los efectos de mejoría de la cepa KW3110 en modelos de ratón que tienen dermatitis atópica, en los ejemplos;
la fig. 30 es un conjunto de fotos que muestran los resultados de la estimación patológica de la parte del pabellón auricular usando tinción con hematoxilina-eosina para la supresión del engrosamiento del pabellón auricular de modelos de ratón para los efectos de mejoría de la cepa KW3110 en modelos de ratón que tienen dermatitis atópica, en los ejemplos;
la fig. 31 es un conjunto de fotos que muestran la estimación patológica de la parte del pabellón auricular usando tinción con azul de toluidina para la supresión del engrosamiento del pabellón auricular de modelos de ratón para los efectos de mejoría de la cepa KW3110 en modelos de ratón que tienen dermatitis atópica, en los ejemplos;
la fig. 32 es un conjunto de gráficas que muestran los resultados de medir el cambio de la relación Th1/Th2 en la prueba usando yogur para los efectos de la cepa KW3110 en fiebre del heno en seres humanos, en los ejemplos;
la fig. 33 es un conjunto de gráficas que muestra los resultados de medir el cambio ECP antes y después de iniciar la prueba en la prueba usando yogur para los efectos de la cepa KW3110 en fiebre del heno en seres humanos, en los ejemplos;
la fig. 34 es un conjunto de gráficas que muestra los resultados de observar el cambio de síntomas subjetivos antes y después de iniciar la prueba en la prueba usando yogur para los efectos de la cepa KW3110 para fiebre del heno en seres humanos, en los ejemplos;
la fig. 35 es una gráfica que muestra los resultados de examinar el nivel de producción de IL-12 cuando se fabrica como un refresco, examinar el mantenimiento de la actividad antialérgica cuando se fabrica realizando diversos tratamientos usando la cepa KW3110, en los ejemplos;
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la fig. 36 es una gráfica que muestra los resultados de examinar el nivel de producción de IL-12 cuando se fabrica combinando en un yogur, examinar el mantenimiento de la actividad antialérgica cuando se fabrica realizando diversos tratamientos usando la cepa KW3110, en los ejemplos;
la fig. 37 es una gráfica que muestra el resultado de examinar los niveles de producción de IL-12 y IL-4 cuando se fabrica como comprimidos, examinar el mantenimiento de la actividad antialérgica cuando se fabrica realizando diversos tratamientos usando la cepa KW3110, en los ejemplos.
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Aplicabilidad industrial
Es posible obtener las bacterias del ácido láctico con alta actividad antialérgica, y tener composiciones que muestran alta actividad antialérgica que tienen las bacterias del ácido láctico como ingredientes activos. La composición antialérgica de referencia es particularmente eficaz para alergia medioambiental tal como fiebre del heno, dermatitis atópica, asma bronquial, rinitis alérgica, conjuntivitis alérgica y similares. Particularmente, como se muestra en los datos de fiebre del heno o los datos de experimentos de terapia para asma usando polen como antígeno, muestra efectos significativos en la prevención/tratamiento de enfermedades de hipersensibilidad mucosa tales como fiebre del heno, asma bronquial, rinitis alérgica, conjuntivitis alérgica y similares. La KW3110 de L. paracasei, que es uno de los ingredientes activos de la composición antialérgica de la presente invención, no sólo tiene una fuerte actividad antialérgica, actividad inmunoestimulante, sino que también es excelente por su adhesividad a células intestinales y resistencia a ácido gástrico y ácido biliar. Por tanto, administrando por vía oral las bacterias del ácido láctico o productos que usan KW3110 de la bacteria del ácido láctico L. paracasei, el uso de alimentos o bebidas puede ejercitar funciones de probiótica que son convencionalmente conocidas, tales como la función que regula los intestinos, la función que disminuye el colesterol o la función hipotensora mostrada en muchas bacterias del ácido láctico, además de la función antialérgica. La composición con función antialérgica puede ingerirse continuamente todos los días, particularmente en forma de bebida, y también mantiene la función antialérgica que llega a ser eficaz con la cantidad que es posible ingerir continuamente. Además, es posible proporcionar bebidas de buen sabor y buena capacidad de almacenamiento.

Claims (19)

1. Un producto probiótico que comprende una cepa KW3110 viable de la bacteria del ácido láctico Lactobacillus paracasei o su mutante como ingrediente activo, en donde el producto probiótico es una bebida o producto alimenticio.
2. El producto probiótico según la reivindicación 1, en donde el producto probiótico es una materia prima láctea fermentada usando la cepa KW3110 de la bacteria del ácido láctico Lactobacillus paracasei o su mutante.
3. El producto probiótico según la reivindicación 1 a 2, en donde el producto probiótico es yogur.
4. El producto probiótico según la reivindicación 1 a 3, en donde el número de bacterias del ácido láctico de la cepa KW3110 de Lactobacillus paracasei o su mutante en el producto probiótico es 5 X 10^{9} o más células por ingesta diaria.
5. El producto probiótico según la reivindicación 1 a 4, en donde el producto probiótico se usa para prevenir y/o tratar enfermedades alérgicas.
6. Un método para producir productos probióticos, en el que una parte o todas las bacterias del ácido láctico en la bebida o alimento producido usando bacterias del ácido láctico o la bebida o alimento que comprende bacterias del ácido láctico están sustituidas por la cepa KW3110 de la bacteria del ácido láctico Lactobacillus paracasei o su mutante.
7. Un método para producir un producto probiótico que comprende las bacterias del ácido láctico, en el que las bacterias del ácido láctico es la cepa KW3110 de Lactobacillus paracasei o su mutante.
8. Un método para producir un producto probiótico que se produce usando bacterias del ácido láctico, en el que las bacterias del ácido láctico usadas es la cepa KW3110 de Lactobacillus paracasei o su mutante.
9. El método para producir un producto probiótico según las reivindicaciones 6 a 8, en donde el producto probiótico es una bebida o producto alimenticio.
10. El método para producir un producto probiótico según la reivindicación 9, en donde el producto probiótico es una materia prima láctea fermentada usando la cepa KW3110 de la bacteria del ácido láctico Lactobacillus paracasei o su mutante.
11. El método para producir un producto probiótico según las reivindicaciones 9 a 10, en donde el producto probiótico es yogur.
12. El método para producir un producto probiótico según las reivindicaciones 6 a 11, en donde el número de bacterias del ácido láctico de la cepa KW3110 de Lactobacillus paracasei o su mutante en el producto probiótico es 5 X 10^{9} o más células por ingesta diaria.
13. El método para producir un producto probiótico según las reivindicaciones 6 a 12, en donde el producto probiótico se usa para prevenir y/o tratar enfermedades alérgicas.
14. Uso de la cepa KW3110 de la bacteria del ácido láctico Lactobacillus paracasei o su mutante en la fabricación de un producto probiótico.
15. El uso de la cepa KW3110 de la bacteria del ácido láctico Lactobacillus paracasei o su mutante en la fabricación de un producto probiótico según la reivindicación 14, en donde el producto probiótico es una bebida o producto alimenticio.
16. El uso de la cepa KW3110 de la bacteria del ácido láctico Lactobacillus paracasei o su mutante en la fabricación de un producto probiótico según la reivindicación 15, en donde el producto probiótico es una materia prima láctea fermentada usando la cepa KW3110 de la bacteria del ácido láctico Lactobacillus paracasei o su mutante.
17. El uso de la cepa KW3110 de la bacteria del ácido láctico Lactobacillus paracasei o su mutante en la fabricación de un producto probiótico según las reivindicaciones 15 y 16, en donde el producto probiótico es yogur.
18. El uso de la cepa KW3110 de la bacteria del ácido láctico Lactobacillus paracasei o su mutante en la fabricación de un producto probiótico según las reivindicaciones 14 a 17, en donde el número de bacterias del ácido láctico de la cepa KW3110 de Lactobacillus paracasei o su mutante en el producto probiótico es 5 x 10^{9} o más células por ingesta diaria.
19. El uso de la cepa KW3110 de la bacteria del ácido láctico Lactobacillus paracasei o su mutante en la fabricación de un producto probiótico según las reivindicaciones 14 a 18, en donde el producto probiótico se usa para prevenir y/o tratar enfermedades alérgicas.
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