MXPA02006302A - Procedimiento para la fabricacion de 6-9-alfa-d-glucopiranosil-d-sorbitol. - Google Patents

Abstract

La invencion presente se refiere a un procedimiento para la fabricacion enzimatica de 6-0-a-D- glucopiranosil-D-sorbitol (1,6-GPS) a partir de isomaltulosa. Esta previsto que la isomaltulosa se coloca en una solucion reactiva acuosa que contiene una entidad mostrando una actividad de sorbitol-hidrogenasa (SDH), que se incuba y que a continuacion se cosecha 1,6-GPS de la solucion reactiva.

Description

PROCEDIMIENTO PARA LA FABRICACIÓN DE 6-O-a-D- GLUCOPIRANOSIL-D-SORBITOL DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un procedimiento para la fabricación enzimática de 6-0-a-D-glucopiranosil-D-sorbitol (en lo siguiente 1,6-GPS) partiendo de isomaltulosa o sacarosa, asi como los medios para la realización de ese procedimiento. Se conocen procedimientos para la fabricación de 1, 6-GPS partiendo de sacarosa, que comprenden la transformación enzimática de sacarosa para obtener isomaltulosa y a continuación una hidrogenación por medios químicos de la isomaltulosa obtenida para formar ambos estereoisómeros 1,6-GPS y 1-0-a-D-glucopiranosil-D-manitol (a continuación 1,1-GPM). De la DE 44 14 185 Cl se conoce una isomerasa de sacarosa que cataliza la transformación de sacarosa a isomaltulosa . Schiweck (alimenta 19 (1980), 5-16) manifiesta la transformación enzimática de sacarosa a isomaltulosa seguida por la hidrogenación de la isomaltulosa en catalizadores de niquel de Raney para obtener Palatinit® (también llamado Isomalt) , una mezcla casi equimolar de 1, ß-GPS y 1,1-GPM. La publicación describe la fabricación de isomaltulosa mediante transglucosidación de sacarosa por Protaminobacter rubrum . Además se manifiesta como en presencia de catalizadores de niquel de Raney la isomaltulosa obtenida por los microorganismos se transforma mediante hidrogenación en 1,6-GPS y 1,1-GPM y como puede enriquecerse a continuación mediante cristalización por evaporación y enfriamiento. La DE 197 01 439 Al manifiesta una procedimiento para la hidrogenación de isomaltulosa mediante un catalizador de niquel unido a un portador, siendo que se obtienen mezclas de 1, 6-GPS y 1,1-GPM. La DE 197 05 664 Al describe un procedimiento para la fabricación de mezclas enriquecidas de 1,6-GPS o 1,1-GPM. En esa publicación se manifiesta un procedimiento mediente el cual se fabrican mezclas enriquecidas de 1,6-GPS y/o de 1,1-GPM partiendo de isomaltulosa hidrogenada o de mezclas que contengan isomaltulosa hidrogenada. Mediante estos procedimientos es posible fabricar 1,6-GPS puro, incrementando la concentración de lejia rica en 1,6-GPS en ciertas condiciones. La DE 195 23 008 Al manifiesta un procedimiento para la fabricación de 1,1-GPM y 1,6-GPS. El documento describe como diferentes catalizadores se emplean a presiones por debajo de 50 atmósferas de tal manera, que se obtienen mezclas de 1, 6-GPS y 1,1-GPM mediante hidrogenación de isomaltulosa. Los catalizadores manifestados, mediante los cuales se transforma la isomaltulosa, contienen rutenio, niquel asi como sus mezclas . De la EP 0 625 578 Bl se desprenden procedimientos para la obtención de mezclas de alcoholes y azúcares que contengan 1,1-GPM y 1,6-GPS mediante la transposición de sacarosa a isomaltulosa y trehalulosa asi como hidrogenación a continuación para obtener 1,1-GPM y 1-O-a-D-glucopiranosil-D-sorbitol (1,1-GPS) . Los procedimientos según el estado de la técnica se ven como desventajosas sobre todo por dos razones. Por un lado es posible otener solamente mezclas de 1,6-GPS y 1,1-GPM mediante los métodos conocidos, de los cuales debe aislarse la substancia de interés mediante procedimientos de separación químicos y físicos costosos. Por otro lado no es posible realizar el procedimiento completo de la transformación de sacarosa hasta el producto final deseado en un solo paso procedimental . El estado de la técnica requiere por lo tanto series de procedimientos bastante complicados para la fabricación de 1,6-GPS partiendo de sacarosa, siendo que se emplean varios pasos procedimentales físicos, químicos y biológicos en diversos reactores. Para la hidrogenación de la isomaltulosa se requieren según el actual estado de la técnica catalizadores, reactores especiales de hidrogenación asi como hidrógeno técnico. Una desventaja esencial de la hidrogenación conocida de isomaltulosa para obtener 1, 6-GPS y 1,1-GPM consiste por lo tanto en el aparato técnico requerido. Frecuentemente se requieren para la hidrogenación presiones de aproximadamente 50 hasta 100 atmósferas, lo que obliga al uso de instalaciones de aparatos específicos. Como los productos obtenidos generalmente se utilizarán en la industria alimenticia, debe seleccionarse el método procedi ental de tal manera que ningún material tóxico, por ejemplo, de los catalizadores, termina en el producto final de la reacción de hidrogenación. El producto obtenido es una mezcla de los componentes esenciales 1,6-GPS y 1,1-GPM, de los cuales debe separarse la substancia de interés en cada caso mediante métodos de limpieza químicos y quimico-fisicos . Para obtener 1,6-GPS o 1,1-GPM químicamente puro se requieren después de la conclusión de la hidrogenación química costosos procesamientos de enriquecimiento y aislamiento. El rendimiento de estos pasos procedimentales frecuentemente no es satisfactorio. El problema técnico que da origen a la invención presente consiste por lo tanto en la preparación de un procedimiento y de los medios para llevarlo a cabo, que posibilita la fabricación sencilla, económica y selectiva de 1, 6-GPS partiendo de isomaltulosa.

La presente invención resuelve este problema técnico mediante la facilitación de un procedimiento para la fabricación enzimática de 1,6-GPS partiendo de isomaltulosa, siendo que la isomaltulosa se agrega a una solución reactiva acuosa que contiene una entidad que muestra una actividad de sorbitol-dehidrogenasa (SDH) , se incuba y se obtiene 1, 6-GPS de la solución reactiva. La invención posibilita, por lo tanto, hidrogenar isomaltulosa por via bioquímica o enzimática para obtener 1,6-GPS mediante una entidad que muestra una actividad SDH. La entidad utilizada inventivamente que muestra una actividad SDH reduce isomaltulosa específicamente a 1,6-GPS. La entidad que muestra actividad SDH se caracteriza porque está en posición de transformar isomaltulosa o mezclas que la contengan en 1,6-GPS por via enzimática. La ventaja de la transformación enzimática de isomaltulosa a 1,6-GPS reside, en adición a la mayor sencillez del procedimiento que posibilita, además en la alta especifidad de reacción, substrato y estereoisomeria, en la uniformidad del producto reactivo, en el ahorro de energia y materia prima asi como su compatibilidad con el ambiente medio. La invención se refiere por lo tanto a la enseñanza sorprendente que mediante un procedimiento enzimático especifico puede fabricarse de manera completamente deliberada 1,6-GPS partiendo de isomaltulosa.

Inventivamente se coloca el educto isomaltulosa en una solución reactiva acuosa que contiene la entidad con la actividad de sorbit-dehidrogenasa (SDH) y se incuba durante suficiente tiempo para que se forme 1,6-GPS y se pueda obtener de la solución reactiva mediante procedimientos conocidos, por ejemplo cristalización. En el contexto de la presente invención se entiende por solución reactiva acuosa agua sin tampón o agua tamponeado mediante algún sistema de tampón usual que contiene según condiciones de partida y de resultado substancias adicionales como estabilizadores, sistemas de indicación, equivalentes de reducción, medios de regeneración, compuestos del medio de cultivo, sales, azúcares, alcoholes de azúcar, etc. En una forma de ejecución preferida de la invención, la entidad mostrando actividad SDH es la enzima SDH. Para la transformación enzimática inventiva de isomaltulosa a 1, 6-GPS es posible agregar la entidad mostrando actividad SDH, es decir la enzima SDH, en forma limpia, enriquecida y/o aislada a la solución reactiva, siendo que la enzima, por ejemplo, puede ser de origen natural. Desde luego es posible que la SDH utilizada inventivamente sea una SDH inventiva preparada de manera recombinante a partir un organismo modificado mediante ingeniería genética. Es ventajoso utilizar SDH aislada, si se desean llevar a cabo investigaciones de la cinética de la transformación de isomaltulosa a 1, 6-GPS, para la optimización de esta reacción. En particular exigen todas las cuestiones que se ocupan del equilibrio químico de la transformación de isomaltulosa a 1,6-GPS que se trabaje con enzimas aisladas, ya que de otra forma no seria posible analizar con suficiente precisión la estequiometria, los constantes de disociación, cuestiones de la inhibición o activación de la enzima, problemas de la cooperatividad, de la velocidad inicial, de la conformación, de los ligantes y todos los demás problemas de la cinética enzimática y de los datos interesantes de enlace. Sobre todo, para estar en posición de influenciar la reacción de manera deliberada, es ventajoso que la actividad SDH se presente de manera aislada, ya que de otra forma no se puede excluir que a causa del efecto recíproco con otros componentes de la solución reactiva los resultados de las modificaciones del valor pH, de la concentración de iones y de la temperatura no sean reproducibles, ya que enicmas sometidas a limpieza, parcialmente limpias y adheridas a células muestran valores divergentes en el análisis. La invención por lo tanto se refiere también a un procedimiento para el aislamiento parcial o completo de una SDH de microorganismos, particularmente de microorganismos de la especie gluconobacter, especialmente preferido de la especie Gluconobacter suboxidans, siendo que en un primer paso se desintegran los microorganismos mediante procedimientos usuales y se homogenizan para obtener un extracto crudo, en un segundo paso se hace la separación de los extractos crudos mediante cromatografía de intercambio aniónico, en un tercer paso una filtración por gel y en un cuarto paso una cromatografía por afinidad de colorantes. De manera preferida está previsto inventivamente obtener la limpieza hasta homogeneidad de la enzima parcialmente limpia obtenida después de la cromatografía por afinidad mediante focalización cromática, o en otra ejecución preferida mediante cromatografía por afinidad de colorantes adicional, seguido por elución de afinidad con por lo menos un equivalente reductivo. En una forma de ejecución particularmente preferida, la invención se refiere a un procedimiento para el aislamiento de SDH de un microorganismo, siendo que el microorganismo se desintegra en un primer paso del procedimiento y se homogeniza para formar un extracto crudo, en un segundo paso de procedimiento el extracto crudo se somete a cromatografía por intercambio aniónico, en un tercer paso de procedimiento a una primera cromatografía por afinidad de ligantes de color y en un cuarto paso de procedimiento una segunda cromatografía por afinidad de ligantes de color. En una forma de ejecución muy particularmente preferida, la invención se refiere a un procedimiento precedentemente mencionado, siendo que después de la primera y antes de la segunda cromatografía por afinidad de ligantes de color se hace una ultrafiltración. En una forma de ejecución particularmente preferida se hace a continuación del procedimiento precedentemente mencionado, o sea después de la segunda cromatografía por afinidad de ligantes de color, una elución de afinidad de la SDH pura, siendo que se usa un equivalente reductivo, especialmente NADH. En otra forma de ejecución preferida, la entidad mostrando actividad NDH es un microorganismo vivo o muerto que contenga SDH o un extracto crudo o un homogeneiato de el. La transformación prevista inventivamente de manera preferida con microorganismos muertos, particularmente preferido con microorganismos disecados, se hace en una forma preferida de la presente invención después de la rehidratación de estos en presencia de una solución enzimática de SDH de acuerdo a métodos estándar, por ejemplo, agregando tanino y/o aldehido glutárico y es ventajoso, porque la enzima soluble se agrupa en altas concentraciones firmememente alrededor del microorganismo. Desde luego es posible también hacer la rehidratación con agua o también desistir completamente de una rehidratación separada, de tal manera que los organismos muertos se agregan directamente a la solución reactiva acuosa. La transformación inventivamente prevista de isomaltulosa mediante microorganismos vitales tiene entre otras la ventaja, que es posible efectuarla con relativamente poca complejidad. Bioreactores en las que se _ usan microorganismos pueden usarse normalmente en cualquier parte y exigen en comparación con las transformaciones químico-catalíticas de isomaltulosa a 1,6-GPS una inversión menor en cuanto a energía y mantenimiento. Desde luego es necesario seleccionar las condiciones reactivas (valor pH, concentración de iones, requerimiento de oxígeno/bióxido de carbono, oligoelementos, temperaturas, etc. ) de tal manera, que los microorganismos estén en condiciones de una óptima transformación de isomaltulosa a 1,6-GPS. Bajo esas condidiones de procedimiento, la SDH puede mostrar una estabilidad y efectividad mayor en el microambiente natural, o sea dentro de la célula, que la enzima aislada. Además, bajo condiciones adecuadas, puede posibilitarse una propagación de células y con esto un incremento en la concentración de SDH. Frente al estado de la técnica, según el cual es necesario trabajar con catalizadores y hidrógeno técnico de costosa preparación, la transformación enzimática significa por lo tanto una ventaja en lo que se refiere a confiabilidad, automatización y sencillez así como calidad y rendimiento de producto final del procedimiento . Inventivamente está previsto en una forma de ejecución preferida, separar o unir ciertos compartimentos de célula o sus partes. Estructuras de hidrocarburos, lípidos o proteínas y/o péptidos así como ácidos nucleicos que están en posición de influenciar la entidad mostrando actividad de SDH respectivamente la enzima positiva o negativamente, pueden unirse o separarse de tal manera. Para evitar esta influencia o usarla deliberadamente, se fabrican extractos crudos de los microorganismos. Esto puede hacerse mediante sonorización, compresión, homogenización, mezcla con esferas de vidrio, mediante detergentes, influencia de campos eléctricos, operación mecánica en nitrógeno líquido o digestión enzimática de membrana y paredes celulares. En un subsecuente paso puede en una forma de ejecución preferida centrifugarse el extracto obtenido para proceder con la transformación inventiva con el sobrenadante o el sedimento. La preparación del extracto ofrece además la ventaja, que mediante simple medición de la extinción se puede determinar la relación entre ácido nucleico y enzima. Ya que bajo ciertas condiciones de procedimiento puede ser necesario separar los ácidos nucleicos, porque estos pueden formar complejos con la entidad mostrando actividad SDH y pueden disminuir de tal manera la eficiencia de la transformación de isomaltulosa a 1,6-GPS. La preparación de un extracto crudo en sentido de la invención incluye también todas las medidas para estabilizar el extracto crudo, respectivamente para optimizar su efecto catalítico. A esto puede referirse tanto la adición de sulfuro de protamina, cloruro de manganeso y lisozima, como la modificación de la intensidad iónica y cualquier medida que sirve a modificar la actividad de proteasa del extracto crudo inventivo de tal manera que se optimice su efecto. En otra forma de ejecución preferida, el microorganismo que contiene SDH o el organismo del cual proviene el SDH completa o parcialmente limpia, es un organismo de la especie Gluconobacter, particularmente Gluconobacter suboxidans DSM 2003. Particularmente en la combinación preferentemente prevista con el sistema de regeneración coenzimática SDH/FDH (formiat-dehidrogenasa) es posible obtener un muy buen rendimiento de 1,6-GPS con estas cepas. Sin embargo, la transformación enzimática de ningunga manera queda restringida a estas dos cepas. Todos los organismos, particularmente microorganismos, que tengan la capacidad de transformar isomaltulosa en uno a varios pasos a 1, 6-GPS pueden usarse inventivamente, por ejemplo, también fungi, levaduras, cultivos de células, etc.. Ahí pueden estar incluidos mutantes, variantes modificadas con ingeniería genética o preparadas de otra forma o aisladas de los organismos precedentemente mencionados, por ejemplo, organismos que tengan una actividad SDH gracias a la introducción de una secuencia de nucleótidos que codifique SDH. Se prefieren organismos que también muestren una actividad de sacarosa-mutasa, para que mediante un solo tipo de organismo sacarosa puede transformarse enzimáticamente a 1,6-GPS. En otra forma de ejecución preferida, las entidades inventivas con actividad SDH, particularmente microorganismos, extractos crudos, sus partes y/o las enzimas enriquecidas o aisladas son inmovilizadas. Mediante inmovilización, las encimas, los orgánulos celulares y las células se ponen en un estado insoluble y limitado respecto a su espacio reactivo. Inventivamente se inmoviliza la entidad mostrando actividad SDH bajo condiciones en las que muestra una actividad enzimática de SDH de lo más alto posible. Inventivamente también se prevee la inclusión de células vitales en polímeros. La inmovilización puede hacerse mediante (i) enlace así como también mediante (ii) inclusión. En el caso de una inmovilización mediante enlace de la entidad mostrando actividad SDH existen enlaces de portador (iónicos o covalentes) y reticulación transversal (reticulación mutua y reticulación con otros polímeros) . En el caso de inmovilización mediante inclusión de la entidad mostrando actividad SDH está prevista una inclusión en estructuras de gel (esferas, fibras y similares) y en membranas (microcápsulas y reactores de membrana) . Bajo inmovilización se entiende por lo tanto todos los métodos que sirven para limitar la movilidad y la solubilidad de la entidad mostrando actividad SDH por medios biológicos, químicos o físicos. Esto puede hacerse en particular mediante adsorción a substancias portadoras inertes o cargadas eléctricamente, inorgánico u orgánico, siendo que las substancias inorgánicas son, por ejemplo, vidrios porosos, sílice gelatinoso, óxido de aluminio, hidroxilapatita u óxidos metálicos; los polímeros naturales pueden ser, por ejemplo, celulosa, almidón, dextrano o agarosa y polimeros sintéticos pueden ser poliacrilamida, alcohol polivinílico, Nylon u otros. Inventivamente se prevee también incluir la entidad mostrando actividad SDH en una retícula tridimensional; esto según una forma de ejecución de la invención puede ser gelatina o agar. También puede ser previsto efectuar la inmovilización mediante reticulación transversal con agentes bifuncionales como dialdehido glutárico o bencidina. También es posible una microencapsulación de la entidad mostrando actividad SDH que lleva a la limitación del espacio reactivo con la ayuda de membranas artificiales o naturales. La invención comprende también una inmovilización sin portador mediante floculación y "cross-linking" tanto como una coinmovilización de células vivas y/o muertas con enzimas libres o inmovilizados. También el incremento del peso molecular, por ejemplo, mediante enlace con dextrano, sirve para la inmovilización en el sentido de la invención. La enzima inmovilizada puede ser también una enzima que está unida a compartimentos de un microorganismo o a un organismo completo con vida o seco, sin embargo, en el sentido de la invención, inmovilizado puede significar también, que la enzima sola o la enzima en combinación con compartimentos de organismos estén unidas a un portador. Importante es que la matriz cargada pueda hacer contacto con la isomaltulosa de tal manera que la deseada reacción enzimática para formar 1,6-GPS ocurre. Sin embargo, la invención se refiere desde luego también al uso de las entidades con actividad SDH en forma libre, es decir en forma no inmovilizada. En otra forma de ejecución preferida, la transformación enzimática inventiva se hace con o sin regulación del valor pH. En particular, como en la forma de ejecución particularmente preferida se aplican equivalentes reductivos en forma de transportadores de hidrógeno, la selección del valor pH tiene influencia sobre el rendimiento total de 1,6-GPS. De acuerdo a esto es posible clasificar la transformación enzimática de isomaltulosa a 1, 6-GPS en reacciones, en las que no se lleva a cabo regulación del valor pH y en aquellas, en las que se lleva a cabo una regulación del valor pH. La regulación del valor pH puede hacerse mediante adición o cesión de substancias que están en la posición de incrementar, disminuir o estabilizar el valor pH. Inventivamente pueden usarse ácidos o bases de conformidad con las definiciones de Lowry-Brónsted o Le is-Pearson, siendo que protones, iones de hidronio, iones de hidróxido, o pares de electrones libres son cedidos respectivamente se vuelven disponibles o son absorbidos. Por ejemplo, puede preverse una fumigación de la solución reactiva acuosa con C02, que es - como inducción de un ácido - una medida para regular el valor pH. Puede buscarse de manera ventajosa que el valor pH se fije en un rango que se juzga óptimo para la actividad de la enzima. Este óptimo puede lograrse mediante diversos tampones o mediante la adición de substancias que disminuyan o incrementen el valor pH. En general, sin embargo, de ninguna manera se limita la regulación del valor pH a procedimientos químicos como, por ejemplo, procesos de formación de complejos, titraciones o similares. Cualquier intervención en el sistema que tenga como consecuencia que el valor pH se pueda regular o estabilizar de cualquier manera, queda comprendido como ejecución de una regulación del valor pH en el sentido de la invención. En ejecución ventajosa de la invención, el valor pH de la solución reactiva acuosa se ubica alrededor de 6.0 hasta 8.0, de preferencia en pH 7.0. En una forma de ejecución preferida de la invención, se agregan a la solución reactiva acuosa en adición a la entidad mostrando actividad SDH también equivalentes reductivos, especialmente cuando se usa SDH limpia o aislada. Equivalentes reductivos en el sentido de la presente invención son transportador-es de hidrógeno o de electrones, que pueden presentarse en forma de coenzimas de grupos prostéticos. Tales equivalentes reductivos pueden ser, por ejemplo, NAD+/NADH, NADP+/NADPH, FMN/FMNH2 o FAD/FADH2. Coenzimas y grupos prostéticos de reacciones de oxidoreducción sirven como transportadores de hidrógeno y/o de electrones disociables y/o firmemente enlazados a proteinas. Sin embargo, también otros coenzimas o grupos prostéticos pueden servir como equivalentes reactivos, siempre que tengan la capacidad de transferir átomos de hidrógeno respectivamente electrones. Preferidos inventivamente son en particular tetrapirroles cíclicos, glutatión, ácido lipóico, quinonas, proteinas de fierro y azufre, flavoproteinas, flavinucleótidos y todos los demás que puedan transferir protones, átomos y/o electrones respectivamente grupos funcionales durante la catalización enzimática.

De manera preferida se usan células vivas que muestran actividad SDH para la fabricación enzimática de 1,6-GPS , de manera que se no es necesaria la adición de equivalentes reductivos. En otra forma de ejecución especialmente preferida se hace la transformación enzimática de isomaltulosa a 1,6-GPS en presencia de medios de regeneración como formiat-dehidrogenasa (FDH) y/o formiato, particularmente cuando se usa SDH limpia o aislada. Mediante la adición de SDH y FDH a la solución reactiva acuosa se hace posible una reacción química durante la cual formiato se transforma continuamente en C02 e isomaltulosa en 1,6-GPS. La transformación del formiato en C02 se hace por FDH como intermediario. Los átomos de hidrógeno absorbidos por los medios de reducción, por ejemplo NAD+, presentes también en la solución reactiva durante esa oxidación, se utilizan durante la reducción de isomaltulosa a 1,6-GPS, que transcurre en paralelo. Desde luego pueden considerarse también dehidrogenasas o enzimas completamente distintas en lugar del FDH, con otras especificaciones de substrato, como coenzima del sistema de regeneración, o sea como medio de regeneración. Por ejemplo es posible usar otros ácidos orgánicos respectivamente sus sales como medio de regeneración. De importancia es que las substancias adicionadas, particularmente FDH/formiato, puedan reaccionar con los transportadores de hidrógeno, las coenzimas o los grupos prostéticos de tal manera, que electrones y/o hidrógeno se transfieren de tal forma que la formación continua de 1, 6-GPS sea posible. En el caso de la utilización de células vivas como entidad mostrando actividad SDH puede suprimirse la adición de medios de regeneración y equivalentes reductivos. En otra forma más de ejecución preferida se hace la transformación de isomaltulosa a 1,6-GPS en el marco de un proceso continuo. El proceso continuo puede llevarse a cabo en un reactor de circulación, donde tiene lugar el crecimiento de microbios y por lo tanto la formación de producto, la síntesis de 1,6-GPS. De esta manera pueden fabricarse muy grandes cantidades de 1,6-GPS. Mediante la aplicación del proceso continuo pueden seleccionarse también libremente los ciclos de limpieza y de preparación y no están preestablecidos por los parámetros de termentadores específicos o de propiedades fisiológicas determinadas de los microorganismos, ya que en los sistemas continuas el ambiente que rodea los microorganismos no se modifica por el consumo de substratos y la generación de productos, porque los productos se retiran y los substratos se agregan continuamente. Además es posible construir los bioreactores o instalaciones en el proceso continuo de forma mucho más pequeña y económica. Bajo proceso continuo se entienden también en el sentido de la invención todas las medidas complementarias tendientes a evitar el peligro de infección con otros organismos, que pueden propagarse rápidamente en el sistema debido a la circulación del substrato. Esto puede incluir condiciones estériles y no estériles . La presente invención se refiere también a medidas de procedimiento y medios tendientes a disponer la fermentación continua mediante condiciones extremas de tal forma que estas sean estables contra posibles infecciones debido a las condiciones extremas seleccionadas (por ejemplo tamponar con un valor pH muy bajo o aplicación de antibiotica) . En eso pueden aplicarse variaciones o modificaciones de las premencionadas entidades con actividad SDH adaptadas a estas condiciones hostiles a las infecciones, por ejemplo microorganismos resistentes a los antibióticos. Bajo un proceso continuo en el sentido de la invención puede entenderse también, sin embargo, cualquier sistema de células en crecimiento y enzimas catalizantes al cual por un lado se agrega una solución de cultivo y del otro se extrae solución de cultivo, incluyendo 1,6-GPS formado enzimáticamente; ahí puede tratarse tanto de sistemas homogéneas como de sistemas inhomogéneas. La invención se refiere desde luego también a modos de procedimiento semicontinuos y por lotes. En una forma más de ejecución preferida se prepara la isomaltulosa, que forma la materia prima para la reacción de transformación a 1,6-GPS, mediante transformación enzimática de sacarosa. La isomaltulosa aplicada en el procedimiento inventivo puede fabricarse mediante transformación enzimática (transglucosidación) mediante enzimas limpias o enriquecidas, extractos crudos o microorganismos partiendo de sacarosa que muestre una actividad de sacarosa-mutasa. En conexión con la presente invención se entiende por sacarosa-mutasa por lo tanto una enzima que pueda isomerizar la sacarosa a isomaltulosa y que se conoce también como sacarosa-isomerasa. Ejemplos para células que contengan una proteina con secuencias de nucleótidos que codifiquen una actividad de sacarosa-mutasa, son particularmente microorganismos de las especies Protaminobacter, Erwinia , Serra tia , Leuconostoc, Pseudomonas , Agrobacterium, Klebsiella y Enterobacter. Ejemplos específicos para tales microorganismos son Protaminobacter rubrum (CBS 547, 77), Erwinia rhapontici (NCPPB 1578), Serratia plymuthica (ATCC 15928), Serratia marcescens (NCIB 8285), Leuconostoc mesenteroides NRRL B-521f (ATCC 10830a) , Pseudomonas mesoacidophila MX-45 (FERM 11808 respectivamente FERM 12397), Agrobacterium radiobacter MX-232 (FERM 12397 respectivamente FERM BP 3620), Klebsiliella subspecies y Enterobacter species .

Ejemplos específicos para proteinas con actividad de sacarosa-mutasa y ácidos nucleicos que codifican para ello de- . rubrum, E. rhapontici , Enterobacter spec . SZ62 y P. mesoacidophila están descritos en PCT/EP 95/00165. Las células o proteinas o secuencias de nucleótidos de estas células mencionados pueden usarse, por ejemplo, introduciendo las secuencias de nucleótidos que codifican para SDH bajo el control de entidades regulatorias en las células precentemente mencionadas y exprimiéndolas . En una forma de ejecución particularmente preferida se hace la transformación enzimática de sacarosa a isomaltulosa por medio de células P. rubrum ( Protaminobacter rubrum) preferentemente inmovilizados o mediante una desintegración de células o de un extracto crudo de P. rubrum o mediante sacarosa-mutasa parcialmente o completamente limpia (también sacarosa-isomerasa) . Esta transformación se hace preferentemente en una solución reactiva junto con la transformación pendiente del SDH de isomaltulosa a 1,6-GPS. La inmovilización de células con sacarosa-mutasa, por ejemplo, P. rubrum, de sus desintegraciones celulares o de la enzima aislada (sacarosa-mutasa) sirve para limitar la movilidad y la solubilidad de los biocatalizadores utilizados por medios biológicos, químicos y/o físicos. La inmovilización en el sentido de la invención puede hacerse por varios métodos, como por ejemplo unión de biocatalizadores entre si o con substancias portadoras, mediante fijación en la retícula de una matriz polímera o mediante envoltura con membranas artificiales o naturales, lo que incluye desde luego el uso de micelas inversas. Mediante inmovilización de las células, la desintegración de células o/y la sacarosa-mutasa, los biocatalizadores así producidos no solamente se vuelven reutilizables, sino sobre todo pueden separarse fácilmente después o durante el proceso, para reemplazarlos en dado caso con otros catalizadores que catalizan otros procesos, como la transformación de isomaltulosa a 1,6-GPS. Una ventaja esencial es que células o enzimas, gracias a la inmovilización, pueden usarse en concentraciones locales mucho más altas y sobre todo en sistemas de circulación continua. La inmovilización puede en eso hacerse en portadores cerámicos, en polimeros, en varios geles y gelatinas, por inclusión en poliacrilamida o mediante otros procedimientos. En otra forma de ejecución preferida la transformación de sacarosa a isomaltulosa y de isomaltulosa a 1,6-GPS se hace en un solo paso procedimental, quiere decir que ambas reacciones de transformación enzimática ocurren al mismo tiempo o ligeramente desfasadas en una sola solución reactiva acuosa. La transformación de sacarosa a 1, 6-GPS puede hacerse en un paso procedimental, porque las dos reacciones enzimáticas individuales pueden transcurrir bajo condiciones de procedimiento parecidas. En una forma de ejecución paricularmente preferida, la transformación de sacarosa a 1, 6-GPS se hace en un solo bioreactor (la así llamada "reacción de puchero") . Estas configuraciones de la invención incluyen la fabricación enzimática directa de 1,6-GPS partiendo de sacarosa, siendo que tanto para la transformación de sacarosa a isomaltulosa como también de isomaltulosa a 1,6-GPS pueden usarse las células no inmovilizadas e inmovilizadas, los extractos crudos y/o las enzimas precedentemente mencionados, los que por lo tanto muestren en su caso actividades de SDH y de sacarosa-mutasa. Inventivamente, la transformación es posible también en una fermentación por lotes y/o de Fed Batch (una fermentación discontinua) , siendo que el medio de cultivo se inocule en un punto de tiempo determinado y la fermentación se termina después del consumo del substrato limitado, lo que puede ser, por ejemplo, sacarosa, otros substratos o enzimas/coenzimas - o en algún momento oportuno diferente. Las condiciones de la reacción pueden seleccionarse, sin embargo, también de tal forma, que la influencia limitante de un substrato queda casi eliminada. Reacciones por lotes pueden llevarse a cabo en un así llamado sistema cerrado. Estos sistemas deben considerarse inventivamente también como cerrados, cuando se agrega a la fase líquida cerrada continuamente oxígeno, aire u otro gas o mezcla de gases. En un proceso por lotes, el ambiente de las células cambia continuamente ya que puede suceder una reducción del substrato y bajo ciertas circumstancias también un incremento de la concentración de células. El así llamado "proceso de potaje" puede llevarse a cabo en el sentido de la invención también bajo mantención del equilibrio de circulación - bajo continua evacuación de 1, 6-GPS - como catálisis enzimática continua. En otra forma de ejecución preferida, la temperatura de la solución reactiva acuosa durante la transformación enzimática es de 20°C hasta 40°C, particularmente de 25 °C. A la temperatura de 25 °C, la SDH limpia muestra una estabilidad de aproximadamente una semana. Por lo tanto, las temperaturas en este rango están muy adecuadas para llevar a cabo un proceso catalítico enzimático de mayor duración. En otra forma de ejecución preferida, la invención se refiere a un procedimiento para la fabricación de 1, 6-GPS partiendo de sacarosa, siendo que la sacarosa debe transformarse primeramente por vía enzimática en isomaltulosa y a continuación la isomaltulosa enzimáticamente en 1,6-GPS. Todo este procedimiento puede transcurrir de manera continua, semicontinua o discontinua, en uno o en varios pasos procedimentales y en uno o varios bioreactores. La invención se refiere también a una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima con la actividad de una sorbitol-dehidrogenasa (SDH) , seleccionado del grupo consistente de a) moléculas de ácido nucleico que codifican una proteina que muestra la secuencia de aminoácidos indicada bajo SEQ ID Nr. 1 o un tramo complementario de ella; b) moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de nucleótidos presentada bajo SEQ ID Nr. 2 o un tramo complementario de ella; c) moléculas de ácido nucleico que hibridan con una molécula de ácido nucleico mencionada baja a) o b) ; d) moléculas de ácido nucleico, cuya secuencia de nucleótidos difiere de la secuencia de las moléculas de ácido nucleico mencionadas bajo b) o c) debido a la degeneración del código genético. En conexión con la presente invención, se entiende bajo una enzima con una actividad de sorbitol-dehidrogenasa una proteina o un péptido que está capaz de catalizar la transformación de isomaltulosa en 1,6-GPS. En esto, la isomaltulosa por convertir puede haberse generado mediante la transformación enzimática de sacarosa. Las moléculas de ácido nucleico inventivas pueden aislarse de fuentes naturales, preferentemente de Gluconobacter spec. , o pueden sintetizarse mediante procedimientos conocidos. Es posible mediante técnicas de biología molecular usuales integrar una variación de mutaciones a las moléculas de ácido nucleico inventivas, lo que conduce a una síntesis de enzimas con propiedades biológicas modificadas, que también están comprendidas por la invención. Mutaciones en el sentido de la invención se refiere también a todas las mutaciones de supresión que conducen a enzimas recortadas. Mediante otros mecanismos moleculares, como inserciones, duplicaciones, transposiciones, fusión de genes, intercambio de nucleótidos, pero también transferencia de genes entre diferentes cepas de microorganismos y otros pueden producirse, por ejemplo, modificaciones de la actividad enzimática y/o la regulación de la enzima. De esta manera pueden, por ejemplo, prepararse enzimas mutantes que tienen un valor Km, Ki o Ka modificado y/o que ya no están sujetas o están sujetas de forma alterada a los mecanismos de regulación normalmente presentes en células. Además pueden prepararse inventivamente enzimas mutantes que muestran una estabilidad, especificación de substrato o de producto diferentes o un esquema variado de efectores o un perfil modificado de actividades, de temperatura, de valor pH y/o de concentración. Además, la enseñanza inventiva se refiere a enzimas que muestran una concentración enzimática activa modificada, una construcción alterada de las subunidades, modificaciones pre y postraslacionales, por ejemplo, péptidos de signalización o de transporte y/u otros grupos funcionales . La invención se refiere también a moléculas de ácido nucleico que hibridan con las premencionadas moléculas inventivas de ácido nucleico. Hibridación significa en el marco de la invención una hibridación bajo condiciones convencionales de hibridación, como se encuentran descritos en Sambrook et al. (Molecular Cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a edición, 1989), preferentemente condiciones exactas. Conforme la invención presente se habla de una hibridación, cuando después de lavar por una hora con 1 x SSC y 0.1% SDS a 55°C, preferentemente a 62°C y de manera particularmente preferida a 68 °C, especialmente durante 1 hora en 0.2 x SSC y 0.1% SDS a 55°C, preferentemente a 62 °C y de manera particularmente preferida a 68 °C, aún se observa una señal positiva de hibridación. Una secuencia de nucleótidos en estado de hibridación bajo tales condiciones de lavado con una de las secuencias de nucleótidos indicadas en los protocolos de secuencia, es una secuencia de nucleótidos inventiva . La identificación y el aislamiento de tales moléculas de ácido nucleico puede en eso hacerse mediante el uso de las moléculas de ácido nucleico inventivas o de partes de estas moléculas respectivamente del tramo complementario. Como prueba de hibridación pueden usarse, por ejemplo, moléculas de ácido nucleico, que son exactas o que esencialmente muestran la secuencia de nucleótidos mostrada bajo SED ID Nr. 2 o partes de esa secuencia. En el caso de los fragmentos usados como prueba de hibridación puede tratarse también de fragmentos sintéticos, que se preparan con la ayuda de las técnicas de síntesis usuales y cuya secuencia coincide esencialmente con la de una molécula de ácido nucleico inventiva. Las moléculas que hibridan con las moléculas de ácido nucleico inventivas incluyen también fragmentos, derivados y variantes alelas de las moléculas de ácido nucleico arriba descritas, que codifican una enzima inventiva. Bajo "fragmentos" se entiende en esto partes de las moléculas de ácido nucleico, que son suficientemente largas para codificar la enzima descrita. La expresión "derivado" significa en relación con la invención, que las secuencias de estas moléculas se distinguen de las moléculas de ácido nucleico arriba descritas en una o varias posiciones, pero que muestran un alto grado de homología con esas secuencias. Homología significa en eso una identidad de secuencia de por lo menos 40%, particularmente una identidad de por lo menos 60%, de preferencia más de 80% y especialmente preferido más de 90%, 95%, 97% o 99% a nivel de ácido nucleico. En esto muestran las enzimas codificadas mediante estas moléculas de ácido nucleico una identidad secuencial de por lo menos 80% con la secuencia de aminoácido indicada en SEQ ID Nr. 1, preferentemente de 85% y especialemente preferido de más de 90%, 95%, 97% y 99% an nivel de aminoácido. Las desviaciones respecto a las moléculas de ácido nucleico arriba descritas pueden haberse originado, por ejemplo, mediante supresión, sustitución, inserción o recombinación. Puede tratarse en esto tanto de variantes que ocurren naturalmente, como por ejemplo de secuencias de otros organismos o de mutaciones, siendo que tales mutaciones pueden haber ocurrido de forma natural o inducidas mediante mutagenesis deliberada (rayos ultravioletos o rayos X, agentes químicos y otros) . Además puede tratarse en el caso de las variaciones de secuencias preparadas sintéticamente. En el caso de las variaciones alelas puede tratarse tanto de variantes que ocurren naturalmente como de variantes preparados sintéticamente o mediante técnicas de ADN recombinantes. Las enzimas codificadas por las diferentes variantes de las moléculas de ácido nucleico inventivas muestran ciertas características comunes, tales como actividad enzimática, concentración enzimática activa, subunidades, modificaciones postranslacionales, grupos funcionales, peso molecular, reactividad imunológica, conformación y/o propiedades físicas, como comportamiento de flujo en electroforesis sobre gel, comportamiento cromatográfico, coeficientes de sedimentación, solubilidad, propiedades espectroscópicas, estabilidad, valor de pH óptimo, valor de pH isoeléctrico, óptimo de temperatura y/u otros. En el caso de las moléculas de ácido nucleico inventivas puede tratarse tanto de moléculas de ADN como de ARN. Moléculas de ADN inventivas son por ejemplo moléculas del ADN de genoma c cADN. La invención se refiere además a vectores que contengan moléculas de ácido nucleico inventivas. Preferentemente se trata en esto de plásmidos, cósmidos, virus, bacteriófagos, vectores shuttle y otros vectores usuales en la ingeniería genética. Los vectores inventivos pueden poseer además otras entidades funcionales que causan o contribuyen a una estabilidad y/o replicación del vector en el organismo huésped. En una forma de ejecución especial, se comprenden también los vectores en los que la molécula del ácido nucleico inventiva está unida operativamente a por lo menos un elemento regulatorio que garantiza la transcripción y síntesis de moléculas de ácido nucleico traslatables en células procariontes o eucariotas. Tales elementos regulatorios pueden ser promotores, enhancers, operadores y/o señales de terminación de transcripción. Desde luego, los vectores pueden también contener tanto los elementos necesarios para su estabilidad y/o para su replicación, como también genes de resistencia a antibióticos, es decir marcadores de selección. La invención se refiere también a los vectores premencionados, siendo que estos contengan además de la secuencia del ácido nucleico que se encuentra bajo el control de por lo menos un elemento regulatorio, que codifica una SDH, una secuencia de ácido nucleico que también se encuentra bajo el control de por lo menos un elemento regulatorio, que codifica una sacarosa-mutasa. Un vector tal muestra por lo tanto la información genética para ambas enzimas que son necesarias para la transformación enzimática de sacarosa mediante isomaltulosa a 1,6-GPS. Tales vectores permiten usar de manera particularmente sencilla el aparato metabólico de un solo organismo huésped para transformar la sacarosa enzimáticamente en un solo paso procedimental en 1,6-GPS. La invención se refiere también a células huésped que contengan una de las moléculas de ácido nucleico inventivas o uno de los vectores inventivos, respectivamente están transformadas con este y que preferentemente están en posición de exprimir SDH y en dado caso la sacarosa-mutasa, así como particularmente preferido de preparar 1,6-GPS de isomaltulosa respectivamente de sacarosa. Además, la invención se refiere a todas las células huésped derivadas de una célula huésped transformada con las moléculas de ácido nucleico inventivas o con los vectores inventivos. La invención se refiere por lo tanto a células huésped que contengan las moléculas de ácido nucleico o los vectores inventivos, siendo que bajo célula huésped se entiende un organismo que está en posición de absorber in vitro moléculas de ácido nucleico recombinante y sintetizar en dado caso las enzimas codificadas por las moléculas de ácido nucleico inventivas. Preferentemente, estas son células procariontes o eucariotas. Sobre todo, la invención se refiere a microorganismos que contengan vectores inventivos, derivados o partes de estos vectores, que habilitan estos para la síntesis de enzimas para la producción de 1,6-GPS partiendo de isomaltulosa o partiendo de sacarosa. La célula huésped inventiva puede estar caracterizada también, porque la molécula inventiva de ácido nucleico introducida bien es heteróloga respecto a la célula transformada, lo que desde luego no significa que no existe en esta célula, o bien que se localiza en otro punto o en cantidad de copias diferente en el genoma a la secuencia correspondiente que existe naturalmente. En una forma de ejecución de la invención, esta es una célula procarionte, preferentemente una célula procarionte Gram negativa, de manera particularmente preferida una célula de Enterobacter. En esto es posible, por un lado, usar una célula que no contenga SDH y/o sacarosa-mutagenasa propia, por ejemplo, E. coli , por otro lado también pueden usarse células que ya contengan uno o dos de esas genes en su cromosoma. Ejemplos preferidos para células procariontes adecuadas son células de E. coli , Protaminobacter rubrum, Erwinia rhapontici , Enterobacter spec. o Pseudomonas mesoacidophila . El especialista en el campo de la biología molecular está familiarizado con la transformación de células procariontes con secuencias exógenas de ácido nucleico. En otra forma de ejecución de la presente invención, sin embargo, la célula inventiva también puede ser una célula eucariota, como una célula de fungi (por ejemplo levadura) o células animales. Procedimientos para la transformación respectivamente transfección de células eucariotas con secuencias exógenas de ácido nucleico son conocidos también por el especialista en el campo de la biología molecular.

La invención se refiere también a cultivos celulares que contengan por lo menos una de las células huésped inventivas, siendo que el cultivo celular inventivo en particular esté habilitado para producir una SDH y en dado caso una sacarosa-mutasa. La invención se refiere también a un procedimiento para la fabricación de una SDH, siendo que la célula huésped inventiva se cultiva en un medio de cultivo bajo condiciones tales, que se permite la formación de la SDH y esta puede ser cosechada. Otra forma más de ejecución inventiva son proteinas que se codifican mediante moléculas inventivas de ácido nucleico, así como procedimientos para su preparación, siendo que la célula huésped inventiva se cultiva bajo condiciones que permiten la síntesis de la proteina y que a continuación se aisla la proteina de las células cultivadas y/o del medio de cultivo. La invención se refiere además a anticuerpos monoclonales y policlonales que están en posición de identificar una estructura de una entidad mostrando actividad SDH inventiva y ligarla en dado caso. Esa estructura puede ser una proteina, un carbohidrato así como un complejo de lípidos y/o glicolipido, que específicamente está relacionado con la entidad con SDH. También anticuerpos dirigidos contra estructuras que se deben clasificar como modificaciones postranslacionales de la SDH están comprendidos en la presente invención. Importante es que la estructura espacial de las nubes de electrones puede ser identificada mediante anticuerpos de tal manera, que se permite sacar conclusiones acerca de las propiedades biológicas, químicas y físicas de la entidad mostrando actividad SDH. En otra forma especial más de ejecución, la invención se refiere también a anticuerpos que interactuan con los anticuerpos inventivos precedentemente mencionados, y especialmente pueden identificarlas y ligarlas. La invención se refiere además a los anticuerpos precedentemente mencinados, siendo que estos están modificados por vía biológica, química o física. A continuación se busca ilustrar la invención mediante ejemplos y las figuras correspondientes. Las figuras muestran: Figura 1 una tarjeta de Plasmid del Plasmid pBact 2 y Figura 2 una tarjeta de Plasmid pH G 467 SEQ ID Nr. 1 muestra la secuencia de SDH que incluye 262 aminoácidos, SEQ ID Nr. 2 muestra la secuencia de SDH que incluye 789 nucleótidos, SEQ ID Nr. 3 hasta 9 muestran las secuencias parciales de aminoácidos de la SDH.

Ejemplo 1: Preparación de la SDH La producción de biomasa de Gluconobacter suboxidans Para preparar suficiente biomasa de Gluconobacter suboxidans DSM 2003 se fermentó la cepa a escala de laboratorio. Como medio 1 se usó: D-manitol (50 g/L), peptona de caseina (10 g/L), extracto de levadura (5 g/L) y CaC03 (20 g/L) . Un medio 2 se compone como sigue: D-manitol (75 g/L) , peptona de caseina (16 g/L) , extracto de levadura ( 8 g/L) y CaC03 (1 g/L) . Como precultivo se usó una conserva liofilizada de la cepa Gluconobacter suboxidans DSM 2003 suspendida en 1 mL del medio 1, se extendió sobre una placa de agar con medio 1 y se cultivó durante 72 h a 25 °C. A continuación se adicionó una inoculación del cultivo de la placa de agar a 25 mL del medio 1 y se cultivó en un matraz de agitación durante 48 h a 25 °C. Este cultivo, también designado como primer precultivo, se cultivó a continuación en 250 mL del medio 1 en una matraz de agitación (volumen 1 L) durante 48 h a 25 °C. El cultivo obtenido de esa forma - también designado como precultivo 2 -, sirve posteriormente como inoculación para la fermentación. Para la fermentación se transfirió el segundo precultivo del matraz de agitación en 15 L del medio 2 a un fermetador de 20 L y se cultivó bajo las siguientes condiciones: Valor pH: 6.9 (se mantuvo constante mediante tritración con 5 N NaOH) velocidad de agitación: 350 RPM y saturación de oxígeno: 40%. Las condiciones mencionadas se mantuvieron constantes durante la fermentación. La fermentación se terminó con el fin del crecimiento celular - mismo que se determinó mediante consumo de substrato por HPLC. La masa celular así obtenida se cosechó mediante centrifucación (8000 x g, 20 min, 4 °C) y se lavó con una solución de NaCl de 0.9% y se diluyó en 50 mM de tampón de Tris (pH 7.0) 1:3 y a continuación se desintegró en el proceso French-Press . Los fragmentos de células generados se retiraron mediante ultracentrifugación (110.000 x g, 20 min, 4°C). El sobrenadante transparente - el así llamado extracto crudo - se aplicó de inmediato o se almacenó a -30 °C. Limpieza de la SDH Para la limpieza del SDH se seleccionó el siguiente esquema de tres pasos: Paso 1: El extracto crudo se aplicó a una columna de DEAE-sefarosa equilibrada con 50 mM tampón de Tris/HCl (pH 7.0) y se eluyó con un gradiente lineal de 0.0 hasta 0.5 M NaCl in 50 mM tampón de Tris/HCl y con un coeficiente de flujo de 50 cm/h. La SDH pudo eluirse a 0.2 M NaCl. Paso 2: Se preparó una columna de cromatografía por afinidad de ligantes de color como sigue: (i) un gel de sefarosa 4B-CL se usó como matriz (Boyer, P.M. y Hsu, J.T. (1993) en: Fiechter, A. (ed. ) , Advances in Biochemical engineering, 49, 1-44) y (ii) el colorante Blue 160 (Blue H-ERD) se inmovilizó de acuerdo al método Neuhauser, W. et al., 1997 (Biochem. J. , 326, 683-692). Para esto se usaron 10 mg de colorante por 1 mL de gel. Las fracciones con contenido de SDH unificadas del paso 1 se dialisaron y se aplicaron (aprox. 2 a 5 mg próteina/mL de gel) a la columna de ligantes de colores (2.6 x 7.0 cm, equilibrado con 50 mM tampón de tris/HCl) . La proteina adsorbida se eluyó con un gradiente lineal de 0.0 a 0.5 M NaCl en 50 mM de tampón tris/HCl, pH 7.0 y un coeficiente de flujo de 2.0 mL/min. La SDH pudo eluirse a 0.1 M NaCl. Paso 3: Las fracciones activas unificadas del paso 2 se dializaron y se incrementó la concentración mediante ultrafiltración y se aplicó nuevamente a una columna de ligantes de color (2.6 x 7.0 chm, equilibrado con 50 mM tampón de tris/HCl), siendo que se aplicaron aprox. 0.5 mg proteina sobre 1 mL de gel. La elusión por afinidad de la SDH pura se hizo con 10 mM NADH en 20 mM de tampón de tris/HCl, pH 7.0 a un coeficiente de flujo de 10 cm/h. La NADH se retiró a continuación mediante diálisis. La SDH limpia puede almacenarse a -30 °C por aprox. 8 meses, a +4°C la SDH es estable por aprox. 30 dias. Tabla 1. Esquema de limpieza para la SDH Mediante el esquema de limpieza representado, es decir separación del extracto crudo mediante cromatografía de intercambio de aniones, seguido por primera cromatografía por afinidad de ligantes de colores, ultrafiltración y segunda cromatografía por afinidad de ligantes de colores, puede lograrse un enriquecimiento de aproximadamente 50 veces respecto al valor del extracto crudo. El rendimiento es entonces aprox. del 33%. Ejemplo 2: Preparación de 1.6-GPS partiendo de isomaltulosa . La preparación encimática continua de 1,6-GPS en un reactor de membarana de enzimas Con un reactor de acero fino (volumen 50 ml) se hizo la preparación continua de 1,6-GPS partiendo de isomaltulosa. El reactor de membrana de enzimas tenía una carcaza doble para el control de temperatura mediante enfriamiento por agua, entradas para la aplicación de un electrodo de conductividad y de valor pH, y conexiones para la medición de presión, para la alimentación con substrato, para el retiro de producto y para la toma de pruebas. El agitador magnético en el interior del reactor, que puede operarse externamente, garantiza un entremezclado óptimo de las substancias usadas. La tapa del reactor tenía en la parte inferior una placa de metal sinterizado, en la que se habían colocado una membrana de ultrafiltración y un anillo en O. Después del llenado del reactor se atornilló la tapa con la parte inferior. La alimentación del substrato se hizo mediante una bomba de pistones. La conductividad y el valor pH de la solución reactiva se midieron continua y directamente, siendo que un sistema de regulación mantuvo el valor pH constante titrimétricamente. Como la membrana de ultrafiltración no garantiza una detención completa de la coenzima, se aplicó una membrana cargada de la empresa Nitto (Nitto-Membran NTR-7410) . Este método electrostático para la detención de coenzimas garantiza la remanencia también de coenzimas disociadas in el espacio reactivo deseado. El reactor de membrana descrito se llenó con una solución de 250mM isomaltulosa y glucosa en 50 mM de tampón tris/HCl, pH 7.5 (+0.1% NaN3) . A un flujo de 2 ml/h se operó el reactor a continuación durante 24 h "en vacío", para detectar eventuales fugas u otros problemas y eliminarlos en dado caso. A continuación se agregó SDH y la enzima de regeneración FDH en un superloop, como se usa para la aplicación de pruebas en la cromatografía. Al prinicipio de la reacción se usaron 1 U/ml en cada caso de SDH completamente limpia (del ejemplo 1) y de GDH (dehidrogenasa de glucosa del Bacillus mega terium) .

Mediante inyección de 2.5 µM NAD+ se arrancó la reacción. El valor pH se mantuvo constante mediante titración con ÍM tris en pH 7.0. Una magnitud importante en la operación de un reactor continuo es la distribución de los períodos de permanencia. Esta se calcula bajo la suposición de entremezclado óptimo de la mezcla reactiva de conformidad con la fórmula V r = , siendo que V es el volumen del reactor y V0 el flujo del volumen. Después de 4 horas de ensayos por lotes se fijó el flujo en 2 ml/h, así que el período promedio de permanencia (t) era de 25 horas. La duración del ensayo era de 234 horas, siendo que a intervalos regulares se determinaron la actividad enzimática, el consumo de lejía, la conductividad, la presión, el substrato y el volumen de producto. Las pruebas de producto obtenidas se analizaron respecto a su composición mediante HPLC y se comprobó la formación de 1,6-GPS. Ejemplo 3: Procedimiento enzimático en un solo bioreactor ("proceso de potaje") para la fabricación de 1,6-GPS partiendo de sacarosa. Para la fabricación enzimática directa de 1,6-GPS partiendo de sacarosa se hizo un ensayo de lote con células inmobilizadas de P. rubrum, así como con la enzima SDH de G. suboxidans 2003 y FDH de Candida boidinii en las condiciones indicadas a continuación. Los substratos en esta re-acción eran sacarosa y formiato amónico. Volumen: 10 ml Temperatura : 25 °C Sacarosa: 500 mM Formiato: 500 mM células P. rubrum : i g SDH 5 U FDH: 10 U NAD 1 mM Como en esta reacción el valor pH incrementó, se estabilizó con 1 M ácido fórmico constantemente a un valor pH de 7.0. El consumo de substrato se controló durante toda la reacción mediante métodos de DC y DNS (para la transformación de sacarosa a isomaltulosa) así como HPLC (para la transformación de isomaltulosa a 1,6-GPS). Se pudo mostrar la formación directa de 1,6-GPS dentro de un recipiente reactivo y en un solo paso procedimental partiendo de sacarosa. Ejemplo 4: Acido nucleico y secuencia derivada de péptidos de la SDH 1. Determinación de las secuencias peptídicas Para la determinación de las secuencias de aminoácidos parciales se digirió trípticamente la SDH de Gluconobacter suboxidans DSM 2003 sometida a limpieza conforme ejemplo 1 y se separó conforme métodos estándar. Las secuencias parciales de péptidos están representadas en SEQ ID Nr. 3 hasta 9. 2. Preparación de sondas de ADN Basado en las secuencias analizadas durante la determinación de las secuencias peptídicas se preparó un Primer mediante el cual se logró la clonación del gen completo de la SDH partiendo de Gluconobacter suboxidans DMS 2003. 3. Preparación del banco de genes y aislamiento de clones Los Primer premencionados (SEQ ID Nr. 3 y 5) se usaron en una reacción PCR y se obtuvo un fragmento de la secuencia que codifica SDH. Con el fragmento de PCR obtenido se preparó una sonda de ADN. En el Southern-Blot del genoma pudieron detectarse bandas hibridantes después del mareaje con la sonda. Se prepararon dos bancos independientes de subgenoma (según digestión Clal ~9kb de fragmento, según digestión BamHl ~3.5 kb de fragmento, limpieza de los fragmentos sobre centrifugación de gradientes de sacarosa) con lotes de fragmentos limpios en pBlueskrip SK. Con la mencionada sonda marcada se verificaron los bancos de clones de subgenoma mediante hibridación. Se logró la identificación de varios clones, de los cuales en cada caso se continuó con el análisis de un clon del banco BamHl y Clal. 4. Análisis de secuencias La determinación de secuencias de los fragmentos clonados arrojó en ambos casos una secuencia de ADN coincidente. De esta pudo prepararse la secuencia del aminoácido de la SDH. Coincide con las secuencias que se originaron de las secuencias peptídicas, con excepción de la posición Codon 196, para la cual la secuencia peptídica para péptido 5 había dado serina (S) en lugar del ahora encontrado triptofano (W 196) . La secuencia de nucleótidos de la SDH de Gluconobacter suboxidans DMS 2003 se representa bajo SEQ ID Nr. 2 y engloba 789 nucleótidos. La secuencia del aminoácido de la sorbitol-dehidrogenasa de Gluconobacter suboxidans DMS 2003 se representa bajo SEQ ID Nr. 1 y engloba 262 aminoácidos. 5. Expresiones en E. coli La secuencia codificante se prolongó en la terminación 5' con la secuencia GAATTCTT y en la terminación 3' con la secuencia AAGCTT. Esta secuencia se integró en el vector pBtac2 (Fig. 1; J. Bosius (1988), Biotechnology 10, 205-225) que se habia preparado con EcoRI y HindIII. La plasmida resultante pHWG 467 (Fig. 2) incluye un gen de resistencia a la ampicilina y la secuencia que codifica SDH bajo el control del promotor tac. La plasmida pHWG 467 se transformó en E. coli JM109. Estas células producen actividad SDH después de inducción con IPTG. La proteina correspondiente puede determinarse en extractos crudos respecto a sus actividad. En gel SDS de estos extractos, la proteina puede colorarse como banda dominante a 28 kDa con Coomassie Brilliant Blue.

LISTA DE SECUENCIAS <110> Südzucker AG Mannheim/Ochsenfurt <120> Procedimiento para la preparación de 6-O-alpha-D-Glucopyranosyl-D-sorbit <130> 15441Sdz <140> <141> <160> 9 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 262 <212> PRT <213> Gluconobacter suboxydans <400> 1 Met Ser Lys Lys Phe Asn Gly Lys Val Cys Leu Val Thr Gly Ala Gly 1 5 10 15 Gly Asn lie Gly Leu Ala Thr Ala Leu Arg Leu Ala Glu Glu Gly Thr 20 25 30 Ala lie Ala Leu Leu Asp Met Asn Arg Glu Ala Leu Glu Lys Ala Glu 35 40 45 Ala Ser Val Arg Glu Lys Gly Val Glu Ala Arg Ser Tyr Val Cys Asp 50 55 60 Val Thr Ser Glu Glu Ala Val He Gly Thr Val Asp Ser Val Val Arg 65 70 75 80 Asp Phe Gly Lys He Asp Phe Leu Phe Asn Asn Ala Gly Tyr Gln Gly 85 90 95 Ala Phe Ala Pro Val Gln Asp Tyr Pro Ser Asp Asp Phe Ala Arg Val 100 105 110 Leu Thr He Asn Val Thr Gly Ala Phe His Val Leu Lys Ala Val Ser 115 120 125 Arg Gln Met He Thr Gln Asn Tyr Gly Arg He Val Asn Thr Ala Ser 130 135 140 Met Ala Gly Val Lys Gly Pro Pro Asn Met Ala Ala Tyr Gly Ala Ser 145 150 155 160 Lys Gly Ala He He Ala Leu Thr Glu Thr Ala Ala Leu Asp Leu Ala 165 170 175 Pro Tyr Asn He Arg Val Asn Ala He Ser Pro Gly Tyr Met Gly Pro 180 185 190 Gly Phe Met Trp Glu Arg Gln Val Glu Leu Gln Ala Lys Val Gly Ser 195 200 205 Gln Tyr Phe Ser Thr Asp Pro Lys Val Val Ala Gln Gln Met He Gly 210 215 220 Ser Val Pro Met Arg Arg Tyr Gly Asp He Asn Glu He Pro Gly Val 225 230 235 240 Val Ala Phe Leu Leu Gly Asp Asp Ser Ser Phe Met Thr Gly Val Asn 245 250 255 Leu Pro He Ala Gly Gly 260 <210> 2 <211> 789 <212> ADN <213> Gluconobacter suboxydans <400> 2 atgtcgaaga agtttaacgg taaagtctgt ctggtcaccg gcgcgggtgg caatattggt 60 cttgcgaccg ccctccgtct ggcagaagag ggcacggcca tcgcccttct ggacatgaac 120 cgcgaggcgc tggaaaaggc ggaagcctcc gtccgtgaaa agggcgtcga agcccgctcc 180 tatgtctgtg acgtcacgtc cgaagaggcc gtgatcggga cggtggatag cgtggtccgg 240 gacttcggga agatcgactt cctgttcaac aatgccggct atcagggcgc cttcgccccc 300 gtgcaggact acccgtccga cgatttcgcg cgcgtgctga cgatcaacgt caccggtgcc 360 ttccacgtcc tcaaagccgt ttcgcgccag atgatcacgc agaactacgg gcgcatcgtc 420 aacaccgcca gcatggccgg tgtgaaggga ccgccaaaca tggccgccta tggtgcgtcc 480 aagggcgcca tcatcgccct gaccgaaacg gccgcgcttg accttgcccc ctacaacatc 540 cgtgtgaacg ccatcagccc cggttacatg gggcccggtt tcatgtggga gcgtcaggtc 600 gagcttcagg ccaaggtcgg aagccagtat ttctccaccg atcccaaggt cgtggcccag 660 cagatgatcg gcagcgttcc gatgcgccgc tatggcgaca tcaacgagat cccgggcgta 720 gtagcgttcc tgctggggga tgattccagc ttcatgacgg gggtgaacct gccgattgct 780 ggcggttga 789 <210> 3 <211> 29 <212> PRT <213> Gluconobacter suboxydans <400> 3 Lys Lys Phe Asn Gly Lys Val Cys Leu Val Thr Gly Ala Gly Gly Asn 1 5 10 15 He Gly Leu Ala Thr Ala Leu Arg Leu Ala Glu Glu Gly 20 25 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Gluconobacter suboxydans <400> 4 Val Leu Thr He Asn Val Thr Gly Ala Phe His Val Leu Lys 1 5 10 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Gluconobacter suboxydans <400> 5 Gly Pro Pro Asn Met Ala Ala Tyr Gly Ala Ser Lys 1 5 10 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Gluconobacter suboxydans <400> 6 Val Val Ala Gln Gln Met He Gly Ser Val Pro Met Arg 1 5 10 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Gluconobacter suboxydans <400> 7 Val Asn Ala He Ser Pro Gly Tyr Met Gly Pro Gly Phe Met Ser Glu 1 5 10 15 Arg <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Gluconobacter suboxydans <400> 8 Val Gly Ser Gln Tyr Phe Ser Thr Asp Pro Lys 10 <210> 9 <211> 21 <212> PRT <213> Gluconobacter suboxydans <400> 9 Ser Tyr Val Cys Asp Val Thr Ser Glu Glu Ala Val He Gly Thr Val 1 5 10 15 Asp Ser Val Val Arg 20

Claims (31)

1. REIVINDICACIONES 1. Procedimiento para la fabricación enzimática de 6-O- -D-glucopiranosil-D-sorbitol (1,6-GPS) a partir de isomaltulosa, siendo que la isomaltulosa se coloca en una solución reactiva acuosa que contiene una entidad mostrando actividad de sorbitol-dehidrogenasa (SDH) , se incuba y a continuación se cosecha 1,6-GPS de la solución reactiva.
2. 2. Procedimiento de conformidad con la reivindicación 1, siendo que a la solución reactiva acuosa se agregan antes o durante la incubación equivalentes reductivas .
3. 3. Procedimiento de conformidad con la reivindicación 1, siendo que la entidad mostrando actividad SDH es SDH aislada.
4. 4. Procedimiento de conformidad con la reivindicación 1, siendo que la entidad mostrando actividad SDH es un microorganismo vivo o muerto o un extracto crudo de este.
5. 5. Procedimiento de conformidad con la reivindicación 5, siendo que el microorganismo que contiene SDH es Gluconobacter suboxidans DSM 2003.
6. 6. Procedimiento de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 5, siendo que el procedimiento se lleva a cabo con o sin regulación del valor pH.
7. 7. Procedimiento de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 6, siendo que a la solución reactiva acuosa se agrega antes o durante el proceso de incubación un medio de regeneración, especialmente formiat-dehidrogenasa (FDH) y formiato.
8. 8. Procedimiento de conformidad con una de las reivindicaciones 3 a 7, siendo que el microorganismo, el extracto crudo o la enzima están inmovilizados.
9. 9. Procedimiento de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 8, siendo que el procedimiento se lleva a cabo de manera continua.
10. 10. Procedimiento de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 9, siendo que la isomaltulosa usada como materia prima se fabrica mediante transformación enzimática de sacarosa a isomaltulosa.
11. 11. Procedimiento de conformidad con la reivindicación 10, siendo que la transformación enzimática de sacarosa a isomaltulosa se hace mediante células inmovilizadas de P. rubrum, sacarosa-mutasa aislada y/o una desintegración de células de P. rubrum.
12. 12. Procedimiento de conformidad con la reivindicación 10 u 11, siendo que la transformación enzimática de sacarosa a isomaltulosa y de isomaltulosa a 1,6-GPS se lleva a cabo en un solo paso procedimental.
13. 13. Procedimiento de conformidad con una de las reivindicaciones l a 12, siendo que la transformación de sacarosa a isomaltulosa y de isomaltulosa a 1,6-GPS se lleva a cabo en un solo bioreactor.
14. 14. Procedimiento de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 13, siendo que la fabricación enzimática se lleva a cabo a temperaturas de 20 °C hasta 40°C, especialmente a 25°C.
15. 15. Procedimiento para la fabricación encimática de 1, 6-GPS a partir de sacarosa, siendo que la sacarosa es transformada enzimáticamente en isomaltulosa y a continuación o al mismo tiempo la isomaltulosa es transformada enzimáticamente a 1,6-GPS mediante un procedimiento de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 14.
16. 16. Procedimiento para el aislamiento de SDH de un microorganismo, siendo que el microorganismo se desintegra en un primer paso procedimental y se homogeniza para formar un extracto crudo, en un segundo paso procedimental el extracto crudo obtenido se somete a una cromatografía de intercambio de aniones, en un tercer paso procedimental una primera cromatografía por afinidad de ligantes de color y en un cuarto paso procedimental una segunda cromatografía por afinidad de ligantes de color.
17. 17. Procedimiento de conformidad con la reivindicación 16, siendo que a continuación de la cromatografía por afinidad de ligantes de color se lleva a cabo una elusión de afinidad con por lo menos un equivalente reductivo.
18. 18. Molécula de ácido nucleico que codifica una enzima con la actividad de una sorbitol-dehidrogenasa (SDH) , seleccionado del grupo consistente de a) moléculas de ácido nucleico que codifican una proteina que muestra la secuencia de aminoácido indicada bajo SEQ ID Nr.l; b) moléculas de ácido nucleico que engloban las secuencias de nucleótidos representadas bajo SEQ ID Nr. 2; y c) moléculas de ácido nucleico que muestran una identidad de secuencias de más del 80% con las moléculas de ácido nucleico mencionadas bajo a) o b) , o un tramo complementario de esta.
19. 19. Molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 18, que es es una molécula de ADN.
20. 20. Molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 19, que es una cADN o una ADN de genoma.
21. 21. Molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 18, que es una molécula ARN.
22. 22. Vector que contiene una molécula de ácido nucleico de conformidad con una de las reivindicaciones 18 a 21.
23. 23. Vector de conformidad con la reivindicación 22, siendo que la molécula de ácido nucleico está asociado con por lo menos un elemento regulatorio, especialmente un promotor, un enhancer y/o una señal de terminación de transcripción .
24. 24. Célula huésped que está transformada con una molécula de ácido nucleico de conformidad con una de las reivindicaciones 18 a 21 o con un vector de conformidad con la reivindicación 22 o 23 o que desciende de una célula huésped tal .
25. 25. Célula huésped de conformidad con la reivindicación 24, siendo que la célula huésped es procarionte o eucariota.
26. 26. Cultivo de células que contengan por lo menos una célula huésped de conformidad con la reivindicación 25.
27. 27. Procedimiento para la fabricación de una SDH, siendo que las células huésped de conformidad con las reivindicaciones 24 o 25 se cultivan en un medio de cultivo bajo condiciones que permiten la formación de SDH y se cosecha SDH.
28. 28. Proteina con la actividad de una SDH, que se puede fabricar con un procedimiento de conformidad con la reivindicación 16 o 27 o condificado con una molécula de ácido nucleico con una de las reivindicaciones 18 a 21.
29. 29. Anticuerpo que muestra una afinidad específica hacia una entidad con la actividad de una SDH de conformidad con la reivindicación 28 o una célula huésped que la produzca de conformidad con una de las reivindicaciones 24 o 25.
30. 30. Anticuerpo que tiene una afinidad hacia el anticuerpo de conformidad con la reivinidación 29.
31. 31. Anticuerpo de conformidad con una de las reivindicaciones 29 y 30, que está modificado.