CN101503662B

CN101503662B - 用于抗过敏症状的微生物株、其组合物和以此微生物株刺激细胞产生干扰素-γ的方法

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Publication number: CN101503662B
Application number: CN2008100048768A
Authority: CN
Inventors: 许清祥; 赖订颖; 王樱谕; 李欣桦; 薛如婷
Original assignee: Bio Ray Biotech Co ltd
Current assignee: Bio Ray Biotech Co ltd
Priority date: 2008-02-05
Filing date: 2008-02-05
Publication date: 2011-04-20
Anticipated expiration: 2028-02-05
Also published as: CN101503662A

Abstract

本发明包括一种经分离的微生物株，命名为类干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)BRAP-01，其具有抗过敏症状的功能。本发明也包括一种用于抗过敏症状的组合物，其包括有效量的上述微生物株；以及赋形剂。本发明还提供一种刺激细胞产生干扰素-γ的方法，包括：提供哺乳动物细胞；将该哺乳动物细胞与经热处理的上述用于抗过敏症状的微生物株进行共培养。

Description

用于抗过敏症状的微生物株、其组合物和以此微生物株刺激细胞产生干扰素-γ的方法

技术领域

本发明关于一种经分离的类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，且特别关于其可用于抗过敏症状。

背景技术

过敏疾病是一种免疫疾病，其为人体内的免疫功能失调，出现不平衡的状况。由于人体内有抗原(过敏原)进入，身体就会产生免疫保护作用，当人体再次接触抗原时，就会诱发身体免疫***产生反应，T细胞会释放干扰素(Interferon，IFN)-γ、白细胞介素(Interleukin，IL)-2，使免疫反应趋向第一型T细胞反应，B细胞因此分泌更多的免疫球蛋白G(IgG)。然而，有过敏体质的人，当过敏原进入体内，则会诱发身体免疫***朝第二型T细胞免疫反应，T细胞会释放白细胞介素4、5、9、13，让免疫B细胞制造免疫球蛋白E(IgE)增加，粘附在肥大细胞(Mast cells)上，再遇过敏原时，过敏原会粘附在免疫球蛋白E上，共同作用后，肥大细胞会释放发炎介质如组织胺(Histamine)、白三烯素(Leukotriene)、***素(Prostaglandin)、和血小板活化因子等，这些发炎介质会进一步导致过敏症状发生。

由上述说明可知，影响过敏免疫反应之一为干扰素γ。免疫细胞活化到某程度后所产生的干扰素-γ^[1]，可以增加抗原呈献细胞的功能，使巨噬细胞能有效的辨识并吞噬侵入的病原体，所以干扰素-γ也被称为巨噬细胞的活化因子之一^[2]。

全世界的过敏疾病罹病率和盛行率有逐年增加之势，且病情转趋严重，住院率和死亡率也随之增加，全球约有20％到30％的人口有过敏疾病的经验。如过敏的标的器官是在鼻子则称之为过敏性鼻炎(rhinitis)，发生在皮肤则为异位性皮肤炎(dermatitis)或荨麻疹(urticaria)，发生在眼睛则为过敏性结膜炎(conjunctivitis)，发生在气管为气喘(asthma)等。这些过敏症状影响短则几周长则数个月，对于过敏患者而言实在造成生活品质上的一大影响因素且现代社会为此付出了巨大成本。

乳酸菌是非致病性的革兰氏阳性杆菌，是肠道的益生菌，在肠道粘膜表面的正常菌丛中大多数是乳酸菌与比菲德氏菌，其临床作用有：调节肠道的通透性、改变肠道微生物的状态与增加肠道IgA的反应性^[3，4，5]。早期的研究发现乳酸菌可刺激老鼠的脾脏细胞株分泌干扰素-γ^[6，7-9]，同时在人类的研究上亦发现血液中的淋巴球细胞亦可被乳酸菌刺激而分泌干扰素-γ^{[10，5，11-12]}。经上述说明可知，干扰素-γ可调节免疫反应产生与否。因此乳酸菌能刺激产生干扰素-γ也代表其可调节免疫反应。

发明内容

本发明提供一种经分离的微生物株，命名为类干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)BRAP-01，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.2218。

本发明也提供一种用于抗过敏症状的微生物株，包括如上述的微生物株。

本发明另提供一种用于抗过敏症状的组合物，包括：有效量的上述微生物株；以及赋形剂。

本发明还提供一种刺激细胞产生干扰素-γ的方法，包括：提供哺乳动物细胞；将该哺乳动物细胞与经热处理的上述用于抗过敏症状的微生物株进行共培养。

为了让本发明的上述和其它目的、特征、和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下：

附图说明

图1A与1B显示分离株BRAP-01进行API 50CH糖化反应测试的结果。

图2A与2B图显示分离株BRAP-01、BR1204以及市售优酪乳(统一LP33机能优酪乳)中LP33菌三株菌的API 50CH糖化反应测试的结果差异。

图3显示BRAP-01、BR1204以及市售优酪乳(统一LP33机能优酪乳)中LP33菌三株菌的随机扩增多型性DNA图谱。

图4A显示BRAP-01、BR1204以及市售优酪乳(统一LP33机能优酪乳)中LP33菌三株菌进行序列比对的结果。

图4B显示BRAP-01、BR1204以及市售优酪乳(统一LP33机能优酪乳)中LP33菌三株菌的演化关系。

图5显示实验样本的不同过敏症状的病患分布情况。

图6显示人类干扰素-γ浓度标准液的序列稀释。

图7显示试剂或各菌株对刺激细胞产生干扰素-γ能力的差异。

图8显示分离株BRAP-01的革兰氏染色镜检。

图9显示将分离株BRAP-01进行API 50CH糖化反应测试的测试结果以API软件进行分析。

发明详述

菌种分离

首先自婴儿粪便检体以ROGOSA平板培养基作为选择性培养基进行菌种分离，以得到分离的单一菌落。

菌种确认

将经由上述方法取得的分离株之一命名为BRAP-01并将其进行各项鉴定。分离株BRAP-01菌落外观为乳白色凸起菌落，适用的液体培养基为MRSbroth，培养温度为33-40℃，微厌氧环境下生长。革兰氏染色结果呈蓝紫色，分离株BRAP-01为革兰氏阳性杆菌。分离株BRAP-01不具运动性、具触酶、不具氧化酶。

根据乳酸菌16S核糖体基因高保留性的特性设计一对分类引物(species primer)-16S rDNA引物：顺向引物为5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向为引物：5，-GTATTACCGCGGCTGCTG-3’。将分离株BRAP-01以上述引物进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)鉴定，得到分离株BRAP-01的16S核糖体DNA基因部分序列516bp，如序列号1的序列所示。将序列号1的序列于美国全国生物技术信息中心(NCBI)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)基因库进行序列比对，结果显示分离株BRAP-01与类干酪乳杆菌相似度99％，结果如表1所示。

表1、分离株BRAP-01与其它类干酪乳杆菌亚种的16S核糖体DNA基因部分序列比对结果

菌株	覆盖范围(Query Coverage)	E值(E value)	最大相同度(Max ident)
				类干酪乳杆菌菌株IMPC 2.116S核糖体RNA基因，部分序列	100％	0.0	99％
类干酪乳杆菌基因的16S rRNA，部分序列，菌株：NRIC 1944	100％	0.0	99％
				类干酪乳杆菌基因的16S rRNA，部分序列，菌株：NRIC 1938	100％	0.0	99％
类干酪乳杆菌基因的16S rRNA，部分序列，菌株：NRIC 1934	100％	0.0	99％

分离株BRAP-01进行微生物50种糖类生化反应鉴定***鉴定(API50CHL)，结果如图1A与1B所示，将此结果以API软件进行分析，确认其为类干酪乳杆菌类干酪亚种(Lactobacillus paracasei ssp paracasei)的辨识度为99％，因此鉴定为类干酪乳杆菌的菌株。综合上述的各项鉴定结果显示此分离株BRAP-01为类干酪乳杆菌的菌株。

不同类干酪乳杆菌的差异分析

将分离株BRAP-01、发明人先前已确认为类干酪乳杆菌的另一菌株BR1204以及市售优酪乳(统一LP33机能优酪乳)中LP33菌株(也为类干酪乳杆菌的一株)进行以下的差异分析。

1.API 50CHL鉴定分析

将上述三菌株进行API 50CHL鉴定，结果显示于图2A与2B，由图可知三株类干酪乳杆菌的生化反应不相同。其中BRAP-01对鼠李糖(Rhamnose)与蜜二糖(Melibiose)的生化反应与其它两株菌完全不同。

2.随机扩增多态性DNA(Randomly amplified polymorphic DNAs，RAPD)分析

利用较广泛的应用于族群分布变异或亚种间差异的研究之随机扩增多态性DNA来判定菌种间的差异。这个方法主要利用聚合酶链式反应的技术以较短的引物(约10个核苷酸)在DNA上任意的配对而进行放大。由于相同族群或相同亚种的个体间核酸序列变异较少，所以放大出的核酸片段大小差异较小，而不同族群或亚种的个体间的差异则较大，所以放大出的核酸片段大小差异亦较大。

本分析所使用引物序列为(5′-AACGCGCAAC-3′)，以此引物进行聚合酶链式反应以得知三株菌株随机扩增多型性DNA的差异。聚合酶链锁反应条件为95℃，10分钟将双股DNA变性分离为单股(denature)；95℃，30秒；36℃，30秒；72℃，30秒，进行30次循环，最终72℃，5分钟来扩增DNA片段。反应完成后以1.5％琼脂糖凝胶(agarose gel)进行DNA电泳分析。图3的随机扩增多态性DNA图谱中显示BRAP-01主要扩增片段为350bp、450bp、650bp、800bp、900bp、1000bp、1300bp、1400bp、1500bp、2500bp(左起第1栏)；LP33主要扩增片段为450bp、950bp、1100bp、1300bp(左起第2栏)；BR1204主要扩增片段为450bp、950bp、1000bp、2500bp(左起第3栏)。因此三株菌在图谱上主要片段不同，故具有差异性。M为DNA分子量标准品，由小至大依序为300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1500bp、2000bp与3000bp(右起第1栏)。

3.16S核糖体基因序列比对

如前述，根据乳酸菌16S核糖体基因高保留性的特性设计一对分类引物(species primer)-16S rDNA引物：顺向引物为5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向为引物：5’-GTATTACCGCGGCTGCTG-3’。将分离株BRAP-01、BR1204与LP33以上述引物进行聚合酶链式反应鉴定，得到分离株BRAP-01的16S核糖体DNA基因部分序列：序列号1，以及BR1204与LP33的16S核糖体DNA基因部分序列，分别各皆约为500-600bp。利用CLC combined Workbench 3.0.2版免费试用软件(CLC bio Inc.Headquartered in Aarhus，Denmark)将三株菌株的16S核糖体DNA基因部分序列进行序列比对，比对结果如图4A所示。将此比对结果产生演化树以证实三株菌株的相关性，如图4B所示。在序列比对上BRAP-01与其它两株具有差异性，经由演化树的结果证实BRAP-01、BR1204与LP33为不同的菌株。

综上所述可以得知BRAP-01、BR1204与LP33在生化反应、基因序列以及演化分类上皆不相同，三株菌确实为不同的菌株，因此可以证实分离株BRAP-01确实为新颖的菌株。

将此新颖的分离株命名为类干酪乳杆菌BRAP-01，并且将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.2218。

又本发明提供一种用于抗过敏症状的微生物株，包括上述的类干酪乳杆菌BRAP-01。其使用形式可包括菌粉等，而菌粉的形成方法包括将培养的细菌经冷冻干燥等方式而得。在一实施例中，将菌种活化培养后利用冷冻干燥方式进行冻干。冻干菌粉粉末检测菌数须大于9.0×10¹⁰CFU/g，在一实施例中为大于1.0×10¹¹CFU/g。

而上述的过敏症状则包括气喘、过敏性鼻炎、异位性皮肤炎、过敏性结膜炎、食物过敏、荨麻疹及/或肠躁症等。上述菌株具抗过敏症状的功能为因其具有刺激细胞产生干扰素-γ的能力。

在一实施例中，可将上述的菌粉取约0.5-3g溶于5-20ml无菌水中，充分均匀混合后，形成菌粉混合液，以系列稀释方式，将菌粉混合液稀释至约9.0×10⁷-3.0×10⁸CFU/ml，接着置于约80-100℃中加热处理约2-8分钟，优选为置于95℃水浴槽中加热处理约5分钟，之后置于4℃备用。然后将经上述处理的菌粉与哺乳动物细胞进行共培养后，再测定细胞所产生的干扰素-γ的量，证实细胞所产生的干扰素-γ的量确实有增加的情形。上述的哺乳动物细胞可包括人类外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。在一实施例中，上述用于抗过敏症状的微生物株促进细胞所产生的干扰素-γ为原来的约6-12倍。

本发明也可将有效量的上述用于抗过敏症状的微生物株与赋形剂等组合以形成用于抗过敏症状的组合物。而赋形剂可为一般食品可添加或药学上可接受的赋形剂，包括乳糖(lactose)、干燥淀粉(starch)、淀粉糊(starch paste)、糊精(dextrin)、环糊精(cyclodextrin)、预胶化淀粉(pregelatinized starch)、羧甲基淀粉钠(carboxymethyl starch sodium)、羟丙基淀粉(hydroxypropy starch)、微品性纤维素(microcrystalline cellulose)、羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose)或麦芽糊精(maltodextrin)，优选为干燥淀粉、糊精、羧甲基纤维素或麦芽糊精。在一实施例中所使用的赋形剂为麦芽糊精。在此组合物中，上述用于抗过敏症状的微生物株的型态可包括菌粉，而菌粉可由冷冻干燥等方式而得。

此组合物也具抗过敏症状的功能，由于其具有刺激细胞产生干扰素-γ的能力。又其可抵抗的过敏症状则包括气喘、过敏性鼻炎、异位性皮肤炎、过敏性结膜炎、食物过敏、荨麻疹及/或肠躁症等。上述的细胞可包括人类外周血单核细胞。在一实施例中，上述用于抗过敏症状的组合物促进细胞所产生的干扰素-γ为原来的约6-12倍。

实施例

一、体外实验

实验方向

体外实验主要分成二部分进行，第一部分为具过敏症状的病患的血液样本分离出外周血单核细胞并将其与试剂或各菌株共同培养来观察病患的外周血单核细胞对试剂或各菌株所产生细胞激素的差异。第二部分为收集不同过敏症状的病患，分别将其外周血单核细胞进一步与试剂或各菌株共培养，以得知BRAP-01抗不同过敏症状的能力。

菌株制备

BRAP-01为筛选自婴儿粪便检体的菌种，该菌种经鉴定为类干酪乳杆菌，该菌种活化培养后，利用冷冻干燥方式进行冻干。冻干菌粉检测菌数须大于1.0×10¹¹CFU/g。进行细胞实验时，取1g菌粉溶于10ml无菌水中，充分均匀混合后，以系列稀释方式，将菌粉混合液稀释至2.0×10⁸CFU/ml，置于95℃水浴槽中加热处理5分钟后，置于4℃备用。实验中使用到的其它菌株的制备亦如上述。

人类外周血单核细胞制备

1.过敏病患血液样本收集

血液检体来自台湾高雄某诊所，共计52名过敏病患，其过敏症状由医师诊断告知，过敏症状包括：气喘(asthma)、过敏性鼻炎(allergic rhinitis)、异位性皮肤炎(dermatitis)、过敏性结膜炎(conjunctivitis)、食物过敏(food allergy)、荨麻疹(urticaria)、肠躁症(IBS，Irritable Bowel Syndrome)等，病患中有多数合并两种以上症状发生，不同过敏症状的病患分布如图5所示。

2.人类外周血单核细胞分离

抽取病患血液约10ml，将病患血液沿管壁缓慢加入含有聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)(BD Pharmacia，Cat.No.17-1400-02)的离心管中，以冷冻离心机进行离心(3000rpm，10分钟)来进行全血的血球分离，分界面处为外周血单核细胞，沉淀物为红血球。将取出的外周血单核细胞置于新的15ml离心管，并加入10ml 1×磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)至离心管中，以离心机进行离心(1500rpm，5分钟)，除去上清液，留下血球细胞沉淀。取10ml RPMI-1640培养基(含1％青霉素-链霉素(Penicillin-Streptomycin)及10％小牛血清)至离心管中，来回吸冲20次并避免气泡产生，使血球细胞均匀分布。取血球细胞悬浮液与台盼蓝(trypan blue)染剂等体积混合，以血球计数盘进行细胞计数。并以RPMI-1640培养基调整血球细胞悬浮液浓度为4.0×10⁶个细胞/ml。

人类外周血单核细胞与乳酸菌共同培养

进行共同培养时，取100μl血球细胞悬浮液及20μl菌株加于96孔盘细胞培养皿，每一个孔(well)含有200μl的混合液，将已加热处理的菌株与人类外周血单核细胞置于培养条件为37℃、5％CO₂细胞培养箱中一起培养48小时后，收集细胞培养液，分别置于2ml离心管，以2000rpm离心5分钟后，取上清液进行酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，测定干扰素-γ的浓度。

以酶联免疫吸附测定测量细胞上清液中的干扰素-γ

1.人类干扰素-γ浓度标准曲线

干扰素-γ标准储存液制备方法如下：将重组人类干扰素-γ(BD Pharmingen，Cat.No.554616)粉末溶解于无菌水中，调整其浓度至56ng/ml，并以每管50μl形式分装后储存于-70℃保存。取出一管浓度56ng/ml的干扰素-γ标号为1，参照图6，将干扰素-γ标准液进行序列稀释，分别取500μl稀释缓冲溶液(1×磷酸盐缓冲液)，加入标示为2、3、4、5、6及7的1.8ml微量离心管中备用。先以微量分注器将1号管加入1080μl的稀释缓冲溶液后，与重组人类干扰素-γ混合均匀。并依箭头指示依序进行干扰素-γ标准液的制备，并以稀释缓冲溶液作为干扰素-γ浓度为零的样品。依据上述方式稀释后使终浓度分别为1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml及31.3pg/ml。

2.细胞所产生的干扰素-γ浓度分析

取适量经纯化的抗-人类干扰素-γ(BD Pharmingen，Cat.No.551221)溶于缓冲液(coating buffer，0.1M Na₂HPO₄，pH 9.0)使得终浓度为2μg/ml，加150μl至每一格中；以胶膜封好，置于4℃中隔夜；次日用洗涤缓冲液(washingbuffer，0.05％Tween 20溶于磷酸盐缓冲液)冲洗每一格3次各3分钟；然后每格加入200μl填充缓冲液(blocking buffer，1％牛血清白蛋白(bovine serumalbumin，BSA)溶于磷酸盐缓冲液)，在37℃反应2小时，再用洗涤缓冲液冲洗每一格3次各3分钟；取样本100μl加入每一格中，于4℃放置隔夜；隔天用洗涤缓冲液冲洗每一格3次各3分钟，再分别加入100μl生物素(biotin)小鼠抗-人类干扰素-γ(BD Pharmingen，Cat No.554550，0.5μg/ml)(1000倍稀释)至每格中，37℃2小时；然后用洗涤缓冲液冲洗每一格3次各3分钟；加入100μl抗生物素蛋白链菌素-碱性磷酸酶(Streptavidin-alkaline phosphatase)(1∶2000)至每格中，37℃1小时；洗涤缓冲液冲洗每一格3次各3分钟，最后加入90μl pNPP(BD Pharmingen，磷酸对硝基苯酯(p-Nitrophenylphosphate)，二钠(di-sodium))至每格中呈色，呈色结果以波长405nm进行读取，读取数值与标准曲线进行浓度换算。

不同菌株刺激具过敏症状病患的人类外周血单核细胞分泌干扰素-γ的比较

将病患的人类外周血单核细胞分成五组进行共同培养来分析试剂或各菌株对刺激细胞产生干扰素-γ能力的差异。第一组为空白组，第二组加入植物白细胞凝集素(Leucoagglutinin，PHA-L)(Sigma L2769)(10μg/ml)为正控制组，第三组加入文献中已证实具有抗敏功效的益生菌，鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)GG(LGG)，ATCC 53103)，第四组为加入分离株BRAP-01，第五组为加入类干酪乳杆菌33，(LP33)。结果如第7图所示。利用人类外周血单核细胞与热处理乳酸菌共同培养后进行干扰素-γ分析，其结果为空白组：578.8±56.47；PHA：1359.0±49.97；LGG：2386.0±31.9；BRAP-01：5495.0±279.1；类干酪乳杆菌33：3315.0±149.9。由上述结果可得知BRAP-01确实能刺激大量干扰素-γ分泌，且分泌量约为LGG的2.5倍，显示类干酪乳杆菌BRAP-01确实有减轻过敏症状的潜力。

不同菌株刺激具不同过敏症状病患的人类外周血单核细胞分泌干扰素-γ 的比较

将具不同过敏症状的病患的人类外周血单核细胞分别分成五组进行共同培养来分析试剂或各菌株对刺激细胞产生干扰素-γ能力的差异。第一组为空白组，第二组加入植物白细胞凝集素(10μg/ml)为正控制组，第三组加入文献中已证实具有抗敏功效的益生菌，鼠李糖乳杆菌GG(LGG，ATCC 53103)，第四组为加入分离株BRAP-01，第五组为加入类干酪乳杆菌33(LP33)，其结果依据分泌干扰素-γ进行比较(以酶联免疫吸附测定单位(ELISA Unit)进行相对值比较，

并以酶联免疫吸附测定单位进行等级区分，＜50％：+；50～100％：++；101％～：+++，结果如表2所示。

表2、不同菌株刺激病患人类外周血单核细胞分泌干扰素-γ的相对值(酶联免疫吸附测定单位)

过敏症状	病患样本数	LGG	BRAP-01	LP33
					气喘	5	+	++	+
过敏性鼻炎	39	+	+++	+
					异位性皮肤炎	12	+	++	+
过敏性结膜炎	7	+	++	+
					食物过敏	7	+	+++	+
荨麻疹	5	+	++	+
					肠躁症	1	-	++	-

依据相对值分布结果，LGG及类干酪乳杆菌33对于具有过敏症状的病患均具有刺激作用，但以BRAP-01较强，显示BRAP-01对于七大过敏症状的病患均具有调控Th1/Th2的作用，刺激干扰素-γ产生。

二、临床实验

利用类干酪乳杆菌BRAP-01进行过敏性鼻炎非正式临床试验

1.受试者

受试者以居住在台湾高雄市且能定期在门诊追踪治疗者为优先，且需符合以下条件：年龄5岁以上、患有过敏性鼻炎至少一年以上、对家尘过敏原皮肤测试呈阳性反应且患者愿意接受临床研究评估。若有下列情形，则不列入研究：准备或正在怀孕中妇女病患、正使用全身性类固醇患者、近半年有抽烟习惯、患有精神障碍者、先天免疫不全的患者、对牛奶过敏者。

而如有下列情形发生，受试者可提早退出实验：急性细菌性或病毒感染并发鼻窦炎、行政因素，如搬家、经济因素、或不合作、有不良反应等。受试者共20位，实验时间为30天。

2.BRAP-01菌粉胶囊制备

取类干酪乳杆菌BRAP-01冷冻管进行活化放大后，添加冷冻保护剂进行冷冻干燥后，以系列稀释方法检测其菌数，菌数须达1.0×10¹¹CFU/g。菌粉制备符合规格后，将菌粉添加麦芽糊精作为赋形剂后充填胶囊，使每颗胶囊菌数大于5×10⁹CFU/g。

3.研究设计

本试验自2007年2月19日开始至2007年4月16日结束。在高雄某诊所进行实验。受试者筛选期为期两周，用来收集病患基本资料包括姓名、住址、年龄、过敏性鼻炎病程及鼻炎评分表，总共筛选20名具有过敏鼻炎的病患进行试验。

在第二次门诊时(基准期)首先再确认病患资料，并填写第一次鼻炎评分表，之后每日食用三颗胶囊，30天后请受试者再填写第二次鼻炎评分表，并依据受试者所填写鼻炎评分结果进行分析。

4.鼻炎评分表

此表修改自Juniper等的小儿鼻结膜炎生活品质评分表(PediatricRhinoconjunctivitis Quality of Life Questionnaire，PRQLQ)^[13]。这份简易鼻炎评分表内容含6个过敏性鼻炎主要症状(包含鼻塞、打喷嚏、易流鼻水、鼻子痒、鼻涕倒流、揉眼睛及鼻子、擤鼻涕)，每个问题以5分定等级。在频率方面，0分为没有、1分为不常、2分为有时候、3分为常常、4分为每天；在困扰程度方面，0分为没有、1分为不常、2分为有时候、3分为常常、4分为每天，受试者共填写两份问卷，每份问卷约可在10分钟内完成。

5.统计方法

资料收集后，以免费试用版统计软件SPSS 10.0版(SPSS Inc.Headquarters，233S.Wacker Drive，11th floor，Chicago，Illinois 60606)进行资料分析，以Wilcoxon-符号等级检定法(Wilcoxon Signed Rank Test)统计，分析后P值＜0.05具统计上显著差异意义，主要评估依据是所有病患对简易鼻炎评分表上每个项目的分数的平均，所有数据以平均±标准差(Mean±SEM)来表示，结果如表3所示。

表3、人体试验分析结果(受试人数N＝20)

		试验前(分数)	试验后(分数)	P值
					频率	鼻塞	2.60±0.22	1.90±0.16	0.002^*
打喷嚏	2.55±0.22	2.00±0.19	0.005^*
				易流鼻水		2.80±0.19	1.90±0.19	0.000^*
鼻子痒	2.70±0.19	1.75±0.20	0.001^*
				鼻涕倒流		2.10±0.27	1.70±0.21	0.073
揉眼睛及鼻子	2.60±0.29	1.80±0.21	0.006^*
				擤鼻涕		2.20±0.28	1.30±0.18	0.003^*
总分	17.55±0.47	12.35±0.20	0.000^*
				困扰程度		鼻塞	2.70±0.23	1.55±0.15	0.000^*
打喷嚏	2.35±0.21	1.40±0.18	0.003^*
					易流鼻水	2.35±0.23	1.35±0.18	0.002^*
鼻子痒	2.30±0.23	1.25±0.18	0.001^*
					鼻涕倒流	2.00±0.27	1.15±0.17	0.003^*
揉眼睛及鼻子	1.90±0.30	0.95±0.20	0.003^*
					擤鼻涕	1.80±0.33	0.80±0.16	0.003^*
总分	15.40±0.62	8.45±0.05	0.000^*

^*P值＜0.01

6.结果

受试者食用含有BRAP-01菌粉的胶囊30天后，比较食用前后过敏性鼻炎相关症状是否具有差异情形。由表3可知，就症状发生频率，在鼻塞、打喷嚏、易流鼻水、揉眼睛及鼻子及擤鼻涕等均具有统计上显着差异(P值＜0.01)。而在症状困扰程度上，受试者在所有症状上均有显着差异，显示受试者在食用含有BRAP-01菌粉的胶囊30天后，每一症状发生频率及困扰程度上均有明显的改善(P值＜0.01)，且所有症状发生频率及困扰程度明显下降，表示食用BRAP-01确实能使过敏性鼻炎患者除了降低症状发生频率之外，还具有改善生活品质的能力。所有的受试者均完成30天的实验，在实验期间内没有严重不良的反应产生。

虽然本发明已以优选实施例批露如上，然其并非用以限定本发明，任何本领域的技术人员，在不脱离本发明之精神和范围内，可作一些更动与润饰，因此本发明的保护范围应以所附的权利要求所界定者为准。

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序列表

Claims

1.一种经分离的微生物株，命名为类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)BRAP-01，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.2218。

2.命名为类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)BRAP-01的经分离的微生物株在制备用于抗过敏症状的组合物中的用途，其中该经分离的微生物株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.2218。

3.权利要求2所述的用途，其中该微生物株的形式为菌粉。

4.权利要求3所述的用途，其中该菌粉是通过冷冻干燥而得。

5.权利要求2所述的用途，其中该过敏症状包括气喘、过敏性鼻炎、异位性皮肤炎、过敏性结膜炎、食物过敏、荨麻疹及/或肠躁症。

6.权利要求2所述的用途，其中该微生物株具有刺激人类外周血单核细胞产生干扰素-γ的能力。

7.权利要求2所述的用途，其中该微生物株促进人类外周血单核细胞产生的干扰素-γ为原来的6-12倍。

8.一种用于抗过敏症状的组合物，包括：

有效量的权利要求1所述的经分离的微生物株；以及

赋形剂。

9.权利要求8所述的用于抗过敏症状的组合物，其中该微生物株的形式为菌粉。

10.权利要求9所述的用于抗过敏症状的组合物，其中该菌粉是通过冷冻干燥而得。

11.权利要求8所述的用于抗过敏症状的组合物，其中该过敏症状包括气喘、过敏性鼻炎、异位性皮肤炎、过敏性结膜炎、食物过敏、荨麻疹及/或肠躁症。

12.权利要求8所述的用于抗过敏症状的组合物，其具有刺激人类外周血单核细胞产生干扰素-γ之能力。

13.权利要求8所述的用于抗过敏症状的组合物，其促进人类外周血单核细胞所产生的干扰素-γ为原来的6-12倍。

14.权利要求8所述的用于抗过敏症状的组合物，其中该赋形剂包括乳糖、干燥淀粉、淀粉糊、糊精、环糊精、预胶化淀粉、羧甲基淀粉钠、羧基淀粉丙酸酯、微晶性纤维素、羧甲基纤维素或麦芽糊精。

15.一种刺激细胞产生干扰素-γ的方法，包括：

提供哺乳动物细胞；

将该哺乳动物细胞与经热处理的权利要求1所述的微生物株进行共培养；

其中，该哺乳动物细胞是人类外周血单核细胞。

16.权利要求15所述的刺激细胞产生干扰素-γ的方法，该方法促进该人类外周血单核细胞所产生的干扰素-γ为原来的6-12倍。