ES2197182T3 - Enzima recombinante y termoestable para la conversion de maltosa en trehalosa. - Google Patents
Enzima recombinante y termoestable para la conversion de maltosa en trehalosa.Info
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Abstract
SE EXPONE UNA ENZIMA TERMOESTABLE RECOMBINANTE, QUE CONVIERTE MALTOSA EN TREHALOSA Y QUE ES ESTABLE HASTA UNA TEMPERATURA DE APROXIMADAMENTE 80 GRADOS C, INCLUSO CUANDO ES INCUBADA EN UN PH 7.0 DURANTE 60 MINUTOS, UNA PREPARACION DE LA ENZIMA, UN DNA QUE LA CODIFICA, UN DNA RECOMBINANTE QUE CONTIENE EL DNA, UN TRANSFORMANTE, Y UN METODO DE CONVERSION ENZIMATICA DE MALTOSA UTILIZANDO LA ENZIMA.
Description
Enzima recombinante y termoestable para la
conversión de maltosa en trehalosa.
La presente invención se refiere a una nueva
enzima recombinante termoestable que convierte maltosa en
trehalosa.
La trehalosa es un disacárido formado por 2
moléculas de glucosa unidas por sus grupos reductores, que se
encuentra de forma natural en bacterias, hongos, algas, insectos,
etc., en una cantidad muy pequeña. Al no tener un residuo reductor
en su molécula, trehalosa no provoca una reacción de
empardecimiento insatisfactoria incluso cuando se calienta en
presencia de aminoácidos o similares, y debido a ello, puede ser un
ventajoso edulcorante alimentario sin miedo a que se produzca un
cambio de coloración y un deterioro poco satisfactorios. Sin
embargo, trehalosa no se puede preparar fácilmente en una cantidad
deseada con los métodos convencionales y, en realidad, no se usa
apenas como edulcorante alimentario.
Los métodos convencionales se clasifican
aproximadamente en dos grupos, a saber, el que usa células de
microorganismos y el que utiliza un sistema multienzimático en el
cual se deja actuar a las enzimas sobre los sacáridos. El primero,
según se revela en la Patente Japonesa Abierta Nº 154.485/75, es un
método que consiste en dejar crecer de microorganismos como
bacterias y levaduras en un medio de cultivo con nutrientes, y
recoger trehalosa del cultivo resultante. El segundo, según se
revela en la Patente Japonesa Abierta Nº 216.695/83, es un método
que consiste en proporcionar maltosa como sustrato, dejando que un
sistema multienzimático que usa fosforilasas de maltosa y trehalosa
actúe sobre la maltosa, y aislando después la trehalosa formada en
el sistema de reacción. Aunque el primer método facilita el
crecimiento de microorganismos sin dificultades especiales, tiene el
inconveniente de que el cultivo resultante sólo contiene como
máximo un 15% p/p de trehalosa sobre el producto seco (s.p.s.). Sí
bien el segundo método permite la separación de trehalosa con una
facilidad relativa, es difícil, teóricamente, aumentar el
rendimiento de trehalosa permitiendo que las enzimas actúen sobre
los sustratos en una concentración considerablemente alta porque la
reacción enzimática per se es una reacción de equilibrio de 2
tipos diferentes de enzimas y el punto de equilibrio se inclina
constantemente hacia la formación de glucosa fosfato.
En vista de todo lo expuesto, los presentes
inventores buscaron con energía entre las enzimas que convierten
directamente maltosa en trehalosa, y han encontrado que
microorganismos que pertenecen a los géneros Pimelobacter y
Pseudomonas, según se revela en la Solicitud de Patente
Japonesa Nº 199.971/93, producen una enzima absolutamente nueva que
forma trehalosa cuando actúa sobre maltosa, lo que significa que se
puede preparar trehalosa a partir de maltosa como material que puede
obtenerse con facilidad en cantidades y a bajo coste y el uso de la
enzima superaría por completo todos los propósitos mencionados.
Se encontró que todas las enzimas de estos
microorganismos tienen un óptimo de temperatura de aproximadamente
20-40ºC, que parece algo insuficiente para la
termoestabilidad durante la producción de trehalosa. Se reconoce en
este campo que la sacarificación de almidón y sustancias amiláceas
debe reaccionar, en general, a una temperatura mayor de 55ºC: si
la reacción de sacarificación se efectúa a una temperatura de 55ºC o
menor, se potencia la contaminación bacteriana para reducir el pH
de las mezclas de reacción e inactivar las enzimas usadas, seguida
de un residuo de una cantidad relativamente grande de sustratos
intactos. Sí la reacción de sacarificación se efectúa usando
enzimas que tienen una mala termoestabilidad, se deberá poner un
gran cuidado durante los cambios de pH y, una vez que se produce la
reducción de pH, se deben añadir rápidamente álcalis a las mezclas
de reacción para aumentarlo.
En vista de todo lo expuesto, los presentes
inventores estudiaron con más detalle las enzimas termoestables que
tienen esta actividad y han encontrado que las enzimas producidas
por microorganismos del género Thermus como un microorganismo
de la especie Thermus aquaticus (ATCC 33923), convierten
eficazmente maltosa en trehalosa sin ser sustancialmente
inactivadas, incluso cuando reaccionan a una temperatura mayor de
55ºC. Estas enzimas, sin embargo, no alcanzan una suficiente
actividad productora de enzimas, lo que provoca el problema de que
la producción a escala industrial de trehalosa requiere,
inevitablemente, un cultivo de tales microorganismos a una escala
considerablemente grande.
La tecnología de ADN recombinante ha hecho
notables progresos en los últimos años. En este momento, puede
prepararse fácilmente en la cantidad deseada incluso una enzima
cuya secuencia total de aminoácidos no se ha revelado, sí el gen que
codifica la enzima se aisló alguna vez y la secuencia de bases se
descodificó, preparando un ADN recombinante que contenía el ADN que
codifica la enzima, introduciendo el ADN recombinante en
microorganismos o células de plantas o animales y cultivando los
transformantes resultantes. En esas circunstancias, se requiere con
urgencia encontrar un gen que codifique la enzima termoestable
mencionada y descodificar la secuencia de bases.
\newpage
Es un objeto de la presente invención
proporcionar una enzima recombinante termoestable que forma
trehalosa cuando actúa sobre la maltosa.
Es otro objeto de la presente invención
proporcionar un ADN que codifica la enzima recombinante.
Es otro objeto más de la presente invención
proporcionar un ADN recombinante replicable que contenga el
ADN.
Es otro objeto de la presente invención
proporcionar un transformante en el que el ADN recombinante se ha
introducido.
Es otro objeto de la presente invención
proporcionar un proceso para preparar de la enzima recombinante
usando el transformante.
Es otro objeto de la presente invención
proporcionar un método para convertir maltosa en trehalosa por la
enzima recombinante.
En consecuencia, la presente invención
proporciona una enzima recombinante que es capaz de convertir
maltosa en trehalosa, que no se inactiva sustancialmente incluso
cuando se incuba a una temperatura mayor de 55ºC, y que tiene una
secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo formado por las
que no son idénticas a la secuencia Nº 3, sino que son variantes de
la secuencia Nº 3 en que uno o más aminoácidos se borran, añaden o
reemplazan con diferentes aminoácidos sin que se altere la
actividad inherente de la enzima que tiene la secuencia de
aminoácidos de la secuencia Nº 3, y en el cual la enzima
recombinante no contiene la secuencia parcial de aminoácidos
Ala-Val-X-Tyr, en la
cual X significa Phe o Ile.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un ADN aislado que codifica una enzima recombinante que
es capaz de convertir maltosa en trehalosa, enzima que no se
inactiva sustancialmente incluso cuando se incuba a una temperatura
mayor de 55ºC, y que tiene una secuencia de aminoácidos
seleccionada entre el grupo formado por la secuencia de aminoácidos
de la secuencia Nº 3 y variantes de la secuencia Nº 3 en que uno o
más aminoácidos de la secuencia Nº 3 se borran, añaden o reemplazan
con diferentes aminoácidos sin que se altere la actividad inherente
de la enzima que tiene la secuencia de aminoácidos de la secuencia
Nº 3.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un ADN recombinante replicable que contiene un vector
autorreplicable y un ADN como se ha definido anteriormente.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un transformante que se prepara por la introducción en
un huésped apropiado de un ADN recombinante replicable que contiene
un ADN según se ha definido anteriormente y un vector
autorreplicable.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un proceso de preparación de una enzima recombinante
que consiste en cultivar un transformante, preparado por la
introducción en un huésped apropiado de un ADN recombinante que
contenía tanto un vector autorreplicable como un ADN según se ha
definido anteriormente, en un medio de cultivo con nutrientes para
formar la enzima, y recoger la enzima formada del cultivo
resultante.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un método de conversión enzimática de maltosa, que
consiste en un paso que permite que la enzima recombinante según se
ha definido anteriormente actúe sobre la maltosa para formar
trehalosa.
La Figura 1 muestra la temperatura óptima de una
enzima producida por Thermus Aquaticus (ATCC 33923).
La Figura 2 muestra el pH óptimo de una enzima
producida por Thermus aquaticus (ATCC 33923).
La Figura 3 muestra la estabilidad térmica de una
enzima producida por Thermus Aquaticus (ATCC 33923).
La Figura 4 muestra la estabilidad de pH de una
enzima producida por Thermus Aquaticus (ATCC 33923).
La Figura 5 muestra la estructura del ADN
recombinante pBTM22 de acuerdo con la presente invención.
La Figura 6 muestra la estructura del ADN
recombinante pBTM23 de acuerdo con la presente invención.
La enzima recombinante de acuerdo con la presente
invención actúa sobre la maltosa para formar trehalosa sin ser
sustancialmente inactivada incluso cuando se deja reaccionar a una
temperatura mayor de 55ºC.
El ADN de acuerdo con la presente invención
expresa la producción de la presente enzima recombinante cuando se
introduce en un vector autorreplicable apropiado para obtener un
ADN recombinante replicable, introducido después en un huésped
apropiado, que es inherentemente incapaz de formar la enzima
recombinante pero que prolifera con facilidad, para formar un
transformante.
El ADN recombinante de acuerdo con la presente
invención expresa la producción de la enzima recombinante
introduciéndola en un huésped apropiado, que es inherentemente
incapaz de formar la enzima recombinante pero que prolifera con
facilidad, para formar un transformante, y cultivando el
transformante en un medio de cultivo con nutrientes.
El transformante forma una cantidad deseada de la
enzima recombinante cuando se cultiva de acuerdo con la presente
invención.
El método de conversión enzimática de acuerdo con
la presente invención convierte maltosa en una composición de
sacáridos formada por trehalosa, glucosa y/o
maltooligosacáridos.
La presente invención se elaboró basada en el
hallazgo de una enzima termoestable absolutamente nueva que
convierte maltosa en trehalosa. Dicha enzima se puede obtener de
cultivos de Thermus aquaticus (ATCC 33923), y los presentes
inventores aislaron la enzima usando varios métodos que incluyen la
cromatografía en columna como la técnica principal, y estudiaron
sus propiedades y características, revelando que en realidad es un
polipéptido que tiene las siguientes propiedades fisicoquímicas:
- (1)
- Acción Formar trehalosa cuando actúa sobre la maltosa, y viceversa;
- (2)
- Peso molecular (PM) Aproximadamente 100.000-110.000 dalton cuando se estudia con electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE);
- (3)
- Punto isoeléctrico (pI) Aproximadamente 3,8-4,8 cuando se estudia con isoelectroforesis;
- (4)
- Temperatura óptima Aproximadamente 65ºC cuando se incuba a un pH 7,0 durante 60 min;
- (5)
- pH óptimo Aproximadamente 6,0-6,7 cuando se incuba a 60ºC durante 60 min;
- (6)
- Estabilidad térmica Estable hasta una temperatura de aproximadamente 80ºC incluso cuando se incuba a un pH 7,0 durante 60 min; y
- (7)
- Estabilidad del pH Estable hasta un pH de 5,5-9,5 incluso cuando se incuba a 60ºC durante 60 min.
Los experimentos revelan las propiedades
fisicoquímicas de una enzima termoestable producida por Thermus
aquaticus (ATCC 33923) son los siguientes:
Experimento
1
Experimento
1-1
En matraces de Erlenmeyer de 500 ml se pusieron
alícuotas de 100 ml de un medio de cultivo líquido (pH 7,5) que
contenía un 0,5% p/v de polipeptona, un 0,1% p/v de extracto de
levadura, un 0,07% p/v de nitrato sódico, un 0,01% p/v de
hidrofosfato disódico, un 0,02% p/v de sulfato de magnesio
heptahidrato, un 0,01% p/v de cloruro cálcico, y agua, y los
matraces se introdujeron en el autoclave a 120ºC durante 20 min
para obtener la esterilización. Después de enfriar los matraces se
inoculó un cultivo de siembra de Thermus aquaticus (ATCC
33923) en cada matraz, seguido por la incubación a 60ºC durante 24
horas bajo una agitación-rotación de 200 rpm para
obtener un cultivo de siembra. Se pusieron alícuotas de veinte
litros de una preparación reciente del mismo medio de cultivo
líquido en jarras de fermentadores de 30 litros, se esterilizaron y
se enfriaron a 60ºC, seguido por la inoculación de 1% v/v del
cultivo de siembra en cada fermentador, y se incubó el resultante a
un pH de 6,0-8,0 y 60ºC durante aproximadamente 20
horas en condiciones de aireación-agitación.
Después, se evaluó la actividad enzimática del
cultivo resultante para revelar que contenía aproximadamente 0,35
unidades/ml de la enzima. Una porción del cultivo se centrifugó y
se estudió el sobrenadante para revelar que contenía
aproximadamente 0,02 unidades/ml de la enzima. Mientras que las
células separadas se suspendieron en tampón fosfato 50 mM (pH 7,0)
para obtener un volumen total igual al volumen original de la
porción, seguido por el estudio de la suspensión para revelar que
contenía aproximadamente 0,33 unidades/ml de la enzima.
En la especificación, la actividad de la enzima
se expresa por el valor medido con el siguiente ensayo: poner un ml
de tampón fosfato 10 mM (pH 7,0) que contenía un 20% p/v de maltosa
en un tubo de ensayo, añadir un ml de una solución de enzima
debidamente diluida en el tubo e incubar la solución en el mismo a
60ºC durante 60 min para efectuar una reacción enzimática, seguido
por una nueva incubación a 100ºC durante 10 min para suspender la
reacción enzimática. Después, una porción de la mezcla de reacción
se diluyó 11 veces con tampón fosfato 50 mM (pH 7,5) y 0,4 ml de lo
cual se puso en un tubo de ensayo, se mezcló con 0,1 ml de una
solución que contenía una unidad/ml de trehalasa, seguido por la
incubación de la mezcla resultante a 45ºC durante 120 min y
cuantificación del contenido de glucosa sobre el método de glucosa
oxidasa. Como control, se proporciona un sistema que usa una
solución de trehalasa y una solución de la enzima que se ha
inactivado por calor a 100ºC durante 10 min, y se trata de igual
modo que antes. El contenido de la trehalosa formada se estima
sobre la base del contenido de glucosa cuantificado anteriormente.
Una unidad de la actividad de la enzima se define como la cantidad
que forma un \mumol de trehalosa por minuto en las condiciones
mencionadas.
Experimento
1-2
El cultivo obtenido en el Experimento
1-1 se centrifugó para separar las células y
aproximadamente 0,28 kg de las células húmedas así obtenidas se
suspendió en tampón fosfato 10 mM (pH 7,0), se fragmentaron de la
forma habitual y se centrifugaron para obtener aproximadamente 1,8
l de una solución cruda de la enzima. La solución se mezcló con
sulfato amónico para obtener una saturación del 70% p/v, se
desalinizó dejando reposar a 4ºC toda la noche y se centrifugó para
obtener el sobrenadante. El sobrenadante se mezcló con tampón
fosfato 10 mM (pH 7,0) y la solución de la mezcla se dializó frente
a un preparado reciente del mismo tampón durante 24 horas.
La solución interna del dializado se centrifugó
para obtener un sobrenadante (1.560 ml) que se aplicó a una columna
rellena con 530 ml de ``DEAE-TOYOPEARL® 650'', un
intercambiador de iones comercializado por Tosoh Corporation, Tokio,
Japón, que se había equilibrado previamente con tampón fosfato 10
mM (pH 7,0), seguido por la introducción en la columna de un
gradiente lineal con cloruro sódico tamponado entre 0 M y 0,4 M en
tampón fosfato 10 mM (pH 7,0). Del eluído se obtuvieron fracciones
con actividad objetiva de la enzima que se combinaron, se
dializaron frente a tampón fosfato 10 mM (pH 7,0) que contenía
sulfato amónico 1 M durante 10 horas, y se centrifugó para obtener
el sobrenadante. El sobrenadante se aplicó a una columna rellena con
380 ml de ``BUTYL-TOYOPEARL® 650'', un gel para
cromatografía hidrofóbica comercializado por Tosoh Corporation,
Tokio, Japón, que se había equilibrado previamente con tampón
fosfato 10 mM (pH 7,0) que contenía sulfato amónico 1 M, seguido por
la introducción en la columna de un gradiente lineal de sulfato
amónico tamponado entre 1 M y 0 M en tampón fosfato 10 mM (pH
7,0).
Las fracciones eluídas con sulfato amónico 0,2 M,
que contenían la actividad objetiva de la enzima, se recogieron,
mezclaron y dializaron frente a tampón fosfato 10 mM (pH 7,0) que
contenía cloruro sódico 0,2 M durante 16 horas. La solución
dializada se centrifugó para eliminar las sustancias insolubles y se
introdujo en una columna rellena con 380 ml de ``TOYOPEARL®
HW-55S'', un gel para cromatografía por filtración
en gel comercializado por Tosoh Corporation, Tokio, Japón, que se
había equilibrado previamente con tampón fosfato 10 mM (pH 7,0) que
contenía cloruro sódico 0,2 M, seguido por la introducción en la
columna con tampón fosfato 10 mM (pH 7,0) que contenía cloruro
sódico 1 M. Las fracciones que tienen la actividad de la enzima se
recogieron del eluído y se introdujeron en una columna rellena con
``MONO Q HR5/5'' que se había equilibrado con tampón fosfato 10 mM
(pH 7,0). La columna se alimentó con un gradiente lineal de cloruro
sódico tamponado entre 0,1 M y 0,35 M en tampón fosfato 10 mM (pH
7,0), seguido por la recogida de las fracciones que tienen la
actividad de la enzima. La enzima purificada así obtenida tenía una
actividad específica de aproximadamente 135 unidades/mg de proteína
en un rendimiento de aproximadamente 330 unidades por litro de
cultivo.
La enzima purificada se sometió a una
electroforesis en un gel de poliacrilamida al 7,5% p/v para obtener
una única banda de proteína con la actividad de la enzima, lo que
significa que tenía una pureza considerablemente alta.
Experimento
2
Experimento
2-1
A una solución acuosa que contenía un 5% p/p de
maltosa o trehalosa como sustrato se añaden 2 unidades/g de
sustrato de la enzima purificada obtenida en el Experimento
1-2, y la mezcla se incubó a 60ºC y un pH de 7,0
durante 24 horas. Para analizar la composición del sacárido de la
mezcla de reacción, se secó en vacío, se disolvió en piridina y se
trimetilsilanizó de la manera habitual, y el resultante se sometió a
una cromatografía de gases. Los equipos y condiciones usados en
este análisis fueron los siguientes: como cromatógrafo de gases se
usó un equipo ``GC-16A'' comercializado por Shimadzu
Seisakusho, Ltd., Tokio, Japón; como columna, se usó una columna de
acero inoxidable con un diámetro interno de 3 mm y una longitud de
2 m, rellena con ``SILICONE OV-17/CHROMOSOLB W'' al
2% comercializado por GL Sciences Inc., Tokio, Japón; como
detector, uno de tipo de llama de hidrógeno de ionización; como gas
portador, el gas nitrógeno (con un flujo de 40 ml/min); y como
horno de columna, un horno con una temperatura de
160-320ºC con una temperatura programada que aumenta
a una velocidad de 7,5ºC/min. Las composiciones de sacáridos de las
mezclas de reacción se recogen en la Tabla 1:
Sustrato | Composición de sacáridos de la mezcla de reacción (%) | ||
Trehalosa | Glucosa | Maltosa | |
Maltosa | 70,0 | 4,4 | 25,6 |
Trehalosa | 76,2 | 3,1 | 20,7 |
Como se muestra en la Tabla 1, la enzima
purificada formó aproximadamente un 70% p/p de trehalosa y
aproximadamente un 4% p/p de glucosa cuando actuó sobre la maltosa
como sustrato, a la vez que formó aproximadamente un 21% p/p de
maltosa y aproximadamente un 3% p/p de glucosa cuando actuó sobre
trehalosa como sustrato. Estos datos indican que la enzima
purificada tiene actividades de conversión de maltosa en trehalosa
y de conversión de trehalosa en maltosa, así como de hidrólisis de
la unión á-1,4 en la molécula de maltosa y de la unión á,á-1,1 en
la molécula de trehalosa. No se ha publicado ninguna enzima de este
tipo, lo que induce a pensar que se trata de una nueva vía
enzimática.
Experimento
2-2
De acuerdo con el método publicado por U.K.
Laemmli en Nature, Vol. 227, pp. 680-685 (1970), la
enzima purificada se sometió a una electroforesis en gel de
poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE)
para dar una única banda de proteína en la posición correspondiente
a aproximadamente 100.000 - 110.000 dalton. Las proteínas
marcadoras usadas en este experimento fueron miosina (PM= 200.000
dalton), \beta-galactosidasa (PM= 116.250 dalton),
fosforilasa B (PM= 97.400 dalton), albúmina sérica (PM= 66.200
dalton) y ovoalbúmina (PM= 45.000 dalton).
Experimento
2-3
La enzima purificada dio un punto isoeléctrico de
aproximadamente 3,8-4,8 cuando se sometió a una
isoelectroforesis en 2% p/v ``AMPHOLINE®'' al 2% p/v en un gel de
poliacrilamida comercializado por Pharmacia LKB Biotechnology AB,
Uppsala, Suecia.
Experimento
2-4
La temperatura óptima de la enzima purificada fue
aproximadamente de 65ºC como se muestra en la Figura 1 cuando se
incubó de la forma habitual en tampón fosfato 10 mM (pH 7,0) durante
60 min.
Experimento
2-5
El pH óptimo de la enzima purificada fue
aproximadamente de 6,0-6,7 como se muestra en la
Figura 2 cuando se estudió de la forma habitual incubándola a 60ºC
durante 60 min en tampón acetato, tampón fosfato o tampón carbonato
sódico/bicarbonato sódico 10 mM con diferentes pH.
Experimento
2-6
La enzima purificada fue estable hasta una
temperatura de aproximadamente 80ºC como se muestra en la Figura 3
cuando se estudió de la forma habitual incubándola en tampón
fosfato 50 mM (pH 7,0) durante 60 min.
Experimento
2-7
La enzima purificada fue estable hasta un pH de
aproximadamente 5,5-9,5 como se muestra en la Figura
4 cuando se experimentó de la forma habitual incubándola a 60ºC
durante 60 min en tampón acetato, tampón fosfato o tampón carbonato
sódico/bicarbonato sódico 50 mM con diferentes pH.
Experimento
2-8
La secuencia de aminoácidos que contenía el N
terminal de la enzima purificada se analizó en un equipo ``MODEL
470A'', un secuenciador de proteínas en fase gaseosa comercializado
por Perkin-Elmer Corp., Instrument Div., Norrwalk,
EE.UU., y reveló una secuencia de aminoácidos que contenía el N
terminal de la secuencia Nº 1.
Secuencia Nº
1
Experimento
2-9
Una cantidad adecuada de la enzima purificada
preparada en el Experimento 1-2 se pesó, dializó
frente a tampón Tris-HCl 10 mM (pH 9,0) a 4ºC
durante 18 horas, y se mezcló con tampón Tris-HCl
10 mM (pH 9,0) para obtener una solución que contenía
aproximadamente 1 mg/ml de la enzima. La solución se incubó a 100ºC
durante 5 min para desnaturalizar la enzima, y se puso
aproximadamente 1 ml de la misma en un tubo de ensayo, se mezcló
con 40 \mug de lisil endopeptidasa y se incubó a 30ºC durante 44
horas para hidrolizar parcialmente la enzima. El hidrolizado
resultante se aplicó en una columna ``\muBONDASPERE C18'' para
cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa
comercializada por Japan Millipore Ltd., Tokio, Japón, que se había
equilibrado con trifluoroacetato al 0,1% v/v, seguido por la
introducción en la columna de trifluoroacetato al 0,1% v/v que
contenía acetonitrilo en un flujo de 1,0 ml/min a la vez que se
aumenta la concentración de acetonitrilo entre el 0% v/v y el 70%
v/v.
Las fracciones que contenían un fragmento del
péptido eluído aproximadamente 58 min a 60 min después de comenzar
la introducción se recogieron, mezclaron, secaron al vacío y
disolvieron en 0,5 ml de tampón Tris-HCl 10 mM (pH
8,0), se mezcló con 5 \mug de TPCK tratado con tripsina y se
incubó a 37ºC durante 16 horas para efectuar la hidrólisis. La
reacción enzimática se suspendió por congelación y el hidrolizado
resultante se introdujo en una columna rellena con ``\muBONDASPERE
C18'', seguido por la introducción en la columna de trifluoroacetato
0,1% v/v que contenía acetonitrilo acuoso a un flujo de 1,0 ml/min
mientras se aumenta la concentración de acetonitrilo acuoso entre
el 15% v/v y el 55% v/v. Las fracciones que contenían un fragmento
de péptido eluído aproximadamente 42 min después de comenzar la
introducción, se recogieron, mezclaron, secaron al vacío y
disolvieron en trifluoroacetato 0,1% v/v que contenía 50% v/v de
acetonitrilo acuoso. De igual modo que en el Experimento
2-8, se reveló que el fragmento de péptido contenía
la secuencia de aminoácidos de la secuencia Nº 2.
Secuencia Nº
2
Como no se conoce ninguna enzima con estas
propiedades fisicoquímicas, se puede estimar que se trata de una
nueva sustancia.
Los presentes inventores estudiaron en
profundidad el ADN cromosómico de Thermus aquaticus (ATCC
33923) usando un oligonucleótido como sonda que se había
sintetizado químicamente sobre la secuencia de aminoácidos según se
revela en los Experimentos 2-8 y
2-9, y han obtenido un fragmento de ADN que
consistía en aproximadamente 3.600 pares de bases que tienen la
secuencia de bases de la secuencia Nº 4. La descodificación de la
secuencia de bases reveló que la enzima termoestable del
microorganismo está formada por 963 aminoácidos y tiene la secuencia
de aminoácidos de la secuencia Nº 3.
\newpage
Secuencia Nº
3
Secuencia Nº
4
Los pasos secuenciales del experimento usados
para revelar la secuencia de aminoácidos y la secuencia de bases de
la secuencia Nº 3 y 4 se resumen a continuación:
- (1)
- Se aisló una enzima termoestable a partir de un cultivo de un microorganismo donante, altamente purificado, y se determinó su secuencia de aminoácidos que contenía el N terminal. La enzima purificada se hidrolizó parcialmente con proteasa, a partir de la cual se aisló un fragmento de péptido y se determinó su secuencia de aminoácidos;
- (2)
- Por separado, se aisló el ADN del cromosoma de un microorganismo donante, se purificó y se digirió parcialmente con una enzima de restricción para obtener el fragmento de ADN formado por aproximadamente 4.000-8.000 pares de bases. El fragmento de ADN se ligó con una ADN ligasa en el vector plásmido, que previamente se había cortado con una enzima de restricción para obtener un ADN recombinante;
- (3)
- El ADN recombinante se introdujo en un microorganismo de la especie Escherichia coli para obtener los transformantes, y a partir de un transformante objetivo que contenía un ADN que codifica la enzima termoestable se seleccionó por el método de hibridación de colonias usando un oligonucleótido, como sonda, que se había sintetizado químicamente basado en la secuencia parcial de aminoácidos mencionada anteriormente; y
- (4)
- El ADN recombinante se obtuvo a partir del transformante seleccionado y se apareó con un cebador, seguido por la actuación de la ADN polimerasa sobre el resultante para ampliar el cebador y determinar la secuencia de bases de la cadena complementaria de ADN resultante por el método dideoxi de terminación de la cadena. La comparación de una secuencia de aminoácidos, que podría estimarse según la secuencia de bases determinada, con la secuencia de aminoácidos mencionada anteriormente, concluyó que codifica la enzima termoestable.
Los siguientes Experimentos 3 y 4 ilustran en
concreto los aspectos anteriores (2) a (4), y las técnicas usadas
en este documento son las que se usan convencionalmente en este
campo, por ejemplo, los descritos por J. Sumbruck y cols. en
``Molecular Cloning. A Laboratory Manual'', 2nd edition,
publicado por Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
Experimento
3
Experimento
3-1
Un cultivo de siembra de Thermus aquaticus
(ATCC 33923) se inoculó en un medio de caldo con nutrientes (pH
7,0), y se cultivó a 60ºC durante 24 horas con agitador giratorio.
Las células se separaron del cultivo resultante por centrifugación,
se suspendieron en tampón TES (pH 8,0), se mezclaron con lisozima al
0,05% p/v y se incubaron a 37ºC durante 30 min. El resultante se
congeló a -80ºC durante una hora, se mezcló con tampón TSS (pH 9,0),
se calentó a 60ºC, y se mezcló después con una solución de mezcla de
tampón TES y fenol, y la solución resultante se enfrió con hielo,
seguido por centrifugación para obtener un sobrenadante. Al
sobrenadante se añadió el doble de volumen de etanol frío y se
recogió el ADN cromosómico crudo precipitado, se suspendió en
tampón SSC (pH 7,1), se mezcló con 7,5 \mug de ribonucleasa y 125
\mug de proteasa, y se incubó a 37ºC durante una hora. A
continuación, se añadió una solución de mezcla de cloroformo y
alcohol isoamílico a la mezcla de reacción para extraer el ADN
cromosómico objetivo, y el extracto se mezcló con etanol frío,
seguido por la recogida del sedimento formado que contenía el ADN
cromosómico. El ADN cromosómico purificado resultante se disolvió en
tampón SSC (pH 7,1) para dar una concentración de aproximadamente 1
mg/ml, y la solución resultante se congeló a -80ºC.
Experimento
3-2
Aproximadamente 1 ml del ADN cromosómico
purificado obtenido en el Ejemplo 3-1 se colocó en
un tubo de ensayo, se mezcló con aproximadamente 10 unidades de
Sau 3AI, una enzima de restricción y se hizo reaccionar
enzimáticamente a 37ºC durante aproximadamente 20 min para escindir
parcialmente el ADN cromosómico, seguido por la recuperación del
fragmento de ADN formado por aproximadamente
4.000-8.000 pares de bases mediante
ultracentrifugación por gradiente de densidad con sacarosa. Un
\mug de Bluescript II SK(+), vector plásmido comercializado por
Stratagene Cloning Systems, California, EE.UU., se puso en un tubo
de ensayo, se sometió a la acción de Bam HI, una enzima de
restricción, para digerir completamente el vector plásmido, se
mezcló con 10 \mug del fragmento de ADN y 2 unidades de ADN ligasa
T4, y se dejó reposar a 4ºC toda la noche para ligar el fragmento
de ADN al fragmento de vector plásmido. Al ADNrecombinante
resultante se añadieron 30 \mul de ``Epicurian Coli®
XLI-Blue'', una célula competente comercializada por
Stratagene Cloning Systems, California, EE.UU., Japón, se dejó
reposar enfriando en hielo durante 30 min, se calentó a 42ºC, se
mezcló con caldo SOC y se incubó a 37ºC durante una hora para
introducir el ADN recombinante en Escherichia coli.
El transformante resultante se inoculó en una
placa de agar (pH 7,0) que contenía 50 \mug/ml de
5-bromo-4-cloro-3-indolil-\betaD-galactósido
y se cultivó a 37ºC durante 18 horas, seguido por la colocación de
una película de nailon en la placa de agar para fijar
aproximadamente 6.000 colonias formadas en la placa de agar. Según
la secuencia de aminoácidos de
Trp-Tyr-Lys-Asp-Ala-Val
como se muestra en la secuencia Nº 1, la secuencia de bases de la
sonda 1 representada por la secuencia de bases de
5'-TGGTAYAARGAYGCNGT-3' se sintetizó
por métodos químicos, se marcó con ^{32}P, y se hibridó con las
colonias de los transformantes fijados en la película de nailon,
seguido por la selección 5 de transformantes que se había hibridado
fuertemente con la sonda 1.
El ADN recombinante objetivo se seleccionó de la
forma habitual a partir de los transformantes 5 y, de acuerdo con el
método descrito por E. M. Southern en Journal of Molecular
Biology, Vol. 98, pp. 503-517 (1975), el ADN
recombinante se hibridó con la sonda 2 representada por la secuencia
de bases de
5'-AAYATGTGGCCNGARGA-3', que se
había sintetizado por procedimientos químicos basados en la
secuencia de aminoácidos de la secuencia Nº 2, es decir,
Asn-Met-Trp-Pro-Glu-Glu,
y marcado con ^{32}P, seguido por la selección de un ADN
recombinante que se había hibridado fuertemente con la sonda 2. El
ADN recombinante y el transformante así seleccionados se
denominaron, respectivamente, ``pBTM22'' y ``BTM22''.
El transformante BTM22 se inoculó en caldo L (pH
7,0) que contenía 100 \mug/ml de ampicilina y se cultivó a 37ºC
durante 24 horas con un agitador giratorio. Después de completar el
cultivo, las células resultantes se recogieron por centrifugación
del cultivo y se trataron con el método alcalino convencional para
extraer el ADN recombinante de las células. El extracto se purificó
y analizó de la forma habitual y reveló que el ADN recombinante
pBTM22 consiste aproximadamente en 10.300 pares de bases. Como se
muestra en la Figura 5, un fragmento que contenía el ADN, que
consiste aproximadamente en 2.900 pares de bases y codifica la
enzima termoestable, se localiza cerca del lugar digerido de
Hind2 III, una enzima de restricción.
Experimento
3-3
En matraces de 500 ml se pusieron alícuotas de
100 ml de un medio de cultivo líquido con nutrientes (pH 7,0) que
contenía un 2,0% p/v de glucosa, un 0,5% p/v de peptona, un 0,1%
p/v de extracto de levadura, un 0,1% p/v de hidrofosfato
dipotásico, un 0,06% p/v de dihidrofosfato disódico, un 0,05% p/v de
sulfato de magnesio heptahidrato, un 0,5% p/v de carbonato cálcico
y agua, y cada matraz se esterilizó calentando a 115ºC durante 30
min, se enfrió, se mezcló con 50 \mug/ml de ampicilina y se
inoculó con el transformante BTM22 obtenido en el Experimento
3-2, seguido por el cultivo del transformante a 37ºC
durante 24 horas con un agitador giratorio. El cultivo resultante
se trató con un disgregador ultrasónico para romper las células y la
suspensión resultante se centrifugó para eliminar las sustancias
insolubles. En el sobrenadante así obtenido se estudió la actividad
de la enzima y se reveló que el cultivo contenía aproximadamente
800 unidades de una enzima recombinante.
Como control, se inoculó un cultivo de siembra de
Escherichia coli XLI-Blue o Thermus
aquaticus (ATCC 33923) en una preparación reciente del mismo
medio de cultivo líquido con nutrientes pero sin ampicilina y, en
caso de cultivarse Thermus aquaticus (ATCC 33923), se
cultivó y trató de modo similar al descrito anteriormente excepto
en que se fijó una temperatura de cultivo a 65ºC. Estudiando la
actividad del resultante, un cultivo L de Thermus aquaticus
contenía aproximadamente 350 unidades de la enzima, y el
rendimiento fue significativamente más bajo que el del transformante
BTM22. Escherichia coli XLI-Blue usada como
huésped no formó la enzima termoestable.
A continuación, la enzima producida por el
transformante BTM22 se purificó de igual modo que en los
Experimentos 1 y 2, y se examinaron sus propiedades y
características fisicoquímicas. Como resultado, se reveló que tiene
sustancialmente las mismas propiedades fisicoquímicas que la enzima
termoestable de Thermus aquaticus (ATCC 33923), es decir,
tiene un peso molecular de aproximadamente
100.000-110.000 dalton en SDS-PAGE y
un punto isoeléctrico de aproximadamente 3,8-4,8 en
isoelectroforesis, y no se inactiva sustancialmente, incluso cuando
se incuba a 80ºC durante 60 min en agua (pH 7,0). Los resultados
indican que la presente enzima termoestable se puede preparar por
tecnología de ADN recombinante, y el rendimiento se puede aumentar
significativamente de esta manera.
Experimento
4
Dos \mug del ADN recombinante pBTM22 del
Experimento 3-2 se pusieron en un tubo de ensayo, se
mezclaron con una solución de hidróxido sódico acuoso 2 M para
efectuar su degeneración, y se mezclaron con una cantidad adecuada
de etanol frío, seguido por la recogida del sedimento formado que
contenía una plantilla de ADN y el secado del sedimento al vacío. A
la plantilla de ADN se añadieron 50 pmol/ml de un cebador
sintetizado por procedimientos químicos, representado por la
secuencia de bases de
5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3', 10 \mul
de tampón Tris-HCl 40 mM (pH 7,5) que contenía
cloruro de magnesio 20 mM y cloruro sódico 20 mM, y la mezcla se
incubó a 65ºC durante 2 min para efectuar el apareamiento y se
mezcló con 2 \mul de una solución acuosa que contenía dATP, dGTP
y dTTP en las cantidades respectivas de 7,5 \muM, 0,5 \mul de
[\alpha-^{32}P]dCTP (2 mCi/ml), 1 \mul
de ditiotreitol 0,1 M y 2 \mul de T7 con 1,5 unidades/ml de ADN
polimerasa, seguido por la incubación de la mezcla resultante a
25ºC durante 5 min para extender el cebador desde el terminal 5'
hasta el terminal 3'. De esta manera, se formó una cadena
complementaria de ADN.
El producto de reacción que contenía la cadena
complementaria de ADN se dividió en cuatro partes iguales, a cada
una de las cuales se añadieron 2,5 \mul de una solución de
cloruro sódico acuoso 50 mM que contenía 80 \muM de dNTP y 8
\muM de ddATP, ddCTP, ddGTP o ddTTP, y la mezcla resultante se
incubó a 37ºC durante 5 min, seguido por la suspensión de la
reacción añadiendo 4 \mul de una solución de formamida acuosa al
98% v/v que contenía EDTA 20 mM, un 0,05% p/v de azul bromofenol y
0,05% p/v de cianol xileno. La mezcla de reacción se calentó con un
baño de agua hirviendo durante 3 min, y se puso una pequeña
alícuota en gel de poliacrilamida al 6% p/v y se realizó la
electroforesis usando como energía un voltaje constante de
aproximadamente 2.000 voltios para separar los fragmentos de ADN,
seguido por la fijación del gel de la forma habitual, el secado y la
autorradiografía del resultado.
El análisis de los fragmentos de ADN separados
los radiogramas reveló que la cadena complementaria de ADN contenía
la secuencia de bases consistente en aproximadamente 3.600 pares de
bases de la secuencia Nº 5. Una secuencia de aminoácidos estimable a
partir de la secuencia de bases fue como se muestra en paralelo a
la secuencia Nº 5, y se comparó con la secuencia de aminoácidos que
contenía el N terminal o las secuencias parciales de aminoácidos de
las secuencias Nº 1 y 2 y reveló que la secuencia de aminoácidos de
la secuencia Nº 1 correspondía con la que estaba situada en las
posiciones 1 a 20 de la secuencia Nº 5, y la secuencia de
aminoácidos de la secuencia Nº 2 correspondía con la que estaba
situada en las posiciones 236 a 250 de la secuencia Nº 5. Estos
resultados indican que la presente enzima recombinante tiene la
secuencia de aminoácidos de la secuencia Nº 3, y la secuencia de
aminoácidos del ADN derivada de Thermus aquaticus (ATCC
33923) se codifica según la secuencia de bases de la secuencia Nº
4.
Secuencia Nº
5
Como se describe anteriormente, se encontró la
enzima termoestable presente capaz de convertir maltosa en
trehalosa y viceversa como resultado de la investigación de los
presentes inventores desde hace mucho tiempo y, a diferencia de las
enzimas convencionales, la enzima tiene unas propiedades
fisicoquímicas específicas. La presente invención tiene como
objetivo preparar una enzima recombinante mediante tecnología de
ADN recombinante. Con respecto a los siguientes ejemplos, se
describirán con detalle el proceso de preparación de dicha enzima
recombinante, su preparación y usos.
Las enzimas recombinantes como se denominan en la
presente invención incluye aquellas que, en general, se preparan
por la tecnología de ADN recombinante y son capaces de convertir
maltosa en trehalosa y viceversa. Habitualmente, el presente ADN
recombinante tiene una secuencia de aminoácidos revelada, es decir,
la secuencia de aminoácidos de la secuencia Nº 3 o una homóloga a
ella. Las variantes que contenían secuencias de aminoácidos que son
homólogas a la secuencia de aminoácidos de la secuencia Nº 3 se
pueden preparar sustituyendo uno o más aminoácidos de la secuencia
Nº 3 con otros aminoácidos sin alternar la actividad inherente de la
enzima. Incluso cuando se use el mismo ADN y los huéspedes en los
que se introduce el ADN, así como en los ingredientes y componentes
del medio de cultivo con nutrientes que se utiliza para el cultivo
de transformantes, y temperatura y pH de cultivo, se pueden producir
enzimas modificadas que tienen la actividad enzimática inherente a
la enzima codificada por el ADN pero con un defecto de uno o más
aminoácidos situados en las cercanías de los terminales N y/o C de
la secuencia de aminoácidos de la secuencia Nº 3, o que tiene uno o
más aminoácidos que se añaden nuevos al N terminal por modificación
de las enzimas intracelulares de los huéspedes después de la
expresión del ADN. Tales variantes se pueden incluir en la presente
enzima recombinante, siempre que tengan las propiedades
deseadas.
La enzima recombinante de acuerdo con la presente
invención se puede obtener de cultivos de transformantes que
contenían el ADN específico. Los transformantes que se pueden usar
en la presente invención se pueden obtener por la introducción en
huéspedes apropiados de la secuencia de bases de la secuencia Nº 4,
las secuencias de bases homólogas a ella o las secuencias de bases
complementarias a estas secuencias de bases. Una o más bases en las
secuencias de bases mencionadas anteriormente se pueden reemplazar
con otras bases mediante la degeneración del código genético sin
alternar la secuencia de aminoácidos que codifica. Huelga decir que
una o más bases en la secuencia de bases que codifica la enzima o
sus variantes se puede reemplazar fácilmente con otras bases para
permitir que el ADN exprese realmente la producción de la enzima en
los huéspedes.
En la presente invención se puede utilizar
cualquier ADN derivado de fuentes naturales y los que se sintetizan
artificialmente, siempre que tengan las secuencias de bases
mencionadas anteriormente. Las fuentes naturales del ADN de acuerdo
con la presente invención son, por ejemplo, microorganismos del
género Thermus aquaticus (ATCC 33923) del que se puede
obtener un gen que contenía el ADN usado en la presente invención.
Estos microorganismos se pueden inocular en el medio de cultivo con
nutrientes y cultivarse durante aproximadamente 1-3
días en condiciones aerobias y las células resultantes se
recogieron de los cultivos y se sometieron a ultrasonicación o se
trataron con una enzima para lisar la pared celular, como lisozima o
\beta-glucanase, para extraer los genes que
contenían el ADN presente. En este caso, se puede usar una enzima
proteolítica como la proteasa, en combinación con la enzima que lisa
la pared celular y, en caso de tratar las células con
ultrasonicación, se pueden tratar en presencia de un surfactante
como dodecilsulfato sódico (SDS) o tratarse con el método de
congelación y descongelación. El ADN objetivo se puede obtener por
tratamiento del resultante con extracción con fenol, sedimentación
con alcohol, centrifugación, tratamiento con proteasa y/o
tratamiento con ribonucleasa, procedimientos que se usan en general
en este campo. Para sintetizar el ADN por medios artificiales de
acuerdo con la presente invención, se puede sintetizar químicamente
usando la secuencia de bases de la secuencia Nº 3, o se puede
obtener en forma de plásmido insertando el ADN que codifica la
secuencia de aminoácidos de la secuencia Nº 4 en un vector
autorreplicable apropiado para obtener un ADN recombinante,
introducción del ADN recombinante en un huésped apropiado para
obtener un transformante, cultivo del transformante, separación de
las células proliferadas del cultivo resultante, y recogida de los
plásmidos que contenían el ADN recombinante de las células.
Por ejemplo, este tipo de ADN recombinante se
introduce habitualmente en los huéspedes en forma de un ADN
recombinante. En general, el ADN recombinante contiene el ADN
mencionado y un vector autorreplicable y se puede preparar por
métodos convencionales con una facilidad relativa cuando se tiene a
mano el material de ADN.
Ejemplos de dicho vector son los vectores
plásmidos como pBR322, pUC18, Bluescript II SK(+),
pKK223-3, pUB110, pTZ4, pC194, pHV14, TRp7, TEp7,
pBS7, etc.; y vectores fagos como \lambdagt.\lambdaC,
\lambdagt. \lambdaB, \rho11, \Phi1, \Phi105, etc. Entre
estos vectores plásmidos y fagos, pBR322, pUC18, Bluescript II
SK(+), pKK223-3, \lambdagt.\lambdaC y
\lambdagt.\lambdaB se usan satisfactoriamente en caso de que el
ADN presente se exprese en Escherichia coli, mientras que
pUB110, pTZ4, pC194, \rho11, \phi1 y \phi105 se usan
satisfactoriamente para expresar el ADN en microorganismos del
género Bacillus. Los vectores plásmidos pHV14, TRp7, TEp7 y
pBS7 se usan idóneamente cuando se deja crecer el ADN recombinante
en 2 o más tipos de huéspedes.
Los métodos usados para insertar el ADN presente
en dichos vectores en la presente invención pueden ser los métodos
convencionales que se usan en general en este campo. Un gen que
contenía el ADN presente y un vector autorreplicable se someten
primero a la digestión por una enzima de restricción y/o un
disgregador ultrasónico, y después se ligan los fragmentos
resultantes del ADN y del vector. Para ligar dichos fragmentos del
ADN y del vector, se pueden aparear si es necesario y someter
después a la acción de una ADN ligasa en vivo o en
vitro. El ADN recombinante así obtenido se puede replicar sin
limitaciones sustanciales introduciéndolo en un huésped apropiado,
y cultivando el transformante resultante.
El ADN recombinante de acuerdo con la presente
invención se puede introducir en microorganismos huéspedes
apropiados, como Escherichia coli y los del género
Bacillus, así como actinomicetos y levaduras. En el caso de
que se use Escherichia coli como huésped, se puede cultivar
en presencia del ADN recombinante e ión calcio, mientras que en
caso de que se utilicen microorganismos del género Bacillus
se pueden utilizar el método de células competentes y la hibridación
de colonias. Los transformantes deseados se pueden clonar con el
método de hibridación de colonias o por cultivo de varios
transformantes en medio de cultivo con nutrientes que contenta o
maltosa o trehalosa y la selección posterior de transformantes que
formen trehalosa o maltosa.
Los transformantes así obtenidos
extracelularmente producen la enzima objetivo cuando se cultivan en
un medio de cultivo con nutrientes. En general, como medio de
cultivo con nutrientes se puede usar un medio líquido suplementado
con fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno y/o minerales y, si es
necesario, un suplemento adicional con una pequeña cantidad de
aminoácidos y/o vitaminas. Ejemplos de las fuentes de carbono son
los sacáridos como almidón, hidrolizado de almidón, glucosa,
fructosa y sacarosa. Ejemplos de las fuentes de nitrógeno son las
sustancias orgánicas e inorgánicas que contengan nitrógeno, como
amoniaco, sales de amonio, urea, nitrato, peptona, extracto de
levadura, granos de soja desgrasados, licor con maíz en remojo y
extracto de ternera. Los cultivos que contengan la enzima objetivo
se pueden obtener por inoculación de los transformantes en el medio
de cultivo con nutrientes y su posterior incubación a una
temperatura de 20-50ºC y un pH de
2-9 durante aproximadamente 1-6
días en condiciones aerobias por
aireación-agitación, etc. Dichos cultivos se pueden
usar intactos como un preparado de la enzima pura y, habitualmente,
las células de cultivo se pueden fragmentar con un disgregador
ultrasónico y/o enzimas que lisan de la pared celular antes de su
uso, seguido por la separación de la enzima de las células intactas
y restos celulares por filtración y/o centrifugación, y
purificación de la enzima. Los métodos usados para purificar la
enzima en la invención incluyen los métodos convencionales en
general. Una vez que las células de cultivo intactas y los detritus
celulares se eliminan, se somete el resultado a uno o más métodos,
como concentración, desalinización, diálisis, sedimentación
separadora, cromatografía por filtración en gel, cromatografía por
intercambio de iones, cromatografía hidrofóbica, cromatografía de
afinidad, electroforesis en gel e isoelectroforesis.
Como se ha descrito anteriormente, la presente
enzima recombinante termoestable ejerce una actividad distintiva de
formación de trehalosa o maltosa a partir de maltosa o trehalosa,
respectivamente, incluso cuando se deja actuar a una temperatura
mayor de 55ºC, y dicha actividad no se ha encontrado en enzimas
convencionales. La trehalosa tiene un dulzor suave y de alta
calidad y tiene la gran ventaja de ser capaz de edulcorar los
productos alimentarios sin miedo a provocar un cambio de coloración
y deterioro no satisfactorios porque no tiene un residuo reductor
en su molécula. Al usar estas propiedades de la presente enzima
recombinante termoestable, se puede usar maltosa, que no se podría
haber usado en algunos campos debido a su reducibilidad, al
convertirse en la trehalosa útil con una manejabilidad
satisfactoria y sin una reducibilidad sustancial.
Explicando ahora el presente método de conversión
enzimática con más detalle, la palabra ``maltosa'' como se denomina
en la presente invención significa habitualmente un compuesto
sacárido que contiene maltosa y se puede usar cualquier material o
método en la presente invención siempre que se forme trehalosa
cuando la presente enzima recombinante termoestable actúa sobre ella
o se forma en consecuencia. Para producir efectivamente trehalosa a
escala industrial, se pueden usar arbitrariamente compuestos
sacáridos con un contenido de maltosa relativamente alto, es decir,
habitualmente alrededor de un 70% p/p o más, preferiblemente
alrededor de un 80% p/p o más. Dichos compuestos sacáridos se
pueden preparar por los métodos convencionales usados en general en
este campo, por ejemplo, los que se revelan en las Publicaciones de
Patentes Japonesas Nº 11.437/81 y 17.078/81, en los cuales se deja
actuar \beta-amilasa sobre almidón gelatinizado o
licuado y se separa la maltosa formada por el método de
separación-sedimentación o por el método de
diálisis, o los que se revelan en las Publicaciones de Patentes
Japonesas Nº 13.089/72 y 3.938/79, en los cuales se deja actuar
\beta-amilasa sobre almidón gelatinizado o licuado
junto con una enzima desramificante del algodón como isoamilasa o
pululanasa.
En el método de conversión enzimática de acuerdo
con la presente invención, una cantidad eficaz de la presente enzima
recombinante termoestable se deja coexistir en un medio acuoso que
contenga maltosa, manteniéndose la mezcla resultante a una
temperatura y pH prescritos para reaccionar enzimáticamente hasta
que se forma la cantidad deseada de trehalosa. Aunque la reacción
enzimática continúa incluso en una concentración relativamente baja
de aproximadamente 0,1% p/p, s.p.s., la concentración se puede
establecer aproximadamente en un 2% p/p o más, s.p.s.,
preferiblemente, aproximadamente 5-50% p/p, s.p.s.,
para ejecutar un método de conversión enzimática a escala
industrial. La temperatura y pH de reacción se fijan en un intervalo
en el que se forme eficazmente maltosa sin que se inactive la
enzima recombinante, es decir, una temperatura mayor de 55ºC,
preferiblemente, aproximadamente 56-63ºC, y un pH de
aproximadamente 5-10, preferiblemente,
aproximadamente 6-7. La cantidad de la enzima
recombinante y el tiempo de reacción se establecen apropiadamente
dependiendo de las condiciones de la reacción enzimática. El
presente método de conversión enzimática convierte eficazmente
maltosa en trehalosa, y la velocidad de conversión alcanza hasta
aproximadamente un 50% o más en algunos casos.
Las mezclas de reacción que se pueden obtener con
el presente método de conversión enzimática se pueden usar intactas
y, habitualmente, se pueden purificar antes de su uso. Por ejemplo,
las mezclas de reacción se filtran y centrifugan para eliminar las
sustancias insolubles y las soluciones resultantes se decoloran con
carbón activado, se desalinizan y purifican con una resina de
intercambio de iones y se concentran en productos almibarados.
Dependiendo de su uso, estos productos almibarados se pueden secar
en vacío y secar por rociado para formar productos sólidos. Para
obtener los productos que sustancialmente contienen trehalosa, los
productos almibarados se someten a uno o más métodos de
cromatografía con intercambiadores de iones, carbones activados o
geles de sílice, fermentación usando levaduras y eliminación por
descomposición reduciendo los sacáridos con álcalis. Para tratar
una cantidad relativamente grande de las mezclas de reacción, en la
invención se usan arbitrariamente cromatografías de intercambio de
iones como las que utilizan los lechos fijos, los lechos móviles y
los lechos pseudomóviles, tal como se revelan en las Patentes
Japonesas Abiertas Nº 23.799/83 y 72.598/83, que permiten la
producción eficaz y a gran escala de productos con un alto contenido
en trehalosa que han sido difíciles de obtener en grandes
cantidades.
La trehalosa y los compuestos sacáridos que
contienen trehalosa obtenidos de este modo se pueden usar en varios
productos en los que se debería evitar la reducibilidad de los
edulcorantes sacáridos y, por lo tanto, se pueden usar
arbitrariamente en productos alimentarios en general, cosméticos y
farmacéuticos como edulcorantes, mejoradores del sabor, mejoradores
de la calidad, estabilizantes, rellenos, adyuvantes o
excipientes.
Los siguientes ejemplos explican la preparación
de la enzima recombinante termoestable y un método de conversión
enzimática de maltosa de acuerdo con la presente invención:
En matraces de Erlenmeyer de 500 ml se añadieron
alícuotas de 100 ml de un medio de cultivo con nutrientes que
contenían un 2,0% p/v de glucosa, un 0,5% p/v de peptona, un 0,1%
p/v de extracto de levadura, un 0,1% p/v de hidrofosfato disódico,
un 0,06% p/v de dihidrofosfato disódico, un 0,05% p/v de sulfato de
magnesio heptahidrato, un 0,5% p/v de carbonato cálcico y agua, y
cada matraz se esterilizó calentando a 115ºC durante 30 min, se
enfrió, se mezcló con 50 \mug/ml de ampicilina, y se inoculó con
el transformante BTM22 obtenido en el Experimento
1-2, seguido por la incubación a 37ºC durante 24
horas en condiciones de agitación-rotación para
obtener un cultivo de siembra. A jarras de fermentadores de 30 L se
añadieron alícuotas de 18 L de una preparación reciente del mismo
medio de cultivo con nutrientes, esterilizado de igual modo que se
ha descrito, se mezclaron con 50 \mug/ml de ampicilina, y se
inocularon con un 1% v/v del cultivo de siembra, seguido por la
incubación a 37ºC y un pH de 6-8 durante 24 horas
bajo condiciones de aireación-agitación. Los
cultivos resultantes se combinaron, se trataron con ultrasonicación
para fragmentar las células, se centrifugaron para eliminar las
sustancias insolubles, seguido por la valoración de la actividad
enzimática del sobrenadante resultante. En consecuencia, un litro
de cultivo contenía aproximadamente 800 unidades de la enzima
recombinante. El estudio de un sobrenadante realizado por el método
del Experimento 1-1 reveló que en este cultivo se
obtenían aproximadamente 5 ml de una solución acuosa que contenía
aproximadamente 152 unidades/ml de una enzima recombinante con una
actividad específica de aproximadamente 135 unidades/mg de
proteína.
El ADN recombinante pBTM22, obtenido por el
método del Ejemplo 3-2, se escindió con Hind
III, una enzima de restricción, para obtener un fragmento de ADN
consistente en aproximadamente 8.100 pares de bases que contenían la
secuencia de bases en una posición desde 107 a 2.889 de la
secuencia Nº 4.
Ocho oligonucleótidos que contenían las
secuencias de bases representadas por:
5'-AGCTTGAATTCTTTTTTAATAAAATCAGGAGGAAAAACCATGGACC-3',
5'-CCCTCTGGTACAAGGACGCGGTGATCTACCAGCTCCAC-3',
5'-GTCCGCTCCTTCTTTGACGCCAACAACGACGGCTACGG-3',
5'-GGACTTTGAGGGCCTGAGGCGGA-3',
5'-AGCTTCCGCCTCAGGCCCTCAAAGTCCCCGTAGCCGTCGTTGTTG-3',
5'-GCGTCAAAGAAGGAGC-GGACGTGGAGCTGGTAGATCACC-3',
5'-GCGTCCTTGTACCAGAGGGGGTCCATGGTTTTTCCTCC-3',
y 5'-TGATTTTATTAAAAAAGAATTCA-3' se
mezclaron en cantidades adecuadas y la mezcla se incubó con éxito a
100ºC, 65ºC, 37ºC y 20ºC durante 20 min, respectivamente, para
aparearse con los oligonucleótidos. Un primer ADN recombinante, que
contenía la secuencia de bases de la secuencia Nº 6 y una secuencia
de bases consistente en las bases de las posiciones
1-2.889 de la secuencia Nº 3 en la cual las
guaninas (G) situadas en las posiciones 1-963 se
reemplazaron con adeninas (A), añadiendo para ello el fragmento de
ADN anterior a un ADN dicatenárico de 141 pares de bases que tenía
el extremo cohesivo 5' de 4 bases en cada terminal, que consiste en
la secuencia de bases de la secuencia Nº 6 y las bases de las
posiciones 1-110 de la secuencia Nº 4 en la cual la
guanina (G) situada en la posición 1 de la secuencia Nº 4 se
reemplazó con adenina (A) sin alternar la secuencia de aminoácidos
consistente en los situados en las posiciones 1-36
de la secuencia Nº 3, y se dejó la mezcla reposar a 4ºC toda la
noche en presencia de ADN ligasa T4 para aparearse con el
contenido.
Secuencia Nº
6
AGCTTGAATT CTTTTTTAAT AAAATCAGGA GGAAAAACC
39
El ADN recombinante pBTM22 obtenido con el método
del Experimento 3-2 se escindió con Bam HI,
una enzima de restricción, para obtener el fragmento de ADN que
contiene aproximadamente 2.400 pares de bases que contenía la
secuencia de bases situada entre las posiciones 1.008 a 2.889 de la
secuencia Nº 4 que después se ligó con ``M13tv19 RF DNA'', un vector
fago comercializado por Takara Shuzo Co., Ltd., Tokio, Japón, que
se había escindido con Bam HI para obtener un segundo ADN
recombinante.
Se sintetizó un oligonucleótido que contenía una
secuencia de bases representada por
5'-CGGTAGCCCTGCAGC-CCCGGG-3'
correspondiente a la secuencia de bases de las posiciones 3.438 a
3.458 de la secuencia Nº 5, donde ``timina (T)'', la base situada
en posición 3.448 de la secuencia Nº 5, se reemplazó con ``guanina
(G)'', según el proceso químico habitual. Al usar el
oligonucleótido sintetizado y el ``MUTAN-G'', un
sistema de mutación específico del locus comercializado por Takara
Shuzo Co., Ltd., Tokio, Japón, se obtuvo un tercer ADN
recombinante, que contenía la secuencia de bases situadas en las
bases 1.008 a 2.889 de la secuencia Nº 4 donde ``timina (T)'', es
decir, la base situada en la posición 3.448 de la secuencia Nº 5, se
reemplazó con ``guanina (G)'' sin alternar la secuencia de
aminoácidos de las bases en posiciones 337 a 963 de la secuencia Nº
5 que estaba contenida en el segundo ADN recombinante. El
procedimiento de mutación específica del locus siguió a la fijación
manual al ``MUTAN-G''.
Un fragmento de ADN, que contiene
aproximadamente 1.390 pares de bases teniendo en la secuencia de
bases en posiciones 1 a 1.358 de la secuencia Nº 4 donde ``guanina
(G)'', es decir, la primera base de la secuencia Nº 4, fue
reemplazada con ``adenina (A)'', obtenida por escisión con enzimas
de restricción Eco RI y Bgl II, y un fragmento de ADN que
contiene proximadamente 1.550 pares de bases que contienen la
secuencia de bases en posiciones 1.359 a 2.889 de la secuencia Nº 4
obtenida por escisión del tercer ADN recombinante con enzimas de
restricción Bgl II y Pst I, se ligaron con
``pKK223-3'', un vector plásmido comercializado por
Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Suecia, con ADN ligasa T4
para obtener el ADN recombinante pBTM23 que contenía la secuencia
de bases de la secuencia Nº 4.
El ADN recombinante pBTM23 así obtenido se
introdujo en Escherichia coli LE 392 (ATCC 33572) que
previamente se había preparado en una célula competente de acuerdo
con el método descrito por J. Sambrook en ``Molecular Cloning, A
Laboratory Manual'', 2nd edition, pp. 1.74-1.81
(1989), publicado por Cold Spring Harbor Laboratory Press, New
York, EE.UU., para obtener el presente transformante BTM23 que
contenía el ADN que codifica la presente enzima. El transformante
se cultivó con el método del Experimento 3-2, y las
células proliferadas se recogieron del cultivo resultante y se
lisaron para extraer el ADN recombinante que después se purificó y
analizó, revelando que el ADN recombinante pBTM23 de la Figura 6
consistía aproximadamente en 7.500 pares de bases y contenía el
fragmento de ADN que contenía 2.889 pares de bases que se había
ligado en dirección 3' de Nco I, una enzima de
restricción.
El transformante BTM23 se cultivó de igual modo
que en el Ejemplo A-1, excepto en que se usó un
medio de cultivo líquido (pH 7,0) que contenía un 1% p/v de
maltosa, un 3% p/v de polipeptona, un 1% p/v de ``MEAST PIG'', un
producto de Asahi Breweries, Ltd., Tokio, Japón, un 0,1% p/v de
hidrofosfato sódico dihidrato, 200 \mug/ml de ampicilina sódica y
agua. Al cultivo resultante se añadieron lisozima de albúmina,
comercializada por Seikagaku Kogyo Co., Ltd., Tokio, Japón, y
``TRITON X-100'', un surfactante, hasta obtener
concentraciones respectivas de 0,1 mg/ml y 1 mg/ml, y el resultante
se incubó a 37ºC durante 16 horas con agitación para extraer una
enzima recombinante termoestable de las células. La suspensión se
calentó a 60ºC durante una hora para inactivar las enzimas
concomitantes de Escherichia coli, seguido por centrifugación
de la mezcla para eliminar impurezas y estudio de la actividad de
la enzima en el sobrenadante, revelando que el cultivo L contenía
aproximadamente 120.000 unidades de la enzima recombinante
termoestable. El sobrenadante se purificó con el método del
Experimento 1 para obtener aproximadamente 177 ml de solución
acuosa que contenía aproximadamente 1.400 unidades/ml de la enzima
recombinante termoestable con una actividad específica de
aproximadamente 135 unidades/mg de proteína.
Las propiedades y características de la enzima
purificada se estudiaron con el método del Experimento 2, revelando
que tiene un peso molecular de 100.000-110.000
dalton en electroforesis en gel de poliacrilamida con
dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) y un punto
isoeléctrico de aproximadamente 3,8-4,8 en
isoelectroforesis, y no se inactiva incluso cuando se incuba a 80ºC
durante 60 min en una solución acuosa (pH 7,0). Estas propiedades
fisicoquímicas son sustancialmente iguales que cuando se usa
Thermus aquaticus (ATCC 33923) como microorganismo
donante.
Se suspendió en agua almidón de patata en polvo
para obtener una concentración de 10% p/p, y se ajustó el pH de la
suspensión a 5,5, se mezcló con 2 unidades/g de almidón de
``SPITASE HS'', una muestra de \alpha-amilasa
comercializada por Nagase Biochemicals, Ltd., Kyoto, Japón, y se
calentó a 95ºC para conseguir la gelatinización y licuefacción. A
continuación, la solución licuada resultante se esterilizó en
autoclave a 120ºC durante 20 min para inactivar la enzima residual,
se enfrió rápidamente a 50ºC, se ajustó a un pH 5,0, se mezcló con
500 unidades/g de almidón de una muestra de isoamilasa
comercializada por Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc.,
Okayama, Japón, y 20 unidades/g de almidón de una muestra de
\beta-amilasa comercializada por Nagase
Biochemicals, Ltd., Kyoto, Japón, y se sometió a una reacción
enzimática a 50ºC durante 24 horas para obtener una solución de
sacáridos que contenía aproximadamente un 92% p/p de maltosa,
s.p.s. La solución de sacáridos se calentó a 100ºC durante 20 min
para inactivar la enzima residual, se enfrió a 60ºC, se ajustó a un
pH de 6,5, se mezcló con 1 unidad/g de almidón de la enzima
recombinante obtenida en el Ejemplo A-1, y se
sometió a una reacción enzimática durante 96 horas. La mezcla de
reacción se calentó a 100ºC durante 10 min para inactivar la enzima
residual, se enfrió, se filtró y, de la forma habitual, se decoloró
con un carbón activado, se desalinizó y se desionizó con una resina
de intercambio de iones, y se concentró para obtener un jarabe al
70% p/p con un rendimiento de aproximadamente el 95% en relación con
el almidón utilizado, s.p.s.
El producto contiene aproximadamente un 68% p/p
de trehalosa, s.p.s., y tiene a reducibilidad relativamente baja
debido a que su ED (equivalente a dextrosa) es de 18,4, además de
un dulzor suave, una viscosidad moderada y una capacidad para
retener la humedad, lo que le hacen arbitrariamente útil en varios
compuestos como productos alimenticios, cosméticos y farmacéuticos
como edulcorante, mejorador del sabor, estabilizante, relleno,
adyuvante o excipiente.
La mezcla de reacción obtenida en el Ejemplo
B-1 se ajustó a un pH 5,0, se mezcló con 10
unidades/g de almidón de ``GLUCOZYME'', una muestra de glucoamilasa
comercializada por Nagase Biochemicals, Ltd., Kyoto, Japón, y se
sometió a una reacción enzimática a 50ºC durante 24 horas. La
mezcla de reacción así obtenida se calentó para inactivar la enzima
residual y, de la forma habitual, se decoloró, se desalinizó, se
purificó y se sometió a una cromatografía en columna de intercambio
de iones usando ``XT-1016 (grado de polimerización
del 4%)'', una resina de intercambio de cationes en forma de
Na^{+} comercializada por Tokyo Organic Chemical Industries.,
Ltd., Tokio, Japón, para aumentar el contenido de trehalosa. Más
concretamente, la resina de intercambio de iones, previamente
suspendida en agua, se introdujo en 4 columnas de acero inoxidable
con camisa, con un diámetro interior de la columna de 5,4 cm, y las
columnas se colocaron en cascada en serie para obtener una longitud
total de la columna de 20 m. Se introdujo en las columnas
aproximadamente un 5% v/v de la mezcla de reacción mientras se
mantenía la temperatura interna de las mismas a 60ºC, y se
fraccionó introduciendo en las columnas agua caliente a 60ºC con
una VE (velocidad de espacio) de 0,15, seguido por la recogida de
las fracciones de contenido alto de trehalosa. Las fracciones se
mezclaron y, de la forma habitual, el resultado se concentró, se
secó al vacío y se pulverizó para obtener un polvo de trehalosa con
un rendimiento de aproximadamente el 50% con respecto a la materia
prima, s.p.s.
El producto, que contiene aproximadamente un 97%
p/p trehalosa, s.p.s, y que contiene un polvo con capacidad
reductora relativamente baja y un dulzor suave, se puede usar
arbitrariamente en varios compuestos como productos alimenticios,
cosméticos y farmacéuticos como edulcorante, mejorador del sabor,
estabilizante, relleno, adyuvante o excipiente.
Una fracción de contenido alto de trehalosa
obtenida por el método del Ejemplo B-2, se decoloró
de la forma habitual con un carbón activado, se desalinizó con un
intercambiador de iones y se concentró a una solución de
aproximadamente el 70% p/p. El concentrado se colocó en un
cristalizador y se enfrió gradualmente con agitación para obtener
una pasta con un porcentaje de cristalización de aproximadamente el
45%. La pasta se roció a una presión de aproximadamente 150
kg/cm^{2} desde un inyector situado en la parte superior de la
torre de secado, mientras se soplaba un aire caliente
aproximadamente a 85ºC hacia abajo desde la parte superior de la
torre de secado y se soplaba un aire caliente aproximadamente a
45ºC a través del convector de red de alambre, que estaba situado
en la base de la torre de secado, para obtener un polvo cristalino
recogido por el convector, y el polvo fue recogiéndose gradualmente
a su salida de la torre de secado. A continuación, el polvo
cristalino se transfirió a una torre de envejecimiento y se dejó
reposar durante 10 horas en el chorro de aire caliente para
completar la cristalización y secado. De esta manera, se obtuvo un
polvo cristalino hidro de trehalosa con un rendimiento de
aproximadamente un 90% con respecto a la materia prima, s.p.s.
El producto carece sustancialmente de higroscopia
y es fácilmente manejable, y se puede usar arbitrariamente en
varios compuestos como productos alimenticios, cosméticos y
farmacéuticos como edulcorante, mejorador del sabor, mejorador de la
calidad, estabilizante, relleno, adyuvante o excipiente.
Una fracción de contenido alto de trehalosa,
obtenida según el método del Ejemplo B-2, se
purificó de igual modo que en el Ejemplo B-3, y la
solución resultante se transfirió a un vaso y se dejó hervir a
presión reducida para obtener un jarabe con un contenido de humedad
de aproximadamente el 3,0% p/p. El jarabe se introdujo en un
cristalizador, se mezcló con aproximadamente un 1,0% p/p de
trehalosa cristalina anhidra como cristal de siembra, se cristalizó
a 120ºC con agitación y se transfirió a un vaso de aluminio liso,
seguido por el envejecimiento del contenido a 100ºC durante 6 horas
para formar un bloque. El bloque así obtenido se pulverizó con un
cortador, se secó en un lecho fluidizado para obtener un polvo de
trehalosa cristalina anhidra con un contenido de humedad de
aproximadamente un 0,3% p/p y un rendimiento de aproximadamente el
85% con respecto a la materia prima, s.p.s.
El producto tiene una actividad deshidratante
potente y se puede usar arbitrariamente como secante en productos
alimenticios, cosméticos y farmacéuticos, así como en sus
materiales y productos intermedios, y también se puede usar como
edulcorante en forma de polvo blanco con un dulzor suave en
productos alimenticios, cosméticos y farmacéuticos.
``MALTOSA HHH'', una maltosa de alta pureza
comercializada por Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc.,
Okayama, Japón, se disolvió en agua para obtener una concentración
de 40% p/p, se calentó a 57ºC, se ajustó a un pH de 6,5, se mezcló
con 2 unidades/g de maltosa, s.p.s., de una enzima recombinante
termoestable obtenida con el método del Ejemplo A-2,
seguido por una reacción enzimática durante 48 horas. La mezcla de
reacción se calentó a 100ºC durante 10 min para inactivar la enzima
residual, se enfrió, se filtró, se decoloró con un carbón activado
de la forma habitual, se desalinizó y se purificó con una resina de
intercambio de iones, se secó al vacío y se pulverizó para obtener
un producto en polvo que contenía aproximadamente un 73% p/p de
trehalosa, s.p.s., con un rendimiento de aproximadamente el 90% con
respecto a la maltosa del material, s.p.s.
Aunque el producto tiene una ED (equivalencia con
dextrosa) de 19, que es aproximadamente un 30% de la de la maltosa,
tiene la misma viscosidad que la maltosa e, igualmente, un dulzor
suave y una capacidad adecuada para retener la humedad. Por lo
tanto, el producto se puede usar arbitrariamente como edulcorante,
mejorador de la calidad, estabilizante, relleno, adyuvante y
excipiente en varios compuestos como productos alimenticios,
cosméticos y farmacéuticos.
Como se ha descrito anteriormente, la presente
invención se basa en el hallazgo de una nueva enzima termoestable
que forma trehalosa o maltosa cuando actúa sobre la maltosa o
trehalosa. La presente invención tiene como objetivo explorar una
forma de producir dicha enzima a una escala industrial y con un
rendimiento considerablemente alto utilizando la tecnología de ADN
recombinante. El método de conversión enzimático que usa la
presente enzima recombinante termoestable convierte maltosa en un
compuesto sacárido que contiene trehalosa, glucosa y/o maltosa con
un rendimiento considerablemente alto. Trehalosa tiene un dulzor
suave y de alta calidad y no tiene un residuo reductor en su
molécula, por lo cual puede edulcorar fácilmente productos
alimenticios en general sin miedo a provocar cambios de coloración y
deterioros no satisfactorios. La enzima recombinante que tenga una
secuencia de aminoácidos revelada se puede usar con mayor seguridad
para la preparación de trehalosa, cuyo uso está permitido en los
productos alimenticios.
Por lo tanto, la presente invención es una
invención útil que ejerce la acción y efecto significativos
mencionados anteriormente, a la vez que supone una gran
contribución a este campo.
Claims (31)
1. Una enzima recombinante que es capaz de
convertir maltosa en trehalosa, que no se inactiva sustancialmente
incluso cuando se incuba a una temperatura mayor de 55ºC, y que
tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo
formado por aquellos que no son idénticos a la secuencia Nº 3 sino
variantes de la secuencia Nº 3 en la que uno o más aminoácidos se
borran, añaden o reemplazan con diferentes aminoácidos sin que se
altere la actividad inherente de la enzima que tiene la secuencia de
aminoácidos de la secuencia Nº 3, y en la cual la enzima
recombinante no contiene la secuencia parcial de aminoácido
Ala-Val-X-Tyr, donde
X significa Phe o Ile.
2. Una enzima recombinante de acuerdo con la
reivindicación 1 que tiene las siguientes propiedades
fisicoquímicas:
- (a)
- Acción - formación de trehalosa cuando actúa sobre maltosa, y viceversa;
- (b)
- Peso molecular (PM) - aproximadamente 100.000-110.000 dalton cuando se estudió con isoelectroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE);
- (c)
- Punto isoeléctrico (pI)- aproximadamente 3,8-4,8 cuando se estudió con isoelectroforesis;
- (d)
- Temperatura óptima - aproximadamente 65ºC cuando se incuba a un pH 7,0 durante 60 min;
- (e)
- pH óptimo - aproximadamente 6,0-6,7 cuando se incuba a 60ºC durante 60 min;
- (f)
- Estabilidad térmica - estable hasta una temperatura de aproximadamente 80ºC incluso cuando se incuba a un pH 7,0 durante 60 min; y
- (g)
- Estabilidad de pH - estable hasta un pH de 5,5-9,5 incluso cuando se incuba a 60ºC durante 60 min.
3. Un ADN aislado que codifica una enzima
recombinante que es capaz de convertir maltosa en trehalosa, enzima
que no se inactiva sustancialmente incluso cuando se incuba a una
temperatura mayor de 55ºC, y que tiene una secuencia de aminoácidos
seleccionada entre el grupo formado por la secuencia de aminoácidos
de la secuencia Nº 3 y variantes de la secuencia Nº 3 en que uno o
más aminoácidos de la secuencia Nº 3 se borran, añaden o reemplazan
con diferentes aminoácidos sin que se altere la actividad inherente
de la enzima que tiene la secuencia de aminoácidos de la secuencia
Nº 3.
4. El ADN de la reivindicación 3, que tiene una
secuencia de bases seleccionada entre el grupo formado por la
secuencia de bases Nº 4, las secuencias de bases homólogas a la
misma en que una o más bases de la secuencia Nº 4 se borran, añaden
o reemplazan con bases diferentes sin que se altere la actividad
inherente de la enzima que tiene la secuencia de aminoácidos Nº, y
las secuencias de bases complementarias a estas secuencias de
bases.
5. El ADN de la reivindicación 4, en el cual una
o más bases de la Secuencia Nº 4 se reemplazan con otras bases
mediante la degeneración del código genético sin alterarse la
secuencia de aminoácidos de la secuencia Nº 3.
6. El ADN de la reivindicación 3, que tiene la
secuencia de bases Nº 5.
7. El ADN de cualquiera de las reivindicaciones 3
a 6, que procede de un microorganismo del género Thermus.
8. Un ADN recombinante replicable que contiene un
vector autorreplicable y un ADN según se define en cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 7.
9. El ADN recombinante replicable de la
reivindicación 8, en el cual el ADN contiene una secuencia de bases
seleccionada entre el grupo formado por la secuencia de bases Nº 4,
en las secuencias de bases homólogas a la misma en que una o más
bases de la secuencia Nº 4 se borran, añaden o reemplazan con bases
diferentes sin que se altere la actividad inherente de la enzima [-]
y las secuencias de bases complementarias a estas secuencias de
bases.
10. El ADN recombinante replicable de la
reivindicación 9, en el cual el ADN que codifica la enzima se
obtiene reemplazando una o más bases de la secuencia Nº 4 con otras
bases mediante la degeneración del código genético sin que se
altere la secuencia de aminoácidos de la secuencia Nº 3.
11. El ADN recombinante replicable de la
reivindicación 8, en el cual el ADN que codifica la enzima tiene la
secuencia de bases Nº 5.
\newpage
12. El ADN recombinante replicable de cualquiera
de las reivindicaciones 8 a 11, en el cual el ADN que codifica la
enzima procede de un microorganismo del género Thermus.
13. El ADN recombinante replicable de cualquiera
de las reivindicaciones 8 a 12, en el cual el vector autorreplicable
es el vector plásmido Bluescript II SK(+) o
pKK223-3.
14. Un transformante que se prepara por la
introducción en una célula huésped apropiada del ADN recombinante
replicable que contiene un ADN según se define en cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 7 y un vector autorreplicable.
15. El transformante de la reivindicación 14, en
el cual el ADN tiene una secuencia de bases seleccionada entre el
grupo formado por la secuencia de bases Nº 4, las secuencias de
bases homólogas a la misma en que una o más bases de la secuencia
Nº 4 se borran, añaden o reemplazan con bases diferentes sin que se
altere la actividad inherente de la enzima [-] y las secuencias de
bases complementarias a estas secuencias de bases.
16. El transformante de la reivindicación 15, en
el cual dicho ADN se obtiene reemplazando una o más bases en la
secuencia de bases de la secuencia Nº 4 con otras bases mediante la
degeneración del código genético sin que se altere la secuencia de
aminoácidos de la secuencia Nº 3.
17. El transformante de la reivindicación 14, en
el cual el ADN tiene la secuencia de bases Nº 5.
18. El transformante de cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 17, en el cual el ADN procede de un
microorganismo del género Thermus.
19. El transformante de cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 18, en el cual dicho vector autorreplicable
es el vector plásmido Bluescript II SK(+) o
pKK223-3.
20. El transformante de cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 19, en el cual dicho huésped es un
microorganismo de la especie Escherichia coli.
21. Un proceso de preparación de una enzima
recombinante, que consiste en:
el cultivo de un transformante, preparado por la
introducción en una célula huésped apropiada de un ADN recombinante
que contenía tanto un vector autorreplicable como el ADN según se
define en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, en un medio de
cultivo con nutrientes para formar la enzima;
y la recogida de la enzima formada en el cultivo
resultante.
22. El proceso de la reivindicación 21, en el
cual el ADN que codifica la enzima tiene la secuencia de bases Nº
4, las secuencias de bases homólogas a la misma en que una o más
bases de la secuencia Nº 4 se borran, añaden o reemplazan con bases
diferentes sin que se altere la actividad inherente de la enzima
[-], y las secuencias de bases complementarias a estas secuencias
de bases.
23. El proceso de la reivindicación 22, en el
cual dicho ADN se obtiene reemplazando una o más bases en la
secuencia de bases de la secuencia Nº 4 con otras bases mediante la
degeneración del código genético sin alterar la secuencia de
aminoácidos de la secuencia Nº [-]3.
24. El proceso de la reivindicación 21, en el
cual el ADN tiene la secuencia de bases secuencia Nº 5.
25. El proceso de una cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 24, en el cual el ADN procede de un
microorganismo del género Thermus.
26. El proceso de una cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 25, en el cual dicho vector autorreplicable
es el vector plásmido Bluescript II SK(+) o
pKK223-3.
27. El proceso de una cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 26, en el cual dicho huésped es un
microorganismo de la especie Escherichia coli.
28. El proceso de una cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 27, en el cual la enzima recombinante formada
en el medio de cultivo con nutrientes se recupera por
centrifugación, filtración, concentración, desalinización, diálisis,
sedimentación separadora, cromatografía por intercambio de iones,
cromatografía por filtración en gel, cromatografía hidrofóbica,
cromatografía de afinidad, electroforesis en gel y/o
isoelectroforesis.
29. Un método de conversión enzimática de
maltosa, que consiste en un paso que permite que la enzima
recombinante de la reivindicación 1 actúe sobre la maltosa para
formar trehalosa.
\newpage
30. El método de la reivindicación 29, en el cual
el paso consiste en unir una cantidad eficaz de la enzima
recombinante en un medio acuoso que contenía maltosa hasta un 50%
p/p, y someter la mezcla resultante a una reacción enzimática a una
temperatura mayor de 55ºC y a un pH de 5-10.
31. El método de la reivindicación 30, en el cual
la mezcla de reacción resultante contiene al menos aproximadamente
un 50% p/p de trehalosa, en relación con el producto seco.
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