ES2197182T3

ES2197182T3 - Enzima recombinante y termoestable para la conversion de maltosa en trehalosa.

Info

Publication number: ES2197182T3
Application number: ES95306875T
Authority: ES
Inventors: Keiji Tsusaki; Michio Kubota; Toshiyuki Sugimoto
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK; Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1994-10-01
Filing date: 1995-09-29
Publication date: 2004-01-01
Anticipated expiration: 2015-09-29
Also published as: DE69529953T2; JP3810457B2; EP0704531A2; DE69529953D1; US6087146A; EP0704531B1; TW493000B; AU692298B2; US6165768A; KR100427529B1; AU3297595A; JPH08149980A; US5773282A; KR960014149A; ATE234928T1; TW575665B; IL115443A0; DK0704531T3; EP0704531A3

Abstract

SE EXPONE UNA ENZIMA TERMOESTABLE RECOMBINANTE, QUE CONVIERTE MALTOSA EN TREHALOSA Y QUE ES ESTABLE HASTA UNA TEMPERATURA DE APROXIMADAMENTE 80 GRADOS C, INCLUSO CUANDO ES INCUBADA EN UN PH 7.0 DURANTE 60 MINUTOS, UNA PREPARACION DE LA ENZIMA, UN DNA QUE LA CODIFICA, UN DNA RECOMBINANTE QUE CONTIENE EL DNA, UN TRANSFORMANTE, Y UN METODO DE CONVERSION ENZIMATICA DE MALTOSA UTILIZANDO LA ENZIMA.

Description

Enzima recombinante y termoestable para la conversión de maltosa en trehalosa.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere a una nueva enzima recombinante termoestable que convierte maltosa en trehalosa.

Estado de la cuestión

La trehalosa es un disacárido formado por 2 moléculas de glucosa unidas por sus grupos reductores, que se encuentra de forma natural en bacterias, hongos, algas, insectos, etc., en una cantidad muy pequeña. Al no tener un residuo reductor en su molécula, trehalosa no provoca una reacción de empardecimiento insatisfactoria incluso cuando se calienta en presencia de aminoácidos o similares, y debido a ello, puede ser un ventajoso edulcorante alimentario sin miedo a que se produzca un cambio de coloración y un deterioro poco satisfactorios. Sin embargo, trehalosa no se puede preparar fácilmente en una cantidad deseada con los métodos convencionales y, en realidad, no se usa apenas como edulcorante alimentario.

Los métodos convencionales se clasifican aproximadamente en dos grupos, a saber, el que usa células de microorganismos y el que utiliza un sistema multienzimático en el cual se deja actuar a las enzimas sobre los sacáridos. El primero, según se revela en la Patente Japonesa Abierta Nº 154.485/75, es un método que consiste en dejar crecer de microorganismos como bacterias y levaduras en un medio de cultivo con nutrientes, y recoger trehalosa del cultivo resultante. El segundo, según se revela en la Patente Japonesa Abierta Nº 216.695/83, es un método que consiste en proporcionar maltosa como sustrato, dejando que un sistema multienzimático que usa fosforilasas de maltosa y trehalosa actúe sobre la maltosa, y aislando después la trehalosa formada en el sistema de reacción. Aunque el primer método facilita el crecimiento de microorganismos sin dificultades especiales, tiene el inconveniente de que el cultivo resultante sólo contiene como máximo un 15% p/p de trehalosa sobre el producto seco (s.p.s.). Sí bien el segundo método permite la separación de trehalosa con una facilidad relativa, es difícil, teóricamente, aumentar el rendimiento de trehalosa permitiendo que las enzimas actúen sobre los sustratos en una concentración considerablemente alta porque la reacción enzimática per se es una reacción de equilibrio de 2 tipos diferentes de enzimas y el punto de equilibrio se inclina constantemente hacia la formación de glucosa fosfato.

En vista de todo lo expuesto, los presentes inventores buscaron con energía entre las enzimas que convierten directamente maltosa en trehalosa, y han encontrado que microorganismos que pertenecen a los géneros Pimelobacter y Pseudomonas, según se revela en la Solicitud de Patente Japonesa Nº 199.971/93, producen una enzima absolutamente nueva que forma trehalosa cuando actúa sobre maltosa, lo que significa que se puede preparar trehalosa a partir de maltosa como material que puede obtenerse con facilidad en cantidades y a bajo coste y el uso de la enzima superaría por completo todos los propósitos mencionados.

Se encontró que todas las enzimas de estos microorganismos tienen un óptimo de temperatura de aproximadamente 20-40ºC, que parece algo insuficiente para la termoestabilidad durante la producción de trehalosa. Se reconoce en este campo que la sacarificación de almidón y sustancias amiláceas debe reaccionar, en general, a una temperatura mayor de 55ºC: si la reacción de sacarificación se efectúa a una temperatura de 55ºC o menor, se potencia la contaminación bacteriana para reducir el pH de las mezclas de reacción e inactivar las enzimas usadas, seguida de un residuo de una cantidad relativamente grande de sustratos intactos. Sí la reacción de sacarificación se efectúa usando enzimas que tienen una mala termoestabilidad, se deberá poner un gran cuidado durante los cambios de pH y, una vez que se produce la reducción de pH, se deben añadir rápidamente álcalis a las mezclas de reacción para aumentarlo.

En vista de todo lo expuesto, los presentes inventores estudiaron con más detalle las enzimas termoestables que tienen esta actividad y han encontrado que las enzimas producidas por microorganismos del género Thermus como un microorganismo de la especie Thermus aquaticus (ATCC 33923), convierten eficazmente maltosa en trehalosa sin ser sustancialmente inactivadas, incluso cuando reaccionan a una temperatura mayor de 55ºC. Estas enzimas, sin embargo, no alcanzan una suficiente actividad productora de enzimas, lo que provoca el problema de que la producción a escala industrial de trehalosa requiere, inevitablemente, un cultivo de tales microorganismos a una escala considerablemente grande.

La tecnología de ADN recombinante ha hecho notables progresos en los últimos años. En este momento, puede prepararse fácilmente en la cantidad deseada incluso una enzima cuya secuencia total de aminoácidos no se ha revelado, sí el gen que codifica la enzima se aisló alguna vez y la secuencia de bases se descodificó, preparando un ADN recombinante que contenía el ADN que codifica la enzima, introduciendo el ADN recombinante en microorganismos o células de plantas o animales y cultivando los transformantes resultantes. En esas circunstancias, se requiere con urgencia encontrar un gen que codifique la enzima termoestable mencionada y descodificar la secuencia de bases.

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Resumen de la invención

Es un objeto de la presente invención proporcionar una enzima recombinante termoestable que forma trehalosa cuando actúa sobre la maltosa.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un ADN que codifica la enzima recombinante.

Es otro objeto más de la presente invención proporcionar un ADN recombinante replicable que contenga el ADN.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un transformante en el que el ADN recombinante se ha introducido.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un proceso para preparar de la enzima recombinante usando el transformante.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un método para convertir maltosa en trehalosa por la enzima recombinante.

En consecuencia, la presente invención proporciona una enzima recombinante que es capaz de convertir maltosa en trehalosa, que no se inactiva sustancialmente incluso cuando se incuba a una temperatura mayor de 55ºC, y que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo formado por las que no son idénticas a la secuencia Nº 3, sino que son variantes de la secuencia Nº 3 en que uno o más aminoácidos se borran, añaden o reemplazan con diferentes aminoácidos sin que se altere la actividad inherente de la enzima que tiene la secuencia de aminoácidos de la secuencia Nº 3, y en el cual la enzima recombinante no contiene la secuencia parcial de aminoácidos Ala-Val-X-Tyr, en la cual X significa Phe o Ile.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un ADN aislado que codifica una enzima recombinante que es capaz de convertir maltosa en trehalosa, enzima que no se inactiva sustancialmente incluso cuando se incuba a una temperatura mayor de 55ºC, y que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo formado por la secuencia de aminoácidos de la secuencia Nº 3 y variantes de la secuencia Nº 3 en que uno o más aminoácidos de la secuencia Nº 3 se borran, añaden o reemplazan con diferentes aminoácidos sin que se altere la actividad inherente de la enzima que tiene la secuencia de aminoácidos de la secuencia Nº 3.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un ADN recombinante replicable que contiene un vector autorreplicable y un ADN como se ha definido anteriormente.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un transformante que se prepara por la introducción en un huésped apropiado de un ADN recombinante replicable que contiene un ADN según se ha definido anteriormente y un vector autorreplicable.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un proceso de preparación de una enzima recombinante que consiste en cultivar un transformante, preparado por la introducción en un huésped apropiado de un ADN recombinante que contenía tanto un vector autorreplicable como un ADN según se ha definido anteriormente, en un medio de cultivo con nutrientes para formar la enzima, y recoger la enzima formada del cultivo resultante.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método de conversión enzimática de maltosa, que consiste en un paso que permite que la enzima recombinante según se ha definido anteriormente actúe sobre la maltosa para formar trehalosa.

Breve descripción de los dibujos acompañantes

La Figura 1 muestra la temperatura óptima de una enzima producida por Thermus Aquaticus (ATCC 33923).

La Figura 2 muestra el pH óptimo de una enzima producida por Thermus aquaticus (ATCC 33923).

La Figura 3 muestra la estabilidad térmica de una enzima producida por Thermus Aquaticus (ATCC 33923).

La Figura 4 muestra la estabilidad de pH de una enzima producida por Thermus Aquaticus (ATCC 33923).

La Figura 5 muestra la estructura del ADN recombinante pBTM22 de acuerdo con la presente invención.

La Figura 6 muestra la estructura del ADN recombinante pBTM23 de acuerdo con la presente invención.

Descripción detallada de la invención

La enzima recombinante de acuerdo con la presente invención actúa sobre la maltosa para formar trehalosa sin ser sustancialmente inactivada incluso cuando se deja reaccionar a una temperatura mayor de 55ºC.

El ADN de acuerdo con la presente invención expresa la producción de la presente enzima recombinante cuando se introduce en un vector autorreplicable apropiado para obtener un ADN recombinante replicable, introducido después en un huésped apropiado, que es inherentemente incapaz de formar la enzima recombinante pero que prolifera con facilidad, para formar un transformante.

El ADN recombinante de acuerdo con la presente invención expresa la producción de la enzima recombinante introduciéndola en un huésped apropiado, que es inherentemente incapaz de formar la enzima recombinante pero que prolifera con facilidad, para formar un transformante, y cultivando el transformante en un medio de cultivo con nutrientes.

El transformante forma una cantidad deseada de la enzima recombinante cuando se cultiva de acuerdo con la presente invención.

El método de conversión enzimática de acuerdo con la presente invención convierte maltosa en una composición de sacáridos formada por trehalosa, glucosa y/o maltooligosacáridos.

La presente invención se elaboró basada en el hallazgo de una enzima termoestable absolutamente nueva que convierte maltosa en trehalosa. Dicha enzima se puede obtener de cultivos de Thermus aquaticus (ATCC 33923), y los presentes inventores aislaron la enzima usando varios métodos que incluyen la cromatografía en columna como la técnica principal, y estudiaron sus propiedades y características, revelando que en realidad es un polipéptido que tiene las siguientes propiedades fisicoquímicas:

(1): Acción Formar trehalosa cuando actúa sobre la maltosa, y viceversa;

(2): Peso molecular (PM) Aproximadamente 100.000-110.000 dalton cuando se estudia con electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE);

(3): Punto isoeléctrico (pI) Aproximadamente 3,8-4,8 cuando se estudia con isoelectroforesis;

(4): Temperatura óptima Aproximadamente 65ºC cuando se incuba a un pH 7,0 durante 60 min;

(5): pH óptimo Aproximadamente 6,0-6,7 cuando se incuba a 60ºC durante 60 min;

(6): Estabilidad térmica Estable hasta una temperatura de aproximadamente 80ºC incluso cuando se incuba a un pH 7,0 durante 60 min; y

(7): Estabilidad del pH Estable hasta un pH de 5,5-9,5 incluso cuando se incuba a 60ºC durante 60 min.

Los experimentos revelan las propiedades fisicoquímicas de una enzima termoestable producida por Thermus aquaticus (ATCC 33923) son los siguientes:

Experimento 1

Purificación de la enzima

Experimento 1-1

Producción de la enzima

En matraces de Erlenmeyer de 500 ml se pusieron alícuotas de 100 ml de un medio de cultivo líquido (pH 7,5) que contenía un 0,5% p/v de polipeptona, un 0,1% p/v de extracto de levadura, un 0,07% p/v de nitrato sódico, un 0,01% p/v de hidrofosfato disódico, un 0,02% p/v de sulfato de magnesio heptahidrato, un 0,01% p/v de cloruro cálcico, y agua, y los matraces se introdujeron en el autoclave a 120ºC durante 20 min para obtener la esterilización. Después de enfriar los matraces se inoculó un cultivo de siembra de Thermus aquaticus (ATCC 33923) en cada matraz, seguido por la incubación a 60ºC durante 24 horas bajo una agitación-rotación de 200 rpm para obtener un cultivo de siembra. Se pusieron alícuotas de veinte litros de una preparación reciente del mismo medio de cultivo líquido en jarras de fermentadores de 30 litros, se esterilizaron y se enfriaron a 60ºC, seguido por la inoculación de 1% v/v del cultivo de siembra en cada fermentador, y se incubó el resultante a un pH de 6,0-8,0 y 60ºC durante aproximadamente 20 horas en condiciones de aireación-agitación.

Después, se evaluó la actividad enzimática del cultivo resultante para revelar que contenía aproximadamente 0,35 unidades/ml de la enzima. Una porción del cultivo se centrifugó y se estudió el sobrenadante para revelar que contenía aproximadamente 0,02 unidades/ml de la enzima. Mientras que las células separadas se suspendieron en tampón fosfato 50 mM (pH 7,0) para obtener un volumen total igual al volumen original de la porción, seguido por el estudio de la suspensión para revelar que contenía aproximadamente 0,33 unidades/ml de la enzima.

En la especificación, la actividad de la enzima se expresa por el valor medido con el siguiente ensayo: poner un ml de tampón fosfato 10 mM (pH 7,0) que contenía un 20% p/v de maltosa en un tubo de ensayo, añadir un ml de una solución de enzima debidamente diluida en el tubo e incubar la solución en el mismo a 60ºC durante 60 min para efectuar una reacción enzimática, seguido por una nueva incubación a 100ºC durante 10 min para suspender la reacción enzimática. Después, una porción de la mezcla de reacción se diluyó 11 veces con tampón fosfato 50 mM (pH 7,5) y 0,4 ml de lo cual se puso en un tubo de ensayo, se mezcló con 0,1 ml de una solución que contenía una unidad/ml de trehalasa, seguido por la incubación de la mezcla resultante a 45ºC durante 120 min y cuantificación del contenido de glucosa sobre el método de glucosa oxidasa. Como control, se proporciona un sistema que usa una solución de trehalasa y una solución de la enzima que se ha inactivado por calor a 100ºC durante 10 min, y se trata de igual modo que antes. El contenido de la trehalosa formada se estima sobre la base del contenido de glucosa cuantificado anteriormente. Una unidad de la actividad de la enzima se define como la cantidad que forma un \mumol de trehalosa por minuto en las condiciones mencionadas.

Experimento 1-2

Purificación de la enzima

El cultivo obtenido en el Experimento 1-1 se centrifugó para separar las células y aproximadamente 0,28 kg de las células húmedas así obtenidas se suspendió en tampón fosfato 10 mM (pH 7,0), se fragmentaron de la forma habitual y se centrifugaron para obtener aproximadamente 1,8 l de una solución cruda de la enzima. La solución se mezcló con sulfato amónico para obtener una saturación del 70% p/v, se desalinizó dejando reposar a 4ºC toda la noche y se centrifugó para obtener el sobrenadante. El sobrenadante se mezcló con tampón fosfato 10 mM (pH 7,0) y la solución de la mezcla se dializó frente a un preparado reciente del mismo tampón durante 24 horas.

La solución interna del dializado se centrifugó para obtener un sobrenadante (1.560 ml) que se aplicó a una columna rellena con 530 ml de ``DEAE-TOYOPEARL® 650'', un intercambiador de iones comercializado por Tosoh Corporation, Tokio, Japón, que se había equilibrado previamente con tampón fosfato 10 mM (pH 7,0), seguido por la introducción en la columna de un gradiente lineal con cloruro sódico tamponado entre 0 M y 0,4 M en tampón fosfato 10 mM (pH 7,0). Del eluído se obtuvieron fracciones con actividad objetiva de la enzima que se combinaron, se dializaron frente a tampón fosfato 10 mM (pH 7,0) que contenía sulfato amónico 1 M durante 10 horas, y se centrifugó para obtener el sobrenadante. El sobrenadante se aplicó a una columna rellena con 380 ml de ``BUTYL-TOYOPEARL® 650'', un gel para cromatografía hidrofóbica comercializado por Tosoh Corporation, Tokio, Japón, que se había equilibrado previamente con tampón fosfato 10 mM (pH 7,0) que contenía sulfato amónico 1 M, seguido por la introducción en la columna de un gradiente lineal de sulfato amónico tamponado entre 1 M y 0 M en tampón fosfato 10 mM (pH 7,0).

Las fracciones eluídas con sulfato amónico 0,2 M, que contenían la actividad objetiva de la enzima, se recogieron, mezclaron y dializaron frente a tampón fosfato 10 mM (pH 7,0) que contenía cloruro sódico 0,2 M durante 16 horas. La solución dializada se centrifugó para eliminar las sustancias insolubles y se introdujo en una columna rellena con 380 ml de ``TOYOPEARL® HW-55S'', un gel para cromatografía por filtración en gel comercializado por Tosoh Corporation, Tokio, Japón, que se había equilibrado previamente con tampón fosfato 10 mM (pH 7,0) que contenía cloruro sódico 0,2 M, seguido por la introducción en la columna con tampón fosfato 10 mM (pH 7,0) que contenía cloruro sódico 1 M. Las fracciones que tienen la actividad de la enzima se recogieron del eluído y se introdujeron en una columna rellena con ``MONO Q HR5/5'' que se había equilibrado con tampón fosfato 10 mM (pH 7,0). La columna se alimentó con un gradiente lineal de cloruro sódico tamponado entre 0,1 M y 0,35 M en tampón fosfato 10 mM (pH 7,0), seguido por la recogida de las fracciones que tienen la actividad de la enzima. La enzima purificada así obtenida tenía una actividad específica de aproximadamente 135 unidades/mg de proteína en un rendimiento de aproximadamente 330 unidades por litro de cultivo.

La enzima purificada se sometió a una electroforesis en un gel de poliacrilamida al 7,5% p/v para obtener una única banda de proteína con la actividad de la enzima, lo que significa que tenía una pureza considerablemente alta.

Experimento 2

Propiedades fisicoquímicas de la enzima

Experimento 2-1

Acción

A una solución acuosa que contenía un 5% p/p de maltosa o trehalosa como sustrato se añaden 2 unidades/g de sustrato de la enzima purificada obtenida en el Experimento 1-2, y la mezcla se incubó a 60ºC y un pH de 7,0 durante 24 horas. Para analizar la composición del sacárido de la mezcla de reacción, se secó en vacío, se disolvió en piridina y se trimetilsilanizó de la manera habitual, y el resultante se sometió a una cromatografía de gases. Los equipos y condiciones usados en este análisis fueron los siguientes: como cromatógrafo de gases se usó un equipo ``GC-16A'' comercializado por Shimadzu Seisakusho, Ltd., Tokio, Japón; como columna, se usó una columna de acero inoxidable con un diámetro interno de 3 mm y una longitud de 2 m, rellena con ``SILICONE OV-17/CHROMOSOLB W'' al 2% comercializado por GL Sciences Inc., Tokio, Japón; como detector, uno de tipo de llama de hidrógeno de ionización; como gas portador, el gas nitrógeno (con un flujo de 40 ml/min); y como horno de columna, un horno con una temperatura de 160-320ºC con una temperatura programada que aumenta a una velocidad de 7,5ºC/min. Las composiciones de sacáridos de las mezclas de reacción se recogen en la Tabla 1:

TABLA 1

Sustrato	Composición de sacáridos de la mezcla de reacción (%)
	Trehalosa	Glucosa	Maltosa
Maltosa	70,0	4,4	25,6
Trehalosa	76,2	3,1	20,7

Como se muestra en la Tabla 1, la enzima purificada formó aproximadamente un 70% p/p de trehalosa y aproximadamente un 4% p/p de glucosa cuando actuó sobre la maltosa como sustrato, a la vez que formó aproximadamente un 21% p/p de maltosa y aproximadamente un 3% p/p de glucosa cuando actuó sobre trehalosa como sustrato. Estos datos indican que la enzima purificada tiene actividades de conversión de maltosa en trehalosa y de conversión de trehalosa en maltosa, así como de hidrólisis de la unión á-1,4 en la molécula de maltosa y de la unión á,á-1,1 en la molécula de trehalosa. No se ha publicado ninguna enzima de este tipo, lo que induce a pensar que se trata de una nueva vía enzimática.

Experimento 2-2

Peso molecular

De acuerdo con el método publicado por U.K. Laemmli en Nature, Vol. 227, pp. 680-685 (1970), la enzima purificada se sometió a una electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) para dar una única banda de proteína en la posición correspondiente a aproximadamente 100.000 - 110.000 dalton. Las proteínas marcadoras usadas en este experimento fueron miosina (PM= 200.000 dalton), \beta-galactosidasa (PM= 116.250 dalton), fosforilasa B (PM= 97.400 dalton), albúmina sérica (PM= 66.200 dalton) y ovoalbúmina (PM= 45.000 dalton).

Experimento 2-3

Punto isoeléctrico

La enzima purificada dio un punto isoeléctrico de aproximadamente 3,8-4,8 cuando se sometió a una isoelectroforesis en 2% p/v ``AMPHOLINE®'' al 2% p/v en un gel de poliacrilamida comercializado por Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Suecia.

Experimento 2-4

Temperatura óptima

La temperatura óptima de la enzima purificada fue aproximadamente de 65ºC como se muestra en la Figura 1 cuando se incubó de la forma habitual en tampón fosfato 10 mM (pH 7,0) durante 60 min.

Experimento 2-5

pH óptimo

El pH óptimo de la enzima purificada fue aproximadamente de 6,0-6,7 como se muestra en la Figura 2 cuando se estudió de la forma habitual incubándola a 60ºC durante 60 min en tampón acetato, tampón fosfato o tampón carbonato sódico/bicarbonato sódico 10 mM con diferentes pH.

Experimento 2-6

Estabilidad térmica

La enzima purificada fue estable hasta una temperatura de aproximadamente 80ºC como se muestra en la Figura 3 cuando se estudió de la forma habitual incubándola en tampón fosfato 50 mM (pH 7,0) durante 60 min.

Experimento 2-7

Estabilidad del pH

La enzima purificada fue estable hasta un pH de aproximadamente 5,5-9,5 como se muestra en la Figura 4 cuando se experimentó de la forma habitual incubándola a 60ºC durante 60 min en tampón acetato, tampón fosfato o tampón carbonato sódico/bicarbonato sódico 50 mM con diferentes pH.

Experimento 2-8

Secuencia de aminoácidos que contenía el N terminal

La secuencia de aminoácidos que contenía el N terminal de la enzima purificada se analizó en un equipo ``MODEL 470A'', un secuenciador de proteínas en fase gaseosa comercializado por Perkin-Elmer Corp., Instrument Div., Norrwalk, EE.UU., y reveló una secuencia de aminoácidos que contenía el N terminal de la secuencia Nº 1.

Secuencia Nº 1

1

Experimento 2-9

Secuencia parcial de aminoácidos

Una cantidad adecuada de la enzima purificada preparada en el Experimento 1-2 se pesó, dializó frente a tampón Tris-HCl 10 mM (pH 9,0) a 4ºC durante 18 horas, y se mezcló con tampón Tris-HCl 10 mM (pH 9,0) para obtener una solución que contenía aproximadamente 1 mg/ml de la enzima. La solución se incubó a 100ºC durante 5 min para desnaturalizar la enzima, y se puso aproximadamente 1 ml de la misma en un tubo de ensayo, se mezcló con 40 \mug de lisil endopeptidasa y se incubó a 30ºC durante 44 horas para hidrolizar parcialmente la enzima. El hidrolizado resultante se aplicó en una columna ``\muBONDASPERE C18'' para cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa comercializada por Japan Millipore Ltd., Tokio, Japón, que se había equilibrado con trifluoroacetato al 0,1% v/v, seguido por la introducción en la columna de trifluoroacetato al 0,1% v/v que contenía acetonitrilo en un flujo de 1,0 ml/min a la vez que se aumenta la concentración de acetonitrilo entre el 0% v/v y el 70% v/v.

Las fracciones que contenían un fragmento del péptido eluído aproximadamente 58 min a 60 min después de comenzar la introducción se recogieron, mezclaron, secaron al vacío y disolvieron en 0,5 ml de tampón Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), se mezcló con 5 \mug de TPCK tratado con tripsina y se incubó a 37ºC durante 16 horas para efectuar la hidrólisis. La reacción enzimática se suspendió por congelación y el hidrolizado resultante se introdujo en una columna rellena con ``\muBONDASPERE C18'', seguido por la introducción en la columna de trifluoroacetato 0,1% v/v que contenía acetonitrilo acuoso a un flujo de 1,0 ml/min mientras se aumenta la concentración de acetonitrilo acuoso entre el 15% v/v y el 55% v/v. Las fracciones que contenían un fragmento de péptido eluído aproximadamente 42 min después de comenzar la introducción, se recogieron, mezclaron, secaron al vacío y disolvieron en trifluoroacetato 0,1% v/v que contenía 50% v/v de acetonitrilo acuoso. De igual modo que en el Experimento 2-8, se reveló que el fragmento de péptido contenía la secuencia de aminoácidos de la secuencia Nº 2.

Secuencia Nº 2

2

Como no se conoce ninguna enzima con estas propiedades fisicoquímicas, se puede estimar que se trata de una nueva sustancia.

Los presentes inventores estudiaron en profundidad el ADN cromosómico de Thermus aquaticus (ATCC 33923) usando un oligonucleótido como sonda que se había sintetizado químicamente sobre la secuencia de aminoácidos según se revela en los Experimentos 2-8 y 2-9, y han obtenido un fragmento de ADN que consistía en aproximadamente 3.600 pares de bases que tienen la secuencia de bases de la secuencia Nº 4. La descodificación de la secuencia de bases reveló que la enzima termoestable del microorganismo está formada por 963 aminoácidos y tiene la secuencia de aminoácidos de la secuencia Nº 3.

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Secuencia Nº 3

3

4

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Secuencia Nº 4

7

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Los pasos secuenciales del experimento usados para revelar la secuencia de aminoácidos y la secuencia de bases de la secuencia Nº 3 y 4 se resumen a continuación:

(1): Se aisló una enzima termoestable a partir de un cultivo de un microorganismo donante, altamente purificado, y se determinó su secuencia de aminoácidos que contenía el N terminal. La enzima purificada se hidrolizó parcialmente con proteasa, a partir de la cual se aisló un fragmento de péptido y se determinó su secuencia de aminoácidos;

(2): Por separado, se aisló el ADN del cromosoma de un microorganismo donante, se purificó y se digirió parcialmente con una enzima de restricción para obtener el fragmento de ADN formado por aproximadamente 4.000-8.000 pares de bases. El fragmento de ADN se ligó con una ADN ligasa en el vector plásmido, que previamente se había cortado con una enzima de restricción para obtener un ADN recombinante;

(3): El ADN recombinante se introdujo en un microorganismo de la especie Escherichia coli para obtener los transformantes, y a partir de un transformante objetivo que contenía un ADN que codifica la enzima termoestable se seleccionó por el método de hibridación de colonias usando un oligonucleótido, como sonda, que se había sintetizado químicamente basado en la secuencia parcial de aminoácidos mencionada anteriormente; y

(4): El ADN recombinante se obtuvo a partir del transformante seleccionado y se apareó con un cebador, seguido por la actuación de la ADN polimerasa sobre el resultante para ampliar el cebador y determinar la secuencia de bases de la cadena complementaria de ADN resultante por el método dideoxi de terminación de la cadena. La comparación de una secuencia de aminoácidos, que podría estimarse según la secuencia de bases determinada, con la secuencia de aminoácidos mencionada anteriormente, concluyó que codifica la enzima termoestable.

Los siguientes Experimentos 3 y 4 ilustran en concreto los aspectos anteriores (2) a (4), y las técnicas usadas en este documento son las que se usan convencionalmente en este campo, por ejemplo, los descritos por J. Sumbruck y cols. en ``Molecular Cloning. A Laboratory Manual'', 2nd edition, publicado por Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

Experimento 3

Preparación del ADN recombinante que contenía el ADN que codifica una enzima termoestable, y el transformante

Experimento 3-1

Preparación del ADN cromosómico

Un cultivo de siembra de Thermus aquaticus (ATCC 33923) se inoculó en un medio de caldo con nutrientes (pH 7,0), y se cultivó a 60ºC durante 24 horas con agitador giratorio. Las células se separaron del cultivo resultante por centrifugación, se suspendieron en tampón TES (pH 8,0), se mezclaron con lisozima al 0,05% p/v y se incubaron a 37ºC durante 30 min. El resultante se congeló a -80ºC durante una hora, se mezcló con tampón TSS (pH 9,0), se calentó a 60ºC, y se mezcló después con una solución de mezcla de tampón TES y fenol, y la solución resultante se enfrió con hielo, seguido por centrifugación para obtener un sobrenadante. Al sobrenadante se añadió el doble de volumen de etanol frío y se recogió el ADN cromosómico crudo precipitado, se suspendió en tampón SSC (pH 7,1), se mezcló con 7,5 \mug de ribonucleasa y 125 \mug de proteasa, y se incubó a 37ºC durante una hora. A continuación, se añadió una solución de mezcla de cloroformo y alcohol isoamílico a la mezcla de reacción para extraer el ADN cromosómico objetivo, y el extracto se mezcló con etanol frío, seguido por la recogida del sedimento formado que contenía el ADN cromosómico. El ADN cromosómico purificado resultante se disolvió en tampón SSC (pH 7,1) para dar una concentración de aproximadamente 1 mg/ml, y la solución resultante se congeló a -80ºC.

Experimento 3-2

Preparación del ADN recombinante pBTM22 y del transformante BTM22

Aproximadamente 1 ml del ADN cromosómico purificado obtenido en el Ejemplo 3-1 se colocó en un tubo de ensayo, se mezcló con aproximadamente 10 unidades de Sau 3AI, una enzima de restricción y se hizo reaccionar enzimáticamente a 37ºC durante aproximadamente 20 min para escindir parcialmente el ADN cromosómico, seguido por la recuperación del fragmento de ADN formado por aproximadamente 4.000-8.000 pares de bases mediante ultracentrifugación por gradiente de densidad con sacarosa. Un \mug de Bluescript II SK(+), vector plásmido comercializado por Stratagene Cloning Systems, California, EE.UU., se puso en un tubo de ensayo, se sometió a la acción de Bam HI, una enzima de restricción, para digerir completamente el vector plásmido, se mezcló con 10 \mug del fragmento de ADN y 2 unidades de ADN ligasa T4, y se dejó reposar a 4ºC toda la noche para ligar el fragmento de ADN al fragmento de vector plásmido. Al ADNrecombinante resultante se añadieron 30 \mul de ``Epicurian Coli® XLI-Blue'', una célula competente comercializada por Stratagene Cloning Systems, California, EE.UU., Japón, se dejó reposar enfriando en hielo durante 30 min, se calentó a 42ºC, se mezcló con caldo SOC y se incubó a 37ºC durante una hora para introducir el ADN recombinante en Escherichia coli.

El transformante resultante se inoculó en una placa de agar (pH 7,0) que contenía 50 \mug/ml de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\betaD-galactósido y se cultivó a 37ºC durante 18 horas, seguido por la colocación de una película de nailon en la placa de agar para fijar aproximadamente 6.000 colonias formadas en la placa de agar. Según la secuencia de aminoácidos de Trp-Tyr-Lys-Asp-Ala-Val como se muestra en la secuencia Nº 1, la secuencia de bases de la sonda 1 representada por la secuencia de bases de 5'-TGGTAYAARGAYGCNGT-3' se sintetizó por métodos químicos, se marcó con ^{32}P, y se hibridó con las colonias de los transformantes fijados en la película de nailon, seguido por la selección 5 de transformantes que se había hibridado fuertemente con la sonda 1.

El ADN recombinante objetivo se seleccionó de la forma habitual a partir de los transformantes 5 y, de acuerdo con el método descrito por E. M. Southern en Journal of Molecular Biology, Vol. 98, pp. 503-517 (1975), el ADN recombinante se hibridó con la sonda 2 representada por la secuencia de bases de 5'-AAYATGTGGCCNGARGA-3', que se había sintetizado por procedimientos químicos basados en la secuencia de aminoácidos de la secuencia Nº 2, es decir, Asn-Met-Trp-Pro-Glu-Glu, y marcado con ^{32}P, seguido por la selección de un ADN recombinante que se había hibridado fuertemente con la sonda 2. El ADN recombinante y el transformante así seleccionados se denominaron, respectivamente, ``pBTM22'' y ``BTM22''.

El transformante BTM22 se inoculó en caldo L (pH 7,0) que contenía 100 \mug/ml de ampicilina y se cultivó a 37ºC durante 24 horas con un agitador giratorio. Después de completar el cultivo, las células resultantes se recogieron por centrifugación del cultivo y se trataron con el método alcalino convencional para extraer el ADN recombinante de las células. El extracto se purificó y analizó de la forma habitual y reveló que el ADN recombinante pBTM22 consiste aproximadamente en 10.300 pares de bases. Como se muestra en la Figura 5, un fragmento que contenía el ADN, que consiste aproximadamente en 2.900 pares de bases y codifica la enzima termoestable, se localiza cerca del lugar digerido de Hind2 III, una enzima de restricción.

Experimento 3-3

Producción de la enzima recombinante por el transformante BTM22

En matraces de 500 ml se pusieron alícuotas de 100 ml de un medio de cultivo líquido con nutrientes (pH 7,0) que contenía un 2,0% p/v de glucosa, un 0,5% p/v de peptona, un 0,1% p/v de extracto de levadura, un 0,1% p/v de hidrofosfato dipotásico, un 0,06% p/v de dihidrofosfato disódico, un 0,05% p/v de sulfato de magnesio heptahidrato, un 0,5% p/v de carbonato cálcico y agua, y cada matraz se esterilizó calentando a 115ºC durante 30 min, se enfrió, se mezcló con 50 \mug/ml de ampicilina y se inoculó con el transformante BTM22 obtenido en el Experimento 3-2, seguido por el cultivo del transformante a 37ºC durante 24 horas con un agitador giratorio. El cultivo resultante se trató con un disgregador ultrasónico para romper las células y la suspensión resultante se centrifugó para eliminar las sustancias insolubles. En el sobrenadante así obtenido se estudió la actividad de la enzima y se reveló que el cultivo contenía aproximadamente 800 unidades de una enzima recombinante.

Como control, se inoculó un cultivo de siembra de Escherichia coli XLI-Blue o Thermus aquaticus (ATCC 33923) en una preparación reciente del mismo medio de cultivo líquido con nutrientes pero sin ampicilina y, en caso de cultivarse Thermus aquaticus (ATCC 33923), se cultivó y trató de modo similar al descrito anteriormente excepto en que se fijó una temperatura de cultivo a 65ºC. Estudiando la actividad del resultante, un cultivo L de Thermus aquaticus contenía aproximadamente 350 unidades de la enzima, y el rendimiento fue significativamente más bajo que el del transformante BTM22. Escherichia coli XLI-Blue usada como huésped no formó la enzima termoestable.

A continuación, la enzima producida por el transformante BTM22 se purificó de igual modo que en los Experimentos 1 y 2, y se examinaron sus propiedades y características fisicoquímicas. Como resultado, se reveló que tiene sustancialmente las mismas propiedades fisicoquímicas que la enzima termoestable de Thermus aquaticus (ATCC 33923), es decir, tiene un peso molecular de aproximadamente 100.000-110.000 dalton en SDS-PAGE y un punto isoeléctrico de aproximadamente 3,8-4,8 en isoelectroforesis, y no se inactiva sustancialmente, incluso cuando se incuba a 80ºC durante 60 min en agua (pH 7,0). Los resultados indican que la presente enzima termoestable se puede preparar por tecnología de ADN recombinante, y el rendimiento se puede aumentar significativamente de esta manera.

Experimento 4

Preparación de la cadena complementaria de ADN y determinación de su secuencia de bases y secuencia de aminoácidos

Dos \mug del ADN recombinante pBTM22 del Experimento 3-2 se pusieron en un tubo de ensayo, se mezclaron con una solución de hidróxido sódico acuoso 2 M para efectuar su degeneración, y se mezclaron con una cantidad adecuada de etanol frío, seguido por la recogida del sedimento formado que contenía una plantilla de ADN y el secado del sedimento al vacío. A la plantilla de ADN se añadieron 50 pmol/ml de un cebador sintetizado por procedimientos químicos, representado por la secuencia de bases de 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3', 10 \mul de tampón Tris-HCl 40 mM (pH 7,5) que contenía cloruro de magnesio 20 mM y cloruro sódico 20 mM, y la mezcla se incubó a 65ºC durante 2 min para efectuar el apareamiento y se mezcló con 2 \mul de una solución acuosa que contenía dATP, dGTP y dTTP en las cantidades respectivas de 7,5 \muM, 0,5 \mul de [\alpha-^{32}P]dCTP (2 mCi/ml), 1 \mul de ditiotreitol 0,1 M y 2 \mul de T7 con 1,5 unidades/ml de ADN polimerasa, seguido por la incubación de la mezcla resultante a 25ºC durante 5 min para extender el cebador desde el terminal 5' hasta el terminal 3'. De esta manera, se formó una cadena complementaria de ADN.

El producto de reacción que contenía la cadena complementaria de ADN se dividió en cuatro partes iguales, a cada una de las cuales se añadieron 2,5 \mul de una solución de cloruro sódico acuoso 50 mM que contenía 80 \muM de dNTP y 8 \muM de ddATP, ddCTP, ddGTP o ddTTP, y la mezcla resultante se incubó a 37ºC durante 5 min, seguido por la suspensión de la reacción añadiendo 4 \mul de una solución de formamida acuosa al 98% v/v que contenía EDTA 20 mM, un 0,05% p/v de azul bromofenol y 0,05% p/v de cianol xileno. La mezcla de reacción se calentó con un baño de agua hirviendo durante 3 min, y se puso una pequeña alícuota en gel de poliacrilamida al 6% p/v y se realizó la electroforesis usando como energía un voltaje constante de aproximadamente 2.000 voltios para separar los fragmentos de ADN, seguido por la fijación del gel de la forma habitual, el secado y la autorradiografía del resultado.

El análisis de los fragmentos de ADN separados los radiogramas reveló que la cadena complementaria de ADN contenía la secuencia de bases consistente en aproximadamente 3.600 pares de bases de la secuencia Nº 5. Una secuencia de aminoácidos estimable a partir de la secuencia de bases fue como se muestra en paralelo a la secuencia Nº 5, y se comparó con la secuencia de aminoácidos que contenía el N terminal o las secuencias parciales de aminoácidos de las secuencias Nº 1 y 2 y reveló que la secuencia de aminoácidos de la secuencia Nº 1 correspondía con la que estaba situada en las posiciones 1 a 20 de la secuencia Nº 5, y la secuencia de aminoácidos de la secuencia Nº 2 correspondía con la que estaba situada en las posiciones 236 a 250 de la secuencia Nº 5. Estos resultados indican que la presente enzima recombinante tiene la secuencia de aminoácidos de la secuencia Nº 3, y la secuencia de aminoácidos del ADN derivada de Thermus aquaticus (ATCC 33923) se codifica según la secuencia de bases de la secuencia Nº 4.

Secuencia Nº 5

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Como se describe anteriormente, se encontró la enzima termoestable presente capaz de convertir maltosa en trehalosa y viceversa como resultado de la investigación de los presentes inventores desde hace mucho tiempo y, a diferencia de las enzimas convencionales, la enzima tiene unas propiedades fisicoquímicas específicas. La presente invención tiene como objetivo preparar una enzima recombinante mediante tecnología de ADN recombinante. Con respecto a los siguientes ejemplos, se describirán con detalle el proceso de preparación de dicha enzima recombinante, su preparación y usos.

Las enzimas recombinantes como se denominan en la presente invención incluye aquellas que, en general, se preparan por la tecnología de ADN recombinante y son capaces de convertir maltosa en trehalosa y viceversa. Habitualmente, el presente ADN recombinante tiene una secuencia de aminoácidos revelada, es decir, la secuencia de aminoácidos de la secuencia Nº 3 o una homóloga a ella. Las variantes que contenían secuencias de aminoácidos que son homólogas a la secuencia de aminoácidos de la secuencia Nº 3 se pueden preparar sustituyendo uno o más aminoácidos de la secuencia Nº 3 con otros aminoácidos sin alternar la actividad inherente de la enzima. Incluso cuando se use el mismo ADN y los huéspedes en los que se introduce el ADN, así como en los ingredientes y componentes del medio de cultivo con nutrientes que se utiliza para el cultivo de transformantes, y temperatura y pH de cultivo, se pueden producir enzimas modificadas que tienen la actividad enzimática inherente a la enzima codificada por el ADN pero con un defecto de uno o más aminoácidos situados en las cercanías de los terminales N y/o C de la secuencia de aminoácidos de la secuencia Nº 3, o que tiene uno o más aminoácidos que se añaden nuevos al N terminal por modificación de las enzimas intracelulares de los huéspedes después de la expresión del ADN. Tales variantes se pueden incluir en la presente enzima recombinante, siempre que tengan las propiedades deseadas.

La enzima recombinante de acuerdo con la presente invención se puede obtener de cultivos de transformantes que contenían el ADN específico. Los transformantes que se pueden usar en la presente invención se pueden obtener por la introducción en huéspedes apropiados de la secuencia de bases de la secuencia Nº 4, las secuencias de bases homólogas a ella o las secuencias de bases complementarias a estas secuencias de bases. Una o más bases en las secuencias de bases mencionadas anteriormente se pueden reemplazar con otras bases mediante la degeneración del código genético sin alternar la secuencia de aminoácidos que codifica. Huelga decir que una o más bases en la secuencia de bases que codifica la enzima o sus variantes se puede reemplazar fácilmente con otras bases para permitir que el ADN exprese realmente la producción de la enzima en los huéspedes.

En la presente invención se puede utilizar cualquier ADN derivado de fuentes naturales y los que se sintetizan artificialmente, siempre que tengan las secuencias de bases mencionadas anteriormente. Las fuentes naturales del ADN de acuerdo con la presente invención son, por ejemplo, microorganismos del género Thermus aquaticus (ATCC 33923) del que se puede obtener un gen que contenía el ADN usado en la presente invención. Estos microorganismos se pueden inocular en el medio de cultivo con nutrientes y cultivarse durante aproximadamente 1-3 días en condiciones aerobias y las células resultantes se recogieron de los cultivos y se sometieron a ultrasonicación o se trataron con una enzima para lisar la pared celular, como lisozima o \beta-glucanase, para extraer los genes que contenían el ADN presente. En este caso, se puede usar una enzima proteolítica como la proteasa, en combinación con la enzima que lisa la pared celular y, en caso de tratar las células con ultrasonicación, se pueden tratar en presencia de un surfactante como dodecilsulfato sódico (SDS) o tratarse con el método de congelación y descongelación. El ADN objetivo se puede obtener por tratamiento del resultante con extracción con fenol, sedimentación con alcohol, centrifugación, tratamiento con proteasa y/o tratamiento con ribonucleasa, procedimientos que se usan en general en este campo. Para sintetizar el ADN por medios artificiales de acuerdo con la presente invención, se puede sintetizar químicamente usando la secuencia de bases de la secuencia Nº 3, o se puede obtener en forma de plásmido insertando el ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de la secuencia Nº 4 en un vector autorreplicable apropiado para obtener un ADN recombinante, introducción del ADN recombinante en un huésped apropiado para obtener un transformante, cultivo del transformante, separación de las células proliferadas del cultivo resultante, y recogida de los plásmidos que contenían el ADN recombinante de las células.

Por ejemplo, este tipo de ADN recombinante se introduce habitualmente en los huéspedes en forma de un ADN recombinante. En general, el ADN recombinante contiene el ADN mencionado y un vector autorreplicable y se puede preparar por métodos convencionales con una facilidad relativa cuando se tiene a mano el material de ADN.

Ejemplos de dicho vector son los vectores plásmidos como pBR322, pUC18, Bluescript II SK(+), pKK223-3, pUB110, pTZ4, pC194, pHV14, TRp7, TEp7, pBS7, etc.; y vectores fagos como \lambdagt.\lambdaC, \lambdagt. \lambdaB, \rho11, \Phi1, \Phi105, etc. Entre estos vectores plásmidos y fagos, pBR322, pUC18, Bluescript II SK(+), pKK223-3, \lambdagt.\lambdaC y \lambdagt.\lambdaB se usan satisfactoriamente en caso de que el ADN presente se exprese en Escherichia coli, mientras que pUB110, pTZ4, pC194, \rho11, \phi1 y \phi105 se usan satisfactoriamente para expresar el ADN en microorganismos del género Bacillus. Los vectores plásmidos pHV14, TRp7, TEp7 y pBS7 se usan idóneamente cuando se deja crecer el ADN recombinante en 2 o más tipos de huéspedes.

Los métodos usados para insertar el ADN presente en dichos vectores en la presente invención pueden ser los métodos convencionales que se usan en general en este campo. Un gen que contenía el ADN presente y un vector autorreplicable se someten primero a la digestión por una enzima de restricción y/o un disgregador ultrasónico, y después se ligan los fragmentos resultantes del ADN y del vector. Para ligar dichos fragmentos del ADN y del vector, se pueden aparear si es necesario y someter después a la acción de una ADN ligasa en vivo o en vitro. El ADN recombinante así obtenido se puede replicar sin limitaciones sustanciales introduciéndolo en un huésped apropiado, y cultivando el transformante resultante.

El ADN recombinante de acuerdo con la presente invención se puede introducir en microorganismos huéspedes apropiados, como Escherichia coli y los del género Bacillus, así como actinomicetos y levaduras. En el caso de que se use Escherichia coli como huésped, se puede cultivar en presencia del ADN recombinante e ión calcio, mientras que en caso de que se utilicen microorganismos del género Bacillus se pueden utilizar el método de células competentes y la hibridación de colonias. Los transformantes deseados se pueden clonar con el método de hibridación de colonias o por cultivo de varios transformantes en medio de cultivo con nutrientes que contenta o maltosa o trehalosa y la selección posterior de transformantes que formen trehalosa o maltosa.

Los transformantes así obtenidos extracelularmente producen la enzima objetivo cuando se cultivan en un medio de cultivo con nutrientes. En general, como medio de cultivo con nutrientes se puede usar un medio líquido suplementado con fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno y/o minerales y, si es necesario, un suplemento adicional con una pequeña cantidad de aminoácidos y/o vitaminas. Ejemplos de las fuentes de carbono son los sacáridos como almidón, hidrolizado de almidón, glucosa, fructosa y sacarosa. Ejemplos de las fuentes de nitrógeno son las sustancias orgánicas e inorgánicas que contengan nitrógeno, como amoniaco, sales de amonio, urea, nitrato, peptona, extracto de levadura, granos de soja desgrasados, licor con maíz en remojo y extracto de ternera. Los cultivos que contengan la enzima objetivo se pueden obtener por inoculación de los transformantes en el medio de cultivo con nutrientes y su posterior incubación a una temperatura de 20-50ºC y un pH de 2-9 durante aproximadamente 1-6 días en condiciones aerobias por aireación-agitación, etc. Dichos cultivos se pueden usar intactos como un preparado de la enzima pura y, habitualmente, las células de cultivo se pueden fragmentar con un disgregador ultrasónico y/o enzimas que lisan de la pared celular antes de su uso, seguido por la separación de la enzima de las células intactas y restos celulares por filtración y/o centrifugación, y purificación de la enzima. Los métodos usados para purificar la enzima en la invención incluyen los métodos convencionales en general. Una vez que las células de cultivo intactas y los detritus celulares se eliminan, se somete el resultado a uno o más métodos, como concentración, desalinización, diálisis, sedimentación separadora, cromatografía por filtración en gel, cromatografía por intercambio de iones, cromatografía hidrofóbica, cromatografía de afinidad, electroforesis en gel e isoelectroforesis.

Como se ha descrito anteriormente, la presente enzima recombinante termoestable ejerce una actividad distintiva de formación de trehalosa o maltosa a partir de maltosa o trehalosa, respectivamente, incluso cuando se deja actuar a una temperatura mayor de 55ºC, y dicha actividad no se ha encontrado en enzimas convencionales. La trehalosa tiene un dulzor suave y de alta calidad y tiene la gran ventaja de ser capaz de edulcorar los productos alimentarios sin miedo a provocar un cambio de coloración y deterioro no satisfactorios porque no tiene un residuo reductor en su molécula. Al usar estas propiedades de la presente enzima recombinante termoestable, se puede usar maltosa, que no se podría haber usado en algunos campos debido a su reducibilidad, al convertirse en la trehalosa útil con una manejabilidad satisfactoria y sin una reducibilidad sustancial.

Explicando ahora el presente método de conversión enzimática con más detalle, la palabra ``maltosa'' como se denomina en la presente invención significa habitualmente un compuesto sacárido que contiene maltosa y se puede usar cualquier material o método en la presente invención siempre que se forme trehalosa cuando la presente enzima recombinante termoestable actúa sobre ella o se forma en consecuencia. Para producir efectivamente trehalosa a escala industrial, se pueden usar arbitrariamente compuestos sacáridos con un contenido de maltosa relativamente alto, es decir, habitualmente alrededor de un 70% p/p o más, preferiblemente alrededor de un 80% p/p o más. Dichos compuestos sacáridos se pueden preparar por los métodos convencionales usados en general en este campo, por ejemplo, los que se revelan en las Publicaciones de Patentes Japonesas Nº 11.437/81 y 17.078/81, en los cuales se deja actuar \beta-amilasa sobre almidón gelatinizado o licuado y se separa la maltosa formada por el método de separación-sedimentación o por el método de diálisis, o los que se revelan en las Publicaciones de Patentes Japonesas Nº 13.089/72 y 3.938/79, en los cuales se deja actuar \beta-amilasa sobre almidón gelatinizado o licuado junto con una enzima desramificante del algodón como isoamilasa o pululanasa.

En el método de conversión enzimática de acuerdo con la presente invención, una cantidad eficaz de la presente enzima recombinante termoestable se deja coexistir en un medio acuoso que contenga maltosa, manteniéndose la mezcla resultante a una temperatura y pH prescritos para reaccionar enzimáticamente hasta que se forma la cantidad deseada de trehalosa. Aunque la reacción enzimática continúa incluso en una concentración relativamente baja de aproximadamente 0,1% p/p, s.p.s., la concentración se puede establecer aproximadamente en un 2% p/p o más, s.p.s., preferiblemente, aproximadamente 5-50% p/p, s.p.s., para ejecutar un método de conversión enzimática a escala industrial. La temperatura y pH de reacción se fijan en un intervalo en el que se forme eficazmente maltosa sin que se inactive la enzima recombinante, es decir, una temperatura mayor de 55ºC, preferiblemente, aproximadamente 56-63ºC, y un pH de aproximadamente 5-10, preferiblemente, aproximadamente 6-7. La cantidad de la enzima recombinante y el tiempo de reacción se establecen apropiadamente dependiendo de las condiciones de la reacción enzimática. El presente método de conversión enzimática convierte eficazmente maltosa en trehalosa, y la velocidad de conversión alcanza hasta aproximadamente un 50% o más en algunos casos.

Las mezclas de reacción que se pueden obtener con el presente método de conversión enzimática se pueden usar intactas y, habitualmente, se pueden purificar antes de su uso. Por ejemplo, las mezclas de reacción se filtran y centrifugan para eliminar las sustancias insolubles y las soluciones resultantes se decoloran con carbón activado, se desalinizan y purifican con una resina de intercambio de iones y se concentran en productos almibarados. Dependiendo de su uso, estos productos almibarados se pueden secar en vacío y secar por rociado para formar productos sólidos. Para obtener los productos que sustancialmente contienen trehalosa, los productos almibarados se someten a uno o más métodos de cromatografía con intercambiadores de iones, carbones activados o geles de sílice, fermentación usando levaduras y eliminación por descomposición reduciendo los sacáridos con álcalis. Para tratar una cantidad relativamente grande de las mezclas de reacción, en la invención se usan arbitrariamente cromatografías de intercambio de iones como las que utilizan los lechos fijos, los lechos móviles y los lechos pseudomóviles, tal como se revelan en las Patentes Japonesas Abiertas Nº 23.799/83 y 72.598/83, que permiten la producción eficaz y a gran escala de productos con un alto contenido en trehalosa que han sido difíciles de obtener en grandes cantidades.

La trehalosa y los compuestos sacáridos que contienen trehalosa obtenidos de este modo se pueden usar en varios productos en los que se debería evitar la reducibilidad de los edulcorantes sacáridos y, por lo tanto, se pueden usar arbitrariamente en productos alimentarios en general, cosméticos y farmacéuticos como edulcorantes, mejoradores del sabor, mejoradores de la calidad, estabilizantes, rellenos, adyuvantes o excipientes.

Los siguientes ejemplos explican la preparación de la enzima recombinante termoestable y un método de conversión enzimática de maltosa de acuerdo con la presente invención:

Ejemplo A-1 Preparación de la enzima recombinante

En matraces de Erlenmeyer de 500 ml se añadieron alícuotas de 100 ml de un medio de cultivo con nutrientes que contenían un 2,0% p/v de glucosa, un 0,5% p/v de peptona, un 0,1% p/v de extracto de levadura, un 0,1% p/v de hidrofosfato disódico, un 0,06% p/v de dihidrofosfato disódico, un 0,05% p/v de sulfato de magnesio heptahidrato, un 0,5% p/v de carbonato cálcico y agua, y cada matraz se esterilizó calentando a 115ºC durante 30 min, se enfrió, se mezcló con 50 \mug/ml de ampicilina, y se inoculó con el transformante BTM22 obtenido en el Experimento 1-2, seguido por la incubación a 37ºC durante 24 horas en condiciones de agitación-rotación para obtener un cultivo de siembra. A jarras de fermentadores de 30 L se añadieron alícuotas de 18 L de una preparación reciente del mismo medio de cultivo con nutrientes, esterilizado de igual modo que se ha descrito, se mezclaron con 50 \mug/ml de ampicilina, y se inocularon con un 1% v/v del cultivo de siembra, seguido por la incubación a 37ºC y un pH de 6-8 durante 24 horas bajo condiciones de aireación-agitación. Los cultivos resultantes se combinaron, se trataron con ultrasonicación para fragmentar las células, se centrifugaron para eliminar las sustancias insolubles, seguido por la valoración de la actividad enzimática del sobrenadante resultante. En consecuencia, un litro de cultivo contenía aproximadamente 800 unidades de la enzima recombinante. El estudio de un sobrenadante realizado por el método del Experimento 1-1 reveló que en este cultivo se obtenían aproximadamente 5 ml de una solución acuosa que contenía aproximadamente 152 unidades/ml de una enzima recombinante con una actividad específica de aproximadamente 135 unidades/mg de proteína.

Ejemplo A-2 Preparación de la enzima recombinante termoestable Ejemplo A-2(a) Preparación del transformante BTM23

El ADN recombinante pBTM22, obtenido por el método del Ejemplo 3-2, se escindió con Hind III, una enzima de restricción, para obtener un fragmento de ADN consistente en aproximadamente 8.100 pares de bases que contenían la secuencia de bases en una posición desde 107 a 2.889 de la secuencia Nº 4.

Ocho oligonucleótidos que contenían las secuencias de bases representadas por: 5'-AGCTTGAATTCTTTTTTAATAAAATCAGGAGGAAAAACCATGGACC-3', 5'-CCCTCTGGTACAAGGACGCGGTGATCTACCAGCTCCAC-3', 5'-GTCCGCTCCTTCTTTGACGCCAACAACGACGGCTACGG-3', 5'-GGACTTTGAGGGCCTGAGGCGGA-3', 5'-AGCTTCCGCCTCAGGCCCTCAAAGTCCCCGTAGCCGTCGTTGTTG-3', 5'-GCGTCAAAGAAGGAGC-GGACGTGGAGCTGGTAGATCACC-3', 5'-GCGTCCTTGTACCAGAGGGGGTCCATGGTTTTTCCTCC-3', y 5'-TGATTTTATTAAAAAAGAATTCA-3' se mezclaron en cantidades adecuadas y la mezcla se incubó con éxito a 100ºC, 65ºC, 37ºC y 20ºC durante 20 min, respectivamente, para aparearse con los oligonucleótidos. Un primer ADN recombinante, que contenía la secuencia de bases de la secuencia Nº 6 y una secuencia de bases consistente en las bases de las posiciones 1-2.889 de la secuencia Nº 3 en la cual las guaninas (G) situadas en las posiciones 1-963 se reemplazaron con adeninas (A), añadiendo para ello el fragmento de ADN anterior a un ADN dicatenárico de 141 pares de bases que tenía el extremo cohesivo 5' de 4 bases en cada terminal, que consiste en la secuencia de bases de la secuencia Nº 6 y las bases de las posiciones 1-110 de la secuencia Nº 4 en la cual la guanina (G) situada en la posición 1 de la secuencia Nº 4 se reemplazó con adenina (A) sin alternar la secuencia de aminoácidos consistente en los situados en las posiciones 1-36 de la secuencia Nº 3, y se dejó la mezcla reposar a 4ºC toda la noche en presencia de ADN ligasa T4 para aparearse con el contenido.

Secuencia Nº 6

AGCTTGAATT CTTTTTTAAT AAAATCAGGA GGAAAAACC 39

El ADN recombinante pBTM22 obtenido con el método del Experimento 3-2 se escindió con Bam HI, una enzima de restricción, para obtener el fragmento de ADN que contiene aproximadamente 2.400 pares de bases que contenía la secuencia de bases situada entre las posiciones 1.008 a 2.889 de la secuencia Nº 4 que después se ligó con ``M13tv19 RF DNA'', un vector fago comercializado por Takara Shuzo Co., Ltd., Tokio, Japón, que se había escindido con Bam HI para obtener un segundo ADN recombinante.

Se sintetizó un oligonucleótido que contenía una secuencia de bases representada por 5'-CGGTAGCCCTGCAGC-CCCGGG-3' correspondiente a la secuencia de bases de las posiciones 3.438 a 3.458 de la secuencia Nº 5, donde ``timina (T)'', la base situada en posición 3.448 de la secuencia Nº 5, se reemplazó con ``guanina (G)'', según el proceso químico habitual. Al usar el oligonucleótido sintetizado y el ``MUTAN-G'', un sistema de mutación específico del locus comercializado por Takara Shuzo Co., Ltd., Tokio, Japón, se obtuvo un tercer ADN recombinante, que contenía la secuencia de bases situadas en las bases 1.008 a 2.889 de la secuencia Nº 4 donde ``timina (T)'', es decir, la base situada en la posición 3.448 de la secuencia Nº 5, se reemplazó con ``guanina (G)'' sin alternar la secuencia de aminoácidos de las bases en posiciones 337 a 963 de la secuencia Nº 5 que estaba contenida en el segundo ADN recombinante. El procedimiento de mutación específica del locus siguió a la fijación manual al ``MUTAN-G''.

Un fragmento de ADN, que contiene aproximadamente 1.390 pares de bases teniendo en la secuencia de bases en posiciones 1 a 1.358 de la secuencia Nº 4 donde ``guanina (G)'', es decir, la primera base de la secuencia Nº 4, fue reemplazada con ``adenina (A)'', obtenida por escisión con enzimas de restricción Eco RI y Bgl II, y un fragmento de ADN que contiene proximadamente 1.550 pares de bases que contienen la secuencia de bases en posiciones 1.359 a 2.889 de la secuencia Nº 4 obtenida por escisión del tercer ADN recombinante con enzimas de restricción Bgl II y Pst I, se ligaron con ``pKK223-3'', un vector plásmido comercializado por Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Suecia, con ADN ligasa T4 para obtener el ADN recombinante pBTM23 que contenía la secuencia de bases de la secuencia Nº 4.

El ADN recombinante pBTM23 así obtenido se introdujo en Escherichia coli LE 392 (ATCC 33572) que previamente se había preparado en una célula competente de acuerdo con el método descrito por J. Sambrook en ``Molecular Cloning, A Laboratory Manual'', 2nd edition, pp. 1.74-1.81 (1989), publicado por Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, EE.UU., para obtener el presente transformante BTM23 que contenía el ADN que codifica la presente enzima. El transformante se cultivó con el método del Experimento 3-2, y las células proliferadas se recogieron del cultivo resultante y se lisaron para extraer el ADN recombinante que después se purificó y analizó, revelando que el ADN recombinante pBTM23 de la Figura 6 consistía aproximadamente en 7.500 pares de bases y contenía el fragmento de ADN que contenía 2.889 pares de bases que se había ligado en dirección 3' de Nco I, una enzima de restricción.

Ejemplo A-2(b) Preparación de enzima recombinante termoestable mediante el uso del transformante

El transformante BTM23 se cultivó de igual modo que en el Ejemplo A-1, excepto en que se usó un medio de cultivo líquido (pH 7,0) que contenía un 1% p/v de maltosa, un 3% p/v de polipeptona, un 1% p/v de ``MEAST PIG'', un producto de Asahi Breweries, Ltd., Tokio, Japón, un 0,1% p/v de hidrofosfato sódico dihidrato, 200 \mug/ml de ampicilina sódica y agua. Al cultivo resultante se añadieron lisozima de albúmina, comercializada por Seikagaku Kogyo Co., Ltd., Tokio, Japón, y ``TRITON X-100'', un surfactante, hasta obtener concentraciones respectivas de 0,1 mg/ml y 1 mg/ml, y el resultante se incubó a 37ºC durante 16 horas con agitación para extraer una enzima recombinante termoestable de las células. La suspensión se calentó a 60ºC durante una hora para inactivar las enzimas concomitantes de Escherichia coli, seguido por centrifugación de la mezcla para eliminar impurezas y estudio de la actividad de la enzima en el sobrenadante, revelando que el cultivo L contenía aproximadamente 120.000 unidades de la enzima recombinante termoestable. El sobrenadante se purificó con el método del Experimento 1 para obtener aproximadamente 177 ml de solución acuosa que contenía aproximadamente 1.400 unidades/ml de la enzima recombinante termoestable con una actividad específica de aproximadamente 135 unidades/mg de proteína.

Las propiedades y características de la enzima purificada se estudiaron con el método del Experimento 2, revelando que tiene un peso molecular de 100.000-110.000 dalton en electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) y un punto isoeléctrico de aproximadamente 3,8-4,8 en isoelectroforesis, y no se inactiva incluso cuando se incuba a 80ºC durante 60 min en una solución acuosa (pH 7,0). Estas propiedades fisicoquímicas son sustancialmente iguales que cuando se usa Thermus aquaticus (ATCC 33923) como microorganismo donante.

Ejemplo B-1 Preparación de jarabe de trehalosa mediante la enzima recombinante

Se suspendió en agua almidón de patata en polvo para obtener una concentración de 10% p/p, y se ajustó el pH de la suspensión a 5,5, se mezcló con 2 unidades/g de almidón de ``SPITASE HS'', una muestra de \alpha-amilasa comercializada por Nagase Biochemicals, Ltd., Kyoto, Japón, y se calentó a 95ºC para conseguir la gelatinización y licuefacción. A continuación, la solución licuada resultante se esterilizó en autoclave a 120ºC durante 20 min para inactivar la enzima residual, se enfrió rápidamente a 50ºC, se ajustó a un pH 5,0, se mezcló con 500 unidades/g de almidón de una muestra de isoamilasa comercializada por Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japón, y 20 unidades/g de almidón de una muestra de \beta-amilasa comercializada por Nagase Biochemicals, Ltd., Kyoto, Japón, y se sometió a una reacción enzimática a 50ºC durante 24 horas para obtener una solución de sacáridos que contenía aproximadamente un 92% p/p de maltosa, s.p.s. La solución de sacáridos se calentó a 100ºC durante 20 min para inactivar la enzima residual, se enfrió a 60ºC, se ajustó a un pH de 6,5, se mezcló con 1 unidad/g de almidón de la enzima recombinante obtenida en el Ejemplo A-1, y se sometió a una reacción enzimática durante 96 horas. La mezcla de reacción se calentó a 100ºC durante 10 min para inactivar la enzima residual, se enfrió, se filtró y, de la forma habitual, se decoloró con un carbón activado, se desalinizó y se desionizó con una resina de intercambio de iones, y se concentró para obtener un jarabe al 70% p/p con un rendimiento de aproximadamente el 95% en relación con el almidón utilizado, s.p.s.

El producto contiene aproximadamente un 68% p/p de trehalosa, s.p.s., y tiene a reducibilidad relativamente baja debido a que su ED (equivalente a dextrosa) es de 18,4, además de un dulzor suave, una viscosidad moderada y una capacidad para retener la humedad, lo que le hacen arbitrariamente útil en varios compuestos como productos alimenticios, cosméticos y farmacéuticos como edulcorante, mejorador del sabor, estabilizante, relleno, adyuvante o excipiente.

Ejemplo B-2 Preparación de polvo de trehalosa mediante el ADN recombinante

La mezcla de reacción obtenida en el Ejemplo B-1 se ajustó a un pH 5,0, se mezcló con 10 unidades/g de almidón de ``GLUCOZYME'', una muestra de glucoamilasa comercializada por Nagase Biochemicals, Ltd., Kyoto, Japón, y se sometió a una reacción enzimática a 50ºC durante 24 horas. La mezcla de reacción así obtenida se calentó para inactivar la enzima residual y, de la forma habitual, se decoloró, se desalinizó, se purificó y se sometió a una cromatografía en columna de intercambio de iones usando ``XT-1016 (grado de polimerización del 4%)'', una resina de intercambio de cationes en forma de Na^{+} comercializada por Tokyo Organic Chemical Industries., Ltd., Tokio, Japón, para aumentar el contenido de trehalosa. Más concretamente, la resina de intercambio de iones, previamente suspendida en agua, se introdujo en 4 columnas de acero inoxidable con camisa, con un diámetro interior de la columna de 5,4 cm, y las columnas se colocaron en cascada en serie para obtener una longitud total de la columna de 20 m. Se introdujo en las columnas aproximadamente un 5% v/v de la mezcla de reacción mientras se mantenía la temperatura interna de las mismas a 60ºC, y se fraccionó introduciendo en las columnas agua caliente a 60ºC con una VE (velocidad de espacio) de 0,15, seguido por la recogida de las fracciones de contenido alto de trehalosa. Las fracciones se mezclaron y, de la forma habitual, el resultado se concentró, se secó al vacío y se pulverizó para obtener un polvo de trehalosa con un rendimiento de aproximadamente el 50% con respecto a la materia prima, s.p.s.

El producto, que contiene aproximadamente un 97% p/p trehalosa, s.p.s, y que contiene un polvo con capacidad reductora relativamente baja y un dulzor suave, se puede usar arbitrariamente en varios compuestos como productos alimenticios, cosméticos y farmacéuticos como edulcorante, mejorador del sabor, estabilizante, relleno, adyuvante o excipiente.

Ejemplo B-3 Preparación de polvo de trehalosa cristalina mediante la enzima recombinante

Una fracción de contenido alto de trehalosa obtenida por el método del Ejemplo B-2, se decoloró de la forma habitual con un carbón activado, se desalinizó con un intercambiador de iones y se concentró a una solución de aproximadamente el 70% p/p. El concentrado se colocó en un cristalizador y se enfrió gradualmente con agitación para obtener una pasta con un porcentaje de cristalización de aproximadamente el 45%. La pasta se roció a una presión de aproximadamente 150 kg/cm^{2} desde un inyector situado en la parte superior de la torre de secado, mientras se soplaba un aire caliente aproximadamente a 85ºC hacia abajo desde la parte superior de la torre de secado y se soplaba un aire caliente aproximadamente a 45ºC a través del convector de red de alambre, que estaba situado en la base de la torre de secado, para obtener un polvo cristalino recogido por el convector, y el polvo fue recogiéndose gradualmente a su salida de la torre de secado. A continuación, el polvo cristalino se transfirió a una torre de envejecimiento y se dejó reposar durante 10 horas en el chorro de aire caliente para completar la cristalización y secado. De esta manera, se obtuvo un polvo cristalino hidro de trehalosa con un rendimiento de aproximadamente un 90% con respecto a la materia prima, s.p.s.

El producto carece sustancialmente de higroscopia y es fácilmente manejable, y se puede usar arbitrariamente en varios compuestos como productos alimenticios, cosméticos y farmacéuticos como edulcorante, mejorador del sabor, mejorador de la calidad, estabilizante, relleno, adyuvante o excipiente.

Ejemplo B-4 Preparación de polvo de trehalosa cristalina anhidra mediante la enzima recombinante

Una fracción de contenido alto de trehalosa, obtenida según el método del Ejemplo B-2, se purificó de igual modo que en el Ejemplo B-3, y la solución resultante se transfirió a un vaso y se dejó hervir a presión reducida para obtener un jarabe con un contenido de humedad de aproximadamente el 3,0% p/p. El jarabe se introdujo en un cristalizador, se mezcló con aproximadamente un 1,0% p/p de trehalosa cristalina anhidra como cristal de siembra, se cristalizó a 120ºC con agitación y se transfirió a un vaso de aluminio liso, seguido por el envejecimiento del contenido a 100ºC durante 6 horas para formar un bloque. El bloque así obtenido se pulverizó con un cortador, se secó en un lecho fluidizado para obtener un polvo de trehalosa cristalina anhidra con un contenido de humedad de aproximadamente un 0,3% p/p y un rendimiento de aproximadamente el 85% con respecto a la materia prima, s.p.s.

El producto tiene una actividad deshidratante potente y se puede usar arbitrariamente como secante en productos alimenticios, cosméticos y farmacéuticos, así como en sus materiales y productos intermedios, y también se puede usar como edulcorante en forma de polvo blanco con un dulzor suave en productos alimenticios, cosméticos y farmacéuticos.

Ejemplo B-5 Preparación de polvo de trehalosa mediante la enzima recombinante

``MALTOSA HHH'', una maltosa de alta pureza comercializada por Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japón, se disolvió en agua para obtener una concentración de 40% p/p, se calentó a 57ºC, se ajustó a un pH de 6,5, se mezcló con 2 unidades/g de maltosa, s.p.s., de una enzima recombinante termoestable obtenida con el método del Ejemplo A-2, seguido por una reacción enzimática durante 48 horas. La mezcla de reacción se calentó a 100ºC durante 10 min para inactivar la enzima residual, se enfrió, se filtró, se decoloró con un carbón activado de la forma habitual, se desalinizó y se purificó con una resina de intercambio de iones, se secó al vacío y se pulverizó para obtener un producto en polvo que contenía aproximadamente un 73% p/p de trehalosa, s.p.s., con un rendimiento de aproximadamente el 90% con respecto a la maltosa del material, s.p.s.

Aunque el producto tiene una ED (equivalencia con dextrosa) de 19, que es aproximadamente un 30% de la de la maltosa, tiene la misma viscosidad que la maltosa e, igualmente, un dulzor suave y una capacidad adecuada para retener la humedad. Por lo tanto, el producto se puede usar arbitrariamente como edulcorante, mejorador de la calidad, estabilizante, relleno, adyuvante y excipiente en varios compuestos como productos alimenticios, cosméticos y farmacéuticos.

Como se ha descrito anteriormente, la presente invención se basa en el hallazgo de una nueva enzima termoestable que forma trehalosa o maltosa cuando actúa sobre la maltosa o trehalosa. La presente invención tiene como objetivo explorar una forma de producir dicha enzima a una escala industrial y con un rendimiento considerablemente alto utilizando la tecnología de ADN recombinante. El método de conversión enzimático que usa la presente enzima recombinante termoestable convierte maltosa en un compuesto sacárido que contiene trehalosa, glucosa y/o maltosa con un rendimiento considerablemente alto. Trehalosa tiene un dulzor suave y de alta calidad y no tiene un residuo reductor en su molécula, por lo cual puede edulcorar fácilmente productos alimenticios en general sin miedo a provocar cambios de coloración y deterioros no satisfactorios. La enzima recombinante que tenga una secuencia de aminoácidos revelada se puede usar con mayor seguridad para la preparación de trehalosa, cuyo uso está permitido en los productos alimenticios.

Por lo tanto, la presente invención es una invención útil que ejerce la acción y efecto significativos mencionados anteriormente, a la vez que supone una gran contribución a este campo.

Claims

1. Una enzima recombinante que es capaz de convertir maltosa en trehalosa, que no se inactiva sustancialmente incluso cuando se incuba a una temperatura mayor de 55ºC, y que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo formado por aquellos que no son idénticos a la secuencia Nº 3 sino variantes de la secuencia Nº 3 en la que uno o más aminoácidos se borran, añaden o reemplazan con diferentes aminoácidos sin que se altere la actividad inherente de la enzima que tiene la secuencia de aminoácidos de la secuencia Nº 3, y en la cual la enzima recombinante no contiene la secuencia parcial de aminoácido Ala-Val-X-Tyr, donde X significa Phe o Ile.

2. Una enzima recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 que tiene las siguientes propiedades fisicoquímicas:

(a): Acción - formación de trehalosa cuando actúa sobre maltosa, y viceversa;

(b): Peso molecular (PM) - aproximadamente 100.000-110.000 dalton cuando se estudió con isoelectroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE);

(c): Punto isoeléctrico (pI)- aproximadamente 3,8-4,8 cuando se estudió con isoelectroforesis;

(d): Temperatura óptima - aproximadamente 65ºC cuando se incuba a un pH 7,0 durante 60 min;

(e): pH óptimo - aproximadamente 6,0-6,7 cuando se incuba a 60ºC durante 60 min;

(f): Estabilidad térmica - estable hasta una temperatura de aproximadamente 80ºC incluso cuando se incuba a un pH 7,0 durante 60 min; y

(g): Estabilidad de pH - estable hasta un pH de 5,5-9,5 incluso cuando se incuba a 60ºC durante 60 min.

3. Un ADN aislado que codifica una enzima recombinante que es capaz de convertir maltosa en trehalosa, enzima que no se inactiva sustancialmente incluso cuando se incuba a una temperatura mayor de 55ºC, y que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo formado por la secuencia de aminoácidos de la secuencia Nº 3 y variantes de la secuencia Nº 3 en que uno o más aminoácidos de la secuencia Nº 3 se borran, añaden o reemplazan con diferentes aminoácidos sin que se altere la actividad inherente de la enzima que tiene la secuencia de aminoácidos de la secuencia Nº 3.

4. El ADN de la reivindicación 3, que tiene una secuencia de bases seleccionada entre el grupo formado por la secuencia de bases Nº 4, las secuencias de bases homólogas a la misma en que una o más bases de la secuencia Nº 4 se borran, añaden o reemplazan con bases diferentes sin que se altere la actividad inherente de la enzima que tiene la secuencia de aminoácidos Nº, y las secuencias de bases complementarias a estas secuencias de bases.

5. El ADN de la reivindicación 4, en el cual una o más bases de la Secuencia Nº 4 se reemplazan con otras bases mediante la degeneración del código genético sin alterarse la secuencia de aminoácidos de la secuencia Nº 3.

6. El ADN de la reivindicación 3, que tiene la secuencia de bases Nº 5.

7. El ADN de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, que procede de un microorganismo del género Thermus.

8. Un ADN recombinante replicable que contiene un vector autorreplicable y un ADN según se define en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7.

9. El ADN recombinante replicable de la reivindicación 8, en el cual el ADN contiene una secuencia de bases seleccionada entre el grupo formado por la secuencia de bases Nº 4, en las secuencias de bases homólogas a la misma en que una o más bases de la secuencia Nº 4 se borran, añaden o reemplazan con bases diferentes sin que se altere la actividad inherente de la enzima [-] y las secuencias de bases complementarias a estas secuencias de bases.

10. El ADN recombinante replicable de la reivindicación 9, en el cual el ADN que codifica la enzima se obtiene reemplazando una o más bases de la secuencia Nº 4 con otras bases mediante la degeneración del código genético sin que se altere la secuencia de aminoácidos de la secuencia Nº 3.

11. El ADN recombinante replicable de la reivindicación 8, en el cual el ADN que codifica la enzima tiene la secuencia de bases Nº 5.

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12. El ADN recombinante replicable de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en el cual el ADN que codifica la enzima procede de un microorganismo del género Thermus.

13. El ADN recombinante replicable de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en el cual el vector autorreplicable es el vector plásmido Bluescript II SK(+) o pKK223-3.

14. Un transformante que se prepara por la introducción en una célula huésped apropiada del ADN recombinante replicable que contiene un ADN según se define en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7 y un vector autorreplicable.

15. El transformante de la reivindicación 14, en el cual el ADN tiene una secuencia de bases seleccionada entre el grupo formado por la secuencia de bases Nº 4, las secuencias de bases homólogas a la misma en que una o más bases de la secuencia Nº 4 se borran, añaden o reemplazan con bases diferentes sin que se altere la actividad inherente de la enzima [-] y las secuencias de bases complementarias a estas secuencias de bases.

16. El transformante de la reivindicación 15, en el cual dicho ADN se obtiene reemplazando una o más bases en la secuencia de bases de la secuencia Nº 4 con otras bases mediante la degeneración del código genético sin que se altere la secuencia de aminoácidos de la secuencia Nº 3.

17. El transformante de la reivindicación 14, en el cual el ADN tiene la secuencia de bases Nº 5.

18. El transformante de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, en el cual el ADN procede de un microorganismo del género Thermus.

19. El transformante de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, en el cual dicho vector autorreplicable es el vector plásmido Bluescript II SK(+) o pKK223-3.

20. El transformante de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, en el cual dicho huésped es un microorganismo de la especie Escherichia coli.

21. Un proceso de preparación de una enzima recombinante, que consiste en:

el cultivo de un transformante, preparado por la introducción en una célula huésped apropiada de un ADN recombinante que contenía tanto un vector autorreplicable como el ADN según se define en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, en un medio de cultivo con nutrientes para formar la enzima;

y la recogida de la enzima formada en el cultivo resultante.

22. El proceso de la reivindicación 21, en el cual el ADN que codifica la enzima tiene la secuencia de bases Nº 4, las secuencias de bases homólogas a la misma en que una o más bases de la secuencia Nº 4 se borran, añaden o reemplazan con bases diferentes sin que se altere la actividad inherente de la enzima [-], y las secuencias de bases complementarias a estas secuencias de bases.

23. El proceso de la reivindicación 22, en el cual dicho ADN se obtiene reemplazando una o más bases en la secuencia de bases de la secuencia Nº 4 con otras bases mediante la degeneración del código genético sin alterar la secuencia de aminoácidos de la secuencia Nº [-]3.

24. El proceso de la reivindicación 21, en el cual el ADN tiene la secuencia de bases secuencia Nº 5.

25. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24, en el cual el ADN procede de un microorganismo del género Thermus.

26. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25, en el cual dicho vector autorreplicable es el vector plásmido Bluescript II SK(+) o pKK223-3.

27. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 26, en el cual dicho huésped es un microorganismo de la especie Escherichia coli.

28. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 27, en el cual la enzima recombinante formada en el medio de cultivo con nutrientes se recupera por centrifugación, filtración, concentración, desalinización, diálisis, sedimentación separadora, cromatografía por intercambio de iones, cromatografía por filtración en gel, cromatografía hidrofóbica, cromatografía de afinidad, electroforesis en gel y/o isoelectroforesis.

29. Un método de conversión enzimática de maltosa, que consiste en un paso que permite que la enzima recombinante de la reivindicación 1 actúe sobre la maltosa para formar trehalosa.

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30. El método de la reivindicación 29, en el cual el paso consiste en unir una cantidad eficaz de la enzima recombinante en un medio acuoso que contenía maltosa hasta un 50% p/p, y someter la mezcla resultante a una reacción enzimática a una temperatura mayor de 55ºC y a un pH de 5-10.

31. El método de la reivindicación 30, en el cual la mezcla de reacción resultante contiene al menos aproximadamente un 50% p/p de trehalosa, en relación con el producto seco.