ES2657480T3

ES2657480T3 - Péptidos inmunogénicos y su uso en trastornos inmunitarios

Info

Publication number: ES2657480T3
Application number: ES11187013.5T
Authority: ES
Inventors: Jean-Marie Saint-Remy
Original assignee: Katholieke Universiteit Leuven; Life Sciences Research Partners vzw
Current assignee: Katholieke Universiteit Leuven; Life Sciences Research Partners vzw
Priority date: 2006-08-11
Filing date: 2007-08-13
Publication date: 2018-03-05
Anticipated expiration: 2027-08-13
Also published as: US20160194367A1; CA2660605C; US20100303866A1; PT2476436T; EP2476435A2; ES2601432T3; EP2476437B1; WO2008017517A1; EP2059256A1; EP2476436B1; ES2657504T3; EP2476436A2; PL2476436T3; AU2007283731B2; US11718650B2; DK2059256T3; US20200317742A1; EP2476435A3; EP2476435B1; PL2476435T3

Abstract

Un péptido inmunogénico aislado que comprende: - un epítopo de linfocitos T del MHC de clase II de una proteína autoantigénica implicada en esclerosis múltiple; y - un motivo redox C-X(2)-[CT] o [CST]-X(2)-C, estando dicho motivo adyacente a dicho epítopo o separado de dicho epítopo por un máximo de 7 aminoácidos.

Description

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linfocitos B incubados durante 18 horas con un clon de linfocito T citolítico (relación 2/1). El panel derecho representa el mismo ensayo pero llevado a cabo con una célula efectora CD4+ de control. Las curvas discontinuas representan la tinción anti caspasa 3 en linfocitos B cultivados sin linfocitos T.

B: se administraron 5x106 linfocitos B transducidos con p21-35 IV a cada ratón (n = 6), seguido 5 días después de 5x105 Tregs citolíticos. Dos semanas después, los ratones se sacrificaron y las células se prepararon a partir del bazo y los pulmones mediante purificación en gradiente de densidad y selección CD19+ usando perlas magnéticas. La presencia de ARNm que codifica la construcción retrovírica usada para generar linfocitos B transgénicos se detectó mediante PCR. Un grupo de ratones (n = 6), que recibió los linfocitos B transducidos pero no linfocitos T citolíticos, se trató de forma similar. Se analizaron seis ratones en cada grupo y los resultados representativos se muestran en los carriles A para los bazos de 2 ratones tratados con los Tregs citolíticos y en los carriles B para 2 ratones del grupo de control.

C: se administraron 5x105 Tregs citolíticos Vβ8.1+ o un clon de linfocito T de control V8.1+ IV a ratones BALB/c sin tratamiento previo, seguido 24 horas después de tres instilaciones nasales con 100 microgramos de Der p 2. Dos semanas después, los ratones se sacrificaron y los linfocitos pulmonares se prepararon mediante centrifugación en gradiente de densidad. La proporción de células que expresaban Vbeta.8.1 se calculó mediante Facs dentro de la población de células CD4+. Los resultados se expresan como % promedio ± e.t.m. de 6 ratones en cada grupo. El % de CD4 es el porcentaje de CD4 dentro de la población linfocítica total; el % de Vb8.1 es el porcentaje de células que expresan Vb8.1 dentro de la población de células CD4 totales.

La Figura 16 muestra la prevención (a-f) y supresión (g-l) del asma experimental mediante clones de Treg citolíticos de acuerdo con una realización de la invención. Los paneles A a F muestran datos de ratones tratados con Treg citolíticos específicos de mp21-35Asn (clones T1 y T3) antes de la sensibilización IP con Der p 2. (El “clon de linfocito T de control” es específico para el péptido 830-844 del toxoide del tétanos, el “modelo de Der P 2” se refiere a experimentos en los que no se administra ninguna célula a las células). En los paneles G a L los ratones se trataron con las líneas celulares anteriores después de sensibilización IP con Der p 2. Los paneles A y G muestran los números de células BALF totales; los paneles B y H muestran recuentos de células BALF diferenciales; los paneles C e I muestran citocinas BALF como se mide mediante ELISA; los paneles D y J muestran una puntuación semicuantitativa para infiltración pulmonar por eosinófilos y linfocitos. Los paneles E y K muestran recuento de células caliciformes. Los resultados se expresan como la proporción (%) de células caliciformes dentro de la población de células epiteliales después de tinción con PAS; los paneles F y L muestran hiperreactividad de las vías respiratorias evaluada mediante inhalación de concentraciones crecientes de metacolina. Los valores de PenH se determinaron usando un pletismógrafo de cuerpo completo. Los resultados se muestran como “área bajo la curva” (ABC) para valores de PenH. Para comparación, se muestran los valores de ABC obtenidos en ratones sin tratamiento previo en un experimento independiente (sin tratamiento previo). Este grupo proporciona valores de fondo en ensayos tanto de prevención como de supresión. Los datos representan resultados de un mínimo de 5 ratones por grupo. Las barras representan la media ± e.t.m

* P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01 en comparación (valor de P de una cola) con el modelo de Der p 2. La Figura 17 muestra la inducción de apoptosis mediante línea de linfocitos T CD4 efectores específica para epítopo de linfocitos T de Der p1 (114-128), marcado con CFSE e incubado con APC cargadas con el péptido correspondiente (114-128) (panel superior) de acuerdo con una realización de la invención. El panel inferior muestra la mortalidad de línea basal (40 %) cuando un número idéntico de células efectoras (no marcadas) reemplazó el clon de linfocito T regulador. La Figura 18A muestra el recuento de células diferencial de BALF después de instilaciones nasales con 100 μg de Der p1 (modelo) o NaCl (negativo). Se transfirieron de forma adoptiva a ratones linfocitos T citolíticos bien antes (prevención) o bien después (supresión) de la primera serie de instilación nasal con Der p 1. Las barras representan la media ± ETM, *p <0,05; **p <0,01 en comparación con el grupo negativo. La Figura 18B muestra la puntuación de histología después de la transferencia adoptiva de linfocitos T citolíticos de acuerdo con una realización de la invención. Se establecieron puntuaciones para infiltrados de eosinófilos, linfocitos y plasmocitos usando una escala de 0 a 6 (sin lesión a infiltración masiva). Los ratones recibieron 2 series de 3 instilaciones nasales con 100 μg de Der p 1 (modelo) o NaCl (negativo). Se transfirieron de forma adoptiva a los ratones linfocitos T citolíticos bien antes (prevención) o bien después (supresión) de la primera serie de instilación nasal con Der p 1. Las barras representan la media ± ETM, *p <0,05; **p <0,01; ***p <0,001 en comparación con el grupo modelo. La Figura 19A muestra la producción de TNF alfa (histogramas negros) e IFN-gamma (histogramas grises) de clon citolítico estimulado con APC sin usar péptido, usando péptido p21-35 de tipo silvestre (C-x-x-S) o p21-35 mutado con Ser24Cys (C-x-x-C) de acuerdo con una realización de la invención. La Figura 19B muestra la detección por PCR semicuantitativa de transcritos de Granzima (carriles 1 a 3) y Fas-L (carriles 6 a 8). Se estimuló un clon citotóxico con APC cargadas con p21-35 de tipo silvestre (carriles 1, 6), p2135 modificado con Ser24Cys (carriles 2, 7) o sin péptido (carriles 3, 8). Los carriles 4 y 5 son marcadores de peso molecular. La Figura 20 muestra la apoptosis de linfocitos T efectores marcados con CFSE y cocultivados con células APC

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de acuerdo con una realización de la invención. Las barras indican linfocitos T efectores no marcados y péptido MOG de tipo silvestre: Tefect wtMOG; linfocitos Tr y péptido MOG no modificado: Tr wtMOG; linfocitos Tr y péptido MOG modificado que contiene la secuencia de tiorredoxina: Tr CsMOG). Se obtuvieron linfocitos T CD4+ CD25+ de animales inmunizados con péptido MOG que contenía una secuencia consenso de tiorredoxina (CSMOG). Se obtuvieron células CD4+CD25-efectoras de animales EAE (Tefect). La Figura 21 muestra el efecto del péptido MOG modificado por inyección en el desarrollo de EM en un modelo animal. (0: sin enfermedad, 1: cola flácida, 2: cola flácida y pérdida de peso mayor de 10 %, 3: parálisis parcial de las extremidades posteriores, 4: parálisis completa de las extremidades posteriores). Modelo: 3 ratones C57BL/6 recibieron, el día 0, inyección SC de 100 μg de péptido MOG/400 μg de Mycobacterium butyricum en CFA e inyección ip de 300 ng de Bordetella pertussis en NaCl. El día +2, se proporcionó una segunda inyección de B. pertussis. Transferencia adoptiva: 3 ratones recibieron inyección iv con 500.000 Treg, 24 horas antes de la inducción de enfermedad como en el grupo modelo. La Figura 22 muestra la puntuación clínica de ratones con y sin prevención por inyección de péptido MOG en un modelo para Esclerosis Múltiple. La Figura 23 muestra la inducción in vitro de apoptosis en células CD4 policlonales marcadas con CFSE de dos esplenocitos de ratones NOD. Estas células se cocultivaron con APC cargadas con péptido GAD65 524-543 [SEQ ID. NO: 34] junto con células CD4 policlonales purificadas a partir de ratones NOD tratados con péptidos modificados. La figura muestra tinción de células CD4 diana con 7-AAD y anexina V-PE. La tabla representa el porcentaje de células dobles positivas (células muertas).

Descripción detallada

Definiciones

El término “péptido” como se usa en el presente documento se refiere a una molécula que comprende una secuencia de aminoácidos de entre 2 y 200 aminoácidos, conectada por enlaces peptídicos, pero que puede en una realización particular comprender estructuras distintas de aminoácidos (como por ejemplo un compuesto orgánico de enlace). Los péptidos de acuerdo con la invención pueden contener cualquiera de los 20 aminoácidos convencionales o versiones modificadas de los mismos, o pueden contener aminoácidos de origen no natural incorporados por síntesis peptídica química o mediante modificación química o enzimática.

El término “antígeno” como se usa en el presente documento se refiere a una estructura de una macromolécula, típicamente proteína (con o sin polisacáridos) o hecha de composición proteica que comprende uno o más haptenos y que comprende epítopos de linfocitos T. La expresión “proteína antigénica” como se usa en el presente documento se refiere a una proteína que comprende uno o más epítopos de linfocitos T. Un autoantígeno o una proteína autoantigénica como se usa en el presente documento se refieren a una proteína humana o animal presente en el cuerpo, que induce una respuesta inmunitaria dentro del mismo cuerpo humano o animal.

La expresión “proteína antigénica alimentaria o farmacéutica” se refiere a una proteína antigénica presente de forma natural en un producto alimentario o farmacéutico, tal como en una vacuna.

El término “epítopo” se refiere a una o varias partes (que pueden definir un epítopo conformacional) de una proteína antigénica que se reconocen específicamente y a las que se une un anticuerpo o una parte del mismo (Fab’, Fab2’, etc.) o un receptor presentado en la superficie celular de un linfocito B o T, y que es capaz, por dicha unión, de inducir una respuesta inmunitaria.

La expresión “epítopo de linfocitos T” en el contexto de la presente invención se refiere a un epítopo de linfocitos T dominante, subdominante o menor, es decir una parte de una proteína antigénica que es reconocida específicamente y a la que se une un receptor en la superficie celular de un linfocito T. Si un epítopo es dominante, subdominante o menor depende de la reacción inmunitaria inducida contra el epítopo. La dominancia depende de la frecuencia a la que dichos epítopos son reconocidos por linfocitos T y son capaces de activarlos, entre todos los epítopos posibles de linfocitos T de una proteína.

En realizaciones particulares, un epítopo de linfocitos T es un epítopo reconocido por moléculas del MHC de clase II, que consiste en una secuencia de +/-9 aminoácidos que se ajustan en el surco de la molécula del MHC II. Dentro de una secuencia peptídica que representa un epítopo de linfocitos T, los aminoácidos en el epítopo se numeran de P1 a P9, los aminoácidos N terminales del epítopo se numeran P-1, P-2 y así sucesivamente, los aminoácidos C terminales del epítopo se numeran P+1, P+2 y así sucesivamente, como se ilustra en la Figura 3A.

El término “homólogo” como se usa en el presente documento en referencia a los epítopos usados en el contexto de la invención, se refiere a moléculas que tienen al menos 50 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 98 % de identidad de secuencia de aminoácidos con el epítopo de origen natural, manteniendo de este modo la capacidad del epítopo para unirse con un anticuerpo o receptor de superficie celular de un linfocito B y/o T. Las realizaciones particulares de homólogos de un epítopo corresponden al epítopo natural modificado en como máximo tres, más particularmente más particularmente como máximo 2, más particularmente en un aminoácido.

El término “derivado” como se usa en el presente documento en referencia a los péptidos de la invención se refiere

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a moléculas que contienen al menos la parte activa del péptido (es decir capaces de inducir actividad de linfocitos T CD4+ citolíticos) y, además de la misma, comprenden una parte complementaria que puede tener diferentes fines tales como estabilizar los péptidos o alterar las propiedades farmacocinéticas o farmacodinámicas del péptido.

La expresión “identidad de secuencia” de dos secuencias como se usa en el presente documento se refiere al número de posiciones con nucleótidos o aminoácidos idénticos dividido por el número de nucleótidos o aminoácidos en la secuencia más corta, cuando las dos secuencias se alinean. En realizaciones particulares, dicha identidad de secuencia es del 70% al 80%, del 81% al 85%, del 86% al 90%, del 91% al 95%, del 96% al 100% o del 100 %.

La expresión “polinucleótido (o ácido nucleico) que codifica péptido” como se usa en el presente documento se refiere a una secuencia de nucleótidos que, cuando se expresa en un ambiente apropiado, da como resultado la generación de la secuencia peptídica relevante o un derivado u homólogo de la misma. Dichos polinucleótidos o ácidos nucleicos incluyen las secuencias normales que codifican el péptido, así como derivados y fragmentos de estos ácidos nucleicos capaces de expresar un péptido con la actividad requerida. De acuerdo con una realización, el ácido nucleico que codifica los péptidos de acuerdo con la invención o fragmento del mismo es una secuencia que codifica el péptido o fragmento del mismo que se origina de un mamífero o correspondiente a un mamífero, más particularmente un fragmento peptídico humano.

La expresión “compuesto orgánico que tiene una actividad reductora” se refiere en el contexto de la presente invención a compuestos, más en particular secuencias de aminoácidos, con una actividad reductora para enlaces disulfuro en proteínas. La expresión “trastornos inmunitarios” o “enfermedades inmunitarias” se refiere a enfermedades en las que una reacción del sistema inmunitario es responsable de o sostiene una disfunción o situación no fisiológica en un organismo. Se incluyen en los trastornos inmunitarios, entre otros, trastornos alérgicos y enfermedades autoinmunitarias.

Las expresiones “enfermedades alérgicas” o “trastornos alérgicos” como se usan en el presente documento se refieren a enfermedades caracterizadas por reacciones de hipersensibilidad del sistema inmunitario a sustancias específicas denominadas alérgenos (tales como polen, picaduras, fármacos o alimentos). La alergia es el conjunto de señales y síntomas observados siempre que un paciente individual atópico se encuentre con un alérgeno al que se ha sensibilizado, lo que puede dar como resultado el desarrollo de diversas enfermedades, en particular enfermedades y síntomas respiratorios tales como asma bronquial. Existen diversos tipos de clasificaciones y la mayoría de trastornos alérgicos tienen diferentes nombres dependiendo de la parte del cuerpo del mamífero en que se produzca. La “hipersensibilidad” es una reacción indeseable (perjudicial, que produce incomodidad y en ocasiones es letal) producida en un individuo tras exposición a un antígeno al que se ha sensibilizado; la “hipersensibilidad inmediata” depende de la producción de anticuerpos IgE y es por lo tanto equivalente a la alergia.

Las expresiones “enfermedad autoinmunitaria” o “trastorno autoinmunitario” se refieren a enfermedades que resultan de una respuesta inmunitaria aberrante de un organismo contra sus propias células y tejidos debido a una incapacidad del organismo de reconocer sus propias partes constituyentes (hasta el nivel submolecular) como “propias”. El grupo de enfermedades puede dividirse en dos categorías, enfermedades específicas de órganos y sistémicas.

Un “alérgeno” se define como una sustancia, habitualmente una macromolécula o una composición proteica que induce la producción de anticuerpos IgE en pacientes individuales predispuestos, particularmente genéticamente dispuestos (atópicos). Se presentan definiciones similares en Liebers y col. (1996) Clin. Exp. Allergy 26, 494-516.

La expresión “cantidad terapéuticamente efectiva” se refiere a una cantidad del péptido de la invención o derivado del mismo, que produce el efecto terapéutico o preventivo deseado en un paciente. Por ejemplo, en referencia a una enfermedad o un trastorno, es la cantidad que reduce en algún grado uno o más síntomas de la enfermedad o el trastorno, y más particularmente devuelve a la normalidad, parcial o completamente, los parámetros fisiológicos o bioquímicos asociados con o causantes de la enfermedad o el trastorno. De acuerdo con una realización particular de la presente invención, la cantidad terapéuticamente eficaz es la cantidad del péptido de la invención o derivado del mismo que conducirá a una mejora o una restauración de la situación fisiológica normal. Por ejemplo, cuando se usa para tratar terapéuticamente a un mamífero afectado por un trastorno inmunitario, es una cantidad diaria de péptido/kg de peso corporal de dicho mamífero. Como alternativa, cuando la administración es mediante terapia génica, la cantidad de ADN desnudo o vectores víricos se ajusta para asegurar la producción local de la dosificación relevante del péptido de la invención, derivado u homólogo del mismo.

El término “natural” cuando hace referencia a un péptido o a una secuencia en el presente documento se refiere al hecho de que la secuencia es idéntica a una secuencia de origen natural. A diferencia de este, el término “artificial” se refiere a una secuencia o un péptido que, como tal, no aparece en la naturaleza. Opcionalmente, una secuencia artificial se obtiene de una secuencia natural por modificaciones limitadas tales como cambio de uno o más aminoácidos dentro de la secuencia de origen natural o añadiendo aminoácidos en el extremo N o C terminal de una secuencia de origen natural. Los aminoácidos se denominan en el presente documento por su nombre completo, su abreviatura de tres letras o su abreviatura de una letra.

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Los motivos de secuencias de aminoácidos se escriben en el presente documento de acuerdo con el formato de Prosite. El símbolo X se usa para una posición en la que se acepte cualquier aminoácido. Las alternativas se indican enumerando los aminoácidos aceptables para una posición dada, entre corchetes (‘[ ]’). Por ejemplo: [CST] significa un aminoácido seleccionado de Cys, Ser o Thr. Los aminoácidos que se excluyen como alternativas se indican enumerándolos entre llaves (‘{ }’). Por ejemplo: {AM} significa cualquier aminoácido excepto Ala y Met. Los diferentes elementos en un motivo se separan entre sí por un guion -. La repetición de un elemento idéntico dentro de un motivo puede indicarse colocando detrás de ese elemento un valor numérico o un intervalo numérico entre paréntesis. Por ejemplo: X(2) corresponde a X-X, X (2, 4) corresponde a X-X o X-X-X o X-X-X-X, A (3) corresponde a A-A-A.

La presente invención se basa en el hallazgo de que un péptido, que comprende un epítopo de linfocitos T y una secuencia peptídica, que tiene actividad reductora es capaz de generar una población de linfocitos T reguladores que tienen un efecto citotóxico en células presentadoras de antígenos.

En consecuencia, en su sentido más amplio, la invención se refiere a péptidos que comprenden al menos un epítopo de linfocitos T de un antígeno (propio o no propio) con potencial para desencadenar una reacción inmunitaria, acoplado con un compuesto orgánico que tiene una actividad reductora, tal como un motivo de secuencia de tiorreductasa. El epítopo de linfocitos T y el compuesto orgánico se separan opcionalmente por una secuencia de engarce. En realizaciones opcionales adicionales el péptido comprende adicionalmente una secuencia de dirección a endosoma y/o secuencias “flanqueantes” adicionales.

Los péptidos de la invención pueden representarse de forma esquemática como A-L-B o B-L-A, en los que A representa un epítopo de linfocitos T de un antígeno (propio o no propio) con potencial para desencadenar una reacción inmunitaria, L representa un engarce y B representa un compuesto orgánico que tiene una actividad reductora.

La actividad reductora de un compuesto orgánico puede ensayarse con respecto a su capacidad para reducir un grupo sulfhidrilo tal como en el ensayo de solubilidad de insulina descrito en los ejemplos del presente documento en los que la solubilidad de insulina se altera tras la reducción, o con una insulina marcada con fluorescencia. El compuesto orgánico reductor puede acoplarse en el lado amino terminal del epítopo de linfocitos T o en el extremo carboxilo terminal del epítopo de linfocitos T.

En general el compuesto orgánico con actividad reductora es una secuencia peptídica. Se encuentran fragmentos peptídicos con actividad reductora en tiorreductasa que son pequeñas enzimas reductoras de disulfuro que incluyen glutarredoxinas, nucleorredoxinas, tiorredoxinas y otras tiol/disulfuro oxidorreductasas (Holmgren (2000) Antioxid Redox Signal 2, 811-820; Jacquot y col. (2002) Biochem Pharm 64, 1065-1069). Son multifuncionales, ubicuas y se encuentran en muchos procariotas y eucariotas. Ejercen actividad reductora para enlaces disulfuro en proteínas (tales como enzimas) mediante cisteínas redox activas dentro de secuencias consenso de dominio activo conservadas: C-X(2)-C, C-X(2)-S, C-X(2)-T, S-X(2)-C, T-X(2)-C (Fomenko y col. (2003) Biochemistry 42, 1121411225; Fomenko y col. (2002) Prot. Science 11: 2285-2296), en las que X significa cualquier aminoácido. Dichos dominios también se encuentran en proteínas mayores tales como la proteína disulfuro isomerasa (PDI) y fosfolipasa C específica de fosfoinositida (Tabla 1).

Tabla 1: Aparición del motivo CST-X(2)-CST en proteínas reductoras representativas

Organismo: Longitud de la proteína Posición de Cestructura secundaria y Descripción

X(2)-S: en la flanqueante C-X(2)-S

proteína: #

D. pteronyssinus: 129 21-25 b-CHGS-coil Alérgeno Der p 2

E. coli K12: 115 30-35 b-CGFS-a Glutarredoxina

E. coli K12: 104 14-18 b-CGTS-a Arsenato reductasa

S. cerevisiae: 203 108-112 b-CPYS-a homólogo glutarredoxina de

S. cerevisiae: 231 136-140 b-CSYS-a homólogo glutarredoxina de

S. cerevisiae: 517 62-66 b-CLHS-a proteína disulfuro isomerasa

H. sapiens: 793 72-78 b-CGHS-a homólogo tiorredoxina de

# b: cadena beta ; a: hélice alfa

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En realizaciones particulares, sin embargo, los péptidos de la presente invención comprenden solamente un epítopo de linfocitos T.

En consecuencia, los péptidos de acuerdo con la presente invención comprenden, además de un compuesto reductor, un epítopo de linfocitos T derivado de un antígeno, típicamente un alérgeno o un autoantígeno, dependiendo de la aplicación. Como se describe posteriormente un epítopo de linfocitos T en una secuencia proteica puede identificarse por ensayos funcionales y/o uno o más ensayos de predicción por ordenador. Los aminoácidos en una secuencia de epítopo de linfocitos T se numeran de acuerdo con su posición en el surco de unión de las proteínas del MHC. En realizaciones particulares, el epítopo de linfocitos T presente dentro de los péptidos de la invención consiste en entre 8 y 25 aminoácidos, aún más particularmente entre 8 y 16 aminoácidos, aún más particularmente consiste en 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 aminoácidos. En una realización más particular, el epítopo de linfocitos T consiste en una secuencia de 9 aminoácidos. En una realización particular adicional, el epítopo de linfocitos T es un epítopo que se presenta a linfocitos T por moléculas del MHC de clase II. En realizaciones particulares de la presente invención, la secuencia de epítopo de linfocitos T es una secuencia de epítopo que se ajusta a la hendidura de una proteína del MHC II, más particularmente un ajuste nonapeptídico en la hendidura del MHC II.

El epítopo de linfocitos T de los péptidos de la presente invención puede corresponder a una secuencia de epítopo natural de una proteína o puede ser una versión modificada de la misma, siempre que el epítopo de linfocitos T modificado conserve su capacidad para unirse dentro de la hendidura del MHC, similar a la secuencia de epítopo de linfocitos T natural. El epítopo de linfocitos T modificado puede tener la misma afinidad de unión por la proteína del MHC que el epítopo natural, pero también puede tener una afinidad reducida. En realizaciones particulares la afinidad de unión del péptido modificado no es menor de 10 veces menos que el péptido original, más particularmente no menos de 5 veces menos. Es un hallazgo de la presente invención que los péptidos de la presente invención tienen un efecto estabilizador en complejos proteicos. En consecuencia, el efecto estabilizador del complejo de péptido-MHC compensa la afinidad reducida del epítopo modificado por la molécula del MHC. Un ejemplo del mismo es la sustitución Ile28Asn del péptido de Der p 2 p21-35, que a pesar de su menor afinidad por la hendidura del MHC II, es capaz de inducir la misma respuesta de linfocitos T que el péptido de Der p 2 natural p21

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En realizaciones particulares, la secuencia que comprende el epítopo de linfocitos T y el compuesto reductor dentro del péptido se une adicionalmente con una secuencia de aminoácidos (u otro compuesto orgánico) que facilita la captación del péptido en endosomas tardíos para procesamiento y presentación dentro de determinantes del MHC de clase II. La dirección a endosoma tardío está mediada por señales presentes en la cola citoplasmática de proteínas y corresponde a motivos peptídicos bien identificados tales como el motivo basado en dileucina [DE]XXXL[LI] o DXXLL (por ejemplo DXXXLL), el motivo basado en tirosina YXXØ o el denominado motivo de grupo ácido. El símbolo Ø representa restos de aminoácidos con cadenas laterales hidrófobas voluminosas tales como Phe, Tyr y Trp. Las secuencias de dirección a endosoma tardío permiten el procesamiento y la presentación eficaz del epítopo de linfocitos T derivado de antígeno por moléculas del MHC de clase II. Dichas secuencias de dirección endosómica están contenidas, por ejemplo, dentro de la proteína gp75 (Vijayasaradhi y col. (1995) J Cell Biol 130, 807-820), la proteína CD3 gamma humana, la HLA-BM β (Copier y col. (1996) J. Immunol. 157, 1017-1027), la cola citoplasmática del receptor DEC205 (Mahnke y col. (2000) J Cell Biol 151, 673-683). Se desvelan otros ejemplos de péptidos que actúan como señales de clasificación al endosoma en la revisión de Bonifacio y Traub (2003) Annu. Rev. Biochem. 72, 395-447. Como alternativa, la secuencia puede ser la de un epítopo de linfocitos T subdominante

o menor de una proteína, que facilita la captación en el endosoma tardío sin superar la respuesta de linfocitos T hacia el antígeno, es decir epítopo de linfocitos T derivado de alérgeno o autoantígeno.

La secuencia de dirección a endosoma tardío puede localizarse en el extremo amino terminal o en el extremo carboxilo terminal del péptido derivado de autoantígeno o alérgeno para captación y procesamiento eficaz y también puede acoplarse mediante una secuencia flanqueante, tal como una secuencia peptídica de hasta 10 aminoácidos. Cuando se usa un epítopo de linfocitos T menor para fines de dirección, este último se localiza típicamente en el extremo amino terminal del péptido derivado de autoantígeno o alérgeno.

En consecuencia, la presente invención prevé péptidos de proteínas antigénicas y su uso en la inducción de reacciones inmunitarias específicas. Los péptidos de la presente invención pueden corresponder a fragmentos de proteínas que comprenden, dentro de su secuencia, los elementos de la presente invención, es decir un compuesto reductor y un epítopo de linfocitos T separado por como máximo 10, preferentemente 7 aminoácidos o menos. Como alternativa, y para la mayoría de proteínas antigénicas, los péptidos de la invención se generan acoplando un compuesto reductor, más particularmente un motivo reductor como se describe en el presente documento, en dirección N terminal o C terminal de un epítopo de linfocitos T de la proteína antigénica (bien directamente adyacente al mismo o con un engarce de como máximo 10, más particularmente como máximo 7 aminoácidos) para obtener los elementos característicos de la invención. Además la secuencia de epítopo de linfocitos T de la proteína y/o el motivo puede modificarse y/o pueden introducirse (o modificarse) una o más secuencias flanqueantes y/o una secuencia de dirección, en comparación con la secuencia de origen natural. Por lo tanto, dependiendo de si los elementos de la presente invención pueden encontrarse o no dentro de la secuencia de la proteína antigénica de interés, los péptidos de la presente invención pueden comprender una secuencia que es “artificial” o “de origen natural”.

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La longitud de los péptidos de la presente invención puede variar sustancialmente. En realizaciones particulares, en las que el compuesto reductor corresponde al motivo como se describe en el presente documento, la longitud de los péptidos varía de 12-13 aminoácidos, es decir que consiste en un epítopo de 8-9 aminoácidos y adyacente al mismo el motivo como se describe en el presente documento de 4 aminoácidos, hasta 50 o más aminoácidos. Por ejemplo, un péptido de acuerdo con la invención puede comprender una secuencia de dirección endosómica de 40 aminoácidos, una secuencia flanqueante de aproximadamente 2 aminoácidos, un motivo como se describe en el presente documento de 4 aminoácidos, un engarce de 4 aminoácidos y un péptido de epítopo de linfocitos T de 9 aminoácidos.

En consecuencia, en realizaciones particulares, los péptidos completos consisten en entre 12 aminoácidos y 20 hasta 25, 30, 50, 75, 100 o 200 aminoácidos. En realizaciones más particulares, los péptidos consisten en entre 10 y 20 aminoácidos. Más particularmente, cuando el compuesto reductor sea un motivo como se describe en el presente documento, la longitud de la secuencia (artificial o natural) que comprende el epítopo y motivo opcionalmente conectado por un engarce (denominado en el presente documento secuencia de “epítopo-motivo”), sin la secuencia de dirección endosómica, es crítica. El “epítopo-motivo” más particularmente tiene una longitud de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 o 19 aminoácidos, óptimamente de 18 aminoácidos o menos. Dichos péptidos de 12 o 13 a 18 aminoácidos pueden acoplarse opcionalmente con una señal de dirección endosómica de la que el tamaño es menos crítico.

Como se ha detallado anteriormente, en realizaciones particulares, los péptidos de la presente invención comprenden un motivo reductor como se describe en el presente documento ligado a una secuencia de epítopo de linfocitos T. De acuerdo con una realización particular los péptidos son péptidos de proteínas que no comprenden dentro de su secuencia natural nativa una secuencia de aminoácidos con propiedades redox cercanas (es decir dentro de una secuencia de 11 aminoácidos en dirección N o C terminal) del epítopo de interés, más específicamente que no comprenden en su secuencia natural nativa una secuencia consenso de tiorredoxina, glutarredoxina o tiorreductasas u homólogos de las mismas, cerca del epítopo de interés. Más particularmente, la invención abarca la generación de péptidos inmunogénicos de proteínas antigénicas que no comprenden una secuencia seleccionada de C-X(2)-S, S-X(2)-C, C-X(2)-C, S-X(2)-S, C-X( 2)-T, T-X(2)-C, o cualquier otra secuencia consenso que sea típica de secuencias consenso de tiorredoxina, glutarredoxina o tiorreductasas cerca del epítopo de interés, es decir dentro de una secuencia de 11 aminoácidos en dirección N o C terminal de la secuencia de epítopo. En realizaciones particulares adicionales, la presente invención proporciona péptidos inmunogénicos de proteínas antigénicas que no comprenden las secuencias de aminoácidos anteriormente descritas con propiedades redox dentro de su secuencia. En realizaciones particulares adicionales, la proteína antigénica no comprende de forma natural la secuencia C-H-G-S dentro de una secuencia de 11 aminoácidos en dirección N o C terminal de la secuencia de epítopo. Más particularmente la presente invención reivindica péptidos distintos de péptidos que comprenden el epítopo EPCIIHRGKP [SEQ ID NO: 1] del péptido p21-35 de Der p 2 (CHGSEPCIIHRGKPF [SEQ ID NO: 2]) y el motivo C-H-G-S [SEQ ID. NO: 3], en particular los péptidos en los que este motivo se localiza en dirección N terminal de la secuencia de epítopo, ya que dichos péptidos corresponden a péptidos generados en la técnica anterior y usados para inducir una respuesta inmunitaria en el contexto del mapeo de epítopos de Der p 2 (Wu y col. 2002, J. Immunol. 169, 2430-2435).

En realizaciones particulares adicionales, los péptidos de la invención son péptidos que comprenden epítopos de linfocitos T que no comprenden una secuencia de aminoácidos con propiedades redox dentro de su secuencia natural.

Sin embargo, en realizaciones alternativas, el epítopo de linfocitos T puede comprender cualquier secuencia de aminoácidos que asegure la unión del epítopo con la hendidura del MHC. Cuando un epítopo de interés de una proteína antigénica comprenda un motivo tal como se describe en el presente documento dentro de su secuencia de epítopo, los péptidos inmunogénicos de acuerdo con la presente invención comprenden la secuencia de un motivo como se describe en el presente documento y/o de otra secuencia reductora acoplada en dirección N o C terminal con la secuencia de epítopo de modo que (a diferencia del motivo presente dentro del epítopo, que está internado dentro de la hendidura) el motivo unido puede asegurar la actividad reductora.

En realizaciones particulares, los péptidos de la presente invención no son péptidos naturales sino artificiales que contienen, además de un epítopo de linfocitos T, un motivo como se describe en el presente documento, por el que el motivo se separa opcionalmente del epítopo de linfocitos T por un engarce que consiste en hasta siete, más particularmente hasta cuatro aminoácidos.

En una realización particular, se proporcionan péptidos de acuerdo con la invención de la proteína Der p 2, que comprenden un motivo como se describe en el presente documento y un epítopo de Der p 2. Más particularmente se proporcionan péptidos que comprenden una o más copias del epítopo nonapeptídico EPCIIHRGKP [SEQ ID NO: 1] de Der p 2 cada una unida con un motivo reductor que consiste en el motivo C-X2-C. Como alternativa, se proporcionan péptidos de la proteína Der p 2 que comprenden un epítopo de linfocitos T distinto de una secuencia que comprende EPCIIHRGKP [SEQ ID NO: 1] ligada a un motivo C-X(2)-[CST] o [CST]-X (2)-C. Los péptidos de la invención comprenden opcionalmente una secuencia de dirección endosómica. Más particularmente, se proporcionan péptidos inmunogénicos de Der p 2 que comprenden el motivo de C-X2-C.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a los procesos para generar péptidos inmunogénicos de la presente

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invención (o una composición que comprende dicho péptido), el péptido induce la activación de linfocitos T que reconocen el péptido de linfocitos T derivado de antígeno (es decir el alérgeno o autoantígeno) y proporciona una señal adicional al linfocito T mediante reducción del receptor de superficie. Esta activación supraóptima da como resultado linfocitos T que adquieren propiedades citotóxicas para la célula que presenta el epítopo de linfocitos T, así como propiedades supresoras en linfocitos T testigos. De esta manera, los péptidos o la composición que comprende los péptidos descritos en la presente invención, que contienen un epítopo de linfocitos T derivado de antígeno y, fuera del epítopo, un compuesto reductor puede usarse para inmunización directa de mamíferos, incluyendo seres humanos.

Un aspecto de la invención proporciona por lo tanto péptidos de la invención o derivados de los mismos, para su uso como una medicina. En consecuencia, la presente invención proporciona procedimientos terapéuticos que comprenden administrar uno o más péptidos de acuerdo con la presente invención a un paciente que lo necesite.

La presente invención ofrece procedimientos por los que pueden inducirse linfocitos T específicos de alérgeno/antígeno dotados de propiedades citotóxicas mediante inmunización con péptidos pequeños. Se ha descubierto que los péptidos que contienen (i) una secuencia que codifica un epítopo de linfocitos T de un antígeno (es decir alérgeno, autoantígeno) y (ii) una secuencia consenso con propiedades redox, y que también comprende opcionalmente además una secuencia para facilitar la captación del péptido en endosomas tardíos para presentación por MHC de clase II eficaz, inducen linfocitos T supresores.

Las propiedades inmunogénicas de los péptidos de la presente invención son particularmente interesantes en el tratamiento y la prevención de reacciones inmunitarias. En consecuencia, otro aspecto de la presente invención posibilita el uso de los péptidos descritos en el presente documento como un medicamento, más particularmente para la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de un trastorno inmunitario en un mamífero, más particularmente en un ser humano.

Otro aspecto de la presente invención se refiere por lo tanto a un procedimiento de tratamiento o prevención de un trastorno inmunitario de un mamífero que necesite dicho tratamiento o prevención, usando los péptidos de la invención, homólogos o derivados de los mismos, comprendiendo los procedimientos la etapa de administrar a dicho mamífero que padece o está en riesgo de un trastorno inmunitario una cantidad terapéuticamente eficaz de los péptidos de la invención, homólogos o derivados de los mismos tal como para reducir los síntomas del trastorno inmunitario. Se prevé el tratamiento tanto de seres humanos como de animales, tal como, pero sin limitación, mascotas y caballos.

Los trastornos inmunitarios indicados anteriormente se seleccionan en una realización particular de enfermedades alérgicas y enfermedades autoinmunitarias. Las enfermedades alérgicas se describen convencionalmente como enfermedades mediadas por tipo 1 o enfermedades mediadas por IgE. Las manifestaciones clínicas de enfermedades alérgicas incluyen asma bronquial, rinitis alérgica, dermatitis atópica, hipersensibilidad alimentaria y reacciones anafilácticas a picaduras de insectos o fármacos. Las enfermedades alérgicas están provocadas por reacciones de hipersensibilidad del sistema inmunitario a sustancias específicas denominadas alérgenos (tales como polen, picaduras, fármacos o alimentos). La forma más grave de un trastorno alérgico es el choque anafiláctico, que es una urgencia médica. Los alérgenos incluyen alérgenos portados por el aire, tales como los de ácaros del polvo domésticos, mascotas y pólenes. Los alérgenos también incluyen alérgenos ingeridos responsables de la hipersensibilidad alimentaria, incluyendo frutas, verduras y leche.

Para tratar las enfermedades anteriores, se generan péptidos de acuerdo con la invención a partir de las proteínas antigénicas o alérgenos conocidos o que se cree que son un factor causante de la enfermedad. Los alérgenos que pueden usarse para la selección de epítopos de linfocitos T son típicamente alérgenos que se seleccionan del grupo que consiste en:

-alérgenos alimentarios presentes en cacahuetes, pescado por ejemplo bacalao, clara de huevo, crustáceos por

ejemplo gambas, leche por ejemplo leche de vaca, trigo, cereales, frutas de la familia de las rosáceas (manzana,

ciruela, fresa), verduras de las familias de liliáceas, crucíferas, solanáceas y umbelíferas, frutos secos, sésamo,

cacahuete, soja y otros alérgenos de la familia de las legumbres, especias, melón, aguacate, mango, higo,

plátano, etc. -alérgenos de ácaros del polvo domésticos obtenidos de Dermatophagoides spp o D. pteronyssinus, D. farinae y

D. microceras, Euroglyphus maynei o Blomia sp., -alérgenos de insectos presentes en cucarachas o himenópteros, -alérgenos del polen, especialmente pólenes de árboles, hierba y pasto, -alérgenos de animales, especialmente en gatos, perros, caballos y roedores, -alérgenos de hongos, especialmente de Aspergillus, Alternaria o Cladosporium, y -alérgenos ocupacionales presentes en productos tales como látex, amilasa, etc.

El epítopo de linfocitos T correspondiente a una proteína antigénica (o inmunógeno) adecuado para su uso en el contexto de la presente invención es típicamente un epítopo de linfocitos T universal o promiscuo (es decir un epítopo de linfocitos T capaz de unirse con una mayoría de las moléculas del MHC de clase II), más particularmente presente en un alérgeno portado por el aire o un alérgeno portado por alimentos. En realizaciones particulares, dicho

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alérgeno se selecciona del grupo que consiste en alérgenos de rinosinusitis, alérgenos de asma bronquial alérgica y alérgenos de dermatitis atópica.

Los alérgenos también pueden ser alérgenos principales presentes en mohos o diversos fármacos tales como hormonas, antibióticos, enzimas, etc. (véase también la definición en Clin. Exp. Allergy 26, 494-516 (1996) y en Molecular Biology of Allergy and Immunology, Ed. R. Bush (1996)). Otros alérgenos relacionados con enfermedades alérgicas específicas también se conocen bien en la técnica y pueden encontrarse en Internet, por ejemplo en www.allergome.org.

Se clasifican ampliamente enfermedades autoinmunitarias en dos categorías, enfermedades específicas de órganos y sistémicas. No se ha identificado la etiología precisa de enfermedades autoinmunitarias sistémicas. Por el contrario, las enfermedades autoinmunitarias específicas de órganos están relacionadas con una respuesta inmunitaria específica incluyendo linfocitos B y T, que se dirige al órgano y de este modo induce y mantiene un estado crónico de inflamación local. Los ejemplos de enfermedades autoinmunitarias específicas de órganos incluyen diabetes de tipo 1, miastenia grave, tiroiditis y esclerosis múltiple. En cada una de estas afecciones, se ha identificado un único autoantígeno o un número pequeño de autoantígenos, incluyendo insulina, el receptor muscular de acetilcolina, peroxidasa tiroidea y proteína básica principal, respectivamente. Está bien reconocido que la supresión de esta respuesta inmunitaria específica de órgano es beneficiosa y conduce a recuperación parcial o completa de la función orgánica. No hay, sin embargo, ninguna terapia que suprima dicha respuesta inmunitaria de una manera específica de antígeno. La terapia actual hace uso en su lugar de la supresión no específica obtenida por el uso de corticosteroides y agentes inmunosupresores, que muestran todos efectos secundarios significativos relacionados con su ausencia de especificidad, limitando de este modo su uso y su eficacia general. La Tabla 2 muestra una lista no limitante de ejemplos de autoantígenos conocidos que están ligados a trastornos autoinmunitarios específicos de órgano y que se prevén dentro del contexto de la presente invención.

Tabla 2. Autoantígenos representativos y enfermedades ligadas con los mismos

Enfermedad antígeno

enfermedades tiroideas tiroglobulina peroxidasa tiroidea receptor de TSH

diabetes de tipo 1 insulina (proinsulina) ácido glutámico descarboxilasa (GAD) tirosina fosfatasa IA-2 proteína de choque térmico HSP65 proteína relacionada con la subunidad catalítica de la glucosa-6-fosfatasa específica de islotes (IGRP)

adrenalitis 21-OH hidroxilasa

síndromes poliendocrinos 17-alfa hidroxilasa histidina descarboxilasa triptófano hidroxilasa tirosina hidroxilasa

gastritis y anemia perniciosa factor intrínseco de H+/K+ ATPasa

esclerosis múltiple glucoproteína de oligodendrocito de mielina (MOG) proteína básica de mielina (MBP) proteína proteolipídica (PLP)

miastenia grave receptor de acetilcolina enfermedades oculares proteína de unión a retinol (RBP)

enfermedades del oído interno colágeno de tipo II y tipo IX enfermedad celíaca transglutaminasa tisular enfermedades inflamatorias del proteína de histona H1 pANCA intestino ateroesclerosis proteína de choque térmico HSP60

De acuerdo con la presente invención, se proporcionan péptidos inmunogénicos que comprenden un epítopo de linfocitos T de un antígeno (propio o no propio) con potencial para desencadenar una reacción inmunitaria, tal como un alérgeno o un autoantígeno, tal como los descritos en la Tabla 2. En una realización particular, el epítopo de linfocitos T es un epítopo de linfocitos T dominante.

En consecuencia, en realizaciones particulares, los procedimientos de tratamiento y prevención de la presente invención comprenden la administración de un péptido inmunogénico como se describe en el presente documento, en el que el péptido comprende un epítopo de linfocitos T de una proteína antigénica que desempeña un papel en la enfermedad para tratar (por ejemplo tal como las descritas en la Tabla 2 anterior). En realizaciones particulares

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adicionales, el epítopo usado es un epítopo dominante.

La identificación y selección de un epítopo de linfocitos T de dichas proteínas antigénicas, más en particular de alérgenos o autoantígenos, para uso en el contexto de la presente invención es conocida por un experto en la materia.

Para identificar un epítopo adecuado para su uso en el contexto de la presente invención, se ensayan secuencias peptídicas aisladas de una proteína antigénica, por ejemplo, mediante técnicas de biología de linfocitos T, para determinar si las secuencias peptídicas inducen una respuesta de linfocitos T. Las secuencias peptídicas que se ha descubierto que inducen una respuesta de linfocitos T se definen como poseedoras de actividad estimulante de linfocitos T.

La actividad estimulante de linfocitos T humanos puede ensayarse adicionalmente cultivando linfocitos T obtenidos de un individuo sensible a, por ejemplo, un alérgeno de ácaros (es decir un individuo que tiene una respuesta inmunitaria mediada por IgE a un alérgeno de ácaros) con un péptido/epítopo derivado del alérgeno y determinar si se produce proliferación de linfocitos T en respuesta al péptido/epítopo como se mide, por ejemplo, por captación celular de timidina tritiada. Los índices de estimulación para respuestas por linfocitos T a péptidos/epítopos pueden calcularse como la CPM máxima en respuesta a un péptido/epítopo dividido por la CPM de control. Un índice de estimulación (I.E.) de linfocitos T igual a o mayor de dos veces el nivel de fondo se considera “positivo”. Se usan resultados positivos para calcular el índice de estimulación medio para cada péptido/epítopo para el grupo de péptidos/epítopos ensayado.

Los epítopos de linfocitos T no naturales (o modificados) pueden opcionalmente ensayarse adicionalmente con respecto a su afinidad de unión por moléculas del MHC de clase II. Esto puede realizarse de diferentes maneras. Por ejemplo, se obtienen moléculas del HLA de clase II solubles mediante lisis de células homocigotas para una molécula de clase II dada. Esta última se purifica por cromatografía de afinidad. Se incuban moléculas de clase II solubles con un péptido de referencia marcado con biotina producido de acuerdo con su afinidad de unión fuerte por esa molécula de clase II. Los péptidos para evaluar con respecto a unión a clase II se incuban después a diferentes concentraciones y su capacidad para desplazar el péptido de referencia de su unión a clase II se calcula por la adición de neutravidina. Pueden encontrarse procedimientos por ejemplo en Texier y col., (2000) J. Immunology 164, 3177-3184).

De acuerdo con la presente invención, las propiedades inmunogénicas de epítopos de linfocitos T se aumentan ligándolos a un compuesto reductor. Particularmente, los péptidos de la presente invención que comprenden al menos un epítopo de linfocitos T y el compuesto reductor como se describe en el presente documento tienen un índice de estimulación de linfocitos T medio de más de o igual a 2,0. Un péptido que tiene un índice de estimulación de linfocitos T de más de o igual a 2,0 se considera útil como un agente terapéutico. Más particularmente, los péptidos de acuerdo con la invención tienen un índice de estimulación de linfocitos T medio de al menos 2,5, al menos 3,5, al menos 4,0 o incluso al menos 5,0. Además, los péptidos tienen típicamente un índice de positividad (I.P.) de al menos aproximadamente 100, al menos 150, al menos aproximadamente 200 o al menos aproximadamente 250. El índice de positividad para un péptido se determina multiplicando el índice de estimulación de linfocitos T medio por el porcentaje de individuos, en una población de individuos sensibles a ácaros del polvo domésticos (por ejemplo, al menos 9 individuos, al menos 16 individuos o al menos 29 o 30, o incluso más), que tienen linfocitos T que responden al péptido (correspondiente por lo tanto al IE multiplicado por la naturaleza promiscua del péptido/epítopo). Por lo tanto, el índice de positividad representa tanto la fuerza de una respuesta de linfocitos T a un péptido (I.E.) como la frecuencia de una respuesta de linfocitos T a un péptido en una población de individuos sensibles a ácaros del polvo domésticos.

Para determinar los epítopos de linfocitos T óptimos, por ejemplo, mediante técnicas de mapeo fino, un péptido que tiene actividad estimulante de linfocitos T y por lo tanto comprende al menos un epítopo de linfocitos T como se determina por técnicas de biología de linfocitos T se modifica mediante la adición o supresión de restos de aminoácidos en el extremo amino o carboxilo terminal del péptido y se ensaya para determinar un cambio en la reactividad de linfocitos T al péptido modificado. Si se descubre que dos o más péptidos que comparten un área de solapamiento en la secuencia de proteína nativa tienen actividad estimulante de linfocitos T humanos, como se determina por técnicas de biología de linfocitos T, pueden producirse péptidos adicionales que comprenden todos o una parte de dichos péptidos y estos péptidos adicionales pueden ensayarse por un procedimiento similar. Siguiendo esta técnica, los péptidos se seleccionan y producen de forma recombinante o sintética. Los epítopos o péptidos de linfocitos T se seleccionan basándose en diversos factores, incluyendo la fuerza de la respuesta de linfocitos T al péptido/epítopo (por ejemplo, índice de estimulación) y la frecuencia de la respuesta de linfocitos T al péptido en una población de individuos.

Adicionalmente y/o como alternativa, pueden usarse uno o más algoritmos in vitro para identificar una secuencia de epítopo de linfocitos T dentro de una proteína antigénica. Los algoritmos adecuados incluyen, pero sin limitación, los hallados en los siguientes sitios web:

-http://antigen.i2r.a-star.edu.sg/predBalbc/; -http://antigen.i2r.a-star.edu.sg/predBalbc/;

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-http://www.imtech.res.in/raghava/mhcbn/; -http://www.syfpeithi.de/home.htm; -http://www-bs.informatik.uni-tuebingen.de/SVMHC; -hftp://bio.dfci.harvard.edu/Tools/antigenic.html; -http://www.jenner.ac.uk/MHCPred/.

Más particularmente, dichos algoritmos permiten la predicción dentro de una proteína antigénica de una o más secuencias nonapeptídicas que se ajustarán al surco de una molécula del MHC II.

Los péptidos de la presente invención pueden generarse usando técnicas de ADN recombinante, en células de bacterias, levadura, insectos, células vegetales o células de mamífero. A la vista de la longitud limitada de los péptidos, estos pueden prepararse por síntesis química de péptidos, en la que los péptidos se preparan por acoplamiento de los diferentes aminoácidos entre sí. La síntesis química es particularmente adecuada para la inclusión de, por ejemplo, D-aminoácidos, aminoácidos con cadenas laterales de origen no natural o aminoácidos naturales con cadenas laterales modificadas tales como cisteína metilada.

Están bien descritos procedimientos de síntesis química de péptidos y los péptidos pueden pedirse de compañías tales como Applied Biosystems y otras compañías.

Pueden realizarse síntesis de péptidos como síntesis de péptidos de fase sólida (SPPS) o por el contrario síntesis de péptidos en fase de solución. Los procedimientos de SPPS mejor conocidos son t-Boc y química de fase sólida de Fmoc:

Durante la síntesis de péptidos se usan varios grupos protectores. Por ejemplo, las funcionalidades de hidroxilo y carboxilo se protegen por grupo de t-butilo, lisina y triptófano se protegen por grupo de t-Boc y asparaginas, glutamina, cisteína e histidina se protegen por grupo de tritilo, y arginina se protege por el grupo pbf. En realizaciones particulares, dichos grupos protectores pueden dejarse en el péptido después de la síntesis.

Los péptidos pueden ligarse entre sí para formar péptidos más largos usando una estrategia de ligamiento (acoplamiento quimioselectivo de dos fragmentos peptídicos desprotegidos) como se ha descrito originalmente en Kent (Schnolzer y Kent (1992) Int. J. Pept. Protein Res. 40, 180-193) y se revisa por ejemplo en Tam y col. (2001) Biopolymers 60, 194-205 que proporciona un enorme potencial de conseguir síntesis de proteínas que está más allá del alcance de SPPS. Se han sintetizado muchas proteínas con un tamaño de 100-300 restos con éxito por este procedimiento. Los péptidos sintéticos han continuado desempeñando un papel crucial cada vez mayor en los campos de investigación de bioquímica, farmacología, neurobiología, enzimología y biología molecular debido a los enormes avances en la SPPS.

Como alternativa, los péptidos pueden sintetizarse usando moléculas de ácido nucleico que codifican los péptidos de la presente invención en un vector de expresión apropiado que incluye las secuencias de nucleótidos codificantes. Dichas moléculas de ADN pueden prepararse fácilmente usando un sintetizador de ADN automático y la relación de codón-aminoácido bien conocida del código genético. Dicha molécula de ADN también puede obtenerse como ADN genómico o como ADNc usando sondas oligonucleotídicas y metodologías de hibridación convencionales. Dichas moléculas de ADN pueden incorporarse en vectores de expresión, incluyendo plásmidos, que se adaptan para la expresión del ADN y producción del polipéptido en un hospedador adecuado tal como bacteria, por ejemplo Escherichia coli, célula de levadura, célula animal o célula vegetal.

Las propiedades físicas y químicas de un péptido de interés (por ejemplo solubilidad, estabilidad) se examinan para determinar si el péptido es/sería adecuado para su uso en composiciones terapéuticas. Típicamente esto se optimiza ajustando la secuencia del péptido. Opcionalmente, el péptido puede modificarse después de la síntesis (modificaciones químicas por ejemplo adición/supresión de grupos funcionales) usando técnicas conocidas en este campo.

Se cree que los epítopos de linfocitos T por sí solos desencadenan acontecimientos tempranos en el nivel de linfocito T auxiliar uniéndose con una molécula del HLA apropiada en la superficie de una célula presentadora de antígenos y estimulando la subpoblación de linfocitos T relevante. Estos acontecimientos conducen a la proliferación de linfocitos T, secreción de linfocinas, reacciones inflamatorias locales, el reclutamiento de células inmunitarias adicionales al sitio, y activación de la cascada de linfocitos B que conduce a la producción de anticuerpos. Un isotipo de estos anticuerpos, IgE, es fundamentalmente importante en el desarrollo de síntomas alérgicos y su producción está influida pronto en la cascada de acontecimientos, al nivel del linfocito T auxiliar, por la naturaleza de las linfocinas secretadas. Un epítopo de linfocitos T es el elemento básico o unidad más pequeña de reconocimiento por un receptor de linfocitos T en el que el epítopo comprende restos de aminoácidos esenciales para el reconocimiento de receptores, que son contiguos en la secuencia de aminoácidos de la proteína.

Sin embargo, tras la administración de los péptidos de acuerdo con la invención (que comprenden un epítopo de linfocitos T acoplado a una secuencia redox) o composiciones de los mismos, se cree que se producen los siguientes acontecimientos:

• activación de linfocitos T específicos de antígeno (es decir alérgeno o autoantígeno) resultante de la interacción

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afín con el péptido derivado de antígeno (es decir alérgeno o autoantígeno) presentado por moléculas del MHC de clase II;

•: la secuencia consenso de reductasa reduce proteínas de superficie de linfocitos T, tales como la molécula CD4 (y también CD3), cuyo segundo dominio contiene un enlace disulfuro restringido. Esto transduce una señal a linfocitos T. Entre una serie de consecuencias relacionadas con la ruta oxidativa aumentada, son acontecimientos importantes el aumento del flujo de entrada de calcio y la translocación del factor de transcripción NF-κB al núcleo. Esto último da como resultado el aumento de la transcripción de IFN gamma y granzimas, lo que permite que las células adquieran propiedades citotóxicas;

•: la citotoxicidad afecta a células que presentan el péptido por un mecanismo, que implica secreción de granzima B, e interacciones Fas-FasL. La destrucción de las células diana presentadoras de antígenos evita la activación de otros linfocitos T específicos para epítopos localizados en el mismo antígeno, o para un antígeno no relacionado que se procesaría por la misma célula presentadora de antígenos;

•: una consecuencia adicional de la activación de linfocitos T es suprimir la activación de linfocitos T testigos por un mecanismo dependiente del contacto célula-célula. En tal caso, los linfocitos T activados por un antígeno presentado por una célula presentadora de antígenos diferente también se suprimen siempre que los linfocitos T tanto citotóxicos como testigos estén en proximidad estrecha.

El mecanismo de acción anteriormente postulado está fundamentado en datos experimentales (véase ejemplos anteriores). Algunos experimentos también han sugerido, además, la implicación de la ruta de la perforina y/o la activación de la indoleamina oxidasa en células diana, lo que da como resultado aumento del catabolismo de triptófano, un aminoácido esencial para supervivencia celular, así como la producción de micropartículas por Treg activados.

Los experimentos en modelos in vivo descritos posteriormente han demostrado que la administración (es decir inyección) de un péptido de acuerdo con la invención o una composición del mismo puede prevenir o suprimir una respuesta inmunitaria específica de antígeno. Como ejemplo, en un modelo de ratón de asma debido a la sensibilización de un alérgeno, Der p 2, la preinmunización con un péptido de acuerdo con la invención descrito anteriormente evita la infiltración de células inflamatorias de pulmón, que es una característica del asma. La hiperreactividad de las vías respiratorias no específica, como se mide por inhalación de dosis creciente de metacolina, se previene esencialmente por el mismo protocolo experimental. También se previene completamente la migración de células al fluido broncoalveolar (véase ejemplo 4). Además, la transferencia adoptiva de clones de linfocitos T (derivados de animales inmunizados con la composición) previene y suprime completamente tanto la infiltración de células inflamatorias como la hiperreactividad de las vías respiratorias en receptores. Dichos clones de linfocitos T que son inducidos por la administración de los péptidos de acuerdo con la invención presentan varias características fenotípicas, que los hacen distintos de los Treg actualmente identificados, bien Treg naturales o bien Treg adaptativos. Por lo tanto, los Treg citotóxicos muestran aumento de la expresión de marcadores de superficie incluyendo CD103, CTLA-4, FasL e ICOS (tras la activación). Son CD25alto incluso en reposo y CD127bajo (IL7-R). La expresión del factor de transcripción incluye T bet pero no el represor de la transcripción Foxp3, considerado como un distintivo de los Treg naturales. Aparte de la alta producción de IFN gamma, dichos clones no secretan o secretan solamente cantidades traza de IL-10, IL-4, IL-5, IL-13 o TGF beta. Las características anteriores no son exclusivas, sino que se proporcionan como una ilustración del hecho de que dichos Treg citotóxicos son distinguibles de otros Treg conocidos.

En consecuencia, en un aspecto adicional más, la presente invención proporciona procedimientos para generar Treg citotóxicos específicos de antígeno bien in vivo o bien in vitro e, independientemente de los mismos, procedimientos para diferenciar Treg citotóxicos de otros Treg basándose en los datos de expresión característicos anteriormente descritos.

Un aspecto de la presente invención se refiere a procedimientos in vivo para la producción de los Treg específicos de antígeno de la invención. Una realización particular se refiere al procedimiento para producir o aislar dichos Treg inmunizando animales (incluyendo seres humanos) con los péptidos de la invención como se describe en el presente documento y después aislando los Treg de dichos animales inmunizados. Se describen procedimientos más detallados en la sección de Ejemplos del presente documento y son parte de la invención.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a procedimientos in vitro para la producción de Treg específicos de antígeno de la invención. Los Treg son cruciales en la inmunorregulación y tienen gran potencial terapéutico. La eficacia de inmunoterapia basada en Treg depende críticamente de la especificidad de Ag de los linfocitos T reguladores. Además, el uso de Treg específicos de Ag a diferencia de Treg expandidos policlonales reduce el número total de Treg necesarios para la terapia. La generación de linfocitos T reguladores in vitro usando procedimientos conocidos en la técnica tiene varias desventajas importantes. El porcentaje de Treg dentro de una muestra de células periféricas aisladas es aproximadamente 5 % y el cultivo de linfocitos Treg es difícil, de modo que la cantidad de Treg siempre está limitada. Además, los Treg generados de esta manera no son específicos y por lo tanto no son capaces de suprimir una respuesta inmunitaria específica, sino que tienen solamente un efecto inmunosupresor general cuando se administran a un paciente. En consecuencia, se han desarrollado estrategias para el desarrollo de procedimientos de selección que permitan la selección y expansión de Treg específicos de Ag, altamente potentes. Sin embargo, el número de linfocitos Treg específicos de antígeno obtenidos de esta manera sigue siendo limitado.

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La presente invención proporciona procedimientos para generar linfocitos T reguladores específicos de antígeno que tienen actividad citotóxica.

En una realización, se proporcionan procedimientos que comprenden el aislamiento de células sanguíneas periféricas, la estimulación de la población celular in vitro por un péptido inmunogénico de acuerdo con la invención y la expansión de la población celular estimulada, más particularmente en presencia de IL-2. Los procedimientos de acuerdo con la invención tienen la ventaja de que se producen números mayores de Treg y que pueden generarse los Treg que son específicos para la proteína antigénica (usando un péptido que comprende un epítopo específico de antígeno.

En una realización alternativa, los Treg pueden generarse in vivo, es decir, mediante la inyección de los péptidos inmunogénicos descritos en el presente documento a un sujeto, y la recogida de los Treg generados in vivo.

Los linfocitos T reguladores específicos de antígeno que pueden obtenerse por los procedimientos de la presente invención son particularmente interesantes para la administración a mamíferos para inmunoterapia, en la prevención de reacciones alérgicas y en el tratamiento de recaídas en enfermedades autoinmunitarias. Se prevén tanto el uso de células alogénicas como el uso de células autogénicas.

En consecuencia, un aspecto de la presente invención proporciona poblaciones de Treg citotóxicos caracterizadas como se describe posteriormente en el presente documento. Más particularmente, las poblaciones de poblaciones de Treg de la presente invención se obtienen por los procedimientos descritos en el presente documento.

En consecuencia, la presente invención proporciona Treg específicos de antígeno con propiedades citotóxicas de acuerdo con la invención para su uso como un medicamento, más particularmente para su uso en terapia celular adoptiva, más particularmente en el tratamiento de reacciones alérgicas agudas y recaídas de enfermedades autoinmunitarias tales como esclerosis múltiple. La presente invención también se refiere al uso de dichos Treg aislados o poblaciones de linfocitos Treg generados como se describe en el presente documento, más particularmente poblaciones de linfocitos Treg específicos de antígeno generadas como se describe en el presente documento para la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de trastornos inmunitarios. De forma similar, la invención se refiere a procedimientos de tratamiento mediante el uso de dichos Treg aislados o población de Treg generada.

Un aspecto adicional de la presente invención proporciona procedimientos para diferenciar linfocitos Treg citotóxicos de otros linfocitos Treg basándose en características de expresión de las células. Más particularmente, los procedimientos de acuerdo con la invención comprenden determinar si la población de linfocitos Treg demuestra una

o más de las siguientes características en comparación con una población de linfocitos Treg no citotóxicos:

-un aumento de la expresión de marcadores de superficie incluyendo CD103, CTLA-4, FasL e ICOS tras la

activación, -alta expresión de CD25, -expresión de CD4, ICOS, CTLA-4, GITR y baja o ninguna expresión de CD127 (IL7-R), -expresión del factor de transcripción T-bet y egr-2 (Krox-20) pero no del represor de la transcripción Foxp3, -una alta producción de IFN-gamma y ninguna cantidad o solamente cantidades traza de IL-10, IL-4, IL-5, IL-13 o

TGF-beta.

Más particularmente, los procedimientos de la presente invención comprenden determinar que las células expresan CD4, que no expresan IL-10 o TGF-beta, que expresan Krox-20 y producen granzimas y ligando de Fas. Más particularmente estas células se seleccionan adicionalmente de forma funcional como células que no responden a la activación por reconocimiento de TCR. En realizaciones particulares adicionales, los procedimientos abarcan determinar todas las características descritas anteriormente.

Durante los últimos años se ha realizado un gran progreso en la caracterización de linfocitos T reguladores (Treg) en condiciones tanto fisiológicas como patológicas. Más particularmente, se ha analizado el potencial del uso de Treg para la terapia de algunas enfermedades. La presente invención se refiere al desarrollo de un subconjunto de nueva definición de Treg adoptivos específicos de antígeno que difiere de los Treg previamente indicados por el procedimiento usado para inducción in vitro o in vivo y por propiedades específicas. Los Treg pertenecen a dos categorías amplias, es decir Treg naturales y Treg inducidos (o adaptativos). Los Treg naturales se han descrito por primera vez en el ratón en 1995, y se definen como un subconjunto de linfocitos T CD4+ seleccionados de forma activa en el timo. Dichas células se caracterizan por la expresión de varios marcadores de superficie, incluyendo CD25 en células en reposo, GITR, CTLA-4 y LAG-3. Más recientemente, los Treg naturales se han definido adicionalmente por la falta de expresión de CD127 (IL-7R). El represor de la transcripción Foxp3 desempeña un papel determinante en la selección de Treg naturales. Las mutaciones de Foxp3 dan como resultado la ausencia de Treg naturales, con una desregulación inmunitaria ligada a X con poliendocrinopatía, enteropatía, manifestaciones atópicas e infecciones letales. Dichos Treg naturales suprimen diversos procesos inflamatorios incluyendo síndromes gastrointestinales. A nivel molecular, Foxp3 se combina con el factor de transcripción de NFAT en competición con AP1, y de este modo regula la transcripción de varias citocinas. El mecanismo de acción de Treg naturales se está sometiendo a un escrutinio intenso. In vitro, dichas células producen IL-10 y TGF-beta. In vivo, sin

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metales alcalinos o alcalinotérreos, sales de amonio no sustituidas o sustituidas de ácidos grasos superiores (C10-C22), por ejemplo las sales de sodio o potasio de ácido oleico o esteárico, o de mezclas de ácidos grasos naturales que pueden obtenerse de aceite de coco o aceite de sebo. Los tensioactivos sintéticos incluyen sales de sodio o calcio de ácidos poliacrílicos; sulfonatos y sulfatos grasos; derivados de bencimidazol sulfonado y alquilarilsulfonatos. Los sulfonatos o sulfatos grasos están habitualmente en forma de sales de metales alcalinos o alcalinotérreos, sales de amonio no sustituidas o sales de amonio sustituidas con un radical de alquilo o acilo que tiene de 8 a 22 átomos de carbono, por ejemplo la sal de sodio o calcio de ácido lignosulfónico o ácido dodecilsulfónico o una mezcla de sulfatos de alcohol graso obtenidos de ácidos grasos naturales, sales de metales alcalinos o alcalinotérreos de ésteres de ácido sulfúrico o sulfónico (tales como lauril sulfato sódico) y ácidos sulfónicos de aductos de óxido de etileno/alcohol graso. Los derivados de bencimidazol sulfonado adecuados típicamente contienen de 8 a 22 átomos de carbono. Son ejemplos de alquilarilsulfonatos las sales de sodio, calcio o alcanolamina de ácido dodecilbencenosulfónico o ácido dibutilnaftalenosulfónico o un producto de condensación de ácido naftaleno sulfónico/formaldehído. También son adecuados los fosfatos correspondientes, por ejemplo sales de éster de ácido fosfórico y un aducto de p-nonilfenol con óxido de etileno y/o propileno, o fosfolípidos. Son fosfolípidos adecuados para este fin los fosfolípidos naturales (que se originan de células animales o vegetales) o sintéticos del tipo cefalina o lecitina tales como por ejemplo fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilglicerina, lisolecitina, cardiolipina, dioctanilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina y sus mezclas.

Los tensioactivos no iónicos adecuados incluyen derivados polietoxilados y polipropoxilados de alquilfenoles, alcoholes grasos, ácidos grasos, aminas o amidas alifáticas que contienen al menos 12 átomos de carbono en la molécula, alquilarensulfonatos y dialquilsulfosuccinatos, tales como derivados de poliglicoléter de alcoholes alifáticos y cicloalifáticos, ácidos grasos saturados e insaturados y alquilfenoles, conteniendo dichos derivados típicamente de 3 a 10 grupos de glicol éter y de 8 a 20 átomos de carbono en el resto de hidrocarburo (alifático) y de 6 a 18 átomos de carbono en el resto de alquilo del alquilfenol. Son tensioactivos no iónicos adecuados adicionales aductos solubles en agua de óxido de polietileno con polipropilenglicol, etilendiaminopolipropilenglicol que contiene de 1 a 10 átomos de carbono en la cadena de alquilo, cuyos aductos contienen de 20 a 250 grupos de etilenglicoléter y/o de 10 a 100 grupos de propilenglicoléter. Dichos compuestos contienen habitualmente de 1 a 5 unidades de etilenglicol por unidad de propilenglicol. Son ejemplos representativos de tensioactivos no iónicos nonilfenol-polietoxietanol, éteres poliglicólicos de aceite de ricino, aductos de óxido de polipropileno/polietileno, tributilfenoxipolietoxietanol, polietilenglicol y octilfenoxipolietoxietanol. Los ésteres de ácidos grasos de polietilensorbitán (tales como polioxietilensorbitán trioleato), glicerol, sorbitán, sacarosa y pentaeritritol también son tensioactivos no iónicos adecuados. Los tensioactivos catiónicos adecuados incluyen sales de amonio cuaternario, particularmente haluros, que tienen 4 radicales de hidrocarburo opcionalmente sustituidos con halo, fenilo, fenilo sustituido o hidroxi; por ejemplo sales de amonio cuaternario que contienen como sustituyente N al menos un radical de alquilo C8C22 (por ejemplo cetilo, laurilo, palmitilo, miristilo, oleílo y similares) y, como sustituyentes adicionales, alquilo inferior no sustituido o halogenado, bencilo y/o radicales de hidroxialquilo inferior.

Puede encontrarse una descripción más detallada de agentes tensioactivos adecuados para este fin por ejemplo en “McCutcheon’s Detergents and Emulsifiers Annual” (MC Publishing Crop., Ridgewood, Nueva Jersey, 1981), “Tensid-Taschenbucw’, 2ª ed. (Hanser Verlag, Viena, 1981) y “Encyclopaedia of Surfactants, (Chemical Publishing Co., Nueva York, 1981). Pueden administrarse péptidos, homólogos o derivados de los mismos de acuerdo con la invención (y sus sales o composiciones farmacéuticas fisiológicamente aceptables todas incluidas en la expresión “principios activos”) mediante cualquier vía apropiada para la afección para tratar y apropiada para los compuestos, aquí las proteínas y fragmentos para administrar. Las vías posibles incluyen regional, sistémica, oral (forma sólida o de inhalación), rectal, nasal, tópica (incluyendo ocular, bucal y sublingual), vaginal y parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intraarterial, intratecal y epidural). La vía preferida de administración puede variar según por ejemplo la afección del receptor o las enfermedades para tratar. Como se describe en el presente documento, el vehículo o los vehículos son óptimamente “aceptables” en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la formulación y no deletéreos para el receptor de los mismos. Las formulaciones incluyen las adecuadas para administración oral, rectal, nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), vaginal o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intraarterial, intratecal y epidural). Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria y pueden prepararse por cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica de la farmacia. Dichos procedimientos incluyen la etapa de poner en asociación el principio activo con el vehículo que constituye uno o más ingredientes accesorios. En general las formulaciones se preparan poniendo de forma uniforme e íntimamente en asociación el principio activo con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos o ambos, y después, si es necesario, moldeando el producto. Las formulaciones de la presente invención adecuadas para administración oral pueden presentarse como unidades discretas tales como cápsulas, obleas o comprimidos que contienen cada una una cantidad predeterminada del principio activo; como un polvo o gránulos; como solución o una suspensión en un líquido acuoso o un líquido no acuoso; o como una emulsión líquida de aceite en agua o una emulsión líquida de agua en aceite. El principio activo también puede presentarse como una embolada, un electuario o una pasta. Puede prepararse un comprimido por compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes adyuvantes. Pueden prepararse comprimidos en forma comprimida comprimiendo en una máquina adecuada el principio activo en una forma que fluye libremente tal como un polvo o gránulos, opcionalmente mezclado con un aglutinante, lubricante, diluyente inerte, conservante, tensioactivo o agente dispersante. Pueden prepararse comprimidos moldeados moldeando en una máquina adecuada una mezcla del compuesto en polvo humedecida con un diluyente

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líquido inerte. Los comprimidos pueden estar opcionalmente revestidos o ranurados y pueden formularse de modo que proporcionen liberación lenta o controlada del principio activo en los mismos.

Para tratamientos locales por ejemplo en la piel, tal como de la articulación, las formulaciones se aplican opcionalmente como una pomada tópica o crema que contiene el principio o los principios activos en una cantidad de, por ejemplo, 0,075 a 20 % p/p (incluyendo principio o principios activos en un intervalo entre 0,1 % y 20 % en incrementos de 0,1 % p/p tales como 0,6 % p/p, 0,7 % p/p, etc.), particularmente de 0,2 a 15 % p/p y más particularmente de 0,5 a 10 % p/p. Cuando se formulan en una pomada, los principios activos pueden emplearse con una base de pomada parafínica o una miscible en agua. Como alternativa, los principios activos pueden formularse en una crema con una base de crema de aceite en agua. Si se desea, la fase acuosa de la base de crema puede incluir, por ejemplo, al menos 30 % p/p de un alcohol polihídrico, es decir un alcohol que tiene dos o más grupos hidroxilo tales como propilenglicol, butano 1,3-diol, manitol, sorbitol, glicerol y polietilenglicol (incluyendo PEG400) y mezclas de los mismos. Las formulaciones tópicas pueden incluir convenientemente un compuesto que potencie la absorción o penetración del principio activo a través de la piel u otras áreas afectadas. Los ejemplos de dichos potenciadores de la penetración dérmica incluyen dimetilsulfóxido y análogos relacionados. La fase oleosa de las emulsiones de la presente invención puede constituirse a partir de ingredientes conocidos de una manera conocida. Aunque la fase puede comprender únicamente un emulsionante (conocido de otro modo como un emulgente), convenientemente comprende una mezcla de al menos un emulsionante con una grasa o un aceite o tanto con una grasa como con un aceite. Opcionalmente, se incluye un emulsionante hidrófilo junto con un emulsionante lipófilo que actúa como un estabilizador, típicamente incluyendo tanto un aceite como una grasa. Juntos, el emulsionante o emulsionantes con o sin estabilizador o estabilizadores componen la denominada cera emulsionante, y la cera junto con el aceite y la grasa componen la denominada base de pomada emulsionante que forma la fase dispersada oleosa de las formulaciones de crema.

La elección de aceites o grasas adecuados para la formulación se basa en la consecución de las propiedades cosméticas deseadas, ya que la solubilidad del compuesto activo en la mayoría de aceites probablemente usado en formulaciones de emulsiones farmacéuticas es muy baja. Por lo tanto la crema debería opcionalmente ser un producto no graso, que no manche y lavable con consistencia adecuada para evitar la fuga de tubos u otros recipientes. Pueden usarse alquilésteres mono o dibásicos de cadena sencilla o ramificada tales como diisoadipato, isocetil estearato, diéster de propilenglicol de ácidos grasos de coco, isopropil miristato, decil oleato, isopropil palmitato y particularmente butil estearato, 2-etilhexil palmitato o una mezcla de ésteres de cadena ramificada conocidos como Crodamol CAP. Estos pueden usarse solos o en combinación dependiendo de las propiedades requeridas. Como alternativa, pueden usarse lípidos de alto punto de fusión tales como parafina blanda blanca y/o parafina líquida u otros aceites minerales. Las formulaciones adecuadas para administración tópica al ojo también incluyen colirios en los que el principio activo se disuelve o suspende en un vehículo adecuado, especialmente un disolvente acuoso para el principio activo. El principio activo está opcionalmente presente en dichas formulaciones en una concentración de 0,5 a 20 %, provechosamente de 0,5 a 10 % particularmente aproximadamente de 1,5 % p/p. Las formulaciones adecuadas para administración tópica en la boca incluyen pastillas para chupar que comprenden el principio activo en una base aromatizada, habitualmente sacarosa y goma arábiga o de tragacanto; pastillas que comprenden el principio activo en una base inerte tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y goma arábiga; y colutorios que comprenden el principio activo en un vehículo líquido adecuado. Las formulaciones para administración rectal pueden presentarse como un supositorio con una base adecuada que comprende por ejemplo manteca de cacao o un salicilato. Las formulaciones adecuadas para administración nasal en las que el vehículo es un sólido incluyen un polvo grueso que tiene un tamaño de partícula por ejemplo en el intervalo de 20 a 500 micrómetros (incluyendo tamaños de partículas en un intervalo entre 20 y 500 micrómetros en incrementos de 5 micrómetros tales como 30 micrómetros, 35 micrómetros, etc.), que se administra de la misma manera en que se toma el rapé, es decir mediante inhalación rápida a través del orificio nasal de un recipiente del polvo mantenido cerca de la nariz. Las formulaciones adecuadas en las que el vehículo es un líquido, para administración como, por ejemplo, una pulverización nasal o como gotas nasales, incluyen soluciones acuosas u oleosas del principio activo. Pueden prepararse formulaciones adecuadas para administración oral de acuerdo con procedimientos convencionales y pueden suministrarse con otros agentes terapéuticos. Las formulaciones adecuadas para administración vaginal pueden presentarse como pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones en pulverización que contienen además del principio activo vehículos tales como los que se conocen en la técnica que son apropiados. Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones de inyección estéril acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacterioestáticos y solutos que hacen a la formulación isotónica con la sangre del receptor pretendido; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en recipientes de dosis unitaria o multidosis, por ejemplo ampollas selladas y viales, y pueden almacenarse en una condición liofilizada (criodesecada) que requiere solamente la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo agua para inyecciones, inmediatamente antes de su uso. Pueden prepararse soluciones y suspensiones de inyección extemporánea a partir de polvos estériles, gránulos y comprimidos del tipo previamente descrito.

Son formulaciones de dosificación unitaria típicas las que contienen una dosis diaria o subdosis diaria unitaria, como se ha indicado anteriormente en el presente documento, o una fracción apropiada de las mismas, de un principio activo. Debería entenderse que además de los ingredientes particularmente mencionados anteriormente las formulaciones de la presente invención pueden incluir otros agentes convencionales en la técnica teniendo en

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cuenta el tipo de formulación en cuestión, por ejemplo las adecuadas para administración oral pueden incluir agentes saporíferos. Pueden usarse péptidos, homólogos o derivados de los mismos de acuerdo con la invención para proporcionar formulaciones farmacéuticas de liberación controlada que contienen como principio activo uno o más compuestos de la invención (“formulaciones de liberación controlada”) en los que la liberación del principio activo puede controlarse y regularse para permitir dosificación de menor frecuencia o para mejorar el perfil de farmacocinética o toxicidad de un compuesto dado de la invención. Pueden prepararse formulaciones de liberación controlada adaptadas para administración oral en las que unidades discretas comprenden uno o más compuestos de la invención de acuerdo con procedimientos convencionales. Pueden incluirse ingredientes adicionales para controlar la duración de acción del principio activo en la composición. Pueden conseguirse de este modo composiciones de liberación controlada seleccionando vehículos poliméricos apropiados tales como por ejemplo poliésteres, poliaminoácidos, polivinilpirrolidona, copolímeros de etileno-vinilacetato, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, sulfato de protamina y similares. La tasa de liberación de fármaco y duración de acción también pueden controlarse incorporando el principio activo en partículas, por ejemplo microcápsulas, de una sustancia polimérica tal como hidrogeles, ácido poliláctico, hidroximetilcelulosa, polimetil metacrilato y los otros polímeros anteriormente descritos. Dichos procedimientos incluyen sistemas de suministro de fármacos coloidales como liposomas, microesferas, microemulsiones, nanopartículas, nanocápsulas y así sucesivamente. Dependiendo de la vía de administración, la composición farmacéutica puede requerir revestimientos protectores. Las formas farmacéuticas adecuadas para inyección incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de las mismas. Los vehículos típicos para este fin incluyen por lo tanto tampones acuosos biocompatibles, etanol, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares y mezclas de los mismos. A la vista del hecho de que, cuando se usan varios principios activos en combinación, no aportan necesariamente su efecto terapéutico conjunto directamente en el mismo momento en el mamífero para tratar, la composición correspondiente también puede estar en forma de un kit o envase médico que contenga los dos ingredientes en depósitos o compartimentos separados pero adyacentes. En este último contexto, cada principio activo puede formularse por lo tanto de una manera adecuada para una vía de administración diferente de la del otro ingrediente, por ejemplo uno de ellos puede estar en forma de una formulación oral o parenteral mientras que el otro está en forma de una ampolla para inyección intravenosa o un aerosol.

La parte experimental de la presente invención muestra un subconjunto de linfocitos T específicos de antígeno, inducidos in vivo y fáciles de expandir con propiedades reguladoras. Estos últimos incluyen: (1) inducción de apoptosis de APC después de activación afín dependiente del MHC de clase II, que afecta tanto a células dendríticas como a linfocitos B, y demostrada in vitro e in vivo, y; (2) supresión de linfocitos T testigos por mecanismo dependiente de contacto en ausencia de IL-10 y/o TGF-β. La presente invención desvela además procedimientos para distinguir Treg citolíticos inducidos de Treg tanto naturales como adaptativos. Basándose en la caracterización de 15 clones, el fenotipo de superficie se define como CD25hi, CTLA-4hi, GITR+ e ICOS+, pero CD127(-). Dichos clones expresan bajos niveles de CD62L y CD103 pero no CCR7. La producción de citocinas se limitó a IFN-gamma, sin TGF-beta o IL-10. Todos los clones fueron Foxp3(-) pero fuertemente positivos para T-bet y Egr-2, junto con altos niveles de transcrito para la granzima B. Los Treg naturales se definen por la expresión de Foxp3 y ausencia de CD127, producen altos niveles de IL-10, al menos in vitro, y son específicos para autoantígenos. Entre los numerosos linfocitos T adaptativos descritos hasta la fecha, la mayoría comparten la producción de IL-10 (y TGF-beta en algunos casos tales como en linfocitos Th3) y son Foxp3 y CD25 negativos. Es central para Treg citolíticos la fuerte expresión de T-bet. T-bet se induce por IFN-γ mediante una ruta dependiente de STAT1 y ejerce diferentes actividades, incluyendo supresión de la transcripción de IL-2, inducción de transcripción de granzima y es un factor de maduración para diferenciación de Th1.

No se descubrió ningún transcrito para IL-2 en los clones de linfocitos T de la presente invención y resulta interesante que IL-2 exógena no restauró la transcripción de IL-2, incluso después de ciclos de estimulación repetidos in vitro. Esto sugiere que los Treg citolíticos han experimentado una alteración epigenética, que mantendría su actividad reguladora tanto in vitro como in vivo. Aunque se requiere T-bet para la maduración del subconjunto de Th1, su expresión no clasifica necesariamente las células como pertenecientes a dicho linaje. La inducción de granzima B por T-bet se ha observado con linfocitos T citolíticos CD8+. Los Treg descritos en el presente documento son anérgicos en el sentido de que fueron incapaces de proliferar y/o producir IL-2 tras reticulación de su antígeno receptor. Resulta interesante que este estado anérgico podría superarse por la adición de IL-2. Se observó una alta expresión del factor de transcripción Egr-2 (Krox-20), que regula positivamente inhibidores del ciclo celular tales como p21cip1 y p27kip. Se sabe que IL-2 puede invalidar la supresión mediada por Egr-2, posiblemente mediante activación de NF-κB. Esta última regula positivamente la transcripción de granzima, lo que podría actuar de forma sinérgica con T-bet para la producción de granzima. Se debería ser consciente de que las propiedades reguladoras no se pierden cuando las células se estimulan mediante la adición de IL-2. En una realización particular, esta es una propiedad de los Treg citolíticos presentes, un subconjunto de células aparentemente estable que ejerce su actividad reguladora sobre la activación dependiente de IL-2. La inducción de la apoptosis es el mecanismo en la base de la actividad reguladora. Esto se demostró tanto al nivel de APC como al nivel de linfocitos T testigos por mostrar activación de caspasa 3 y/o unión de anexina V. Se ha mostrado que las dos rutas principales que conducen a la apoptosis se activaron en Treg citolíticos. Se indujo producción tanto de GrB como de perforina por la activación de Treg, con transcripción aumentada para GrB pero no granzima A. GrB, a diferencia de GrA, induce la apoptosis por al menos dos mecanismos, concretamente activación directa e indirecta de procaspasa 3, esta última mediante la liberación de citocromo C por mitocondrias y activación de caspasa 9. Los

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inhibidores específicos de GrB mostraron reducción significativa de la inducción de apoptosis, y solamente a concentraciones cercanas a la citotoxicidad celular. Es dudoso que se requiera perforina para dicha actividad, ya que EGTA no bloqueó la apoptosis en ningún grado significativo. La segunda ruta por la que puede inducirse apoptosis es la ruta de Fas-FasL. Resulta interesante que FasL está presente en gránulos de exocitosis junto con granzimas, y se ancla a la membrana tras la activación celular, que constituye la principal ruta para expresión de FasL en linfocitos T. FasL señaliza a través de Fas lo que conduce a activación de caspasa 8, con una activación corriente abajo de caspasa 3 y caspasa 9 a través de liberación mitocondrial del citocromo C, actuando de este modo de forma sinérgica con GrB. Se obtuvo inhibición parcial de la apoptosis usando un anticuerpo específico de FasL. La participación relativa de las rutas de GrB y FasL está dictada por el grado de expresión de FasL. Por lo tanto, las células Wehi, que tienen una expresión constitutiva alta de Fas, se lisan fácilmente por Treg, en comparación por ejemplo con células dendríticas. No se ha establecido completamente si la acción combinada de GrB y FasL explica toda la actividad citolítica, ya que experimentos preliminares han mostrado que la combinación de los dos inhibidores no anuló la apoptosis de células diana. Se sabe que algunos Treg secretan Granzimas. Por lo tanto, la granzima B está implicada en el mecanismo por el que los Treg naturales controlan respuestas inmunitarias, tanto en ser humano como en el ratón. Los ratones GrB KO tienen un defecto de regulación. Es, sin embargo, difícil establecer en qué medida los Treg inducidos usan granzimas para ejercer su actividad reguladora. Un informe muestra que una proporción de Treg de tipo Tr1 activados por anticuerpos anti CD3 y anti CD46 expresan GrB. Una dificultad aún no resuelta con las granzimas es la falta de inhibidores específicos y eficaces. Los inhibidores químicos o peptídicos, tales como los usados en la presente invención (Ejemplo 11), requerían altas concentraciones para estar activos. El uso de la ruta de Fas-FasL no se ha indicado previamente en Treg adaptativos, y muy pocos datos indican que los Treg CD4+CD25+ podrían usar también Fas-L como mecanismo. Es notable que la inducción de apoptosis se observa con células dendríticas y con linfocitos B, lo que sugiere que pueden regularse las respuestas inmunitarias tanto primaria como secundaria. Además, los Treg que reconocen un único epítopo de linfocitos T de antígenos incluso complejos tienen la capacidad de suprimir la respuesta a la proteína completa eliminando la célula presentadora de antígenos. Esto se ilustra bien por los datos in vivo, en los que la respuesta hacia un alérgeno completo, Der p 2, se suprime después de la transferencia adoptiva de un único clon de Treg. Este efecto es reforzado por la supresión de linfocitos T testigos incluso cuando estos últimos se activan mediante interacción con una APC diferente, siempre que el contacto celular sea posible entre Treg y linfocitos T efectores. Resulta interesante que los Treg pueden regular linfocitos T efectores en diversos estadios de maduración, Th0, Th1 o Th2. Resulta importante que los Treg citolíticos inducen apoptosis en células diana y no en necrosis. La APC apoptótica puede desempeñar un papel en la supresión. Se ha demostrado de hecho que las células apoptóticas captadas por células presentadoras de antígenos inducen tolerancia, mientras que las células necróticas inducen más bien inflamación. In vivo, la supresión casi completa de inflamación dentro de los pulmones debería considerarse ciertamente una señal de apoptosis de células diana en lugar de necrosis. Un aspecto de la presente invención es la demostración de que también se produce apoptosis de linfocitos B in vivo. Por lo tanto, los ratones a los que se ha transferido de forma adoptiva linfocitos B transgénicos que expresan p21-35 seguido de Treg citolíticos de especificidad correspondiente muestran desaparición completa de linfocitos B, como se detecta en el bazo. Es poco probable que los linfocitos B transgénicos hayan migrado a otros sitios. No se ha descubierto ninguna prueba de dichas células en pulmones o en el hígado. Las propiedades funcionales de células transgénicas p21-35 son idénticas a las de linfocitos B incubados con el péptido en un ensayo de carga convencional. Se ha mostrado aquí que se induce la apoptosis de linfocitos B transgénicos in vitro mediante cocultivo con Treg citolíticos, lo que indica buenas pruebas de la relevancia in vivo de la citólisis de APC. Se ha prestado particular atención a la posible implicación de IL-10. Los Treg naturales así como la mayoría si no todos los subconjuntos descritos de Treg adaptativos producen IL-10 (Levings y col. (2002) Int. Arch. Allergy Immunol. 129, 263-276). Uno de estos subtipos se indujo después de exposición respiratoria a alérgeno y expresó Foxp3, GATA3 y no produjo nada de IFN-γ (Akbari y col. (2002) Nature medicine 8, 1024-1032). Otro tipo se indujo durante fuertes condiciones de polarización de Th1 (Listeria monocytogenes como adyuvante), expresó Foxp3, T-bet y produjo IFN-γ (Stock y col. (2004) Nat. Immunol. 5, 1149-1156). Ambos subconjuntos fueron capaces de inhibir la hiperreactividad de las vías respiratorias e inflamación mediante un mecanismo dependiente de IL-10. No hubo ninguna prueba de la producción de IL-10 por los Treg citolíticos negativos para Foxp3 ni activación de STAT3 o SP1. La observación de que la inducción de apoptosis requería contacto celular directo como se muestra en experimentos de transwell, y la supresión conocida de transcripción de IL-10 por IFN-gamma, produciéndose esta última a altos niveles por todos los Treg citolíticos, se tomaron como pruebas contra una implicación significativa de IL-10 en la actividad de Treg citolíticos. Notablemente, solo se requirió un adyuvante suave tal como alumbre. Resulta interesante que la inmunización con el péptido mp2135 preparado en CFA/IFA fue aún más eficaz en la supresión de la inflamación de las vías respiratorias y la hiperreactividad, pero esto fue en perjuicio de la acumulación de grandes números de linfocitos Th1 en los pulmones. Además, esto muestra que la inmunización en CFA no consiguió inducir Treg citolíticos. La metilación de cisteína aumentó la presentación por MHC de clase II, pero esto es atribuible al aumento de la estabilidad del péptido y aumento de la captación por APC. Resulta interesante que no era posible inducir Treg citolíticos para un segundo epítopo de linfocitos T importante de Der p 2, p71-85. La sustitución de isoleucina 28 por asparagina redujo la afinidad de unión con moléculas del MHC de clase II, lo que se ha mostrado que no es perjudicial para la inducción de Treg citolíticos. Se ha indicado que péptidos alterados que portan epítopos de linfocitos T aumentan la afinidad de unión y/o el reconocimiento de TCR, o inducen tolerancia, un resultado con frecuencia difícil de predecir. En el presente caso, los Treg tanto efectores como citolíticos reconocieron el mismo epítopo, y pudieron expandirse in vitro con p21-35 en su secuencia de tipo silvestre o mutada.

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La Figura 9 muestra los niveles de expresión de diversos genes en un clon de linfocito T específico de péptido 21-35 en reposo por clasificación de células activadas por fluorescencia (Facs). En la Tabla 4, se proporciona la intensidad de fluorescencia media de cuatro clones diferentes (T1 a T4) (2x105 células). Se observaron altos niveles de CD25, ICOS, GITR, CD103 y CTLA-4 intracelular. CD28 no se expresaba o se expresaba escasamente. CD62-L y CD45RB se expresaron a niveles bajos. Todos los anticuerpos fueron de Becton-Dickinson (NJ, Estados Unidos).

Tabla 4: Fluorescencia media de clones de Treg marcados con anticuerpos fluorescentes

CD28: CD62L CD103 CD45RB ICOS GITR CTLA-4

T1: 5 36 21 6 251 127 98

T2: 12 27 25 10 245 150 110

T3: 4 39 27 6 263 110 92

T4: 4 36 14 7 253 129 87

Ejemplo 9: Se inducen linfocitos Treg con propiedades citotóxicas por inmunización con un péptido hecho de un epítopo de linfocito T dominante del alérgeno Der p 1 ligado a una secuencia consenso de tipo glutarredoxina (Figura 10).

Un epítopo de linfocito T dominante del alérgeno Der p 1 reconocido por p114-128 SNYCQIYPPNANKIR de ratones BALB/c [SEQ ID NO: 5] se sintetizó en línea con la secuencia CGFS (secuencia de motivo [SEQ ID NO: 6]), que porta una secuencia consenso de tipo glutarredoxina de E. coli k12. Esta última se añadió al extremo amino terminal del epítopo de linfocitos T (tomando s114 como P1).

El péptido completo tiene la secuencia CGFSSNYCQIYPPNANKIR [SEQ ID NO: 7]. La secuencia que contiene el epítopo de linfocitos T Der p 1 sin la secuencia consenso de tipo glutarredoxina [SEQ ID NO: 5] se usó como un control.

Ambos péptidos se unieron por una secuencia enlazadora SGGSGGSGG [SEQ ID. NO: 8] en el extremo amino terminal de la secuencia con el extremo amino terminal de la secuencia IITIAWAALLLVAAIFGVASCLI RSRSTKNEANQPLLTDS [SEQ ID NO: 9], correspondiente al dominio transmembrana y la cola citosólica truncada de la proteína gp75, para dirigir el epítopo de linfocitos T al endosoma tardío (el motivo basado en dileucina está subrayado).

La secuencia completa del péptido que comprende secuencia de dirección, enlazador, motivo y secuencia de epítopo es:

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mientras que el péptido de control sin la secuencia CGFS [SEQ ID. NO: 6] tiene la secuencia:

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Se inmunizaron grupos de ratones BALB/c por vía subcutánea (20 μg) con el péptido experimental [SEQ ID NO: 10]

o el péptido de control [SEQ ID NO: 11] adsorbido en hidróxido de aluminio. Se realizaron tres inyecciones a intervalos de 2 semanas. Diez días después de la última inmunización, se sacrificaron los ratones y se prepararon linfocitos T CD4+ del bazo usando perlas magnéticas. Después se estimularon linfocitos T CD4+ (2x106 células) in vitro por el epítopo de linfocitos T Der p 1 (20 μg) presentado por células del bazo adherentes que actúan como células presentadoras de antígenos.

Diez días después de la estimulación se calculó el número de líneas de linfocitos T específicas obtenidas en cada grupo por análisis de dilución limitante. Cada línea celular se evaluó por su capacidad para lisar células WEHI, una línea de linfocitos B seleccionada por su eficacia en la presentación de antígenos por determinantes del MHC de clase II, como se describe en el Ejemplo 6. Solamente células obtenidas de animales inmunizados con el péptido que contenía la secuencia consenso de glutarredoxina habían adquirido la capacidad para lisar células WEHI, y la lisis se produce solamente en presencia del epítopo de linfocitos T Der p 1 afín.

La Figura 10 muestra que podrían obtenerse clones de linfocitos T con propiedades de Treg solamente de ratones que recibieron la construcción hecha del epítopo de Der p 1 ligado a un motivo redox de tipo glutarredoxina y gp75,

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pero no de ratones que recibieron el péptido de control. Todos los clones de linfocitos T obtenidos después del tratamiento con la construcción y reestimulados in vitro fueron citotóxicos.

Ejemplo 10: Uso de un epítopo de linfocitos T dominante de proteína MOG en un modelo in vivo paraesclerosis múltiple

Puede inducirse esclerosis múltiple en modelos experimentales por inmunización con el péptido de Glucoproteína de Oligodendrocitos de Mielina (MOG) VGWYRSPFSRVVHLYR [SEQ ID. NO: 12], que corresponde a los restos de aminoácidos 37-52 de la proteína MOG. Este péptido contiene un epítopo de linfocitos T dominante. La posición P1, es decir el primer aminoácido anclado en el surco del MHC de clase II es Y40 (la secuencia P1-P9 está subrayada). Los 3 aminoácidos del extremo amino terminal del péptido se reemplazan por la secuencia CGPS [SEQ ID. NO: 13], que corresponde a la secuencia de tiorredoxina humana, los restos 21 a 24, dando como resultado el péptido CGPSYRSPFSRWHLYR [SEQ ID. NO: 14]. El péptido experimental [SEQ ID. NO: 14] y el péptido de control [SEQ ID. NO: 12] se unen por la secuencia enlazadora SGGSGGSGG [SEQ ID. NO: 8] en el extremo amino terminal de la secuencia VSVSAVRLGLGLIIFSLGVIS WRRAGHSSYTPLPGSNYSEGWHIS [SEQ ID. NO: 15] correspondiente al dominio transmembrana y la cola citosólica de la proteína HLA-DMβ, para dirigir el epítopo de linfocitos T al endosoma tardío (el motivo de péptido basado en tirosina está subrayado).

Las secuencias del péptido diana son:

VSVSAVTLGLGLIIFSLGVISWRRAGHSSYTPLPGSNYSEGWHIS SGGSGGSGG CGPS YRSPFSRWHLYR [SEQ ID. NO: 16] y

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Se transfiere a un grupo de ratones C57BL/6 de forma adoptiva un clon de linfocito T efector específico de MOG CD4+ siguiendo un protocolo que se pretende que induzca un síndrome de esclerosis múltiple. Esto implica la administración del péptido de MOG en adyuvante completo de Freund y 2 inyecciones de toxina de Pertussis. Este protocolo induce una expansión del clon de linfocito T efector, que da como resultado el desarrollo de señales compatibles con esclerosis múltiple en un periodo de 12 días después de la administración de péptido de MOG.

Se transfiere de forma adoptiva a un segundo grupo de ratones C57BL/6 un clon de linfocito T regulador específico de MOG (obtenido usando los péptidos [SEQ ID NO: 16 y 17] descritos anteriormente), seguido después de 1 día del protocolo completo de inducción de enfermedad.

Se observa que la puntuación clínica desarrollada por ratones pretratados con un clon de linfocito T citolítico se reduce significativamente en comparación con ratones que reciben solamente el clon de linfocito T efector.

Procedimientos y materiales

Ratones. Se obtuvieron ratones BALB/c de seis a ocho semanas de edad de instalaciones internas. Los estudios in vivo fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad de Leuven.

Reactivos. Se sintetizaron péptidos derivados de alérgeno de Dermatophagoides pteronyssinus grupo 2 (Der p 2) Der p 1 y toxoides de tétanos (pureza, >85 %). Las secuencias son: p21-35, CHGSEPCIIHRGKPF [SEQ ID. NO: 2]; p114-128 (aminoácidos 114-128 de Der p 1), SNYCQIYPPNANKIR [SEQ ID. NO: 5]; p830 (aminoácidos 830-844 del toxoide del tétanos), QYIKANSKFIGITEL [SEQ ID. NO: 18]; mp21-35 QYIKANSKFIGITELGGCHGSEPCIIHRGKPF [SEQ ID. NO: 19]; mp21-35Asn QYIKANSKFIGITELGGCHGSEPCNIHRGKPF [SEQ ID. NO: 20]. Se produjo Der p 2 de longitud completa recombinante en Pichia pastoris.

Sensibilización a alérgenos. Los animales se sensibilizaron el día 1, 14 y 28 por una inyección i.p. de 40 μg de alérgeno recombinante absorbido en 6 mg de AL(OH)3. El día 43, 44 y 45, los ratones se expusieron a 100 μg de alérgeno en 50 μl de solución salina por instilación intranasal, seguido de una primera medición de la función pulmonar por pletismógrafo de cuerpo completo. Se realizó una segunda serie de instilaciones nasales el día 50, 51 y 52 seguido de evaluación de la función pulmonar por pletismógrafo de cuerpo completo.

Purificación celular. Se obtuvieron linfocitos T CD4 esplénicos después de inmunización de péptidos. Después de purificación de gradiente de densidad de Ficoll (Nycomed Pharma), se enriquecieron por selección negativa usando el Kit de Aislamiento de linfocitos T CD4 (Miltenyi Biotec) y columnas de separación de LS. Se seleccionaron de forma positiva células dendríticas esplénicas usando Microperlas CD11c (Miltenyi Biotec) en columnas de separación LS. Se estimularon con 5 μg/ml de LPS (Sigma) durante 5 horas, después se lavaron y se mantuvieron durante 18 horas en un incubador de CO2; se recuperaron células vivas eliminando las células muertas y apoptóticas con microperlas de anexina V en columnas de LS y MidiMacs (todos de Miltenyi Biotec).

Se prepararon linfocitos B a partir de células del bazo de ratones BALB/c sin tratamiento previo por selección positiva usando microperlas de CD19 (Miltenyi Biotec). Como células presentadoras de antígenos, se agotaron los

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linfocitos T de esplenocitos por microperlas CD90 (Miltenyi Biotec) en columnas de agotamiento de LD. En algunos ensayos, se prepararon células adherentes esplénicas incubando esplenocitos durante 2 h a 37 ºC en medio de cultivo. Se retiraron células no adherentes y las células restantes se recuperaron para ensayos.

Se prepararon linfocitos de pulmón por digestión con colagenasa (Sigma) y centrifugación por Percoll (Pharmacia) como se ha descrito previamente (Abraham y col. (1990) J. Immunol. 144, 2117-2122).

Cultivo celular. Se cultivaron células dendríticas, linfocitos T y linfocitos B en medio RPMI 1640 que contenía FCS 5 %, 2-ME 50 μM, gentamicina 200 μg/ml (Invitrogen). Se obtuvieron células Wehi 231 de la colección Europea de cultivos celulares (ECACC).

El clon de linfocito T efector G221N es específico para el péptido p21-35. G121, R3TB7, T1 y T3 identifican clones de linfocitos T citolíticos ensayados en ese estudio (en el Ejemplo 11).

Ensayos de procesamiento de péptidos. Se ensayó G221N, un clon de linfocito T efector específico para el péptido p21-35 en un ensayo de proliferación en el que se usaron células adherentes esplénicas como APC. Se pretrataron con leupeptina 0,2 μM, cloroquina 0,1 mM, colchicina 60 μM o se dejaron sin tratar durante 30 min. Después de 3 lavados con PBS, se cargaron APC durante 1 hora con el péptido p21-35, mp21-35 o Der p 2 a 37 ºC. Después se lavaron dos veces con medio de cultivo y se añadieron al clon G221N (105 cada uno) durante 72 h. Para bloquear la endocitosis las APC también se trataron con NaN3/desoxiglucosa (2 mg/ml, 50 mM, respectivamente) durante todo el tiempo de incubación con los péptidos seguido de 3 lavados con PBS frío.

Se ensayó la proliferación por la adición de 1 pCi/pocillo de [3H]timidina (ICN) durante las últimas 18 h. Las células se recogieron y se contó el isótopo incorporado (cpm). Los datos se expresaron como índice de estimulación calculado dividiendo las cpm obtenidas para linfocitos T G221N estimulados con APC con péptido cargado por el valor obtenido con APC no cargadas.

Derivatización de clones de linfocitos T reguladores. Se inmunizaron ratones BALB/c por 3 inyecciones en la almohadilla plantar de 20 μg/ml de péptido mp21-35Asn en alumbre a intervalos de 2 semanas. Diez días después de la última inyección, los linfocitos T CD4+ del bazo se estimularon con esplenocitos pobres en linfocitos T de ratones sin tratamiento previo en presencia del péptido mp21-35Asn. Después de 10 días, las células se reestimularon en las mismas condiciones pero con 10 U/ml de IL-2 de ratón (Roche). Después de la quinta reestimulación, los linfocitos T se subclonaron en presencia de 10 U/ml de IL-2 por dilución limitante. Las estimulaciones específicas posteriores se llevaron a cabo en presencia de 20 U/ml de IL-2 de ratón. La línea de linfocitos T G121 se obtuvo como se ha descrito previamente (Janssens y col. (2003) J. Immunol. 171, 4604-4612.)

Análisis de FACS. Se usó un FACSCalibur (Becton Dickinson) para citometría de flujo analítica y los datos se analizaron con software CellQuest. Diez días después de la última reestimulación, los linfocitos T se tiñeron con anticuerpos para CD25, CD28, CD62-L, CD103, CD45RB, ICOS, CTLA-4 y CD11c, (Pharmingen), GITR, Foxp3, Granzima-B, T-bet(4B10), perforina, CD127 y Vb8.1 TCR, (eBioscience).

Ensayos de supresión de testigos. Se marcaron clones T auxiliares y linfocitos T CD4+CD25-diana con CFSE 125 nM (Molecular Probes) durante 15 minutos en PBS a 37 ºC. La reacción se detuvo lavando las células con PBS que contenía FBS 30 %. Estas células (3 x 105) se co-cultivaron con 105 clones de linfocitos T CD4+ citotóxicos y esplenocitos pobres en linfocitos T con anticuerpo anti-CD3 1 μg/ml (eBioscience). Para la supresión de clones de T auxiliares, se co-cultivaron 105 células con el mismo número de células citotóxicas y esplenocitos pobres en linfocitos T. Después de 48 h o 72 horas, las células se recogieron y se analizaron por citometría de flujo.

Para algunos cultivos, se usaron anticuerpos de bloqueo contra FAS-L, GITR, LAG-3 a 10 μg/ml (eBioscience). Se realizaron ensayos de Transwell en placas de 24 pocillos (Becton Dickinson).

Detección de apoptosis. Se usaron anexina V-FICT o –PE para detectar muerte celular en linfocitos B, células dendríticas y linfocitos T (kit de detección de Anexina V, BD Biosciences). En algunos experimentos, la apoptosis se midió por detección intracelular de caspasa 3 activada con anticuerpos marcados con FITC o PE (Pharmingen) o mediante marcaje nuclear con una solución de tinción de yoduro de propidio (PI) (Pharmingen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Para inhibición de la actividad de GZ-B, se añadieron Z-AAD-CMK (Calbiochem) o 3,4-dicloroiso-cumarina (DCIC) (SIGMA) a concentraciones indicadas durante todo el periodo de co-cultivo.

Detección de citocinas. Se reestimularon un millón de linfocitos Treg con 3 millones de esplenocitos pobres en linfocitos T irradiados durante 72 horas. Los sobrenadantes se evaluaron con respecto a la presencia de diferentes citocinas. Se evaluaron IL-10 e IL-13 usando el kit de Elisa de ratón OptEIA (BD Biosciences). Se evaluaron TGF-β e IL-13 con los kits de ensayo anti TGF-b1 de ratón DuoSet o anti IL-13 de ratón DuoSet, respectivamente (R&D Systems). Se analizó la producción de IL-2, IL-4, IL-5, IFN-γ y TNF-α mediante citometría de flujo usando el kit de CBA de Citocinas Th1/Th2 (BD Biosciences).

Para estimulación de células CD4+ policlonales, se estimularon 106 células con 5 x 105 esplenocitos pobres en

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linfocitos T irradiados (de ratones sin tratamiento previo) y Der p 2 10 μg/ml durante 72 h.

Proliferación de células CD4+ policlonales. Se estimularon 105 células CD4 esplénicas de ratones tratados con péptidos con 105 esplenocitos pobres en linfocitos T y mp21-35 10 μg/ml, péptido p380 5 μg/ml o Der p2 10 μg/ml. Se ensayó la incorporación de (3H)-timidina como ya se ha descrito. Los resultados se muestran como recuento promedio de isótopos (cpm)  e.t.m. de 6 ratones ensayados individualmente por triplicado.

Hiperreactividad de las vías respiratorias. La hiperreactividad de las vías respiratorias (HRVR) en ratones libres usando un pletismógrafo de cuerpo completo (EMKA) de acuerdo con procedimientos publicados (Hamelmann y col. (1997) Am. J. Resp. Crit. Care Med. 156, 766-775). Se usó la pausa de pico potenciado (PenH) como un parámetro para broncoconstricción. Los animales se expusieron durante 1 minuto a dosis crecientes de metacolina aerosolizada (de 10 a 100 mg/ml), seguido de 3 minutos de reposo durante el que se evaluaron los parámetros de respiración. Los valores de PenH se expresaron como las medias de mediciones llevadas a cabo cada 30 segundos durante un periodo de 3 minutos después de cada exposición a metacolina. Se midió la distensibilidad pulmonar con el sistema FlexiVent (Scireq).

Recogido de líquido de lavado broncoalveolar (BALF). Tres días después de la exposición a metacolina, los ratones se sacrificaron, se aisló la tráquea y se insertó una cánula. Se recogió BALF lavando con 1 ml de solución salina que contenía BSA al 5 % (usado para detección de citocinas) y después se siguió de 2x1 ml de solución salina. Se estableció el recuento celular. Se prepararon citoespines por centrifugación a 1400rpm durante 6 min y se tiñeron (procedimiento de Diff-Quik). Se contaron cien células en 3 campos diferentes para identificación celular.

Histología pulmonar. Los pulmones se fijaron con formaldehído 4 %, se deshidrataron y se incluyeron en parafina para su corte (secciones de 7 μm de grosor) y se tiñeron con hematoxilina/eosina. Los eosinófilos se detectaron por tinción de Giemsa May-Grünwald. Se identificaron células caliciformes en mucosa de las vías respiratorias por la reacción de ácido peryódico-Schiff (PAS). Se contaron células positivas para PAS y se expresaron como porcentaje de células epiteliales totales. Para cada ratón, se examinaron 5 campos de cada sección pulmonar, de los bronquios centrales así como de bronquios pequeños. La densidad de infiltración de eosinófilos y linfocitos se clasificó de la siguiente manera: ausente: 0; ligera pero no sistemática: 1; ligera: 2; de ligera a media: 3; media: 4; de media a alta: 5; alta: 6.

Todos los portaobjetos fueron examinaron por dos personas, incluyendo un patólogo que desconocía los grupos a los que pertenecían los ratones.

Para análisis de linfocitos T transferidos, los pulmones se fijaron con paraformaldehído, se crioprotegieron con sacarosa al 20 % durante una noche y se congelaron instantáneamente en medio OCT. Se cortaron secciones de criostato (9 μm), se fijaron en acetona y se montaron con reactivo antidestinción (ProLong Gold; Invitrogen) y se analizaron con microscopia confocal. Se realizó análisis en un Zeiss Axioplan2 conectado a una cámara de video 3CCD (DXC-93OP, Sony) y software KS300 (Zeiss).

Expresión dirigida de péptido en linfocitos B. El vector pMND-SN onco-retrovírico se obtuvo del Dr. D. Kohn, USC. Se preparó una construcción de fusión que contenía p21-35 (aminoácidos 21 a 35 de Der p 2) y el extremo carboxilo terminal de gp75 (aminoácidos 488 a 539) conectado con un enlazador Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly [SEQ ID. NO: 8], mediante PCR y se clonó en vector pMND. El vector resultante pMND-p21gp75 se usó junto con vectores que codificaban proteínas víricas para transfectar de forma transitoria células 293T y se obtuvieron células productoras onco-retrovíricas como se ha descrito previamente (Janssens W. y col., Human gene therapy 14, 263-276 (2003)). Se co-cultivaron linfocitos B esplénicos preactivados durante 24 horas con LPS bacteriano 50 μg/ml con sobrenadante que contenía vector vírico filtrado en presencia de polibreno (6 μg/ml) y LPS (50 μg/ml). Después se lavaron linfocitos B exhaustivamente antes de la transferencia adoptiva a ratones BALB/c sin tratamiento previo.

Análisis de ARNm. Se realizaron reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR) como se ha descrito previamente (Janssens W. y col. (2003), Human gene therapy 14, 263-276. Para linfocitos T, se analizaron 106 células el día 12 después de la reestimulación. Las secuencias de cebadores fueron: Granzima A, (directo) 5’ ctctggtccccggggccatc 3’ [SEQ ID. NO: 21] e (inverso) 5’ tatgtagtgagccccaagaa 3’ [SEQ ID. NO: 22]; para Granzima B, (directo) 5’ ctccacgtgctttcaccaaa 3’ [SEQ ID. NO: 23] e (inverso) 5’ ggaaaatagtacagagaggca 3’ [SEQ ID. NO: 24]; para β-actina, (directo) 5’ cattgtgatggactccggagacgg 3’ [SEQ ID. NO: 25] e (inverso) 5’ catctcctgctcgaagtctagagc 3’ [SEQ ID. NO: 26]. La temperatura de hibridación fue de 55 ºC durante 27 ciclos.

Detección de linfocitos B transducidos in vivo. Los ratones que recibieron linfocitos B transducidos con pMNDp21gp75 seguido de transferencia de clones de linfocitos T se sacrificaron y se purificaron linfocitos B esplénicos con microperlas de CD19 (Miltenyi Biotec). Se transcribieron de forma inversa cinco μg de ARN total para la preparación de ADNc. Se llevó a cabo PCR en ADNc usando cebadores específicos de vector retrovírico (directo) 5’ ccctttatccagccctcactc 3’ [SEQ ID. NO: 27] e (inverso) 5’ cctggggactttccacaccc 3’ [SEQ ID. NO: 28]. La temperatura de hibridación fue de 56 ºC durante 28 ciclos.

Análisis estadístico. Se usaron ensayos no paramétricos para evaluar las diferencias entre las medias (ensayo de U de Mann-Whitney). Para evaluar la hiperreactividad de las vías respiratorias, se calculó el área bajo la curva y las diferencias se evaluaron por el ensayo de U de Mann-Whitney.

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obtenidos de ratones inmunizados con mp21-35Asn eran citolíticos, mientras que no se obtuvo ninguno de dichos clones con mp21-35Asn en CFA/IFA (0/5) o de ratones inmunizados con Der p 2 (0/4). Resulta interesante que se obtuvo un número pequeño de linfocitos T efectores CD4+ de ratones no inmunizados (véase posteriormente) pero ninguno fue citolítico.

Se caracterizó el fenotipo de Treg citolíticos. Se obtuvieron resultados similares para un total de 15 clones obtenidos de inmunizaciones separadas. Se muestran resultados de Facs representativos para marcadores de superficie en la Figura 12a (un clon representativo) y en la Tabla 5 (4 clones), que indican niveles de expresión homogéneos.

Tabla 5 Presencia de marcadores de superficie en 4 clones citolíticos obtenidos con péptido mp21-35Asn (expresado como IFM)

CD28: CD26L CD103 CD45RB ICOS GITR CTLA-4

T1: 5 36 21 6 251 127 96

T2: 12 27 25 10 245 150 110

T3: 4 39 27 6 263 110 92

T4: 4 36 14 7 253 129 87

Todos los clones expresaron altos niveles de CTLA-4, GITR e ICOS, con expresión significativa, aunque baja, de CD62L y CD103, y expresión apenas detectable del receptor de quimiocina CCR7. Se expresó de forma uniforme Tbet pero no Foxp3, mientras que CD127 solamente era tenue (Figura 12b). Además, los clones de Treg expresan altos niveles de Granzima B y perforina. Los experimentos de RT-PCR muestran niveles detectables de ARNm de Granzima A, pero a un nivel mucho menor que Granzima B (Figura 12c). El patrón de secreción de citocinas mostró casi exclusivamente IFN-gamma, pero no mostró o mostró muy poco de IL-10 y no mostró TGF-β (Figura 12d). No se detectó TGF-β unido a superficie.

Todos los Treg citolíticos fueron anérgicos ya que no respondieron a activación por antígeno en ausencia de IL-2 añadida. Esto último invirtió la anergia sin restaurar la transcripción de IL-2 y sin pérdida de propiedades reguladoras, como se muestra después de ciclos de reestimulación. Esto sugiere una alteración epigenética, posiblemente relacionada con la hiperexpresión de T-bet. Además, estos clones expresaron altos niveles de egr-2, que se sabe que activan la transcripción de reguladores negativos del ciclo celular. Estas células expresaron altos niveles de CD44, pero mostraron baja expresión de CED45RB (y CD62L como se ha mencionado anteriormente), identificándolos como células de memoria. La ausencia de producción de citocinas supresoras sugiere que su mecanismo de acción requiere contacto célula-célula. La expresión de granzimas y perforina clasificó dichos clones entre los linfocitos T con un potencial citolítico. Finalmente, se determinó el uso de Vβ de Treg citolíticos, lo que indica una predominancia de Vβ8.1, con algunos clones pertenecientes a la familia Vβ7. Se secuenció la cadena beta de varios clones, mostrando diferencias significativas en CDR3, lo que indica que la respuesta hacia el péptido p21-35 fue oligoclonal. Se evaluaron por lo tanto clones de Treg funcionalmente para determinar tanto el mecanismo de lisis de células diana como su capacidad para inducir supresión de linfocitos T testigos.

Inducción de la apoptosis en células presentadoras de antígenos

Se obtuvo lisis de células presentadoras de antígeno tanto con linfocitos B como con células dendríticas. Se indujo que linfocitos B esplénicos de ratones de BABL/c sin tratamiento previo, precargados con p21-35 indujeran activación de caspasa 3 solamente cuando se incubó con el clon de linfocito T citolítico R3TB7 (es decir, otro clon de linfocito T con la actividad citolítica, obtenido de una manera similar) (Figura 13a: panel izquierdo), pero no cuando se añadió un linfocito T específico de p21-35 efector CD4+ de control (Figura 13ª: panel derecho). Los mismos experimentos se repitieron usando Anexina V como un marcador de apoptosis, proporcionando los mismos resultados.

Se llevaron a cabo experimentos con células dendríticas CD11c+ cargadas con p21-35 (Figura 13b: panel izquierdo)

o WEHI (Figura 13b: panel derecho). Tras la incubación con R3TB7, se indujo la apoptosis de prácticamente todas las células dendríticas (CD) o células Wehi como se mide por activación de caspasa 3. Los mismos experimentos se llevaron a cabo con Anexina V y mostraron resultados idénticos.

Puede inducirse apoptosis por la ruta de Fas-FasL o por secreción de gránulos citotóxicos que contienen granzimas. Se realizaron intentos de inhibir cada una de estas rutas. La adición de concentraciones crecientes de un anticuerpo hacia FasL, o de inhibidores de granzima B, a un cultivo celular que contenía células WEHI cargadas con p21-35 y un clon de linfocito T citolítico, aumentó el número de células WEHI supervivientes de una manera dependiente de dosis (Figura 13c) En varios experimentos se ha mostrado que el anticuerpo anti FasL restauró hasta el 80 % de la supervivencia de células WEHI. Solamente se obtuvo restauración parcial de la supervivencia con inhibidores de granzima B y solamente cuando se usaron altas dosis, cercanas a la citotoxicidad celular, lo que indica que la

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granzima B no representó muchas de la citólisis celular. En experimentos adicionales, se usó EGTA como un inhibidor de la exocitosis de gránulos, que también mostró solamente restauración parcial de la supervivencia de células Wehi.

Se evaluó adicionalmente si la lisis de células diana requería contacto entre células. Para este fin, se usaron CD CD11+ cargadas con p21-35 (o mp21-35Asn en experimentos paralelos). Cuando se incubaron células CD cargadas con el clon de linfocito T citolítico G121, se observó lisis en el 89 % de las células como se midió por expresión de anexina V (Figura 13d, panel izquierdo). Cuando se llevaron a cabo los mismos experimentos en un sistema de transwell, la lisis de CD se limitó al 15 %, lo que indica que la lisis requería contacto directo entre células (Figura 13d, panel derecho).

Para determinar adicionalmente que la lisis de APC requería contacto directo con linfocitos T citolíticos a través de presentación en el MHC de clase II de p21-35, se llevó a cabo un experimento en el que se cargaron dos poblaciones idénticas de células Wehi con p21-35 o con un péptido irrelevante (p71-85). Estas dos poblaciones pudieron distinguirse por marcaje de CFSE diferencial. Puede verse a partir de la Figura 13e que, aunque las células WEHI que presentan p21-35 estaban completamente lisadas, solamente el 40 % de las células cargadas con p71-85 fueron afectadas.

En conjunto, se concluye que los clones de linfocitos T citolíticos indujeron apoptosis de CD y linfocitos B por un mecanismo que requería la formación de una sinapsis inmunitaria por presentación de péptidos dependiente del MHC de clase II. Se ha demostrado la participación significativa de Fas-FasL, pero solamente la implicación limitada de granzima B.

Supresión de linfocitos T testigos

Se examinó el mecanismo de supresión de linfocitos T testigos con linfocitos T CD4+CD25(-) policlonales y con diversos clones de linfocitos T efectores CD4+. En primer lugar, se ensayó la capacidad de los Treg para suprimir la proliferación de linfocitos T CD4+CD25(-) después de activación anti CD3 en presencia de células presentadoras de antígenos. Los resultados obtenidos para dos clones de linfocitos T citolíticos (G121 y R3TB7) se muestran en la Figura 14a. El número de linfocitos T CD4+ CD25(-) detectables, así como el número de divisiones observadas se redujo drásticamente en un periodo de incubación de 48 horas cuando se añadió uno de los dos clones citolíticos (paneles superior izquierdo y medio). Este efecto fue aún más pronunciado a las 72 horas para el segundo clon de linfocito T (panel medio inferior). Resulta interesante que solamente se lisaron linfocitos T CD4+CD25(-) activados, como puede verse a partir del eje vertical que representa la formación de blastos. El experimento de control en el que se reemplazó Treg por un número idéntico de linfocitos T CD4+CD25(-) no marcados (paneles derechos) eliminó un posible artefacto relacionado con números variables de células totales en el medio de cultivo.

A continuación, se analizó la cinética de supresión. En los experimentos mostrados en la Figura 14b, puede verse que el 48 y el 70 % de linfocitos T CD4+CD25(-) marcadas con CFSE expresan anexina V después de 18 y 24 horas de coincubación con una Treg citolítico (R3TB7), respectivamente, usando el mismo sistema de ensayo que en la Figura 14a. Dicho efecto rápido sugiere la implicación de rutas secretoras similares a las usadas por linfocitos T citotóxicos CD8+. Los experimentos se repitieron por lo tanto para verificar si la inhibición de exocitosis de gránulos por adición de EGTA al cultivo inhibiría la supresión. Básicamente no se examinó inhibición de la supresión de linfocitos T testigos a las 72 horas con 2 concentraciones de EGTA (Figura 14c).

A continuación, se evaluó si los clones de linfocitos T de especificidad definida y fenotipos diferentes podrían suprimirse por linfocitos T citolíticos cuando se activaron por reconocimiento afín de antígenos correspondientes, en lugar de activación anti CD3 no específica. Para este fin, se derivatizaron tres clones de ratones BALB/c, concretamente un linfocito Th2 específico de un segundo alérgeno no relacionado de la misma fuente (Der p 1), un linfocito Th1 específico para un segundo epítopo de linfocito T importante de Der p 2 (aminoácidos 71-85) y un clon de Th0 específico para el epítopo de linfocitos T subdominante 830-844 del toxoide del tétanos. Cada uno de estos 3 clones se usó en todos los sistemas de ensayo indicados en el presente documento. Los resultados se muestran para un único clon en cada ensayo, pero los resultados se confirmaron en todas las posibles combinaciones de ensayos y clones. En un primer conjunto de ensayos, la proliferación de un clon de linfocito T se midió usando células marcadas con CFSE después de presentación del antígeno correspondiente por esplenocitos pobres en linfocitos T. Para eliminar un artefacto debido a la competición por los nutrientes en el medio de cultivo, se añadió una cantidad igual del clon de Th2 no marcado al clon de Th2 marcado con CFSE. Un clon de Th2 específico para Der p 1 proliferó fácilmente como se midió durante un periodo de tiempo de 72 horas (Figura 14d). En ensayos paralelos, también se cargaron APC con p21-35 y un clon de linfocito T citolítico se añadió a una relación 1/1 al clon de Th2 específico de Der p 1. La Figura muestra que solamente el 5 % del clon de Th2 sobrevivió después de 72 horas de incubación. La Figura también muestra que la adición de anticuerpos específicos a FasL durante el periodo de incubación completo dio como resultado una inhibición parcial de la supresión (36 % de clon de Th2 residual), mientras que un anticuerpo anti GITR o anti Lag3 no tuvo ningún efecto. Se obtuvieron resultados idénticos con un clon de Th1 para Der p 2 y con un clon de Th0 para toxoide del tétanos. Los clones fueron por lo tanto susceptibles a la supresión por linfocitos T

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Claims

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