TWI418356B - 可作為免疫調節劑之副乾酪乳酸桿菌ｌｔ１２ - Google Patents

Description

可作為免疫調節劑之副乾酪乳酸桿菌LT12

本發明係關於一種新穎副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei)及其用於調節免疫反應及治療與過敏相關疾病之用途。

過敏是指免疫系統對外來物，例如細菌、花粉或灰塵等，產生的一種過度免疫反應，該外來物被通稱為「過敏原」。這些過敏原有時會被人體視為有害或具危險性而啟動一部分的免疫系統，但事實上該過敏原不會造成感染或有毒性。當人體與過敏原接觸而造成免疫反應時，組織胺和***素可能接著會被釋放出來造成過敏症狀，包括呼吸道的發炎反應、異位性皮膚炎、過敏性結膜炎、蕁麻疹、濕疹、特定胃腸疾病或哮喘等。

據報導指出，已開發國家的孩童較容易患有過敏，因為這些國家過分注重公共衛生，也常接種疫苗或使用抗生素，因此降低了感染的機會，而感染通常會對抗過敏或氣喘。在醫學上，這種現象被稱為是「衛生學假說」，主要論述孩童時期若是缺乏對感染原的接觸，會趨向Th-2的免疫反應，例如：生產過剩的IL-4(interleukin-4)、IL-5及IL-13。這些Th-2型細胞激素會吸引嗜伊性紅血球(eosinophils)、嗜鹼性白血球(basophils)及肥大細胞(mast cell)至發炎位置，這些細胞可以單獨或是與免疫球蛋白E(IgE)共同作用而產生過敏反應。另外，IL-4與IL-13可促進B細胞進行抗體的類型轉換(isotype switch)以增加血液中IgE的量。根據「衛生學假說(hygiene hypothesis)」，誘發Th-1(T helper 1)細胞的免疫反應，例如：促進IFN-γ的表現，也許可以有效的減緩過敏反應。

許多研究指出，乳酸菌(Lactobacillus sp.)在生物體內具有 調節免疫反應的能力，包括促進細胞激素的分泌、活化巨噬細胞與自然殺手細胞及抗體的產生等(Madsen et al.,2001,Gastroenterology 121：580-591)。Collins等人(U.S.Pat.No.7,390,519)曾表示唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius)AH102,AH103,AH105,AH109或AH110等品系可做為一種抗發炎的生物治療劑來有效預防及/或治療發炎反應。Hsu等人(U.S.Pat.No.6994848)也揭露副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei)GM-080可促進IFN-γ的分泌，且可用來治療與過敏相關的疾病。

然而，多種自然界中存在的乳酸菌至今還未被完全發現及進行完整地研究。本發明提供一個組合物，其包含一種新穎副乾酪乳酸桿菌品系(Lactobacillus paracasei)及其免疫調節之應用，其與相關之先前文獻已揭露之品系不同。

本發明一方面為提供一種具有免疫調節功能的新穎副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei)LT12。

本發明另一方面為提供一種組合物，包含上述副乾酪乳酸桿菌LT12及載體。此組成物可為食品(例如：優格、餅乾、麥片、巧克力及點心棒)，飲料(例如：茶、不含酒精的飲料、牛奶及果汁)，或是包含醫學上可接受之載體之藥物。

本發明的再另一方面提供一種調節免疫系統(如：先天性免疫(innate immunity)或適應性免疫(adaptive immunity))或治療過敏之方法及其組合物，其係為給予有需要的個體服用有效量之上述任一組合。該個體(例如：人類患者)可為患有IgE介導的立即性過敏反應(immediate hypersensitivity)或是T細胞介導的遲發性過敏反應(delayed hypersensitivity)之病人。

本發明又一方面亦包含利用前述副乾酪乳酸桿菌LT12製備調節免疫系統或治療過敏之藥物之用途。

本發明的一個或多個具體實施例將會在下文做描述。本發 明其他特徵及優點也將可在以下圖式、實施例及申請專利範圍中分別顯見。

本發明提供一種新穎副乾酪乳酸桿菌品系，命名為LT12，此菌株可用來調節免疫反應及治療過敏。該菌株LT12於2009年9月21日寄存於美國農業菌種保存中心(1815N.University Street,Peoria,Illinois,61601,U.S.A.)，寄存編號為NRRL-B50327。該菌株LT12另於2010年2月10日寄存於中華民國財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC910461。

副乾酪乳酸桿菌株LT12係自人類糞便中分離，須在檢體採樣後的十二小時內進行分離的步驟。稱重(約一公克)的檢體放至均質機(Stomacher400,Seward,UK)攪拌30秒使其均質化，再以預還原(pre-reduced)之腦心浸出物培養液(brain heart infusion broth)稀釋，接著以適合的選擇性培養基進行培養。適當之稀釋物塗盤於乳酸菌醋酸鹽培養基(Rogosa Acetate agar,Difco，USA)，或含有12μg/ml萬古黴素(vancomycin,Sigma,USA)的乳酸菌醋酸鹽培養基(Rogosa Acetate agar,Difco，USA)，以培養所有的乳酸菌屬以及可抗萬古黴素的乳酸菌，例如：副乾酪乳酸桿菌群(L.paracasei group)，包含副乾酪乳酸桿菌(L.paracasei)、酪蛋白乳酸桿菌(L.casei)及雷曼氏乳酸桿菌(L.rhamnosus)等。API 50 CHL系統(bioMérieux,Inc.USA)係用於鑑定抗萬古黴素的副乾酪乳酸桿菌中的品系。鑑定結果如表1所示。

LT12之微生物學特徵如下：

(1)形態學特徵

(a)細胞形狀及大小：菌體在37℃下於MRS培養液中隔夜培養後，在顯微鏡下觀察到的形狀為桿狀，邊緣為圓形。

(b)活動力：有

(c)鞭毛：無

(d)孢子形成：無

(e)革藍氏染色：陽性

(2)培養特徵：

(a)培養基：MRS培養液(Difco,USA)，最終pH 6.2~6.5。

(b)培養條件：37℃兼性厭氧

(3)生理學特徵：

(a)過氧化氫酶：陽性

(b)氧化酶：陰性

(c)API 50 CHL測試：測試結果如表1所示

(4)遺傳特徵：

如實施例2所示，以隨機放大多形態DNA鑑定(Random Amplification Polymorphic DNA,RAPD)方法針對LT12、Lactobacillus paracasei(Cell biotech Co.,Ltd.,Korea)(以下簡稱LP-CBT)、Lactobacillus paracasei GMNL32(以下簡稱：GMNL32)、Lactobacillus paracasei subsp.paracasei BCRC 14023(以下簡稱：BCRC 14023)及Lactobacillus paracasei subsp.paracasei BCRC 12188(以下簡稱：BCRC 12188)進行RAPD之分析。12個隨機核酸引子如表2所列。電泳圖結果顯示LT12具有不同的條帶模式(如表3所示)。綜合以上鑑定結果，LT12為一種新穎副乾酪乳酸桿菌株。

根據本發明的一個具體實施例，可使用活細胞的形式的LT12或其功能變異株。根據本發明的另一個具體實施例，可使用非活細胞的形式，如熱致死菌體，其包含菌株LT12產生的有利因子。本文在此所稱之「功能變異株」一詞係指其具有LT12相同特徵之菌株，可達相同功效。

本發明係提供一個LT12菌株及其功能變異株，其具有調節免疫活性及/或抗過敏反應之活性。本文在此所稱之「調節免疫活性」一詞係指其具有自穩定態或低落的免疫系統提升免 疫活性(免疫刺激活性)，或是抑制多餘或過度的免疫反應以回復到適當的水平(抑制免疫活性)。以另一角度來說，此是用來調控免疫性細胞(例如T細胞、B細胞或巨噬細胞)以穩定總體免疫反應的平衡。舉例來說，但不限於，刺激或抑制細胞激素的產生、活化淋巴細胞、平衡Th1/Th2活性及抑制過敏反應等。

本發明亦提供一可用於治療過敏之LT12菌株或其功能變異株。本文在此所稱之「過敏」一詞係指是指生理上的保護性免疫所導致而傷害宿主的一種免疫反應。最常見的兩種過敏是由IgE介導的立即性過敏反應，及T細胞介導的遲發性過敏反應。過敏的臨床症狀包含過敏性鼻炎、過敏性哮喘、食物過敏、過敏性皮膚炎、眼睛過敏及全身型過敏性反應(anaphylaxis)等。本文在此所稱之「治療過敏」一詞係指一系列可以反轉上述所提到免疫症狀的免疫反應，例如，但不限於，阻斷Th-2介導的免疫反應，減少Th-2型細胞激素(如：IL-4,IL-5,IL-13)，增加Th-1型細胞激素(如INF-γ)，以及抑制IgE⁺記憶B細胞及嗜伊性紅血球的活化或分化。

根據本發明的一個具體實施例，藉由ELISA分析確認LT12能刺激由捐贈者血液分離出之周邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)分泌INF-γ(如表四)。INF-γ是一種細胞激素，其對於先天性免疫及適應性免疫於對抗病毒及細菌的感染非常重要。它是Th-1型細胞激素的代表，可以抑制Th-2型細胞的分化，因此減少L-4,IL-5,IL-13的生成，該等細胞激素會刺激免疫球蛋白類轉換成IgE，以及擴增原始及IgE⁺記憶B細胞的數量。因此，促進INF-γ的表現可能有效地治療過敏。

根據本發明的另一個具體實施例，LT12也能刺激周邊血液單核細胞分泌其他的細胞激素，包含由人類細胞激素抗體微陣列(Human cytokine antibody array)所分析出的IL-1α、IL-6、IL-10、IFN-γ、MCP-2以及TNF-α(參見圖1A-1E及表6)。

因此，本發明提供一種調節免疫的方法及組合物，包括給予一個體服用有效量之副乾酪乳酸桿菌LT12與醫學上可接受之載體。

本發明亦提供一個治療過敏方法及組合物，包括給予一個體服用有效量之副乾酪乳酸桿菌LT12與醫學上可接受之載體。本文在此所稱之「醫藥上可接受之載體」包括，但不限於：生理食鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其相關之組合物。

令人意外的是，本發明發現一組合物，包含LT12與第二種副乾酪乳酸桿菌，亦具有免疫調節活性及/或抗過敏活性。在一個實施例中，第二種副乾酪乳酸桿菌之品系為LP-CBT，LT12與其之菌數比例為100：1。較佳之LT12與第二種菌株之菌數比為2：1。如實施例4之結果所示，組合物亦能刺激周邊血液單核細胞分泌其他的細胞激素，包含由人類細胞激素抗體微陣列(Human cytokine antibody array)所分析的IL-1α、IL-6、IL-10、IFN-γ、MCP-2以及TNF-α。另外，MCP-3僅由經LT12組合物刺激之周邊血液單核細胞產生。

根據本發明，LT12提供了極佳的免疫調節及抗過敏的活性。根據本發明的一個實施例，LT12或其組合物可以用來作為一組合物之有效成分。該組合物可被製為食物、飲料或藥物。除此之外，也可包含各種的添加物，添加物的種類舉例來說，但不限於，例如人工色素(例如：β-胡蘿蔔素、胭脂樹紅色素、薑黃、辣椒粉、藥品及化妝品染料等)、調味料、香料、甜味劑、乳化劑及/或增稠劑、防腐劑、維生素及抗氧化劑(例如：維生素A、C、D、E、B-1、B-5、B-6、鋅、硒、鈣、α-維生素E、麩胱胺(glutathione)、二丁基羥基甲苯(butylated hydroxytoluene,BHT)、丁基羥基甲氧苯(butylated hydroxyanisole,BHA)及半胱胺酸(cysteine))。

本發明將由下列實施例做進一步的說明，但實際發明並不侷限於此說明書所陳述之實施例。

實施例1：分離副乾酪乳酸桿菌株LT12

副乾酪乳酸桿菌LT12係從人類糞便進行分離，須在檢體採樣後十二小時內進行分離的步驟。稱重(約一公克)的檢體放至均質機(Stomacher400,Seward,UK)攪拌30秒使其均質化，再以預還原(pre-reduced)之腦心浸出物培養液(brain heart infusion broth)稀釋，接著以適合的選擇性培養基進行培養。適當之稀釋物塗盤於乳酸菌醋酸鹽培養基(Rogosa Acetate agar,Difco，USA)，或含有12μg/ml萬古黴素(vancomycin,Sigma,USA)的乳酸菌醋酸鹽培養基(Rogosa Acetate agar,Difco，USA)以培養所有的乳酸菌屬，以及可抗萬古黴素的乳酸菌，例如：副乾酪乳酸桿菌群(L.paracasei group)，包含副乾酪乳酸桿菌(L.paracasei)、酪蛋白乳酸桿菌(L.casei)及雷曼氏乳酸桿菌(L.rhamnosus)等。API 50 CHL系統(bioMérieux,Inc.USA)係用於鑑定抗萬古黴素的副乾酪乳酸桿菌的品系。

實施例2：副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei)之鑑定

API 50 CHL系統係用於鑑定乳酸菌。藉由一系列酵素反應來建立乳酸菌菌株的特性。LT12的API 50 CHL系統鑑定結果列示如表1。

隨機放大之多形態DNA(RAPD分析)鑑定：

以下幾種菌株分別進行40小時之培養後進行DNA萃取：LT12、Lactobacillus paracasei(Cell biotech Co.,Ltd.,Korea)(簡稱LP-CBT)、Lactobacillus paracasei GMNL32(簡稱：GMNL32)、Lactobacillus paracasei subsp.paracasei BCRC 14023(簡稱：BCRC 14023)、Lactobacillus paracasei subsp.paracasei BCRC 12188(簡稱：BCRC 12188)，抽取染色體後以12個隨機多型性核酸引子(表2)進行RAPD分析。RAPD分析結果詳見表3，可由電泳分析觀察到LT12與其他四株菌株有不同的的條帶模式。

綜合API 50 CHL鑑定及RAPD分析，LT12有別於典型的副乾酪乳酸桿菌菌株。因此，LT12為一種新穎副乾酪乳酸桿菌株。

實施例3：LT12與其他乳酸菌之過敏調節功能

實驗菌體之製備

LT12、LP-CBT及Lactobacillus rhamnosus GG(以下簡稱LGG)於乳酸菌MRS培養液中37℃培養24小時，接著菌液以3000rpm離心15分鐘。沉澱物加入1ml無菌PBS(phosphate buffered saline)清洗兩次後，接著加熱至95℃加熱30分鐘，製備成熱致死菌液。

周邊血液單核細胞(PBMC)之製備

新鮮血液來自於健康捐贈者(二男三女，年齡分布為24至40歲)，於室溫下以2000rpm離心10分鐘，接著收集膚色血球層(buffy coat layer)之樣本。收集之樣本加入等量稀釋液(Dilute medium，含RPMI-1640,2%胎牛血清)緩慢地移至內裝4ml之Histopaque-1077 ficoll plus溶液。在室溫中以1200rpm離心30分鐘後，加入8ml清洗液(Wash medium，含RPMI-1640,2%胎牛血清，1% PBS)混合均勻充分清洗兩次並自樣品的界面收集PMBC。已收集之PMBC以完全培養液(complete medium，包含RPMI-1640,10%胎牛血清，1% PBS)再懸浮 後，以濃度10⁶細胞/ml培養於24孔盤中。

刺激IFN-γ分泌及細胞激素IFN-γ定量

將PBMCs分別與三種菌株(LT12、LP-CBT及LGG)各以給定濃度(5 x 10⁶,5 x 10⁷或5 x 10⁸CFU/ml)進行共同培養。經過48小時的共同培養後，收集各井的細胞上清液，以酵素免疫分析套組(ELISA kit)定量分析細胞激素IFN-γ，步驟如下。其中分別以5μg/ml植物血球凝集素PHA(phytohemagglutinin)及10μg/ml脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)作為正對照組。

於96孔盤中加入100μL/井4μg/ml之抗IFN-γ抗體(RayBio® Human IFN-γ ELISA,RayBiotech Inc.,USA)，於4℃靜置隔夜。移除孔內液體，加入250μL/well清洗緩衝液(wash buffer)清洗，隨之移除孔內液體，重複上述清洗步驟共5次。加入200μL/井之檢測稀釋液(assay diluent)，於室溫下靜置1小時。加入250μL/井之清洗緩衝液清洗，重複上述清洗步驟共5次。接著加入100μL/井之PMBCs樣本於室溫下反應二小時。加入250μL/井清洗緩衝液清洗五次後，各井加入100μL/井之二級抗體反應一小時。加入250μL/井清洗緩衝液清洗五次後，接著加入100μL/井之辣根過氧化酵素(Avidin-HRP)(1：250)反應30分鐘。加入250μL/井之清洗緩衝液清洗7次，接著加入100μL/井之受質溶液(substrate solution)。於室溫下靜置3~15分鐘呈色後，加入50μL/井之2N H₂SO₄停止反應。孔盤各井以波長450nm測定吸光值，依標準曲線換算樣品中細胞激素(IFN-γ)濃度。測試結果如表4。

在各菌株中，LT12在不同的菌體濃度下都具有最強之刺激IFN-γ生成之能力

實施例4：LT12及其組合物之對於周邊血液單核細胞產生細胞激素之功能評估

熱致死之LT12，及其組合物包括菌數比例為2：1之LT12及LP-CBT，以前述之方法製備。PBMCs(來源C及來源E)與LT12(5 x 10⁷/ml)及LT12組合物(5 x 10⁷/ml)共同培養48小時後，以人類細胞激素抗體微陣列(RayBio^®Human cytokine antibody array,Cat.AAH-CYT-1,RayBiotech Inc.,USA)評估被誘發之細胞激素分泌型態。

分析步驟如分析套組之說明所示(http：//www.raybiotech.com/cytokine_antibody_array.asp)。簡單來說，剪開膜片包裝，用平頭鑷小心將膜片夾至套組所附之八孔盤中，沿盤壁注入2mL/井之阻隔緩衝液(blocking buffer)置於搖動器上輕搖，室溫培養30分鐘。除去阻隔緩衝液，注入1mL/井之檢體。置於搖動器上輕搖2小時反應後，以2mL/井之清洗緩衝液I清洗2次，再用2mL/井之清洗緩衝液II清洗3次。加入1mL/井之生物素(biotin)-抗體溶液，置於搖動器上輕搖2小時反應。除去抗體溶液後，以2mL/井之清洗緩衝液I清洗2次，再用2mL/井之清洗緩衝液II清洗3次。 注入2mL/井之辣根過氧化酵素親合素(HRP-Streptavidin)，置於搖動器上輕搖培養2小時。用鑷子小心夾出膜片滴乾殘存液體，再置回已除去液體之孔盤，注入0.5mL/井之混合檢測液體(detection buffer)，避光反應2分鐘。用鑷子將膜片夾至套組所附之兩片塑膠片之中或塑膠套(plastic wrap)，將膜片連同塑膠片置於避光暗盒(cassette)中於暗房內壓片40秒及顯影。細胞激素抗體陣列於膜上的位置圖如表5所示。

分析結果如表6及圖1A-E所示。試驗分析之組別計有5組，分別為PBMC來源C的空白組(圖1A)、PBMC來源C與LT12共同培養組(圖1B)、PBMC來源C與LT12組合物共同培養組(圖1C)、PBMC來源E的空白組(圖1D)及PBMC來源E與LT12共同培養組(圖1E)。各共同培養試驗組皆觀察到細胞激素分泌的增加，包括IL-1α、IL-6、IL-10、INF-γ、MCP-2和TNF-α，其中細胞激素IL-1α、INF-γ、MCP-2和TNF-α僅有經LT12和LT12組合物刺激之PBMCs才被誘發產生。將同為PBMC來源C的各組進行組間比較，可發現LT12組合物 對誘發GRO-α、IL-10和MCP-2產生的能力高於LT12。此外，僅有LT12組合物能誘發PMBCs表現MCP-3。

熟知技藝之人士將可在不背離本發明精神之下，根據實施 例進行改變和修改。要注意的是，本發明並不受限於說明書中實施例所揭露之範圍，而涵蓋於其他根據申請範圍內揭露之所有變化之形式。

前文之所述以及實施方式可藉由附加之圖式達到更好的說明效果。為了加強本發明之說明，將適當的實施例之圖式列舉於此。要注意的是，本發明並不受限於列舉於此的說明。

圖1係為一照片顯示利用人類細胞激素抗體陣列分析法(Human cytokine antibody Array)分析各組之轉漬(blot)：周邊血液單核細胞來源C空白組(圖1A)、以LT12單獨刺激周邊血液單核細胞來源C(圖1B)、以LT12與第二種副乾酪乳酸桿菌刺激周邊血液單核細胞來源C(圖1C)、周邊血液單核細胞來源E空白組(圖1D)及以LT12刺激周邊血液單核細胞來源E(圖1E)。細胞激素抗體陣列於膜上的位置圖如表5所示。

<110> 利統股份有限公司

<120> 可作為免疫調節劑之副乾酪乳酸桿菌LT12

<140> 098144461

<141> 2009-12-23

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<170> PatentIn 3.3版

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Claims (8)

1. 一種經分離之副乾酪乳酸桿菌菌株(Lactobacillus paracasei strain)LT12，其中該副乾酪乳酸桿菌菌株LT12寄存於美國農業菌種保存中心，寄存編號為NRRL-B50327，且寄存於中華民國財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC910461。
2. 一種組合物，包括如申請專利範圍第1項所述之副乾酪乳酸桿菌LT12。
3. 如申請專利範圍第2項所述之組合物，其中該副乾酪乳酸桿菌LT12為活體。
4. 如申請專利範圍第2項所述之組合物，其中該副乾酪乳酸桿菌LT12是非活化的。
5. 如申請專利範圍第2項所述之組合物，其可為食物、飲料、或是藥物。
6. 如申請專利範圍第2項所述之組合物，其可進一步包含第二種副乾酪乳酸桿菌菌株。
7. 如申請專利範圍第6項所述之組合物，其中該副乾酪乳酸桿菌與第二種副乾酪乳酸桿菌菌株之菌數比可介於2：1至100：1。
8. 如申請專利範圍第6項所述之組合物，其可為食物、飲料、或是藥物。