CN117925756A - 一种高纯度柑橘黄酮糖苷的制备方法 - Google Patents
一种高纯度柑橘黄酮糖苷的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117925756A CN117925756A CN202410076699.3A CN202410076699A CN117925756A CN 117925756 A CN117925756 A CN 117925756A CN 202410076699 A CN202410076699 A CN 202410076699A CN 117925756 A CN117925756 A CN 117925756A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- citrus
- purity
- flavonoid glycoside
- flavone
- beta
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000207199 Citrus Species 0.000 title claims abstract description 61
- 235000020971 citrus fruits Nutrition 0.000 title claims abstract description 61
- 229930182486 flavonoid glycoside Natural products 0.000 title claims abstract description 24
- 150000007955 flavonoid glycosides Chemical class 0.000 title claims abstract description 24
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 229930003944 flavone Natural products 0.000 claims abstract description 39
- 235000011949 flavones Nutrition 0.000 claims abstract description 39
- GAMYVSCDDLXAQW-AOIWZFSPSA-N Thermopsosid Natural products O(C)c1c(O)ccc(C=2Oc3c(c(O)cc(O[C@H]4[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O4)c3)C(=O)C=2)c1 GAMYVSCDDLXAQW-AOIWZFSPSA-N 0.000 claims abstract description 31
- VHBFFQKBGNRLFZ-UHFFFAOYSA-N vitamin p Natural products O1C2=CC=CC=C2C(=O)C=C1C1=CC=CC=C1 VHBFFQKBGNRLFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 31
- 239000001606 7-[(2S,3R,4S,5S,6R)-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-[(2S,3R,4R,5R,6S)-3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-5-hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)chroman-4-one Substances 0.000 claims abstract description 29
- 150000002212 flavone derivatives Chemical class 0.000 claims abstract description 29
- 229930019673 naringin Natural products 0.000 claims abstract description 29
- 229940052490 naringin Drugs 0.000 claims abstract description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 26
- 108010025880 Cyclomaltodextrin glucanotransferase Proteins 0.000 claims abstract description 21
- -1 flavone glycoside Chemical class 0.000 claims abstract description 17
- 229940108690 glucosyl hesperidin Drugs 0.000 claims abstract description 17
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims abstract description 12
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 12
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims abstract description 12
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 claims abstract description 11
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 claims abstract description 11
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 claims abstract description 11
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims abstract description 9
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims abstract description 9
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 claims abstract description 8
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims abstract description 7
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 31
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 31
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 21
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 20
- 239000001100 (2S)-5,7-dihydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)chroman-4-one Substances 0.000 claims description 16
- QUQPHWDTPGMPEX-UHFFFAOYSA-N Hesperidine Natural products C1=C(O)C(OC)=CC=C1C1OC2=CC(OC3C(C(O)C(O)C(COC4C(C(O)C(O)C(C)O4)O)O3)O)=CC(O)=C2C(=O)C1 QUQPHWDTPGMPEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- QUQPHWDTPGMPEX-UTWYECKDSA-N aurantiamarin Natural products COc1ccc(cc1O)[C@H]1CC(=O)c2c(O)cc(O[C@@H]3O[C@H](CO[C@@H]4O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]4O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]3O)cc2O1 QUQPHWDTPGMPEX-UTWYECKDSA-N 0.000 claims description 15
- APSNPMVGBGZYAJ-GLOOOPAXSA-N clematine Natural products COc1cc(ccc1O)[C@@H]2CC(=O)c3c(O)cc(O[C@@H]4O[C@H](CO[C@H]5O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]5O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]4O)cc3O2 APSNPMVGBGZYAJ-GLOOOPAXSA-N 0.000 claims description 15
- VUYDGVRIQRPHFX-UHFFFAOYSA-N hesperidin Natural products COc1cc(ccc1O)C2CC(=O)c3c(O)cc(OC4OC(COC5OC(O)C(O)C(O)C5O)C(O)C(O)C4O)cc3O2 VUYDGVRIQRPHFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- QUQPHWDTPGMPEX-QJBIFVCTSA-N hesperidin Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC=C1[C@H]1OC2=CC(O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@H]4[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O4)O)O3)O)=CC(O)=C2C(=O)C1 QUQPHWDTPGMPEX-QJBIFVCTSA-N 0.000 claims description 15
- 229940025878 hesperidin Drugs 0.000 claims description 15
- ARGKVCXINMKCAZ-UHFFFAOYSA-N neohesperidine Natural products C1=C(O)C(OC)=CC=C1C1OC2=CC(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)OC3C(C(O)C(O)C(C)O3)O)=CC(O)=C2C(=O)C1 ARGKVCXINMKCAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- DFPMSGMNTNDNHN-ZPHOTFPESA-N naringin Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC=2C=C3O[C@@H](CC(=O)C3=C(O)C=2)C=2C=CC(O)=CC=2)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O DFPMSGMNTNDNHN-ZPHOTFPESA-N 0.000 claims description 14
- 101000874334 Dalbergia nigrescens Isoflavonoid 7-O-beta-apiosyl-glucoside beta-glycosidase Proteins 0.000 claims description 12
- 101000757733 Enterococcus faecalis (strain ATCC 700802 / V583) Autolysin Proteins 0.000 claims description 12
- 101000757734 Mycolicibacterium phlei 38 kDa autolysin Proteins 0.000 claims description 12
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 8
- 150000002213 flavones Chemical class 0.000 claims description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 claims description 5
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 claims description 5
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 claims description 5
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 claims description 5
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 claims description 5
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 claims description 3
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 claims description 3
- 239000005913 Maltodextrin Substances 0.000 claims description 3
- 241000205156 Pyrococcus furiosus Species 0.000 claims description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 3
- 229940035034 maltodextrin Drugs 0.000 claims description 3
- 241000193375 Bacillus alcalophilus Species 0.000 claims description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims description 2
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 abstract description 3
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 abstract description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract description 3
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 abstract description 2
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 abstract description 2
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 36
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 32
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical group CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 9
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 9
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 7
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 5
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 5
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 4
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 4
- 238000010563 solid-state fermentation Methods 0.000 description 4
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 4
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 3
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 3
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 2
- 108010055629 Glucosyltransferases Proteins 0.000 description 2
- 102000000340 Glucosyltransferases Human genes 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N schardinger α-dextrin Chemical compound O1C(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(O)C2O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2CO HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 241000588986 Alcaligenes Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 241000205160 Pyrococcus Species 0.000 description 1
- 240000005384 Rhizopus oryzae Species 0.000 description 1
- 235000013752 Rhizopus oryzae Nutrition 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000003889 chemical engineering Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- AIONOLUJZLIMTK-UHFFFAOYSA-N hesperetin Natural products C1=C(O)C(OC)=CC=C1C1OC2=CC(O)=CC(O)=C2C(=O)C1 AIONOLUJZLIMTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AIONOLUJZLIMTK-AWEZNQCLSA-N hesperetin Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC=C1[C@H]1OC2=CC(O)=CC(O)=C2C(=O)C1 AIONOLUJZLIMTK-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 1
- 229960001587 hesperetin Drugs 0.000 description 1
- 235000010209 hesperetin Nutrition 0.000 description 1
- FTODBIPDTXRIGS-UHFFFAOYSA-N homoeriodictyol Natural products C1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 FTODBIPDTXRIGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006276 transfer reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 230000008728 vascular permeability Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
- C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
- C07H1/06—Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H17/04—Heterocyclic radicals containing only oxygen as ring hetero atoms
- C07H17/06—Benzopyran radicals
- C07H17/065—Benzo[b]pyrans
- C07H17/07—Benzo[b]pyran-4-ones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/20—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an exo-1,4 alpha-glucosidase, e.g. dextrose
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种高纯度柑橘黄酮糖苷的制备方法，采用环糊精糖基转移酶催化柑橘黄酮与糊精之间的糖基转移过程，之后采用糖化酶选择性降解多糖基柑橘黄酮至单糖基柑橘黄酮，随后采用β‑糖苷酶选择性降解反应液中未转化的柑橘黄酮原料，最后通过大孔吸附树脂吸附分离溶液中的单糖基柑橘黄酮。通过该方法制备得到的柑橘黄酮糖苷如葡萄糖基橙皮苷和葡萄糖基柚皮苷，具有较高的纯度，纯度可以达到95％以上。
Description
技术领域
本发明涉及柑橘黄酮糖苷的制备，尤其涉及一种高纯度柑橘黄酮糖苷的制备方法。
背景技术
柑橘黄酮如橙皮苷和柚皮苷，具有抗氧化、强化毛细血管、改善血管通透性、调节胆固醇等功效，但较差的水溶性和生物活性限制了柑橘黄酮的应用范围和功效。而对柑橘黄酮进行糖基化修饰，能够有效提升其水溶性和生物活性，在食品、药品和日化品领域有着广阔的应用前景。如橙皮苷的糖基化修饰产物葡萄糖基橙皮苷、柚皮苷的糖基化修饰产物葡萄糖基柚皮苷，可以作为高端化妆品原料应用于面霜、眼霜、爽肤水等护肤产品中，具有较高的经济价值。
目前，可通过环糊精糖基转移酶催化糊精和柑橘黄酮分子之间的糖基转移反应，制备葡萄糖基橙皮苷和葡萄糖基柚皮苷。但是，如图1所示，环糊精糖基转移酶的催化过程具有可逆性和产物多样性的特征，导致催化产物中除葡萄糖基柑橘黄酮以外还存在未被糖基化修饰的柑橘黄酮底物和连接了多个葡萄糖基的多糖基柑橘黄酮。此外，底物柑橘黄酮水溶性和生物活性均较差，在催化过程中易与葡萄糖基柑橘黄酮形成包含物，对产品的稳定性和生物活性造成影响。而且多糖基柑橘黄酮虽然具备较好的水溶性，但多余的葡萄糖基不具备生物活性，会导致单位重量产品的生物活性下降。因此制备高纯度的柑橘黄酮糖苷，对提升柑橘黄酮类产品的稳定性和生物活性具有重要意义。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种高纯度柑橘黄酮糖苷的制备方法，通过该方法制备得到的柑橘黄酮如葡萄糖基橙皮苷和葡萄糖基柚皮苷，具有较高的纯度。
本发明解决上述问题的技术方案如下：
一种高纯度柑橘黄酮糖苷的制备方法，包括以下步骤：
S1、以柑橘黄酮和糊精为底物，以环糊精糖基转移酶作为催化剂，获得含柑橘黄酮、单糖基柑橘黄酮、多糖基柑橘黄酮的催化液；
S2、向步骤S1的催化液中加入糖化酶，得到含柑橘黄酮、单糖基柑橘黄酮的催化液；
S3、向步骤S2的催化液中加入β-糖苷酶，得到处理后催化液；
S4、将步骤S3的处理后催化液用大孔吸附树脂分离，得到高纯度柑橘黄酮糖苷。
作为优选，所述柑橘黄酮为橙皮苷/柚皮苷，所述糊精为麦芽糊精，所述高纯度柑橘黄酮糖苷为高纯度葡萄糖基橙皮苷/葡萄糖基柚皮苷。
作为优选，所述环糊精糖基转移酶来源于嗜碱芽孢杆菌(Bacillus sp.)，所述环糊精糖基转移酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述环糊精糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
作为优选，所述糖化酶来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)。
作为优选，所述β-糖苷酶来源于焦热球菌(Pyrococcus furiosus)，所述β-糖苷酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述β-糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
作为优选，所述大孔吸附树脂选自型号为XR919C、XAD-4、XAD-16、HP20中的一种或多种。
作为优选，步骤S1中温度为30～50℃，pH为8.5～11.5，柑橘黄酮质量浓度为3～7％，糊精质量浓度为6～14％，含所述环糊精糖基转移酶的湿菌体质量浓度为0.5～1.5％。
作为优选，步骤S2中温度为35～55℃，pH为2～6，含所述糖化酶的发酵产物的质量浓度为1％。
作为优选，步骤S3中温度为70～110℃，pH为5.5～8.5，含所述β-糖苷酶的湿菌体的质量浓度为1～3％。
本发明的另一目的，是提供通过上述高纯度柑橘黄酮糖苷的制备方法制备得到的高纯度柑橘黄酮糖苷。
本发明具有以下有益效果：
本发明采用环糊精糖基转移酶催化柑橘黄酮与糊精之间的糖基转移过程，之后采用糖化酶选择性降解多糖基柑橘黄酮至单糖基柑橘黄酮，随后采用β-糖苷酶选择性降解反应液中未转化的柑橘黄酮原料，最后通过大孔吸附树脂分离溶液中的单糖基柑橘黄酮。通过该方法制备得到的柑橘黄酮糖苷如葡萄糖基橙皮苷和葡萄糖基柚皮苷，具有较高的纯度，纯度可以达到95％以上。
附图说明
图1为环糊精糖基转移酶催化柑橘黄酮的糖基化修饰过程图(以橙皮苷为例)；
图2为环糊精糖基转移酶催化橙皮苷糖基化修饰后所得样品的液相分析结果图；
图3为环糊精糖基转移酶催化柚皮苷糖基化修饰后所得样品的液相分析结果图；
图4为喷雾干燥所得葡萄糖基橙皮苷样品的液相分析结果图；
图5为喷雾干燥所得葡萄糖基柚皮苷样品的液相分析结果图。
具体实施方式
本具体实施方式仅仅是对本发明的解释，并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读了本发明的说明书之后所做的任何改变，只要在权利要求书的范围内，都将受到专利法的保护。下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。
实施例1：重组工程菌的构建及环糊精糖基转移酶的异源表达
参考NCBI数据库报道的嗜碱芽孢杆菌(Bacillus sp.)来源的环糊精葡萄糖基转移酶的氨基酸序列(NCBI登录号NO.AAV38118)，加入His-tag纯化标签，交由基因合成公司(苏州金唯智生物科技有限公司)，经过密码子优化，人工合成环糊精葡萄糖基转移酶编码基因(核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示)，并克隆到表达载体pET22b的NcoI/BamHI之间，获得重组质粒pET22b-CGTase。
将重组质粒转化到表达宿主E.coli BL21(DE3)中，具体操作如下：取2μL重组质粒，加入到100μL的E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰水浴中放置30min。42℃热激45s，冰水孵育3min。加入900μL不含抗生素的LB培养基，37℃孵育60min使其抗性复苏。5000rpm离心2min，将菌体浓缩至100μL，均匀涂布在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB平板上。将平板倒置，于37℃过夜培养。
阳性克隆转化子的鉴定。在长有重组子的平板上，直接挑取6个单菌落至含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基里，在37℃培养过夜。利用生工生物工程(上海)有限公司的SanPrep柱式质粒提取试剂盒，提取质粒，并酶切验证和测序验证，最终得到含有的重组质粒的阳性克隆子。
将阳性克隆子接种在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基上进行复苏，37℃，200rpm的摇床中过夜培养10h后，以体积浓度5％的接种量转接至新鲜的含有50μg/mL氨苄青霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃，200rpm的摇床中培养3h；以体积浓度5％的接种量接种到含50mg/L氨苄青霉素的发酵培养基中，37℃培养5h，然后降低发酵温度至22℃，以3g/h/L起始发酵培养基的速率补加甘油，再以5.4g/h/L起始发酵培养基的速率补加乳糖，其中甘油共补加15h，乳糖共补加5h，22℃继续发酵16h，得到含环糊精糖基转移酶的发酵液，其湿菌体含量约为40g/L。
实施例2：通过米曲霉的固态发酵制备糖化酶
按质量百分数称取麸皮10％，豆饼粉3％，水87％，混合后置于121℃环境下加热30min后冷却至室温获得固态发酵培养基，之后接入米根霉孢子液，接种量为1％，随后置于28℃环境下培养3天获得固态发酵产物，并将发酵产物置于45℃真空干燥箱中干燥处理，固态发酵过程中需对培养基进行翻扒。
进一步对固态发酵产物进行糖化酶酶活检测，在100g/L麦芽糊精溶液中加入5g/L固态发酵产物，在45℃，pH＝4.0的条件下催化1h后采用DNS法测定溶液中还原糖的生成速率，约为6.75g/L/h，对应酶活为12.5U/g。同时检测所得糖化酶的催化选择性，将5g/L固态发酵产物加入至10g/L葡萄糖基橙皮苷溶液中，在45℃，pH＝4.0的条件下催化1h后液相检测葡萄糖基橙皮苷浓度不变，确保所得糖化酶不具备降解目标产物葡萄糖基橙皮苷的能力。
实施例3：重组工程菌的构建及β-糖苷酶的异源表达
参考NCBI数据库报道的焦热球菌(Pyrococcus furiosus)来源的β-糖苷酶的氨基酸序列(NCBI登录号WP_011011185)，交由基因合成公司(苏州金唯智生物科技有限公司)，经过密码子优化，人工合成β-糖苷酶编码基因(核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示)，并克隆到表达载体pET28a(+)的NcoI/BamHI之间，获得重组质粒pET28a(+)-BgaS。
将重组质粒转化到表达宿主E.coli BL21(DE3)中，具体操作如下：取2μL重组质粒，加入到100μL的E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰水浴中放置30min。42℃热激45s，冰水孵育3min。加入900μL不含抗生素的LB培养基，37℃孵育60min使其抗性复苏。5000rpm离心2min，将菌体浓缩至100μL，均匀涂布在含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上。将平板倒置，于37℃过夜培养。
阳性克隆转化子的鉴定。在长有重组子的平板上，直接挑取6个单菌落至含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基里，在37℃培养过夜。利用生工生物工程(上海)有限公司的SanPrep柱式质粒提取试剂盒，提取质粒，并酶切验证和测序验证，最终得到含有的重组质粒的阳性克隆子。
将阳性克隆子接种在含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基上进行复苏，37℃，200rpm的摇床中过夜培养12h后，以体积浓度2％的接种量转接至新鲜的含有50μg/mL卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃，200rpm的摇床中培养4h；以体积浓度5％的接种量接种到含50mg/L卡那霉素的发酵培养基中，37℃培养4h，然后降低发酵温度至24℃，以2.85g/h/L起始发酵培养基的速率补加甘油，再以2.5g/h/L起始发酵培养基的速率补加乳糖，其中甘油共补加14h，乳糖共补加8h，24℃继续发酵19h，得到含β-糖苷酶的发酵液，其湿菌体含量约为40g/L。
实施例4：催化制备葡萄糖基橙皮苷溶液
将按实施例1所述方法获得的含环糊精糖基转移酶的发酵液用于催化橙皮苷的糖基化修饰，催化过程如下：取50mL水中分别加入10％质量浓度的橙皮苷，之后加入20％质量浓度的糊精得到底物溶液，滴加2mol/L的NaOH溶液将pH调至10.0。将发酵液稀释至湿菌体质量浓度为2％后，滴加2mol/L的NaOH溶液将pH调至10.0。将底物溶液和发酵液按1:1体积比混合，在40℃的恒温水浴磁力搅拌器中催化16h，得到含葡萄糖基橙皮苷、橙皮苷和多糖基橙皮苷的混合溶液，催化过程以2mol/L的NaOH滴定调节pH使之维持在10.0。所得溶液的液相分析结果如图2所示。HPLC-UV检测条件如下：色谱柱为ODS InertSustainC18；流动相为乙腈/水(20：80v/v)，含0.1％的三氟乙酸，流速1mL/min，吸收波长283nm，进样体积为10μL，从图2可以看出，催化液中除葡萄糖基橙皮苷外还含有多糖基橙皮苷和橙皮苷杂质。
之后使用2mol/L的盐酸将溶液pH调节至4.0，并向溶液中加入5g/L如实施例2中所述的固态发酵物，在45℃条件下催化24h，催化过程以2mol/L盐酸滴定调节pH使之维持在10.0。该过程可将多糖基橙皮苷降解至葡萄糖基橙皮苷。
之后使用2mol/L的NaOH将溶液pH调节至5.5，将实施例3中所述的含β-糖苷酶的发酵液稀释至湿菌体质量浓度为4％后滴加2mol/L的NaOH溶液将pH调至5.5，将溶液和发酵液按1:1体积比混合，在90℃条件下催化24h后冷却至室温，催化过程以2mol/L的NaOH滴定调节pH使之维持在5.5。该过程可将橙皮苷降解至橙皮素。
实施例5：催化制备葡萄糖基柚皮苷溶液
将按实施例1所述方法获得的含环糊精糖基转移酶的发酵液用于催化柚皮苷的糖基化修饰，催化过程如下：取50mL水中分别加入质量浓度为10％的柚皮苷，之后加入质量浓度为20％的糊精得到底物溶液，将溶液升温至90℃，待底物溶解后冷却至室温，使用2mol/L的NaOH溶液将pH调至7.0。将发酵液稀释至湿菌体质量浓度为2％后滴加2mol/L的NaOH溶液将pH调至7.0。将底物溶液和发酵液按1:1体积比混合，在40℃的恒温水浴磁力搅拌器中催化16h，得到含葡萄糖基柚皮苷、柚皮苷和多糖基柚皮苷的混合溶液，催化过程以2mol/L的NaOH滴定调节pH使之维持在7.0。所得溶液的液相分析结果如图3所示。HPLC-UV检测条件如下：色谱柱为ODS InertSustain C18；流动相为乙腈/水(20：80v/v)，含0.1％的三氟乙酸，流速1mL/min，吸收波长283nm，进样体积为10μL，从图3可以看出，催化液中除葡萄糖基柚皮苷外还含有多糖基柚皮苷和柚皮苷杂质。
之后使用2mol/L的盐酸将溶液pH调节至4.0，并向溶液中加入5g/L如实施例2中所述的固态发酵物，在45℃条件下催化24h，催化过程以2mol/L盐酸滴定调节pH使之维持在4.0。该过程可将多糖基柚皮苷降解至葡萄糖基柚皮苷。
之后使用2mol/L的NaOH将溶液pH调节至5.5，将实施例3中所述的含β-糖苷酶的发酵液稀释至湿菌体质量浓度为4％后滴加2mol/L的NaOH溶液将pH调至5.5，将溶液和发酵液按1:1体积比混合，在90℃条件下催化24h后冷却至室温，催化过程以2mol/L的NaOH滴定调节pH使之维持在5.5。该过程可将柚皮苷降解至柚皮素。
实施例6：通过树脂吸附制备高纯度葡萄糖基柑橘黄酮
对实施例4和实施例5中最终溶液进行柱吸附处理。选用逊尔化工XR919C树脂，树脂用量为400g/L催化液，上样流速为0.5BV/h。上样结束后使用20％乙醇溶液进行洗涤，洗涤体积为6BV，流速为1BV/h。洗涤结束后使用30％的乙醇溶液进行洗脱，洗脱体积为4BV，流速为1BV/h。得到高纯度葡萄糖基橙皮苷和葡萄糖基柚皮苷溶液，将样品真空浓缩除去乙醇后喷雾干燥可获得高纯度葡萄糖基橙皮苷和葡萄糖基柚皮苷产品，产品液相分析结果如图4和图5所示，HPLC-UV检测条件如下：色谱柱为ODS InertSustain C18；流动相为乙腈/水(20：80v/v)，含0.1％的三氟乙酸，流速1mL/min，吸收波长283nm，进样体积为10μL。从图4和图5可以看出，最终得到了高纯度葡萄糖基橙皮苷和葡萄糖基柚皮苷。
Claims (10)
1.一种高纯度柑橘黄酮糖苷的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、以柑橘黄酮和糊精为底物，以环糊精糖基转移酶作为催化剂，获得含柑橘黄酮、单糖基柑橘黄酮、多糖基柑橘黄酮的催化液；
S2、向步骤S1的催化液中加入糖化酶，得到含柑橘黄酮、单糖基柑橘黄酮的催化液；
S3、向步骤S2的催化液中加入β-糖苷酶，得到处理后催化液；
S4、将步骤S3的处理后催化液用大孔吸附树脂分离，得到高纯度柑橘黄酮糖苷。
2.根据权利要求1所述的一种高纯度柑橘黄酮糖苷的制备方法，其特征在于，所述柑橘黄酮为橙皮苷/柚皮苷，所述糊精为麦芽糊精，所述高纯度柑橘黄酮糖苷为高纯度葡萄糖基橙皮苷/葡萄糖基柚皮苷。
3.根据权利要求1所述的一种高纯度柑橘黄酮糖苷的制备方法，其特征在于，所述环糊精糖基转移酶来源于嗜碱芽孢杆菌(Bacillus sp.)，所述环糊精糖基转移酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述环糊精糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述的一种高纯度柑橘黄酮糖苷的制备方法，其特征在于，所述糖化酶来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)。
5.根据权利要求1所述的一种高纯度柑橘黄酮糖苷的制备方法，其特征在于，所述β-糖苷酶来源于焦热球菌(Pyrococcusfuriosus)，所述β-糖苷酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述β-糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
6.根据权利要求1所述的一种高纯度柑橘黄酮糖苷的制备方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂选自型号为XR919C、XAD-4、XAD-16、HP20中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的一种高纯度柑橘黄酮糖苷的制备方法，其特征在于，步骤S1中温度为30～50℃，pH为8.5～11.5，柑橘黄酮质量浓度为3～7％，糊精质量浓度为6～14％，含所述环糊精糖基转移酶的湿菌体质量浓度为0.5～1.5％。
8.根据权利要求1所述的一种高纯度柑橘黄酮糖苷的制备方法，其特征在于，步骤S2中温度为35～55℃，pH为2～6，含所述糖化酶的发酵产物的质量浓度为1％。
9.根据权利要求5所述的一种高纯度柑橘黄酮糖苷的制备方法，其特征在于，步骤S3中温度为70～110℃，pH为5.5～8.5，含所述β-糖苷酶的湿菌体质量浓度为1～3％。
10.权利要求1～9任一项所述的方法制备得到的高纯度柑橘黄酮糖苷。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410076699.3A CN117925756A (zh) | 2024-01-18 | 2024-01-18 | 一种高纯度柑橘黄酮糖苷的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410076699.3A CN117925756A (zh) | 2024-01-18 | 2024-01-18 | 一种高纯度柑橘黄酮糖苷的制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117925756A true CN117925756A (zh) | 2024-04-26 |
Family
ID=90754988
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410076699.3A Pending CN117925756A (zh) | 2024-01-18 | 2024-01-18 | 一种高纯度柑橘黄酮糖苷的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117925756A (zh) |
-
2024
- 2024-01-18 CN CN202410076699.3A patent/CN117925756A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10683525B2 (en) | Method for producing 2-O-glyceryl-alpha-D-glucopyranoside | |
| US11203742B2 (en) | Sucrose phosphorylase mutant with improved enzyme activity and construction method thereof and use thereof | |
| EP4276171A1 (en) | Bacillus subtilis genetically engineered bacterium for producing tagatose and method for preparing tagatose | |
| CN112342232B (zh) | 一种适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌的构建方法 | |
| CN111662831A (zh) | 黑曲霉Rha-N1及其应用 | |
| CN112852796A (zh) | 一种纤维二糖差向异构酶突变体及其在制备乳果糖中的应用 | |
| CN112063678A (zh) | 一种Siamenoside I的生物合成方法 | |
| Liu et al. | A process for production of trehalose by recombinant trehalose synthase and its purification | |
| CN110184288A (zh) | 没食子酸和原儿茶酸的制备方法及其反应催化剂的制备方法 | |
| WO2024113827A1 (zh) | 一种低聚糖脱支酶突变体及其在葡萄糖母液中的应用 | |
| CN111455003A (zh) | 一种微藻制备d-阿洛酮糖的方法 | |
| CN117925756A (zh) | 一种高纯度柑橘黄酮糖苷的制备方法 | |
| CN106119235B (zh) | 一种来源于伯克霍尔德氏菌的dpe及其应用 | |
| CN116200318A (zh) | 一种胞外分泌表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌 | |
| CN113005132B (zh) | 一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因及其应用方法 | |
| CN112980754B (zh) | 一种枯草芽孢杆菌全细胞催化淀粉制备肌醇的方法 | |
| CN114107244A (zh) | 一种环糊精糖基转移酶突变体、编码基因及其应用 | |
| CN113403332B (zh) | 一种α-琼胶酶基因及其编码酶的应用 | |
| CN117511901A (zh) | 新型环糊精糖基转移酶突变体、编码基因及其应用 | |
| CN118222658B (zh) | 生物合成红景天苷的方法 | |
| CN114317476B (zh) | 葡萄糖基甘油的生物催化生产工艺及其蔗糖磷酸化酶 | |
| US20240254527A1 (en) | Bacillus subtilis genetically engineered bacterium for producing tagatose and method for preparing tagatose | |
| CN114231509B (zh) | 一种蔗糖磷酸化酶及葡萄糖基甘油生产工艺 | |
| CN115261367B (zh) | 一种纤维二糖差向异构酶突变体及其应用 | |
| WO2023169200A1 (zh) | 重组酵母菌及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |