ES2438982T3

ES2438982T3 - Isomerasa de arabinosa expresada en el género Corynebacterium y procedimiento de elaboración de tagatosa mediante su uso

Info

Publication number: ES2438982T3
Application number: ES07833921.5T
Authority: ES
Inventors: Seong-Bo Kim; Young-Mi Lee; Seung-Won Park; Jung-Hoon Kim; Sang-Hoon Song; Kang-Pyo Lee; Hye-Won Kim; Hye-Jin Choi
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2006-11-27
Filing date: 2007-11-08
Publication date: 2014-01-21
Anticipated expiration: 2027-11-08
Also published as: US20090246828A1; EP2087108B1; KR20080047844A; NZ576797A; CN101631856A; CN101631856B; WO2008066260A1; KR100872694B1; US8802393B2; AU2007326238B2; EP2087108A1; DK2087108T3; EP2087108A4; JP5274476B2; AU2007326238A1; US20080124770A1; JP2010510774A

Abstract

Un procedimiento para producir una isomerasa de arabinosa que comprende: preparar un vector recombinante mediante la inserción de un gen que codifica para una isomerasa de arabinosatermófila, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. Nº: 3 procedente de la Thermotoga neapolitanaDSM 5068, en el vector lanzadera pCJ-1 KCCM 10611 o pCJ-7 KCCM 10617; transfectar una cepa del género Corynebacterium con el vector recombinante, y producir la isomerasa de arabinosa mediante el cultivo de la cepa del género Corynebacterium.

Description

Isomerasa de arabinosa expresada en el género Corynebacterium y procedimiento de elaboración de tagatosa mediante su uso 5

Campo técnico

La presente invención se refiere a un gen de la isomerasa de arabinosa expresado en una cepa del género Corynebacterium y a un procedimiento para la preparación de tagatosa mediante su uso, y más particularmente, la presente invención proporciona un gen que codifica para la isomerasa de arabinosa, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 3, procedente de Thermotoga neapolitana DSM 5068, un vector de expresión recombinante preparado mediante la inserción del gen en el vector lanzadera pCJ-1 KCCM 10611P o pCJ-7 KCCM 10617P, un procedimiento de preparación de una isomerasa de arabinosa termófila mediante la expresión del gen en una cepa del género Corynebacterium de calidad alimentaria GRAS transfectada con el vector de expresión

15 recombinante, y un procedimiento de preparación de tagatosa a partir de galactosa usando el mismo.

Antecedentes de la técnica

Con el creciente interés en el bienestar o en una vida saludable, se ha propuesto la tagatosa como una alternativa al azúcar ya que tiene menos efectos secundarios y el azúcar es uno de los principales factores que provocan diversas enfermedades en adultos. La tagatosa es el isómero de la galactosa y es conocido por tener unas propiedades fisicoquímicas similares a las de la fructosa. La tagatosa es un azúcar natural bajo en calorías, y recientemente ha sido aprobado por la FDA de EE.UU. como una sustancia GRAS (Generally Recognized As Safe [generalmente reconocida como segura]), por lo que ahora está permitida su adición como edulcorante en comidas, bebidas,

25 comidas saludables, aditivos de dietas, etc.

GRAS indica una sustancia que es generalmente reconocida como segura, lo que es juzgado por personas especializadas con una experiencia y una capacidad suficientes mediante procedimientos científicos y el examen en las condiciones indicadas y el propósito de uso. GRAS es un sistema único usado únicamente en los EE.UU. para evaluar la seguridad de los alimentos y de las sustancias químicas alimentarias (en ciertas condiciones) pero es reconocido mundialmente.

La tagatosa se produce bien mediante isomerización, que es un procedimiento químico que usa un catalizador para producir un isómero de galactosa, o bien mediante un procedimiento biológico que usa la isomerasa para convertir

35 enzimáticamente la galactosa.

Uno de los procedimientos biológicos bien conocidos por los expertos en la técnica es convertir aldosa o derivados de aldosa en cetosa o derivados de cetosa mediante el uso de una enzima. La isomerización de galactosa en tagatosa mediante el uso de la isomerasa de arabinosa se lleva a cabo generalmente termodinámicamente y a una elevada temperatura, y muestra una tasa de conversión proporcionalmente alta. Por lo tanto, el desarrollo de una enzima que trabaje de forma estable a elevadas temperaturas y de un procedimiento para preparar tagatosa usando la misma son técnicas clave para la aplicación industrial de la misma basada en la conversión biológica de la tagatosa usando una isomerasa. Mediante el cribado de isomerasas de arabinosa derivadas de bacterias termófilas, se ha ensayado una isomerasa termófila aplicable industrialmente, y también han realizado esfuerzos muchos

45 equipos de investigación para establecer un proceso de isomerización que usa la misma.

En Corea, se ha desarrollado un procedimiento de isomerización enzimática que usa una isomerasa de arabinosa por parte de Tong Yang Confectionery Corp. Según el procedimiento, la isomerasa de arabinosa derivada de E. coli se expresó homogéneamente en E. coli mediante tecnología recombinante. Esta isomerasa recombinante se hizo reaccionar a 30 °C durante 24 horas para convertir la galactosa en tagatosa, y en ese momento la tasa de conversión era del 25 %, lo que indicaba que tanto la termoestabilidad como el rendimiento de conversión eran muy bajos (solicitud de patente coreana Nº 99-16118). El profesor Oh, Deok-keun y sus colegas (universidad de Sejong) tuvieron éxito en la expresión heterogénea de la isomerasa de arabinosa procedente de Geobacillus stearothermophilus en E. coli y basándose en eso propusieron un procedimiento de isomerización a elevada

55 temperatura para convertir la galactosa en tagatosa. Los presentes inventores tuvieron éxito en la clonación de un nuevo gen de isomerasa de arabinosa de Thermotoga neapolitana y en su producción en E. coli, y desarrollaron adicionalmente un procedimiento de elaboración de tagatosa en un estado hipertermófilo usando la enzima (patente coreana Nº 10-0443865).

El documento WO02/052021 se refiere a un gen que codifica la L-isomerasa de arabinosa derivada de Thermatoga neapolitana 5068, a una isomerasa de arabinosa termoestable expresada por dicho gen, a un proceso para preparar dicha isomerasa de arabinosa y a un proceso para preparar D-tagatosa empleando dicha isomerasa de arabinosa.

La producción de tagatosa usando una isomerasa de arabinosa derivada de termófilos aún depende del 65 procedimiento de usar una enzima recombinante expresada en masa en E. coli recombinante o de la isomerización de galactosa en tagatosa usando un hospedador que contiene la enzima recombinante. Sin embargo, esta producción biológica de tagatosa usando E. coli recombinante no es apropiada para la producción de tagatosa como ingrediente alimentario. Para producir tagatosa como aditivo alimentario, es esencial que la isomerasa de arabinosa sea expresada en un hospedador que sea un microorganismo GRAS apropiado para la producción en masa de la

5 misma.

Corynebacterium es un microorganismo industrial que se ha usado para la producción de compuestos químicos aplicables a varios ámbitos incluyendo L-lisina, L-treonina y varios alimentos que contienen ácidos nucleicos, suministros médicos y alimentos. La cepa Corynebacterium es una cepa GRAS (generalmente reconocida como segura), que favorece la manipulación génica y la producción en masa. Además, esta cepa es muy estable en las diversas condiciones del proceso y tiene una membrana celular comparativamente estable, en comparación con otras bacterias. Por lo tanto, esta cepa permanece estable incluso bajo la elevada presión osmótica generada por una elevada concentración de galactosa.

15 Srivastava P y Deb JK revisan sistemas de expresión génica en corinebacterias, incluyendo plásmidos corinebacterianos y elementos reguladores, y el desarrollo de vectores para la clonación y la expresión génica (Srivastava P y Deb JK (2005) Gene expression systems in corynebacteria. Protein Expression and Purification 40: 221 -229).

Los presentes inventores averiguaron que la isomerasa de arabinosa termófila procedente de la Thermotoga neapolitana hipertermófila es sobreexpresada en una forma activa en una cepa del género GRAS de Corynebacterium, y adicionalmente completaron la invención según las reivindicaciones 1 -3 mediante el desarrollo de una nueva técnica para inducir la isomerización de la tagatosa a partir de una elevada concentración de galactosa mediante el uso de enzimas recombinantes expresadas en especies de Corynebacterium.

Desvelación de la invención

Problema técnico

Es un objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para preparar cepas GRAS que expresan la isomerasa de arabinosa de forma estable en sus células en las condiciones de elevada temperatura y elevada concentración de galactosa aprovechando la producción en masa de la enzima recombinante en la cepa del género Corynebacterium.

35 Solución técnica

Para superar los límites del procedimiento convencional, en el que una enzima sólo podría ser expresada en E. coli, es también un objeto de la presente solicitud proporcionar un procedimiento para preparar tagatosa en el que se expresa la isomerasa de arabinosa procedente de Thermotoga en una forma activa en una cepa GRAS de Corynebacterium, y consecuentemente se genera tagatosa de calidad alimentaria a partir de galactosa usando la enzima recombinante expresada u hospedadores que la contienen.

El anterior objeto y otros objetos de la presente solicitud pueden conseguirse mediante las siguientes formas de realización de la presente invención.

45 En lo sucesivo se describe la presente invención con detalle.

La presente invención proporciona un procedimiento según la reivindicación 1 para producir una enzima recombinante mediante la introducción del gen de la isomerasa de arabinosa a partir de un microorganismo que es muy difícil de obtener a partir de un cultivo celular directo, porque las condiciones de crecimiento óptimas para el microorganismo son al menos 80 °C o son condiciones anaerobias, en un hospedador de calidad alimentaria.

La isomerasa de arabinosa puede proceder preferiblemente de una cepa de Thermotoga, Thermus o Sulforobus cuya temperatura de reacción óptima esté en el intervalo de 70 – 90 °C.

55 El gen de la isomerasa de arabinosa procede de la hipertermófila Thermotoga neapolitana DSM 5068, que tiene la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. Nº 3.

El gen de la isomerasa de arabinosa puede ser modificado por los expertos en la técnica usando cualquier procedimiento convencional de mutagénesis, tal como la evolución dirigida y mutagénesis dirigida. Por lo tanto, cualquier célula hospedadora que tenga un cierto nivel de homología con un hospedador GRAS, por ejemplo una homología de al menos el 70 % pero preferiblemente de al menos el 80 % y más preferiblemente de al menos el 90 % con un hospedador GRAS, y una enzima recombinante que sea expresada en una forma activa en el hospedador, y cualquier célula hospedadora que contenga la enzima, están todos incluidos en los criterios de la

65 presente solicitud.

La presente solicitud también desvela un vector que contiene un gen que codifica para la isomerasa de arabinosa. El vector de la presente solicitud es un vector típico para la clonación o la expresión génica.

5 En la presente invención se usó un promotor que es activo en Corynebacterium como el vector para expresar una isomerasa termófila en una forma activa. La secuencia promotora usada para la expresión génica en Corynebacterium no ha sido identificada, a diferencia de otros promotores usados en microorganismos industriales tales como E. coli o Bacillus subtilis. En este documento se ha desarrollado un fuerte promotor que se origina en Corynebacterium, un popular microorganismo industrial, y que puede ser expresado en E. coli. El promotor Tac se conoce por ser uno de los promotores más fuertes. El promotor Tac se prepara mediante la fusión de una secuencia de la región -35 del promotor del operón de triptófano de E. coli con una secuencia de la región -10 del promotor del operón de lactosa de E. coli. Se confirmó que el promotor formado por CJ-1 ~ CJ-7 de la presente invención era más eficaz para expresar un gen objetivo en células bacterianas del género Corynebacterium que el promotor tac (publicación de patente coreana Nº 10-2006-0068505).

15 El promotor de Corynebacterium muestra una actividad promotora no sólo en microorganismos del género Corynebacterium, sino también en bacterias del género Escherichia y en células de E. coli. En particular, el promotor muestra una actividad de promotor en células bacterianas del género Escherichia al menos dos veces mayor de lo que lo hace el promotor tac.

La cepa de calidad alimentaria, es decir, una cepa GRAS, incluye Corynebacterium, y más específicamente Corynebacterium glutamicum KCTC 10302.

Según una forma de realización de la presente solicitud, se preparó una cepa recombinante mediante la

25 transformación de Corynebacterium con el vector, que después se cultivó para proporcionar una isomerasa de arabinosa de calidad alimentaria. El medio de cultivo y las condiciones dependían del tipo de hospedador.

La presente solicitud proporciona una isomerasa de arabinosa recombinante y un procedimiento para la preparación de tagatosa a partir de galactosa mediante la inmovilización de células hospedadoras que contienen la enzima recombinante.

Breve descripción de los dibujos

La aplicación de las formas de realización preferidas de la presente invención se comprende mejor mediante 35 referencia a los dibujos anexos, en los que:

la Fig. 1 es un diagrama esquemático que ilustra la construcción de los vectores de expresión recombinantes pCJ-1-TNAI y pCJ-7-TNAI que contienen un gen que codifica para la isomerasa de arabinosa termófila procedente de la cepa Thermotoga neapolitana DSM 5068,

la Fig. 2 es una gráfica que ilustra el crecimiento del cultivo dependiente del tiempo de la cepa recombinante de Corynebacterium. Particularmente, se cultivó Corynebacterium recombinante en un medio óptimo a 30 °C durante 24 horas.

45 la Fig. 3 es una fotografía que ilustra los resultados de una SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico) de los patrones de expresión de proteínas totales observados en disoluciones enzimáticas en bruto de cada etapa de separación y purificación de la isomerasa de arabinosa expresada en Corynebacterium recombinante. Cada banda proteica indica lo siguiente:

M: marcador proteico de amplio alcance (Bio-Rad, EE.UU.)

1: disolución enzimática en bruto

2: sobrenadante enzimático tratado térmicamente 55

3.: Fragmento enzimático después de la cromatografía de intercambio aniónico (columna HiTrap Q, GE Healthcare, EE.UU.)

4.: Fragmento enzimático purificado tras la cromatografía de exclusión por tamaños (columna Superdex 200 pg, GE Healthcare, EE.UU.)

La Fig. 4 es una gráfica que ilustra la cantidad de la isomerasa de arabinosa. La Corynebacterium recombinante y la

E. coli que contiene la isomerasa de arabinosa expresada en una forma activa se hicieron reaccionar en PBS

(disolución salina tamponada con fosfato) que contenía diferentes concentraciones de galactosa de 0, 10, 20, 30 y 65 40 % durante 2 horas a elevada temperatura (70 °C) con agitación, y después se midió el nivel de expresión enzimática en el tampón.

Mejor modo de llevar a cabo la invención

5 Las formas de realización prácticas y actualmente preferidas de la presente invención se ilustran según se muestra los siguientes ejemplos.

[Ejemplos]

En la forma de realización preferida de la presente invención se insertó un gen que codifica para la isomerasa de arabinosa termófila procedente de la Thermotoga neapolitana DSM 5068 hipertermófila en pCJ-1 y pCJ-7 (vectores lanzadera E. coli-Corynebacterium, publicación de patente coreana Nº 10-2006-0068505). Se transfectó Corynebacterium glutamicum KCTC 13032 con los vectores anteriores, en la que finalmente se sobreexpresó dicha proteína. Las cepas recombinantes de Corynebacterium glutamicum CJ-1-TNAI (KCCM10786P) y CJ-7-TNAI

15 (KCCM10787P) se cultivaron y se obtuvieron extractos celulares a partir de cada etapa del cultivo celular. Se midió la actividad de producción de tagatosa, esto es, se midió la cantidad de proteína recombinante activa etapa por etapa. Se separó del cultivo resultante expresado óptimamente y se purificó mediante lisis celular, tratamiento térmico, resina de intercambio iónico y cromatografía en gel. Finalmente se examinó la secuencia de aminoácidos del amino terminal y se confirmó la actividad de producción de tagatosa mediante la medición de la actividad proteica.

Ejemplo 1: clonación de la isomerasa de arabinosa

Se cultivó Thermotoga neapolitana DSM 5068 en condiciones anaerobias. Se realizó una centrifugación a 8.000 x g

25 durante 10 minutos para recuperar las células cultivadas. Se extrajo el ADN genómico de las células obtenidas mediante el uso de un kit Cell culture DNA Midi (Qiagen, EE.UU.). Se realizó una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con el ADN genómico mediante el uso de los oligonucleótidos 5'-CCCGA TATCATGATCGATCT-' CAAACAGTATGAG-3' (SEC. ID. Nº 1) y 5'-TGCACTGCAGTCATCT TTT-TAAAAGTCCCC-3' (SEC. ID. Nº 2) con la excepción de las secuencias de los sitios enzimáticos de restricción EcoRV y PstI como cebadores. El producto de la PCR se obtuvo mediante la amplificación del ADN de 1509 pb que contenía el gen de la isomerasa de arabinosa de Thermotoga neapolitana. Para producir en masa la isomerasa de arabinosa codificada por el gen amplificado se seleccionaron los vectores derivados del género Corynebacterium que mostraban una excelente capacidad de sobreexpresión de la proteína. Los vectores se introdujeron en E. coli DH5alpha, que fueron depositadas en el Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM), una autoridad depositaria internacional (IDA), el 6 de noviembre

35 de 2004 (números de acceso: KCCM-10611 y KCCM-10617) (Tabla 1).

Tabla 1

[Tabla 1]

Promotor: Vector Número de acceso Proteína derivada

pCJ1: pECCG117 KCCM-10611 Proteína de choque térmico hsp60

pCJ7: pECCG117 KCCM-10617 Dismutasa de superóxido de manganeso

El producto de la PCR digerido con las enzimas de restricción EcoRV y Pstl se insertó en los vectores lanzadera pCJ-1 y pCJ-7, que fueron digeridos con las mismas enzimas, dando lugar a la construcción de los vectores de

45 expresión recombinantes pCJ-1-TNAI y pGJ-7-TNAl (véase la Fig. 1). Se transfectó Corynebacterium glutamicum KCTC 13032 con los vectores de expresión recombinantes pCJ-1-TNAI y pCJ-7-TNAl para preparar cepas recombinantes, que se denominaron Corynebacterium glutamicum CJ-1-TNAI y Corynebacterium glutamicum CJ-7-TNAI. Las cepas recombinantes se depositaron en el Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM), una autoridad depositaria internacional (IDA), ubicada en #361-221, Hongje l-Dong, Seodaemun-Gu, Seúl, Corea, el 18 de octubre de 2006 (números de acceso: KCCM 10786P y KCCM 10787P).

Ejemplo 2: expresión de la isomerasa de arabinosa en Corynebacterium

Se inocularon las cepas recombinantes Corynebacterium glutamicum CJ-1-TNAI y Corynebacterium glutamicum CJ

55 7-TNAI (números de acceso: KCCM10786P y KCCM10787P) preparadas en el Ejemplo 1 en medio MB (Bactotrypton 10 g/l, extracto de Bacto-yeast 5 g/l, NaCl 10 g/l, Soytone 5 g/l) que contenía 10 !g/ml de canamicina a la concentración de DO600 = 0,1, seguido de un cultivo a 30 °C durante 24 horas para inducir la expresión de la isomerasa de arabinosa recombinante. Para medir la actividad enzimática de la isomerasa de arabinosa expresada, se centrifugó la disolución del cultivo a 8.000 x g durante 10 min y se recuperaron las células. Las células se resuspendieron en tampón Tris-HCl (pH 7,0) 50 mM, seguido de la aplicación de ultrasonidos para lisar las células. Se obtuvo el sobrenadante como una disolución enzimática en bruto, con la que se realizó la isomerización de la galactosa. Particularmente, para la isomerización se mezclaron 100 !l de una disolución enzimática que contenía 40 mM de galactosa como sustrato con 1 ml de un tampón de reacción (Tris-HCl 50 mM, pH 7,0). En ese momento se añadieron a la mezcla de reacción 5 mM de MnCI2 y 1 mM de CoCl2. La mezcla de reacción enzimática en bruto se hizo reaccionar a 60 °C durante 20 minutos. Se midió la actividad de la enzima en bruto mediante el método de

5 cisteína-carbazol-ácido sulfúrico (Dische, Z., y E. Borenfreund., A New Spectrophotometric Method for the Detection and Determination of Keto Sugars and Trioses, J. Biol. Chem., 192: 583 -587, 1951). El contenido proteico en la disolución enzimática en bruto se cuantificó con un kit de ensayo Bradford (Biorad, EE.UU.). Como resultado, la actividad de isomerasa era de 2,050 (mg de tagatosa/mg de proteína·h), lo que indicaba que se había generado con éxito el producto de la isomerización de la galactosa, la tagatosa.

10 Ejemplo 3: optimización de las condiciones de cultivo para la producción en masa de la cepa de recombinante

Se inocularon las cepas recombinantes preparadas en el Ejemplo 2 en medio MB (Bacto-trypton 10 g/l, extracto de

15 Bacto-yeast 5 g/l, NaCl 10 g/l, Soytone 5 g/l) que contenía 10 !g/ml de canamicina a la concentración primaria de DO600 = 0,6. Se investigó el crecimiento de las cepas en los medios básicos para el cultivo de Corynebacterium, medio MB (Bacto-trypton 10 g/l, extracto de Bacto-yeast 5 g/l, NaCl 10 g/l, Soytone 5 g/l) y un medio modificado (Bacto-peptone 10 g/l, extracto de Bacto-yeast 5 g/l, NaCl 2,5 g/l, extracto de vaca 5 g/l). Se compararon los crecimientos dependientes de la temperatura (25 °C, 30 °C, 37 °C), dependientes del pH y dependientes de la

20 concentración de glucosa (fuente de carbono) y de sacarosa en los dos medios. Además se midieron así los crecimientos en las diversas condiciones y niveles de expresión de la enzima cada hora para juzgar las condiciones óptimas de expresión para la producción en masa de la isomerasa de arabinosa recombinante (Tablas 2 y 3).

Tabla 2

25 [Tabla 2]

Medio modificado: medio MB

Aeróbico
Aeróbico: Estacionario 25 °C 30 °C 37 ºC

DO600: 10,1 9,4 5,56 8,88 10,1 4,44

pH: 7,5 7,6 7,8 7,4 7,5 7,5

Actividad (mU/ml): 60,907 56,09 34,2 58,783 60,907 29,054

30 Tabla 3 [Tabla 3]

0%: Sacarosa Glucosa

2,5 %: 5% 7,5 % 10 % 2,5 % 5% 7,5 % 10 %

DO600: 10,1 13,6 12,72 14,86 12,94 14,7 14,32 10,96 4,36

pH: 7,5 4,5 4,7 4,7 4,7 4,5 4,5 4,7 4,7

Actividad (mU/ml): 60,907 85,088 82,160 79,104 73,708 67,935 58,896 58,649 42,441

35 Para medir la actividad enzimática de la isomerasa de arabinosa recombinante, la enzima se trató y se cuantificó de la misma forma a la descrita en el Ejemplo 2. Cuando las células se cultivaron a 30 °C en condiciones aeróbicas con la adición de un 2,5 % de sacarosa, la tagatosa, el producto de la isomerización de la galactosa, mostró aproximadamente 85,1 mU/ml de actividad enzimática, lo que es 1,4 veces mayor que la observada en el cultivo

40 estándar (60,9 mU/ml), lo que sugiere que la actividad enzimática aumentó al aumentar el crecimiento de las células. Los resultados del crecimiento celular en el medio óptimo se muestran en la Fig. 2.

Ejemplo 4: separación y purificación de la isomerasa de arabinosa recombinante y confirmación de la expresión de la proteína activa mediante la secuenciación de los aminoácidos N terminales

45 Se elaboraron 2 l de cultivo de la cepa recombinante en las condiciones óptimas de cultivo determinadas en el anterior Ejemplo 3. La disolución de cultivo se centrifugó a 8.000 x g durante 10 minutos y se recuperaron las células. Las células se resuspendieron en tampón Tris-HCI 50 mM (pH 7,0), y se usaron para la purificación proteica. La suspensión celular progresó hacia la lisis celular usando un homogeneizador celular a alta presión de la serie T (4,0 kW; Constant systems, Reino Unido), seguido de un tratamiento térmico a 80 °C durante 20 min. La centrifugación se realizó a 10.000 x g durante 10 minutos para separar la isomerasa de arabinosa termófila recombinante expresada. La disolución de enzima recombinante separada se purificó mediante cromatografía de intercambio aniónico (Hiprep Q 16/10, Amersham Bioscience, EE.UU.), ultrafiltración (Centriprep 30, Amicon,

5 Alemania) y cromatografía de exclusión por tamaños; Superdex 200pg, Amersham Bioscience, EE.UU.) (Tabla 4). La composición proteica de la disolución enzimática de cada etapa se analizó mediante SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico) (Fig. 3).

Tabla 4

[Tabla 4]

Etapa de purificación: Proteína total (mg) Actividad total (AU) Purificación (%) Rendimiento (%)

Disolución enzimática en bruto: 665 410,4 1,0 100

Tratamiento térmico: 480 364,3 1,2 89

Cromatografía de intercambio iónico: 63,5 201,5 5,1 49

Cromatografía en gel: 28,1 136,3 7,7 33

La proteína recombinante separada y purificada fue finalmente identificada mediante la secuenciación de los

15 aminoácidos N terminales. La proteína purificada mediante cromatografía en gel se analizó mediante SDS-PAGE y como resultado se confirmó que la proteína tenía un peso molecular de aproximadamente 55 kDa, que era el mismo peso molecular que la isomerasa de arabinosa de Thermotoga neapolitana. La banda proteica se transfirió a una membrana de PVDF para una investigación adicional por parte del Korean Basic Science Institute. Como resultado, se identificaron los 10 aminoácidos del amino terminal de la proteína recombinante separada como 'Met-Ile-Asp-Leu

20 Lys-Gln-Tyr-Glu-Phe-Trp', que era la secuencia de la secuencia de proteínas N terminal de la isomerasa de arabinosa de Thermotoga neapolitana. Por lo tanto, se confirmó que esta secuencia era la misma que la secuencia de aminoácidos de la isomerasa de arabinosa originada a partir de Thermotoga neapolitana (SEC. ID. Nº 3).

Ejemplo 5: estabilidad de reacción de la cepa recombinante para la expresión enzimática a elevada 25 temperatura y elevada concentración

Corynebacterium es una cepa muy estable en diversas condiciones de producción y tiene una membrana celular comparativamente dura, por lo tanto permanece estable incluso en las condiciones altamente osmóticas provocadas por una elevada concentración de sacarosa. Estas características de la cepa favorecen la mejora de la estabilidad

30 de reacción con una elevada concentración de un sustrato. Por lo tanto, aprovechando dichas características, los presentes inventores expresaron la isomerasa de arabinosa hipertermófila en Corynebacterium.

La cepa recombinante de Corynebacterium cultivada en un medio preparado en el Ejemplo 3 y la cepa recombinante de E. coli cultivada en medio LB (5 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de Bacto-trypton, 10 g/l de cloruro sódico) se 35 centrifugaron respectivamente a 8.000 x g durante 10 minutos para obtener las células. Las células se resuspendieron en PBS (disolución salina tamponada con fosfato) para experimentos adicionales. Para comparar la estabilidad de la cepa con una elevada concentración de sustrato, se añadió galactosa al 0, 10, 20, 30 y 40 % a la disolución, seguido de una reacción con agitación a 70 °C durante 0, 1 y 2 horas. Para cuantificar la proteína expresada en las células de cada producto de reacción, se realizó una centrifugación a 13.000 x g durante 10 40 minutos y se obtuvo el sobrenadante. Después, las proteínas expresadas fueron cuantificadas mediante BCA (método de ensayo de proteínas del ácido bicincónico). A partir de la comparación de la expresión proteica según la concentración de sustrato entre las células recombinantes de E. coli y las células recombinantes de Corynebacterium, se confirmó que el nivel de expresión proteica en Corynebacterium era significativamente menor en comparación con el del control de E. coli. En la E. coli recombinante, la concentración de la lactosa aumentó

45 significativamente según progresaba la reacción, mientras que la expresión de la proteína en Corynebacterium aumentó aproximadamente un 20 % incluso después de partir con la mayor concentración de galactosa de este experimento, que era del 40 % (Fig. 4).

Los resultados anteriores indican que la elución de proteínas está notablemente reducida en las células bajo una

50 elevada concentración de sustrato, en comparación con la de E. coli. Esto es, al contrario que el hospedador convencional de E. coli, un hospedador de Corynebacterium que contiene la enzima expresada en el mismo muestra una elución reducida de proteína intracelular bajo un elevado contenido en azúcar.

También se confirmó que el hospedador de Corynebacterium era muy estable en unas condiciones de reacción

55 duras, incluyendo alta temperatura y alta concentración de sustrato, en comparación con el hospedador de E. coli. Esta estabilidad favorece el aumento de la estabilidad de reacción en un reactor celular inmovilizado, y por lo tanto da como resultado un aumento de la semivida del reactor celular inmovilizado.

Aplicabilidad industrial

Como se explicó anteriormente, se observó la expresión estable de la isomerasa de arabinosa procedente de la Thermotoga hipertermófila en Corynebacterium, y por lo tanto se lleva a cabo de forma eficaz una reacción continua

5 inmovilizada en la forma de realización preferida de la presente invención mediante el uso de Corynebacterium que contenía la forma activa de la enzima. Para producir material alimentario biotécnico usando un microorganismo enzimático, un aditivo debe cumplir una calidad alimentaria GRAS. La isomerasa de arabinosa procedente de la Thermotoga de calidad alimentaria preparada mediante el procedimiento de la presente invención puede ser aplicada a una reacción continua de forma estable para aumentar la posibilidad de industrialización de la enzima.

10 Los expertos en la materia apreciarán que las concepciones y las formas de realización específicas desveladas en la anterior descripción pueden utilizarse fácilmente como una base para modificar o diseñar otras formas de realización para llevar a cabo los mismos propósitos de la presente invención.

15 <110> CJ Corporation

<120> Isomerasa de arabinosa expresada en el género Corynebacterium y procedimiento de elaboración de tagatosa mediante su uso

20 <130> PA06-0312

<160> 3

<170> Kopatentln 1.71 25

<210> 1

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial 30

<220>

<223> cebador 1

<400> 1 35 cccgatatca tgatcgatct caaacagtat gag

<210> 2

<211> 30

<212> ADN 40 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador 2

45 <400> 2 tgcactgcag tcatcttttt aaaagtcccc

<210> 3

<211> 496 50 <212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 3

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para producir una isomerasa de arabinosa que comprende:

5 preparar un vector recombinante mediante la inserción de un gen que codifica para una isomerasa de arabinosa termófila, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. Nº: 3 procedente de la Thermotoga neapolitana DSM 5068, en el vector lanzadera pCJ-1 KCCM 10611 o pCJ-7 KCCM 10617;

transfectar una cepa del género Corynebacterium con el vector recombinante, y 10 producir la isomerasa de arabinosa mediante el cultivo de la cepa del género Corynebacterium.
2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la cepa es Corynebacterium glutamicum CJ-1-

TNAI KCCM 10786P. 15
3. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la cepa es Corynebacterium glutamicum CJ-7-TNAI KCCM 10787P.