MXPA98007512A - Peptidos con afinidad incrementada por moleculasde locus a leucocitus humanos - Google Patents

Abstract

La presente invención provee péptidos inmunogénicos que comprenden un supermotivo HLA-A3. Los péptidos pueden usarse para tratar, diagnosticar o monitorear varias condiciones patológicas.

Description

PEPTIDQS CON AFINIDAD INCREMENTADA POR MOLÉCULAS DE LOCUS A LEUCOCITOS HUMANOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se re-fiere a compos c ones y métodos para prevenir» tratar o diagnosticar varios estados patológicos. En particular» provee péptidos novedosos capaces de unirse con moléculas seleccionadas del complejo de histocompat b 1 dad mayor (MHC) e inducir una respuesta inmune.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las moléculas del MHC se clasifican como moléculas clase I o clase II. Las moléculas de MHC clase II se expresan principalmente sobre células implicadas en la iniciación y sostenimiento de respuestas inmunes, tales como lin-focitos T» lin-foc tos B» macrófagos y similares. Las moléculas de MHC clase II son reconocidas por linfocitos T auxiliares e inducen la proli eración de linfocitos T auxiliares y la ampl ficación de la respuesta inmune hacia el péptido inmunogénico particular _, * que se despliega. Las moléculas de MHC clase I se expresan en casi todas las células nucleadas y son reconocidas por linfocitos T citotóxicos (CTL) que entonces destruyen a las células que llevan el antígeno. Los CTL son particularmente importantes en el rechazo de tumores y en el combate contra infecciones virales» fúngicas y paras tarias. La relación entre la afinidad de unión a moléculas de MHC clase I y la i munogenici ad de epítopes discretos de péptido ha sido analizada en dos diferentes enfoques experimentales (Sette, y otros» J. I munol . » 153:5586-5592 (1994)). En el primer enfoque» se analizó la nmunogen cidad de ^Ét epítopes potenciales que varían en afinidad de unión a MHC sobre una escala de lO»0O0 veces en ratones transgénicos HLA— A*O201. En el segundo enfoque» se determinó la antigenicidad de ÍO aproximadamente lOO diferentes epítopes potenciales derivados del virus de la hepatitis B (HBV)» llevando todos ellos motivos de unión A*0201» utilizando PBL de pacientes con hepatitis aguda. En ambos casos» se encontró que un umbral de afinidad de aproximadamente 500 nM (de preferencia 500 nM o menos) jfc determina la capacidad de un epítape de péptido para evocar una respuesta de CTL. Estos datos se correlación bien con las mediciones de afinidad de unión de la clase I» ya sea de péptidos procesados naturalmente o de los epítopes de células T previamente descritos. Estos datos indican la importante función de la selección de determinantes en la conformación de respuestas de células T. En general» las respuestas de CTL no están dirigidas contra todos los epítopes posibles. Mas bien» están restringidas a unos pocos determinantes nmunodo inantes (ZinKernagel » y otros, Adv. Im unol . 27» 51-59 (1979); BenninK» y otros. J. Exp. Med. 16B, 1935—1939 (19BB); Rawle, y otros, J.

Im unol . 146, 3977-3984 (1991)). Se ha reconocido desde hace mucho que la i nmunodomi ancia (Benacerraf » y otros» Science 175, 273-279 (1972)) pude ser explicada ya sea por la capacidad de un epítope dado para unirse selectivamente a una molécula 5 particular del MHC (teoría de selección de determinantes) (Vitiello» y otros, J. Im unol » 131:1635 (1933); Rosenthal , y jj otros, Nature 267» 156-158 (1977)) o ser reconocido sel ct amente por la especif cidad existente de TCR (teoría del repertorio) (Klein, J. » Im unology» the Science of Self- 10 IMonself Discrimination, John Wiley & Sons, New York, p. 270-310 (1982)). Se ha demostrado que también factores adicionales» principalmente ligados a los eventos de procesamiento, pueden tener una función clave para regir, más allá de la inmunogen c dad descrita, cual de los muchos determinantes potenciales será presentado como nmunodominante (Sercarz, y otros, Annu. Rey. I munol . II, 729-766 (1993)). La habilidad para modular la afinidad de unión de un péptido inmunogénico particular hacia una o más moléculas del locus A de leucocitos humanos <"HLA"), y con ello para modular la respuesta inmune evocada por el péptido, incrementaría en gran medida la utilidad de las vacunas y agentes terapéuticos a base de péptidos. La presente invención provee estas y otras ventajas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee péptidos y ácidos nucleicos que los codifican para utilizarse en vacunas y agentes terapéuticos. La invención provee métodos de inducción de una respuesta de células T citotóxicas en un paciente contra Í un antígeno preseleccionado» el método comprende poner en contacto una célula T citotóxica con un péptido inmunogénico de la invención. Los péptidos de la invención pueden derivarse de ÍO varios antígenos» incluyendo antígenos virales» antígenos asociados a tumor» antígenos de parásito» antígenos de hongo» y similares. Los métodos de la invención pueden llevarse a cabo n vitro o in vivo. En una modalidad preferida» los péptidos se ponen en contacto con células T citotóxicas administrando al ¿5 paciente una molécula de ácido nucleico que comprende una _*» secuencia que codifica el péptido inmunogénico. En una modalidad» el péptido es de entre aproximadamente 9 y aproximadamente 15 residuos y se une a por lo menos dos moléculas de HLA tipo A3» con una constante de disociación de menos de apro madamente SOOnM» e induce una respuesta de células T citotóxicas. Los péptidos inmunogénicos tienen una secuencia de 9 residuos que comprenden un motivo de unión desde el extremo N hasta el extremo C» de la manera sigu ente: 25 un primer residuo sujetador primario en la segunda posición» seleccionado del grupo que consiste de A» L, I, V, M, S y T, y un segundo residuo sujetador primario en la novena posición, seleccionado del grupo que consiste de R y K; y uno o más residuos sujetadores secundarios» seleccionados del grupo que consiste de Y» F» o W en la tercera posición» Y» F» o W en la sexta posición» Y» F» o W en la séptima posición» P en la octava posición» y cualquier combinación de los mismos. La invención provee además péptidos inmunogénicos que se unen a productos del gen HLA—A*03Q1. Estos péptidos comprenden un motivo de unión de nueve residuos» del extremo N al extremo C» de la manera siguiente: un primer residuo sujetador primario en la segunda posición» seleccionado del grupo que consiste de A» L» I» V» M» S y T. y un segundo residuo sujetador primario en la novena posición» seleccionado del grupo que consiste de R y K> y uno o más residuos sujetadores secundarios seleccionados del grupo que consiste de R» H» o K en la primera posición» Y» F» o W en la tercera posición» P» R» H» K» Y» F» o W en la cuarta posición» A en la quinta posición» Y» F» o en la sexta posición» P en la octava posición, y cualquier combinación de los mismos. La invención también provee péptidos inmunogénicos que se unen a productos del gen HLA—A..1101. Estos péptidos comprenden un motivo de unión de nueve residuos» del extremo N al extremo C» de la manera siguiente: un primer residuo sujetador primario en la segunda posición» seleccionado del grupo que consiste de A, L, I. V, M, S y T» y un segundo residuo sujetador primario en la novena posición, seleccionado del grupo que consiste de R y K; y un residuo sujetador secundario seleccionado del grupo que consiste de A en la primera posición» Y» F, o W» en la tercera posición, Y, F, o W en la cuarta posición, A en la 9k quinta posición, Y, F, o W en la sexta posición, Y, F, o W en la séptima posición, P en la octava posición, y cualquier combinación de los mismos. 10 La invención también provee péptidos inmunogénicos que se unen a productos de gen HLA-A-x-3101. Estos péptidos comprenden un motivo de nueve residuos» del extremo N al extremo C» de la manera siguiente: un primer residuo sujetador primario en la segunda Ate posición» seleccionado del grupo que consiste de A» L» I» V. M» S y T» y un segundo residuo sujetador primario en la novena posición» seleccionado del grupo que consiste de R y K» y un residuo sujetador secundario seleccionado del grupo que consiste de R» H» o K en la primera posición» Y» F» o 20 W» en la tercera posición» P, en la cuarta posición» Y» F» o en la sexta posición» Y, F» o W en la séptima posición» A o P en la octava posición» y cualquier combinación de los mismos. La invención también provee péptidos inmunogénicos que se unen a productos del gen HLA-A..3301. Estos péptidos 25 comprenden un motivo de nueve residuos» del extremo N al extremo C» de la manera siguiente: un primer residuo sujetador primario en la segunda posición, seleccionado del grupo que consiste de A, L, I, V» M» S y T, y un segundo residuo sujetador primario en 1 a novena posición, seleccionado del grupo que consiste de R y K> y 5 un residuo sujetador secundario seleccionado del grupo que consiste de Y» F» o W en la tercera posición» A» Y» J?k F» o W» en la séptima posición» y cualquier combinación de los mismos. La invención también provee péptidos nmunogénicos 10 que se unen a productos de gen HLA—A*6801. Estos péptidos comprenden un motivo de nueve residuos» del extremo N al extremo C» de la manera siguiente: un primer residuo sujetador primario en la segunda posición» seleccionado del grupo que consiste de A. L» I» V» M» J S y T. y un segundo residuo sujetador primario en 1 a novena posición» seleccionado del grupo que consiste de R y K; y un residuo sujetador secundario seleccionado del grupo que consiste de Y, F, W, S, T, o C en la primera posición, Y, F» W» L, I, V, o M, en la quinta posición, Y, F, o W en la séptima posición, P en la octava posición» y cualquier combinación de los mismos. La invención también provee métodos de identif cación de péptidos inmunogénicos que se unen a moléculas de HLA tipo A—3 con una constante de disociación de menos de aproximadamente 500 nM. El método comprende seleccionar una secuencia de aminoácidos de una proteína antigénica para • determinar la presencia del motivo de unión de la invención» y seleccionar una o más subsecuencias en la proteína antigénica que tengan el motivo de unión. Se preparan y analizan péptidos de prueba de apro i adamente S y aproximadamente 11 residuos que comprenden las subsecuencias sel ccionadas. Después se identifican los péptidos con una constante de disociación de menos de 500 nM.

De in c ones El término "péptido" se usa intercambiablemente con "oligopépt do" en la presente especificación para designar una serie de residuos» típicamente L—aminoáci os» unidos uno al otro típicamente mediante enlaces peptídicos entre los grupos alfa-amino y carbonilo de aminoácidos adyacentes. Los oligopéptidos de la invención son de menos de aproximadamente 15 residuos de longitud y usualmente consisten de entre aproximadamente 9 y aproximadamente 11» de preferencia 9 o ÍO res duos. Un "péptido inmunogénico" es un péptido que comprende 0 un motivo o super otivo específico de alelo» de tal manera que el péptido se unirá a una molécula de MHC e inducirá una respuesta de CTL. Los pép ?dos i munogénicos de la invención son capaces de unirse a una molécula apropiada de HLA tipo A3, e inducir una repuesta de células T citotóxicas contra el 5 antígeno del cual se deriva el pépt?do inmunogénico. Un "residuo sujetador primario" es un aminoácido en una posición específica a largo de una secuencia de péptido, que puede proveer un punto de contacto entre el péptido inmunogénico y la molécula de MHC. Generalmente, de uno a tres, usualmente dos, residuos sujetadores primarios dentro de un péptido de longitud definida, definen un motivo para un péptido inmunogénico. Estos residuos están típicamente en estrecho contacto con la ranura de unión del péptido, con sus cadenas ^___W laterales enterradas en cavidades específicas de la misma ranura. Típicamente, los residuos sujetadores primarios están localizados en la posición 2 y 9 del péptido de 9 residuos. Un "residuo sujetador secundario" es un aminoácido que está presente en una frecuencia signi cativamente más alta de la que podría esperarse por distribución aleatoria en una posición particular diferente de los sujetadores primarios en 9& un péptido. Alternat vamente, los sujetadores secundarios pueden ser identificados como aquellos que tienen una frecuencia más alta entre péptidos de alta afinidad de unión o están asociados con unión de alta afinidad. Puede usarse la presencia o ausencia de residuos particulares en estas posiciones para modular sutilmente la afinidad de unión de un péptido que comprende un motivo particular. Como se usa en la presente, "residuos negativos de unión" son aminoácidos que si están presentes en ciertas posiciones (típicamente no en posiciones su etadoras primarias), darán como resultado afinidad de unión reducida por la molécula objetivo de HLA.

El termino "motivo" se refiere al patrón de residuos en un péptido de longitud definida» usualmente de alrededor de 8 a apro adamente 15 aminoácidos» que es reconocido por una molécula particular de MHC. Los motivos de péptido son 5 típicamente diferentes para cada alelo del MHC humano y difieren en el patrón de los residuos sujetadores primario y á - Ék secundario. Un "super oti o" se refiere a motivos que, cuando están presentes en un péptido inmunogénico» permiten que el 10 péptido se una a más de un antígeno de HLA. El supermotivo preferiblemente es reconocido con afinidad alta o intermedia (como se define más adelante) mediante por lo menos un alelo de HLA» reconocido preferiblemente por al menos dos alelos, de preferencia reconocido por al menos tres alelos» y se prefiere j—p que sea reconocido por más de tres alelos. Las moléculas de HLA clase I que comparten ciertos motivos de unión de péptidos similares» son agrupadas en supertipos de HLA. Un "supertipo o familia de HLA", como se usa aquí, describe grupos de moléculas agrupadas en base a las 20 especificidades compartidas de unión de péptido, más bien que a los supertipos serológicos basados en determinantes antigénicos compartidos. Una molécula de HLA, "HLA tipo A-3" (referida también como un alelo) como se usa aquí» se refiere a un grupo de moléculas de HLA codificadas por alelos HLA-A que comparten un motivo de unión de péptido de traslape con el supermotivo HLA— A3 descrito en la presente. El supermotivo de 9 residuos compartidos por estos alelos comprende los siguientes residuos sujetadores primarios: A» L, I, V» M, S o T en la posición 2 y residuos cargados pos tivamente» tales como R y K» en la posición 9 (el extremo C en noná eros). Los miembros ejemplares de esta familia, identificados ya sea por serología o l tipificación de ADN, incluyen: A3 (A**G301), All (A**1101), A31 (A**3101), A**3301, y A*»6B01. Otros miembros de la familia incluyen A34, ASS» y A**7401. Como se explica en detalle más adelante» la unión a cada uno de los alelos individuales puede ser modulada finamente mediante substituciones en las posiciones sujetadores secundarias. El supertipo "similar a HLA—A2" está caracterizado por una preferencia para ligandos de péptido con aminoácidos —^i pequeños o al fáticos (L» I» V» M» A» y T) en la posición 2 y el extremo C. La famil a está comprendida de por lo menoe ocho alelos de HLA-A (A-0201, A**0202 , A-0203» A-0204, A-O205 , A-0206, A-6802, y A**6901 ) . El supertipo "similar a HLA—B7" está comprendido de 20 productos de por lo menos una docena de alelos de HLA—B (B7» B~3501-3, B51, B**5301 » B~5401 , B~5501 , B~5502, B"5601 , BB-6701 y B**7801) (Sidney, y otros, J Immunol 154:247 (1995). Barber, y otros. Curr Biol 5:179 (1995); H ll, y otros, Nature 360:434 (1992); Rammensee. y otros» Immunogenetics 41 : 178 (1995), y 25 está caracter zado por moléculas que reconocen péptidos que llevan prolina en posición 2 y aminoácidos hidrofóbicos o alifaticos (L, I, V, M, A, F, W, y Y) en su extremo C. Las frases "aislado" o "biológicamente puro" se refiere a material que está substancialmente o esencialmente libre de los componentes que normalmente son acompañantes como se encuentra en su estado natural. De esta manera, los péptidos de esta invención no contienen materiales asociados normalmente con su medio ±xrx, s tu» por ejemplo» moléculas 1 de MHC sobre células que presentan el antígeno. Aun cuando una proteína ha sido aislada hasta una banda homogénea o dominante» existen trazas de contam antes en la escala de 5 a 1054 de proteína natural que se purifican junto con la proteína deseada. Los péptidos aislados de esta invención no contienen esta proteína endógena purificada conjuntamente. El término "residuo" se refiere a un aminoácido o un imitador de aminoácido incorporado en un oligopéptido por medio de un enlace am?do o enlace similar a amido.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra motivos específicos de alelo refinados de los cinco alelos tipo A3: A**O301» A**1101, A**3101 » A**3301» y A**6801. Se muestran residuos indi iduales o grupos de residuos de naturaleza química similar» asociados para cada posición no sujetadora con buenas o deficientes capacidades de unión a cada alelo individual. La figura 2 muestra el supermotivo tipo A3. Los números entre paréntesis indican el numero de moléculas para las cuales fue preferido o perjudicial el residuo o grupo de res duos. La figura 3 resume los efectos secundarios que afectan la capacidad de unión de los péptidos para a) B**0702» b) B-3501 c) B51, d) B**5301 y e) B**5401. Estos mapas se usaron subsecuentemente para definir el supermotivo tipo B7 (f). Los valores entre paréntesis indican la frecuencia en la que fue preferido o perjudicial un residuo o grupo de residuos. La figura 4 muestra la capacidad de unión promedio relativa de los péptidos de 9 residuos del supermotivo A**0101, como función de los diferentes residuos que se presentan en cada una de las posiciones no sujetadoras. Se anal zaron grupos de datos de grupos de péptidos de sub ot os de 2 - 9 residuos (a)» y de 3 - 9 residuos (b)» y se tabuló como se describe en Materiales y Métodos. Los grupos 2-9 y 3—9 contenían 101 y 85 péptidos diferentes, respectivamente. También se muestran mapas de efectos secundarios que afectan la capacidad de unión de péptidos de 9 residuos que llevan los submotivos 2—9 (c) y 3—9 (d) de A-01O1. .__* La figura 5 muestra la capacidad de unión promedio relativa de péptidos decá eros de sub otivo A**0101 como función de los diferentes residuos que se presentan en cada una de la posiciones no sujetadoras. Se analizaron y tabularon grupos de datoe de los grupos de péptidos de submotivos de 2 — ÍO residuos (a), o 3 - 10 residuos (b). Los grupos 2-10 y 3-10 contenían 91 y 89 péptidos diferentes, respectivamente. También se muestran mapas de efectos secundarios que afectan la capacidad de unión de péptidos decá eros que llevan los submotivos Al de 2—10 residuos (c) y (1) y/o 3—10 residuos (d).

DESCRIPCIÓN DE LA MODALIDAD PREFERIDA • La presente invención se refiere a la determinación de motivos y super oti vos de péptido específicos de alelo para alelos de MHC clase I humanos (referidos como HLA), en particular, alelos similares a HLA-A3. Estos motivos se usan después para preparar y modificar epítopes de células T de cualquier antígeno deseado, particularmente los asociados con enfermedades virales, enfermedades parasitarias, enfermedades rfk5 micóticas o cánceres de humanos. Como se indicó antes» la alta afinidad de unión de HLA está correlacionada con inmunogenicidad superior. La in unogem'cidad superior puede manifestarse de varias maneras diferentes. Por ejemplo» un péptido que presenta mayor unión será inmunogénico más a menudo. Cerca del 90% de los péptidos que presentan mayor unión son inmunogénicos» en contraste con aproximadamente 50% de los péptidos que se unen con afinidad intermedia. Un péptido de unión mayor también conducirá a una respuesta más vigorosa. Como resultado, se requiere menos péptido para evocar un efecto biológico o similar. Así, en algunas modalidades de la invención, los epítopes de unión mayor son particularmente convenientes. En algunas modalidades de la invención, es conveniente la identif cación de epítopes subdominantes en oposición a los dominantes. En la nomenclatura adoptada aquí (Sercarz y otros, (1993)» véase anter ormente). un "epítope dominante" induce una respuesta después de inmunización con antígenos naturales intactos. Dicha respuesta es reactiva cruzadamente jn. vi tro con el epítope del péptido. Un "epítope oculto" evoca una respuesta por inmunización de péptido» pero ÍO no tiene reacción cruzada jn vitro cuando se usa proteína completa intacta como antígeno. Finalmente» un "epítope subdominante" es un epítope que evoca poca o ninguna respuesta después de la inmunización con antígenos completos» pero para los cuales puede obtenerse una respuesta por inmunización con l p péptido, y esta respuesta (a diferencia del caso de los epítopes ocultos) es detectada cuando se usa la proteína completa para recordar la repuesta jn vitro. El concepto de dominancia y subdominancia es relevante para la inmunoterapia de enfermedad viral y cáncer.

En el curso de enfermedades virales crónicas» el reclutamiento de epítopes subdom nantes puede ser crucial para la eliminación exitosa de la infección» especialmente si las especificidades de CTL dominantes han sido inactivadas por tolerancia funcional» supresión» mutación de virus y otros mecanismos (Franco» y otros» Current Opinión in Immunology» 7:524-531» (1995)). Además» en el caso de antígenos de cáncer y tumor» parece que los CTL que reconocen por lo menos algunos de los péptidos de unión más alta» podrían haber sido inactivados funcionalmente por tolerancia y supresión» y son reconocidos preferencialmente los péptidos de afinidad de unión más baja. En particular» se ha observado que un número signif cat vo de epítopes derivados de antígenos asociados a tumores (TAA) no virales conocidos se unen a HLA clase I con afinidad intermedia (CI505. en la escala 50-500 mM) . Se ha encontrado que a de 15 péptidos de TAA conocidos» reconocidos por linfocitos de infiltración de tumor (TIL) o CTL» se unen en la escala de 50-500 mM. Estos datos están en contraste con las estimaciones de que 90% de los antígenos virales conocidos que fueron reconocidos como péptidos» se unieron a HLA con CI5054 de 50 µM o menos, mientras que solo apro i adamente 105Í se unieron en la escala de 50-500 M (Sette, y otros, J. I munol . , 153:5586-5592 (1994)). Este fenómeno se debe probablemente en el establecimiento del cáncer» a eliminación o inhibición funcional de los CTL que reconocen varios de los péptidos de unión mayor» presumiblemente debido a eventos de tolerancia de células T. La presente invención provee métodos para modular la afinidad de unión de péptidos inmunogénicos mediante la selección de residuos deseados en las posiciones sujetadoras primaria y secundaria. Como se explica en detalle más adelante» se provee aquí un supermotivo para unión incrementada a alelos tipo A3. Dependiendo del efecto deseado sobre la afinidad de unión» es que son substituidos los residuos sujetadores en un péptido deseado. Los ejemplos de modulaciones que pueden lograrse usando la presente invención» incluyen afinidad incrementada por un alelo particular (por ejemplo» mediante substitución de residuos sujetadores secundarios específicos para el alelo)» reactividad cruzada incrementada entre diferentes alelos (por ejemplo» mediante substitución de residuos sujetadores secundarios compartidos por más de un alelo)» y producción de un epítope subdominante (por ejemplo, mediante substitución de residuos que incrementan afinidad pero que no están presentes en el epítope inmunodomi ante). Pueden usarse en la presente invención epítopes en varias proteínas objetivo potenciales. Los ejemplos de antígenos adecuados incluyen antígeno específico de próstata (PSA), antígenos de núcleo y superficie de hepatitis B (HBVc, HBVs). antígenos de hepatitis C» antígenos de virus Epstein— Barr» antígenos de melanoma (v.gr.» MAGE—1) » antígenos del virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y antígenos del virus de papiloma humano (HPV). Antígenos ejemplares de hongos incluyen los derivados de Candida albicans, Cryptococcus neoformans , Cocci oides spp.» Histoplas a spp. i y Aspergi 1 lus furoigatis. Los antígenos de parásito incluyen los derivados de Plasmodium SP .. Trypanosoma spp., Schistoso a SPP . , leishmania SPP y similares. La preparación y evaluación de los péptidos de la invención se describen en las publ caciones PCT WO 94/20127 y WO 94/03205. Brevemente» los péptidos que comprenden los epítopes de un antígeno particular, son sintetizados y analizados para determinar su capacidad de unión a las moléculas de MHC apropiadas, en pruebas que utilizan por ejemplo moléculas clase I purificadas y péptidos radioyodados y/o células que expresan moléculas vacías de clase I, por ejemplo por medio de tinción inmuno luorescente y micro luorometría de flujo, pruebas de ensamble de clase I dependiente de péptido» e inhibición del reconocimiento de CTL por competencia de péptidos. Los péptidos que se unen a las moléculas clase I son evaluadas adicionalmente para determinar su capacidad para servir como blancos para los CTL derivados de individuos infectados o inmunizados, así como para determinar su capacidad para inducir respuestas de CTL primarias in tro ° in v vo que puedan originar poblaciones de CTL capaces de reaccionar con células blanco seleccionadas asociadas con una enfermedad. En toda esta descripción, los resultados se expresan en términos de CI50. Dadas las condiciones en las cuales se desarrollan las pruebas (es decir, concentrac ones limitantes de MHC y péptido marcado), estos valores se aproximan a los valores K):>. Debe indicarse que los valores de CI50 pueden cambiar» a menudo dramáticamente, si se varían las condiciones de prueba, y dependiendo de los reactivos particulares usados (por ejemplo, la preparación de MHC, etc.). Por ejemplo, concentraciones excesivas de MHC aumentarán la CI50 medida aparente de un ligando dado. Como se usa en la presente, "afinidad alta" está definida aquí como una unión con una CI50 (oK0) de menos de 50nM. La "afinidad intermedia" es 1 a unión con una CI50 (o K0) de entre aproximadamente 50 y aproximadamente 500 nM. Las pruebas para determinar la unión se describen en detalle en las publicaciones de PCT WO 94/20127 y WO 94/03205. Una forma alternativa de expresar los datos de unión es un valor relativo a un péptido de referencia. El péptido de referencia se incluye en cada prueba. Conforme una prueba particular se hace más o menos sensible, las CISO de los péptidos probados puede cambiar un poco. Sin embargo, la unión relativa al péptido de referencia no cambiará. Por ejemplo, en una prueba corrida bajo condiciones tales que la CI50 del péptido de referencia aumenta 10 veces» todos los valores de CI50 también se desviarán aproximadamente 10 veces. Por lo tanto, para evitar ambigüedades» las determ naciones de si un péptido es un enlazador bueno» intermedio» débil o negativo, deben basarse en su CI50, en relación con la CI50 del péptido estándar. La nomenclatura usada para describir compuestos de péptido sigue la práctica convencional, en la que el grupo amino es presentado a la izquierda (el extremo N) y el grupo carbox lo a la derecha (el extremo C) de cada residuo de aminoácido. En las fórmulas que representan modalidades específicas seleccionadas de 1 a presente invención, los grupos terminales amino y carboxilo, aunque no se muestra especif icamente , están en la forma que asumirían a valores de pH fisiológico, a menos que se especifique de otra manera. En las fórmulas de estructura de aminoácido, cada residuo está representado generalmente por designaciones estándar de tres letras o de una sola letra. La forma L de un residuo de •É9- aminoácido está representado por una sola letra mayúscula o una primera letra mayúscula de un símbolo de tres letras» y la forma D— para aquellos aminoácidos que tienen formas D» está representada por una sola letra minúscula o un símbolo de tres letras minúsculas. La glicina no tiene átomo de carbono asimétrico y es referida simplemente como "Gly" o G. Los péptidos inmunogénicos pueden prepararse sintéticamente» o por medio de tecnología de ADN recombinante» -d ^ o a partir de fuentes naturales tales como virus completos o tumores. Aunque el péptído prefe lemente estará substancialmente libre de otras proteínas y fragmentos de proteínas de la célula huésped que se presentan naturalmente» en algunas modalidades los péptidos pueden ser conjugados 20 sintéticamente con fragmentos o partículas naturales. Los polipéptidos o péptidos pueden ser de una variedad de longitudes» ya sea en sus formas neutras (sin carga) o en formas que son sales, y ya sea libres de modificaciones tales como glicosilación, oxidación de cadena 25 lateral o fosforilación» o contienen estas modificaciones» sujetas a la condición de que la modificación no destruya la actividad biológica de los polipeptidos como se describe en la presente. Convenientemente, el péptido será tan pequeño como sea posible, mientras que mantenga substancialmente toda la actividad biológica del péptido grande. Cuando sea posible» puede ser conveniente utilizar los péptidos de la invención hasta una longitud de apro i adamente 8 a apro i adamente 20 residuos de aminoácidos, típicamente de 9 a 15» y de preferencia de 9 a 10, conmensuradamente en tamaño con péptidos virales procesados endógenamente o péptidos de células de tumor que se unen a moléculas de MHV clase I sobre la superficie de la célula. Los super otivos preferidos descritos en la presente son adecuados para péptidos de aproxi adamente 9 residuos de longitud. La identificación de supermoti os, sujetadores primarios y sujetadores secundarios para péptidos de otras longitudes (por ejemplo 8» 10» y 11 residuos) puede llevarse a cabo usando las técnicas descritas en la presente. Los péptidos que tienen la actividad deseada pueden modificarse conforme sea necesario para proveer ciertos atributos deseados» por ejemplo, características farmacológicas mejoradas, siempre que aumente o por lo menos retenga substancialmente toda la actividad biológica del péptido no modificado para unirse a la molécula de MHC deseada y activar la célula T apropiada. Por ejemplo, los péptidos pueden ser sometidos a varios cambios, tales como subst tuciones» ya sea conservati as o no conservativas» en donde dichos cambios pueden proveer ciertas ventajas en su uso» tal como unión mejorada de MHC. Por substituciones conservati as se entiende el reemplazo de un residuo de* aminoácido con otro que es biológicamente y/o químicamente similar, por ejemplo, un residuo hidrofóbico por otro, o un residuo polar por otro. Estas subst tuciones incluyen combinaciones tales como Gly, Ala; Val, lie» Leu» Met; Asp» Glu; Asn» Gln; Ser, Thr; Lys» Arg; y Phe» Tyr. El efecto de substituciones de un solo aminoácido puede ser sondeado también utilizando D—am noácidos .

Dichas modificaciones pueden hacerse usando procedimientos bien conocidos de síntesis de péptidos» como se describe por ejemplo en Merr? ield, Science 232:341—347 (19B6), y Stewart and Young» Solid Phase Peptide Synthesis» (RocKford, 111., Pierce), 2d Ed. ( 1984) . rf-5 Los péptidos también pueden ser modificados extendiendo o reduciendo la secuencia de aminoácidos del compuesto, por ejemplo, med ante la adición o supresión de aminoácidos. Los péptidos o análogos de la invención también pueden ser modificados alterando el orden o composición de ciertos residuos, apreciándose fácilmente que ciertos residuos aminoácidos esenciales para la actividad biológica, por ejemplo, aquellos en los sitios de contacto críticos o residuos conservados, no pueden ser alterados generalmente sin urx efecto adverso sobre la actividad biológica. Los aminoácidos no críticos no necesitan ser limitados a los que ocurren naturalmente en las proteínas, tales como L—x-ami oácidos» o sus isómeros D— » pero pueden incluir también aminoácidos no naturales» tales como ß— —é-aminoácidos» así como muchos derivados de L— -aminoácidos. Típicamente» se emplea una serie de péptidos con substituciones de un solo aminoácido para determinar el efecto de la carga electrostática. carácter hidrofóbico» etc.» sobre la unión. Por ejemplo» se hace una serie de substituc ones de aminoácidos cargados posit vamente (v.gr.. Lys o Arg) o cargados negat vamente (v.gr.» Glu) a lo largo de la longitud del péptido» revelando diferentes patrones de sensibilidad hacia varias moléculas MHC y receptores de células T. Además» puede emplearse substituciones múltiples usando entidades pequeñas relati amente neutras tales como Ala, Gly, Pro» o residuos similares. Las substituciones pueden ser de homo— oligómeros o hetero-ol i gomeros. El número y tipos de residuos que son substituidos o agregados depende de la separación necesaria entre los puntos de contacto esenciales y ciertos atributos funcionales que se buscan (por ejemplo carácter hidrofóbico contra carácter hidrofílico). La afinidad de unión incrementada para una molécula de MHC o un receptor de células T puede lograrse también mediante tales subst tuciones» en comparación con la afinidad del péptido original. En cualquier caso, dichas substituciones deben emplear residuos de aminoácidos u otros fragmentos moleculares elegidos para evitar, por ejemplo, interferencia estérica y de carga que pudiera romper el enlace. 2.A Las substituciones de aminoácidos son típicamente de residuos individuales. Pueden combinarse subst tuciones» supresiones, inserciones o cualquier combinación de las mismas para llegar a un péptido final. Las variantes substi tucionales son aquellas en las cuales por lo menos un residuo de un péptido ha sido removido y un residuo diferente ha sido insertado en su lugar. Dichas substituciones generalmente se hacen de conformidad con el siguiente Cuadro 1» cuando se desea modular finamente las caracter sticas del péptido.

CUADRO 1 Residuo Original Substitución Ejemplar Ala Ser Arg Lys » His Asn Gln , Asp Glu Cys Ser Gln Asn Glu Asp Gly Pro His Lys ; Arg lie Leu; Val Leu lie; Val > Lys Arg; His Met Leu; lie Phe Tyr; Trp Ser Thr Thr Ser Trp Tyr; Phe Tyr Trp; Phe Val lie; Leu Pueden hacerse cambios substanciales en función (por ejemplo» afinidad por moléculas de MHC o receptores de células T), seleccionando substituciones que son menos conservativas que las del Cuadro 1» es decir, seleccionando residuos que 5 difieran más significativamente en su efecto en el mantenimiento (a) de la estructura del esqueleto del péptido en Iflfc- el área de substitución, por ejemplo como una conformación laminar o helicoidal, (b) la carga o carácter hidrofóbico de la molécula en el sitio blanco o (c) el volumen de la cadena ÍO lateral. Las substituciones que en general se espera que produzcan los cambios mayores en las propiedades del péptido, serán aquellas en las cuales (a) un residuo hidrofílico» por ejemplo serilo» substituya a (o sea substituido por) un residuo hidrofóbico» por ejemplo leucilo» isoieucilo» fen lalani lo, valilo o alanilo; (b) un residuo que tiene una cadena lateral electroposi i a, por ejemplo, lisilo, arginilo, o histidilo, substituya a (o sea substituido por) un residuo electronegativo, por ejemplo gluta ilo o aspartilo; o (c) un residuo que tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo» fen lalanina» substituya a (o sea substituido por) uno que no tiene una cadena lateral, por ejemplo, glicina. Los péptidos también pueden comprender isósteros de dos o más residuos en el péptido inmunogénico. Un isóstero como se define en la presente» es una secuencia de dos o más residuos de aminoácidos que pueden substituir a una segunda secuencia» porque la conformación estérica de la primera secuencia se ajusta a un sitio de unión especifico para la segunda secuencia. El término incluye específicamente modi icaciones en el esqueleto del péptido bien conocidas para el experto en la materia. Tales modificaciones incluyen 5 modif caciones en el nitrógeno de amida» el carbono ex, a idacarbonilo, reemplazo completo del enlace amido, ^É ^ extensiones, supresiones o entrelazamientos del esqueleto. Ver, en general, Spatola, Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Protein, Vol. VII (Weinstein ed. , 1983). ÍO Las modif cac ones de péptidos con varios imitadores de aminoácidos o aminoácidos no naturales, son particularmente útiles para aumentar la estabilidad del péptido jn v vo. La estab lidad puede determinarse en diferentes formas. Por ejemplo» se han usado peptidasas y varios medios biológicos &*_ tales como plasma y suero humano para probar la estabilidad. Ver, por ejemplo» Verhoef y otros» Eur. J. Drug Metab. Pharmacokin 11:291-302 (1986). La vida media de los péptidos de la presente invención se determina convenientemente utilizando una prueba con suero humano al 25% (v/v). En términos 20 generales» el protocolo es como sigue. Suero humano recolectado (tipo AB» no inactivado con calor) es desl ipidizado mediante centrifugación antes de su uso. Después, el suero se diluye hasta 25% con medio de cultivo de tejidos RPMI» y se utiliza para probar la estabilidad del péptido. A intervalos 25 predeterminados» se retira una pequeña cantidad de la solución de reacción y se agrega a ácido trie! oroacético acuoso al 6% o bien a etanol . La muestra de reacción turbia se enfría (4°C) durante 15 minutos y después se hace girar para hacer pella las proteínas séricas precip tadas. Después se determina la presencia de los péptidos mediante HPLC de fase inversa usando 5 condiciones de cromatografía específicas para estabilidad. Los péptidos de la presente invención o análogos de 99 . los mismos que tienen actividad estimuladora de CTL» pueden ser modificados para proveer atributos deseados» aparte del mejoramiento de la vida media en suero. Por ejemplo» puede incrementarse la capacidad de los péptidos para inducir actividad de CTL mediante su unión a una secuencia que contiene por lo menos ?n epítope que es capaz de inducir una respuesta de células T auxiliares. Los conjugados inmunogén cos particularmente preferidos de péptidos/auxi 1 iares T están k§ l gados por una molécula separadora. El separador está , comprendido típicamente de moléculas neutras relativamente pequeñas» tales como aminoácidos o imitadores de aminoácidos» que substancial mente no tiene carga bajo condiciones fisiológicas. Los separadores se seleccionan típicamente de» por ejemplo» Ala; Gly, u otros separadores neutros de aminoácidos no polares o aminoácidos polares neutros. Se entenderá que el separador presente opcional ente no necesita estar comprendido de los mismos residuos y por lo tanto puede ser un hetero—ol gómero o uri homo-ol ig mero. Cuando está presente, el separador será usualmente de por lo menos uno o dos residuos, usualmente tres a seis residuos.

Alternativamente» el péptido de CTL puede ser unido al péptido de auxil ar T sin un separador. El péptido inmunogénico puede estar ligado al péptido auxiliador T, ya sea directamente o mediante un separador en el extremo amino o carboxilo del péptido de CTL. El extremo amino ya sea del péptido inmunogénico o del péptido de auxiliador T. puede estar acilado. Los péptidos de auxiliares T usados en la invención pueden ser modificados de la misma manera que los péptidos de CTL. Por ejemplo» pueden ser modificados para incluir D—aminoácidos o ser conjugados con otras moléculas tales como lípidos» proteínas» azúcares y similares. Los péptidos de auxiliador T ejemplares incluyen el toxoide del tétanos 830-843, influenza 307-319» circu sporozoítos de malaria 382-398 y 378-389. Alternati amente» el péptido de auxiliar T es uno que es reconocido por células auxil ares T en la mayoría de la población. Esto p?ede lograrse seleccionando secuencias de aminoácido que se unan a muchas, la mayoría, o a todas las moléculas de MHC clase II. Estas son conocidas como secuencias de auxiliador T "no restringidas firmemente por MHC" o "promiscuas" . Los ejemplos de secuencias de aminoácidos que son promiscuas incluyen secuencias de antígenos tales como la toxina del tétanos en las posiciones 830-843 (QYIKANSKFIGITE) » proteína CS de Plasmodium falc paru en las posiciones 378—398 (DIEKKIAKMEKASSVFNWNS) , y proteína de Streptococcus de 18KD en las posiciones 1-16 (GAVDSILGGVATYGAA) .

Alternativamente» es posible preparar péptidos sintéticos capaces de estimular linfocitos T auxiliares» de una manera no restringida firmemente por MHC» utilizando secuencias de aminoácidos no encontradas en 1 a naturaleza (véase» por ejemplo» la publicación de PCT WO 95/07707). Estos compuestos sintéticos denominados epítope de unión Pan-DR (PADRE) están k»_- diseñados en base a su actividad de unión a la mayoría de las moléculas HLA-DR (MHC clase II humano). Por ejemplo, se ha encontrado que un pépt do que tiene la fórmula: aKXVWANTLKAAa» en donde X = ci lohexi lalanina» fenilalanina» o tirosina» y a = D-alanina o L—alanina» se une a la mayoría de los alelos» HLA— DR, y que estimula la respuesta de linfocitos T auxil ares de la mayoría de los individuos, sin importar su tipo de HLA. Los epítopes auxiliares T pueden ser modificados también para aumentar su efecto biológico. Por ejemplo, los péptidos que presentan epítopes T auxiliares pueden contener D—aminoácidos para aumentar su resistencia a las proteasas y así extender su vida media en el suero. También, los péptidos de auxiliar T pueden ser conjugados con otras moléculas tales como lípidos, proteínas o azúcares, o cualquier otro compuesto sintético» para aumentar su actividad biológica. Específicamente» el péptido auxiliar T puede ser conjugado con una o más cadenas de ácido palmítico ya sea en el extremo amino o en el carboxilo. En algunas modalidades, puede ser conveniente incluir 5 en las composiciones farmacéuticas de la invención, por lo menos un componente que prepare CTL. Se han identificado lípidos como agentes capaces de preparar CTL in vivo contra antígenos virales. Por ejemplo, pueden fijarse residuos de ácido palmítico a los grupos alfa y épsilon amino de un residuo de Lys, y después ligarse, por ejemplo» mediante uno o más residuos de unión tales como Gly. Gly-Gly—. Ser» Ser—Ser, o similares, con un péptido inmunogénico. El péptido unido con - lípido puede entonces ser inyectado directamente en una forma micelar» incorporado en un liposoma o emulsionado en un adyuvante, por ejemplo» adyuvante incompleto de Freund. En una modalidad preferida. un inmunógeno part cularmente efectivo comprende ácido palmítico unido a grupos amino alfa y épsilon de Lys, que es unido mediante enlace, por ejemplo v.gr. Set— Ser, al extremo amino del péptido i munogénico. Como otro ejemplo de preparación de respuestas de CTL por lípido» pueden usarse lipoproteí as de E. col tales como tri Ipalmitoi 1-S-gl iceri Icisteinl iseri 1—serina (P..-CSS)» para preparar CTL específicos de virus cuando se les une covalentemente a un péptido apropiado, véase» Deres y otros, Nature 342:561—564 (1989), incorporada en la presente como referencia. Los péptidos de la invención pueden acoplarse con P3CSS» por ejemplo» y el lipopéptido administrarse a un individuo para preparar específicamente una respuesta de CTL para el antígeno blanco. Además» como la inducción de anticuerpos neutral zantes puede ser preparada también con P3CSS conjugado con un péptido que exhibe un epítope apropiado» las dos composiciones pueden combinarse para evocar más • 32 efectivamente respuestas tanto humorales como mediadas por célula contra la infección. Además, pueden añadirse aminoácidos adicionales al extremo de un péptido para proveer facilidad de unión de péptidos uno con el otro» para acoplar a un soporte de vehículo» o un péptido más grande» para modificar las propiedades físicas o químicas del péptido y oligopéptido» o similares. Pueden introducirse aminoácidos tales co o tirosina» cisteína» lisina» ácido glutámico o aspártico» o similares, en O el extremo C- o N- del péptido u oligopéptido. La modificación en el extremo C. en algunos casos» puede alterar las características de unión del péptido. Además» las secuencias del péptido u oligopéptido pueden diferir de la secuencia natural al ser modificadas por acilación NHs-terminal » por ejemplo, mediante alcanoil (C — so ) o tiogl colil acetilación» amidación de carboxilo term nal» por ejemplo» amoniaco» metilamina, etc. En algunos casos, estas modif caciones pueden proveer sitios de unión para un soporte u otra molécula. Los péptidos de la invención pueden prepararse en una 0 amplia variedad de formas. Debido a su tamaño relat vamente corto, los péptidos pueden sintetizarse en solución o sobre un soporte sólido de conformidad con las técnicas convencionales. Se tienen disponibles varios sintetizadores automáticos y pueden utilizarse de conformidad con los protocolos conocidos. 5 véase, por ejemplo, Stewart y Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2da ed. » Pierce Chemical Co. (1984), véase más • 33 adelante. Al ernativamente» puede emplearse tecnología de ADN recombinante» en donde una secuencia de nucleótido que codifica un péptido inm?nogénico de interés es insertada en ?n vector de expresión, transformada o transfectada en una célula huésped apropiada y cultivada bajo condiciones adecuadas para su expresión. Estos procedimientos son conocidos generalmente en la técnica, como se describe» en términos generales» en » SambrooK y otros. Molecular Cloning» a Laboratory Manual» Cold Spring Harbor Press» Cold Spring Harbor» New York (1982). que se incorpora en la presente como referencia. De esta manera, pueden usarse proteínas de fusión que comprenden una o más secuencias de péptido de la invención para presentar el epítope apropiado de células T. M5 Como la secuencia codificadora para los péptidos de la longitud contemplada en la presente, puede sintetizarse por medio de técnicas químicas» por ejemplo» el método de os otriéster de Matteucci y otros» J. Am. Chem. Soc. 103:3185 (1981), puede hacerse modificación simplemente substituyendo la base o bases apropiadas por aquéllas que codifican la secuencia del péptido natural. Puede proveerse entonces la secuencia codificadora con ligadores apropiados y ligarse en vectores de expresión disponibles comunmente en la técnica, y los vectores usarse para transformar huéspedes adecuados para producir la proteína de fusión deseada. Actualmente se tienen disponibles varios de estos vectores y sistemas de huésped adecuados. Para # 34 la expresión de las proteínas de fusión» la secuencia codificadora será provista con codones de iniciación y paro ligados operativamente» regiones de promotor y terminador y usualmente un sistema de replicación para proveer un vector de 5 expresión para la expresión en el huésped celular deseado. Por ejemplo» se proveen secuencias promotoras compatibles con los J^>_ huéspedes bacterianos en plásmidos que contienen sitios de restricción convenientes para la inserción de la secuencia codificadora deseada. Los vectores de expresión resultantes son transformados en huéspedes bacterianos adecuados. Desde luego» pueden usarse también huéspedes de levadura o células de mamífero» empleando vectores y secuencias de control adecuados. Los péptidos de la presente invención y las composiciones farmacéuticas y de vacuna de la invención son ¡?ß útiles para su administración a mamíferos» particularmente a » humanos» para tratar y/o prevenir infección viral y cáncer. Los ejemplos de enfermedades que pueden tratarse utilizando los péptidos inmunogénicos de la invención incluyen cáncer de próstata» hepatitis B» hepatitis C. SIDA. carcinoma renal. carcinoma cervical» li foma CMV y condilo a acuminado. Además, los péptidos pueden usarse para tratar cualquier número de enfermedades infecciosas, tales como infecciones virales, fúngicas y parasitarias. Se describen antígenos adecuados, por ejemplo, en WO 94/20127 y WO 94/03205. 25 Como se indicó antes los péptidos de la invención inducen respuestas inmunes de CTL cuando se ponen en contacto con un CTL específico para un epítope sobre el péptido. La manera en la cual el péptido hace contacto con el CTL no es crítico para la invención, no obstante. Por ejemplo, el péptido puede hacer contacto con el CTL ya sea in vivo o i vitro. Si el contacto ocurre in v vo, el péptido mismo puede ser administrado al paciente o pueden usarse otros vehículos (por ejemplo, vectores de ADN que codifican uno o más péptidos» vectores virales que codifican los péptidos, liposomas y similares), como se describe más adelante. Para compos ciones farmacéuticas» los péptidos inmunogénicos o ADN que los codifican, se administran a un individuo que ya sufre de cáncer o está infectado con el patógeno de interés. Los péptidos o el ADN que los codifican pueden adm nistrarse i dividualmente o como fusiones de una o más de las secuencias de péptido descritas en la presente. Pueden tratarse aquéllos en la fase de incubación o en la fase aguda de infección con los péptidos inmunogénicoe, separadamente o en conjunto con otros tratamientos, según sea apropiado. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones se administran a un paciente en una cantidad suficiente para evocar una respuesta efectiva de CTL contra el virus o antígeno de tumor y para curar o por lo menos impedir parcialmente los síntomas y/o compl caciones. Una cantidad adecuada para realizar esto, se define como "dosis terapéuticamente efectiva". Las cantidades efectivas para este uso dependerán por ejemplo, de la composición particular administrada, el modo de administración, la etapa y severidad de la enfermedad tratada, el peso y estado general de salud del paciente, y el juicio del médico que prescribe, pero generalmente varía para la inmunización inicial (esto es, para administración 5 terapéutica o pro iláctica) de aproximadamente 1.0 µg a aproxi adamente 5000 µg de péptido para un paciente de 70 kg, ^ _ seguido por dosificaciones de refuerzo de aproximadamente 1.0 µg a aproximadamente 1000 µg de péptido en cumplimiento con un régimen de refuerzo por semanas a meses, dependiendo de la respuesta y condición del paciente, midiendo la actividad específica de CTL en la sangre del paciente. Debe tenerse en cuenta que los péptidos y las composiciones de la presente invención pueden emplearse generalmente en estados patológicos serios, es decir, situaciones que ponen en peligro la vida, o s que potencialmente pueden poner en peligro la vida. En tales « casos» en vista de la reducción al mínimo de substancias extrañas y la naturaleza relativa no tóxica de los péptidos» es posible» y puede ser conveniente, que el médico tratante administre un exceso substancial de estas composiciones de péptido. Para uso terapéutico, la administración debe comenzar al primer síntoma de infección viral, o a la detección o remoción quirúrgica de tumores, o recién después del diagnóstico en el caso de infección aguda. Esto es seguido por dosis de refuerzo hasta que por lo menos los síntomas sean substancialmente abatidos, y durante ?n período posterior. En infección crónica» pueden requerirse dosis de carga seguidas por dosis de refuerzo. El tratamiento de un individuo infectado con las composiciones de la invención puede acelerar la resolución de la infección de individuos infectados agudamente. Para aquellos individuos susceptibles (o predispuestos) a desarrollar infección crónica» las composiciones son particularmente útiles en métodos de prevención de la evolución de la infección aguda a la crónica. Cuando los individuos susceptibles son identi cados antes o durante la infección» por ejemplo» como se describe en la presente» la composición puede ser dirigida a ellos» reduciendo al mínimo la necesidad de administración a una población más grande. El péptido u otras composiciones pueden usarse n también para tratamiento de infección crónica y para estimular • el sistema inmune para eliminar células infectadas con patógeno en portadores. Es importante proveer una cantidad de péptido nmunopotenciador en una formulación y modo de administración que sea suficiente para estimular efecti amente una respuesta citotóxica de células T. De esta manera» para el tratamiento de infección crónica, una dosis representat a está en la escala de aproxi adamente 1.0 µg a apro i adamente 5000 µg, de preferencia aproximadamente 5 µg a lOOO µg, para un paciente de 70 kg por dosis. Puede requerirse dosis inmunizantes seguidas por dosis de refuerzo a intervalos establecidos» por ejemplo de l a 4 semanas» posiblemente durante un período prolongado para inmunizar e ectivamente a ?n individuo. En el caso de infección crónica» la administración debe continuar hasta que por lo menos los síntomas clínicos o las pruebas de laboratorio indiquen que ha sido el minada, o substanc al ente abatida, la infección viral y durante un período posterior. Las composiciones farmacéuticas para tratamiento terapéutico están destinadas para administración parenteral» tópica» oral o local. De preferencia» las composiciones farmacéuticas se administran parenteral ente» por ejemplo, 0 intravenosamente» subcutáneamente» i tradérmicamente o intramuscularmente. De esta manera» la invención provee composiciones para admi istración parenteral que comprenden una solución de los péptidos munogénicos di sueltos o suspendidos en un vehículo aceptable» de preferencia un vehículo acuoso. Puede usarse una variedad de vehículos acuosos» por ejemplo» * agua» agua amortiguada» solución salina al 0.8%. solución de glicina al 0.3%, ácido hialurónico y similares. Estas composiciones pueden ser ester lizadas por medio de técnicas de esterilización convencionales bien conocidas, o pueden 0 filtrarse de manera estéril. Las soluciones acuosas resultantes pueden empacarse para usarse como tales o 1 iof i 1 izarse» siendo combinada la preparación liofilizada con una solución estéril antes de su administración. Las composiciones pueden contener substancias auxiliares armacéuticamente aceptables» según sea 5 requerido» para aproximarse a las condiciones fisiológicas» tales como agentes ajustadores y amortiguadores de pH» agentes ajustadores de tonicidad» agentes humectantes y similares» por ejemplo» acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio» cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina, etc. La concentración de péptidos estimuladores de CTL de la invención en las composiciones farmacéuticas puede variar ampliamente, es decir, de menos de aproxi adamente 0.1%, usualmente a, o por lo menos apro adamente 2%, hasta 20 a 50% o más en peso» y serán seleccionadas principalmente por los volúmenes de fluido» viscosidades» etc.» de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado. Los péptidos de la invención pueden ser administrados también mediante liposomas, que sirven para dirigir los péptidos a un tejido particular» tal como tejido linfoíde, o dirigirlos selecti amente a las células infectadas» así como también aumentan la vida media de la composición del péptido. Los liposomas incluyen emulsiones, espumas, micelas, monocapas insolubles» cristales líquidos» dispersiones de fosfolípido» capas laminares y similares. En estas preparaciones» el péptido a liberar es incorporado como parte de un liposoma» solo o en conjunto con una molécula que se une por ejemplo a un receptor prevaleciente entre células linfoides» tales como anticuerpos monoclonales que se unen al antígeno CD45 o con otras composiciones terapéuticas o i munogénicas. De esta manera» los liposomas llenos o decorados con un péptido deseado de la invención» pueden ser dirigidos al sitio de las células linfoides» en donde los liposo as liberan entonces las composiciones seleccionadas de péptido terapéutico/i nmunogénico. Los liposomas para utilizarse en la invención se forman de lípidos normales formadores de vesícula» que incluyen generalmente fosfolípidos neutros y cargados negativamente» y un esterol tal como colesterol. La selección de lípidos es guiada generalmente por la consideración de, por ejemplo, el tamaño del liposoma, la sensibilidad al ácido y la estabilidad de los liposomas en la corriente sanguínea. Se tienen una variedad de métodos para preparar liposomas, como se describe por ejemplo en Szoka y otros, An. Rev. Biophys, Bioeng. 9:467 (1989), patentes de los E.U.A. Nos. 4,235,871, 4,501,728, 4,837,028, y 5,019,369, incorporadas en la presente como referencia. Para dirigirlo a las células inmunes, un ligando por incorporar en el liposoma puede incluir, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de los mismos, específicos para determinantes de la superficie celular de las células del sistema inmune deseado. Puede administrarse una suspensión de liposoma que contiene ?n péptido ntravenosamente, localmente, tópicamente, etc.» en una dosis que varía de acuerdo a» entre otras cosas» la manera de administración, el péptido por liberar y la etapa de enfermedad por tratar. Para composiciones sólidas» pueden usarse vehículos sólidos no tóxicos convencionales que incluyen» por ejemplo» grados farmacéuticos de manitol» lactosa» almidón» estearato de magnesio» sacarina de sodio» talco» celulosa» glucosa» sacarosa» carbonato de magnesio y similares. Para administrac ón oral» una composición no tóxica farmacéuticamente aceptable se forma incorporando cualquiera de los excipientes empleados normalmente» tales co o los vehículos enlistados anteriormente» y por lo general 10 a 95% del ingrediente activo» esto es» uno o más péptidos de la invención» y muy preferiblemente en una concentración de 25 a 75%. Para administración en aerosol» los péptidos inmunogénicos se surten preferiblemente en forma finamente dividida junto con un agente tensioactivo y propulsor. Los porcentajes típicos de los péptidos son 0.01% — 20% en peso, de preferencia 1% - 10%. Por supuesto» el agente tensioactivo debe ser no tóxico y de preferencia soluble en el propulsor. Representativos de tales agentes son los esteres o esteres parciales de ácidos grasos que contienen de 6 a 22 átomos de carbono, tales como ácidos caproico» octanoico» láurico» palmítico» esteárico» linoleico, linolénico, olestérico y oleico con un alcohol polihídrico alifático o su anhídrido cíclico. Pueden emplearse esteres mixtos tales como glicéridos mixtos o naturales. El agente tensioactivo puede constituir 0.1% — 20% en peso de la composición, de preferencia 0.25 — 5%. El resto de la composición es, ordinariamente, propulsor. Puede incluirse también un vehículo según se desee como con, por ejemplo» lecitina para liberación intranasal.

En otro aspecto, la presente invención está dirigida a vacunas que contienen como ingrediente activo una cantidad inmunológicamente efectiva de uno o más péptidos inmunogén cos como se describen en la presente. El péptido o péptidos pueden ser introducidos en un huésped» incluyendo humanos, ligarse a su propio vehículo o como un homopolímero o heteropolímero de unidades de péptido activo. Dicho polímero tiene la ventaja de reacción inmunológica incrementada y» cuando se usan diferentes péptidos para hacer el polímero» la capacidad adicional de inducir anticuerpos y/o CTL que reaccionan con diferentes determinantes antigénicos de los virus o las células de tumor. Los vehículos útiles son bien conocidos en la técnica e incluyen» por ejemplo» tiroglobulina» albúminas tales como seroalbúmina humana» toxoide del tétanos, pol ia inoácidos tales como pol ( 1 isina: ácido glutámico), proteína de núcleo de los virus de influenza, hepatitis B, vacuna recombinante del virus de la hepatitis B y similares. Las vacunas pueden contener también un diluyente fisiológicamente tolerable (aceptable) tal como agua, solución salina amortiguada de fosfato, o solución salina» y típicamente incluyen además un adyuvante. Son bien conocidos en la técnica materiales adyuvantes tales como adyuvante incompleto de Freund» fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio o alumbre. Y, como se mencionó anteriormente» las respuestas de CTL pueden ser preparadas conjugando péptidos de la invención con lípidos, tales como P3CSS . Después de inmunización con una composición de péptido como se describe en la presente» mediante inyección» aerosol, administración oral» transdérmica u otra vía» el sistema inmune del huésped responde a la vacuna produciendo grandes cantidades de CTL específicos para el antígeno deseado, y el huésped se hace por lo menos parcialmente inmune a infección posterior, o resistente para desarrollar infección crónica. Las composiciones de vacuna que contienen los péptidos de la invención se administran a un paciente susceptible o en riesgo de infección viral o cáncer para evocar una respuesta inmune contra el antígeno y así incrementar las capacidades de respuesta inmune del propio paciente. Dicha cantidad está definida como una "dosis i n unogéni camente efectiva". En este uso, las cantidades precisas nuevamente dependen del estado de salud y peso del paciente, del modo de administración» la naturaleza de la formulación» etc.» pero por lo general varían de apro madamente 1.0 µg a aproximadamente 5000 µg por paciente de 70 kg» más comúnmente de aproxi adamente ÍO µg a aproxi adamente 500 µg mg por 70 kg de peso corporal . En algunos casos, puede ser conveniente combinar las vacunas de péptido de la invención con vacunas que induzcan respuestas de anticuerpo neutralizante para el virus de interés, particularmente para antígenos de envoltura virales. Para propósitos terapéuticos o de inmun zación, los péptidos de la invención pueden expresarse también por medio de huéspedes virales atenuados, tales como vaccinia o epitelioma contagioso. Este enfoque implica el uso de virus de vacuna como un vector para expresar secuencias de nucleótido que codifican los péptidos de la invención. Después de la introducción en un huésped infectado agudamente o crónicamente o en un huésped infectado, el virus de vacuna reco binante expresa el péptido inmunogénico, y con ello evoca una respuesta de CTL en el huésped. Los vectores de vacuna y los métodos útiles en los protocolos de inmunización se describen por ejemplo en la Patente de los E.U.A. No. 4,722,848, incorporada en la presente como referencia. Otro vector es BCB (Bacilo Calmette Guerin) . Se describen vectores de BCG en Stover y otros (Nature 351:456— 460 (1991)) que se incorpora en la presente como referencia. Serán evidentes para el experto en la materia una amplia variedad de otros vectores útiles para la administración terapéutica o inmunización de los péptidos de la invención, por ejemplo, vectores de Salmonella Typhi y similares, a partir de la descripción presente. Pueden usarse péptidos antigé 'cos para evocar también CTL ex vivo. El CTL resultante puede usarse para tratar infecciones crónicas (virales o bacterianas) o tumores en pacientes que no responden a otras formas convencionales de terapia» o no responderán a un enfoque de terapia con vacuna de péptido. Las respuestas de CTL ex vivo a un patógeno particular (agente infeccioso o antígeno de tumor) son inducidas incubando en cultivo de tejidos las células precursoras de CTL del paciente (CTL ) junto con una fuente de células presentadoras de antígeno (APC) y el péptido inmunogénico apropiado. Después de un tiempo de incubación apropiado (típicamente una a cuatro semanas), en el cual las CTL,.. se activan y maduran y se expanden en CTL efectoras» las células son infundi as de regreso hacia el paciente, en donde destruirán su célula blanco específica (una célula infectada o una célula de tumor). El ADN que codifica uno o más de los péptidos de la invención puede ser administrado también al paciente. Este enfoque se describe por ejemplo en Wolff y otros, Science 247: 1465-1468 (1990), así co o las patentes de los E.U.A. Nos. 5,580,859 y 5,589,466. Un medio preferido de administrar ácidos nucleicos que codifican los péptidos de la invención, utiliza construcciones de minigen que codifican epítopes múltiples de la invención. Para crear una secuencia de ADN que codifica los epítopes de CTL seleccionados (minigen) para la expresión en células humanas, las secuencias de aminoácidos de los epítopes son traducidas inversamente. Se usa una tabla de uso de codón humano para guiar la elección de codón para cada aminoácido. Estas secuencias de ADN que codifican el epítope son asociadas directamente» creando una secuencia continua de polipéptido.

Para optimizar la expresión y/o inmunogenic dad, pueden incorporarse elementos adicionales en el diseño del minigen.

Ejemplos de secuencias de aminoácidos que podrían ser traducidas inversamente e incluidas en la secuencia del minigen incluyen: epítopes de linfocitos T auxiliares, una secuencia guía (señal), y una señal de retención en retículo endoplásmico. Además» la presentación de epítopes de CTL a MHC puede ser mejorada incluyendo secuencias flanqueadoras de origen natural o sintético (por ejemplo polialanina) adyacentes a los epítopes de CTL. La secuencia de minigen es convertida a ADN ensamblando polinucleótidos que codifican las cadenas más y menos del minigen. Se sintetizan» fosforilan» purifican y fijan bajo las condiciones apropiadas, ol igonucléotidos de traslape (30 a 100 bases de largo) usando técnicas bien conocidas. Los extremos de los ol gonucléotidos se unen usando ADN ligasa T4. Este minigen sintético, que codifica el polipéptido de epítope de CTL» puede ser clonado después en un vector de expresión deseado. Secuencias reguladoras estándar bien conocidas para el experto en la materia están incluidas en el vector para asegurar la expresión en las células blanco. Se requieren varios elementos de vector: un promotor con un sitio de clonación hacia el extremo 3" para inserción del minigen; una señal de pol iadel inación para terminación de transcripción eficiente; un origen de replicación de E. col i ; y un marcador seleccionable de E . col i (por ejemplo, resistencia a ampicilina o kanamicina). Para este propósito» pueden usarse varios promotores» por ejemplo» el promotor de citomegalovirus humano (hCMV). Véase» las patentes de los Estados Unidos Nos. 5»580» 859 y 5»589»466 para otras secuencias de promotor adecuadas. Pueden ser convenientes modificaciones adicionales de vector para optimizar la expresión del minigen y su inmunogenicidad. En algunos casos se requieren intrones para expresión eficiente del gen» y pueden incorporarse uno o más intrones de origen natural o sintético en la región transcrita del minigen. Puede considerarse también la inclusión de secuencias de estabilización de ARNm para aumentar la expresión del mi ni gen. Se ha propuesto recientemente que las secuencias unoesti uí adoras (ISSs o CpGs) desempeñan una función en la in unogen c dad de vacunas de ADN. Pueden incluirse estas secuencias en el vector» fuera de la secuencia modificadora del minigen» si se encuentra que incrementa la inmunogenici ad. En algunas modalidades, puede usarse un vector de ^s expresión bicistrónico, para permitir la producción de los epítopes codificados por el minigen y una segunda proteína incluida para incrementar o reducir la inmunogenicidad. Los ejemplos de proteínas o polipéptidos que pueden incrementar benéficamente la respuesta inmune si son coexpresadas» incluyen cítocinas (v.gr.» IL-2» IL12» GM-CSF)» moléculas inductoras de citocinas (v.gr.» LelF) o moléculas coestimuladoras. Los epítopes de auxiliares (HTL) pueden unirse a señales de dirección intracelular y expresarse separadamente de los epítopes de CTL. Esto podría permitir la dirección de los epítopes de HTL hacia un compartimiento celular diferente al de los epítopes de CTL. Si se requiere, esto podría facilitar la entrada más eficiente de epítopes de HTL en la ruta de MHC clase II, mejorando con ello la inducción de CTL. En contraste con la inducción de CTL, en ciertas enfermedades p?ede ser benéfico reducir específicamente la respuesta inmune mediante coexpresión de moléculas inmunosupresoras (v.gr. TGF—ß) . Una vez seleccionado el vector de expresión, el minigen es clonado en la región pol adaptadora hacia el extremo 3" del promotor. Este plásmido es transformado en una cepa apropiada de E. col i , y se prepara ADN utilizando técnicas estándar. La orientación y la secuencia de ADN del minigen, así como de todos los elementos incluidos en el vector, son confirmadas utilizando mapeo de restricción y análisis de secuencia de ADN. Pueden almacenarse células bacterianas que hospedan en plásmido correcto como un banco maestro de células y ?n banco de células de trabajo. Se producen cantidades terapéuticas de ADN plasmídico mediante fermentación en E . col i , seguido por purificación. Se utilizan alícuotas del banco de células de trabajo para inocular el medio de fermentación (tal como el caldo Terr?fic) y desarrollarlas hasta la saturación en matraces agitados o un biorreactor de acuerdo con técnicas bien conocidas. Puede purificarse el ADN plasmídico utilizando tecnologías estándar de bioseparación, tales como las resinas de intercambio aniónico en fase sólida provistas por Qui agen. Si se requiere» puede aislarse ADN super—enrol lado de las formas circular abierta y lineal utilizando electrofóresis en gel u otros métodos . Puede preparase ADN plasm dico purificado para inyección» utilizando una variedad de formulaciones. La más simple de estas es la reconstitución de ADN liofilizado en solución salina amortiguada con fosfato (PBS). Este enfoque» conocido como "ADN descubierto" se usa actualmente para administración intramuscular (IM) en pruebas clínicas. Para aumentar al máximo los efectos in ?noterapéuticos de las vacunas de ADN de minigen. puede ser conveniente un método alternativo para formular ADN plasmídico purificado. Se han descrito una variedad de métodos» y se han hecho disponibles técnicas nuevas. Pueden usarse también lípidos catiónicos en la formulación (véase» por ejemplo» como se describe en Debs y Zhu (1993) WO 93/24640; Mann oy Gould-Fogeri te (1988) BioTechniques 6(7): 682-691; Rose, Patente de E.U.A. No. 5,279,833» Brigham (1991) WO 91/06309; y Felger y otros (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 84:7413—7414). Además» también se pueden formar complejos con gl colípidos» liposomas fusogém'cos» péptidos y compuestos referidos colectivamente como protectores» interactivos, no condensantes (PINO, con el ADN plasmídico purificado para afectar las variables tales como estabil dad» dispersión intramuscular» o tráfico hacia órganos o tipos celulares específicos. Los ácidos nucleicos pueden administrarse también utilizando liberación balística como se describe por ejemplo en la Patente de los Estados Unidos No. 5» 204» 253. Pueden administrarse partículas comprendidas únicamente de ADN. Alternat vamente» el ADN puede ser adherido a partículas, tales como partículas de oro. Puede usarse sens bil zac ón de células objetivo como una prueba funcional para expresión y presentación de los epítopes de CTL codificados por el minigen para MHC clase I. El ADN plasmídico es introducido en una línea celular de mamífero que es adecuada como el blanco para pruebas estándar de liberación de cromo de CTL. El método de transfección usado dependerá de la formulación final. Puede utilizarse electroporación para ADN "descubierto", mientras que los lípidos catiónicos permiten la transfección directa n v tro. Puede co—transfectarse un plásmido que expresa proteína fluorescente verde (GFP) para permitir el enriquecimiento de células transfectadas utilizando clasificación de células activadas con luorescencia (FACS). Estas células son marcadas después con cromo 51 y usadas como células objetivo para líneas de CTL específicas de epítope. La citólisis, detectada mediante liberación de 51Cr, indica la producción de presentación de MHC de epítopes de CTL codificados por el minigen. La inmunogenicidad jn vi o es un segundo enfoque para la prueba funcional de formulaciones de ADN del minigen. Ratones transgénicos que expresan moléculas apropiadas de MHC humano son inmunizados con el producto de ADN. La dosis y la vía de administración dependen de la formulación (por ejemplo IM para ADN en PBS» IP para ADN en complejo con lípido).

Veintiún días después de la inmunización. se recolectan esplenocitos y se reesti ?lan durante una semana en presencia de péptidos que codifican cada epítope por probar. Estas células efectoras (CTL) son analizadas para determinar la citólisis de las células objetivo marcadas con cromo 51» cargadas con el péptido» utilizando técnicas estándar. La lisis de las células blanco sensibilizadas por MHC que cargan los péptidos correspondientes a los epítopes codificados por el mi ni gen» demuestra que la vacuna de ADN funciona para inducción de CTL ±r\ v o. Los péptidos de la invención pueden usarse también co o reactivos de diagnóstico. Por ejemplo» un péptido de la invención puede usarse para determinar la susceptibil dad de un individuo particular a un régimen de tratamiento que emplea el ^f.S péptido o péptidos relacionados, y así puede ser que ayude a modificar un protocolo de tratamiento existente o para determinar un pronóstico para un individuo afectado. Además, los péptidos pueden usarse también para predecir qué individuos estarán en riesgo substancial de desarrollar infección crónica.

Se ofrecen los siguientes ejemplos a manera de ilustración» y no a manera de limitación.

EJEMPLO 1 Unión de Supertipo Similar a A3 25 Este ejemplo provee motivos re i idos para cada uno • 52 de los alelos tipo A3, A3» All» A*3101» A*3301 , y A.-6S01. delineando especi icidades de unión de sujetador secundario. Los motivos fueron derivados calculando en cada posición no sujetadora a lo largo de la secuencia de péptido» la capacidad de unión relativa promedio de los péptidos que llevan cada uno de los veinte aminoácidos comunes» agrupados de acuerdo con sus similitudes químicas individuales.

Materiales y Métodos O Purificación de clase I. Se utilizaron las siguientes líneas celulares homocigóticas transformadas con el virus Epstein-Barr (EBV)» como fuentes de moléculas clase i: GM3107 (A3» B7» Human Genetic Mutant Repository); BVR (All, B35.3, Cw4» Human Genetic Mutant Repository); SPACH (A31» B62, Cwl/3; s ASHI Repository Collection); y LWAGS (A*3301» B14. Cw8, ASHI Repository Collection) (Bodmer y otros» Hum Immunol 43:149 (1995)). Se usó un transfectante C1R caracterizado por el Dr. Walter Storkus (University of Pittsburgh), para el aislamiento de A..6801. Las líneas celulares se mantuvieron como se 0 describió anteriormente (Sidney y otros, J. I munol 154:247 (1995); Sette y otros, Mol Immunol 31:813 (1994)). Se prepararon lisados de células y moléculas clase I purificadas como se describió anteriormente (Sidney y otros, J. Im unol 154:247 (1995); Sette y otros, Mol Im unol 31:813 5 (1994)). Brevemente, las células se usaron a una concentración de 10a células/ml en Tris-HCl 50 M, pH 8.5, conteniendo NP-40 • 53 al 1% (Fluka Biochernika, Buschs» Suiza), NaCl 150 M» EDTA 5mM» y PMSF 2 mM. Los lisados se pasaron a través de filtros de O.45 mieras y se clarificaron de núcleos y desechos mediante centrifugac ón a 10,000 x g durante 20 minutos. Después, se purificaron las moléculas del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) por medio de cromatografía de afinidad. Se usaron como precolumnas columnas de Sepharose CL4B inactivada y Sepharose de Proteína A. El lisado de células se agotó en moléculas HLA—B y HLA-C mediante pasadas repetidas sobre 10 cuentas de Sepharose de Proteína A conjugadas con el anticuerpo Bl.23.2 contra HLA(B.C) (Rebai y otros» Tissue Antigens 22:107 (1983)). Para la supresión efectiva se requirieron típicamente de dos a cuatro pasadas. Subsecuentemente» se usó el anticuerpo W6/32 contra HLA(A»B) (Barnstable y otros» Cell 14:9 (1987)) para capturar moléculas de HLA—A. Los pasos de purificación de proteína» concentración y efectividad de supresión» fueron seguidos por medio de electrofóresis en gel de poliacrilamida y dodeci Isulfato de sodio (SDS-PAGE).

Pruebas de unión y definición del supermotivo. Se desarrollaron pruebas cuantitativas para la unión de péptidos para las moléculas clase I solubles» en base a la inhibición de unión de un péptido sonda estándar radiomarcado para moléculas de MHC solubilizadas con detergente» según se describió anteriormente (Kubo, y otros, J. I munol 152:3913 (1994); Kast, y otros, J. Im unol 152:3904 (1994); (Sidney, y otros» J. • 54 Immunol 154:247 Sette, y otros, Mol Immunol 31:813 (1994)); Ruppert, y otros, Cell 74:924 (1993)). Brevemente, 1—ÍO M de péptido de sonda radiomarcado, yodado por medio del método de claramina T (Greenwood, y otros, Biochem J 89:114 (1963)), fue incubado conjuntamente a temperatura ambiente con varias cantidades de MHC en presencia de ß,-»—microglobul ina humana» 1 micromolar (Scripps Laboratories» San Diego, California. E.U.A.) y una combinación de inhibidores de proteasa. Al final de un período de incubación de 2 días. se determinó el 0 porcentaje de radioactividad unida a MHC mediante cromatografía de filtración en gel de exclusión de tamaño sobre una columna TSK 20OO. El péptido A3C0N1 (secuencia KVFPYALINK) (Kubo, y otros, J. Immunol 152:3913 (1994)) se utilizó como la sonda 5 rad omarcada para las pruebas de A3» All» A31, y Ax-6801. Se usó un análogo T Y de HBVc 141-151 (secuencia STLPETYVVRR) (Missale, y otros, J Exp Med 177:751 (1993)) como la radiosonda marcada para la prueba de A*3301. En el caso de pruebas competi ivas» se calculó la concentración de péptido que 0 produce 50% de inhibición de la unión del péptido sonda de radiomarcado (CI50). Los péptidos se probaron usualmente a una o dos dosis altas» y se determinó la CI50 de los péptidos que dieron inhibición positiva en experimentos subsecuentes» en los cuales se probaron dos a seis diluciones adicionales, según fue 5 necesario. Las concentraciones de MHC que produjeron aproximadamente 15% de unión del péptido sonda radiomarcado, se utilizaron para todas las pruebas de inhibición competitiva. Debido a q?e bajo estas condiciones (marca) < (MHC) y CI50 > (MHC)» las CI50 medidas son aproximaciones razonables de los valores reales de kD. Cada péptido competidor fue probado en dos a cuatro experimentos completamente independientes. Como un control positivo» se probó en cada experimento la versión no marcada de la sonda radíomarcada relevante y se midió su CISO. El promedio de CI50 de A3C0N1 para las pruebas de A3, All, A31, y AXGSOl, fue de 11, S, 18, y B nM, respect vamente. La CI50 promedio del péptido HBVc 141—151 en la prueba A.-3301, fue de 29 nM.

Definición de motivos de sujetador secundario específicos de HLA-A. Se utilizó una modificación del procedimiento usado por Rupper y otros (R?pper, y otros, Cell 74:929 (1993)) para definir los motivos de sujetador secundario A..0201. Brevemente, se definieron motivos de sujetadores secundarios específicos de alelo determinando el efecto sobre la unión de HLA de los veinte aminoácidos que ocurren comunmente en cada posición no sujetadora de secuencias de nueve residuos. Las determinaciones se hicieron calculando los valores de unión relativos promedio para cada combinación posición-aminoácido (por ejemplo, posición 1» alanina; posición 2» alanina» etc). Para solucionar los problemas con la baja ocurrencia de ciertos aminoácidos, se agruparon ciertos residuos con otros de naturaleza similar, como se describió • 56 anteriormente (Rupper, y otros, Cell 74:929 (1993)). Los tipos de residuo asociados en una posición particular con capacidades de unión promedio cuatro veces superior (o inferior) que la capacidad de unión promedio global de todo el grupo de doscientos péptidos, se consideraron asociados con capacidad de unión buena (o deficiente).

Síntesis de péptido. Los péptidos se sintetizaron ya sea como se describió anteriormente (Rupper» y otros. Cell 74:929 (1993))» o se compraron como material crudo de Chiron Mimotopes (Chiron Corp., Australia). Los péptidos sintentizados se purificaron hasta > 95% de homogeneidad por medio de cromatografía de líquidos de alta presión de fase inversa (HPLC). Se determinó la pureza de estos péptidos sintéticos en fgS una columna analítica de fase inversa y su composición se determinó mediante análisis, secuenciación. y/o análisis de espectrometría de masas de los aminoácidos.

Calculo de las frecuencias fenotípicas de supertipos 20 de HLA en varias raíces étnicas y cobertura proyectada de pobl ación. Se calcularon frecuencias de gen para cada alelo de HLA a partir de frecuencias de antígeno o alelo (Imanishi, y otros, Proceedings of the Eleventh International Histocompatibi 1 ity Workshop and Conference, Vol. 1, Tokio, 25 Oxford University Press (1992); Fernandez—Vi a , y otros, Hum Im unol 33:163 (1992)) utilizando fórmulas de distribución binomial, gf = 1 - (RC(l-af)) (Tiwa y otros 33:163 (1992)) (T wari y otros, The HLA complex» en: HLA and Disease Associates» NY. Spr nger-Verlag (1985)). Para obtener frecuencias fenotípicas globales se calcularon frecuencias de gen acumulativas y las frecuencias de antígeno acumulativas se derivaron mediante el uso de la fórmula inversa (af = 1—(1— Cgf)z). Como se discute. cuando no se tuvieron datos de frecuencia a nivel de tipificación de ADN» se asumió correspondencia a las frecuencias de antígeno definidas serológicamente. Para obtener cobertura de población total» no se asumió desequilib io de ligamiento y solo se incluyeron los alelos que se confirmaron como pertenec entes a cada uno de los supertipos (estimaciones mínimas). Se hicieron estimaciones de la cobertura potencial total lograda por combinaciones entre locus» añadiendo a la cobertura A la proporción de población no cubierta de A que pudiera esperarse que estuviera cubierta por los alelos B considerados» (por ejemplo» total = A + B**(l — A)). Los miembros confirmados del supertipo de la línea A3 son A3» All, A31» y A S801. Aunque el supertipo similar a A3 puede incluir potencialmente A32, A66, y A*7401» estos alelos no fueron incluidos en los cálculos de frecuencia global. Así mismo, se confirmaron los miembros de la familia de supertipo Similar a A2, A*0201, A*0202» A*0203, A*0204, A*0205 » A*0206» A*6S02» y A..6901 (potencialmente también A*3001) . Finalmente» los alelos confirmados del supertipo similar a B7 son B7.

B*35Ql-03» B51, B*5301 , B*5401 , B 5501-2 , B*5S01 , B*6701 , y B*7B01 (también potenc almente B*1401* BX3504-06, B*4201, y B..5602) .

Resultados Análisis estructural de las cavidades de unión de péptidos de varios alelos de HLA. Como se mencionó anter ormente, los estudios anteriores han indicado que las moléculas de HLA A3, All y A-*GB01 , están asociadas con la especi icidad para los ligandos que llevan residuos pequeños o hidrofóbicos en la posición 2» y extremos C- cargados posit vamente (Kubo, y otros, J. I unol 152:3913 (1994); G?o y otros» Nature 360:364 (1994); Falk y otros» Intmunogenet.es 40:238 (1994); Dibrino y otros. J. Immunol 151:5930 (1993); DiBrino y otros» Proc Nati Acad Sci USA 90:1508 (1993); Zhang y otros» Proc Nati Acad Sic USA 90:2217 (1993); Settle y otros» Mol Immunol 31:813 (1994). Los autores de la presente decidieron evaluar la posible base estructural de estas similitudes aparentes en especif cidad de ligando en mayor detalle. Para este fin» como se sabe que las cadenas laterales del residuo en la posición 2 y en extremo C de los péptidos antigénicos hacen contacto con los residuos que forman las cavidades B y F de las moléculas HLA clase I (Madden. y otros» Cell 75:693 (1993); Saper, y otros, J Mol Biol 219:277 (1991)), los residuos que forman estas cavidades pol órficas fueron tabulados para varias moléculas de HLA clase I. Se encontró que los tipos de HLA que se sabe reconocen residuos pequeños o hidrofóbicos en la posición 2 (vgr. A**0101, A**0201, A**O301 , A**1101» A**6801» y A**6802) y los tipos de HLA que reconocen residuos cargados posit vamente en el extremo C (vgr.» A**0301 A**1101» A**6801 y B**2705 ) de sus ligandos de péptido» comparten ciertas características estructurales clave. En particular» las moléculas de HLA que se unen a residuos pequeños e hidrofóbicos en la posición 2 llevan residuos alifáticos (M o V) en las posiciones 45 y 65» y residuos potenciales formadores de enlaces de hidrógeno tales como N y K» o H y Q en las posiciones 66 y 70» respectivamente. Todas estas moléculas también llevan un residuo Y en la posición 99. En contraste, las moléculas clase 1 que exhibieron diferentes especificidades de unión difieren en una o más de estas posiciones. De manera similar» solo las moléculas clase I que prefieren extremos C cargados positi amente llevan D» T, L y D en las posiciones 77, BO, Bl y 116, respectivamente. En conclusión» este análisis sugirió que un grupo de moléculas de HLA clase I (A3. All y A**S801) comparten ciertas características estructurales clave en sus cavidades B y F» y un motivo de ligando de péptido común caracterizado por residuos pequeños o hidrofóbicos en la posición 2» y residuos cargados pos t amente en el extremo C. En este punto» los autores de la presente designaron tentati amente estas moléculas de HLA clase I como parte de un supertipo similar A3, y el motivo correspondiente como el supermotivo tipo A3. Los análisis de otras moléculas clase I para las cuales se desconocen los motivos, revelo que A**3101, A**3301, A**3401, A**6601, y A**7401 también comparten estas mismas secuencias de consenso en sus cavidades B y F. De esta manera, se predijo que estas moléculas son parte del supertipo similar a A3. Datos recientes (Falk, y otros» Immunogenetic 4?:Z3B (1994) han demostrado independ entemente que A32 y A33 están realmente caracterizados por un motivo de péptido tipo A3.

Moléculas tipo A3 que exhiben especif c dades de sujetador primario de traslape y repertorios de unión de péptido. Para comparar la escala de motivos reconocidos por algunas de las moléculas tipo A3 más frecuentes (A3» All» A31» A**3301» Y A**680D» se realizó un anál sis molecular más detallado de las especifidades de unión del sujetador principal (posición 2 y extremo C) de estas moléculas. Se han descrito anteriormente pruebas de unión a péptido específicas de A3 y All que miden la capacidad de péptidos sintéticos no marcados para inhibir la unión de un pép o sonda radiomarcado para moléculas de HLA clase I purificadas por afinidad (Kubo» y otros» J Immunol 152:3913 (1994); Kast, y otros. J I munol 152:3904 (1994); Sette, y otros , Mol Im unol 31:813 (1994)). Se desarrollaron pruebas de unión específicas para A31, A**3301 y A**6B01» utilizando enfoques similares ((Kubo» y otros» J Immunol 152:3913 (1994); Kast» y otros» J Immunol 152:3904 (1994); del G?ercio, y otros, J Immnunol 154:685 (1995); Sidney» y otros» J Im unol 154:247 (1995); Sette» y otros» Mol Immunol 31:813 (1994); Ruppert , y otros, Cell 74:929 (1993)). Se exploraron subsecuentemente especificidades de sujetador primario de la moléculas tipo A3 analizando un panel de péptidos que llevan susbst tuciones en la posición 2 o 9 de un péptido poli-A prototipo AXAAAAAAX, para determinar su capacidad inhibidora de A3, All, A31 , A**3301» y A-6801. Cada molécula expresó preferencias i div duales» pero en la mayoría de los casos considerados» se obtuvo unión signif cat a cuando la posición 2 fue ocupada por A» I» L. M» S» T» o V» y el extremo C era ya sea R o K. Estos datos están de acuerdo con los datos de colección secuencias generada por los autores de la presente (Kubo» y otros» J Immunol 152:3913 (1994) y otros (Falk» y otros, Im unogenet cs 40:238 (1994) D?brino, y otros, J Im unol 151:5930 (1993) DiBrino, y otros Proc Nati Acad Sci USA 9?:i508 (1993), y también extiende, en los casos de A31, A**3301 y A**6801» la definición de los moti os sujetadores primarios. En conclusión, estos datos sugieren que el supermotivo sujetador primario tipo A3 puede ser definido como A, I, L» M, S» T o V en la posición 2» y ya sea R o K en el extremo C.

Moléculas tipo A3 q?e comparten repertorios de unión de péptido de traslape. Se examinó después la magnitud a la cual el motivo sujetador primario del supertipo semejante a A3 permite degenerar la unión entre las moléculas de supertipo similar a A3. Se ensambló un grupo de 200 secuencias de péptido de origen natural de 9 residuos que llevan los residuos A» I» L» S» T o V en la posición 2 y K o R e la posición 9. A parte de la restricción de que cada combinación posible de sujetador esté representada en proporción a la frecuencia natural de los aminoácidos individuales» los péptidos que comprenden el grupo fueron seleccionados aleatoriamente de secuencias de antígenos virales y de tumor. Cuando se probó cada péptido para determinar su capacidad para unirse a moléculas de A3» All» A31» A**3301 y A**S801 purificadas» fue evidente que un patrón de unión único estaba asociado con cada tipo alélico (datos no mostrados). Por ejemplo» algunos péptidos fueron más bien selectivos» uniendo solo un tipo de clase I» mientras que otros ciertos péptidos reaccionaron cruzadamente, más bien que de manera extensa, uniendo cuatro o cinco de las moléculas probadas. Se encontró que» en general» aproximadamente 10% (5% — 16%) de las combinaciones de péptido—HLA estuvieron asociadas con buena unión (CI50 = 50 nM)» y aproximadamente 17% (11%-24%). con unión intermedia (CI50 50-500 nM) para cualquier alelo dado. Estas frecuencias de unión alta e intermedia son similares a las indicadas anteriormente para péptidos que contienen motivo de secuencias de colección A**0201 (Ruppert» y otros» Cell 74:929 (1993)). Más notablemente, sin embargo» fue el grado relat vamente alto de reactividad cruzada observada. De los 127 péptidos que fueron capaces de unirse a por lo menos una molécula tipo A3» 43 de ellas (34%) se unieron a 3 o más de las moléculas de supertipo sim lar a A3. Cuatro péptidos se unieron a las cinco moléculas tipo A3 probadas. Por comparación» en un grupo de 39 péptidos que fueron probados para su unión a cinco moléculas clase I no relacionadas (A**0101, A3, A24, y B7), solamente tres (8%) se unieron a dos moléculas y ninguna se unió a tres o más moléculas. En el cuadro 2 se enlistan los péptidos identi cados como enlazadores altos o intermedios para al menos cuatro de las cinco moléculas tipo A3 probadas. En el cuadro, las capacidades 10 de unión buenas o intermedias están definidas como CI50 = 500 mM, y están resaltadas por medio de sombreado. Tomados en conjunto, estos datos demuestran traslape signif cati o en los repertorios de unión de las moléculas s?pertipo similar a A3, y validan el motivo sujetador primario de sujetador primario de * supertipo similar a A3.

El supermotivo tipo A3 define residuos sujetadores secundarios que confieren degeneración a los potenciales ligandos de pépt do. Como se indicó anteriormente» aunque el traslape en los repertorios de unión de moléculas supertipo similar a A3 es signi icativo, también dista mucho de ser completo; cada molécula tipo A3 retiene también grados substanciales de especi icidad. Para entender la base de las reacti idades cruzadas observadas» los autores de la presente intentaron definir un supermot vo tipo A3 que describiera estas características de ligando de péptido que están asociadas con • 64 la degeneración del supertipo similar a A3. y que pudieran ser útiles en la predicción de enlazadores degenerados tipo A3. En primer lugar» se derivaron motivos refinados para cada uno de los alelos tipo A3 analizados en la presente (A3. 5 All. A31» A**3301 y A**6B01) » delineando especif cidades de unión de sujetador secundario, como se describe en Materiales y "•L métodos. Este enfoque es similar a uno usado anteriormente para definir un motivo A**0201 refinado (Ruppert, y otros, Cell 74:929 (1993)). Los motivos se derivaron calculando en cada posición no sujetadora a lo largo de la secuencia del péptido, la capacidad de unión relativa por medio de los péptidos que llevan cada uno de los 20 aminoácidos comunes, agrupados de acuerdo con similitudes químicas individuales. Representativos de los datos generados mediante esta procedimiento, los valores js calculados para A3 se muestran en el cuadro 3A. Siguiendo este como un ejemplo, se probaron 21 péptidos diferentes que poseían un residuo aromático (F, W, Y) en la posición 3 de su secuencia. Estos péptidos tenían capacidad de unión relativa promedio para A3, 31.7 veces más alta que el promedio global del grupo de 200 péptidos. Por analogía a lo que se describió anteriormente en el caso de A**0201, se definieron residuos preferidos y pe udiciales como residuos asociados con capacidades de unión promedio que fueron cuatro veces mayores o cuatro veces menores que el promedio global» respectivamente.

Consecuentemente, los residuos aromáticos en la posición 3 fueron considerados residuos "preferidos" para unión de A3.

• * CUADRO 2 PEPTIDOS REACTIVOS CRUZADAMENTE DE SUPERMOTIVO TIPO A3 SECUENCIA CAPACIDAD DE ONION (CI50 nM) A ELOS UNIDOS 123456 7 8 9 A3 All A31 A*33 A*68 A . Pépt ldos reactivos cruzadamente del SHRermotiye tipo A3 , identificados en el análisis inicial * /*' CUADRO 3 PREFERENCIAS DE SUJETADOR SECUNDARIO ESPECIFICAS DE ALELO, DETERMINADAS POR VALORES RELATIVOS DE UNION POSICIÓN GRUPO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 B. All A 7.9 0.S6 0.85 5.0 2.0 0.18 0.30 ' G 1.5 0.44 0.68 0.37 1.5 1.4 0.22 DE 0.12 -O' 0.30 0.37 0.48 0.30 0.46 1.4 % RHK 1.3 0.35 1.9 0 LIVM 1.3 *-S._' .47 0.37 0.37 2.1 «. -_: YFW 0.31 ? . 1.8 0.52 3.1 1.5 2.9 0.38 6.2 5.1 3.6 13 14 3.9 QN 0.65 0.92 0.73 0.48 0.88 0.59 0.98 stc 3.8 1.3 1. 1.4 1.2 0.38 1.8 P 0.17 0.45 3.2 1.6 1.5 0.77 18 • 68 Se realizó un anál sis sim lar para cada alelo (A3, All, A31, A*3301) y se util zó para derivar mapas de requerimientos de sujetador secundario específicos de alelo para cada posición (cuadro 3B-E). En la figura 1 se muestran resúmenes de los motivos modificados obtenidos para cada alelo de supertipo similar a A-3 examinado. Cada molécula exhibió sus propios requer mientos únicos de sujetador secundario. Por ejemplo, los residuos cargados pos vamente ( , H, K) en la posición 4, fueron preferidos por A3, pero no por ninguna otra molécula tipo A3. Similarmente, en la posición 8, la glicina (G) estuvo asociada con capacidad de unión deficiente solo para All, mientras que las cargas negativas (D, E) fueron perjudiciales solamente para A31. Además de estos tipos de aspectos únicos específicos de alelo, ciertos residuos fueron _5 asociados con unión deficiente o buena en una mayoría de las moléculas de supertipo A3. Por ejemplo, la pro! ina (P) en la posición 1 fue perjudicial para las 5 moléculas A3 probadas. Los residuos aromáticos <F, , Y) en la posición 7 y prolina en la posición 8, fueron preferidos por cuatro de las cinco 0 moléculas probadas (figura 1). En base a los varios motivos refinados individuales, se construyó un supermotivo tipo A3. Residuos pe judiciales para por lo menos tres de los cinco alelos considerados fueron definidos como residuos perjudiciales en el supermotivo. 5 Contrariamente, los residuos preferidos por al menos tres de los cinco alelos considerados, pero tampoco perjudiciales para ningún alelo, fueron definidos como residuos preferidos. El supermotivo tipo A3 derivado siguiendo este enfoque se muestra en la figura 2.

Una prueba de la eficacia del supermotivo A3, en la predicción de péptidos altamente reactivos en forma cruzada.

-*^. Para probar la validez del supermotivo tipo A3 definido anter ormente, se probó un grupo adicional de IOS péptidos no incluidos anteriormente en el análisis de supermoti os, para determinar su unión a A3, All, A31, A*3301 , y A*6B01. Este grupo incluía 30 péptidos que tenían por lo menos un residuo del supermotivo preferido y ningún residuo perjudicial (supermotivo positivo), 43 péptidos con por lo menos un residuo perjudicial (supermotivo negativo), y 35 péptidos ni con = residuos perjudiciales ni preferidos (supermotivo neutro). De los 30 péptidos de supermotivo positivo, 27 (90%) se unieron a 2 o más moléculas tipo A3, y 16 (53%) se unieron a 3 o más moléculas. En contraste, 18 (51%) de 35 péptidos de supermotivo neutro se unieron a dos o más tipos A3, y 8 (23%) se unieron a tres o más moléculas. Finalmente, los péptidos de supermotivo negativo fueron mucho menos capaces de unirse a alelos múltiples, con 6 (14%) péptidos uniéndose a dos moléculas tipo A3, y ningún péptido uniéndose a tres o más moléculas. Estos resultados son cualitati amente similares a los obtenidos cuando el grupo original de péptidos usados para definir el supermotivo fue sometido al mismo tipo de análisis, y está en • 70 sorprendente contraste con el nivel de reactividad cruzada observada en el caso del grupo de péptidos de control mencionados anteriormente, que se unen a alelos de HLA no relacionados, en los cuales solo unos cuantos péptidos (8%) se unieron a un alelo diferente del elemento de restricción original. Del grupo de péptidos para validar el supermotivo tipo A3, se identificaron 10 péptidos adicionales que se unen con afinidad alta o intermedia por lo menos a cuatro de las cinco moléculas tipo A3 probadas (cuadro 2B ) .

En todos los grupos étnicos ayor ar os están conservadas altas frecuencias fenotip cas de s?perti os de HLA. Para evaluar la relevancia potencial de los supertipos de HLA en general, y del supertipo similar a A3 en particular, se examinó la incidencia de varios alelos o ant igenos de HLA clase I. A la fecha, la mayor parte de los datos de población de HLA— A y —B que están disponibles se basan en tipificación serológica. Estos datos no tienen resolución en el nivel de alelos definido por las secuencias de ADIM, y consecuentemente no distingue entre subtipos. Sin embargo, la comparación de las especificidades de unión a péptido de los subtipos, ya sea mediante estudios de unión de péptido (del Guercio, y otros, J Immunol 154:685 (1995); Tanigaki, y otros, Hum Immunol 39:155 (1994)), análisis de colección de secuencias (Fleischer, y otros, Tissue Antigens 44:311 (1994); RotzschKe, y otros, Eur J Immunol 22:2453 (1992)), o análisis de estructura de cavidad basada en la secuencia primaria, sugieren que en la mayoría de los casos los subtipos tendrán especi c dades de sujetador principal de péptido muy similares, si es que no son idénticas. De esta manera, en el siguiente análisis, si no se tuvieron disponibles datos de población en el nivel de subtipo de ADfM, pero los datos de unión, los motivos publ cados o el análisis de secuencias sugerían que los subtipos tendrán traslapo de especif cidades de unión de péptido, se asumió una correspondencia uno a uno entre subtipos de alelo y los antigenes definidos serológ camente. Cuando la incidencia de los varios alelos o antígenos tipo A3, en diferentes raices técnicas fue examinada, se hizo evidente que mientras la frecuencia de cada alelo o antigeno individual puede variar prácticamente entre grupos étnicos (I anishi, y otros, Proccedings of the International Histoco patibi 1 ity Workshop and Conference, Vol. 1, Tokyo, Oxford Uni ersity Press (1992)), la frecuencia acumulativa de los cinco alelos tipo A3, es notablemente constante (en la escala de 37% a 53%). Por ejemplo, A3 es común en caucásicos, negros norteamer canos e hispanos, pero está casi ausente en japoneses. Contrar amente, A31 es frecuente en japoneses pero es raro en caucásicos y negros norteamericanos. En contraste, en cada una de las cinco poblaciones examinadas, el subtipo similar a A3, estuvo presente en por lo menos 37%, y hasta 53% de los i d iduos. En este contexto, también es interesante notar que la existencia de un subtipo similar a A3 no es un incidente aislado, ya que los autores de la presente han reportado también recientemente la existencia de subtipos semejantes a A2 (del Tuercio, y otros, J Immunol 154:685 (1995)) y semejantes a B7 (Sidney, y otros, J Im unol 154:247 (1995)). Cada uno de estos subtipos adicionales también es muy prominente, con ^"- frecuencias acumulativas notablemente constantes (en la escala de 40% a 60%) entre diferentes razas étnicas. De hecho, puede calcularse fácilmente que a nivel de gen, por lo menos una ÍO mitad del total de copias de los genes HLA-A o -B en existencia en la actualidad parecen pertenecer a uno u otro de estos subtipos de HLA.

DISCUSIÓN fc Los datos presentados aquí demuestran que los productos de por lo menos 5 alelos diferentes de HLA (A3, All, A31- A*3301» y A*6B01) , y probablemente por lo menos otros tres (A*3401» A 6601» y AX7401 ) predec dos en base al análisis de cavidad, pueden agruparse en un solo subtipo similar a A3, funcional. Esta determ ación se hizo en base a varias observaciones. Como grupo, estas moléculas (a) comparten ciertos aspectos estructurales clave dentro de sus regiones de unión a péptido (b) tienen preferencias similares por sus residuos sujetadores primarios, y (c) comparten repertorios de unión que se traslapan ampliamente. Examinando la actividad de unión de un gran panel de péptidos que llevan residuos sujetadores preferidos por estas moléculas alélicas, se definió también un supermotivo tipo A3. Este supermotivo, que está basado en un mapa detallado de los requerimientos de sujetador secundario para cada una de las moléculas del subtipo similar a 5 A3, permite la predicción eficiente de péptidos de unión degenerados tipo A3. Finalmente, se mostró que el subtipo similar a A3, y que los subtipos en general están representados con frecuencias fenotipicas notablemente altas en todos los grupos étnicos principales. Como tal, los subtipos de HLA clase 10 I basados en especificidades de unión a péptido representan una alternativa funcional a la clasificación serológica y filogenética para entender las relaciones entre las moléculas de HLA clase 1. Además de su uso para la generación del supermotivo II!5 tipo A3, los mapas de sujetador secundario individuales descritos en este estudio representan por si solos una contribución significativa a la comprensión de la unión de péptidos a las moléculas clase I. Debido a que estos mapas fueron derivados utilizando péptidos de tamaño homogéneo, las determinaciones de preferencia en cada una de las posiciones secundarias puede ser más exacta que las derivadas de la secuenciación de colecciones de péptidos procesados naturalmente. También los motivos definidos aquí permiten la determinación de residuos que tienen efectos per udiciales en la unión al péptido. Barber y colaboradores (Barber, y otros, Curr Bil 5:179 (1995)) han demostrado que los peptidos que pueden ser reconocidos en el contexto de dos moléculas que los autores de la presente han incluido en el subtipo similar a HLA—B7, y otros dos péptidos han sido reportados como reconocidos en el 5 contexto de más de un alelo tipo A3, (Missale, y otros» J Exp t Med 177:751 (1993); oening, y otros, J Imm?nol 145:127 (1990); Culmann, y otros, J Im unol 146:1560 (1991)) (ver cuadro 4). Usando un método para la inducción n vitro de CTL primarios (Wentworth, y otros, Mol Immunol 32:603 (1995)) los autores de la presente observaron varios casos en los cuales pueden ser reconocidos péptidos en el contexto tanto de A3 como de All. Probaron los epi topes restringidos del supertipo similar a A3 para determinar la capacidad de unión a las moléculas de subtipo similar a A3, y notaron niveles relati amente altos de degeneración. De los siete epitopes enlistados en el cuadro 4, solamente 1 fue un nonámero que pudo ser analizado en cuanto al supermotivo propuesto en 1 a figura 2A (estudios futuros serán dirigidos hacia la extensión del supermotivo hacia péptidos más grandes que los nonámeros). Este péptido fue supermotivo positivo, y se unió a tres de cinco moléculas tipo A3. No obstante, es importante para cada uno de los ep i topes estar ajustados a las especifici ades de sujetador primario del supertipo similar a A3. La comparación de las clasif caciones de supertipo propuestas por los autores de la presente en base a la relación entre unión de péptido y la clasificación de alelos HLA—A en • 75 base a las relaciones de secuencia de ADN (y reactividad serológica) (Ishikawa, y otros, Hum Immonol 39:220 (1994); Firgaira, y otros, Imm?nogenet cs 40:445 (1994); Karo, y otros» J Immunol 143:3371 (1989)) revela tanto similitudes como diferencias. Por ejemplo» HLA-A3 y All parecen estar estrechamente relacionados y derivados de un gen ancestral común (48-50). A31 y A33, sin embargo, derivan del linaje antiguo que comprende los grupos A2/A10/A19 que es diferente del linaje de A3 y All. Finalmente, HLA—A-.6901 pertenece al grupo evolucionario A28 de HLA CFernande?—Viña y otros, Hum Im unol 33:163 (1992); Ishikawa, y otros, Hum Immonol 39:220 (1994; Lawlor, y otros, Annu Rey Imm?nol 8:23 (1990>_i, que también contiene los alelos HLA-A-.6802 y -A*6901. Sin embargo, en base a su especific ad de unión a péptido, HLA A..6S01 es un miembro del supertipo similar a A3, mientras que se ha demostrado que A*6B02 y A.-6901 pertenecen al subtipo similar a A2 Cdel Quercio, y otros, J I m?nol 154:685 (1995)3. Asi, en base al árbol filogenético disponible de los alelos de HLA Clshikawa, y otros, Hum Im onol 39:220 (1994); Firgaira» y 0 otros, Immunogener cs 40:445 (1994); Karo, y otros, J Immunol 143:3371 (1989)3, los alelos tipo A3 se encuentran en ambos de los linajes antiguos de HLA: A1/A9 que incluye A3 y All, y A2/A10/A19 que incluye A31 , A33, y A*6801. Si la existencia del supertipo similar a A3 de HLA es reflexiva de antigüedad común, 5 entonces el motivo tipo A3 pudiera representar primitiva especificidad de unión a péptidos de HLA clase I humana, y otras especi cidades pudieran representar adaptaciones a medios patogénicos cambiantes.

CUADRO 4 UNION DE PEPTTDOS RESTRINGIDOS TIPO A3 SECUENCIA CAPACIDAD DE ONION (CI50 nM) PEPTIDO 12345678911 RESTRICCIÓN A All A31 A*3301 A*6801 01 3 HBVc 141-151" STLPETTVVRR A31 Aw68 3 - 4 181 , 181 26 3 ' HIV nef 73-82" QVPLRPMTYK A3, All 10 * 183 2164 ^133 8 7 MAGE 1 96-104 SLFRAVITK A3, All '3 2 248 10943 113 ; 3 HIV env 43-52 TV??GVPVWK A3 , All 1 4 163 10357 15 -I t 6 HCV lorf 1858- GVAGA AFK A3 , All 2 '-4 " 330 27188 119 1867 8 i 3 HIV env 42-52 VTVY?GVPVWK A3, All , 8 11 461 38667 172 ' 5 HBV pol 152-161 TLWKAGILYK A3 , All ¡2 1? 292 30526 533 i " " 7 Las capacidades de unión buenas se definieron como < 500 nM y están remarcadas con sombreado.

Estas observaciones, sin embargo, también originan la posibilidad intrigante de que pudiera existir, a nivel de población, una ventaja selectiva en el mantenimiento de frecuencias altas de los varios alelos de supertipo de HLA clase I» generados ya sea por antigüedad común o por evolución convergente. Esta ventaja pudiera estar relacionada con la generación de un repertorio de unión a pépt do efectiva a nivel de población. Esta observación es evidente a partir del hecho de que diferentes moléculas de la misma familia filogenética pueden pertenecer a diferentes fam lias de supertipo de unión. También es posible que este fenómeno pudiera en parte estar relacionado con la explotación óptima de la especificidad de péptido de transportador humano asociado con moléculas procesadoras de antígeno (TAP) ( Androlewicz» y otros, Proc Nati Acad Sci USA 90:9130 (1993); Androlewicz, y otros, Immunity 1:7 (1994); van Endert, y otros, I munity 1:491 (1994); Hee els, y otros, Immunity 1:775 (1994); Momburg, y otros, Curr Opin Im unol 6:32 (1994); Nee es, y otros, Science 261:769 (1993)) que ha mostrado transportar preferencialmente péptidos con ciertos aspectos de secuencia tales como extremos C hifrofóbicos, aromáticos o cargados pos tivamente. Estudios recientes, efectuados por van Endert y asociados, en colaboración con el grupo de los autores de la presente, evaluaron las afinidades relativas de TAP de una gran colección de péptidos, y han descrito un motivo de unión de TAP extendido. Sorprendentemente, este mot o contiene muchos de los aspectos estructurales asociados con el supermotivo tipo A3, tales como la preferencia por residuos aromáticos en las posiciones 3 y 7 de péptidos nona éricos y la ausencia de residuos cargados negat vamente en las posiciones 1 y 3, y P en la posición 1. En base a la evidencia experimental presentada en la presente, parece que, además de la clasificación basada en serologia o relaciones f 1 ogenéticas, los alelos de HLA clase I también puede ser rec1 asificados en supertipos, en base a su ÍO especificidad de ligando. Se han identificado actualmente 3 supertipos, similar a A2, similar a A3 y sim lar a B7, y otros, tales como el supertipo similar a B44» son sugeridos de la literatura (Fle scher, y otros, Tissue Antigens 44:311 (1994); Harris, y otros, J Immunol 151:5955 (1993); Thorpe, y otros, !1:5 Immunogenet cs 40:303 (1994), Falk, y otros, Immunogenetics 41:165 (1994)). Aunque permanece desconocido cuantos supertipos serán identificados y como serán inclusive, los datos disponibles demuestran que el fenómeno de degeneración de especif cidades de unión a péptido, el cual se pensó anteriormente restringido a HLA clase II (Panina-Bordignon, y otros, Eur J I munol 19:2237 (1989); 0T Sullivan, y otros, J Immunol 145:1799 (1990); Busch, y otros, Int Im unol 2:443 (1990))» es también una característica de unión a péptido para HLA clase I. Cualquiera que sea la razón para la ocurrencia de supertipos de HLA clase I» su relevancia práctica potencial debe ser subrayada. La disponibilidad de pruebas de unión cuantitativa y super ot vos detallados debe permitir la identificación de péptidos altamente reactivos en forma cruzada. Esto, a s? vez, debe permitir una cobertura amplia de población con ?na combinación de unos cuantos epitopes de CTL, una posibilidad de gran significado para el uso potencial de enfoques basados en péptidos para el desarrollo de vacunas (V tiello, y otros, J Clin Invest 95:341 (1995)).

EJEMPLO 2 Unión del Supertipo Similar a B7 Trabajo anterior (Sidney» y otros» J. I munol » 154» 247-259 (1995); Hi 11 , y otros, Nature 360, 434-439 (1992); FalK, y otros, I unogenetics 38, 161-162 (1993b); Barber, y otros, Curr. Biol. 5:179 (1995); Schbnbach» y otros» J. I munol . 154:5951-5958 (1995)) ha indicado que una famil a relat amente grande de especificidades de HLA B» definidas colecti amente como el supertipo de unión similar a B7, está caracterizado por ?n motivo de unión a péptido común (P en la posición 2, y residuos hidrofóbicos o aromáticos en el extremo C) . En este ejemplo, se usan pruebas de unión molecular como se describió anteriormente para examinar en detalle las especificidades de sujetador primario (posición 2 y extremo C) de los cinco alelos tipo B7 más frecuentes (B*O702, B*3501, B51, ¡3*5301, y B*5401 ) . Para hacerlo asi, los autores de la presente han sintetizado y probado la unión de un panel de análogos de substitución individual del péptido FHV nef 84-92 (secuencia FPVRPQVPL). HIV nef 84-92 se une a B..0702, B*3501, B51 , B*5301 » y B 5401 ya sea con afinidad alta (CI50 =50 nM) o intermedia (CI50-500 nM). Se encontró que las moléculas del supertipo similar a B7 tienen especificidades compartidas y más bien estrictas en la posición 2. Para los cinco alelos» la prolina fue el residuo preferido. Con solo una excepción (A en el caso de B*3501) todas las subst tuciones probadas en la posición 2 estuvieron asociadas con decrementos de más de 10 veces en la afinidad de unión en comparación con la portación de prolina del péptido original de sujetador C-terminal. En contraste, cuando se analizó la especificidad de unión, cada tipo HLA—B expresó un patrón de especif cidad más bien único en el extremo C. Por ejemplo, B*0702 prefirió M, F y L» mientras que B*5101 prefirió L» I, y V. A pesar de esas diferencias, los patrones de especificidad global C—terminales exhibieron un alto grado de traslape. Los residuos alifáticos y V fueron preferidos por al menos cuatro de las cinco moléculas, y A» L, M» F, y W, fueron preferidos o tolerados en una mayoría de casos. Otros residuos, tales como Y o T, fueron tolerados solamente en casos aislados, mientras que algunos (v.gr. K o D) no fueron tolerados. Estos datos respecto a especificidad de sujetador primario están en buena concordancia con lo que fue descrito en Sidney y otros, J. Immunol . , 154,247-259 (1995). Los péptidos capaces de degenerar la unión del supertipo semejante a B7 deben tener una prolina en la posición 2 y un residuo hidrofóbico o aromático (V, I, L, M, F, W, A) en su extremo C. En la definición formal del motivo de sujetador primario del 5 supertipo semejante a B7, los autores de la presente han ?. incluido conservat amente a Y, a pesar de su carencia relativa H ^. de degeneración, ya que Y constituye la señal dominante en los análisis de colección de secuencias (Hill, y otros, Nature 360, 434—439 (1992); FalK, y otros Immunogene cs 38, 161-162 10 (1993b), Schónbach, y otros I munol . 154:5951-5958 (1995)) de B**3501. En resumen, el motivo sujetador primario del supertipo semejante a B7 es definido como P en 1 a posición 2, y A, I» L, M, V, F, W, y en el extremo C.

T_R Tama o preferido de los ligandos del supertipo similar a B7 Las moléculas clase I usual mente prefieren péptidos de entre 8 y 10 residuos de longitud (FalK y otros, Nature 351.290-296 (1991))» aunque se ha mostrado que se unen péptidos más grandes (Massale, y otros, J. Exp. Med. 177:751 (1993); Chen, y otros, J. Im unol . 152:2874 (1994); Col! ns, y otros. Nature 371-626 (1994)). Para determinar la longitud óptima del péptido para el supertipo similar a B7, se sintetizaron paneles de péptidos de 8, 10 y 11 elementos, representando secuencias virales, de tumor o bacterianas de origen natural, y llevando cada una de ellas la especificidad de sujetador primario del supertipo similar a B7 descrita anteriormente, y se probaron para determinar sus capacidades de unión, seis por tipo, a similar a B7. Se concluyó que 9 residuos representan la longitud óptima de péptido para todas las moléculas tipo B7 examinadas. Esta determinación fue real tanto en términos del porcentaje de péptidos de cada tamaño unido por cualquier molécula, pero también en términos del grado de reactividad cruzada observada (datos no mostrados).

Motivos sujetadores secundarios de alelos tipo B7 y el supermotivo tipo B7 Otros residuos pueden actuar como sujetadores secundarios, proveyendo asi energía de unión complementar a a los péptidos (Ruppert, y otros, Cell 74:929—937 (1993); Madden, y otros Cell 75,693-708 (1993); Saito, y otros, J. Biol. Chem. 268, 21309 (1993); Sidney y otros Hu. Immunol . 45, 79-93 (1996) Kondo, y otros, J. Immunol . 155:4307—4312 (1995); ParKer, y otros, J. Immunol . 152, 163—175 (1994)). También se ha mostrado que ciertos residuos pueden tener efectos negativos sobre la unión de péptidos a las moléculas clase I (Ruppert, y otros, Cell 74:929—937 (1993); Sidney, y otros, Hu . I unol . , 45» 79-93 (1996); Kondo, y otros, J. I unol . 155:4307-4312 (1995), BoehncKe, y otros, J. Immunol . 150, 331-341 (1993)). Para desarrollar un supermotivo tipo B7 que permita la selección eficiente de péptidos con capacidad de unión tipo B7 degenerada, los autores de la presente buscaron definir sujetadores secundarios y efectos secúndanos implicados en la unión de péptido a moléculas tipo B7 utilizando los métodos descritos en la presente. Se determinó la capacidad de unión para las 5 moléculas tipo B7 más comunes» B**0702» B**3501 B51 , B*»5301, y B**5401» de un panel grande de 199 péptidos nonámeros que representan secuencias virales de origen natural que contienen los sujetadores primarios del supertipo similar a B7 (prolina en la posición 2, y A, V, I» L» M» F» y W en el extremo O» y los datos se analizaron. Para cada posición» se calculó la capacidad de unión relativa promedio (ARBC) de los ÍO péptidos que llevan cada uno de los 20 aminoácidos» y se comparó la ARBC de todo el grupo de péptidos. Debido a la rara ocurrencia de ciertos aminoácidos, se agruparon residuos de acuerdo con similitudes químicas indi iduales, como se describió anteriormente (Ruppert, y otros, Cell 74:929-937 b *£5 (1993)). Este análisis se desarrolló separadamente para B**0702, B-3501, B51, B-5301 y B**5401. Se encontró que los patrones de preferencias y aversiones exhibidos por cada molécula, en términos de sujetares secundarios, fueron más bien únicos. Por ejemplo» en 20 el panel probado, 18 péptidos tuvieron residuos cargados positi amente (R, H o ) en la posición 1. Estos péptidos, como grupo, fueron muy buenos enlazadores de B**0702, teniendo una ARBC de 21. Sin embargo, para B51 , los mismos péptidos fueron enlazadores relativamente deficientes, con una ARBC de O.25. 25 Sin embargo, también pudieron observarse profundas similitudes en preferencias. Por ejemplo, los péptidos que llevan residuos aromáticos (F, W, y Y) en la posición uno, fueron, como un grupo, muy buenos enlazadores del grupo de moléculas del supertipo similar a B7 , con ARBC de 4.2, 17, 16, 20 y 70 para B-0702, B**3501, B51 , B~5301 , y B~5401, respect amente. Los valores discutidos anter ormente se usaron subsecuentemente para derivar mapas de requerimientos de sujetador secundario especificas de alelo para cada posición. Para hacer esto» se definieron residuos preferidos y pe judiciales como los residuos asociados con ARBC que fue 3 veces mayor que, o 3 veces menor que, respectivamente, el promedio global. Estos efectos preferidos y perjudiciales se resumen en la figura 3. Estos mapas de sujetador secundario revelan más claramente que mientras que cada molécula exhibió sus propios requerimientos únicos de sujetador secundario, ciertas características fueron altamente conservadas entre las moléculas tipo B7. Por ejemplo, como indicó anteriormente, los residuos aromáticos (F, W, y Y) en la posición 1, fueron _* preferidos por las 5 moléculas tipo B7. Contrariamente» en la •posición 8» los residuos ácidos (D, E) estuvieron asociados con capacidad de unión deficiente para las cinco moléculas. Los efectos secundarios preferidos por 3 o más de los cinco alelo considerados, pero no perjudiciales para ninguna molécula, por una parte, o los efectos secundarios perjudiciales para 3 o más de las cinco moléculas, fueron definidos como compartidos. Las características compartidas se incorporaron entonces en un supermotivo extendido tipo B7 definiendo residuos asociados ya sea con unión deficiente o buena en una mayoría de las moléculas del supertipo similar a B7. Siguiendo esta lógica, seria de esperarse que los péptidos que llevan residuos secundarios preferidos del supermotivo deberían exhibir un grado mayor de degeneración del supertipo similar a B7, que los que no llevan ninguno, o llevan » residuos perjudiciales. Esta suposición se probó determinando la reactividad cruzada de unión de un grupo independiente de 0 péptidos q?e llevan la especificidad del sujetador primaria B7.

Como se predijo, los péptidos que fueron supermotivo positivo (es decir, los péptidos con por lo menos un residuo secundario de supermotivo preferido, y ningún residuo perjudicial) exhibieron un grado substancialmente mayor de reactividad .5 cruzada dentro del supertipo similar a B7, que los péptidos de supermotivo negativo (péptidos con uno o más residuos perjudiciales de supermotivo) (datos no mostrados).

I plementación del supermotivo para mejorar la capacidad de 0 unión Los supermotivos de HLA pueden ser de valor en la predicción de péptidos altamente degenerados» como se demuestra en la presente. Sin embargo, de manera más interesante, la definición de supermotivos de HLA también permite diseñar epitopes altamente reactivos en forma cruzada» identif cando qué residuos dentro de una secuencia de péptido pudieran igualados» o "fijados", para conferir mayor degeneración sobre un pépt do dentro de un supertipo. Para determinar esta posibilidad, se seleccionaron seis péptidos que habían mostrado tener un alto grado de degeneración dentro del supertipo similar a B7 (cuadro 5). Cada péptido se unió a por lo menos tres de la cinco moléculas tipo B7 más comunes, con afinidades altas (CI50 < 50 rtM) o intermedias (CI50 50-500 nM). Estos péptidos se analizaron en el contexto tanto del supermotivo similar a B7 como de los motivos de sujetador secundario específicos de alelo descritos anteriormente para determinar si residuos particulares dentro de sus secuencias podrían ser "fijadas" para aumentar más su unión a las moléculas del supertipo similar a B7. Esta determinación encontró que ninguno de los péptidos particulares considerados contenía un residuo de supermotivo negativo. Tres péptidos (núcleo de HCV 168, MAGE 2 170, y MAGE 3 196)» cada uno de ellos» tenia un residuo que fue perjudicial para una sola molécula tipo B7 (cuadro 5). Después, se sintetizó un panel de análogos substituidos ind viduales. Algunos análogos contenían substituciones de sujetador secundario que fueron ya sea supermotivo positivo, o positivos en el contexto de un alelo particular sin ser perjudicial para cualquier otro. Se seleccionaron otras substituciones en base a los valores descritos en la presente. Debido a que las preferencias para los sujetadores primarios C— erminales fueron únicos para cada alelo, también se consideraron substituciones en esta posición.

Asi, por ejemplo, para probar si podría crementarse la degeneración, se hizo un número de análogos subst tuyendo el supermotivo positivo F con el residuo natural en la posición 1.

Se hicieron otras substituciones, tales como la L C—terminal ^a para Y en HBV pol 541, para manejar unión deficiente del ^ pépt do original para B*0702 y B-.5401. Cuando este panel se probó para determinar su capacidad de unión a moléculas de supertipo similar a B7, se 10 generaron los datos mostrados en el Cuadro 5. En cada caso, una substitución F en posición 1 exhibió unión y/o degeneración incrementada en comparación con la secuencia original. Por ejemplo, MAGE 2 170 se unió con alta afinidad a B*0702, afinidad intermedia a B-K3501, B41, y B.-5301, pero solo ^t5 débilmente a B-*5401. El análogo Fl de este péptido se unió a las cinco moléculas con alta afinidad. El acierto de las substituc ones dirigidas en moléculas especificas fue mucho más difícil de generalizar. Por ejemplo, la substitución de L en el extremo C de HBV pol 541 20 con Y natural , fue acertada para conferir unión a B*0702, aumentando al mismo tiempo la afinidad de unión a otras moléculas (signi cati amente en los casos de B51 y B*5401). En otros casos, el efecto observado fue anticipado, como se demostró mediante el caso de HBV env 313. Este péptido se unió 25 con alta afinidad a B*0702, B*3501, B51, y B.-.5301, pero solo débilmente a B*5401. Se hizo un análogo M en 5 para aumentar la unión a B*5401 , en base a la observación de que los residuos alifáticos ((L, I» V» y M) en la posición 5, fueron positivos para B*5401, y relati amente neutros para otras moléculas. Sin embargo, como se muestra en el Cuadro 5, la capacidad de unión a B*5401» incrementada significativamente, lograda con el análogo M 5» fue a expensas de la unión reducida a B*07Q2» B51 , y B*5301. Aunque el acierto de los análogos individuales fue variable, es notable que para cada caso por lo menos un análogo fue capaz de mejorar la afinidad de unión o bien de extender la degeneración del péptido original. Asi, los péptidos ya degenerados pueden ser "fijados" discretamente para mejorar su capacidad de unión y extender su degeneración.

CUADRO 5 LAS SUBSTITUCIONES DISCRETAS MEJORAN LACAPACIDAD DE UNION DEL SUPERTIPO SIMILAR A B7 Y LA DEGENERACIÓN DE LIGANDOS DEL PEPTIDO UNION (CI50 nM) FUENTE 12 3 45 6 7 8 9 B*0701 B*3501 B*5101 B*5301 B*5401 x-j HIV nef 84 F P V R P Q. V P L 16 43 12 481 71 5 FPVRP QFPL 9.5 23 207 319 241 5 FPVRP QVPI 22 120.0 15 31 1.6 5 I P I P S SWAF 42 2.6 2.3 12 2970 4 HBV ENV 313 Í.P I P S S AF 24 1.2 305 1.7 105 5 I P I PHSWAF 229 2.2 580 930 5.9 3 I PFP S SWAF 186 1.7 16 3.8 826 4 I P I P S SWA? 31 54 15 24 7.7 5 FPHCLAFSY __. 14 83 17 503 3 HBV POL 541 FPHC AFA 25 2.7 28 5.0 24 5 FPHC FS? 74 2.4 4.5 15 7.7 5 FPFCLAFSY - 6.5 27 4.8 5.1 4 FPHCLAFS 1 675 29 6.3 3.8 1.0 4 FPHCLAF SA. 3667 6.5 250 137 0.6 4 LPGCS FS I F 28 90 100 114 6897 4 Núcleo 168 HCV F P G C S F S I F 19 1.6 132 3.2 67 5 P trc S F S I F 8.7 2.5 13 2.7 5128 4 L PG CH7 S I F 24 28 53 39 2778 4 V P I S H L Y I L, 22 171 96 238 3175 4 MAGE2 170 P;P I SHLYIL 16 7.3 6.4 7.0 28 5 VP I SKLY I L 164 273 73 1075 1493 3 VP I SH Y IÍ 108 5333 8.3 326 91 4 MPKAGLLI I 940 5039 393 90 248 3 MAGE3 196 ? P A G L I I 162 1303 5.8 60 150 4 M p YA G L L I I 86 66 1.0 2.3 112 5 MPKAM LI I 1528 - 5.8 186 24 3 MPF'AGLLI I 229 1.0 0.9 2.3 0.27 5 En conclusión, de los datos mostrados en la presente, es evidente que pueden generarse péptidos de unión de afinidad superior substituyendo los residuos "negativos" o neutros de la secuencia, ya sea con residuos neutros o preferidos. Estos péptidos podrían tener también propiedades inmunológicas únicas porque» aunque todavía son reactivos cruzadamente con secuencias tipo silvestre, podrían no estar sometidos a mecanismos de tolerancia o supresión, inactivando CTL que responden a la secuencia tipo s lvestre» y se presentan como un resultado de cáncer o infección crónica. Puede utilizarse el mismo conocimiento para generar péptidos con grados más altos de reactividades cruzadas y con ello una cobertura más favorable de la población.

EJEMPLO 3 Unión del Supertivo Similar a A2 Los autores de la presente también han derivado información adicional sobre los requerimientos estructurales de la unión de A2.1. Para hacer esto, los autores de la presente primero buscaron determinar el grado de permití vi dad de las posiciones sujetadoras 2 y 9. Para este propósito» se sintetizó un panel de análogos que llevan substituciones simples, ya sea en la posición 2 ó 9 de un péptido modelo poli (A) de 9 residuos que contiene el motivo L A2.1 reportado anteriormente en la posición 2 y V en la posición 9 (Ruppert y G-.ros, Cell 74:929- 92 937 (1993), y se midió su capacidad de unión. Se sintetizaron trece análogos diferentes para ambas posiciones de sujetador 2 y 9. En buena concordancia con el motivo A2.1 reportado anteriormente» los péptidos que llevan L o metionina (M) en la ^^ posición 2» fueron los mejores enlazadores. Fueron evidentes incrementos notables en la capacidad de unión (10 a lOO veces), * aún con substituciones relati amente conservadoras tales como isoleucina (I), V al a a (A), y treonina (T). Cambios más ÍO radicales (es decir, residuos D» K, F. C, P, G, N, y S) anularon completamente la capacidad de unión. Se obtuvieron resultados similares en la posición 9, en donde solamente substituciones conservadoras» tales como L y I, se unieron lO É veces del enlazador péptido A2.1 pol i (A) modelo no substituido, j-o También se unieron análogos que llevan substituciones A o M, pero menos fuertemente (decremento de 10 a 100 veces). Finalmente, todas las otras substituciones probadas (T, C, N, F, S, G, P, y R) estuvieron asociadas con pérdida completa de capacidad de unión a A2.1. Asi, en base a estos datos y en 20 buena concordancia con estudios anteriores (19-20), pudo ser identificado un motivo A2.1 "canónico" como L o M en la posición 2 y L, V, o I, en la posición 9. A partir de estos resultados, los autores de la presente dedujeron que la unión a A2 de cualquier péptido que lleva un residuo "no canónico" (pero todavía aceptable) en la posición 2 ó 9 (o 10) (por ejemplo I, V, A o T en 2, o A, M, o T en 9 ó 10) podría ser incrementada reemplazando con un sujetador más "canónico". Por ejemplo, el péptido FHV Env 2181 con la secuencia (LWVTVYYGV) se une a A2.1 con una CI50% de 12,500nM, mientras que el análogo substituido con sujetador con la posición 2, « LMVTVYYGV, se une con CI50% de 3.3 nM. La secuencia de ocurrencia natural HBVc 18-27» FLPSDFFPSI» se une a A2.1 con CI50% de 22 nM» pero su variante VAO substituida con sujetador C-terminal se une a A2.1 con una Kd de 2.5 nM. Finalmente» el péptido HBV pol 538 (YMDDVVLGA) se une a A2.1 con una CI50% de 200 nM» mientras que la variante V^, se une con una CI50% de 5.1 nM. En el cuadro 6 se muestran otros ejemplos de péptidos sujetadores fijos. Algunos de los péptidos fijados se probaron para determinar su capacidad para inducir respuestas de CTL. s Por ejemplo» el péptido HIV Env 2181 y los péptidos HBV pol 721 se probaron en ensayos de CTL primarios (21). y se encontraron positivos. También existen datos de reconocimiento positivo de CTL para los péptidos HBV„18-27 y HBV pol 538. Experimentos posteriores revelaron un papel predominante para residuos no sujetadores en la determinación de la capacidad de unión. Los resultados de estos análisis se describen también en Ruppert y otros, precitados. Consecuentemente con el análisis de los autores de la presente, la frecuencia de un grupo de aminoácidos dados en enlazadores A2.1, se dividió entre la frecuencia de no enlazadores para obtener un cociente de frecuencia. Este cociente indica si un grupo dado de residuos ocurre en una posición dada preferencialroente en enlazadores (cociente >1) o no enlazadores (cociente <1). Para facilitar el análisis, se fijó un nivel de umbral para los cocientes, de tal manera que los residuos que 5 tenían una frecuencia más de 4 veces mayor en enlazadores, en jg comparación con no enlazadores, fueron considerados como ™ residuos favorecidos o preferidos, y los residuos que tuvieron una frecuencia más de 4 veces menor en enTazadores que en no enlazadores, fueron considerados como residuos no favorecidos o ÍO perjudiciales. Siguiendo este enfoque, se identif caron grupos de residuos que muestran asociaciones prominentes ya sea con la capacidad de unión de A2.1 o con la falta de la misma. En general, los efectos más per udiciales se observaron con los t aminoácidos cargados. En la posición 1, tanto los residuos P x5 como los ácidos (E y D) fueron infrecuentes en péptidos de unión de A2.1. En la posición 6, los residuos básicos (H, R y K) estuvieron asociados con péptidos no enlazadores mientras que ambos residuos ácidos y básicos fueron infrecuentes en los buenos enlazadores en las posiciones 3 y 7. Por el contrario, los residuos aromáticos estuvieron asociados con alta afinidad de unión en las posiciones 1, 3, y 5. Además, los residuos con OH- o SH- q?e contienen cadenas laterales» tales como S, T, o C, estuvieron favorecidos en la posición 4, mientras que A estuvo favorecido en la posición 7 y P en la posición 8. En conclusión, el análisis de frecuencia de diferentes grupos de aminoácidos permitió a los autores de la presente definir un motivo A2.1 mas exacto que toma en consideración el impacto de otras posiciones diferentes de las posiciones de sujetador 2 y 9 sobre la afinidad de unión a A2.1.

Análisis de ligandos de A2.1 de ÍO residuos El mismo enfoque descrito anteriormente para péptidos de 9 residuos se usó también para analizar los datos obtenidos con un grupo de péptidos de ÍO residuos. En los extremos N y C de los péptidos, el patrón observado fue más bien similar al observado con nonámeros. Por ejemplo, en el grupo de decámeros, como en el caso de los péptidos nonámeros, la posición 1 estuvo caracterizada por una frecuencia incrementada de residuos aromáticos en el grupo enlazador, mientras que las cargas negativas y P estuvieron asociadas nuevamente con unión deficiente. De nuevo en la posición 3, la carga negativa estuvo asociada con unión deficiente. De manera interesante en esta posición, los residuos alifáticos (en lugar de los aromáticos) estuvieron asociados con unión de alta afinidad. En los extremos C de los péptidos» se observaron también ciertas similitudes. En el decá ero» el penúltimo residuo en la posición 9 (correspondiente a la posición 8 en el nonámero) fue muy permisivo, con solo residuos básicos encontrados más frecuentemente en no enlazadores. Similar a la situación en la posición 7 en el nonámero» ni cargas positivas ni negativas fueron toleradas en la antepenúltima posición 8 de los decámeros. También, la posición 7 no favorece residuos « 96 positivos en los decá eroe, como se observó previamente para la posición 6 en los nonámeros. En analogía a lo que se observó en la posición 3» los residuos asociados con buena unión fueron sin embargo, diferentes. Los residuos aromáticos e hidrofóbicos 5 fueron frecuentes en enlazadores de alta afinidad en la t posición 8 (en oposición a solamente A frecuente en la poeición 7 en los nona eros). Finalmente, se observó un patrón más bien distintivo en la parte media del péptido. En la posición 4, fue favorecido G en enlazadores altos» mientras que tanto A como las cargas positivas fueron muy frecuentes en no enlazadores. P» en la posición 5, estaba completamente ausente en los enlazadores de A2.1. Es notable que ninguna de las tendencias observadas en A las posiciones 4 y 5 en el grupo decámero tienen alguna x5 contraparte en la posición 4 o 5 en el grupo nonámero. En resumen, puede ser generado un motivo detallado para péptidos decámeros de A2.1, siguiendo una estrategia similar a la descrita para los péptidos nonámeros anteriores. Pueden observarse tanto diferencias importantes como 20 similitudes sorprendentes al comparar los grupos de decámero y nonámero en estas posiciones no sujetadoras. En conclusión, a partir de los datos mostrados en la presente, es evidente que pueden generarse péptidos de unión de afinidad más alta substituyendo residuos "negativos" o neutros de la secuencia, ya sea con residuos neutros o preferidos.

Estos péptidos también podrían tener propiedades inmunológicas únicas ya que, aunque son todavía reactivos cruzadamente con las secuencias tipo silvestre» podrían no estar sometidos a mecanismos de tolerancia o supresión» inactivando la respuesta de CTL a la secuencia tipo silvestre» y presentes como resultado de cáncer o infección crónica.

* La unión de un antigeno de péptido a alelos múltiples de HLA permite la definición de un s?pertipo similar a A2. Se han desarrollado pruebas de unión directa a MHC ÍO con péptidos radiomarcados y células de mamífero que expresan HLA clase 1, tales como lineas de células B transformadas con EBV y blastos activados con PHA. Pudo obtenerse unión significati a de la sonda radiomarcada si las células blanco A¡ eran preincubadas durante la noche a 26°C en presencia de S2— microglobul ina. Bajo estas condiciones» hasta un poco porcentaje de las moléculas de HLA expresadas por cualquier tipo de célula» pudo ser ligado por los péptidos marcados. Con estas pruebas» se examinó el grado de reactividad cruzada del péptido 18-27 del núcleo del virus de la hepatitis B restringido con A*-0201, con otros subtipos A2. Se determinó que este epítope de péptido también se une a A-?.0202» A-.O205, y A--0206 pero no a los subtipos A 0207. Experimentos de inhibición con paneles de análogos de péptido resaltaron las especif idades de ligando similares de los alelos HLA—A *0201» A..0202, y A*0205. El análisis de los residuos polimórficos que ayudan a formar las cavidades de B y F de varios alelos de HLA permitió la predicción de unión del epitope 18-27 del núcleo de virus de la hepatitis B a otros 2 alelos de HLA (HLA—A*6B02 y A*6901). De esta manera, parece que una familia de por lo menos 6 diferentes moléculas de HLA—A» definidas colecti amente como 5 el supertipo A2, pueden compartir especificidades de traslape ^^ de ligando (residuos al fáticos en la posición 2 y en el extremo O. Estos resultados sugieren que los epi'topes de péptido ampliamente reactivos en forma cruzada pueden ser identificados, e incrementa en gran medida la factibilidad prospectiva de enfoques de vacunación a base de péptidos. Además, estos datos sugieren un uso adicional de análogos substitui os. Específicamente, esto es incrementar simultáneamente la afinidad de unión de varios miembros del j^ supertipo A2. 15 Un ejemplo de cómo puede realizarse esto, está dado por el péptido HPV 16 EF , 86-93, TLGIVCPI, y su análogo TLGIVXPI (en donde X se representa ácido ot-aminobuti'rico) . Se probó los patrones de unión de estos dos péptidos para alelos tipo A2. Fue evidente que la substitución X incrementó en gran medida la afinidad de unión por todos los alelos tipo A2, dando como resultado ur\ péptido más útil, caracterizado por capacidad de unión incrementada y reactividad cruzada más amplia que su secuencia original. Experimentos subsecuentes utilizando ratones transgénicos A2/kb demostraron que CTL inducidos por el péptido X substituido fueron completamente reactivos cruzadamente con la secuencia tipo silvestre, y que el péptido X, como resultado de su afinidad de unión más alta, fue un inmunógeno más potente.

EJEMPLO 4 5 Unión de A24 y Al Efectos secundarios y unión de A24 Los autores de la presente utilizaron ?n modelo de péptido nonámero de poli (A) conteniendo el motivo especifico A24 de Y en la posic n 2» y F en la pos ción 9. Se encontró que en la posición 2 no solamente Y» sino también F, M y posiblemente W» fueron aceptados. En el extremo C del residuo 9 o 10, los ligandos F y W fueron los más preferidos» pero también fueron aceptados L y I. M también pudo ser predicho • ?5 como aceptable en esta posición (Kubo» y otros» J I munol 152:3913)). A partir de estos resultados. los autores de la presente concluyeron que la unión a A24 de cualquier péptido que lleva ?n residuo no canónico, pero aún aceptable en la posición 2 o 9 (o 10) (por ejemplo F» M, W. en 2 o L, I, M, en 9 (o 10)), pudo ser incrementada reemplazando ese residuo con un sujetador más canónico. Kondo y otros, (J. I unol . 155:4307-4312 (1995)) han descrito resultados de experimentos posteriores que describen la función prominente de residuos no sujetadores en la determinación de la capacidad de unión de A24. Se compiló la base de datos de unión total de A24, y se calculó para cada lOO posición la afinidad de unión promedio relativa de los peptidos que llevan residuos particulares. En el caso de péptidos de 9 residuos, se encontró por ejemplo que los péptidos que llevan G o residuos cargados negativamente (D, E) en la posición 1 tienden a unirse « deficientemente» con una afinidad promedio analizada 10 veces r menor que la afinidad promedio del grupo completo de 141 -- péptidos de 9 residuos. En contraste, los péptidos que llevan residuos aromáticos (F, Y, W) en la posición 1 se unieron muy ÍO bien con una afinidad promedio 11.8 veces mayor que el promedio global . Los péptidos con residuos cargados posit vamente (R, K» M) en la posición 1, también tienden a unirse bien, con una t afinidad promedio 4.6 veces más alta que el promedio global.

W 15 Los efectos secundarios negativos sobre la capacidad de unión de A24 también fueron detectados en otras varias posiciones: D o E en la posición 3 y 6» G en la posición 4 y 7» cargas positivas (K» R» H) en la posición 6. A en la posición 8» P en la posición 5, y amidas (Q y N) en la posición 5 y 8.

Contrariamente, se encontró que los residuos aromáticos (Y, F, W) favorecieron la unión de A24 cuando se encontraron en la posición 7 ? 8» y residuos pequeños de unión de hidrógeno tales como (S, T, C) tuvieron un efecto positivo cuando estuvieron presentes en la posición 4. 25 Es evidente que cada posición individual a lo largo de la secuencia de 9 residuos puede afectar la unión de A24. lOl También es interesante que los residuos hidrofobicos (F, W, Y, L, I, V, y M) nunca estuvieron asociados con unión deficiente. Se realizó también un análisis similar con los datos obtenidos de péptidos de 10 residuos. En analogía a lo que se presentó en la sección anterior, fueron discernidos varios efectos secundarios en el caso de decámeros. Como fue en el caso de los péptidos nonámeros» los residuos negativos (D, E) en la posición 3 y 6 estuvieron asociados con unión deficiente. Sin embargo» en general el mapa de efectos secundarios para decámeros fue muy diferente del de los nonámeros. Por ejemplo, P, en el caso de péptidos de 9 residuos, no estuvo asociado con unión significativamente incrementada en ninguna posición e incluso estuvo asociada con unión reducida en la posición 5. Para decámeros, P estuvo asociado con capacidad de unión incrementada cuando se encontró en las posiciones 4, 5, o 7 de los ligandos de péptido de ÍO residuos. En los péptidos de lO residuos, la posición 5 parece ser más importante en términos de efecto secundario, con (además del ya mencionado P) Y, F, y W asociados con buena unión de A24, y R, H, y K asociados con capacidad de unión deficiente. La presencia de A en las posiciones 7 y 9, y residuos de amida (Q, N) en las posiciones 4 y 8» estuvo asociada también con capacidad de unión deficiente.

Efectos secundarios y unión de Al También se describió un análisis similar al descrito antes para A24» para moléculas HLA—A-*0101. Brevemente» estudios anteriores han definido dos motivos de unión de péptido diferentes específicos para HLA—A..0101. Los mapas de nonámero y decámero de interacc ones secundarias fueron derivados para ambos submotivos A*0101. Para derivar estos mapas de interacciones secundarias» se compilaron los datos de unión de A*Q101 relevantes de grupos de péptido correspondi ntes a cada 0 uno de los dos submotivos. Para cada posición» se calculó la afinidad de unión promedio relativa de los péptidos que llevan cada residuo particular. Para compensar la baja ocurrencia de ciertos residuos particulares» y para obtener un muestreo más w t signi cati o, se combinaron aminoácidos que llevan cadenas laterales químicamente similares, como en el caso de Ruppert y otros» precitados. Los resultados obtenidos mediante este tipo de análisis para péptidos de 9 residuos, se muestran en las figuras 4A y 4B para los s?b otivos 2-9 y 3—9, respect amente. También se muestran como figuras 4c y 4d diagramas que ilustran 0 los efectos secundarios detectados mediante este análisis (para los s?bmotivos 2-9 y 3-9, respectivamente). Incrementos o decrementos en afinidad promedio mayor a 4 veces han sido considerados arb rariamente como signif cativos, como se describió anteriormente. 5 En general, para la mayoría de las posiciones estuvo afectada la capacidad de unión, ya sea negativamente o positi amente, por la presencia de tipos de residuos particulares. Por ejemplo» en el caso del sub otivo 2—9, se encontró que los péptidos llevan D o E en la posición 1 se unieron deficientemente a las moléculas A 0101, con una capacidad de unión relativa promedio (ARBC) de 0.20. Por el contrario» los péptidos que llevan residuos aromáticos (Y, F» o W) en la misma posición (posición 1) se unieron con una afinidad en promedio 4 veces superior (ARBC 4-0) que la capacidad de unión promedio global de todo el grupo de péptidos. La inspección de los diagramas revela algunos aspectos interesantes de la unión de péptido A A*0101. En primer lugar, como se indicó anteriormente, los dos sujetadores en las posiciones 2 y 3 actúan sinergisticamente entre sí. La afinidad de péptidos que llevan los sujetadores M, S o T en la posición 2, es incrementada dramáticamente por la presencia de D o E en 3 (y en una menor extensión por A). Por el contrario, la afinidad de los péptidos que llevan los sujetadores D o E en la posición 3» es incrementada dramáticamente por la presencia de S, T, y M (pero también otras moléculas hidrofóbicas o de cadena corta tales como L, V» I, C y A) . El grado al cual difieren los péptidos que llevan los dos submotivos, en su interacción con la molécula de A*0101 , es revelado examinando otras posiciones. Comparando los valores en las figuras 4a y 4b, es claro que hay numerosos ejemplos en los cuales residuos neutros en el contexto de un motivo tienen efectos positivos o negativos en el contexto del otro motivo. Por ejemplo, en la posición 1, en el motivo 2—9» se prefiere G y residuos aromáticos (Y, F, y W) (ARBC >4.0), A y residuos cargados positi amente (R, H, y K) son relati amente neutros (ARBCs entre 4.0 y 0.25), y residuos cargados negativamente (D y Y) son perjudiciales (ARBC <0.25). En el caso de péptidos que llevan el submotivo 3—9 se nota un diferente patrón y, con la excepción de G» que es preferido todavía» las preferencias son mezcladas. Los residuos cargados posit amente en la posición 1 tienen una influencia positiva signi cat a sobre la unión del péptido (ARBC de 8.3), los residuos cargados negat amente y aromáticos son neutros (ARBC de 1.3 y O.61» respect vamente), y A es perjudicial (ARBC de O.15). Se observan tipos similares de modulación en cada posición a lo largo del motivo. En total, las desviaciones en preferencia del sujetador secundario de submotivo a submotivo es observada mejor en los diagramas de resumen mostrados en la figura 3. En este contexto» puede verse que, con la sola excepción de la preferencia compartida para G en la posición 1, y excluyendo los co-sujetadores de la posición 2 y 3, los motivos secundarios de los dos submotivos decámeros de AxOlOl» son de hecho completamente diferentes. Asi» en un sentido cuantitati o, los dos motivos nonámeros tienen solamente un efecto secundario aparte de 27 (3.7%) en común. El grado al cual estos motivos A-*0101 difieren» está en notable contraste con las similitudes múltiples observadas entre loe motivos extendidos de moléculas A24» A*0201» y de IOS tipo A3 (20), en donde se observo que entre 3 y 5 (13-26%) efectos secundarios fueron compartidos entre cualquiera dos motivos extendidos.

Definición de residuos sujetadores secundarios para ligandos decámeros En analogía a lo que se describió en la sección anterior para l gandos nonameros , los residuos sujetadores secundarios y los efectos secundarios se definieron también para los submotivos 2—10 y 3—10. Los resultados de estos análisis se presentan en las figuras 5a—d. Una vez más, apareció que los sujetadores presentes en la posición 2 y 3 podían actuar sinergísticamente entre sí. La presencia de D, E (y en una extensión mucho menor A, Q y N) en la posición 3, en el contexto del submotivo 2-10» y de los residuos hidrofóbicos (L, I, V, M) o de cadena corta (S, T, C) en la posición 2, en el contexto del submotivo 3—ÍO, estuvieron asociados con incrementos significat os en la capacidad promedio de unión. La comparación de los dos motivos decámeros en las posiciones diferentes de 2 y 3, y en los extremos C. indica que, como fue en el caso de los péptidos de 9 residuos, la modulación en especif cidad de sujetador secundario ocurre dependiendo de los principales residuos sujetadores. Por ejemplo, en la posición 7, se prefieren A y S, T, y C en el motivo 2-10» pero son neutros en el motivo 3-10. Por el contrario, G es preferido en el motivo 3-10, pero es neutro en el motivo 2-10. Sin embargo, también es evidente que, en contraste con los submotivos nonámeros, estas diferencias observadas en decámeros son mucho menos notables. De hecho, los dos submotivos decámeros comparten varias preferencias. Y, F y W en posiciones l y 5, A en 4, P en 7, y G en S tienen efectos positivos para ambos submotivos. De manera similar, R» H y K, en 8» fueron perjudiciales en ambos submotivos decámeros (figuras 5c y 5d). En total» los dos motivos decámeros compartieron 6 efectos secundarios aparte de los 25 (24%). Los ejemplos anteriores se proveen para ilustrar la invención, pero no para limitar su alcance. Otras variantes de la invención serán fácilmente evidentes para el experto en la , materia y están abarcadas por las reivindicaciones anexas.

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en la presente están incorporadas como referencia para todos los propósitos.

Claims (20)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.— Un método de inducción de una respuesta de células T citotó?icas contra un ant geno preseleccionado en un paciente, el método comprende poner en contacto ?na célula T citotóxica con un péptido inmunogénico de entre aproxi adamente 9 y aprox madamente 15 residuos, que se une a por lo menos dos moléculas tipo HLA—A3, con una constante de disociación de menos de apro imadamente 500 nM, e induce una respuesta de células T citotóxicas; dicho péptido in ?nogénico tiene una secuencia de 9 residuos que comprende un motivo de unión, del extremo N al extremo C» de la manera siguiente: un primer residuo sujetador primario en la segunda posición» seleccionado del grupo que consiste de A, L, I, V, M, S y T, y ?n segundo residuo sujetador primario en la novena posición, seleccionado del grupo que consiste de R y K; y uno o más residuos sujetadores secundarios seleccionados del grupo que consiste de Y, F o W, en la tercera posición, Y, F o W en la sexta posición» Y» F o W en la séptima posición, P en la octava posición, y cualquier combinación de los mismos.

2.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido consiste de 9 a 10 residuos.

3.— El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido se deriva de un antígeno viral, un antígeno asociado a tumor, un antígeno de parásito, o un antígeno de hongo.

4.— El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paso de poner en contacto se lleva a cabo in vitro.

5.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paso de poner en contacto se lleva a cabo administrando al paciente una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica el péptido 10 inmunogén co.

6.- Un método de inducción de una respuesta de células T citotóxicas contra un antígeno preseleccionado en un paciente, el método comprende poner en contacto una célula T citotóxica con ?n péptido inmunogénico de entre aproximadamente t 5 9 y aproximadamente 15 residuos, que se une a un producto de gen HLA—A*-0301» con una constante de disociación de menos de aproximadamente 500 nM e induce una respuesta de células T citotóxicas, dicho péptido inmunogénico tiene una secuencia de 9 residuos que comprende un motivo de unión, del extremo N al 20 extremo C, de la manera siguiente: un primer residuo sujetador primario en la segunda posición, seleccionado del grupo que consiste de A, L, I, V, M» S y T, y un segundo residuo sujetador primario en la novena posición, seleccionado del grupo que consiste de R y K; y uno o más residuos sujetadores 25 secundarios seleccionados del grupo que consiste de R, H o K en la primera posición, Y, F, o W, en la tercera posición, P, R, H, K, Y, F o W en la cuarta posición, A en la quinta posición» Y, F» o W en la sexta posición, P en la octava posición, y cualquier combinación de los mismos.

7.- El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el péptido consiste de 9 a 10 residuos.

8.- El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el péptido se deriva de un antígeno viral» un antígeno asociado a tumor» un antígeno de parásito, o un antígeno de hongo.

9.- El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el paso de poner en contacto se lleva a cabo in vitro.

10.- El método de conformidad con la reivindicación 6» caracterizado porque el paso de poner en contacto se lleva a cabo administrando al paciente una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica el péptido inmunogénico .

11.- Un método de inducción de una respuesta de células T citotóxicas contra un antígeno preseleccionado en un paciente» el método comprende poner en contacto una célula T citotóxica con urx péptido inmunogénico de entre aproximadamente 9 y aproximadamente 15 residuos, que se une a un producto de gen HLA—A*1101 , con una constante de disociación de menos de aproximadamente 500 nM e induce una respuesta de células T citotóxicas, dicho péptido inmunogénico tiene una secuencia de 9 residuos que comprende un motivo de unión, del extremo N al extremo C, de la manera siguiente: un primer residuo sujetador primario en la segunda posición, seleccionado del grupo que consiste de A, L, I, V, M, S y T, y un segundo residuo sujetador primario en la novena posición, seleccionado del

5 grupo que consiste de R y K; y un residuo sujetador secundario seleccionado del grupo que consiste de A en la primera tef posición, Y, F» o W, en la tercera posición» Y, F, o W en la cuarta posición, A en la qu nta posición, Y, F» o W en la sexta posición, Y, F, o W en la séptima posición, P en la octava 0 posición, y cualquier combinación de los mismos.

12.- El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el péptido consiste de 9 a ÍO residuos.

13.— El método de conformidad con la reivindicación ip 11. caracterizado porque el péptido se deriva de un antígeno viral, un antígeno asociado a tumor, un antígeno de parásito, o un antígeno de hongo.

14.— El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el paso de poner en contacto se lleva 20 a cabo i vitro.

15.- El método de conformidad con la reivindicación

11, caracterizado porque el paso de poner en contacto se lleva a cabo administrando al paciente una molécula de ácido nucleico que comprende ?na secuencia que codifica el péptido

25 inmunogénico.

16.- Un método de inducción de una respuesta de células T citotoxicas contra un antigeno preseleccionado en un paciente, el método comprende poner en contacto una célula T citotóxica con un péptido inmunogénico de entre aproximadamente

9 y apro i adamente 15 residuos, que se une a un producto de

5 gen HLA—A*3101 , con una constante de disociación de menos de apro imadamente 500 nM e induce una respuesta de células T

- M citotóxicas. dicho péptido inmunogénico tiene una secuencia de

9 residuos que comprende un motivo de unión, del extremo N al extremo C. de la manera siguiente: un primer residuo sujetador

10 primario en la segunda posición, seleccionado del grupo que consiste de A, L, I, V, M, S y T, y un segundo residuo sujetador primario en la novena posición, seleccionado del grupo que consiste de R y K; y un residuo sujetador secundario s seleccionado del grupo que consiste de R. H, o K en la primera posición, Y» F, o W en la tercera posición, P en la cuarta posición, Y, F, o W en la sexta posición, Y, F» o W en la séptima posición, A o P en la octava posición, y cualquier combinación de los mismos.

17.- El método de conformidad con la reivindicación

20 16, caracterizado porque el péptido consiste de 9 a ÍO residuos.

18.— El método de conformidad con la reivindicación

16, caracterizado porque el péptido se deriva de un antígeno viral» un antígeno asociado a tumor, un antígeno de parásito, o 25 un antígeno de hongo.

19.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el paso de poner en contacto se lleva a cabo i vitro. 20.- El método de conformidad con la reivindicación ÍS» caracterizado porque el paso de poner en contacto se lleva a cabo administrando al paciente una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica el péptido inmunogénico. 21.- Un método de inducción de una respuesta de células T citotó?icas contra un antígeno preseleccionado en un

10 paciente, el método comprende poner en contacto una célula T citotóxica con un péptido inmunogénico de entre aproximadamente 9 y aproximadamente 15 residuos, que se une a un producto de gen HLA-A*3301 » con una constante de disociación de menos de aproximadamente 500 nM e induce una respuesta de células T Ét£5 citotóxicas, dicho péptido inmunogénico tiene una secuencia de

9 residuos que comprende un motivo de unión, del extremo N al extremo C, de la manera siguiente: un primer residuo sujetador primario en la segunda posición, seleccionado del grupo que consiste de A» L, I, V, M, S y T, y un segundo residuo

20 sujetador primario en la novena posición, seleccionado del grupo que consiste de R y K; y un residuo sujetador secundario seleccionado del grupo que consiste de Y» F, o W» en la tercera posición, A, Y» F, o W en la séptima posición, y cualquier combinación de los mismos. 25 22.- El método de conformidad con la reivindicación

21, caracterizado porque el péptido consiste de 9 a ÍO res uos, 23.— El método de conformidad con la reivindicación

21» caracterizado porque el peptido se deriva de un antigeno viral, un antígeno asociado a tumor, un antígeno de parásito, o un antígeno de hongo. 24.- El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el paso de poner en contacto se lleva a cabo i n vi tro . 25.- El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el paso de poner en contacto se lleva a cabo administrando al paciente una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica el péptido inmunogénico. 26.- Un método de inducción de una respuesta de células T citotóxicas contra un antígeno preseleccionado en un paciente» el método comprende poner en contacto una célula T citotóxica con un péptido inmunogénico de entre aproximadamente 9 y apro i adamente 15 residuos, que se une a ?n producto de gen HLA-A*GB01, con una constante de disociación de menos de aproximadamente 500 nM e induce una respuesta de células T citotóxicas, dicho péptido inmunogénico tiene una secuencia de 9 residuos que comprende un motivo de unión, del extremo N al extremo C, de la manera siguiente: un primer residuo sujetador primario en la segunda posición, seleccionado del grupo que consiste de A, L, I, V, M, S y T, y un segundo residuo sujetador primario en la novena posición, seleccionado del grupo que consiste de R y K; y un residuo sujetador secundario seleccionado del grupo que consiste de Y, F, W, S, T, o C en la primera posición, Y, F, W, L, I, V, o M en la quinta posición, Y, F, o W en la séptima posición, P en la octava posición, y cualquier combinación de los mismos. 27.- El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el péptido consiste de 9 a 10 residuos. 28.— El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el péptido se deriva de un antígeno viral, un antígeno asociado a tumor, ?n antígeno de parásito, o un antígeno de hongo. 29.- El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el paso de poner en contacto se lleva a cabo n vitro. 30.— El método de conformidad con la reivindicación

26, caracterizado porque el paso de poner en contacto se lleva a cabo administrando al paciente una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica el péptido nmunogénico. 31.- Una composición que comprende un péptido inmunogénico de entre aproximadamente 9 y apro i adamente 15 residuos que se une a por lo menos dos moléculas tipo HLA—A3, con una constante de disociación de menos de aproximadamente 500 nM, e induce una respuesta de células T citotóxicas, dicho péptido inmunogénico tiene una secuencia de 9 residuos que comprende un motivo de unión, del extremo N al extremo C, de la manera siguiente: un primer residuo sujetador primario en la segunda posición, seleccionado del grupo que consiste de A, L, I» V» M, S y T, y un segundo residuo sujetador primario en la novena posición, seleccionado del grupo que consiste de R y K; y uno o más residuos sujetadores secundarios seleccionados del grupo que consiste de Y» F o W en la tercera posición» Y» F o W en la sexta posición, Y, F o W en la séptima posición» P en la octava posición, y cualquier combinación de los mismos. 32.— Una composición que comprende un péptido in unogéníco de entre aproximadamente 9 y aproxi adamente 15 residuos que se une a un producto del gen HLA-A*0301» con una constante de disoc ación de menos de apro i adamente 500 nM, e induce una respuesta de células T citotóxicas, dicho péptido in ?nogénico tiene una secuencia de 9 residuos que comprende un motivo de unión, del extremo N al extremo C» de la manera siguiente: un primer residuo sujetador primario en la segunda posición, seleccionado del grupo que consiste de A, L, I» V» M» S y T, y un segundo residuo sujetador primario en la novena posición, seleccionado del grupo que consiste de R y K ; y uno o más residuos sujetadores secundarios seleccionados del grupo que consiste de R, H o K en la primera posición, Y, F, o W, en la tercera posición, P, R, H, K, Y, F o W en la cuarta posición, A en la quinta posición, Y, F, o W en la sexta posición, P en la octava posición, y cualquier combinación de los mismos.

33.- Una composición que comprende un péptido inmunogénico de entre aproximadamente 9 y apro imadamente 15 residuos que se une a un producto del gen HLA—A*1101, con una constante de disociación de menos de aproximadamente 500 nM, e 5 induce una respuesta de células T citotóxicas, dicho péptido inmunogénico tiene una secuencia de 9 residuos que comprende un & motivo de unión, del extremo N al extremo C» de la manera siguiente: un primer residuo sujetador primario en la segunda posición, seleccionado del grupo que consiste de A, L» I, V, M»

ÍO S y T , y un segundo residuo sujetador primario en la novena posición, seleccionado del grupo que consiste de R y K; y un residuo sujetador secundario seleccionado del grupo que consiste de A en la primera posición, Y, F, o W, en la tercera posición» Y, F, o W en la cuarta posición, A en la quinta k5 posición, Y, F, o W en la sexta posición, Y» F» o W en la séptima posición» P en la octava posición, y cualquier combinación de los mismos. 34.- Una composición que comprende un péptido inm?nogénico de entre aproximadamente 9 y aprox adamente 15

20 residuos que se une a un producto del gen HLA-A*3101, con una constante de disociación de menos de aproximadamente 500 nM, e induce una respuesta de células T citotóxicas, dicho péptido in unogém'co tiene una secuencia de 9 residuos que comprende un motivo de unión» del extremo N al extremo C» de la manera

25 siguiente: un primer residuo sujetador primario en la segunda posición, seleccionado del grupo que consiste de A, L, I, V, M,

S y T, y un segundo residuo sujetador primario en la novena posición, seleccionado del grupo que consiste de R y K; y un residuo sujetador secundario seleccionado del grupo que consiste de R, H, o K en la primera posición, Y, F, o W en la tercera posición, P en la cuarta posición, Y, F» o W en la sexta posición. Y, F, o W en la séptima posición» A o P en la octava posición» y cualquier combinación de los mismos. * 35.- Una composición que comprende un péptido inmunogénico de entre aproximadamente 9 y aproxi adamente 15

10 residuos que se une a un producto del gen HLA-A*3301, con una constante de disociación de menos de apro imadamente 500 nM» e induce una respuesta de células T citotóxicas» dicho péptido inmunogénico tiene una secuencia de 9 residuos que comprende un motivo de unión, del extremo N al extremo C, de la manera siguiente: un primer residuo sujetador primario en la segunda posición, seleccionado del grupo que consiste de A, L, I, V, M, S y T, y un segundo residuo sujetador primario en la novena posición, seleccionado del grupo que consiste de R y K; y un residuo sujetador secundario seleccionado del grupo que

20 consiste de Y, F, o W, en la tercera posición, A, Y, F, o W en la séptima posición, y cualquier combinación de los mismos. 36.- Una composición que comprende un péptido inmunogénico de entre aproximadamente 9 y aproximadamente 15 residuos que se une a un producto del gen HLA—A*6B01» con una

25 constante de disociación de menos de aprox madamente 500 nM, e induce una respuesta de células T citotoxicas, dicho peptido inmunogenico tiene una secuencia de 9 residuos que comprende un motivo de unión, del extremo N al extremo C, de la manera siguiente: un primer residuo sujetador primario en la segunda posición, seleccionado del grupo que consiste de A, L, I, V, M, 5 S y T, y un segundo residuo sujetador primario en la novena posición, seleccionado del grupo que consiste de R y K; y un ?g-| residuo sujetador secundario seleccionado del grupo que consiste de Y, F» W, S, T, o C en la primera posición, Y, F, W, L, I, V, o M en la quinta posición, Y, F, o W en la séptima

ÍO posición. P en la octava posición, y cualquier combinación de los mismos. 37.— Un método de identif cación de péptidos inmunogénicos que se unen a una molécula tipo HLA-A3 con una constante de disociación de menos de aproximadamente 500 nM» el método comprende los pasos de: seleccionar una secuencia de aminoácidos de una proteína antigénica para determinar la presencia del motivo de unión de las re vindicaciones 31» 32. 33, 34, 35 y 36; seleccionar una o más secuencias en la proteína antigénica que tengan el motivo de unión; preparar

20 péptidos de prueba de aproximadamente 8 y aproxi adamente 11 residuos que comprenden las subsecuencias seleccionadas; determinar la capacidad de los péptidos de prueba para unirse al producto de gen; identificar los péptidos con ?na constante de disociación de menos de 500 nM.