ES2318848T3 - Peptidos que se unen a pan dr para potenciar la respuesta inmunitaria. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA COMPOSICIONES Y METODOS PARA INHIBIR O INDUCIR LA ACTIVACION DE CELULAS T EN UN PACIENTE. LOS METODOS INCLUYEN LA ADMINISTRACION DE UNA DOSIS TERAPEUTICAMENTE EFICAZ DE COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE INCLUYEN UN SOPORTE FARMACEUTICAMENTE ACEPTABLE Y PEPTIDOS DE ENTRE APROXIMADAMENTE 4 Y 20 RESIDUOS, QUE UNEN LUGARES DE UNION DE ANTIGENO EN MOLECULAS MHC CODIFICADAS POR, SUSTANCIALMENTE, TODOS LOS ALELOS DE UN LUGAR DR. SE REFIERE A ESTOS PEPTIDOS COMO PEPTIDOS DR-DE UNION SOBRE UN SOPORTE. ESTOS PUEDEN SER UTILIZADOS PARA INHIBIR LAS REPUESTAS INMUNES ASOCIADAS CON LAS INMUNOPATOLOGIAS, COMO LA AUTOINMUNIDAD, EL RECHAZO DE ALOINJERTOS Y LAS RESPUESTAS ALERGICAS. LOS PEPTIDOS PUEDEN SER UTILIZADOS TAMBIEN EN COMBINACION CON PEPTIDOS CTL PARA REFORZAR LA RESPUESTA CTL.

Description

Péptidos que se unen a pan DR para potenciar la respuesta inmunitaria.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a composiciones para prevenir o tratar un número de estados patológicos tales como enfermedades víricas y cánceres. En particular, proporciona péptidos novedosos con capacidad de unirse a moléculas seleccionadas de complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) e inducir una respuesta inmunitaria, y el uso de dichos péptidos para la fabricación de un medicamento para potenciar una respuesta inmunitaria contra un inmunógeno administrado.

Las moléculas de MHC se clasifican como moléculas de clase I o de clase II. Las moléculas de MHC de clase II son expresadas por células presentadoras de antígeno (APC) especializadas tales como macrófagos, células dendríticas, o linfocitos B. Las moléculas de MHC de clase II habitualmente están asociadas a fragmentos de péptidos derivados del procesamiento de antígenos proteínicos que penetran en la ruta endocitaria desde el exterior de las APC. Los complejos de MHC y péptido son presentados posteriormente para ser examinados por los linfocitos T cooperadores CD4+ T que entonces son activados, proliferan y amplifican la respuesta inmunitaria contra el péptido inmunógeno particular que se presenta. La activación de los linfocitos T requiere que se implique el receptor de linfocitos T (TCR) mediante su ligando, un complejo bimolecular de una molécula de MHC y un antígeno peptídico (Shimonkevitz, y cols., J. Immunol. 133, 2067-2074 (1984); Babbitt, y cols., Nature 317, 359-361 (1985); Buus, y cols., Cell 47, 1071-1077 (1986); Townsend, A., y Bodmer, H., Annu. Rev. Immunol. 7, 601-624.

La activación inapropiada de los linfocitos T es un componente de un número de inmunopatologías, tales como autoinmunitarias, rechazo de aloinjertos y respuestas alérgicas. Las enfermedades autoinmunitarias ejemplares incluyen artritis reumatoide, esclerosis múltiple, y miastenia grave. Las respuestas alérgicas que implican la activación de linfocitos T incluyen alergias a diversos pólenes, ácaros del polvo y similares. Además, las enfermedades infecciosas externas pueden provocar patologías inmunitarias (por ejemplo, enfermedad de lyme, hepatitis, LCMV, endocarditis post estreptocócica, o glomerulonefritis). Las hipersensibilidades alimentarias, tales como enfermedad celíaca y enfermedad de Crohn, así como otras enfermedades alérgicas, se han asociado con alelos particulares de MHC o se sospecha que tienen un componente autoinmunitario.

La estrategia que se usa más habitualmente para tratar estas afecciones es suprimir el sistema inmunitario, habitualmente usando fármacos inmunosupresores. Se ha propuesto otra estrategia para los casos en los que se conoce el alelo de MHC asociado a la afección, que supone el bloqueo selectivo de un alelo de MHC dado. Sin embargo, cuando están implicadas un número de restricciones de MHC, deben encontrarse estrategias distintas del bloqueo selectivo.

Se han realizado estudios inmunoquímicos sobre los requisitos para que los péptidos se unan a las moléculas de clase II. Se han definido los motivos de unión de diversos alelos de MHC de clase II murinos y humanos, y también recientemente se han descrito análisis de motivos por secuenciación de péptidos procesados de forma natural para diversos tipos de clase II (Rudensky y cols., Nature 353, 622-627 (1991); Chicz y cols., Nature 358, 764-768 (1992); Hunt y cols., Science 256, 1817-1820 (1992); Rudensky y cols., Nature 359, 429-431 (1992)).

En el caso de las moléculas de DR en particular, se ha demostrado (Brown y cols., Nature 364, 33-39 (1993)) que una gran ancla hidrófoba que se engrana en un bolsillo hidrófobo correspondiente de la hendidura de unión de MHC es el determinante más crucial de las interacciones entre péptido y DR. Otras anclas diversas desempeñan papeles definidos, pero menos destacados y ayudan a determinar la especificidad de los alelos. Recientemente también se ha enfatizado que el esqueleto peptídico de la mitad del extremo C de la molécula peptídica se engrana mediante puentes de hidrógeno directos con las paredes de la hendidura de unión de MHC (Krieger y cols., J. Immunol. 146, 2331-2340 (1991)); O'Sullivan y cols., J. Immunol. 146, 1240-1246 (1991); y O'Sullivan y cols., J. Immunol. 147, 2663-2669 (1991).

Aunque los restos polimorfos específicos de alelo que tapizan los bolsillos de unión de péptidos de los alelos de MHC tienden a dotar a cada alelo de la capacidad de unirse a un único conjunto de péptidos, hay muchos casos en los que se ha demostrado que un péptido dado se une a más de una especificidad de MHC. Esto se ha documentado en el caso del isotipo de DR humano, en el que se ha observado que diversos alelos de DR parecen reconocer motivos similares, e independientemente, diversos investigadores reseñaron una unión y/o reconocimiento degenerados de ciertos epítopos en el contexto de tipos múltiples de DR, que sugerían el concepto de que ciertos péptidos pueden representar epítopos "universales" (Busch y cols., Int. Immunol. 2, 443-451 (1990); Panina-Bordignon y cols., Eur. J. Immunol. 19, 2237-2242 (1989); Sinigaglia y cols., Nature 336, 778-780, (1988); O'Sullivan y cols., J. Immunol. 147, 2663-2669 (1991) Roache y cols., J. Immunol. 144, 1849-1856 (1991); Hill y cols., J. Immunol. 147, 189-197 (1991)). Sin embargo, aunque los epítopos reseñados anteriormente sí tienen la capacidad de unirse a diversos alelos de DR, no son en modo alguno universales.

La presente invención proporciona péptidos que se unen a DR, denominados "péptidos que se unen a pan DR" que son reconocidos por un amplio patrón de alelos de DR. De acuerdo con la presente invención, dichos péptidos que se unen a pan DR pueden usarse como inmunógenos potentes para los linfocitos T restringidos a la clase II, y como vacunas basadas en péptidos humanos o agentes terapéuticos útiles.

Sumario de la invención

La presente solicitud de patente describe composiciones y procedimientos de inducir la activación de linfocitos T en un paciente. Los procedimientos comprenden administrar una dosis terapéuticamente eficaz de composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable y un péptido que se une a sitios de unión de antígenos en moléculas de MHC codificadas por sustancialmente todos los alelos de un locus de DR. Estos péptidos se denominan péptidos que se unen a pan DR. Los péptidos que se unen a pan DR se usan para potenciar una respuesta inmunitaria; el péptido pan DR puede actuar como péptido de linfocito T cooperador y administrarse con un péptido inductor de CTL (linfocitos T citotóxicos). El péptido de linfocito T cooperador puede estar ligado al péptido inductor de CTL formando un conjugado de péptido de CTL y linfocito T cooperador. Los conjugados también pueden estar modificados adicionalmente. Por ejemplo, el conjugado puede estar acetilado, palmitilado o acilado con un ácido graso o ligado a un vehículo. El péptido de CTL también puede estar ligado al péptido del linfocito T cooperador mediante una molécula espaciadora, tal como Ala-Ala-Ala. De forma alternativa, los péptidos pan DR pueden usarse para aumentar las respuestas de anticuerpos. Al igual que con la inducción de las respuestas de CTL, los péptidos pan DR pueden administrarse o bien ligados o mezclados con determinantes inductores de
anticuerpos.

Los péptidos pan DR pueden describirse usando diversas convenciones. Los péptidos pan DR de acuerdo con la invención tienen la fórmula R_{1}-R_{2}-R_{3}-R_{4}-R_{5}, en dirección desde el extremo amino del péptido (R_{1}) al extremo carboxi (R_{5}), donde R_{1} es un D-aminoácido seguido de lisina; R_{2} es ciclohexilalanina, tirosina, o fenilalanina; R_{3} es 3 aminoácidos cada uno de los cuales se selecciona independientemente a partir del grupo constituido por alanina, isoleucina, serina y valina;

R_{4} es triptófano-treonina-leucina-lisina; y R_{5} está constituido por 2 aminoácidos seguidos de un D-aminoácido, donde cada uno de los 2 aminoácidos se selecciona independientemente a partir del grupo constituido por alanina, serina y valina. De acuerdo con esta fórmula, los péptidos pan DR más preferidos tienen la fórmula R_{1}-R_{2}-R_{3}-R_{4}-R_{5}, donde R_{1} es D-alanina seguida de lisina; R_{2} es ciclohexilalanina o fenilalanina; R_{3} es 3 aminoácidos cada uno de los cuales se selecciona a partir del grupo que comprende alanina, isoleucina, y valina; R_{4} es triptófano-treonina-leucina-lisina; y R_{5} es 2 alaninas seguidas de D-alanina.

Los péptidos pan DR también pueden describirse usando el código de una letra para los aminoácidos que habitualmente se encuentra en las proteínas y que especifica una denominación de D-aminoácidos o de aminoácidos no habituales. Usando esta convención, los péptidos pan DR preferidos de la invención incluyen los siguientes: oK(X)VZZWTLKZZo, y oKFVZZWTLKZZo en los que o es un D-aminoácido, Z es alanina, serina o valina, K es lisina, T es treonina, L es leucina, W es triptófano, y (X) es ciclohexilalanina, tirosina o fenilalanina. Los péptidos pan DR más preferidos incluyen aK(X)VAAWTLKAAa, y aKFVAAWTLKAAa en los que a es D-alanina, A es alanina, (X) es ciclohexilalanina, K es lisina, T es treonina, L es leucina, V es valina, I es isoleucina, W es triptófano.

Breve descripción de las figuras

Las Figuras 1A-1F muestran respuestas representativas para tres de doce donantes diferentes. Respuestas de linfocitos T específicas de antígeno de líneas de linfocitos T PBMC humanas generadas el día 0 mediante la adición o bien de péptido 965.10 (cuadrado negro), 906.09 (cuadrado blanco), 760.50 (círculo negro), o toxoide del tétanos 830-843 (círculo blanco) evaluadas el día 14 (segunda estimulación, Figuras 1A, 1B, 1C) y el día 28 (tercera estimulación, Figuras 1D, 1E, 1F). Se muestran los resultados representativos de dos experimentos independientes.

Las Figuras 2A y 2B muestran resúmenes de respuestas de linfocitos T específicas de antígeno de PBMC humanos. La Figura 2A muestra los resultados de una segunda estimulación, y la Figura 2B muestra los resultados de una tercera estimulación. La \Delta cpm máxima obtenida se representa en el eje de ordenadas.

Las Figuras 3A-3F muestran la capacidad inmunógena in vivo de diversos epítopos peptídicos medidas según la capacidad de proliferación de linfocitos T en los nódulos linfáticos murinos estimulados. Se inyectaron 20 \mug/ratón (triángulo blanco), 1 \mug/ratón (cuadrado negro), 50 ng/ratón (cuadrado blanco), 2,5 ng/ratón (círculo negro), o 0,125 ng/ratón (círculo blanco) de TT 830-843 (Figura 3A), Ova 323-336 (Figura 3B), HBVc 128-140 (Figura 3C), 965.10 (Figura 3D), 1024.03 (Figura 3E), y 760.50 (Figura 3F) a ratones C57BL/6J. Diez días después, se extrajeron los nódulos linfáticos que drenaban la zona de inyección y se realizaron ensayos de proliferación de linfocitos T tal como se describe en el Ejemplo 9. Se muestran los resultados representativos de dos experimentos independientes.

Definiciones

Un oligopéptido o péptido tal como se usa en el presente documento se refiere a una cadena de habitualmente menos de aproximadamente treinta restos aminoacídicos, o bien en sus formas neutras (sin carga) o en formas que son sales, y o bien sin modificaciones tales como glicosilación, oxidación de cadenas laterales, o fosforilación o que contienen estas modificaciones, con la condición de que la modificación no destruye la actividad biológica de los polipéptidos tal como se describe en el presente documento.

Cuando se hace referencia a un resto aminoacídico en un péptido, oligopéptido o proteína los términos "resto aminoacídico", "aminoácido" y "resto" se usan de forma intercambiable y, tal como se usa en el presente documento, quieren decir un aminoácido o mimético de aminoácido unido covalentemente a al menos otro aminoácido o mimético de aminoácido a través de un enlace amida o mimético de enlace amida.

Tal como se usa en el presente documento, el término "aminoácido", cuando no se califica, se refiere a un "L-aminoácido" o mimético de L-aminoácido.

Aunque los péptidos preferiblemente estarán sustancialmente libres de otras proteínas naturales y sus fragmentos, en algunas realizaciones los péptidos pueden ser conjugados mediante síntesis a fragmentos o partículas nativos.

Por actividad biológica se quiere decir la capacidad de unirse a una molécula de MHC apropiada e inducir una respuesta de linfocitos T cooperadores, que a su vez ayuda a inducir una respuesta de CTL contra un antígeno o mimético de antígeno diana.

Un "péptido que se une a pan DR" de la invención es un péptido capaz de unirse a al menos aproximadamente 7 de los 12 alelos más comunes de DR (DR1, 2w2b, 2w2a, 3, 4w4, 4w14, 5, 7, 52a, 52b, 52c, y 53) con afinidad elevada. "Afinidad elevada" se define aquí como la unión con un CI_{50}% inferior a 300 nM.

En toda esta descripción, los resultados se expresan en términos de CI_{50}. Dadas las condiciones en las que se realizan los ensayos (es decir, limitando las concentraciones de MHC y de péptidos marcados), estos valores son aproximados a los valores de K_{D}. Debería observarse que los valores de CI_{50} pueden cambiar, a menudo de forma espectacular, si se varían las condiciones del ensayo, y dependiendo de los reactivos particulares que se usen (por ejemplo, preparación de MHC, etc.). Por ejemplo, las concentraciones excesivas de MHC aumentarán la CI_{50} medida aparente de un ligando dado.

Una forma alternativa de expresar los datos de unión, para evitar estas incertidumbres, es como valor relativo con respecto a un péptido de referencia. El péptido de referencia se incluye en todos los ensayos. Cuando un ensayo particular se vuelve más, o menos sensible, las CI_{50} de los péptidos analizados pueden cambiar algo. Sin embargo, la unión relativa al péptido de referencia no cambiará. Por ejemplo, en un ensayo que se realiza en unas condiciones tales que la CI_{50} del péptido de referencia aumenta 10 veces, todos los valores de CI_{50} también cambiarán en aproximadamente 10 veces. Por lo tanto, para evitar ambigüedades, la evaluación de si un péptido presenta una unión buena, intermedia, débil o negativa debería basarse en su CI_{50}, relativa a la CI_{50} del péptido patrón.

Si la CI_{50} del péptido patrón medida en un ensayo particular es diferente de la que se reseña en la Tabla I,

TABLA I

1

entonces debería entenderse que los valores umbral que se usan para determinar los compuestos que presentan una unión buena, intermedia, débil y negativa deberían modificarse por un factor correspondiente.

Un "péptido inductor de CTL" de la presente invención es uno que se deriva de regiones epitópicas seleccionadas de antígenos diana potenciales, tales como antígenos asociados a tumores, que incluyen, pero sin limitación, carcinoma renal, cáncer de mama, antígenos carcinoembrionarios, antígenos de melanoma (MAGE-1), y antígeno específico de cáncer de próstata, antígenos de hepatitis C, antígenos del virus de Epstein-Barr, antígenos de VIH-1 y VIH-2, y antígenos del virus del papiloma.

Las frases "aislado o biológicamente puro" se refiere a un material que está sustancialmente o esencialmente libre de componentes que normalmente lo acompañan como se encuentran en su estado nativo. Así, los péptidos de la presente invención no contienen materiales que se asocian normalmente a su entorno in situ, por ejemplo, las moléculas de MHC de clase I en las células presentadoras de antígeno. Incluso cuando se ha aislado una proteína en una banda homogénea o dominante, existen trazas de contaminantes en el intervalo del 5-10% de la proteína nativa que se purifican a la vez con la proteína deseada. Los péptidos aislados de esta invención no contienen dicha proteína copurificada endógena.

El término "clon de linfocito T" se refiere a un grupo de linfocitos T que son progenie de un único linfocito virgen y que expresan proteínas de receptores en inmunoglobulinas o linfocitos T. El término linfocito "virgen" se usa aquí como se usa en Stites y cols. Basic and Clinical Immunology, 8ª Edición, Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey (1994) que se incorpora al presente documento por referencia.

Un "péptido T cooperador" tal como se usa en el presente documento se refiere a un péptido que reconoce el receptor de los linfocitos T de los linfocitos T cooperadores. Los péptidos T cooperadores de la presente invención son péptidos que se unen a pan DR.

Descripción de la realización preferida

Los péptidos pan DR son de utilidad como componente adyuvante en cualquier formulación de vacuna para potenciar una respuesta inmunitaria contra un inmunógeno administrado. Por ejemplo, los péptidos que se unen a pan DR se administran con péptidos que inducen CTL para inducir una respuesta de CTL contra, por ejemplo, células infectadas con virus. De forma alternativa, los péptidos que se unen a pan DR se conjugan con un péptido que induce CTL y se administran para inducir una respuesta de CTL. En otra realización, los péptidos pan DR se conjugan con péptidos que inducen anticuerpos o se mezclan con un péptido que induce anticuerpos. El uso de péptidos cooperadores para potenciar las respuestas de anticuerpos contra determinantes particulares se describe por ejemplo en Hervas-Stubbs y cols. Vaccine 12:867-871 (1994). Los péptidos cooperadores per se son también conocidos a partir del documento EP 534615.

La nomenclatura que se usa para describir los compuestos peptídicos sigue la práctica convencional en la que el grupo amino se presenta a la izquierda (el extremo N) y el grupo carboxilo a la derecha (el extremo C) de cada resto aminoacídico. En las fórmulas de las estructuras de los aminoácidos, cada resto generalmente se representa mediante denominaciones estándar de tres letras o de una letra. La forma L de un resto aminoacídico se representa mediante una única letra en mayúsculas o una primera letra en mayúsculas de un símbolo de tres letras, y la forma D de los aminoácidos que tienen formas D se representa mediante una única letra minúscula o un símbolo de tres letras en minúscula. La glicina no tiene ningún átomo de carbono asimétrico y se denomina simplemente "Gly" o G.

Los péptidos de la invención pueden prepararse en una gran variedad de formas. Debido a su tamaño relativamente corto, los péptidos pueden sintetizarse en solución o sobre un soporte sólido de acuerdo con técnicas convencionales. Los diversos sintetizadores automáticos están disponibles comercialmente y pueden usarse de acuerdo con protocolos conocidos. Véase, por ejemplo, Stewart y Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2ª ed., Pierce Chemical Co. (1984), referencia anterior.

Péptidos que se unen a pan DR

La presente solicitud de patente describe procedimientos de utilidad para la identificación de modificaciones a un péptido inicial que amplía su especificidad. Por ejemplo, la solicitud de patente internacional WO 92/02543, que se incorpora al presente documento por referencia, describe procedimientos adecuados para identificar péptidos con capacidad de unión a moléculas de DR. Esta solicitud de patente describe el uso de hemaglutinina de virus influenza ("HA"), como fuente de los péptidos que reaccionan específicamente con HLA-DR. Se tamizan porciones de la proteína para determinar su reactividad para proporcionar secuencias que se unen a la molécula de DR apropiada, tal como DR1, DR4w4 o DR4w14.

Una vez se identifica un antígeno o péptido del mismo que se une a la molécula de MHC seleccionada, puede determinarse una "núcleo de la región de unión" del antígeno o péptido, por ejemplo, sintetizando péptidos superpuestos, y/o empleando deleciones (truncados) o adiciones en el extremo N o en el extremo C. Para determinar un núcleo de la región de unión y los restos de contacto críticos, pueden emplearse sustituciones para determinar el efecto de la carga electroestática, capacidad hidrófoba, etc. sobre la unión.

Dentro de la región de núcleo, pueden identificarse los "sitios de contacto críticos", es decir, aquellos restos (o sus equivalentes funcionales) que deben estar presente en el péptido para mantener la capacidad de unirse a una molécula de MHC e inhibir la presentación al linfocito T, mediante sustituciones, deleciones, o inserciones de un único aminoácido. Además, también se pueden realizar barridos sistemáticos con un aminoácido específico (por ejemplo, Ala) para sondar las contribuciones de las cadenas laterales de los restos de contacto críticos.

El efecto de las sustituciones de aminoácidos únicos también pueden sondarse usando D-aminoácidos. Dichas sustituciones pueden hacerse usando procedimientos de síntesis peptídica bien conocidos, como se describe por ejemplo, en Merrifield, Science 232:341-347 (1986), Barany y Merrifield, The Peptides, Gross y Meienhofer, editores. (N.Y., Academic Press), páginas 1-284 (1979); y Stewart y Young, Solid Phase Peptide Synthesis, (Rockford, III., Pierce), 2ª Ed. (1984), que se incorporan por referencia al presente documento.

Los péptidos que se emplean en la presente invención no tienen que ser idénticos a los péptidos que se describen en la sección de Ejemplos, más adelante, ni a una secuencia de proteínas antigénicas particulares de los péptidos de CTL, en tanto en cuanto los presentes compuestos sean capaces de unirse a las moléculas de MHC apropiadas de de proporcionar actividad de los linfocitos T citotóxicos contra la proteína antigénica diana y en tanto en cuanto los péptidos pan DR entren en las fórmulas de las reivindicaciones. Así, una persona de experiencia reconocerá que puede realizarse un número de sustituciones conservadoras sin afectar sustancialmente a la actividad del péptido. Las sustituciones conservadoras son las que suponen sustituir un resto aminoacídico por otro que sea biológicamente y/o químicamente similar, por ejemplo, un resto hidrófobo por otro, o un resto polar por otro.

Usando la estrategia general que se describe anteriormente, puede determinarse un motivo de unión para un alelo de MHC particular. Para ampliar la especificidad del péptido que muestra afinidad elevada por uno o más alelos, se practican modificaciones como se describe anteriormente y los péptidos resultantes se analizan posteriormente para determinar la unión. Después se seleccionan los péptidos modificados que muestran una unión a alelos de MHC particulares significativamente superior. Las modificaciones pueden practicarse de una forma más o menos aleatoria. Una estrategia para modificar el péptido inicial es combinar los motivos de unión de dos o más alelos.

Puede usarse otra estrategia en la que se insertan restos de anclaje que contienen cadenas laterales críticas para la unión al MHC en un péptido de polialanina de 13 restos. Esta estrategia ha sido usada por Jardetzky y cols., Nature 353, 326-329 (1990), que demostraron que un péptido de polialanina que se modificaba con un único resto de contacto de MHC dominante (Tyr) confería al péptido una capacidad de unión de afinidad elevada por DR1. En lugar de usar tirosina como principal resto de contacto con MHC, también puede usarse ciclohexilalanina o fenilalanina. Estos restos son intercambiables con Tyr con respecto a la capacidad del péptido de unirse a los alelos de DR que tienen capacidad de unirse con afinidad elevada al péptido HA, y además también permiten la unión a moléculas de MHC que contenían una sustitución G-V en el 86 de la cadena \beta de DR. Este cambio afecta a la especificidad de unión del bolsillo de unión B en los MHC de clase II de tal forma que la tirosina ya no es capaz de unirse eficazmente, mientras que la ciclohexilalanina, así como la fenilalanina, pueden unirse.

La actividad biológica de los péptidos puede evaluarse en una variedad de sistemas.

Se conoce un gran número de células con moléculas de MHC definidas, particularmente moléculas de MHC de clase II, y están disponibles fácilmente, por ejemplo, en la American Type Culture Collection ("Catalogue of Cell Lines and Hybridomas," 6ª edición (1988) Rockville, Mariland, EE. UU.., que se incorpora al presente documento por referencia.

La estabilidad puede ensayarse de numerosas formas. Por ejemplo, se han usado peptidasas y diversos medios biológicos, tales como plasma y suero humanos, para analizar la estabilidad. Véase, por ejemplo, Verhoef y cols., Eur. J. Drug Metab. Pharmacokin. 11, 291-302 (1986); Walter y cols., Proc. Soc Exp. Biol. Med. 148, 98-103 (1975); Witter y cols., Neuroendocrinology 30, 377-381 (1980); Verhoef y cols., J. Endocrinology 110, 557-562 (1986); Handa y cols., Eur. J. Pharmacol. 70, 531-540 (1981); Bizzozero y cols., Eur. J. Biochem. 122, 251-258 (1982); Chang, Eur. J. Biochem. 151, 217-224 (1985), todos los cuales se incorporan al presente documento por referencia.

La estabilidad se aumenta introduciendo restos aminoacídicos D en los extremos C y N del péptido. Los estudios anteriores han indicado que la semivida de los péptidos in vivo e in vitro, cuando se incuban en medio que contiene suero pueden extenderse de forma considerable haciendo que los péptidos sean resistentes a la actividad de exopeptidasa introduciendo D-aminoácidos en los extremos C y N.

\vskip1.000000\baselineskip

Péptidos de CTL

Los péptidos de CTL pueden administrarse con los péptidos pan DR de la invención para potenciar una respuesta inmunitaria. Pueden usarse los epítopos de CTL de un número de proteínas antigénicas en los conjugados de la presente invención. Los ejemplos de antígenos adecuados incluyen antígeno protático específico (PSA), antígenos nuclear y superficial de la hepatitis B (HBVc, HBVs) antígenos de la hepatitis C, antígenos del virus de Epstein-Barr, antígenos de melanoma (por ejemplo, MAGE-1), antígenos del virus de la inmunodeficiencia humano (VIH) y antígenos del virus del papiloma humano (VPH).

En ciertas realizaciones los péptidos de CTL se derivan del antígeno superficial de HBV o de los polipéptidos, núcleo y prenúcleo de la nucleocápside. En las realizaciones más preferidas que se describen en el presente documento, los péptidos que inducen CTL se derivan de la región de HBenv309-328 (péptido 799.08), HBenV329-348 (péptido 799.09) HBenV349-368 (péptido 799.10), o la región HBc91-110 (péptido 802.03), donde la numeración es acorde a la de Galibert y cols., Nature 281, 646 (1979), que se incorpora al presente documento por referencia.

Los péptidos de CTL que comprenden los epítopos apropiados se sintetizan y después se analizan para determinar su capacidad de unirse a las moléculas de MHC clase I en ensayos usando, por ejemplo, moléculas de clase I purificadas y péptidos radioyodados y/o células que expresan moléculas de clase I vacías, por ejemplo, mediante tinción inmunofluorescente y microfluorimetría de flujo, ensayos de ensamblaje de clase I dependiente de péptidos, e inhibición del reconocimiento de CTL por competición de los péptidos. Los péptidos que se unen a la molécula de clase I se evalúan además para determinar su capacidad de servir de dianas para los CTL derivados de individuos infectados o inmunizados, así como para determinar su capacidad de inducir respuestas primarias de CTL in vitro o in vivo que puedan dar lugar a poblaciones de CTL con capacidad de reaccionar con células diana infectadas o con células tumorales como agentes terapéuticos potenciales.

El uno o más péptidos de CTL pueden administrarse con uno o más péptidos pan DR en una mezcla que puede o no tener asociaciones nocovalentes entre los péptidos. Por ejemplo, uno o más de los péptidos puede estar lipidado como se describe más adelante para facilitar la asociación entre los péptidos. De forma alternativa, los péptidos pueden estar unidos covalentemente formando un conjugado de CTL y pan DR.

Para facilitar la asociación del péptido de CTL con el péptido pan DR, pueden añadirse aminoácidos adicionales a los extremos del péptido de CTL. También pueden usarse restos adicionales para acoplar a un vehículo, a un péptido de soporte o mayor, por las razones que se describen en el presente documento, o para modificar las propiedades físicas o químicas dle péptido u oligopéptido, o similares. Pueden introducirse aminoácidos tales como tirosina, cisteína, lisina, ácido glutámico o aspártico, o similares, al extremo N del péptido u oligopéptido. Además, las secuencias de péptidos u oligopéptidos pueden diferir de la secuencia natural al estar modificada por acilación en el extremo NH_{2}, por ejemplo, mediante acetilación con alcanoílo (C_{1}-C_{20}) o tioglicolilo, amidación en el extremo carboxi, por ejemplo, amoniaco, metilamina, etc. En algunos casos, estas modificaciones pueden proporcionar sitios para unirse a un soporte u otra molécula.

Se entenderá que los péptidos de la presente invención o análogos de los mismos que tienen actividad de estimulación de CTL pueden modificarse proporcionando otros atributos necesarios, por ejemplo, características farmacológicas mejoradas, a la vez que se aumenta o al menos se mantienen sustancialmente toda la actividad biológica del péptido no modificado. Por ejemplo, los péptidos pueden modificarse extendiendo, disminuyendo o sustituyendo secuencias de aminoácidos en los péptidos, por ejemplo, mediante la adición o deleción de aminoácidos o bien en el extremo amino o en el extremo carboxi, o ambos, de los péptidos que se derivan de las secuencias que se describen en el presente documento. Habitualmente, la porción de la secuencia que se pretende que sustancialmente imite un epítopo que estimula CTL no diferirá en más de aproximadamente el 20% de la secuencia de la proteína antigénica diana, excepto donde puedan añadirse aminoácidos adicionales a cualquiera de los dos extremos con el fin de modificar las propiedades físicas o químicas del péptido, por ejemplo, para facilitar el enlace o acoplamiento, y similares. En las situaciones en las que se encuentran regiones de las secuencias de CTL que son polimorfas entre los subtipos víricos, puede ser deseable variar uno o o más aminoácidos particulares para imitar de forma más eficaz los diferentes epítopos de linfocitos T citotóxicos de diferentes cepas o subtipos víricos.

Dentro de las regiones de las secuencias peptídicas identificadas en el contexto de la presente invención como que contienen epítopos de CTL, por ejemplo, péptidos específicos de HBV, existen restos (o los que son sustancialmente equivalentes funcionales) que permiten al péptido mantener su actividad biológica, es decir, la capacidad de estimular una respuesta linfocícita T citotóxica de clase I contra células infectadas con virus o células que expresan antígenos virales. Estos restos pueden identificarse mediante sustituciones, deleciones, o inserciones de un único aminoácido. Además, las contribuciones que aportan las cadenas secundarias de los restos pueden sondarse mediante un barrido sistemático con un aminoácido específico (por ejemplo, Ala). Los péptidos que toleran sustituciones múltiples generalmente incorporan dichas sustituciones en forma de moléculas pequeñas relativamente neutras, por ejemplo, Ala, Gly, Pro, o restos similares. El número y los tipos de restos que pueden sustituirse, añadirse o quitarse dependerá del espaciamiento necesario entre los puntos epitópicos esenciales y ciertos atributos de conformación y función que se busquen (por ejemplo, que sea hidrófobo o hidrófilo). Si se desea, mediante esas alteraciones también puede lograrse una afinidad de unión mayor de los análogos peptídicos a su molécula de MHC para su presentación a un CTL. Generalmente, cualesquiera sustituciones, adiciones o deleciones de espaciadores entre los restos epitópica y/o conformacionalmente importantes deberían emplear aminoácidos u otros restos elegidos para evitar interferencias estéricas y de cargas que puedan alterar la unión. Los péptidos que toleran las sustituciones a la vez que mantienen la actividad biológica deseada también pueden sintetizarse como péptidos que contienen D-aminoácidos, como se describe anteriormente para los péptidos pan DR.

Los péptidos de la invención pueden combinarse mediante un enlace formando polímeros (multímeros), o pueden formularse en una composición sin enlace, en forma de una mezcla. Cuando el mismo péptido está unido a si mismo, formando así un homopolímero, se presenta una pluralidad de unidades epitópicas repetidas. Cuando los péptidos difieren, por ejemplo, un cóctel que representa subtipos víricos diferentes, epítopos diferentes de un subtipo, especificidades de restricción de HLA diferente, o péptidos que contienen epítopos de linfocitos T cooperadores, se proporcionan heteropolímeros con unidades repetidas. Además de los enlaces covalentes, también se contemplan los enlaces no covalentes capaces de formar enlaces intermoleculares e intraestructurales.

\newpage

Preparación de los conjugados

Tal como se ha observado anteriormente, los péptidos inductores de CTL pueden enlazarse covalentemente a los péptidos que se unen a pan DR para preparar conjugados de la invención. Los conjugados de péptidos inductores de CTL y de unión a pan DR particularmente preferidos están enlazados por una molécula espaciadora. De forma alternativa, el péptido de CTL puede estar enlazado al péptido que se une a pan DR sin un espaciador. El espaciador está habitualmente compuesto por moléculas relativamente pequeñas y neutras, tales como aminoácidos o miméticos de aminoácidos, que sustancialmente no tienen carga en condiciones fisiológicas y que pueden tener cadenas secundarias lineales o ramificadas. Los espaciadores habitualmente se seleccionan a partir de, por ejemplo, Ala, Gly, u otras espaciadores neutros de aminoácidos no polares o aminoácidos polares neutros. En ciertas realizaciones preferidas en el presente documento, el espaciador neutro es Ala. Se entenderá que el espaciador opcionalmente presente no tiene que estar compuesto de los mismos restos y así puede ser un heterooligómero u homooligómero. Los espaciadores ejemplares preferidos son los homooligómeros de Ala. Cuando está presente, el espaciador habitualmente será de al menos uno o dos restos, más habitualmente de tres a seis restos. En otras realizaciones, el péptido que se une a pan DR está conjugado al péptido de CTL, preferiblemente con el péptido que se une a pan DR posicionado en el extremo amino. Los péptidos pueden estar unidos mediante un enlace neutro, tal como Ala-Ala-Ala o similares, y preferiblemente contiene además un resto lipídico tal como ácido palmítico o similares (como se describe en más detalle a continuación) que está unido a grupos amino alfa y épsilon amino de un resto Lys ((PAM)2Lys), que está unido al extremo amino del conjugado peptídico, habitualmente mediante un enlace Ser-Ser o
similar.

El péptido inductor de CTL puede estar unido al péptido que se une a pan DR o bien directamente o mediante un espaciador o bien al extremo amino o carboxi del péptido de CTL. El extremo amino o bien del péptido inductor de CTL o del péptido que se une a pan DR puede estar acilado. Además, el conjugado de péptido de CTL y de unión a pan DR puede estar unido a ciertos lípidos alcanoílicos (C_{1}-C_{20}) mediante uno o más restos de unión tales como Gly, Gly-Gly, Ser, Ser-Ser como se describe más adelante.

En algunas realizaciones, puede ser deseable incluir en las composiciones farmacéuticas de la invención al menos un componente que ayude a cebar los CTL. Se han identificado lípidos como agentes capaces de ayudar a cebar CTL in vivo contra los antígenos víricos. Por ejemplo, los restos de ácido palmítico pueden estar unidos a los grupos amino alfa y épsilon de un resto Lys y después unidos, por ejemplo, mediante uno o más restos de enlace tales como Gly, Gly-Gly-, Ser, Ser-Ser, o similares, a un péptido inmunógeno. El péptido lipidado puede inyectarse después directamente una forma micelar, incorporarse a un liposoma o emulsionarse en un adyuvante, por ejemplo, adyuvante incompleto de Freund. En una realización preferida un inmunógeno particularmente eficaz comprende ácido palmítico unido a los grupos amino alfa y épsilon amino de Lys, que está unido mediante un enlazador, por ejemplo, Ser-Ser, al extremo amino del péptido inmunógeno.

Puede usarse otro ejemplo de lípido que ceba las respuestas de CTL, las lipoproteínas de E. coli, tales como tripalmitoil-S-glicerilcisteinliseril-serina (P3CSS) para cebar los CTL específicos de virus cuando están unidos covalentemente a un péptido apropiado. Véase, Deres y cols., Nature 342, 561-564 (1989), que se incorpora al presente documento por referencia. Los péptidos de la invención pueden estar acoplados a P3CSS, por ejemplo, y el lipopéptido administrarse a un individuo para promover específicamente una respuesta de CTL al antígeno diana. Además, dado que la inducción de anticuerpos neutralizantes también puede promoverse con P3CSS conjugado a un péptido que presente un epítopo apropiado, las dos composiciones pueden combinarse para provocar más eficamente tanto respuestas humorales como mediadas por células a la infección.

\vskip1.000000\baselineskip

Composiciones farmacéuticas

Los péptidos que se unen a pan DR de la presente invención y composiciones farmacéuticas y de vacunas de los mismos pueden administrarse a mamíferos, en particular a seres humanos, para fines profilácticos y/o terapéuticos. Los péptidos pan DR pueden usarse para potenciar respuestas inmunitarias contra otros inmunógenos administrados con los péptidos. Por ejemplo, pueden usarse mezclas de CTL/pan DR para tratar y/o prevenir infección vírica y cáncer. De forma alternativa, pueden usarse inmunógenos que pueden inducir respuestas inmunitarias. Los ejemplos de enfermedades que pueden tratarse usando las mezclas inmunógenas de péptidos pan DR y otros inmunógenos incluyen cáncer de próstata, hepatitis B, hepatitis C, SIDA, carcinoma renal, carcinoma de cuello de útero, linfoma, CMV y condiloma acuminado.

En las aplicaciones terapéuticas, las composiciones inmunógenas o los péptidos que se unen a pan DR de la invención se administran a un individuo que ya padece de cáncer o infectado con el virus de interés. Los que están en la fase de incubación o en la fase aguda de la enfermedad pueden tratarse con los péptidos que se unen a pan DR o a conjugados inmunógenos por separado o junto con otros tratamientos, según sea apropiado.

En las aplicaciones terapéuticas, las composiciones que comprenden composiciones inmunógenas se administran a un paciente en una cantidad suficiente para provocar una respuesta de CTL eficaz al virus o antígeno tumoral y para curar o al menos detener parcialmente síntomas y/o complicaciones. De forma similar, las composiciones que comprenden péptidos que se unen a pan DR se administran en una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente los síntomas de la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como "dosis terapéuticamente eficaz." Las cantidades eficaces para este uso dependerán, por ejemplo, de la composición peptídica, de la forma de administración, de la etapa y gravedad de la enfermedad que se está tratando, del peso y estado de salud general del paciente, y del criterio del médico que la prescribe.

Las cantidades terapéuticamente eficaces de las composiciones inmunógenas de la presente invención generalmente varían para la inmunización inicial (es decir, si es para administración terapéutica o profiláctica) desde aproximadamente 1,0 \mug a aproximadamente 5000 \mug de péptido para un paciente de 70 kg, seguida de dosis de refuerzo de desde aproximadamente 1,0 \mug a aproximadamente 1000 \mug de péptido conforme a una pauta de refuerzo de semanas a meses dependiendo de la respuesta del paciente midiendo la actividad de CTL específicos en la sangre del
paciente.

Las cantidades terapéuticamente eficaces de los péptidos que se unen a DR de la presente invención generalmente varían desde aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 2.000 mg de péptido al día para un paciente de 70 kg, siendo las dosis de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 1.000 mg de péptido al día las que se usan más habitualmente.

Debe tenerse en cuenta que las composiciones de la presente invención generalmente pueden emplearse en estados de enfermedad graves, es decir, situaciones mortales o potencialmente mortales. En dichos casos, a la vista de la minimización de las sustancias foráneas y de la naturaleza relativamente no tóxica de los conjugados, es posible y el médico que aplica el tratamiento puede sentir que es deseable administrar excesos sustanciales de estas composi-
ciones.

Para el uso profiláctico, la administración debería comenzar al primer signo de la enfermedad o la detección o eliminación quirúrgica de tumores o poco después del diagnóstico en el caso de infección aguda. Esto se seguiría con dosis de refuerzo hasta que al menos los síntomas hayan remitido sustancialmente y durante un periodo después de esto. En la infección crónica, pueden ser necesarias dosis de carga seguidas de dosis de refuerzo.

El tratamiento de un individuo infectado con las composiciones de la invención puede acelerar la resolución de la infección en los individuos con infección aguda. Para esos individuos susceptibles (o predispuestos) a desarrollar una infección crónica, las composiciones son particularmente útiles en los procedimientos para evitar la evolución de una infección aguda a crónica. Cuando los individuos susceptibles se identifiquen antes o durante la infección, por ejemplo, tal como se describe en el presente documento, la composición puede dirigirse a ellos, minimizando la necesidad de la administración a una población mayor.

También pueden usarse mezclas o conjugados de péptidos para el tratamiento de infección crónica y para estimular el sistema inmunitario para eliminar las células infectadas por virus en los portadores. Es importante proporcionar una cantidad de péptido potenciador del sistema inmunitario en una formulación y modo de administración suficiente para estimular de forma eficaz una respuesta de linfocitos T citotóxicos. Así, para el tratamiento de la infección crónica, una dosis representativa está en el intervalo de aproximadamente 1,0 \mug a aproximadamente 5000 \mug, preferiblemente de aproximadamente 5 \mug a 1000 \mug para un paciente de 70 kg por dosis. Puede ser necesario administrar dosis de inmunización seguidas de las dosis refuerzo a intervalos establecidos, por ejemplo, de una a cuatro semanas, posiblemente durante un periodo de tiempo prolongado para inmunizar de forma eficaz a un individuo. En caso de infección crónica, la administración debería continuar hasta que al menos los síntomas clínicos o las pruebas de laboratorios indiquen que la infección vírica ha sido eliminada o que ha remitido sustancialmente y durante un periodo después de eso.

Las composiciones farmacéuticas para el tratamiento terapéutico pueden ser para administración parenteral, tópica, oral o local. Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas se administran por vía parenteral, por ejemplo, por vía intravenosa, subcutánea, intradérmica o intramuscular. Así, la invención proporciona composiciones para la administración parenteral que comprenden una solución de los péptidos o conjugados disueltos o suspendidos en un vehículo aceptable, preferiblemente un vehículo acuoso. Puede usarse una variedad de vehículos acuosos, por ejemplo, agua, agua tamponada, solución salina al 0,9%, glicina al 0,3%, ácido hialurónico y similares. Estas composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales, notorias, o pueden esterilizarse por filtración. Las soluciones acuosas resultantes pueden envasarse para usarse tal cual, o liofilizarse, donde la preparación liofilizada se combina con una solución estéril antes de la administración. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según sea necesario para aproximarse a las condiciones fisiólogicas, tales como agentes de ajuste del pH y tamponadores, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes humectantes y similares, por ejemplo, acetato sódico, lactato sódico, cloruro sódico, cloruro potásico, cloruro cálcico, monolaurato de sorbitana, oleato de trietanolamina, etc.

La concentración de péptidos pan DR y/o estimuladores de CTL de la invención en las formulaciones farmacéuticas puede variar mucho, es decir, de menos de aproximadamente 0,1%, habitualmente a o al menos aproximadamente 2% hasta 20% a 50% o más en peso, y se seleccionarán principalmente según volúmenes de líquido, viscosidades, etc., de acuerdo con el modo de administración seleccionado particular.

Los péptidos y conjugados de la invención también pueden administrarse mediante liposomas, que sirven para dirigir los conjugados contra un tejido particular, tal como tejido linfoide, o dirigidos selectivamente contra células infectadas, así como para aumentar la semivida de la composición de péptidos. Los liposomas incluyen emulsiones, espumas, micelas, monocapas insolubles, cristales líquidos, dispersiones de fosfolípidos, capas laminares y similares. En estas preparaciones, el péptido a administrar se incorpora como parte de un liposoma, solo o junto con una molécula que se une, por ejemplo, a un receptor predominante entre las células linfoides, tales como anticuerpos monoclonales que se unen al antígeno CD45, o con otras composiciones terapéuticas o inmunógenas. Así, los liposomas cargados con el péptido o conjugado de la invención deseados pueden dirigirse al sitio de las células linfoides, donde los liposomas después liberan las composiciones de péptido terapéutico/inmunógeno seleccionadas. Los liposomas para usar en la invención se forman a partir de lípidos que forman vesículas estándar, que generalmente incluyen fosfolípidos neutros y con carga negativa y un esterol, tal como colesterol. La selección de lípidos generalmente se guía considerando, por ejemplo, el tamaño de los liposomas, la labilidad al ácido y la estabilidad de los liposomas en el torrente sanguíneo. Hay disponible una variedad de procedimientos para preparar liposomas, como se describe, por ejemplo, en Szoka y cols., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9, 467 (1980), patentes de Estados Unidos n.º 4.235.871, 4.501.728, 4.837.028, y 5.019.369, que se incorporan al presente documento por referencia.

Para alcanzar las células inmunitarias, un ligado a incorporar al liposoma, puede incluir por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos para los determinantes de la superficie celular de las células deseadas del sistema inmunitario. Puede administrarse una suspensión de liposomas que contenga un péptido o conjugado por vía intravenosa, local, tópica, etc. en una dosis que varía de acuerdo con, entre otros, la forma de administración, el conjugado que se está administrando y la etapa de la enfermedad que se está tratando.

Para las composiciones sólidas, pueden usarse vehículos sólidos, no tóxicos, convencionales, que incluyen, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio, y similares. Para la administración oral, una composición no tóxica, farmacéuticamente aceptable se forma incorporando cualquiera de los excipientes que se emplean normalmente, tales como los vehículos que se enumeran anteriormente, y generalmente 10-95% de principio activo, es decir, uno o más conjugados de la invención, y más preferiblemente a una concentración de 25%-75%.

Para la administración en aerosol, los péptidos preferiblemente se administran en forma finamente fraccionada junto con un tensioactivo y propelente. Los porcentajes de conjugados habituales son 0,01%-20% en peso, preferiblemente 1%-10%. El tensioactivo, por supuesto, debe ser no tóxico, y preferiblemente ser soluble en el propelente. Representativos de dichos agentes son los ésteres o ésteres parciales de ácidos grasos que contienen de 6 a 22 átomos de carbono, tales como ácido caproico, octanoico, laúrico, palmítico, esteárico, linoleico, linolénico, olestérico y oleico con un alcohol polihídrico alifático o su anhídrido cíclico. Pueden emplearse ésteres mixtos, tales como glicéridos mixtos o naturales. El tensioactivo puede constituir 0,1%-20% en peso de la composición, preferiblemente 0,25-5%. El balance de la composición es propelente normal. También puede incluirse un vehículo, según se desee, como por ejemplo, con lecitina para la administración intranasal.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a vacunas que contienen como principio activo una cantidad inmunológicamente eficaz de un péptido pan DR o un conjugado de CTL\péptido pan DR inmunógeno como se describe en el presente documento. El conjugado(s) puede introducirse en un huésped, que incluye seres humanos, enlazado a su propio vehículo o en forma de un homopolímero o heteropolímero de unidades peptídicas activas. Dicho polímero tiene la ventaja de que aumenta la reacción inmunológica y, cuando se usan péptidos diferentes para formar el polímero, tiene la capacidad adicional de inducir anticuerpos y/o CTL que reaccionan con diferentes determinantes antigénicos de los virus o células tumorales. Los vehículos de utilidad son notorios en la técnica, e incluyen, por ejemplo, tiroglobulina, albúminas tales como albúmina de suero bovina, toxoide del tétanos, poliaminoácidos tales como poli(lisina:ácido glutámico), proteína nuclear del virus de la hepatitis B, vacuna recombinante del virus de la hepatitis B y similares. Las vacunas también contienen un diluyente fisiológicamente tolerable (aceptable) tal como agua, solución salina tamponada con fosfato, o solución salina, y además habitualmente incluyen un adyuvante. Los adyuvantes tales como adyuvante incompleto de Freund, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, o alumbre son materiales notorios en la técnica. Y, tal como se menciona anteriormente, las respuestas de CTL pueden provocarse conjugando péptidos de la invención con lípidos, tales como P3CSS. Al inmunizar con una composición peptídica como se describe en el presente documento, mediante inyección, aerosol, por vía oral, transdérmica u otra, el sistema inmunitario del huésped responde a la vacuna produciendo grandes cantidades de CTL específicas para el antígeno deseado, y el huésped se vuelve al menos parcialmente inmune contra una infección posterior, o resistente a desarrollar una infección crónica.

Las composiciones de vacuna que contienen los péptidos pan DR de la invención se administran a un paciente susceptible a que presente otro tipo de riesgo de contraer la enfermedad, tal como infección vírica o cáncer para provocar una respuesta inmunitaria contra el antígeno y así potenciar la capacidad de respuesta inmunitaria del paciente mismo. Dicha cantidad se define como que es una "dosis inmunógenamente eficaz." En este uso, las cantidades precisas dependen de nuevo del estado de salud y del peso del paciente, del modo de administración, de la naturaleza de la formulación, etc., pero generalmente varía desde aproximadamente 1,0 \mug a aproximadamente 5000 \mug para un paciente de 70 kilogramos, más habitualmente de aproximadamente 10 \mug a aproximadamente 500 \mug por 70 kg de peso corporal.

En algunos casos, puede ser deseable combinar las vacunas con péptidos de la invención con vacunas que inducen respuestas de anticuerpos neutralizadoras contra el virus de interés, particularmente contra antígenos de la cubierta vírica.

Para fines terapéuticos o de immunización, los péptidos de la invención pueden expresarse también en huéspedes víricos atenuados, tales como vaccinia o virus de gripe aviar. Esta estrategia supone el uso de virus vaccinia como vector para expresar secuencias de nucleótidos que codifican los péptidos de la invención. Tras la introducción en huéspedes infectados agudos o crónicos o en un huésped no infectado, el virus vaccinia recombinante expresa el péptido inmunógeno, y provocando así una respuesta de CTL en el huésped. Los vectores de vaccinia y los procedimientos de utilidad en protocolos de inmunización se describen, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos n.º 4.722.848, que se incorpora al presente documento por referencia. Otro vector es BCG (Bacilo Calmette Guerin). Los vectores de BCG se describen en Stover y cols., Nature 351, 456-460 (1991)) que se incorpora al presente documento por referencia. Una amplia variedad de otros vectores de utilidad para la administración terapéutica o immunización de los péptidos de la invención, por ejemplo, vectores de Salmonella typhi y similares, serán obvios para los expertos en la técnica a partir de la descripción del presente documento.

Del mismo modo, pueden usarse conjugados antigénicos para provocar CTL ex vivo. Los CTL resultantes pueden usarse para tratar infecciones crónicas (víricas o bacterianas) o tumores en pacientes que no responden a otras formas convencionales de terapia, o que no responden a una estrategia de tratamiento de vacuna con péptidos. Las respuestas de CTL ex vivo contra un patógeno particular (agente infeccioso o antígeno tumoral) se inducen incubando en cultivo tisular las células precursoras de CTL del paciente (CTLp) junto con una fuente de células presentadoras de antígenos (APC) y el péptido inmunógeno apropiado. Después de un tiempo de incubación apropiado (habitualmente 1-4 semanas), en las que se activan los CTLp y maduran y se expanden como CTL efectores, las células se infunden de nuevo al paciente, donde destruyen su célula diana específica (una célula infectada o una célula
tumoral).

Los péptidos de esta invención también pueden usarse para formar anticuerpos monoclonales. Dichos anticuerpos pueden ser de utilidad como potenciales agentes de diagnóstico o terapéuticos.

Los péptidos también pueden encontrar uso como reactivos de diagnóstico. Por ejemplo, puede usarse un péptido de la invención para determinar la susceptibilidad de un individuo particular a una pauta de tratamiento que emplee el péptido o péptidos relacionados, y así puede ser de ayuda para modificar un protocolo de tratamiento existente o para determinar un pronóstico en un individuo afectado. Además, los péptidos también pueden usarse para predecir qué individuos presentarán un riesgo sustancial de desarrollar una infección crónica.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplos

Ejemplo 1

Procedimientos experimentales I. Líneas celulares y purificación de MHC

Se usaron diversas líneas celulares como fuentes de moléculas de clase II humanas y de ratón de clase II. Se usaron las siguientes líneas celulares homozigóticas transformadas con el virus de Epstein-Barr (EBV) como fuentes de moléculas de HLA de clase III humano (Valli y cols.,J. Clin. Invest. 91, 616-628, 1993): LG2 [DB1*0101 (DR1)]; 3107 [DRB1*1501 (DR2w2b)]; MAT [DRB1*0301 (DR-3)]; PREISS [DRB1*0401 (DR4)]; BIN40 [DRB1*0404 (DRw14)]; SWEIG [DRB1*11011 (DR5)] PITOUT [DRB1*0701 (DR7)]; PF [DQA1*0301/DQB1*0301 (DQ3.1). En algunos casos, se usaron fibroblastos transfectados: L416.3 [DRBS*0101 (DR2w2a)]; TR81.19 [DRB3*0101 (DR52a)]; y L257,6 [DRB4*0101 (DRw53)]. Para las moléculas de clase II de ratón, se usaron las siguientes líneas celulares: A20 (IA^{d}, IE^{d}) (Sette y cols., Science 258, 1801-1804, 1992); CH12 (IA^{k}, IE^{k}) (Sette y cols., 1992); LS102.9 (IA^{s}) (Wall y cols., Int. Imm. 4, 773-777, 1992); y DB27.4 (IA^{b}) (Wall y cols., J. Immuno. 152:4526-4536, 1994).

\vskip1.000000\baselineskip

II. Purificación de moléculas de MHC

Las moléculas de MHC se purificaron esencialmente como se ha descrito (Gorga y cols., J. Biol. Chem. 262, 16087-16094 (1987)). En resumen, se purificaron moléculas de clase II humanas mediante cromatografía por afinidad usando los anticuerpos monoclonales LB3.1 (todos DR, Valli y cols., J. Clin. Invest. 91, 616-628 (1993)) o los IVD12 (DQ3.1, Sidney y cols., J. Immunol. 152, 4516-4525 (1994)). Las moléculas de clase II de ratón se purificaron usando anticuerpos monoclonales MKD6 (IA^{d}, Sette y cols., Science 258, 1801-1804 (1992)); 10.3.6 (IA^{k}, Sette y cols., referencia anterior); 14.44 (IE^{d} y IE^{k}, Sette y cols., referencia anterior); y Y3JP (IA^{s}, Wall y cols., Int. Immunol. 4, 773-777 (1992)).

\vskip1.000000\baselineskip

III. Síntesis de los péptidos

Los péptidos se sintetizaron mediante acoplamiento secuencial de aminoácidos protegidos con N-\alpha-Fmoc en un sintetizador peptídico de Applied Biosystems (Foster City, CA) 430A usando ciclos de acoplamiento de Fmoc estándar (versión de software 1.40). Todos aminoácidos, reactivos, y resinas se obtuvieron de Applied Biosystems o Nova Biochem (San Diego, CA). Los disolventes se obtuvieron de Burdick & Jackson. La síntesis en fase sólida se inició a partir de una resina de Fmoc-aminoácido-Wang sustituida de forma apropiada. La carga de la resina inicial fue de 0,5-0,7 mmol/g de poliestireno, y se usaron 0,1 ó 0,25 meq en cada síntesis. Un ciclo de reacción típico era el siguiente: el grupo Fmoc del extremo N- se eliminó con 25% de piperidina en dimetilformamida (DMF) durante 5 minutos, seguido de otro tratamiento con 25% en DMF durante 15 minutos. La resina se lavó 5 veces con DMF. Se añadió una solución en N-metilpirolidona (NMP) de un exceso de 4 a 10 de un éster de 1-hidroxibenzotriazol éster del Fmoc-aminoácido apropiado a la resina, y la mezcla se dejó reaccionar durante 30-90 minutos. La resina se lavó con DMF como preparación para el siguiente ciclo de elongación. El péptido unido a resina totalmente protegido se sometió a un ciclo con piperidina para eliminar el grupo Fmoc del extremo. El producto se lavó con diclorometano y se secó. La resina después se hizo reaccionar con ácido trifluoroacético en presencia de captadores apropiados [por ejemplo, 5% (v/v) en agua] durante 60 minutos a 20ºC. Después de evaporar el exceso de ácido trifluoroacético, el péptido en bruto se lavó con éter dietílico, se disolvió en agua, y se liofilizó. Los péptidos se purificaron a una homogeneidad del >95% mediante HPLC de fase inversa gradientes de H_{2}O/CH_{3}CN que contenían 0,8% de modificador de TFA en una columna preparativa Vydac C-18 con tamaño de poro de 300 \ring{A}. La pureza de los péptidos sintetizados se analizó en una columna analítica de fase inversa y su composición se estableció mediante análisis y/o secuenciación de aminoácidos. La ciclohexilalanina que se usa en los procedimientos de síntesis se compró en Nova Biochem (San Diego, CA). Se produjeron péptidos palmitilados acoplando ácido palmítico a la resina antes de escindir el péptido. El acoplamiento se logró mediante un procedimiento de anhídrido simétrico, es decir, un exceso de dos veces de ácido palmítico y una vez de diisopropilcarbodiimida en diclorometano durante 1 hora.

\vskip1.000000\baselineskip

IV. Ensayos de unión de péptidos de MHC

Se incubaron moléculas de clase II de ratón o humanas (5 a 500 nM) con péptidos radiomarcados con ^{125}I 5 nM durante 48 horas en PBS que contenía 5% de DMSO en presencia de una mezcla de inhibidor de proteasas. Los péptidos purificados se yodaron usando el procedimiento de cloramina-T (Buus, y cols., Science 235, 1353-1358 (1987)). Las concentraciones finales de inhibidores de proteasas fueron: PMSF 1 nM, 1,10 fenantrolona 1,3 mM, pepestatina A 73 \muM, EDTA 8 mM, N-etilmaleimida 6 mM, y Na-p-tosil-L-lisina clorometil cetona 200 \muM. La concentración final de detergente en la mezcla de incubación era de 2,6% de digitonina (IA^{d} y IA^{k}) o 0,05% de NP-40 (todas moléculas de clase II). Los complejos de clase II-péptido se separaron del péptido libre por filtración en gel en columnas de Sephadex G-50 o TSK2000, y la fracción de péptido unido se calculó tal como se describe anteriormente (Sette y cols., J. Immunol. 142, 35-40 (1989)). En los experimentos preliminares, cada uno de las preparaciones de DR se valoró en presencia de cantidades fijas de péptidos radiomarcados para determinar la concentración de las moléculas de clase II necesaria para unirse al 10 a 20% de la radioactividad total. Todos los posteriores ensayos de inhibición y de unión directa se realizaron después usando esta concentración de clase II. En los ensayos de inhibición, los péptidos inhibidores se analizaron habitualmente a concentraciones que variaban de 120 \mug/ml a 1,2 ng/ml. Después se representaron los datos, y se midió la dosis que arrojaba una inhibición del 50%. Cada péptido se analizó en de dos a cuatro experimentos completamente independientes.

Tal como se usa en el presente documento una unión a <50 nM constituye afinidad elevada y la unión a 50-500 nM constituye una unión de afinidad intermedia.

\vskip1.000000\baselineskip

V. Inhibición de la presentación péptidos con DR restringidos

La capacidad de los péptidos de bloquear la función de presentación de antígenos de MHC se evaluó incubando células con EBV tratadas con mitomicina C del tipo de DR apropiado (5 x 10^{4}/pocillo) con péptidos inhibidores en RPMI 1640 (Bio Whittaker, Walkersville, MD) en medio completo que contenía 10% de suero humano (Gemini Bioproducts, Inc., Calabasas, CA). Los péptidos inhibidores se valoraron de forma rutinaria en placas de 96 pocillos con fondo en U (Costar, Cambridge, MA) con una variedad de cuatro diluciones de factor 10 empezando con una concentración de 150 \mug/ml. Junto con el péptido inhibidor, los pocillos del ensayo también recibían concentraciones subóptimas del péptido inhibidor péptido (DR1, DR4w4, DR5, DR52b) o HA 307-319, Y309>F (DR4w14), o Lol P1 171-190 (DR3) (Sidney y cols., J. Immunol. 149, 2634-2640 (1992)), que, en ausencia de péptidos inhibidores, producía un 30-50% de la respuesta proliferativa máxima. Esta concentración habitualmente era de 50 a 200 ng/ml. Después de incubar los APC con los péptidos durante 2 horas a 37ºC en una incubadora con 5% de CO_{2}, se añadieron 2 x 10^{4} linfocitos T a cada pocillo. El clon de linfocitos T que se usó era Cl 1 [DR1 y DR52b (Krieger y cols., J. Immunol. 146, 2331-2340 (1991))]; Clon 42.19 (DRwl4); Clon JK1 (DR5); y la línea 132-132 (DR3). La proliferación de los linfocitos T se midió tres días después. En resumen, 24 horas después de la adición de los linfocitos T, se añadió [^{3}H]timidina (1 PCi/pocillo) (ICN, Irvine, CA) a cada pocillo durante una incubación final de 18 horas. Después se recolectaron las células sobre filtros de fibra de vídrio (recolector de células LKB Wallac 1295-001, LKB, Gaithersburg, MD), y se midió la incorporación de timidina (contador LKB betaplate 1205). Se calculó el porcentaje de inhibición de la presentación de antígeno para cada dosis de péptido inhibidor necesaria para inhibir el 50% de la respuesta proliferativa.

\newpage

Ejemplo 2

Especificidad de unión a DR de epítopos peptídicos "universales"

Se han definido los motivos de unión de diversos alelos de MHC de clase II murinos y humanos, y también se ha descrito recientemente el análisis de motivos para secuenciar péptidos procesados naturalmente para diversos tipos de clase II (Rudensky y cols., Nature 353, 622-627 (1991); Chicz y cols., Nature 358, 764-768 (1992); Hunt y cols., Science 256, 1817-1820 (1992); Rudensky y cols., Nature 359, 429-431 (1992)).

En el caso de las moléculas de DR en particular, se ha demostrado (Brown y cols., Nature 364, 33-39 (1993)) que una gran ancla hidrófoba que se engrana en un bolsillo hidrófobo correspondiente de la hendidura de unión de MHC es el determinante más crucial de las interacciones entre péptido y DR. Otras anclas diversas desempeñan papeles definidos, pero menos destacados y ayudan a determinar la especificidad de los alelos. Recientemente también se ha enfatizado que el esqueleto peptídico de la mitad del extremo C de la molécula peptídica se engrana con puentes de hidrógeno directos con las paredes de la hendidura de unión de MHC.

Aunque los restos polimorfos específicos de alelo que tapizan los bolsillos de unión de péptidos de MHC tienden a dotar a cada alelo con la capacidad de unirse a un único conjunto de péptidos, hay muchos casos en los que se ha demostrado que un péptido dado se une a más de una especificidad de MHC. Esto se ha documentado en el caso del isotipo de DR humano, en el que anteriormente se había observado que diversos alelos de DR parecían reconocer motivos similares, e independientemente, diversos investigadores reseñaron una unión y/o reconocimiento degenerados de ciertos epítopos en el contexto de tipos múltiples de DR, que sugerían el concepto de que ciertos péptidos pueden representan epítopos "universales" (Busch y cols., Int. Immunol. 2, 443-451 (1990); Panina-Bordignon y cols., Eur. J. Immunol. 19, 2237-2242 (1989); Sinigaglia y cols., Nature 336, 778-780 (1988); O'Sullivan y cols., J. Immunol. 147, 2663-2669 (1991); Roache y cols., J. Immunol. 144, 1849-1856 (1991); Hill y cols., J. Immunol. 147, 189-197 (1991)).

La capacidad de unión a DR de los péptidos de unión a DR descritos anteriormente que pueden unirse a más de una molécula de DR (HA 307-319, TT 830-843, CS 378-398, MT 17-31, y HBVnc 50-69 se estableció usando el ensayo que se describe en el Ejemplo I, párrafo V. Los datos obtenidos (Tabla II, sección A) demuestran que aunque estos péptidos de hecho sí tenían capacidad de unirse a varias de las moléculas de DR analizadas, no podían unirse a otras. Por ejemplo, la HA 307-319 se unía con una afinidad elevada (<50 nM) o intermedia (50-500 nM) a DR1, DR4w4, DR5, DR7, y DR2w2a, y débilmente a DRw53 (2,2 \muM); mientras que no podía detectarse unión para las otras cuatro especificidades de DR. HBVnc 50-69 también se unía a 5 de las 10 especificidades de DR analizadas (DR1, DR2w2b, DR4w4, DR5, y DR2w2a) con afinidad elevada o intermedia. TT 830-843 y CS 378-398 se unían con afinidad elevada o intermedia a 4 de las 10 moléculas de DR analizadas (DR1, DR5, DR7, DR2w2a y DR1, DR4w4, DR5, DR7, respectivamente) y MT 17-31 se unía con afinidad elevada o intermedia a 3 de los 10 tipos de DR.

En conclusión, aunque estos epítopos previamente descritos como "universales" se unían a diversos tipos de DR, no eran completamente "universales" en su capacidad de unión, ya que un máximo del 50% de las especificidades de DR analizadas se unía a un péptido dado con afinidad de elevada a intermedia.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3

Desarrollo de péptidos con afinidad elevada para múltiples alelos de DR: 760.50 y 760.57

Se generó un número de péptidos con capacidad de unión con afinidad elevada a los alelos asociados a artritis reumatoide de DR DR1, DR4w4, y DR4w14. Para producir estos péptidos, los presentes inventores usaron una estrategia inicialmente descrita por Jardetzky y cols., EMBO J. 9:1797-1803 (1990), en la que los restos de anclaje que contenían cadenas secundarias críticas para la unión a MHC se insertan en un péptido de poli-alanina de 13 restos. Dos de dichos péptidos, denominados 760.50 y 760.57, se describen en la solicitud de patente matriz en tramitación con la presente 08/121.101 y eran particularmente interesantes con respecto a su amplia especificidad de unión a DR. Cuando se analizaron para determinar la unión a un grupo de 10 moléculas de DR purificadas, se encontró que, en general, estos péptidos se unían con una afinidad mayor y con una especificidad más amplia que los epítopos "universales" naturales que se describen anteriormente (Tabla II, sección B). Ni 760.50 ni 760.57 eran totalmente "universales" ya que sólo se detectó una afinidad unión baja en 4 de los 10 alelos analizados (DR2w2b, DR3, DR52a, y DRw53).

2

Ejemplo 4

Desarrollo de péptidos con afinidad elevada para múltiples alelos de DR: 760.50 y 760.5

Para ampliar la especificidad, se sintetizaron los péptidos 906.09 y 906.11, en los que se introdujo un V o I en la posición 4 del péptido 760.57. Tal como se muestra en la Tabla II, sección C, ambos péptidos 906.09 y 906.11 mantuvieron una buena afinidad de unión por DR1, DR2w2a, DR4, DR5, y DR7 (en el intervalo de 0,3 a 80 nM). Además, la capacidad de unión (comparados con 760.50 y 760.57) para las moléculas DR2w2b, DR3, DR52a, y DRw53 mejoró significativamente (10 a 25 veces), con CI_{50}% en el intervalo de 20 a 1200 nM. Así, 9 de las 10 especificidades de DR analizadas se unían a estos péptidos con afinidad elevada o intermedia, y uno, DR52a, se unía débilmente.

En conclusión, estos datos ilustran el desarrollo de péptidos unión con afinidad elevada a la mayoría, si no todos, los alelos de DR. Debido a este amplio patrón de reactividad cruzada entre diferentes moléculas de DR, los presentes inventores han determinado que los péptidos 906.09 y 906.11 son péptidos que se unen a pan DR.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5

Los péptidos que se unen a pan DR también se unen a DQ3.1 y a moléculas de clase II de ratón

Se realizaron ensayos para determinar si los péptidos que se unen a pan DR también eran capaces de unirse a otros isotipos de moléculas de clase II humanas o moléculas de clase II no humanas. Más específicamente, se determinó la capacidad de los péptidos que se unen a pan DR de unirse a DQ3.1 y diversas especificidades de clase II de ratón, tal como se muestra en la Tabla III. Como referencia, también se muestran en la Tabla III, sección A, las afinidades de unión de epítopos de clase II de ratón previamente descritos. Todos estos epítopos descritos anteriormente se unían a sus elementos de restricción relevantes con afinidad elevada o intermedia, entre 20 y 400 nM. Se encontró que, en general, los péptidos de la serie 760 (Tabla III, sección B) se unía con afinidad intermedia, en el intervalo de 80 a 700 nM, a cinco de los seis alelos analizados (IA^{b}, IA^{d}, IE^{d}, IA^{s}, IE^{k}). De forma interesante, los péptidos de la serie 906 (Tabla III, sección C) se unía con una afinidad significativamente mayor, en el intervalo de 10 a 100 nM en el caso de los alelos mencionados anteriormente, y 906.11 también se unía con afinidad intermedia a IA^{k}. Con respecto a la unión a DQ3.1, se encontró que 760.50, 760.57, 906.09, y 906.11 todos se unían con una afinidad relativamente elevada a las moléculas de DQ3.1 purificadas (en el intervalo de 30 a 120 nM).

Como control, también se examinó el potencial de unión de los péptidos 760 y 906 a moléculas de clase I humanas. No se detectó unión, hasta 10 \muM, a moléculas de HLA-A1, -A2.1, -A3, -A11, y -A24 purificadas (no se muestran los datos). En conclusión, estos datos sugieren que los péptidos de la serie 906 son péptidos que se unen a todos los MHC de clase II (pero no de clase I).

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA III Capacidad de diversos epítopos peptídicos de unirse a DQ 3.1 y a moléculas de clase II de ratón

3

\newpage

Ejemplo 6

(un ejemplo específicamente fuera del alcance de la invención)

Inhibición de la proliferación de linfocitos T por moléculas que se unen a Pan DR

Debido a su degenerada capacidad de unirse a las moléculas de clase II, las moléculas que se unen a Pan DR son candidatos como agentes terapéuticos en la inhibición de eventos mediados por linfocitos T implicados en el rechazo de aloinjertos, respuestas alérgicas, o autoinmunitarias. Por consiguiente, se evaluó la capacidad de estos péptidos de bloquear una respuesta de proliferación de linfocitos T in vitro. Se usó el ensayo de inhibición de la presentación de antígeno que se describe en el Ejemplo 1, párrafo (V) para realizar estas evaluaciones.

Al igual que con su capacidad de unirse a MHC, se encontró que estos péptidos eran inhibidores potentes de las respuestas de proliferación de linfocitos T humanos restringidos por al menos seis moléculas de DR diferentes (Tabla IV). Más específicamente, los péptidos 760.50 y 760.57, que tienen afinidades de unión elevadas por DR1, DR4w4, DR4w14, y DR5, inhibían la proliferación de linfocitos T restringida por esos alelos, con CI_{50}% en el intervalo de 1,0 a 25 \muM. Por el contrario, estos péptidos se unían a las moléculas de DR3 sólo débilmente, en el intervalo de 2,5 a 6,5 \muM, y por consiguiente, la activación de linfocitos T restringida a DR3 se inhibió deficientemente (CI_{50}% de 220 \muM para 760.57) o nada (CI_{50}% de >250 \muM para 760.50).

Los péptidos 906.09 y 906.11 también inhibieron las respuestas a DR1, DR4w4, DR4w14, y DR5 de forma bastante eficaz (CI_{50}% en el intervalo de 0,5 a 15 \muM). Tal como era de esperar, los análogos de 906, que tienen una capacidad de unión a DR3 intermedia, también eran capaces de inhibir la presentación de antígeno restringida a DR3, con CI_{50}% en el intervalo de 30 a 60 \muM.

En el mismo conjunto de experimentos, los presentes inventores también analizaron los péptidos 760 y 906 para determinar su capacidad de inhibir una respuesta restringida a DR52b. Este experimento era interesante para los presentes inventores ya que no habían sido capaces todavía de desarrollar un ensayo de unión molecular para medir la unión de péptidos a moléculas de DR52b. Los datos obtenidos demuestran que ambos péptidos 906.09 y 906.11 inhibieron la presentación de HA 307-319 Clon 1 en el contexto de las moléculas de DR52b con una buena CI_{50}%, en el intervalo de 1 a 2 \muM, extendiendo así la capacidad de estos péptidos que se unen a pan DR de unirse a un decimoprimer alelo.

Finalmente, estos péptidos no pudieron inhibir la proliferación del clon de linfocitos T con DR restringido, específico de HA en respuesta al mitógeno policlonal PHA, y se unieron en el ensayo de antagonistas de linfocitos T descrito recientemente (De Magistris y cols., Cell 68, 525-634 (1992)), en el que los péptidos se añaden posteriormente (no de forma simultánea) al estímulo antigénico (no se muestran los datos). Estos hallazgos descartan la posibilidad de que los resultados descritos anteriormente puedan haber sido provocados por alguna citotoxicidad no específica de los péptidos 760 o 906.

TABLA IV Inhibición de la proliferación de linfocitos T por los péptidos que se unen a pan DR

5

Ejemplo 7

Generación de epítopos de linfocitos T pan DR para modificar los péptidos que se unen a clase II que reaccionan con muchas moléculas, y ejemplar de la presente invención

También se consideró un tipo de aplicación diferente de los péptidos que se unen a pan DR, en concreto el uso de estos péptidos para producir epítopos de linfocitos T cooperadores con restricciones de pan DR que pudieran proporcionar ayuda para respuestas humorales y citotóxicas. Debido a que todos los restos de contacto potenciales en los TCR de los péptidos que se unen a pan DR eran alaninas, se planteó la hipótesis de que debido a las limitadas interacciones en las que podrían participar las cadenas secundarias de metilo, la introducción de restos cargados hidrófobos más voluminosos podría mejorar la probabilidad de las interacciones con receptores de los linfocitos T y de ese modo aumentar su capacidad inmunógena.

Siguiendo esta línea de razonamiento, los presentes inventores modificaron más el péptido pan DR 906.09. Se generaron diversos análogos mediante la introducción de grupos laterales voluminosos o cargados en las posiciones 2, 5, y 7, que son restos de contacto potenciales en los TCR basándose en los análisis anteriores del péptido HA 307-319. Por el contrario, las posiciones que se sabía que influían en la unión a DR no se alteraron (3, 4, 8, 9, y 11). Además, también se generaron análogos que portaban el aminoácido natural, Phe, en lugar de ciclohexilalanina en la posición 3. Después se analizaron estos péptidos para determinar si mantenían su capacidad de unirse a alelos de DR múltiples, y los péptidos que no mostraban un descenso significativo en su capacidad de unión a DR se analizaron después para determinar su capacidad de inducir una respuesta inmunitaria. Los datos de dos de los mejores péptidos, 965.10 y 1024.03, se describen a continuación.

Cuando estos dos péptidos se analizaron para determinar la unión a HLA DR y murinos (Tabla II, sección D y Tabla III, sección D), se encontró que, en general, mantenían la elevada capacidad de unión y amplia reactividad asociada al péptido progenitor, 906.09, para la mayoría d elos alelos de DR. Las excepciones a esto las representaba 1024.03 que se unía sólo débilmente a DR3 (1470 nM) y también la unión con una afinidad intermedia (420 nM) en lugar de elevada a DRw53. También, los péptidos 965.10 y 1024.03 mostraban capacidades de unión muy reducidas para la mayoría de las moléculas murinas de clase II analizadas. Sin embargo, el alelo 1Ab mantuvo una buena capacidad de unión, permitiendo así usar los ratones H-2b para analizar la capacidad inmunógena in vivo de estos péptidos (véase más adelante). Finalmente, ambos péptidos también mantuvieron una buena capacidad de unión a DQ3.1 (en el intervalo de 25 nM).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 8

Capacidad inmunógena in vitro de péptidos que se unen a pan DR

El epítopo Pan DR 965.10, junto con dos de sus péptidos progenitores, 906.09 y 760.50 y el epítopo natural descrito anteriormente, TT 830-843, se compararon para determinar su capacidad de estimular las respuestas de los linfocitos T in vitro en PBMC de individuos normales. El protocolo que se usó suponía la estimulación repetida de PBL con APC autólogos y antígenos peptídicos, y se diseñó específicamente para permitir el estudio de respuestas primarias in vitro. Este protocolo se proporciona más adelante, seguido de los resultados de los ensayos.

A. Protocolo del ensayo

Se estimularon PBMC de donantes sanos in vitro usando un protocolo adaptado de Manca y cols., J. Immunol. 146, 1964-1971 (1991). Se purificaron monocitos de sangre periférica (PBMC) con Ficoll-Paque (Pharmacia LKB, Uppsala, Suecia) y se plaquearon en 4 pocillos de una placa de cultivo tisular de 24 pocillos (Costar, Cambridge, MA) a 4 x 10^{6} PBMC/pocillo. Los péptidos se añadieron a una concentración final de 10 \mug/ml. Después los cultivos se incubaron a 37ºC, con 5% de CO_{2}. El día 4, se añadió IL-2 recombinante a una concentración final de 10 ng/ml. Los cultivos se alimentaron de la forma habitual cada tres días después de eso, aspirando 1 ml de medio y sustituyéndolo por medio fresco que contenía IL-2. Se realizaron dos estimulaciones adicionales de los linfocitos T con antígeno aproximadamente los días 14 y 28. Los linfocitos T (3 x 10^{5}/pocillo) se estimularon con péptido (10 \mug/ml) usando PBMC autólogos [2 x 10^{6}radiados (7500 rad)/pocillo] como células presentadoras de antígeno en un total de 3 pocillos de una placa de cultivo tisular de 24 pocillos. Además, los días 14 y 28, se determinaron las respuestas de proliferación de los linfocitos T de la forma siguiente: 2 x 10^{4} linfocitos T/pocillo; 1 x 10^{5} PBMC irradiados/pocillo como APC; la concentración de péptido se valoró entre 0,01-10 \mug/ml de concentración final en placas de cultivo tisular de 96 pocillos con fondo en U (Costar, Cambridge, MA). Los ensayos de proliferación de linfocitos T se recogieron el día 3 como se describe anteriormente.

B. Resultados

Los datos representativos de tres donantes normales se muestran en la Figura 1. Los datos obtenidos tras dos tandas de estimulación se muestran en los paneles A a C, y después de una tercera ronda de estimulación, en los paneles D a F. Tal como se había previsto, los péptidos parentales 760.50 y 906.09 eran malos inmunógenos en estos experimentos. Ninguno de los dos péptidos indujo una respuesta significativa (>10.000 cpm) después de dos tandas de estimulación. Después de una tercera tanda de estimulación, 760.50 indujo una respuesta en un donante de los tres analizados. El epítopo TT 830-843 "universal" natural también falló, proporcionando una respuesta significativa después de dos tandas de estimulación, y después de la tercera tanda de estimulación, TT 830-843 también generó una modesta respuesta positiva en los tres donantes. En contraste con estas débiles respuestas, los tres donantes respondieron enérgicamente después de sólo dos tandas de estimulación al péptido pan DR 965.10 modificado.

Las Figuras 2A y 2B resumen todos los datos de estimulación in vitro que se han obtenido (segunda y tercera estimulaciones, respectivamente). Después de dos estimulaciones in vitro (Fig. 2A), el péptido 965.10 era el único péptido capaz de estimular significativamente los linfocitos T en la mayoría de los donantes (9/12). TT 830-843 fue capaz de generar una respuesta en menos individuos (3/12), mientras que 760.50 y 906.09 no pudieron ninguno estimular ninguna respuesta (0/3). Para la tercera estimulación (Figura 2b) 965.10 generó respuestas significativas en 11 de los 12 donantes analizados, el TT 830-843 fue ahora capaz de desarrollar una respuesta significativa en la mayoría de los donantes (7/12); 760.50 indujo una respuesta en 1 de 3 donantes, y 906.09 no pudo estimular ninguno de los 3 donantes analizados.

La capacidad de 965.10 de expandir poblaciones de linfocitos T específicas in vitro desde la segunda estimulación, más su capacidad de proporcionar una respuesta significativa de linfocitos T virtualmente en todos los donantes mediante la tercera estimulación, demuestra la superior capacidad inmunógena de este péptido relativa a los péptidos TT 830-843, 760.50 o 906.09.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 9

Capacidad inmunógena in vivo de los epítopos pan DR en ratones

Se analizó la capacidad inmunógena de los péptidos 760.50, 965.10, y 1024.03 in vivo en ratones C57BL/6J (H-2b+).

Para llevar a cabo estos ensayos, se inyectó a ratones C57BL/6J por vía subcutánea en la base de la cola una valoración de dosis de diversos péptidos (0,000125, 0,0025, 0,05, 1, y 20 \mug/ratón) en PBS/CFA (Difco, Detroit, MI) en un volumen de 100 \mul. El día 10, se extrajeron los nódulos linfáticos inguinales y paraaórticos de los grupos de tres ratones/dosis de péptido, se juntaron y se homogeneizaron obteniendo suspensiones de una única célula. Las células se lavaron dos veces y posteriormente se plaquearon (1 x 10^{6} células/pocillo) en placas de cultivo tisular de microvaloración de 96 pocillo. Se añadió una valoración de péptido a dosis logarítmica (0,01 a 100 \mug/ml) del péptido de inmunización y se realizó un ensayo de proliferación de linfocitos T de tres días como se describe anteriormente.

En estos experimentos, se comparó la actividad de los epítopos no naturales con otros dos epítopos naturales restringidos a IA^{b} naturales definidos anteriormente, Ova 323-336 y 128-140 nuclear de HBV. Estos dos epítopos naturales se unían con una afinidad algo menor (3 a 14 veces) que 965.10 (Tabla III, sección A). El péptido TT 830-843, que no se unía a IA^{b} de forma apreciable (no se muestran los datos), se incluyó como control negativo. Se inmunizó a grupos de ratones con cantidades variables de péptido (0,000125 a 20 \mug/ratón) en CFA. Diez días después de la inmunización, se extrajeron los nódulos linfáticos que drenaban la zona y se estimularon in vitro con dosis variables de antígeno.

Tal como se muestra en la Figura 3, se encontró que, de forma consistente con su incapacidad de unirse IA^{b}, TT 830-843 fue incapaz de generar una respuesta de proliferación de linfocitos T. Los epítopos cooperadores restringidos a IA^{b} Ova 323-336 (Figura 3, panel B) y HBVc 125-140 (Figura 3, panel C) indujeron respuestas en el intervalo de 25.000 a 70.000 cpm a las dos dosis de péptido más elevadas que se usaron para la immunización (1 y 20 \mug/ratón). Los epítopos pan DR 965.10 (Figura 3, panel D) y 1024.03 (Figura 3, panel E) estimularon las respuestas más fuertes, obteniendo dosis de inmunización eficaces desde tan solo 0,05 \mug/ratón, con una magnitud en el intervalo de 100.000 a 150.000 cpm. Por el contrario, el péptido 760.50 (Figura 3, panel F) fue solo marginalmente inmunógeno, induciendo una respuesta proliferativa muy débil, y sólo con la dosis más alta (20 \mug/ratón) analizada. Estos resultados indican que los epítopos pan DR 965.10 y 1024.03 funcionan como epítopos cooperadores muy eficaces in vivo, así como in vitro. Junto con los datos de capacidad inmunógena en seres humanos, también sugieren que además de una elevada capacidad de unión de MHC, la presencia de restos aminoacídicos "inmunodominantes" en las posiciones de contacto potencial en TCR es un elemento importante para la generación de respuestas de linfocitos T vigorosas.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 10

Los péptidos pan DR actúan como epítopos cooperadores para la inducción de CTL in vivo en ratones

Generalmente se asume que la capacidad de inducir una respuesta de proliferación de linfocitos T es un indicador de la capacidad cooperadora de un epítopo peptídico. Los presentes inventores querían verificar esto midiendo la capacidad del péptido 965.10 de ayudar a generar una respuesta de CTL. Se realizaron experimentos de inducción de CTL de acuerdo con el protocolo que se proporciona más adelante.

A. Protocolo de inducción de CTL

Se inmunizó a grupos de tres a seis ratones C57 BL/6J mediante inyección subcutánea en la base de la cola con una mezcla de CTL y epítopos cooperadores disueltos en PBS/5% de DMSO y emulsionados en IFA (Difco, Detroit, MI). Después de 11 días, se sacrificó a los ratones y se prepararon los esplenocitos. Los esplenocitos (3 x 107/10 ml/matraz T25) se estimularon in vitro mediante la adición de blastos con lipopolisacáridos (LPS) singeneicos recubiertos con péptido. Los blastos LPS se prepararon 72 horas antes de usar a partir de esplenocitos de ratones C57BL/6J resuspendidos en medio que contenía LPS (W E. coli 055:B5) (Difco, Detroit, MI) (25 \mug/ml), y sulfato de dextrano (Pharmacia, Uppsalam Suecia) (7 \mug/ml). Los cultivos se prepararon con 1,5 x 10^{6} esplenocitos/ml en un volumen total de 3 ml y se incubaron durante 72 horas a 37ºC, con 5% de CO_{2} en matraces T75.

Posteriormente, se radiaron las células, se lavaron, y se volvieron a suspender a 30-40 x 10^{6} células/ml. Se incubaron alícuotas de 1 ml de esta suspensión con el epítopo de CTL a 100 \mug/ml durante 1 hora a 37ºC, con 5% de CO_{2}. Las células se lavaron una vez y después se volvieron a suspender a 10 x 10^{6} células/ml. Se añadió un volumen de 1 ml por matraz a las células efectoras apropiadas y se incubó durante 6 días. Después se midió la citotoxicidad usando células diana EL4 (haplotipo b) (3 x 10^{6} células/ml) que se incubaron a 37ºC en presencia de cromato sódico ^{51}Cr y péptido de epítopos de CTL. Después de 60 minutos, las células se lavaron tres veces y se volvieron a suspender en RPMI-1640 (Bio Whittaker, Walkersville, MD) que contenía 10% de FCS (Irvine Scientific, Santa Ana, CA), L-Glutamina 2 mM (Irvine Scientific), 50 \mug/ml de gentamicina (Irvine Scientific), y 5 x 10-5 M Beta Mercaptoetanol (Sigma, St. Louis, MO). Posteriormente, se añadieron 1 x 10_{4} células diana marcadas con ^{51}Cr a una valoración de células efectoras en placas de 96 pocillos con fondo en U, volumen final = 200 \mul. Después de 6 horas de incubación a 37ºC, con 5% de CO_{2}, se extrajeron alícuotas de 0,1 ml de sobrenadante de cada pocillo y se determinó la radioactividad un contador gamma Micromedic. La lisis específica porcentual se determinó mediante la siguiente fórmula: % de lisis específica = 100 x (liberación experimental - liberación espontánea)/(liberación máxima - liberación espontánea). Los datos se expresan en unidades de lisis/10^{6} células efectoras. Una unidad de lisis se define arbitrariamente como el número de linfocitos necesario para lograr una lisis del 30% de 1 X 10^{4} células diana marcadas con ^{51}Cr en 6 horas, en ausencia o presencia de péptido.

Los presentes inventores inmunizaron ratones C57BL/6J con una dosis 10 nM del determinante de CTL lipidado (Ova 257-264) restringido a K^{b} (Carbonan y Bevan, J. Exp. Med. 169: 603-612 (1989)), junto con cantidades variables de los epítopos cooperadores de IA^{b} Ova 323-336 (Wall y cols., J. Immunol. 152:4526-4536 (1994)), 128-140 nuclear de HBV, o el péptido 965.10. Después de 11 días, los esplenocitos se estimularon in vitro con el epítopo de CTL Ova 257-264, se incubaron durante 6 días, y después se analizaron en un ensayo estándar en CTL de liberación de cromo de 6 horas. Las dianas de CTL incluían tanto células EL4 pulsadas con Ova 257-264 como células EG7 transfectadas con Ova 257-264.

B. Resultados

Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla V. Se encontró que el epítopo de pan DR 965.10 inducía una respuesta de CTL de una forma dependiente de la dosis, observándose un óptimo de 307 unidades de lisis cuando se inyectaron al mismo 5 \mug/ratón de péptido 965.10 y el epítopo Ova 257-264 CTL. Por el contrario, la actividad cooperadora de los epítopos Ova 323-336 y HBVc 128-140 era mucho menos pronunciada, tanto en términos de magnitud del efecto cooperador (un aumento de cuatro veces y tres veces, respectivamente) y de la dosis necesaria para inducir la actividad cooperador óptima (100 \mug/ratón).

TABLA V Actividad cooperadora de diversos epítopos peptídicos para la inducción de CTL in vivo

6

<110> Epimmune Inc.

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Alteración de la respuesta inmunitaria usando péptidos de unión de Pan DR

\vskip0.400000\baselineskip

<130> JEC/FP5224910

\vskip0.400000\baselineskip

<140> EP 94929801.2

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 1994-09-14

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 08/121,101

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1993-09-14

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn version 3.3

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> fuente

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /observación = "Descripción de secuencia artificial: Secuencia sintética: Péptido estándar HA 307-319"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> fuente

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /observación = "Descripción de secuencia artificial: Secuencia sintética: Péptido estándar MBP 78-101"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> fuente

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /observación = "Descripción de secuencia artificial: Secuencia sintética: Péptido estándar MT 65 kd 3-13"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

9

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> fuente

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /observación = "Descripción de secuencia artificial: Secuencia sintética: Péptido estándar 717.01 combinatorio"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

10

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> fuente

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /observación = "Descripción de secuencia artificial: Secuencia sintética: Péptido estándar Tet Tox 830-843"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

11

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> fuente

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /observación = "Descripción de secuencia artificial: Secuencia sintética: Péptido estándar Tet Tox 1272-1284"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

12

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> fuente

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /observación = "Descripción de secuencia artificial: Secuencia sintética: Péptido estándar ROIV"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\hskip1cm

13

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> fuente

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /observación = "Descripción de secuencia artificial: Secuencia sintética: Péptido estándar Ova 323-326"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\hskip1cm

14

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> fuente

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /observación = "Descripción de secuencia artificial: Secuencia sintética: Péptido estándar lambda rep 12-26"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\hskip1cm

15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> fuente

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /observación = "Descripción de secuencia artificial: Secuencia sintética: Péptido estándar HEL 46-61"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\hskip1cm

16

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> fuente

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /observación = "Descripción de secuencia artificial: Secuencia sintética: Péptido HBVnc 50-69"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\hskip1cm

17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> fuente

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /observación = "Descripción de secuencia artificial: Secuencia sintética: Péptido CS 378-398"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\hskip1cm

18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> fuente

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /observación = "Descripción de secuencia artificial: Secuencia sintética: Péptido MT (Y) 17-31"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\hskip1cm

19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> fuente

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /observación = "Descripción de secuencia artificial: Secuencia sintética: Péptido HBVc 128-140/IA b"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\hskip1cm

20

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> fuente

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /observación = "Descripción de secuencia artificial: Secuencia sintética: Péptido PLP 139-151/IA s"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\hskip1cm

21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> fuente

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /observación = "Descripción de secuencia artificial: Secuencia sintética: Péptido HEL 46-61/IA k"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\hskip1cm

22

Claims (8)

1. Uso de un péptido T cooperador en la preparación de un medicamento para potenciar una respuesta inmunitaria contra un inmunógeno administrado, teniendo dicho péptido T cooperador menos de treinta aminoácidos de longitud, y comprendiendo una cadena de aminoácidos que tiene la fórmula R_{1}-R_{2}-R_{3}-R_{4}-R_{5}, en la que:

R_{1} es un aminoácido K;

R_{2} es un aminoácido que se selecciona del grupo constituido por: (X), Y o F, en el que (X) es ciclohexilalanina;

R_{3} es 3 aminoácidos cada uno de los cuales se selecciona independientemente a partir del grupo constituido por: A, I, S y V;

R_{4} es W-T-L-K; y

R_{5} está constituido por 2 aminoácidos que se seleccionan independientemente a partir del grupo constituido por: A, S y V,

en el que además dicha cadena de aminoácidos tiene un D-aminoácido en el extremo amino y carboxi, donde las letras K, Y, F, A, I, S, V, W, T, L corresponden a los códigos de 1 letra que se usan para la denominación de los aminoácidos.

2. Uso de un péptido T cooperador de acuerdo con reivindicación 1, en el que R_{2} es ciclohexilalanina o fenilalanina; R_{3} es 3 aminoácidos cada uno de los cuales se selecciona independientemente a partir del grupo constituido por alanina, isoleucina y valina; y R_{5} está constituido por 2 alaninas, en el que dicho D aminoácido del extremo amino y carboxi es D-alanina.

3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el péptido de linfocitos T cooperador es aK(X)VAAWTLKAAa o aKFVAAWTLKAAa, en el que (X) es ciclohexilalanina.

4. Uso de un péptido T cooperador de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho medicamento además comprende un péptido inductor de CTL.

5. Una composición que comprende un péptido T cooperador, teniendo dicho péptido T cooperador menos de treinta aminoácidos de longitud, y comprendiendo una cadena de aminoácidos que tiene the fórmula R_{1}-R_{2}-R_{3}-R_{4}-R_{5}, en la que:

R_{1} es un aminoácido K;

R_{2} es un aminoácido que se selecciona del grupo constituido por: (X), Y o F, en el que (X) es ciclohexilalanina;

R_{3} es 3 aminoácidos cada uno de los cuales se selecciona independientemente a partir del grupo constituido por: A, I, S y V;

R_{4} es W-T-L-K; y

R_{5} está constituido por 2 aminoácidos que se seleccionan independientemente a partir del grupo constituido por: A, S y V,

en el que además, dicha cadena de aminoácidos tiene un D-aminoácido en el extremo amino y en el extremo carboxi, donde las letras K, Y, F, A, I, S, V, W, T, L corresponden a los códigos de 1 letra que se usan para la denominación de los aminoácidos.

6. La composición de acuerdo con la reivindicación 5, en la que R_{2} es ciclohexilalanina o fenilalanina; R_{3} es 3 aminoácidos cada uno de los cuales se selecciona independientemente a partir del grupo constituido por alanina, isoleucina y valina; y R_{5} está constituido por 2 alaninas, y en la que dicho D-aminoácido del extremo amino y carboxi es D-alanina.

7. La composición de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el péptido T cooperador es aK(X)VAAWTLKAAa o aKFVAAWTLKAAa, en el que (X) es ciclohexilalanina.

8. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, en la que dicha composición comprende además un péptido inductor de CTL.