ES2312376T3 - Procedimiento para la fabricacion de 6-0-alfa-d-glucopiranosil-d-sorbitol. - Google Patents
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Abstract
Método para la fabricación enzimática de 6-O-alfa-D-glucanopiranosil-D-sorbitol (1,6-GPS) a partir de isomaltulosa, donde la isomaltulosa se incuba en una solución de reacción acuosa que contiene una unidad que presenta actividad de sorbitol-deshidrogenasa (SDH) y seguidamente se obtiene la 1,6-GPS de la solución de reacción.
Description
Procedimiento para la fabricación de
6-0-alfa-D-glucopiranosil-D-sorbitol.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la síntesis enzimática de
6-0-alfa-D-glucopiranosil-D-sorbitol
(a continuación 1,6-GPS) a partir de isomaltulosa o
sacarosa.
Se conocen procedimientos para la fabricación de
1,6-GPS a partir de sacarosa, que engloban una
conversión enzimática de la sacarosa en isomaltulosa y seguidamente
una hidrogenación química de la isomaltulosa obtenida que da lugar
a dos estereoisómeros 1,6-GPS y
1-0-alfa-D-glucopiranosil-D-manitol
(a continuación 1,1-GPM).
De la DE 44 14 185 C1 se conoce una
sacarosa-isomerasa, que cataliza la conversión de
sacarosa en isomaltulosa.
Schiweck (alimenta 19(1980),
5-16) publica la conversión enzimática de la
sacarosa en isomaltulosa y la posterior hidrogenación de la
isomaltulosa a base de catalizadores de Níquel Raney en Palatinit®
(conocido también como Isomalt), una mezcla casi equimolar de
1,6-GPS y 1,1-GPM. El documento
describe la fabricación de isomaltulosa por la transglucosidación
de la sacarosa a través del Protaminobacter rubrum. Además se
describe como en presencia de los catalizadores de níquel Raney la
isomaltulosa obtenida por los microorganismos se transforma
mediante la hidrogenación en 1,6-GPS y
1,1-GPM y seguidamente se puede enriquecer mediante
las cristalizaciones por enfriamiento y evaporación.
La DE 197 01 439 A1 publica un método para la
hidrogenación de la isomaltulosa por medio de un catalizador de
níquel enlazado al soporte, de manera que se obtienen mezclas de
1,6-GPS y 1,1-GPM.
La DE 197 05 664 A1 describe un procedimiento
para la fabricación de mezclas enriquecidas en cantidades de
1,6-GPS y 1,1-GPM. En este escrito
se habla de un método en el cual las mezclas enriquecidas de
1,6-GPS y/o 1,1-GPM se han
fabricado a base de isomaltulosa hidrogenada o de mezclas que
contienen isomaltulosa hidrogenada. Por medio de este procedimiento
es posible fabricar 1,6-GPS puro, de manera que se
puede concentrar y cristalizar por enfriamiento la lejía madre rica
en 1,6-GPS en determinadas condiciones.
La DE195 23 008 A1 publica un método para la
fabricación de 1,1-GPM y 1,6-GPS. El
documento describe los distintos catalizadores que se pueden
emplear para presiones inferiores a 50 atmósferas, de forma que por
hidrogenación de la isomaltulosa se obtienen mezclas de
1,6-GPS y 1,1-GPM. Los catalizadores
mencionados mediante los cuales reacciona la isomaltulosa contienen
rutenio, níquel y sus mezclas.
De la EP 0 625 578 B1 resultan métodos para la
obtención de mezclas de alcoholes de azúcar que contienen
1,1-GPM y 1,6-GPS debido a la
transposición enzimática de la sacarosa en isomaltulosa y
trehalulosa así como la hidrogenación posterior a
1,1-GPM, 1,6-GPS y
1,0-alfa-D-glucopiranosil-D-sorbitol
(1,1-GPS).
Los métodos en base a la tecnología son un
inconveniente por dos motivos. Por un lado con los métodos actuales
únicamente se obtienen mezclas de 1,6-GPS y
1,1-GPM, de las cuales se debe aislar la materia
interesada (1,6-GPS o bien 1,1-GPM)
según una técnica de separación química y física realmente costosa.
Por otro lado no es posible realizar todo el procedimiento de
transformación de la sacarosa en los productos finales deseados en
una única etapa. En la tecnología actual se requieren una serie de
procesos complicados para la fabricación del 1,6-GPS
a partir de la sacarosa, por lo que se tienen que llevar a cabo
diferentes etapas físicas, químicas y biológicas en distintos
reactores. Para la hidrogenación de la isomaltulosa según una
técnica actual se necesitan catalizadores, reactores de
hidrogenación especiales e hidrógeno técnico. Un inconveniente claro
de la hidrogenación conocida de la isomaltulosa en
1,6-GPS y 1,1-GPM reside también en
el gasto técnico necesario. A menudo se necesitan presiones de casi
50 hasta más de 100 atmósferas para la hidrogenación, lo que obliga
a un instrumento específico. Puesto que los productos obtenidos se
emplean en general en la industria de la alimentación, el método
además se debe elegir de forma que ningún material tóxico, por
ejemplo, los catalizadores, pueda ir a parar a los productos
finales de la reacción de hidrogenación. El producto creado es una
mezcla de los componentes esenciales 2,6-GPS y
1,1-GPM, de la cual se debe aislar la materia
interesada mediante métodos de purificación
químico-físicos. Para obtener
1,6-GPS y 1,1-GPM puros desde el
punto de vista químico, se requieren también unos procedimientos de
aislamiento y enriquecimiento costosos tras la hidrogenación
química. El rendimiento de estos procesos a menudo no es
suficientemente satisfactorio.
El problema técnico en el que se basa la
presente invención consiste en que es preciso preparar un método
que permita una fabricación selectiva, simple y económica de
1,6-GPS a partir de isomaltulosa.
La presente invención resuelve este problema
técnico preparando un método para la fabricación enzimática de
1,6-GPS a base de isomaltulosa, en el que se incube
la isomaltulosa en una solución de reacción acuosa que contenga una
unidad que presente actividad de la
sorbitol-deshidrogenasa (SDH) y se obtenga
1,6-GPS de la solución de reacción. La invención
permite además hidrogenar la isomaltulosa de forma bioquímica o
enzimática para dar la 1,6-GPS por medio de una
unidad que presente una actividad de la SDH. La unidad que presenta
la actividad de la SDH conforme a la invención reduce la
isomaltulosa de forma específica en 1,6-GPS. La
unidad que presenta la actividad de la SDH se caracteriza por el
hecho de que es capaz de que la isomaltulosa o la mezcla que la
contenga reaccione por vía enzimática para dar
1,6-GPS o una mezcla que la contenga. La ventaja de
la conversión enzimática de la isomaltulosa en
1,6-GPS reside no solo en que es un método simple
sino también en la elevada especificidad de la reacción, del
sustrato, la estereoespecificidad, así como la exclusividad del
producto de reacción, el ahorro de energía y materias primas y su
tolerancia ambiental.
La invención se refiere asimismo a la
sorprendente doctrina de que por medio de un método enzimático
específico se puede fabricar 1,6-GPS a partir de
isomaltulosa. Según la invención en una solución de reacción acuosa
que contiene una unidad que presenta la actividad de la sorbitol
deshidrogenasa (SDH), aparece el educto de isomaltulosa y se incuba
el tiempo suficiente hasta que se forma 1,6-GPS que
se puede obtener por ejemplo por medio de un método convencional
como la cristalización.
En relación con la presente invención, una
solución de reacción acuosa significa agua no tamponada o bien
tamponada por medio de un sistema tampón corriente, en la cual
existen según las condiciones de partida y de finalidad unos
aditivos como estabilizadores, indicadores, equivalentes de
reducción, medios de regeneración, componentes nutritivos, sales,
azúcares, alcoholes de azúcar etc...
En una configuración preferida de la invención,
la unidad que presenta la actividad de la SDH es la enzima SDH.
Para la reacción enzimática conforme a la invención de la
isomaltulosa en 1,6-GPS es posible que la unidad
que presente la actividad SDH, es decir la enzima SDH, se introduzca
en la solución de reacción en una forma enriquecida, purificada y/o
aislada, de manera que la enzima pueda ser, por ejemplo, de origen
natural. Naturalmente la SDH empleada conforme a la invención puede
ser también una SDH conforme a la invención fabricada mediante
ingeniería genética a partir de un organismo alterado
genotecnológicamente. Es preferible emplear la SDH aislada cuando
deben realizarse investigaciones respecto a la cinética de la
reacción de la isomaltulosa para dar la 1,6-GPS
con el fin de optimizar esta reacción. Especialmente todas las
cuestiones que se refieren al equilibrio químico de la reacción de
la isomaltulosa para dar 1,6-GPS exigen trabajar con
enzimas aisladas, puesto que la estequiometría, las constantes de
disociación, las cuestiones sobre la inhibición o activación del
enzima, los problemas de cooperatividad, la velocidad inicial, la
conformación de los ligandos y otros problemas de la cinética
enzimática y los datos de enlace que interesan no se pueden analizar
de forma suficientemente precisa. Sobre todo para influir en la
reacción de forma definitiva es preferible que la unidad que
presenta la actividad de la SDH se presente de forma aislada,
puesto que de lo contrario no se podrá excluir que debido a las
interacciones con otros componentes de la solución de reacción los
resultados del valor del pH, de la concentración de iones y de las
modificaciones de la temperatura no sean reproducibles, ya que las
enzimas purificadas, parcialmente purificadas y enlazadas a las
células presentan valores divergentes en la analítica.
Por consiguiente, existe también un método para
el aislamiento parcial o total de una SDH a base de microorganismos,
en particular de microorganismos de la especie de los
Gluconobacter, en particular del tipo Gluconobacter
suboxidans, donde en una primera etapa los microorganismos se
disgregan siguiendo un método corriente y se homogenizan para dar
un extracto bruto, en una segunda etapa tiene lugar una separación
del extracto bruto por medio de la cromatografía de intercambio
iónico, en una tercera etapa se produce una filtración en gel y en
una cuarta etapa tiene lugar una cromatografía de afinidad del
colorante. La enzima parcialmente purificada obtenida tras la
cromatografía de afinidad del colorante puede ser purificada por
medio de una cromatofocalización o bien otra configuración
preferida mediante otra cromatografía de afinidad del colorante con
elución posterior de la afinidad con al menos un equivalente de
reducción hacia la homogeneidad.
Existe también un procedimiento para el
aislamiento de la SDH a partir de un microorganismo, en el que el
microorganismo es disgregado en una primera etapa del proceso y
homogeneizado para dar un extracto bruto, en una segunda etapa del
proceso el extracto bruto obtenido es sometido a una cromatografía
de intercambio aniónico, en una tercera etapa del proceso es
sometido a una primera cromatografía de afinidad de los ligandos de
color y en una cuarta etapa del proceso es sometido a una segunda
cromatografía de afinidad de los ligandos de color. Es preferible
realizar una ultrafiltración después de la primera y antes de la
segunda cromatografía de afinidad de los ligandos de color. En
relación al método anteriormente mencionado, es decir después de la
segunda cromatografía de afinidad de los ligandos de color, se
prefiere llevar a cabo una elución de la afinidad de la SDH pura,
para lo cual se empleará un equivalente de la reducción, en
particular la NADH.
En otra configuración preferida, la unidad que
presenta la actividad de la SDH es un microorganismo vivo o muerto
o un extracto bruto o un homogeneizado del mismo que contiene la
SDH. La reacción conforme a la invención prevista en un modo
preferido se lleva a cabo con microorganismos muertos, en particular
desecados, en una configuración preferida de la presente invención
tras la rehidratación de esta en presencia de una solución de la
enzima SDH según métodos estándar, por ejemplo, añadiendo taninos
y/o glutaraldehido y se prefiero ya que la enzima soluble rodea
firmemente el microorganismo en una concentración elevada.
Naturalmente, la rehidratación se puede realizar también con agua o
bien se puede renunciar a una rehidratación especial, de manera que
los organismos muertos pasen directamente a la solución de reacción
acuosa. La reacción también prevista conforme a la invención de la
isomaltulosa con microorganismos vitales tiene entre otras cosas la
ventaja de que se puede realizar con un gasto proporcionalmente
bajo.
Los birreactores, en los cuales se emplean
microorganismos, se utilizan en todas partes y requieren en
comparación con las reacciones catalíticas químicas de la
isomaltulosa hacia la 1,6-GPS, un gasto energético y
de conservación mínimo. Naturalmente, las condiciones de la
reacción (valor del pH, concentración iónica, necesidad de
oxígeno/dióxido de carbono, elementos traza, temperaturas y otros)
se deben elegir de manera que los microorganismos sean capaces de
una reacción óptima de la isomaltulosa hacia la
1,6-GPS. En estas condiciones, la SDH puede
presentar una estabilidad y efectividad elevadas en un
micro-medio natural, es decir dentro de la célula,
similar al de la enzima aislada. Además en las condiciones
adecuadas puede ser posible una reproducción celular y por tanto un
aumento de la concentración de SDH. Frente a la tecnología actual,
según la cual se debe trabajar con catalizadores de fabricación
costosa e hidrógeno técnico, la reacción enzimática a través de
microorganismos presenta una ventaja significativa, en lo que se
refiere a la automatización y simplicidad así como calidad y
rendimiento del producto final del procedimiento.
Según la invención la configuración preferida
consiste en separar o juntar determinados compartimentos o partes
celulares unas con otras. Las estructuras de hidratos de carbono,
lípidos o proteínas y/o péptidos así como ácidos nucleicos, que son
capaces de influir positiva o negativamente en la unidad que
presenta la actividad de la SDH o bien en la enzima, pueden ser
purificadas o aisladas. Para evitar esta influencia o aprovecharla
con una intención determinada, se fabrican extractos brutos a partir
de los microorganismos. Esto se puede hacer mediante sonorización,
por compresión, homogenización, mezcla con bolitas de vidrio, a
través de detergentes, influencia de campos eléctricos, trabajo
mecánico en nitrógeno líquido o por digestión enzimática de la
membrana y de las paredes celulares. En otra etapa se puede
centrifugar el extracto obtenido para llevar a cabo la reacción
conforme a la invención con el sobrante o sedimento. La fabricación
del extracto bruto tiene además la ventaja de que mediante una
simple medición de la extinción se puede determinar la relación de
los ácidos nucleicos con la enzima. En unas condiciones de trabajo
determinadas, puede ser incluso necesario separar los ácidos
nucleicos, ya que estos complejos pueden formar complejos con la
unidad que presenta la actividad de la SDH y reducir así la
eficacia de la conversión de isomaltulosa en
1,6-GPS. La fabricación de un extracto bruto en el
sentido de la invención abarca todas las medidas para estabilizar un
extracto bruto o bien optimizar su acción catalítica. Entre ellas
se encuentran la adición de sulfato de protamina, cloruro de
manganeso y lisocima así como la modificación de la fuerza iónica y
todas aquellas medidas que sirven para modificar la actividad de la
proteasa del extracto bruto conforme a la invención de forma que se
estabilice la unidad que presenta la actividad de SDH y se optimice
su efecto.
En otra configuración preferida el
microorganismo o bien el organismo que contiene la SDH, del que
procede la SDH total o parcialmente purificada, es un organismo de
la especie Gluconobacter, especialmente la Gluconobacter
suboxidans, preferiblemente la Gluconobacter suboxidans DSM
2003. En particular en la combinación prevista preferiblemente
conforme a la invención con el sistema de regeneración del coenzima
SDH/FDH (formiato-deshidrogenasa) se ha de lograr
un rendimiento muy bueno de 1,6-GPS con las cepas
mencionadas. Sin embargo, la reacción enzimática a través de los
microorganismos no se limita en ningún caso a estas dos cepas. Se
puede emplear conforme a la invención el conjunto de organismos, en
particular de microorganismos que son capaces de transformar la
isomaltulosa en una o varias etapas en la 1,6-GPS,
conforme a la invención, por ejemplo, los hongos, levaduras,
cultivos celulares etc... Entre ellos se encuentran los mutantes,
las derivaciones de los organismos mencionados modificados
genotecnológicamente o sintetizados de otro modo o aislados, por
ejemplo, los organismos los cuales debido a que se introduce una
secuencia de nucleótidos que codifica la SDH presentan una
actividad de la SDH. Se prefieren aquellos organismos, que también
presentan una actividad de la sacarosa-mutasa, de
manera que por medio de un único tipo de organismo la sacarosa se
puede transformar por vía enzimática en la
1,6-GPS.
En otra configuración preferida se inmovilizan
las unidades que presentan la actividad de la SDH conforme a la
invención, en particular, los microorganismos, extractos naturales,
parte de los mismos y/o los enzimas enriquecidos o aislados.
Mediante la inmovilización, las enzimas, los organelos celulares y
las células se desplazan en un estado insoluble y delimitado por la
reacción. Conforme a la invención, la unidad que presenta la
actividad de la SDH en unas condiciones en las cuales presenta a ser
posible unas actividades elevadas de la enzima SDH, es
inmovilizada. Según la invención se ha previsto también la inclusión
de células vitales en los polímeros. La inmovilización puede
realizarse mediante el (i) enlace así como mediante (ii) la
inclusión. En una inmovilización del enlace de la unidad que
presenta la actividad de la SDH existen enlaces portadores (iónicos
o covalentes) y reticulaciones transversales (reticulación entre si
o reticulación con otros polímeros). En una inmovilización por
inclusión de la unidad que presenta la actividad de la SDH se ha
previsto la inclusión en estructuras de gel (bolitas, fibras y
similares) y en membranas (microcápsulas y reactores de membrana).
Por inmovilización se entienden todos los métodos que sirven para
delimitar la movilidad y solubilidad de la unidad que presenta la
actividad de la SDH desde un punto de vista biológico, químico o
físico. Esto se puede realizar por adsorción en materiales
portadores inorgánicos o bien orgánicos, cargados eléctricamente o
inertes, donde los materiales inorgánicos por ejemplo son vidrios
porosos, gel de sílice, óxido de aluminio e
hidroxi-apatita o bien óxidos metálicos; los
polímeros naturales pueden ser, por ejemplo, celulosa, almidón,
dextrano o agarosa y los polímeros sintéticos pueden ser
poliacrilamida, alcohol de polivinilo, nylon o bien otros. También
se ha previsto que la unidad que presenta la actividad de la SDH se
incluya en una red tridimensional; en una configuración de la
invención, ésta puede ser gelatina o agar. Además se puede prever la
inmovilización por medio de la reticulación transversal con agentes
bifuncionales como el glutaraldehido o la bencidina. También es
posible una microencapsulación de la unidad que presenta la
actividad de la SDH, que conduce a la limitación del espacio de la
reacción con ayuda de membranas biológicas o artificiales. La
invención abarca también una inmovilización sin soporte a través de
la floculación y reticulación así como una
co-inmovilización de células vivas y/o muertas
coenzimas libres o inmovilizadas. También el aumento del peso
molecular, por ejemplo mediante el enlace al dextrano sirve para
inmovilizar en el sentido de la invención. En el caso de la enzima
inmovilizada, puede tratarse de una enzima que está unida a los
compartimentos de un microorganismo o bien a un microorganismo seco
o vital que se obtiene en su totalidad, sin embargo en el sentido de
la invención puede significar también que la enzima sola o la
enzima en unión a los compartimentos del organismo está enlazada a
un soporte. Resulta significativo que la matriz cargada se pueda
poner en contacto con la isomaltulosa de manera que transcurra la
reacción enzimática deseada dando el 1,6-GPS.
Naturalmente la invención se refiere también a la utilización de la
mencionada unidad que presenta la actividad de la SDH en una forma
libre, es decir no inmovilizada.
En otra forma de configuración preferida se
realiza la conversión enzimática conforme a la invención con o sin
regulación del pH. En particular, puesto que en la forma de
configuración preferida se emplean equivalentes de reducción en
forma de transmisores de hidrógeno, la elección del valor del pH
influye en el equilibrio de la reacción química así como en el
rendimiento total de 1,6-GPS. Por consiguiente, la
reacción enzimática de la isomaltulosa para dar
1,6-GPS puede dividirse en reacciones en las cuales
no se realiza ninguna comprobación del valor del pH y en las que si
se realiza una regulación del pH. La regulación del valor del pH se
puede realizar mediante la adición o eliminación de sustancias, que
son capaces de elevar, disminuir o estabilizar el valor del pH.
Conforme a la invención se pueden emplear ácidos o bases conforme a
la definición de Lowry-Brönsted o
Lewis-Pearson, donde se ceden o se ponen a
disposición o bien pueden ser absorbidos los protones, iones
hidronio, iones hidróxido o pares de electrones libres. Por ejemplo,
se puede prever una gasificación de la solución de reacción acuosa
con CO_{2}, que es una medida para regular el pH como la
introducción de un ácido. Preferiblemente, se puede aspirar a que
el valor del pH se ajuste en una zona, que se ha previsto como
óptima para la actividad de la enzima. Este pH óptimo se puede
alcanzar mediante distintos tampones o por la adición de sustancias
que reduzcan o incrementen el valor del pH. Sin embargo en conjunto
la regulación del valor del pH se limita sin duda alguna a un
procedimiento químico como, por ejemplo, los procesos de formación
de complejos, valoraciones o similares. Cada ataque al sistema que
conduce a que el valor del pH se regule o estabilice de algún modo,
sirve como proceso para regular el valor del pH. En una
configuración preferida de la invención,
el valor del pH de la solución de reacción acuosa se sitúa preferiblemente entre 6,0 y 8,0, en particular a 7,0.
el valor del pH de la solución de reacción acuosa se sitúa preferiblemente entre 6,0 y 8,0, en particular a 7,0.
En una configuración preferida de la invención
se añaden a la solución de reacción acuosa además de una unidad que
presenta la actividad SDH equivalentes de reducción, en particular
si se emplea SDH purificada y aislada. Los equivalentes de
reducción en el sentido de la presente invención son transmisores de
hidrógeno o portadores de electrones, que se pueden presentar en
forma de coenzimas o grupos prostéticos. Dichos equivalentes de
reducción pueden ser, por ejemplo, NAD^{+}/NADH, NADP-/NADPH,
FMN/FMNH_{2} o bien FAD/FADH_{2}. Las coenzimas y grupos
prostéticos de las reacciones de óxido reducción sirven como
transmisores de electrones y/o hidrógeno enlazados firmemente a las
proteínas y/o disociables. Sin embargo, como equivalentes de
reducción pueden servir también otros grupos de
coenzimas/prostéticos que sean capaces de transferir los átomos de
hidrógeno o los electrones. Según la invención se prefieren en
particular los tetrapirroles cíclicos, el glutatión, ácido
lipónico, quinona, proteínas de hierro-azufre, flavo
proteínas, nucleótidos de flavina y otros, que durante la catálisis
enzimática pueden transferir protones, átomos y/o electrones o bien
grupos funcionales.
Preferiblemente, para la fabricación enzimática
de 1,6-GPS se emplearán células que presentan la
actividad SDH viva, de manera que no se necesite la adición de
equivalentes de reducción.
En otra configuración especialmente preferida la
reacción enzimática se realiza a partir de isomaltulosa para dar
1,6-GPS en presencia de medios de regeneración como
la formiato-deshidrogenasa (FDH) y/o la formiato,
en particular si se emplea SDH aislado y purificado. Mediante la
adición de SDH y FDH a la solución de reacción acuosa es posible
una reacción química, mientras el formiato permanente pasa a
CO_{2} y la isomaltulosa a 1,6-GPS. La conversión
de formiato en CO_{2} se realiza sobre FDH. Los átomos de
hidrógeno absorbidos en esta oxidación de un medio de reducción
existente asimismo en la solución de reacción, por ejemplo
NAD^{+}, son empleados en la reducción que tiene lugar en
paralelo de la isomaltulosa en 1,6-GPS. Naturalmente
se pueden plantear en lugar de la FDH otras deshidrogenasa o
enzimas con otras especificidades de sustrato como coenzimas del
sistema de regeneración, es decir como medios de regeneración. Por
ejemplo, se emplearán otros ácidos carboxílicos o bien sus sales
como medios de regeneración. Tiene importancia el que las sustancias
que se van a añadir, en particular el FDH/formiato, sean capaces de
reaccionar con coenzimas o grupos prostéticos transmisores de
hidrógeno, de manera que los electrones y/o átomos de hidrógeno sean
transferidos por lo que sea posible la continuada creación de
1,6-GPS. En el caso de utilizar células vivas como
unidad que presenta la actividad SDH puede cesar la adición del
medio de regeneración y de los equivalentes de reducción.
En otra configuración especialmente preferida la
conversión de isomaltulosa en 1,6-GPS se realiza en
el ámbito de un proceso continuo. El proceso continuo de la
invención se puede llevar a cabo en un reactor irrigado en el que
tenga lugar el crecimiento microbiano y por tanto la formación del
producto, la síntesis de 1,6-GPS. De este modo se
pueden fabricar cantidades muy grandes de 1,6-GPS.
Mediante la utilización del proceso continuado los ciclos de
limpieza y de preparación son opcionales y no vienen dados por los
parámetros de fermentadores específicos o bien determinadas
propiedades fisiológicas de los microorganismos, puesto que en un
sistema continuado el medio que rodea los microorganismos no cambia
debido a los sustratos agotados y a los productos creados, porque
los productos son evacuados de forma constante y los sustratos
alimentados también de forma constante. Además los birreactores o
las instalaciones en un proceso continuo son mucho más pequeños y
económicos. Por un proceso continuo se entiende en el sentido de la
invención todas las medidas complementarias que sirven para evitar
el peligro de infección por otros organismos que se pueden dispersar
al colarse el sustrato rápidamente en el sistema. Esto puede
incluir condiciones estériles o no estériles. La presente invención
se refiere también a las medidas y medios del proceso que sirven
para configurar la fermentación continuada en caso de condiciones
extremas, que se mantienen estables debido a posibles infecciones
como consecuencia de las condiciones extremas elegidas (por
ejemplo, tampones para un valor de pH muy bajo o empleo de
antibióticos). Por lo que se pueden emplear variaciones o
modificaciones de las unidades que presentan la actividad SDH
anteriormente mencionada, que se adaptan a estas condiciones
causantes de la infección, por ejemplo, microorganismos resistentes
a los antibióticos. Por un procedimiento continuo en el sentido de
la invención se puede entender también cualquier sistema de células
que crecen y de enzimas catalizadoras, que por un lado es alimentado
por una solución nutritiva y por otro se extrae una solución de
cultivo, que incluye el 1,6-GPS formado
enzimáticamente; por lo que pueden existir sistemas homogéneos y no
homogéneos.
La invención se refiere naturalmente también a
formas de actuar del proceso semicontinuadas o de tipo
discontinuo.
En otra configuración preferida se fabrica la
isomaltulosa que es la materia de partida para la reacción de
conversión a 1,6-GPS, mediante la transformación
enzimática de la sacarosa. La isomaltulosa empleada en el método
conforme a la invención puede ser fabricada a partir de la sacarosa
mediante una conversión o transformación enzimática
(transglucosidación) por medio de enzimas enriquecidos o
purificados, extractos brutos o microorganismos, que presentan una
actividad de la sacarosa-mutasa. En relación con la
presente invención, por sacarosa-mutasa se entiende
una enzima, que es capaz de isomerizar la sacarosa a isomaltulosa y
se conoce también como sacarosa-isomerasa.
Ejemplos de células, que contienen secuencias de
nucleótidos codificadas para una proteína con actividad de la
sacarosa-mutasa, son en particular los
microorganismos de las especies Protaminobacter, Erwinia,
Serratia, Leuconostoc, Pseudomonas, Agrobacterium, Klebsiella y
Enterobacter. Los ejemplos específicos de dichos microorganismos
son la Protaminobacter rubrum (CBS 547,77), Erwinia
rhapontici (NCPPB 1578), Serratia plymuthica (ATCC
10830a), Pseudomonas mesoacidophila
MX-45(FERM 11808 o bien FERM BP 3619),
Agrobacterium radiobacter MX-232 (FERM 12397
o bien FERM BP 3620), Klebsiella subspecies y Enterobacter
species.
Ejemplos específicos de proteínas con actividad
de sacarosa-mutasa y ácidos nucleicos codificados
para ello de P. rubrum, E. rhapontici, Enterobacter spec. SZ62 y
P. mesoacidophila se han descrito en PCT/EP 95/00165.
Las mencionadas células o proteínas o secuencias
de nucleótidos de estas células pueden ser empleadas con una unidad
de la presente invención que presente la actividad SDH para la
fabricación de 1,6-GPS a partir de sacarosa, por
ejemplo, en las células mencionadas se introducen y expresan
secuencias de nucleótidos que codifican la SDH bajo el control de
unidades reguladoras.
En una configuración especialmente preferida la
conversión enzimática de la sacarosa en isomaltulosa se realiza
preferiblemente por medio de células P. rubrum (Protaminobacter
rubrum) o bien de una disgregación celular o extracto bruto de
P. rubrum o por medio de sacarosa-mutasa
parcial o totalmente purificada (también
sacarosa-isomerasa). Esta reacción se produce
preferiblemente junto a la reacción dependiente de la SDH de
isomaltulosa en 1,6-GPS en una solución de
reacción.
La transposición enzimática de la sacarosa en
isomaltulosa se ha descrito por ejemplo en la DE 195 23 560 A1 o en
la DE 44 14 185 C1, que se incluyen en el contenido expuesto de la
presente comunicación en cuanto a los microorganismos allí
expuestos, las secuencias de ADN, las enzimas y el método para
fabricar la isomaltulosa mediante la conversión enzimática de la
sacarosa.
La inmovilización de las células que presentan
sacarosa-mutasa, por ejemplo P. rubrum, de
los disgregados celulares de las mismas o bien de la enzima aislada
(sacarosa-mutasa) sirve para limitar la movilidad y
solubilidad de los biocatalizadores empleados en la vía biológica,
química o física. La inmovilización en el sentido de la invención
puede realizarse siguiendo diferentes métodos, como por ejemplo, el
enlace de los biocatalizadores entre sí o bien a las sustancias
portadoras, mediante la fijación en la red de una matriz polimérica
o bien mediante el cercado con membranas artificiales o naturales,
lo que naturalmente incluye el empleo de micelas inversas. Mediante
la inmovilización de las células, los disgregados celulares o/y la
sacarosa-mutasa, los biocatalizadores así
producidos no solo se utilizarán de nuevo, pueden sobre todo después
o durante el proceso separarse fácilmente para si fuera preciso ser
sustituidos por otros catalizadores que catalizan las otras
reacciones como la reacción de la isomaltosa para dar
1,6-GPS. Una ventaja esencial es que las células o
las enzimas se pueden utilizar por la inmovilización en
concentraciones locales muy superiores y sobre todo en sistemas de
flujo continuo. La inmovilización se puede realizar sobre soportes
de cerámica, sobre polímeros, sobre distintos geles y gelatinas,
por su inclusión en poliacrilamida o bien por otros métodos.
En otra configuración preferida la conversión de
sacarosa en isomaltulosa y de isomaltulosa en
1,6-GPS se realiza en una única etapa, es decir
ambas reacciones de conversión enzimáticas transcurren al mismo
tiempo o casi al mismo tiempo y en la misma solución de reacción
acuosa. La conversión de sacarosa en 1,6-GPS puede
efectuarse pues en una etapa, ya que ambas reacciones de conversión
pueden transcurrir por vía enzimática en las mismas o prácticamente
las mismas condiciones.
En otra configuración preferida la conversión de
sacarosa en 1,6-GPS se realiza en un único
birreactor (llamada "reacción única").
Estas configuraciones de la invención engloban
la fabricación enzimática directa de 1,6-GPS a
partir de sacarosa, donde tanto para la reacción de la sacarosa en
isomaltulosa como también de isomaltulosa en 1,6-GPS
se pueden emplear las mencionadas células no inmovilizadas e
inmovilizadas, los extractos en bruto y/o las enzimas, que presentan
respectivamente actividades de SDH y de
sacarosa-mutasa.
Según la invención, la conversión es también
posible en una fermentación discontinua, donde el medio nutritivo
es inoculado hasta un tiempo determinado y la fermentación finaliza
tras el consumo del sustrato limitante, que por ejemplo puede ser
sacarosa, otros sustratos o enzimas/coenzimas. Las condiciones de la
reacción se podrán elegir de manera que la influencia limitante de
un sustrato quede ampliamente excluida. Las reacciones discontinuas
se pueden llevar a cabo en un sistema llamado cerrado. Estos
sistemas se conocen también según la invención como cerrados,
cuando la fase líquida cerrada es alimentada de forma continuada por
hidrógeno, aire o bien otro gas o mezcla de gases. En un proceso
discontinuo el entorno de las células varía de forma constante,
puesto que se puede llegar a una disminución del sustrato y también
a un aumento de 1,6-GPS y en ciertas circunstancias
también a un incremento de la concentración celular. El "proceso
único" previamente mencionado puede ser llevado a cabo en el
sentido de la invención incluso manteniendo un equilibrio de flujo
con una evacuación permanente de 1,6-GPS como
catálisis continuada de las enzimas.
En otra configuración preferida la temperatura
de la solución de reacción acuosa para una conversión enzimática se
sitúa entre 20ºC y 40ºC, en particular 25ºC. A temperaturas de 25ºC
la SDH purificada presenta una estabilidad de aproximadamente una
semana. Por tanto las temperaturas alrededor de esta zona son muy
adecuadas para realizar procedimientos catalíticos enzimáticos a
largo plazo.
En otra configuración preferida la invención
hace referencia a un método para fabricar 1,6-GPS a
partir de sacarosa, donde la sacarosa se convierte primero de forma
enzimática en isomaltulosa y a continuación la isomaltulosa se
transforma en una reacción enzimática en 1,6-GPS.
Este proceso puede transcurrir de forma continua, semicontinua o no
continua, en una o varias etapas del proceso en uno o varios
birreactores.
También existe una molécula de ácido nucleico
que codifica una enzima con la actividad de una
sorbitol-deshidrogenasa (SDH), elegida del grupo
formado por
a) Moléculas de ácido nucleico que codifican una
proteína que presenta la secuencia de aminoácidos que se indica en
SEQ ID Nr. 1 o bien una ramificación complementaria de la misma;
b) Moléculas de ácido nucleico que abarcan una
secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID Nr. 2 o bien una
ramificación complementaria de la misma;
c) Moléculas de ácido nucleico, que son
hibridadas con una molécula de ácido nucleico conocida por a) ó
b);
d) Moléculas de ácido nucleico, cuya secuencia
de nucleótidos difiere de la secuencia de la molécula de ácido
nucleico mencionada en b) ó c).
En relación con la presente invención se
entiende por una enzima con una actividad
sorbitol-deshidrogenasa a una proteína o péptido
que es capaz de catalizar la transformación de la isomaltulosa en
1,6-GPS. La isomaltulosa que se va a transformar
procede de la sacarosa.
Las moléculas de ácido nucleico pueden ser
aisladas de fuentes naturales, preferiblemente de la
Gluconobacter spec., o bien pueden ser sintetizados por
métodos conocidos. Por medio de técnicas de biología molecular es
posible incorporar mutaciones de diferente tipo a las moléculas de
ácido nucleico, donde se produce la síntesis de enzimas con
propiedades biológicas ligeramente modificadas, que asimismo son
abarcadas por la invención. Las mutaciones en el sentido de la
invención incluyen también todas las mutaciones por eliminación,
que conducen a enzimas reducidas. Mediante otros mecanismos
moleculares como las inserciones, duplicaciones, transposiciones,
fusiones genéticas, intercambio de nucleótidos pero también por
transferencia genética entre las distintas fuentes de
microorganismos se puede llegar a modificaciones de la actividad de
la enzima y/o de la regulación de la enzima. De este modo se pueden
fabricar, por ejemplo, enzimas mutantes que poseen un valor
K_{m}, K_{i} ó K_{a} alterado y/o ya no sucumben a los
mecanismos de regulación presentes normalmente en las células.
Además se pueden fabricar enzimas mutantes, que presentan un perfil
de actividad, temperatura, valor del pH y/o concentración. Existen
además enzimas que presentan una concentración enzimática activa
alterada, una estructura modificad de subunidades, modificaciones
pre- y pos-traslacionales, por ejemplo, péptidos de
señalización y/o transporte y/o otros grupos funcionales.
Se dan también moléculas de ácido nucleico que
son hibridadas con las mencionadas moléculas de ácido nucleico
conforme a la invención. Hibridación equivale a una hibridación en
unas condiciones convencionales de hibridación, como las descritas
en Sambrook y cols. (Molecular Cloning. A laboratory manual, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 2ª edición 1989), preferiblemente
en condiciones astringentes. Se habla de una hibridación cuando
después de lavar durante una hora con 1xSCC y 0,1% de SDS a 55ºC,
preferiblemente a 62ºC y en particular a 68ºC, incluso se observa
una señal de hibridación positiva. Una secuencia de nucleótidos
hibridada en estas condiciones de lavado con una de las secuencias
de nucleótidos indicada en los protocolos de secuencias es una
secuencia de nucleótidos que está relacionada con la invención.
Una identificación y un aislamiento de este tipo
de moléculas de ácido nucleico se pueden realizar empleando las
moléculas de ácido nucleico conforme a la invención o bien partes de
estas moléculas o bien de la ramificación complementaria. Como
muestra de hibridación se pueden emplear, por ejemplo, moléculas de
ácido nucleico que presentan exactamente la secuencia de
nucleótidos o partes de esta secuencia representada en la SEQ ID Nr.
2. En los fragmentos empleados como muestra de hibridación se puede
tratar de fragmentos sintéticos que son fabricados con ayuda de
técnicas normales de síntesis y cuya secuencia coincide
esencialmente con la de una molécula de ácido nucleico. Las
moléculas hibridadas con las moléculas de ácido nucleico conforme a
la invención abarcan también fragmentos, derivados y variantes
alélicas de la molécula de ácido nucleico anteriormente descrita,
que codifican una enzima conforme a la invención. Por
"fragmentos" se entienden partes de la molécula de ácido
nucleico que son suficientemente largas para codificar la enzima
descrita. La expresión "derivado" significa en relación con la
invención, que las secuencias de estas moléculas difieren de las
secuencias de la molécula de ácido nucleico anteriormente descrita
en una o varias posiciones, pero presentan un elevado grado de
homología con estas secuencias. Homología significa pues una
identidad de secuencia de cómo mínimo un 40%, en particular de una
identidad de al menos un 60%, preferiblemente más de un 80% y en
particular sobre un 90, 95, 97 o 99% a nivel de ácido nucleico. Por
lo que las enzimas codificadas por estas moléculas de ácido nucleico
presentan una identidad de secuencia con respecto a la secuencia de
aminoácidos que se indica en SEQ ID Nr.1 de al menos un 80%,
preferiblemente un 85% y en particular más de un 90%, 95%, 97% y 99%
a nivel de aminoácido. Las desviaciones con respecto a las
moléculas de ácido nucleico anteriormente descritas se pueden
formar, por ejemplo, por deleción, sustitución, inserción o
recombinación. Se puede tratar de variaciones que aparecen de forma
natural, por ejemplo, de secuencias de otros organismos o bien de
mutaciones donde estas mutaciones pueden aparecer de forma natural
o bien por mutagénesis bien definida (rayos UV o rayos X, agentes
químicos u otros). Además en el caso de variaciones puede tratarse
de secuencias fabricadas sintéticamente. Para variantes alélicas se
puede tratar de variantes que aparecen de forma natural, así como
también fabricadas de forma sintética o bien variantes producidas
mediante técnicas ADN recombinantes. Las enzimas codificadas por
diferentes variantes de la molécula de ácido nucleico presentan
determinadas características como la actividad de las enzimas la
concentración enzimática activa, las subunidades, las modificaciones
pos-traslacionales, los grupos funcionales, el peso
molecular, la reactividad inmunológica, la conformación y/o las
propiedades físicas, como el comportamiento en la electroforesis en
gel, el comportamiento cromatográfico, los coeficientes de
sedimentación, la solubilidad, las propiedades espectroscópicas, la
estabilidad, el valor del pH óptimo, el valor del pH isoeléctrico,
el valor óptimo de la temperatura y otros.
En el caso de las moléculas de ácido nucleico se
puede tratar de moléculas de ADN pero también de ARN. Las moléculas
de ADN conforme a la invención son moléculas genómicas de ADN o de
cADN.
Además existen vectores que contienen estas
moléculas de ácido nucleico. Se trata preferiblemente de plasmidas,
cosmidas, virus, bacteriófagos, vectores Shuttle y otros vectores
convencionales en la genotecnología. Los vectores pueden poseer
otras unidades de funcionamiento, que produzcan una estabilización
y/o replicación del vector en un organismo huésped.
Se dan también vectores en los cuales la
molécula de ácido nucleico se enlaza de forma operativa al menos a
un elemento regulador, que garantiza la transcripción y síntesis de
moléculas de ácido nucleico trasladables a pro- y/o células
eucarióticas. Este tipo de elementos reguladores pueden ser
promotores, incrementadotes, operadores y/o señales de terminación
de la transcripción. Naturalmente los vectores pueden contener los
elementos necesarios para su estabilidad y/o replicación así como
genes de resistencia a los antibióticos, o marcadores de
selección.
Los vectores mencionados pueden contener una
secuencia de ácido nucleico que está bajo el control de un elemento
regulador, que codifica una SDH, una secuencia de ácido nucleico que
está asimismo bajo el control de al menos un elemento regulador que
codifica una sacarosa-mutasa. Otro vector de este
tipo presenta también la información genética para ambos enzimas,
que son necesarias para la conversión enzimática de sacarosa a
través de la isomaltulosa en 1,6-GPS. Dichos
vectores permiten de forma simple que un organismo huésped se
aproveche del aparato metabólico para transformar la sacarosa por
vía enzimática en una etapa del proceso en
1,6-GPS.
Se dan también células huésped que contienen una
de las moléculas de ácido nucleico o uno de los vectores o bien son
transformadas por éste y preferiblemente son capaces de expresar la
SDH y si fuera preciso la sacarosa-mutasa así como
más preferiblemente so capaces de fabricar la
1,6-GPS a partir de isomaltulosa o bien sacarosa.
Además son todas las células huésped que proceden de una célula
huésped transformado por las moléculas de ácido nucleico o los
vectores. Es decir células huésped que contiene la molécula de ácido
nucleico o los vectores, de forma que por una célula huésped se
entiende un organismo que es capaz de absorber in vitro las
moléculas de ácido nucleico recombinante y si fuera preciso
sintetizar las enzimas codificadas por las molécula de ácido
nucleico. Preferiblemente se trata de células procarióticas o
eucarióticas. Se trata sobre todo de microorganismos, que contienen
vectores, derivados o partes de vectores, que los capacitan hacia
una síntesis de enzimas para la fabricación de
1,6-GPS a partir de isomaltulosa o de sacarosa. La
célula huésped se puede caracterizar también por que la molécula de
ácido nucleico introducida es o bien heterogénea en cuanto a la
célula transformada, es decir no aparece de forma natural en esta
célula, o bien se localiza en otro lugar o en otro número de copias
en un genoma que la secuencia correspondiente de aparición
natural.
natural.
Esta célula es una célula procariótica,
preferiblemente una célula procariótica
gram-negativa, en particular una célula
enterobacteriana. Por lo que por un lado se puede emplear una célula
que no contenga ningún gen SDH y/o de
sacarosa-mutasa, por ejemplo la E. coli, pero
por otro lado se pueden emplear también células que contengan uno o
dos de dichos genes en su cromosoma. Los ejemplos preferidos de
células procarióticas adecuadas son las células E. coli,
Protaminobacter rubrum, Erwinia rhapontici, Enterobacter spec. O
bien Pseudomonas mesoacidophila, la transformación de las
células procarióticas con secuencias exógenas de ácido nucleico es
bien conocida por el experto en el campo de la microbiología.
Sin embargo, la célula puede ser también una
célula eucariótica, como una célula de hongo (por ejemplo, la
levadura) o bien una célula animal. Los métodos para la
transformación o bien transinfección de células eucarióticas con
secuencias exógenas de ácido nucleico son asimismo bien conocidos
por el experto en el campo de biología molecular.
Se dan también cultivos celulares que presentan
al menos una de las células huésped, donde el cultivo celular es
especialmente capaz de producir una SDH y si fuera preciso una
sacarosa-mutasa.
En relación a la invención existe también un
método para la fabricación de una SDH, donde la célula huésped es
cultivada en un medio de cultivo en unas condiciones tales que
permite la formación de SDH y su obtención.
En relación con la invención existen también
proteínas, que son codificadas por las moléculas de ácido nucleico
así como métodos para su fabricación, donde la célula huésped es
cultivada en unas condiciones que permiten la síntesis de la
proteína y a continuación la proteína es aislada de las células
cultivadas y/o del medio de cultivo.
En relación con la invención existen también
anticuerpos monoclonales y policlonales, que son capaces de
identificar una estructura de una unidad que presenta la actividad
SDH conforme a la invención, y si fuera preciso de enlazarse a
ella. Esta estructura puede ser una proteína, hidrato de carbono así
como también un complejo lipídico y/o glucolipídico, que está en
relación de forma específica con la unidad que presenta la SDH. Se
puede tratar de anticuerpos que se dirigen contra estructuras que se
mencionan como modificaciones traslacionales de la SDH. Resulta
significativo el que una estructura espacial de nubes de electrones
pueda ser identificada por medio de anticuerpos de manera que sean
posibles conclusiones de la unidad que presenta propiedades
biológicas, químicas y físicas de la actividad de la SDH.
Se puede tratar de anticuerpos que interaccionan
con los anticuerpos mencionados, en particular pueden identificarlos
y enlazarse a ellos.
Se puede tratar de los anticuerpos mencionados,
que han sido modificados por vía biológica, química y física.
La invención se puede aclarar con ayuda de los
ejemplos y figuras correspondientes.
Las figuras muestran:
Figura 1 y un mapa del plásmido del Plásmido
pBtac 2
Figura 2 un mapa del plásmido pHWG 467
SEQ ID Nr. 1 muestra la secuencia de aminoácidos
que incluye 262 aminoácidos de SDH
SEQ ID Nr. 2 muestra la secuencia de nucleótidos
que incluye 789 nucleótidos de SDH
SEQ ID Nr. 3 hasta 9 muestran secuencias
parciales de aminoácidos de la SDH
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
1
Para poder disponer de suficiente biomasa de
Gluconobacter suboxidans DSM 2003, se fermentaba la cepa a
escala de laboratorio. Se empleaba como medio 1:
D-manitol 850 g/L), peptona de caseína (10 g/L),
extracto de levadura (5 g/L) y CaCO_{3} (20 g/L). El medio 2 se
componía de lo siguiente: D-manitol (75 g/L),
peptona de caseína (16 g/L), extracto de levadura (8 g/L) y
CaCO_{3} (1 g/L). Como cultivo previo se suspendía una conserva
liofilizada de la cepa Gluconobacter suboxidans DSM 2003 en 1
ml de medio 1, se extendía sobre una placa de agar con medio 1 y se
cultivaba durante 72 h a 25ºC. Una inoculación del cultivo de las
placas de agar se sumergía en 25 ml del medio 1 y se cultivaba en
un matriz de agitación durante 48 h a 25ºC. EL cultivo designado
como primer pre-cultivo se cultivaba entonces en 250
ml de medio 1 en un matraz de agitación (volumen 1 L) durante 48 h
a 25ºC. El cultivo obtenido de esta forma denominado como segundo
pre-cultivo, servía de inoculo para la
fermentación.
Para la fermentación se transfería el segundo
pre-cultivo del frasco de agitación a un volumen de
15 L de medio 2 en un fermentador de 20 L y se cultivaba a 25ºC en
las condiciones siguientes:
Valor del pH: 6,9 (se mantiene constante por la
valoración con NAOH 5N)
Velocidad de agitación: 350 U/min y
Saturación de oxígeno: 40%
Las condiciones mencionadas se mantienen
constantes durante la fermentación. La fermentación finalizaba con
el final del crecimiento celular - que venía establecido por el
consumo de sustrato mediante HPLC.
\newpage
La masa celular así obtenida se cultivaba
mediante centrifugación (8000 x g, 20 min, 4ºC) y se lavaba con una
solución de NaCl al 0,9% y se diluía en tris-tampón
50 mM (pH 7,0) y a continuación se incluía en un proceso
French-Press. Las ramificaciones celulares formadas
se separaban por ultracentrifugación (110.000 x g, 20 min, 4ºC). El
sobrenadante claro - el llamado extracto en bruto - se empleaba
rápidamente o se almacenaba a -30ºC
\vskip1.000000\baselineskip
Para la limpieza de la SDH se elegía el
siguiente esquema de tres fases:
Fase
1
El extracto bruto se aplicaba a una columna
(2,6x9 cm) de Sepharose-DEAE equilibrada de tampón
tris/HCl 50 mM (pH 7,0) y se eluía con un gradiente lineal de NaCl
0,0-0,5 M en tampón tris/HCl 50 mM (pH 7,0) y a una
velocidad de flujo de 50 cm/h. La SDH podía ser eluida en NaCl 0,2
M.
Fase
2
Una columna de cromatografía de afinidad de los
ligandos de color se preparaba del modo siguiente: (i) se empleaba
un gel de Sepharose 4B-CL como matriz (Boyer, P.M. y
Hsu, J.T.(1993) In:Fiechter, A(ed.), Advances in Biochemical
engineering, 49, 1-44) y (ii) se inmovilizaba el
colorante azul 160 (Blue H-ERD) según el método
Neuhauser, W. et al., 1997 (Biochem. J., 326,
683-692). De lo que se empleaban 10 mg de colorante
por 1 ml de gel. Las fracciones que contienen SDH recogidas de la
fase 1 se dializaban y se aplicaban a la columna de ligandos de
color (2,6x7,0 cm, equilibrada con tampón tris/HCl 50 mM, pH 7,0)
(aprox. 2-5 mg de proteína/mL de gel). La proteína
absorbida se eluía con un gradiente lineal de NaCl
0,0-0,5 M en tampón tris/HCl 50 mM, pH 7,0 y a una
velocidad de flujo de 2,0 mL/min. La SDH podía ser eluida en NaCl
0,1 M.
Fase
3
Las fracciones activas recogidas de la fase 2 se
dializaban y concentraban mediante ultrafiltración y de nuevo se
aplicaban a una columna de ligandos de color (2,6x7,0 cm,
equilibrada con tampón tris/HCl 50 mM, pH 7,0) de manera que aprox.
0,5 mg de proteína se aplicaban a 1 mL de gel. La elución por
afinidad de la SDH pura se llevaba a cabo con NaDH 10 mM en tampón
tris/HCl 20 mM, pH 7,0 a una velocidad de flujo de 10 cm/h. La NaDH
se separaba a continuación mediante una diálisis.
La SDH purificada se puede almacenar durante
aproximadamente 8 meses a -30ºC, a +4ºC la SDH es estable
aproximadamente unos 30 días
\vskip1.000000\baselineskip
Por medio del esquema de limpieza representado,
es decir la separación del extracto bruto por medio de una
cromatografía de intercambio iónico, la posterior primera
cromatografía de afinidad de ligandos de color, la ultrafiltración
y segunda cromatografía de afinidad de ligandos de color, se puede
conseguir un enriquecimiento de aproximadamente 50 veces frente al
valor del extracto bruto. El rendimiento es entonces de
aproximadamente un 33%.
Con un reactor de acero fino (volumen 50 ml) se
realizaba la fabricación continuada de 1,6-GPS a
partir de isomaltulosa. El reactor de membrana enzimática
comprendía una camisa doble para el atemperado por medio de un
enfriamiento por agua, perforaciones para el empleo de un electrodo
de conductividad y del valor del pH y conexiones para medir la
presión, adición del sustrato, transporte del producto y extracción
de la muestra. El agitador magnético que se encuentra dentro del
reactor, que puede ser impulsado externamente, garantiza la mezcla
óptima de las sustancias empleadas. La tapa del reactor tenía en su
parte inferior una placa metálica, sobre la cual se aplicaba una
membrana de ultrafiltración y un anillo O. Tras el llenado del
reactor se atornillaba la tapa con la parte inferior. La adición
del sustrato se realizaba con una bomba de émbolo. La conductividad
y el valor del pH de la solución de reacción se medían directamente
y de forma continuada, por lo que un sistema regulador mantenía
constante el valor del pH. Puesto que las membranas de
ultrafiltración no garantizan ninguna retención total de la
coenzima, se empleaba una membrana de la empresa Nitto
(Nitto-Membran NTR-7410). Este
método electrostático de retención de la coenzima garantiza la
permanencia de las coenzimas disociados en la zona de reacción
deseada.
El reactor de membrana descrito se llenaba con
una solución de isomaltulosa 250 mM y glucosa en tampón tris/HCl 50
mM pH 7,5 (+0,1% NaN_{3}). Para un flujo de 2 ml/h se accionaba el
reactor durante 24 horas en "marcha en vacío", para reconocer
fugas u otros problemas y si fuera preciso eliminarlos. A
continuación se introducía la SDH y la enzima de regeneración FDH
con un Superloop, como se emplea para introducir una muestra en
cromatografía. Al comienzo de la reacción se empleaban
respectivamente 1 U/ml de SDH totalmente purificada (del ejemplo 1)
y GDH (glucosa-deshidrogenasa de Bacillus
megaterium). Mediante la inyección de NAD+ 2,5 \muM se
iniciaba la reacción. El valor del pH se mantenía constante a pH
7,0 mediante titulación con Tris 1M. Un parámetro importante en el
funcionamiento de un reactor continuo es la distribución del tiempo
de permanencia. Este se calcula según la fórmula
con una mezcla óptima de la
solución de reacción, donde V es el volumen del reactor y V_{0} el
volumen de corriente. Después de cuatro horas de ensayo discontinuo
se ajustaba la adición de sustrato al flujo de 2 ml/h, de manera
que el tiempo medio de tratamiento (t) fuera de 25 horas. La
duración del ensayo era de 232 horas, de forma que a intervalos
regulares se determinaban las actividades de las enzimas, el consumo
de lejía, la conductividad, presión, el volumen de sustrato y
producto. Se analizaban las muestras de producto obtenidas mediante
HPLC y se detectaba la formación de
1,6-GPS.
Para la fabricación directa de
1,6-GPS a partir de sacarosa se realizaba un ensayo
discontinuo con células inmovilizadas de P. rubrum así como
de la enzima SDH a partir de G oxidans 2003 y FDH a partir de
Candida boidinii en las condiciones siguientes. Los
sustratos en esta reacción eran sacarosa y formiato de amonio.
Volumen: 10 ml
Temperatura: 25ºC
Sacarosa: 500 mM
Formiato: 500 mM
Células de P. rubrum: 1 g
- SDH:
- 5 U
- FDH:
- 10 U
- NAD:
- 1 mM
Puesto que en esta reacción el pH subía, se
regulaba de forma constante con ácido fórmico 1 M en un valor de
7,0. El consumo de sustrato era controlado durante la reacción
mediante métodos de DC y DNS (para la conversión de sacarosa a
isomaltulosa) así como de HPLC (para la conversión de isomaltulosa
en 1,6-GPS). Se producía la formación directa de
1,6-GPS en un recipiente de reacción y se
visualizaba en un paso del procedimiento de la sacarosa.
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar las secuencias de aminoácidos se
digería la SDH purificada de Gluconobacter suboxidans DSM
2003 conforme al ejemplo 1 y se separaba mediante métodos
estándar. Las secuencias parciales obtenidas se representan en SEQ
ID Nr. 3 hasta 9.
\vskip1.000000\baselineskip
En base a las secuencias analizadas en la
determinación de la secuencia de péptidos se fabricaban los
cebadores, que permitían la clonación de todo el gen de SDH de
Gluconobacter suboxidans DMS 2003.
\vskip1.000000\baselineskip
Los cebadores previamente mencionados (SEQ ID
Nr. 3 y 5) se empleaban en una reacción de PCR y se obtenía un
fragmento de la secuencia que codifica la SDH. Con el fragmento de
PCR obtenido se fabricaba una sonda de ADN. En una
inmunotransferencia genómica se podían constatar las bandas
hibridadas tras el marcaje de la sonda. Se constataban dos bancos
genéticos subgenómicos independientes (fragmento de 9 kb según Clal
Verdau, fragmento de 23,5 kb según BamHI Verdau, limpieza de
fragmentos mediante centrifugación de gradientes de sacarosa) con
fragmentos purificados en pBlueskrip SK. Se analizaban los bancos de
clones subgenómicos con la mencionada sonda marcada mediante
hibridación. Se realizaba la identificación de varios clones, de los
cuales se analizaba un clon del banco BamHI y otro del banco
Clal.
\vskip1.000000\baselineskip
La determinación de la secuencia de fragmentos
clonados daba en ambos casos una secuencia de ADN coincidente. De
esta se podía elaborar la secuencia de aminoácidos de la SDH. Esta
coincide con las secuencias de las secuencias de péptidos hasta la
posición del Codon 196, para la cual la secuencia peptídica para el
péptido 5 había dado Serina (S) en lugar del triptófano (W 196)
ahora averiguado.
La secuencia de nucleótidos de la SDH de
Gluconobacter suboxidans DSM 2003 viene representada por SEQ
ID Nr. 2 e incluye 789 nucleótidos
La secuencia de aminoácidos de la
sorbitol-deshidrogenasa del Gluconobacter
suboxidans DSM 2003 viene representada por SEQ ID Nr. 1 e
incluye 262 aminoácidos
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia codificada se alargaba en el
extremo 5' con la secuencia GAATTCTT y en el extremo 3' con la
secuencia AAGCTT. Esta secuencia se integraba en el vector pBtac2
(fig. 1; J. Bosius (1988), Biotechnology 10,
205-225) que se había preparado con EcoRI y
HindI. El plásmido resultante pHWG 467 (fig. 2) contiene un
gen de resistencia a la ampicilina y la secuencia que codifica la
SDH bajo el control del promotor tac. El plásmido pHWG 467 se
transformaba en E. coli JM 109. Estas células se producen
tras la inducción con la actividad SDH del IPTG. La proteína
correspondiente se puede determinar en su actividad en los extractos
en bruto. En el gel de SDS de estos extractos la proteína está
coloreada como banda dominante a 28 kDa con Coomassie Brilliant
Blue.
<110> Südzucker AG mannheim/Ochsenfurt
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método para la fabricación de
6-O-alfa-D-glucanopiranosil-D-sorbitol
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 15441Sdz
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Patente Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 262
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Gluconobacter suboxydans
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 789
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Gluconobacter suboxydans
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Gluconobacter suboxydans
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Gluconobacter suboxydans
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Gluconobacter suboxydans
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Gluconobacter suboxydans
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Gluconobacter suboxydans
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Gluconobacter suboxydans
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Gluconobacter suboxydans
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
Claims (15)
1. Método para la fabricación enzimática de
6-O-alfa-D-glucanopiranosil-D-sorbitol
(1,6-GPS) a partir de isomaltulosa, donde la
isomaltulosa se incuba en una solución de reacción acuosa que
contiene una unidad que presenta actividad de
sorbitol-deshidrogenasa (SDH) y seguidamente se
obtiene la 1,6-GPS de la solución de reacción.
2. Método conforme a la reivindicación 1, donde
a la solución de reacción acuosa se añaden antes o durante la
incubación los equivalentes de reducción.
3. Método conforme a la reivindicación 1, donde
la unidad que presenta la actividad SDH es la SDH aislada.
4. Método conforme a la reivindicación 1, donde
la unidad que presenta la actividad SDH es un microorganismo vivo o
muerto que contiene una SDH o un extracto en bruto del mismo.
5. Método conforme a la reivindicación 4, donde
el microorganismo que contiene la SDH es la Gluconobacter
suboxidans DSM 2003.
6. Método conforme a una de las reivindicaciones
1 hasta 5, donde el método se realiza con una regulación del valor
del pH.
7. Método conforme a una de las reivindicaciones
1 hasta 6, donde a la solución de reacción acuosa se añade antes o
durante la incubación un medio de regeneración, en particular
formiato-deshidrogenasa (FDH) y formiato.
8. Método conforme a una de las reivindicaciones
3 hasta 7, donde el microorganismo, el extracto en bruto o la enzima
es inmovilizado.
9. Método conforme a una de las reivindicaciones
1 hasta 8, donde el método se realiza de forma continuada.
10. Método conforme a una de las
reivindicaciones 1 hasta 9, donde la isomaltulosa empleada como
material de partida se fabrica mediante la reacción enzimática de la
sacarosa en isomaltulosa.
11. Método conforme a la reivindicación 10,
donde la reacción enzimática de la sacarosa para dar la isomaltulosa
se realiza por medio de células de P. rubrum inmovilizadas,
sacarosa-mutasa aislada y/o un aditivo celular de
P. rubrum.
12. Método conforme a las reivindicaciones 10 ó
11, donde la reacción enzimática de sacarosa a isomaltulosa y de
isomaltulosa a 1,6-GPS se realiza en una única etapa
del proceso.
13. Método conforme a una de las
reivindicaciones 1 hasta 12, donde la reacción de la sacarosa a
isomaltulosa y de isomaltulosa a 1,6-GPS se realiza
en un único birreactor.
14. Método conforme a una de las
reivindicaciones 1 hasta 13, donde la fabricación enzimática tiene
lugar a temperaturas de 20 hasta 40ºC, en particular de 25ºC.
15. Método para la fabricación enzimática de
1,6-GPS a partir de sacarosa, donde la sacarosa se
transforma en isomaltulosa por vía enzimática y seguidamente o al
mismo tiempo la isomaltulosa reacciona por vía enzimática mediante
un procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 1 hasta 14
para dar la 1,6-GPS.
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