ES2303132T3 - Preparaciones homogeneas de il-29. - Google Patents
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Abstract
Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC. ID. N.º 27, 29, 40, 41, 83, 85, 87, 89, 95, 97, 103, 105, 111, 113, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 y 161.
Description
Preparaciones homogéneas de
IL-29.
Las citocinas desempeñan una función importante
en la regulación de la hematopoyesis y las respuestas inmunitarias,
y pueden influir en el desarrollo de linfocitos. La familia de
citocinas humanas de clase II incluye los subtipos del
interferón-\alpha (IFN-\alpha),
interferón-\beta (IFN-\beta),
interferón-\gamma (IFN-\gamma),
IL-10, IL-19 (Patente de EE. UU.
5,985,614), MDA-7 (Jiang et al.,
Oncogene 11, 2477-2486, (1995)),
IL-20 (Jiang et al., Oncogene
11, 2477-2486, (1995)), IL-22
(Xie et al., J. Biol. Chem. 275,
31335-31339, (2000)) y AK-155
(Knappe et al., J. Virol. 74,
3881-3887, (2000)). La mayoría de las citocinas se
unen a las señales y las transducen a través de los receptores de
citocinas de Clase I o Clase II. Los miembros de la familia de
receptores de citocinas humanas de clase II incluyen:
interferón-\alphaR1
(IFN-\alphaR1),
interferón-\gamma-R2
(IFN-\gamma-R2),
interferón-\gamma R1 (IFN-\gamma
R1), interferón-\gammaR2
(IFN-\gammaR2), IL-10R (Liu et
al., J. Immunol. 152, 1821-1829,
(1994)), CRF2-4 (Lutfalla et al.
Genomics 16, 366-373, (1993)),
IL-20R\beta (Blumberg et al., Cell
104, 9-19, (2001)) (también conocido como
zcytor7 (Patente de EE. UU. 5,945,511) y CRF2-8
(Kotenko et al., Oncogene 19,
2557-2565, (2000)), IL-20R\beta
(Blumberg et al., ibid, (2001)) (también conocido como
DIRS1 (Tratado de Cooperación en Materia de Patentes (Patent
Cooperation Treaty, PCT) WO 99/46379)), IL-22RA1
(receptor-\alpha1 de la IL-22,
presentado ante la HUGO para su aprobación) (también conocido como
IL-22R (Xie et al., J. Biol. Chem.
275, 31335-31339, (2000)), zcytor11 (Patente
de EE. UU. 5,965,704) y CRF2-9 (Kotenko et
al., Oncogene 19, 2557-2565,
(2000)), y factor tisular.
Habitualmente, los receptores de citocinas de
clase II son heterodímeros compuestos por dos cadenas distintas de
receptores, las subunidades de receptores \alpha y \beta (Stahl
et al., Cell 74, 587-590,
(1993)). En general, las subunidades \alpha son las principales
proteínas de unión a citocinas, y las subunidades \beta son
necesarias para la formación de sitios de unión de alta afinidad,
así como para la transducción de las señales. Una excepción es el
receptor de la IL-20, en el que ambas subunidades
son necesarias para la unión de la IL-20 (Blumberg
et al., ibid, (2001)).
Los receptores de citocinas de clase II son
identificados por un dominio de unión a citocinas conservado de
aproximadamente 200 aminoácidos (D200) en la porción extracelular
del receptor. Este dominio de unión a citocinas está formado por
dos dominios de fibronectina tipo III (FnIII) de aproximadamente 100
aminoácidos cada uno (Bazan J.F. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
87, 6934-6938, (1990); Thoreau et al.,
FEBS Lett. 282, 16-31, (1991)). Cada
dominio de FnIII contiene residuos de Cys, Pro y Trp conservados,
que determinan un patrón de plegamiento característico de siete
cadenas \beta similar al dominio constante de las inmunoglobulinas
(Uze et al., J. Interferon Cytokine Res. 15,
3-26, (1995)). Los elementos estructurales
conservados de la familia de receptores de citocinas de clase II
posibilitan la identificación de nuevos miembros de esta familia en
función de la homología de las secuencias de aminoácidos
primarias.
Las interleucinas son una familia de citocinas
que median las respuestas inmunitarias, incluida la inflamación. La
célula T es fundamental para la respuesta inmunitaria, ya que
produce muchas citocinas e inmunidad adaptativa a los antígenos.
Las citocinas producidas por la célula T se han clasificado en tipo
1 y tipo 2 (Kelso, A. Immun. Cell Biol.
76:300-317, 1998). Las citocinas tipo 1
incluyen: IL-2, interferón gamma
(IFN-\gamma) y LT-\alpha, y
participan en las respuestas inflamatorias, la inmunidad a los
virus, la inmunidad a los parásitos intracelulares y el rechazo de
aloinjertos. Las citocinas tipo 2 incluyen: IL-4,
IL-5, IL-6, IL-10 e
IL-13, y participan en las respuestas humorales, la
inmunidad a los helmintos y la respuesta alérgica. Las citocinas
que pertenecen tanto al Tipo 1 como al Tipo 2 incluyen:
IL-3, GM-CSF y
TNF-\alpha. Existen evidencias que sugieren que
el Tipo 1 y el Tipo 2 que producen poblaciones de células T migran
preferentemente a diferentes tipos de tejido inflamado.
Desde el punto de vista terapéutico, resultan de
particular interés los interferones (pueden encontrarse revisiones
sobre los interferones en la publicación de De Maeyer y De
Maeyer-Guignard, "Interferons", en The
Cytokine Handbook, 3.a edición, Thompson (ed.), páginas
491-516 (Academic Press Ltd. 1998), y la publicación
de Walsh, Biopharmaceuticals: Biochemistry and
Biotechnology, páginas 158-188 (John Wiley &
Sons 1998)). Los interferones exhiben diversas actividades
biológicas, y son útiles para el tratamiento de determinadas
enfermedades autoinmunitarias y ciertos tipos de cáncer, y el
fortalecimiento de la respuesta inmunitaria contra los agentes
infecciosos, incluidos los virus, las bacterias, los hongos y los
protozoos. Hasta la fecha, se han identificado seis formas de
interferón, que se han clasificado en dos grupos principales. Los
llamados IFN "tipo I" incluyen IFN-\alpha,
IFN-\beta, IFN-\omega,
IFN-\delta e interferón-\tau.
Actualmente, el IFN-\gamma y una subclase del
IFN-\alpha son los únicos IFN tipo II.
Los IFN tipo I, que se cree derivan del mismo
gen ancestral, han conservado una estructura lo suficientemente
similar para actuar mediante el mismo receptor de superficie
celular. La cadena- \alpha del receptor del
IFN-\alpha/\beta humano comprende un dominio N
terminal extracelular que tiene las características de un receptor
de citocinas de clase II. El IFN-\gamma no
comparte una homología significativa con los IFN tipo I ni con el
subtipo de IFN-\alpha tipo II, pero comparte
diversas actividades biológicas con los IFN tipo I.
Los médicos clínicos están aprovechando las
múltiples actividades de los interferones mediante el uso de las
proteínas para el tratamiento de una amplia variedad de afecciones.
Por ejemplo, una forma de IFN-\alpha ha sido
aprobada para su uso en más de 50 países, para el tratamiento de
afecciones médicas como la tricoleucemia, el carcinoma de células
renales, el carcinoma de células basales, el melanoma maligno, el
sarcoma de Kaposi relacionado con el SIDA, el mieloma múltiple, la
leucemia mielógena crónica, el linfoma no Hodgkin, la papilomatosis
laríngea, la micosis fungoide, el condiloma acuminado, la hepatitis
B crónica, la hepatitis C, la hepatitis D crónica y la hepatitis no
A, no B/C crónica. La Administración de Alimentos y Fármacos de EE.
UU. ha aprobado el uso del IFN-\beta para el
tratamiento de la esclerosis múltiple, una enfermedad crónica del
sistema nervioso. El IFN-\gamma se utiliza para
tratar las enfermedades granulomatosas crónicas, en las que el
interferón potencia la respuesta inmunitaria del paciente para
destruir los patógenos bacterianos, fúngicos y protozoarios
infecciosos. Los estudios clínicos también indican que el
IFN-\gamma puede ser útil para el tratamiento del
SIDA, la leishmaniasis y la lepra lepromatosa.
La IL-28A,
IL-28B e IL-29 comprenden una nueva
familia de proteínas descubierta recientemente, que tienen
homología de secuencias con los interferones del tipo I y homología
genómica con la IL-10. Esta nueva familia está
descrita en su totalidad en la solicitud de patente de propiedad
común en virtud del PCT WO 02/086087 y en Sheppard et al.,
Nature Immunol. 4:63-68, 2003; ambos
incorporados en la presente por referencia. Funcionalmente, la
IL-28 y la IL-29 se asemejan a los
IFN tipo I por su capacidad para inducir un estado antiviral en las
células, pero, a diferencia de los IFN tipo I, no muestran actividad
antiproliferativa contra ciertas líneas de células B.
Se sabe que la IL-28 y la
IL-29 tienen una cantidad impar de cisteínas
(solicitud de patente en virtud del PCT WO 02/086087 y Sheppard
et al., supra). La expresión de la
IL-28 y la IL-29 recombinantes puede
tener como consecuencia una mezcla heterogénea de proteínas
compuestas de uniones disulfuro intramoleculares en múltiples
conformaciones. La separación de estas formas puede ser difícil y
complicada. Por ende, resulta deseable proporcionar moléculas de
IL-28 e IL-29 que tengan un único
patrón de uniones disulfuro intramoleculares al expresarse y
métodos para replegar y purificar estas preparaciones para mantener
la homogeneidad.
La US 5,206,344 describe las muteínas de la
interleucina-2 y conjugaciones poliméricas de
estas.
Luxon et al., Clinical Therapeutics, Vol.
24, N.º 9, páginas 1363-1383, 1.º de septiembre de
2002, describe los interferones pegilados para el tratamiento de la
infección crónica por hepatitis C.
Koslowski et al., J. Controlled Release,
Vol. 72, N.º 1-3, páginas 217-224,
14 de mayo de 2001, describe las mejoras en la pegilación de
proteínas.
Rajarathnam et al., Biochemistry, Vol.
38, N.º 24, páginas 7653-7658, 15 de junio de 1999,
describe los puentes disulfuro en la
interleucina-8.
La WO 02/086087 describe la familia de proteínas
citocinas de las proteínas zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y
zcyto25.
Sheppard et al., Nature Immunology, Vol.
4, N.º 1, páginas 63-68, enero de 2003, describe la
IL-28, la IL-29 y su receptor de
citocina de Clase II, el IL-28R.
Francis et al., Int. J of Haematology,
Vol. 68, N.º. 1, páginas 1-18, describen la
importancia de la optimización biológica de las técnicas de
acoplamiento.
La presente invención contempla composiciones y
métodos para producir preparaciones de IL-29
homogéneas.
Más detalladamente, la presente invención
proporciona un polipéptido aislado que comprende una secuencia de
aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC. ID. N.º
27, 29, 40, 41, 83, 85, 87, 89, 95, 97, 103, 105, 111, 113, 139,
141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 y 161.
La presente invención también proporciona un
polinucleótido aislado que codifica un polipéptido, donde el
polipéptido codificado comprende una secuencia de aminoácidos
seleccionada del grupo que consiste en las SEC. ID. N.º 27, 29, 40,
41, 83, 85, 87, 89, 95, 97, 103, 105, 111, 113, 139, 141, 143, 145,
147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 y 161.
En la siguiente descripción, se utiliza con
frecuencia una serie de términos. Se proporcionan las siguientes
definiciones para facilitar la comprensión de la invención.
A menos que se especifique lo contrario,
"un" "una", "el", "la", "al menos un" y
"al menos una" se usan de manera indistinta y significan uno o
más de uno.
El término "etiqueta de afinidad" se
utiliza en la presente para denotar un segmento de un polipéptido
que se puede unir a un segundo polipéptido para permitir la
purificación o detección del segundo polipéptido o brindar sitios
para la unión del segundo polipéptido a un sustrato. En principio,
cualquier péptido o proteína para los cuales haya disponibles un
anticuerpo u otro agente de unión específico, se puede utilizar como
etiqueta de afinidad. Las etiquetas de afinidad incluyen un tracto
de polihistidina, la proteína A (Nilsson et al., EMBO
J. 4:1075, 1985; Nilsson et al., Methods
Enzymol. 198:3, 1991), glutatión S transferasa (Smith y
Johnson, Gene 67:31, 1988), etiqueta de afinidad
Glu-Glu (Grussenmeyer et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 82:7952-4, 1985),
sustancia P, péptido Flag^{TM} (Hopp et al.,
Biotechnology 6:1204-10, 1988),
péptido de unión a la estreptavidina u otro epítopo antigénico o
dominio de unión. Véase, en general, Ford et al., Protein
Expression and Purification 2: 95-107,
1991. Los ADN que codifican etiquetas de afinidad se pueden
adquirir a través de proveedores comerciales (p. ej. Pharmacia
Biotech, Piscataway, NJ).
El término "variante alélica" se utiliza en
la presente para denotar cualquiera de dos o más formas alternativas
de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación
alélica surge de manera natural a través de la mutación y puede
tener como consecuencia el polimorfismo fenotípico dentro de las
poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (sin
cambios en el polipéptido codificado) o pueden codificar
polipéptidos con una secuencia de aminoácidos alterada. El término
variante alélica también se usa en la presente para denotar una
proteína codificada por una variante alélica de un gen.
Los términos "amino terminal" y
"carboxilo terminal" se utilizan en la presente para denotar
posiciones dentro de los polipéptidos. Donde el contexto lo
permite, dichos términos se usan con referencia a una secuencia o
porción en particular de un polipéptido para denotar proximidad o
posición relativa. Por ejemplo, una determinada secuencia en
posición carboxilo terminal con respecto a una secuencia de
referencia dentro de un polipéptido está ubicada en posición
proximal al carboxilo terminal de la secuencia de referencia, pero
no necesariamente se encuentra en el carboxilo terminal del
polipéptido completo.
El término "par de
complemento/anticomplemento" denota fracciones no idénticas que
forman un par estable asociado en forma no covalente en las
condiciones adecuadas. Por ejemplo, la biotina y la avidina (o
estreptavidina) son miembros prototípicos de un par de
complemento/anticomplemento. Otros ejemplos de pares de
complemento/anticomplemento incluyen pares de receptor/ligando,
pares de anticuerpo/antígeno (o hapteno o epítopo), pares de
polinucleótidos codificantes/no codificantes y similares. Donde la
posterior disociación del par de complemento/anticomplemento
resulta deseable, el par de complemento/anticomplemento
preferentemente tiene una afinidad de unión de <10^{9}
M^{-1}.
El término "secuencia de nucleótidos
degenerada" denota una secuencia de nucleótidos que incluye uno o
más codones degenerados (en comparación con una molécula de
polinucleótido de referencia que codifica un polipéptido). Los
codones degenerados contienen diferentes tripletes de nucleótidos,
pero codifican el mismo residuo de aminoácidos (es decir, tanto el
triplete GAU como el GAC codifican Asp).
El término "vector de expresión" se utiliza
para denotar una molécula de ADN, lineal o circular, que comprende
un segmento que codifica un polipéptido de interés ligado
operablemente a segmentos adicionales que permiten su
transcripción. Dichos segmentos adicionales incluyen secuencias de
promotores y terminadores, y también pueden incluir uno o más
orígenes de replicación, uno o más marcadores seleccionables, un
potenciador, una señal de poliadenilación, etc. Generalmente, los
vectores de expresión provienen de ADN plasmídico o viral, o pueden
contener elementos de ambos.
El término "aislado", cuando se aplica a un
polinucleótido, denota que el polinucleótido ha sido extraído de su
medio genético natural y, por lo tanto, no contiene otras secuencias
codificantes extrañas o indeseadas, y está en una forma adecuada
para su uso dentro de sistemas de producción de proteínas mediante
genomanipulación. Dichas moléculas aisladas son aquellas separadas
de su medio natural, e incluyen los clones de ADNc y genómicos. Las
moléculas de ADN aisladas de la presente invención no contienen
otros genes con los que se las asocia comúnmente, pero pueden
incluir las regiones naturales 5' y 3' no traducidas, como los
promotores y los terminadores. La identificación de las regiones
asociadas será evidente para una persona con conocimientos generales
de la materia (véase, por ejemplo, Dynan y Tijan, Nature
316:774-78, 1985).
Un polipéptido o proteína "aislado" es un
polipéptido o una proteína que se encuentra en una condición
distinta de su entorno original, como por ejemplo, separado de la
sangre y el tejido animal. En una forma preferida, el polipéptido
aislado no contiene sustancialmente otros polipéptidos, en
particular otros polipéptidos de origen animal. Se prefiere
proporcionar los polipéptidos en una forma altamente purificada, es
decir, con una pureza mayor del 95%; más preferentemente, mayor del
99%. Al usarlo en este contexto, el término "aislado" no
excluye la presencia del mismo poli-
péptido en formas físicas alternativas, tales como dímeros o, como alternativa, en formas glucosiladas o derivatizadas.
péptido en formas físicas alternativas, tales como dímeros o, como alternativa, en formas glucosiladas o derivatizadas.
El término "nivel" cuando se refiere a
células inmunitarias, tales como las células NK, las células T, en
particular las células T citotóxicas, las células B y similares, un
aumento en el nivel significa una mayor cantidad de células o una
mejor actividad de la función celular.
El término "nivel" cuando se refiere a las
infecciones virales, hace referencia a un cambio en el nivel de
infección viral e incluye, a modo de ejemplo, un cambio en el nivel
de CTL o células NK (según se las describió anteriormente), una
disminución en la carga viral, un aumento en el título de anticuerpo
antiviral, una disminución en los niveles serológicos de alanina
aminotransferasa, o una mejoría, determinada por examen histológico,
de un órgano o tejido diana. La determinación de si estos cambios
de nivel constituyen diferencias o cambios significativos se
encuentran dentro de las habilidades de los especialistas en la
materia.
El término "ligados operablemente", al
referirse a los segmentos de ADN, indica que los segmentos están
distribuidos de modo tal que funcionan en forma conjunta para
alcanzar sus fines, p. ej. la transcripción se inicia en el
promotor y avanza por el segmento codificante hasta el
terminador.
El término "ortólogo" denota un polipéptido
o una proteína obtenidos de una especie que es la contraparte
funcional de un polipéptido o una proteína de una especie diferente.
Las diferencias de secuencias entre los ortólogos son el resultado
de la especiación.
Los "parálogos" son proteínas diferentes
pero estructuralmente relacionadas producidas por un organismo. Se
cree que los parálogos surgen por duplicación génica. Por ejemplo,
la \alpha-globina, la
\beta-globina y la mioglobina son parálogos entre
sí.
Un "polinucleótido" es un polímero
monocatenario o bicatenario de bases de desoxirribonucleótidos o
ribonucleótidos leídas desde el extremo 5' hasta el 3'. Los
polinucleótidos incluyen ARN y ADN, y pueden aislarse de fuentes
naturales, sintetizarse in vitro o prepararse a partir de una
combinación de moléculas naturales y sintéticas. Los tamaños de los
polinucleótidos se expresan como pares de bases (cuya abreviatura es
"pb"), nucleótidos ("nt") o kilobases ("kb"). Cuando
el contexto lo permita, los últimos dos términos pueden describir
polinucleótidos que son monocatenarios o bicatenarios. Cuando el
término se aplica a moléculas bicatenarias, se utiliza para denotar
la longitud total y se entenderá que es equivalente al término
"pares de bases". Los especialistas en la materia reconocerán
que las dos cadenas de un polinucleótido bicatenario pueden diferir
levemente en cuanto a su longitud, y que sus extremos pueden estar
escalonados como resultado de una segmentación enzimática; por
ende, todos los nucleótidos dentro de una molécula de polinucleótido
bicatenaria pueden no estar apareados.
Un "polipéptido" es un polímero de residuos
de aminoácidos unidos por uniones peptídicas, sea producido en
forma natural o sintética. Los polipéptidos de menos de alrededor de
10 residuos de aminoácidos se conocen comúnmente como
"péptidos".
El término "promotor" se utiliza en la
presente por su significado reconocido en la especialidad para
denotar una porción de un gen que contiene secuencias de ADN que
permiten la unión de la ARN polimerasa y el inicio de la
transcripción. Comúnmente, pero no siempre, las secuencias de
promotores se encuentran en las regiones no codificantes 5' de los
genes.
Una "proteína" es una macromolécula que
comprende una o más cadenas de polipéptidos. Una proteína también
puede comprender componentes no peptídicos, tales como grupos
carbohidrato. Los carbohidratos y otros sustituyentes no peptídicos
pueden ser agregados a una proteína por la célula en la cual se
produce dicha proteína y varían según el tipo de célula. Las
proteínas se definen en la presente en función de la estructura de
sus esqueletos de aminoácidos; en general, los sustituyentes tales
como los grupos carbohidrato no se especifican, aunque pueden
estar
presentes.
presentes.
El término "receptor" denota una proteína
asociada a una célula que se une a una molécula bioactiva (es decir,
un ligando) y media el efecto del ligando en la célula. Los
receptores unidos a la membrana se caracterizan por una estructura
de múltiples péptidos que comprende un dominio extracelular de unión
a ligandos y un dominio efector intracelular que habitualmente
participa en la transducción de las señales. La unión del ligando al
receptor tiene por consecuencia un cambio en la conformación del
receptor que provoca una interacción entre el dominio efector y las
demás moléculas de la célula. Esta interacción, a su vez, lleva a
una alteración del metabolismo de la célula. Los eventos
metabólicos que se vinculan con las interacciones
receptor-ligando incluyen transcripción génica,
fosforilación, desfosforilación, aumentos en la producción de
monofosfato de adenosina (adenosine monophosphate, AMP) cíclico,
movilización del calcio celular, movilización de los lípidos de
membrana, adhesión celular, hidrólisis de lípidos de inositol e
hidrólisis de fosfolípidos. En general, los receptores pueden estar
unidos a la membrana, ser citosólicos o nucleares; monoméricos (p.
ej. receptor de la hormona estimuladora de la tiroides, receptor
adrenérgico beta) o multiméricos (p. ej. receptor del factor de
crecimiento derivado de las plaquetas
(platelet-derived growth factor, PDGF), receptor de
la hormona de crecimiento, receptor de la IL-3,
receptor del factor estimulante de colonias de
granulocitos-macrófagos (granulocyte macrophage
colony stimulating factor, GM-CSF), receptor del
factor estimulante de colonias de granulocitos (granulocyte colony
stimulating factor, G-CSF), receptor de la
eritropoyetina y receptor de la
IL-6).
IL-6).
El término "secuencia señal de secreción"
denota una secuencia de ADN que codifica un polipéptido (un
"péptido de secreción") que, como componente de un polipéptido
mayor, dirige al polipéptido mayor a través de una vía de secreción
de una célula en la que es sintetizado. Comúnmente, el polipéptido
mayor es segmentado para eliminar el péptido de secreción durante
el tránsito por la vía de secreción.
El término "variante de empalme" se usa en
la presente para denotar formas alternativas de ARN transcrito de
un gen. La variación por empalme surge naturalmente a través del uso
de sitios de empalme alternativos dentro de una molécula de ARN
transcrita o, menos comúnmente, entre moléculas de ARN transcritas
por separado, y puede tener como consecuencia varios ARNm
transcritos del mismo gen. Las variantes de empalme pueden codificar
polipéptidos con una secuencia de aminoácidos alterada. El término
variante de empalme también se usa en la presente para denotar una
proteína codificada por una variante de empalme de un ARNm
transcrito de un gen.
Se entenderá que los pesos moleculares y las
longitudes de los polímeros determinados mediante métodos analíticos
imprecisos (p. ej. electroforesis en gel) son valores aproximados.
Cuando uno de dichos valores se expresa como "alrededor de" X
o "aproximadamente" X, se entenderá que el valor X expresado
tiene una exactitud de
\pm10%.
\pm10%.
"zcyto20", "zcyto21", "zcyto22"
son las denominaciones anteriores de la IL-28A
humana, la IL-29 humana y la IL-28B
humana, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y de
aminoácidos de la IL-28A se muestran en la SEC. ID.
N.º 1 y en la SEC. ID. N.º 2, respectivamente. Las secuencias de
nucleótidos y de aminoácidos de la IL-29 se
muestran en la SEC. ID. N.º 3 y en la SEC. ID. N.º 4,
respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de
la IL-28B se muestran en la SEC. ID. N.º 5 y en la
SEC. ID. N.º 6, respectivamente. Estas secuencias se encuentran
descritas en su totalidad en la solicitud de patente en virtud del
PCT WO 02/086087 comúnmente cedida a ZymoGenetics, Inc.
"zcyto24" y "zcyto25" son las
denominaciones anteriores de la IL-28 de ratón, y se
muestran en las SEC. ID. N.º 7, 8, 9 y 10, respectivamente. El
polinucleótido y los polipéptidos se encuentran descritos en su
totalidad en la solicitud de patente en virtud del PCT WO 02/086087
comúnmente cedida a ZymoGenetics, Inc.
"zcytor19" es la denominación anterior de
la subunidad \alpha del receptor de la IL-28, como
se muestra en la SEC. ID. N.º 11. Los polinucleótidos y
polipéptidos se encuentran descritos en la solicitud de patente en
virtud del PCT WO 02/20569 a nombre de Schering, Inc., y en la WO
02/44209 cedida a ZymoGenetics, Inc. "Receptor de la
IL-28" denota la subunidad \alpha y la
subunidad CRF2-4 de la IL-28 que
forman un receptor heterodimérico.
La presente invención proporciona moléculas de
polinucleótidos, incluidas moléculas de ADN y ARN, que codifican
mutantes cisteína de la IL-29 que tienen como
consecuencia la expresión de una preparación de
IL-29 recombinante que es una preparación
homogénea. A los fines de la presente invención, una preparación
homogénea de IL-29 es una preparación que
comprende, al menos, 98% de un patrón único de uniones disulfuro
intramoleculares en el polipéptido purificado. En otras
aplicaciones, la conformación disulfuro única en una preparación de
polipéptido purificado es homogénea al 99%. Por lo general, estos
mutantes cisteína mantienen cierta actividad biológica de la
IL-29 silvestre, tal como se describe en la
presente. Por lo general, un ligando que se une a su receptor
cognado es específico cuando los K_{D} están dentro del rango de
entre 100 nM y 100 pM. La unión específica dentro del rango de
entre 100 mM y 10 nM K_{D} es unión de baja afinidad. La unión
específica en el rango de entre 2,5 pM y 100 pM K_{D} es unión de
alta afinidad. En otro ejemplo, la actividad biológica de los
mutantes cisteína de la IL-29 está presente cuando
las moléculas son capaces de algún nivel de actividad antiviral
asociada con la IL-28 o la IL-29
silvestres. La determinación del nivel de actividad antiviral se
describe en detalle en la
presente.
presente.
Al referirse a la IL-28, el
término significará tanto la IL-28A como la
IL-28B. Anteriormente, la IL-28A se
denominó zcyto20 (SEC. ID. N.º 1 y 2), la IL-29 se
denominó zcyto21 (SEC. ID. N.º 3 y 4) y la IL-28B se
denominó zcyto22 (SEC. ID. N.º 5 y 6). (Véase, solicitud de patente
en virtud del PCT WO 02/086087 y Sheppard et al.,
supra). Los ortólogos de ratón para la IL-28
anteriormente se denominaron zcyto24 (SEC. ID. N.º 7 y 8) y zcyto25
(SEC. ID. N.º 9 y 10).
El gen de la IL-28A silvestre
codifica un polipéptido de 200 aminoácidos, como se muestra en la
SEC. ID. N.º 2. Puede predecirse que la secuencia señal de la
IL-28A comprende los residuos de aminoácidos -25
(Met) a -1 (Ala) de la SEC. ID. N.º 2. El péptido maduro para la
IL-28A comienza en el residuo de aminoácidos 1 (Val)
de la SEC. ID. N.º 2. Se predice que las hélices de la
IL-28A serán las siguientes: la hélice A está
definida por los residuos de aminoácidos 31 (Ala) a 45 (Leu); la
hélice B por los residuos de aminoácidos 58 (Thr) a 65 (Gln); la
hélice C por los residuos de aminoácidos 69 (Arg) a 86 (Ala); la
hélice D por los residuos de aminoácidos 95 (Val) a 114 (Ala); la
hélice E por los residuos de aminoácidos 126 (Thr) a 142 (Lys); y
la hélice F por los residuos de aminoácidos 148 (Cys) a 169 (Ala);
como se muestra en la SEC. ID. N.º 2.
El gen de la IL-29 silvestre
codifica un polipéptido de 200 aminoácidos, como se muestra en la
SEC. ID. N.º 4. Puede predecirse que la secuencia señal de la
IL-29 comprende los residuos de aminoácidos -19
(Met) a -1 (Ala) de la SEC. ID. N.º 4, SEC. ID. N.º 119 o SEC. ID.
N.º 121. El péptido maduro para la IL-29 comienza
en el residuo de aminoácidos 1 (Gly) de la SEC. ID. N.º 4. La
IL-29 ha sido descrita en la solicitud de patente
en virtud del PCT WO 02/02627. Se predice que las hélices de la
IL-29 serán las siguientes: la hélice A está
definida por los residuos de aminoácidos 30 (Ser) a 44 (Leu); la
hélice B por los residuos de aminoácidos 57 (Asn) a 65 (Val); la
hélice C por los residuos de aminoácidos 70 (Val) a 85 (Ala); la
hélice D por los residuos de aminoácidos 92 (Glu) a 111 (Gln); la
hélice E por los residuos de aminoácidos 118 (Thr) a 139 (Lys); y
la hélice F por los residuos de aminoácidos 144 (Gly) a 170 (Leu);
como se muestra en la SEC. ID. N.º 4.
El gen de la IL-28B silvestre
codifica un polipéptido de 200 aminoácidos, como se muestra en la
SEC. ID. N.º 6. Puede predecirse que la secuencia señal de la
IL-28B comprende los residuos de aminoácidos -21
(Met) a -1 (Ala) de la SEC. ID. N.º 6. El péptido maduro para la
IL-28B comienza en el residuo de aminoácidos 1 (Val)
de la SEC. ID. N.º 6. Se predice que las hélices de la
IL-28B serán las siguientes: la hélice A está
definida por los residuos de aminoácidos 31 (Ala) a 45 (Leu); la
hélice B por los residuos de aminoácidos 58 (Thr) a 65 (Gln); la
hélice C por los residuos de aminoácidos 69 (Arg) a 86 (Ala); la
hélice D por los residuos de aminoácidos 95 (Gly) a 114 (Ala); la
hélice E por los residuos de aminoácidos 126 (Thr) a 142 (Lys); y
la hélice F por los residuos de aminoácidos 148 (Cys) a 169 (Ala);
como se muestra en la SEC. ID. N.º 6.
La presente invención proporciona mutaciones en
las secuencias de la IL-29 silvestre como se muestra
en las SEC. ID. N.º 3 y 4, que tienen como consecuencia la
expresión de formas únicas de la molécula de IL-29.
Debido a que se considera que la heterogeneidad de las formas es el
resultado de múltiples patrones de uniones disulfuro
intramoleculares, las aplicaciones específicas de la presente
invención incluyen las mutaciones de los residuos de cisteína
dentro de las secuencias de IL-29 silvestre. Cuando
la IL-29 se expresa en E. coli, se encuentra
presente una Metionina N terminal o amino terminal. Por ejemplo, las
SEC. ID. N.º 12 a 17, muestran la numeración de nucleótidos y
residuos de aminoácidos para la IL-28A,
IL-29 e IL-28B cuando se encuentra
presente la Met N terminal. La Tabla 1 muestra las posibles
combinaciones de pares cisteína con unión disulfuro intramolecular
para la IL-29
silvestre.
silvestre.
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\vskip1.000000\baselineskip
Las moléculas de polinucleótidos y polipéptidos
de la presente invención tienen una mutación en una o más de las
cisteínas presentes en las moléculas de IL-29
silvestre, pero aun así retienen cierta actividad biológica, tal
como se describe en la presente. La Tabla 2 ilustra ejemplos de
mutantes cisteína, en particular, mutaciones puntuales de cisteína
(C) a serina (S).
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Se ha demostrado que todos los integrantes de la
familia se unen al mismo receptor de citocinas de Clase II, la
IL-28R. La subunidad \alpha de la
IL-28 anteriormente se denominó receptor del
zcytor19. Sin la intención de imponer restricciones teóricas, estas
moléculas parecen enviar todas las señales mediante el receptor
IL-28R a través de la misma vía. El receptor de la
IL-28 se encuentra descrito en una solicitud de
patente en virtud del PCT asignada en común WO 02/44209,
incorporada en la presente por referencia; Sheppard et al.,
supra; Kotenko et al., Nature Immunol.
4:69-77, 2003; y PCT WO/03/040345. El
IL-28R es integrante de la Clase II de receptores
de citocinas, que se caracteriza por la presencia de uno o más
módulos de receptor de citocinas (cytokine receptor modules, CRM)
en sus dominios extracelulares. Otros receptores de citocinas de
Clase II incluyen el zcytor11 (patente de EE. UU. de propiedad
común N.º 5,965,704), CRF2-4 (acceso a la genoteca
N.º Z17227), IL-10R (Acceso a la genoteca N.º
U00672 y NM_001558), DIRS1, zcytor7 (patente de EE. UU. de propiedad
común N.º 5,945,511) y factor tisular. El receptor de la
IL-28, como todos los receptores de Clase II
conocidos, excepto la cadena alfa del receptor de interferón
alfa/beta, tiene solo una única CRM de clase II en su dominio
extracelular.
Las citocinas con haz de cuatro hélices también
se agrupan por la longitud de las hélices que las componen. Las
citocinas de "hélice larga" generalmente están formadas por
hélices de entre 24 y 30 residuos, e incluyen la
IL-6, el factor neurotrófico ciliar (ciliary
neurotrophic factor, CNTF), el factor inhibidor de la leucemia
(leukemia inhibitory factor, LIF) y la hormona de crecimiento humana
(human growth hormone, hGH). Las citocinas de "hélice corta"
generalmente están formadas por hélices de entre 18 y 21 residuos, e
incluyen la IL-2, la IL-4 y el
GM-CSF. Estudios en los que se utilizó el CNTF y la
IL-6 demostraron que puede intercambiarse una
hélice del CNTF por la hélice equivalente de la
IL-6, y de esta forma se brindan a la quimera
propiedades de unión al CTNF. Por ende, parece ser que los dominios
funcionales de citocinas de cuatro hélices se determinan en función
de la homología estructural, independientemente de la identidad de
secuencias y pueden mantener la integridad funcional en una quimera
(Kallen et al., J. Biol. Chem.
274:11859-11867, 1999). Por lo tanto, los
polipéptidos de la IL-28 y la IL-29
con mutantes cisteína serán útiles para preparar moléculas
quiméricas de fusión, en particular con otros interferones, para
determinar y modular la especificidad de la unión al receptor. De
particular interés son las proteínas de fusión que combinan los
dominios helicoidales y de asas de los interferones y las
citocinas, como el IFN-\alpha, la
IL-10 y la hormona de crecimiento humana.
La presente invención proporciona moléculas de
polinucleótidos, incluidas moléculas de ADN y ARN, que codifican
polipéptidos de la IL-29 con mutantes cisteína. La
presente invención proporciona secuencias de nucleótidos
degeneradas que codifican los polipéptidos IL-29
C171S y Met IL-29 C172S divulgados en la presente.
Los especialistas en la materia reconocerán fácilmente que, en
vista de la degeneración del código genético, es posible que exista
una variación considerable en las secuencias entre estas moléculas
de polinucleótidos. Las SEC. ID. N.º 30, 31, 32, 33, 34 y 35 son
secuencias de ADN degeneradas que abarcan todos los ADN que
codifican la IL-28A C48S, Met
IL-28A C49S, IL-28A C50S, Met
IL-28A C51S, IL-29 C171S y Met
IL-29 C172S, respectivamente. Los especialistas en
la materia reconocerán que la secuencia degenerada de las SEC. ID.
N.º 30, 31, 32, 33, 34 y 35 también proporciona todas las
secuencias de ARN que codifican las SEC. ID. N.º 30, 31, 32, 33, 34
y 35 sustituyendo T por U.
Los polipéptidos de la IL-28A
incluyen una mutación en la segunda cisteína, C2, del polipéptido
maduro. Por ejemplo, la C2 del N terminal o del amino terminal del
polipéptido de la SEC. ID. N.º 2 es la cisteína en la posición del
aminoácido 48 o en la posición 49 (Met N terminal adicional) si está
expresada en E. coli (véase, por ejemplo, la SEC. ID. N.º
13). Esta segunda cisteína (de la cual hay siete, como en el caso de
la IL-28B) o C2 de la IL-28A puede
ser mutada, por ejemplo, a una serina, alanina, treonina, valina o
asparragina. Las moléculas con mutación en C2 de la
IL-28A incluyen, por ejemplo, moléculas de
polinucleótidos como se muestran en las SEC. ID. N.º 20 y 22, que
incluyen moléculas de ADN y ARN, que codifican los polipéptidos de
la IL-28A con mutación en C2, como se muestra en las
SEC. ID. N.º 21 y 23, respectivamente. Las SEC. ID. N.º 36 y 37 son
polipéptidos C2 de la IL-28A adicionales.
Además de la IL-28A con mutación
en C2, los polipéptidos de la IL-28A pueden
comprender una mutación en la posición de la tercera cisteína, C3,
del polipéptido maduro. Por ejemplo, la C3 del N terminal o del
amino terminal del polipéptido de la SEC. ID. N.º 2, es la cisteína
en la posición 50 o en la posición 51 (Met N terminal adicional) si
está expresada en E. coli (véase, por ejemplo, la SEC. ID.
N.º 13). Las moléculas con mutación en C3 de la
IL-28A incluyen, por ejemplo, moléculas de
polinucleótidos como se muestran en las SEC. ID. N.º 24 y 26, que
incluyen moléculas de ADN y ARN, que codifican los polipéptidos de
la IL-28A con mutación en C3, como se muestra en
las SEC. ID. N.º 25 y 27, respectivamente. Las SEC. ID. N.º 38 y 39
son polipéptidos C3 de la IL-28A adicionales.
Los polipéptidos de la IL-28A
incluyen, por ejemplo, las SEC. ID. N.º 2, 13, 19, 21, 23 y 25,
codificadas por las moléculas del polinucleótido de la
IL-28A como se muestra en las SEC. ID. N.º 1, 12,
18, 20, 22 y 24, respectivamente. Además, los polipéptidos de la
IL-28A incluyen, por ejemplo, las SEC. ID. N.º 36,
37, 38 y 39.
Los polipéptidos de la IL-28B
también incluyen una mutación en la segunda cisteína, C2, del
polipéptido maduro. Por ejemplo, la C2 del N terminal o del amino
terminal del polipéptido de la SEC. ID. N.º 6 es la cisteína en la
posición del aminoácido 48 o en la posición 49 (Met N terminal
adicional) si está expresada en E. coli (véase, por ejemplo,
la SEC. ID. N.º 17). Esta segunda cisteína (de la cual hay siete,
como en el caso de la IL-28A) o C2 de la
IL-28B puede ser mutada, por ejemplo, a una serina,
alanina, treonina, valina o asparragina. Las moléculas con mutación
en C2 de la IL-28B incluyen, por ejemplo, moléculas
de polinucleótidos como se muestran en las SEC. ID. N.º 122 y 124,
que incluyen moléculas de ADN y ARN, que codifican los polipéptidos
de la IL-28 con mutación en C2, como se muestra en
las SEC. ID. N.º 123 y 125, respectivamente. Las moléculas con
mutación en C2 de la IL-28B adicionales incluyen las
moléculas de polinucleótidos como se muestran en las SEC. ID. N.º
130 y 132 que incluyen moléculas de ADN y ARN, que codifican los
polipéptidos de la IL-28B con mutación en C2, como
se muestra en las SEC. ID. N.º 131 y 133, respectivamente
(publicación del PCT WO 03/066002 (Kotenko et al.)).
Además de la IL-28B con mutación
en C2, existen polipéptidos de la IL-28B que
comprenden una mutación en la posición de la tercera cisteína, C3,
del polipéptido maduro. Por ejemplo, la C3 del N terminal o del
amino terminal del polipéptido de la SEC. ID. N.º 6, es la cisteína
en la posición 50 o en la posición 51 (Met N terminal adicional) si
está expresada en E. coli (véase, por ejemplo, la SEC. ID.
N.º 17). Las moléculas con mutación en C3 de la
IL-28B incluyen, por ejemplo, moléculas de
polinucleótidos como se muestran en las SEC. ID. N.º 126 y 128, que
incluyen moléculas de ADN y ARN, que codifican los polipéptidos de
la IL-28B con mutación en C3, como se muestra en
las SEC. ID. N.º 127 y 129, respectivamente. Las moléculas con
mutación en C3 de la IL-28B adicionales incluyen
las moléculas de polinucleótidos como se muestran en las SEC. ID.
N.º 134 y 136 que incluyen moléculas de ADN y ARN, que codifican los
polipéptidos de la IL-28B con mutación en C3, como
se muestra en las SEC. ID. N.º 135 y 137, respectivamente
(publicación del PCT WO 03/066002 (Kotenko et al.)).
Los polipéptidos de la IL-28B
incluyen, por ejemplo, las SEC. ID. N.º 6, 17, 123, 125, 127, 129,
131, 133, 135 y 137, codificadas por moléculas del polinucleótido
de la IL-28B como se muestra en las SEC. ID. N.º 5,
16, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134 y 136, respectivamente.
Los polipéptidos de la IL-29 de
la presente invención también incluyen, por ejemplo, una mutación en
la quinta cisteína, C5, del polipéptido maduro. Por ejemplo, la C5
del N terminal del polipéptido de la SEC. ID. N.º 4, es la cisteína
en la posición 171 o en la posición 172 (Met N terminal adicional)
si está expresada en E. coli. (véase, por ejemplo, la SEC.
ID. N.º 15). Esta quinta cisteína o C5 de la IL-29
puede mutarse, por ejemplo, a una serina, alanina, treonina, valina
o asparragina. Estos polipéptidos de la IL-29 con
mutación en C5 tienen un patrón de uniones disulfuro de
C1(Cys15 de la SEC. ID. N.º 4)/C3(Cys112 de la SEC.
ID. N.º 4) y C2(Cys49 de la SEC. ID. N.º 4)/C4(Cys145
de la SEC. ID. N.º 4). Las moléculas con mutación en C5 de la
IL-29 adicionales de la presente invención incluyen
las moléculas de polinucleótidos como se muestran en las SEC. ID.
N.º 26, 28, 82, 84, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154,
156, 158 y 160, que incluyen moléculas de ADN y ARN, que codifican
los polipéptidos de la IL-29 con mutación en C5 como
se muestra en las SEC. ID. N.º 27, 29, 83, 85, 139, 141, 143, 145,
147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, y 161, respectivamente. Las
moléculas mutantes C5 de la IL-29 adicionales de la
presente invención incluyen las moléculas de polinucleótidos como
se muestran en las SEC. ID. N.º 86, 88, 94 y 96, que incluyen
moléculas de ADN y ARN, que codifican los polipéptidos de la
IL-29 con mutación en C5 como se muestra en las SEC.
ID. N.º 87, 89, 95 y 97, respectivamente (publicación del PCT WO
03/066002 (Kotenko et al.)). Las moléculas con mutación en C5
de la IL-29 adicionales de la presente invención
incluyen las moléculas de polinucleótidos como se muestran en las
SEC. ID. N.º 102, 104, 110 y 112, que incluyen moléculas de ADN y
ARN, que codifican los polipéptidos de la IL-29 con
mutación en C5 como se muestra en las SEC. ID. N.º 103, 105, 111 y
113, respectivamente (publicación del PCT WO 02/092762 (Baum et
al.)).
Además de la IL-29 con mutación
en C5, existen polipéptidos de la IL-29 que
comprenden una mutación en la posición de la primera cisteína, C1,
del polipéptido maduro. Por ejemplo, la C1 del N terminal del
polipéptido de la SEC. ID. N.º 4, es la cisteína en la posición 15
o en la posición 16 (Met N terminal adicional) si está expresada en
E. coli (véase, por ejemplo, la SEC. ID. N.º 15). Estos
polipéptidos de la IL-29 con mutación en C1, por
ende, tienen un patrón de uniones disulfuro predicho de
C2(Cys49 de la SEC. ID. N.º 4)/C4(Cys145 de la SEC.
ID. N.º 4) y C3(Cys112 de la SEC. ID. N.º 4)/C5(Cys171
de la SEC. ID. N.º 4). Las moléculas mutantes C1 de la
IL-29 adicionales incluyen las moléculas de
polinucleótidos como se muestran en las SEC. ID. N.º 74, 76, 78 y
80, que incluyen moléculas de ADN y ARN, que codifican los
polipéptidos de la IL-29 con mutación en C1, como
se muestra en las SEC. ID. N.º 75, 77, 79 y 81, respectivamente. Las
moléculas mutantes C1 de la IL-29 adicionales
incluyen las moléculas de polinucleótidos como se muestran en las
SEC. ID. N.º 90, 92, 98 y 100, que incluyen moléculas de ADN y ARN,
que codifican los polipéptidos de la IL-29 con
mutación en C1, como se muestra en las SEC. ID. N.º 91, 93, 99 y
101, respectivamente (publicación del PCT WO 03/066002 (Kotenko
et al.)). Las moléculas mutantes C1 de la
IL-29 adicionales incluyen las moléculas de
polinucleótidos como se muestran en las SEC. ID. N.º 106, 108, 114
y 116, que incluyen moléculas de ADN y ARN, que codifican los
polipéptidos de la IL-29 con mutación en C1, como se
muestra en las SEC. ID. N.º 107, 109, 115 y 117, respectivamente
(publicación del PCT WO 02/092762
(Baum et al.)).
(Baum et al.)).
Los polipéptidos de la IL-29 de
la presente invención, por ejemplo, las SEC. ID. N.º 27, 29, 83, 85,
87, 89, 95, 97, 103, 105, 111, 113, 139, 141, 143, 145, 147, 149,
151, 153, 155, 157, 159 y 161, codificadas por las moléculas del
polinucleótido de la IL-29 como se muestran en las
SEC. ID. N.º 3, 14, 26, 28, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92,
94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 138, 140,
142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 y 160, pueden además
incluir una secuencia señal, como se muestra en la SEC. ID. N.º 119
o una secuencia señal como se muestra en la SEC. ID. N.º 121.
Además, la presente invención también incluye los polipéptidos de
la IL-29 como se muestra en las SEC. ID. N.º 40 y
41. Una molécula de polinucleótido que codifica el polipéptido de
la secuencia señal de la SEC. ID. N.º 119 se muestra como SEC. ID.
N.º 118. Una molécula de polinucleótido que codifica el polipéptido
de la secuencia señal de la SEC. ID. N.º 120 se muestra como SEC.
ID. N.º 121.
La presente invención proporciona un polipéptido
aislado que comprende una secuencia de residuos de aminoácidos
seleccionada del grupo que consiste en las SEC. ID. N.º 27, 29, 40,
41, 83, 85, 87, 89, 95, 97, 103, 105, 111, 113, 139, 141, 143, 145,
147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 y 161. En una aplicación, el
polipéptido aislado es una secuencia de aminoácidos seleccionada
del grupo que consiste en las SEC. ID. N.º 27, 29, 40, 41, 83, 85,
87, 89, 95, 97, 103, 105, 111, 113, 139, 141, 143, 145, 147, 149,
151, 153, 155, 157, 159 y 161.
Una proteína de fusión puede comprender un
polipéptido que comprende una secuencia de residuos de aminoácidos
seleccionada del grupo que consiste en las SEC. ID. N.º 2, 4, 6, 8,
10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75,
77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107,
109, 111, 113, 115, 117, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137,
139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 y 161; y una
fracción de óxido de polialquilo. La fracción de óxido de
polialquilo puede opcionalmente ser polietilenglicol, como un
propionaldehído de mPEG de 20 kD o un propionaldehído de mPEG de 30
kD. El polietilenglicol puede ser lineal o ramificado. El
polietilenglicol puede estar unido al polipéptido en forma covalente
en el N terminal o en el C
terminal.
terminal.
Una proteína de fusión puede comprender un
primer polipéptido y un segundo polipéptido unido por una unión
peptídica, donde el primer polipéptido comprende una secuencia de
residuos de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las
SEC. ID. N.º 2, 4, 6, 8, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 36,
37, 38, 39, 40, 41, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97,
99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 123, 125, 127,
129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153,
155, 157, 159 y 161; y un segundo polipéptido. El segundo
polipéptido puede opcionalmente ser un fragmento de anticuerpo. El
fragmento de anticuerpo puede opcionalmente ser F(ab'),
F(ab), Fab', Fab, Fv, scFv y/o la unidad mínima de
reconocimiento. El segundo polipéptido puede opcionalmente ser
albúmina humana. El segundo polipéptido puede opcionalmente ser un
polipéptido seleccionado del grupo que consiste en etiquetas de
afinidad, toxinas, radionucleótidos, enzimas y fluoróforos.
La Tabla 3 presenta los códigos de una sola
letra utilizados dentro de las SEC. ID. N.º 30, 31, 32, 33, 34 y 35
para denotar posiciones de nucleótidos degenerados. Las
"resoluciones" son nucleótidos denotados con una letra del
código. El "complemento" indica el código del (de los)
nucleótido(s) complementario(s). Por ejemplo, el
código Y denota C o T y su complemento R denota A o G, siendo A
complementario de T y siendo G complementario
de C.
de C.
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Los codones degenerados utilizados en las SEC.
ID. N.º 30, 31, 32, 33, 34 y 35, que abarcan todos los codones
posibles de un aminoácido dado, se presentan en la Tabla 4.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Una persona con conocimientos generales de la
materia apreciará que se introduce cierta ambigüedad al determinar
un codón degenerado, representativo de todos los codones posibles
que codifican cada aminoácido. Por ejemplo, el codón degenerado
para serina (WSN) puede, en ciertas circunstancias, codificar
arginina (AGR) y el codón degenerado para arginina (MGN) puede, en
ciertas circunstancias, codificar serina (AGY). Existe una relación
similar entre los codones que codifican fenilalanina y leucina. Por
ende, algunos polinucleótidos abarcados por la secuencia degenerada
pueden codificar variantes de secuencias de aminoácidos, pero una
persona con conocimientos generales de la materia puede identificar
fácilmente dichas variantes de secuencias por referencia a la
secuencia de aminoácidos, por ejemplo, de las SEC. ID. N.º 19, 21,
23, 25, 27, 29, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87,
89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117,
123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147,
149, 151, 153, 155, 157, 159 y 161. La funcionalidad de las
variantes de las secuencias se puede probar fácilmente según se
describe en la presente.
Una persona con conocimientos generales de la
materia también apreciará que diferentes especies pueden mostrar el
"uso de codones preferenciales". En general, véanse Grantham,
et al., Nuc. Acids Res.
8:1893-912, 1980; Haas, et al.
Curr. Biol. 6:315-24, 1996;
Wain-Hobson, et al., Gene
13:355-64, 1981; Grosjean y Fiers,
Gene 18:199-209, 1982; Holm, Nuc.
Acids Res. 14:3075-87, 1986; Ikemura,
J. Mol. Biol. 158:573-97, 1982. Tal
como se los usa en la presente, los términos "uso de codones
preferenciales" o "codones preferenciales" constituyen una
expresión de la materia que hace referencia a codones de traducción
de proteínas que se utilizan más frecuentemente en las células de
una especie determinada, favoreciendo de ese modo a uno o a unos
pocos representantes de los posibles codones que codifican cada
aminoácido (véase la Tabla 4). Por ejemplo, el aminoácido treonina
(Thr) puede ser codificado por ACA, ACC, ACG o ACT, pero en las
células de los mamíferos, ACC es el codón usado más comúnmente; en
otras especies, por ejemplo, células de insectos, levaduras, virus o
bacterias, es posible que sean preferenciales otros codones de Thr
distintos. Los codones preferenciales para una especie en
particular pueden introducirse en los polinucleótidos de la presente
invención mediante una serie de métodos conocidos por los
especialistas en la materia. La introducción de secuencias de
codones preferenciales en el ADN recombinante puede, por ejemplo,
potenciar la producción de la proteína haciendo que la traducción
de la proteína sea más eficiente dentro de un tipo o especie celular
en particular. Por lo tanto, la secuencia de codones degenerados
divulgada en las SEC. ID. N.º 30, 31, 32, 33, 34 y 35 sirve como
plantilla para optimizar la expresión de polinucleótidos en
diversos tipos y especies celulares que se usan habitualmente en la
especialidad y se divulgan en la presente. Las secuencias que
contienen codones preferenciales pueden probarse y optimizarse para
su expresión en diversas especies, y su funcionalidad puede probarse
según se divulga en la presente.
Un polinucleótido aislado se selecciona del
grupo que consiste en las SEC. ID. N.º 1, 3, 5, 7, 9, 12, 14, 16,
18, 20, 22, 24, 26, 28, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94,
96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 122, 124, 126,
128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152,
154, 156, 158 y 160.
Un polinucleótido aislado es capaz de hibridarse
a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEC. ID.
N.º 1, 3, 5, 7, 9, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 74, 76, 78,
80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108,
110, 112, 114, 116,122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140,
142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 y 160, o un complemento
de ellas, en condiciones de hibridación de formamida al 50%, 5xSSC
(1xSSC: cloruro de sodio 0,15 M y citrato de sodio 15 mM), fosfato
de sodio 50 mM (pH 7,6), 5x solución de Denhardt (100x solución de
Denhardt: Ficoll 400 al 2% (p/v), polivinilpirrolidona al 2% (p/v)
y albúmina de suero bovino al 2% (p/v), sulfato de dextrano al 10% y
20 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y fragmentado,
a una temperatura de entre, aproximadamente, 42ºC y 70ºC, donde el
polinucleótido aislado codifica un polipéptido con actividad
antiviral. Opcionalmente, el polipéptido codificado tiene actividad
antiviral contra la hepatitis B y/o la hepatitis C. Opcionalmente,
el polinucleótido aislado puede codificar, al menos, una porción de
una secuencia seleccionada del grupo de las SEC. ID. N.º 2, 4, 6,
8, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 36, 37, 38, 39, 40, 41,
75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105,
107, 109, 111, 113, 115, 117, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135,
137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 y 161.
El polinucleótido aislado puede codificar un polipéptido
representado por las SEC. ID. N.º 2, 4, 6, 8, 10, 13, 15, 17, 19,
21, 23, 25, 27, 29, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 77, 79, 81, 83, 85,
87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115,
117, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145,
147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 ó 161.
La presente invención proporciona un
polinucleótido aislado que codifica un polipéptido donde el
polipéptido codificado se selecciona del grupo que consiste en las
SEC. ID. N.º 27, 29, 40, 41, 83, 85, 87, 89, 95, 97, 103, 105, 111,
113, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 y
161.
Opcionalmente, el polipéptido codificado tiene
actividad antiviral contra la hepatitis B y/o la hepatitis C.
Como se señaló anteriormente, los
polinucleótidos aislados de la presente invención incluyen ADN y
ARN. Los métodos para preparar ADN y ARN son bien conocidos por los
especialistas en la materia. En general, el ARN se aísla de un
tejido o una célula que produce grandes cantidades de ARN de la
IL-28 o la IL-29 con mutación en
cisteína. Dichos tejidos y células se identifican mediante el
análisis Northern blot (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
77:5201, 1980) o cribando el medio condicionado de diversos
tipos celulares para detectar la actividad en las células o el
tejido diana. Una vez identificada la actividad o la célula o el
tejido que produce el ARN, el ARN total puede prepararse extrayendo
el isotiocianato de guanidinio, y realizando luego el aislamiento
mediante centrifugación en un gradiente de CsCl (Chirgwin et
al., Biochemistry 18:52-94,
1979). Se prepara ARN poli(A)^{+} a partir del ARN
total usando el método de Aviv y Leder (Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 69:1408-12, 1972). Se prepara ADN
complementario (ADNc) a partir del ARN poli(A)^{+}
utilizando los métodos conocidos. Como alternativa, puede aislarse
el ADN genómico. Luego, los polinucleótidos que codifican los
polipéptidos de la IL-28 o la IL-29
con mutación en cisteína se identifican y aíslan mediante, por
ejemplo, hibridación o reacción en cadena de la polimerasa
(polymerase chain reaction, PCR).
Puede obtenerse un clon de longitud completa que
codifica la IL-28 o la IL-29 con
mutación en cisteína mediante los procedimientos de clonación
convencionales. Se prefieren los clones de ADN complementario
(ADNc), aunque para algunas aplicaciones (p. ej. expresión en
animales transgénicos) puede ser preferible usar un clon genómico,
o modificar un clon de ADNc para que incluya, al menos, un intrón
genómico. Los métodos para preparar clones de ADNc y genómicos son
bien conocidos para quienes cuentan con conocimientos generales de
la materia, e incluyen el uso de la secuencia divulgada en la
presente, o partes de ella, para sondar o cebar una genoteca. Las
genotecas de expresión
pueden sondarse con anticuerpos contra fragmentos del receptor de la IL-28, u otros elementos de unión específicos.
pueden sondarse con anticuerpos contra fragmentos del receptor de la IL-28, u otros elementos de unión específicos.
Los especialistas en la materia reconocerán que
la secuencia divulgada, por ejemplo, en las SEC. ID. N.º 1, 3 y 5,
respectivamente, representan mutaciones de alelos únicos de las
bandas de IL-28 e IL-29 humanas, y
que se prevé que se produzcan variación alélica y empalmes
alternativos. Por ejemplo, se ha identificado una variante de la
IL-29 donde el residuo de aminoácido 169 (Asn) como
se muestra en la SEC. ID. N.º 4 es un residuo Arg, como se describe
en la WO 02/086087. Las variantes alélicas de esta secuencia pueden
clonarse sondando genotecas de ADNc o genómicas de diferentes
individuos según los procedimientos estándares. Las variantes
alélicas de la secuencia de ADN mostrada en la SEC. ID. N.º 3,
incluidas aquellas que contienen mutaciones silenciosas y aquellas
en las que las mutaciones provocan cambios en la secuencia de
aminoácidos, además de las mutaciones cisteína, están dentro del
alcance de la presente invención, ya que son proteínas que
constituyen variantes alélicas de la SEC. ID. N.º 4. Las moléculas
de ADNc generadas a partir de ARNm empalmados en forma alternativa,
que conservan las propiedades del polipéptido de la
IL-29 con mutación en cisteína están incluidas
dentro del alcance de la presente invención, al igual que los
polipéptidos codificados por dichos ADNc y ARNm. Las variantes
alélicas y las variantes de empalme de estas secuencias pueden
clonarse por sondaje de genotecas de ADNc o genómicas de diferentes
individuos o tejidos según los procedimientos estándares conocidos
en la especialidad, y pueden introducirse mutaciones a los
polinucleótidos que codifican cisteínas o residuos de cisteínas
según se describe en la presente.
Las moléculas de ácido nucleico aisladas que
codifican la IL-28- y la IL-29
variantes o con mutación en cisteína pueden hibridarse en
condiciones rigurosas a moléculas de ácido nucleico que contienen la
secuencia de nucleótidos de las SEC. ID. N.º 18, 20, 22, 24, 26,
28, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102,
104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 122, 124, 126, 128, 130, 132,
134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 y
160 o a moléculas de ácido nucleico que contienen una secuencia de
nucleótidos complementaria a las SEC. ID. N.º 18, 20, 22, 24, 26,
28, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102,
104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 122, 124, 126, 128, 130, 132,
134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 y
160. En general, las condiciones rigurosas se seleccionan para ser
alrededor de 5ºC inferiores al punto de fusión térmico (T_{m})
para la secuencia específica a una concentración iónica y un pH
definidos. El T_{m} es la temperatura (a una concentración iónica
y un pH definidos) a la cual el 50% de la secuencia de acceso se
hibrida a una sonda que coincide
perfectamente.
perfectamente.
Un par de moléculas de ácido nucleico, por
ejemplo, ADN-ADN, ARN-ARN y
ADN-ARN, puede hibridarse si las secuencias de
nucleótidos tienen cierto grado de complementariedad. Los híbridos
pueden tolerar pares de bases con faltas de coincidencia en la
doble hélice, pero la estabilidad del híbrido se ve influenciada por
el grado de falta de coincidencia. El Tm del híbrido no coincidente
disminuye 1ºC por cada 1% a 1,5% de falta de coincidencia en los
pares de bases. Variar la rigurosidad de las condiciones de la
hibridación permite controlar el grado de falta de coincidencia que
se presentará en el híbrido. El grado de rigurosidad aumenta a
medida que aumenta la temperatura de hibridación y disminuye la
concentración iónica de la solución amortiguadora de
hibridación.
Un especialista en la materia cuenta con la
capacidad suficiente para adaptar estas condiciones para usarlas
con el híbrido de un polinucleótido en particular. El T_{m} para
una secuencia de acceso específica es la temperatura (en
condiciones definidas) a la cual el 50% de la secuencia de acceso se
hibridará a una secuencia de sondas que coincide perfectamente. Las
condiciones que influyen en el T_{m} incluyen el tamaño y el
contenido de pares de bases de la sonda de polinucleótidos, la
concentración iónica de la solución de hibridación y la presencia
de agentes desestabilizantes en la solución de hibridación. Se
conocen en la especialidad numerosas ecuaciones para calcular el
T_{m}, y estas son específicas para híbridos de ADN, ARN y
ADN-ARN y secuencias de sondas de polinucleótidos
de longitud variable (véanse, por ejemplo, Sambrook et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición
(Cold Spring Harbor Press 1989); Ausubel et al., (ed.),
Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc.
1987); Berger y Kimmel (ed.), Guide to Molecular Cloning
Techniques, (Academic Press, Inc. 1987); y Wetmur, Crit.
Rev. Biochem. Mol. Biol. 26:227 (1990)). Existen
programas informáticos para el análisis de secuencias, por ejemplo,
OLIGO 6.0 (LSR; Long Lake, MN) y Primer Premier 4.0 (Premier
Biosoft International; Palo Alto, CA), así como sitios en Internet,
para analizar una secuencia dada y calcular el T_{m} en función
de criterios definidos por el usuario. Dichos programas también
analizan una secuencia dada en condiciones definidas e identifican
secuencias de sondas adecuadas. Habitualmente, la hibridación de
secuencias de polinucleótidos más largas, >50 pares de bases, se
realiza a temperaturas de alrededor de 20ºC a 25ºC por debajo del
T_{m} calculado. Para sondas más pequeñas, <50 pares de bases,
la hibridación habitualmente se lleva a cabo al T_{m} o entre 5ºC
y 10ºC por debajo del T_{m} calculado. Esto brinda la máxima tasa
de hibridación para híbridos de ADN-ADN y
ADN-ARN.
Después de la hibridación, las moléculas de
ácido nucleico pueden lavarse para eliminar las moléculas de ácido
nucleico no hibridadas en condiciones rigurosas o en condiciones muy
rigurosas. Las condiciones de lavado rigurosas habituales incluyen
lavado en una solución de 0,5x-2xSSC con dodecil
sulfato de sodio (SDS) al 0,1% a 55ºC-65ºC. A
manera de ejemplo, las moléculas de ácido nucleico que codifican
polipéptidos de la IL-28 o la IL-29
variantes o con mutación en cisteína se hibridan a una molécula de
ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos de las SEC.
ID. N.º 18, 20, 22, 24, 26, 28, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90,
92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 122,
124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148,
150, 152, 154, 156, 158 y 160, respectivamente (o su complemento),
en condiciones de lavado rigurosas, en las cuales la rigurosidad
del lavado es equivalente a 0,5x-2xSSC con SDS al
0,1% a 55ºC-65ºC e incluye 0,5xSSC con SDS al 0,1%
a 55ºC, o 2xSSC con SDS al 0,1% a 65ºC. Un especialista en la
materia puede fácilmente idear condiciones equivalentes, por
ejemplo, sustituyendo SSC por SSPE en la solución de lavado.
Las condiciones de lavado muy rigurosas
habituales incluyen el lavado en una solución de
0,1x-0,2xSSC con dodecil sulfato de sodio (SDS) al
0,1% a 50ºC-65ºC. En otras palabras, las moléculas
de ácido nucleico que codifican el polipéptido de la
IL-28 o la IL-29 variante o con
mutación en cisteína se hibridan a una molécula de ácido nucleico
que contiene la secuencia de nucleótidos de las SEC. ID. N.º 18, 20,
22, 24, 26, 28, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98,
100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 122, 124, 126, 128,
130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154,
156, 158 y 160 (o su complemento) en condiciones de lavado muy
rigurosas, en las cuales la rigurosidad del lavado es equivalente a
0,1x-0,2xSSC con SDS al 0,1% a
50ºC-65ºC e incluye 0,1xSSC con SDS al 0,1% a 50ºC o
0,2xSSC con SDS al 0,1% a 65ºC.
Los polipéptidos de la IL-29
pueden tener una identidad de secuencias sustancialmente similar a
los polipéptidos de la presente invención, por ejemplo, los de las
SEC. ID. N.º 27, 29, 40, 41, 83, 85, 87, 89, 95, 97, 103, 105, 111,
113, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 ó 161. El
término "identidad de secuencias sustancialmente similar" se
utiliza en la presente para denotar polipéptidos que comprenden una
identidad de secuencias de al menos un 80%, al menos un 90%, al
menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al
menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al
menos un 99%, o mayor al 99% con las secuencias que se muestran en
las SEC. ID. N.º 2, 4, 6, 8, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29,
36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95,
97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123,
125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149,
151, 153, 155, 157, 159 ó 161, o sus ortólogos. Los polipéptidos
pueden comprender una secuencia de aminoácidos que tienen una
identidad de secuencias de al menos un 80%, al menos un 90%, al
menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al
menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al
menos un 99%, o mayor al 99% con un polipéptido o fragmento de
polipéptido de la presente invención. Los polipéptidos de la
IL-29 de la presente invención son, preferentemente,
polipéptidos recombinantes. Los polipéptidos de la
IL-29 de la presente invención tienen, al menos, 60
aminoácidos secuenciales. A continuación se describen métodos para
determinar el porcentaje de identidad.
Las moléculas de ácido nucleico de las variantes
pueden identificarse aplicando dos criterios: una determinación de
la similitud entre el polipéptido codificado con la secuencia de
aminoácidos de las SEC. ID. N.º 19, 21, 23, 25, 27, 29, 36, 37, 38,
39, 40, 41, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101,
103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 123, 125, 127, 129, 131,
133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157,
159 ó 161 respectivamente, y/o una valoración de hibridación, según
se ha descrito más arriba. Dichas variantes incluyen las moléculas
de ácido nucleico: (1) que se hibridan a una molécula de ácido
nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos de las SEC. ID.
N.º 18, 20, 22, 24, 26, 28, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92,
94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 122, 124,
126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150,
152, 154, 156, 158 y 160, respectivamente (o su complemento) en
condiciones de lavado rigurosas, en las cuales la rigurosidad del
lavado es equivalente a 0,5x-2xSSC con SDS al 0,1% a
55ºC-65ºC; o (2) que codifican un polipéptido que
tiene una identidad de secuencias de al menos un 80%, al menos un
90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un
94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un
98%, al menos un 99%, o mayor al 99% con la secuencia de aminoácidos
de las SEC. ID. N.º 19, 21, 23, 25, 27, 29, 36, 37, 38, 39, 40, 41,
75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105,
107, 109, 111, 113, 115, 117, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135,
137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 ó 161.
Como alternativa, dichas variantes incluyen las moléculas de ácido
nucleico: (1) que se hibridan a una molécula de ácido nucleico que
contiene la secuencia de nucleótidos de las SEC. ID. N.º 18, 20,
22, 24, 26, 28, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98,
100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 122, 124, 126, 128,
130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154,
156, 158 ó 160, respectivamente (o su complemento) en condiciones de
lavado muy rigurosas, en las cuales la rigurosidad del lavado es
equivalente a 0,1x-0,2xSSC con SDS al 0,1% a
50ºC-65ºC; y (2) que codifican un polipéptido que
tiene una identidad de secuencias de al menos un 80%, al menos un
90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un
94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un
98%, al menos un 99%, o mayor al 99% con la secuencia de aminoácidos
de las SEC. ID. N.º 19, 21, 23, 25, 27, 29, 36, 37, 38, 39, 40, 41,
75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105,
107, 109, 111, 113, 115, 117, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135,
137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 ó 161,
respectivamente.
El porcentaje de identidad de secuencias se
determina por métodos convencionales. Véanse, por ejemplo, Altschul
et al., Bull. Math. Bio. 48:603 (1986), y
Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:10915 (1992). En resumen, dos secuencias de aminoácidos
se alinean para optimizar los puntajes de alineamiento utilizando
una penalización por apertura de gap de 10, una penalización por
extensión de gap de 1 y la matriz de puntuación "blosum62" de
Henikoff y Henikoff (ibid.) como se muestra en la Tabla 4
(los aminoácidos se indican con códigos estándares de una
sola
letra).
letra).
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\vskip1.000000\baselineskip
Los especialistas en la materia apreciarán que
existen muchos algoritmos establecidos para alinear dos secuencias
de aminoácidos. El algoritmo de búsqueda de similitud "FASTA"
de Pearson y Lipman es un método de alineamiento de proteínas
adecuado para examinar el nivel de identidad compartido por una
secuencia de aminoácidos divulgada en la presente y la secuencia de
aminoácidos de una variante putativa de la IL-28 o
la IL-29. El algoritmo FASTA ha sido descrito por
Pearson y Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:2444
(1988), y por Pearson, Meth. Enzymol. 183:63
(1990).
En resumen, el FASTA primero caracteriza la
similitud entre secuencias identificando las regiones compartidas
por la secuencia de consulta (p. ej. SEC. ID. N.º 2) y una secuencia
de prueba que tienen la mayor densidad de identidades (si la
variable ktup es 1) o pares de identidades (si ktup=2), sin tener en
cuenta sustituciones, inserciones o deleciones conservadoras de
aminoácidos. Luego, se vuelven a puntuar las diez regiones con la
mayor densidad de identidades comparando la similitud de todos los
aminoácidos apareados mediante una matriz de sustitución de
aminoácidos, y se "recortan" los extremos de las regiones para
incluir únicamente aquellos residuos que contribuyan a la mayor
puntuación. Si hay varias regiones con puntajes mayores que el valor
de "corte" (calculado mediante una fórmula predeterminada en
función de la longitud de la secuencia y el valor de ktup), las
regiones iniciales recortadas se examinan para determinar si pueden
unirse para formar un alineamiento aproximado con gaps. Finalmente,
las regiones con la mayor puntuación de las dos secuencias de
aminoácidos se alinean mediante una modificación del algoritmo de
Needleman-Wunsch-Sellers (Needleman
y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444 (1970); Sellers,
SIAM J. Appl. Math. 26:787 (1974)), que permite las
inserciones y deleciones de aminoácidos. Los parámetros preferidos
del análisis por el método FASTA son: ktup=1, penalización por
apertura de gap=10, penalización por extensión de gap=1 y matriz de
sustitución=blosum62. Estos parámetros pueden introducirse en un
programa FASTA modificando el archivo de la matriz de puntuación
("SMATRIX"), como se explica en el Anexo 2 de Pearson,
Meth. Enzymol. 183:63 (1990).
El FASTA también puede utilizarse para
determinar la identidad de secuencias de moléculas de ácido nucleico
utilizando una relación, tal como se ha divulgado anteriormente.
Para las comparaciones de secuencias de nucleótidos, el valor de
ktup puede variar entre uno y seis; preferentemente entre tres y
seis; más preferentemente tres, con los demás parámetros fijados
como predeterminados.
Los polipéptidos de la IL-28 o
la IL-29 con mutación en cisteína variantes o los
polipéptidos con una identidad de secuencias sustancialmente
similar se caracterizan por tener una o más sustituciones,
deleciones o adiciones de aminoácidos. Estos cambios son
preferentemente de una naturaleza menor, es decir, sustituciones
conservadoras de aminoácidos (véase la Tabla 6) y otras
sustituciones que no afectan significativamente el plegamiento ni
la actividad del polipéptido; deleciones pequeñas, habitualmente de
entre uno y, aproximadamente, 30 aminoácidos; y extensiones amino o
carboxilo terminales, como un residuo de metionina amino terminal,
un péptido ligador pequeño de aproximadamente 20-25
residuos como máximo, o una etiqueta de afinidad. Los polipéptidos
de entre aproximadamente 146 a 207 residuos de aminoácidos pueden
comprender una identidad de secuencia de al menos un 80%, al menos
un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos
un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos
un 98%, al menos un 99%, o mayor al 99% a la región correspondiente
de las SEC. ID. N.º 19, 21, 23, 25, 27, 29, 36, 37, 38, 39, 40, 41,
75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105,
107, 109, 111, 113, 115, 117, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135,
137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 ó 161.
Los polipéptidos que comprenden etiquetas de afinidad también
pueden comprender un sitio de segmentación proteolítica entre el
polipéptido de la IL-28 y la IL-29 y
la etiqueta de afinidad. Los sitios preferidos incluyen sitios de
segmentación de trombina y sitios de segmentación del factor
Xa.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- Básica:
- arginina
- \quad
- lisina
- \quad
- histidina
- Ácida:
- ácido glutámico
- \quad
- ácido aspártico
- Polar:
- glutamina
- \quad
- asparragina
- Hidrófoba:
- leucina
- \quad
- isoleucina
- \quad
- valina
- Aromática:
- fenilalanina
- \quad
- triptófano
- \quad
- tirosina
- Pequeña:
- glicina
- \quad
- alanina
- \quad
- serina
- \quad
- treonina
- \quad
- metionina
\vskip1.000000\baselineskip
Puede realizarse una determinación de los
residuos de aminoácidos que comprenden regiones o dominios que son
fundamentales para mantener la integridad estructural. Dentro de
estas regiones, se pueden determinar los residuos específicos que
serán más o menos tolerantes al cambio y mantendrán la estructura
terciaria general de la molécula. Los métodos para analizar la
estructura de la secuencia incluyen, a modo de ejemplo, el
alineamiento de múltiples secuencias con alta identidad de
aminoácidos o nucleótidos, propensiones de estructura secundaria,
patrones binarios, compactación complementaria e interacciones
polares ocultas (Barton, Current Opin. Struct. Biol.
5:372-376, 1995 y Cordes et al.,
Current Opin. Struct. Biol. 6:3-10,
1996). En general, al diseñar modificaciones a moléculas o
identificar fragmentos específicos, la determinación de la
estructura estará acompañada por la evaluación de la actividad de
las moléculas modificadas.
Se realizan cambios en la secuencia de
aminoácidos de los polipéptidos de la IL-28 o la
IL-29 con mutación en cisteína, a fin de minimizar
la alteración de la estructura de orden superior esencial para la
actividad biológica. Por ejemplo, cuando el polipéptido de la
IL-28 o la IL-29 con mutación en
cisteína comprenda una o más hélices, se realizarán cambios en los
residuos de aminoácidos, de forma tal de no alterar la geometría de
las hélices y otros componentes de la molécula donde los cambios en
la conformación disminuyan alguna función fundamental, por ejemplo,
la unión de la molécula a sus elementos de unión. Los efectos de los
cambios en la secuencia de aminoácidos pueden predecirse, por
ejemplo, mediante el uso de modelos de ordenador como se divulga
más arriba, o pueden determinarse mediante el análisis de la
estructura de cristales (véase, p. ej. Lapthorn et al.,
Nat. Struct. Biol. 2:266-268, 1995).
Otras técnicas bien conocidas por los especialistas en la materia
comparan el plegamiento de una variante de proteína con una molécula
estándar (p. ej. la proteína originaria). Por ejemplo, puede
realizarse una comparación del patrón de cisteínas en una variante
de las moléculas y en moléculas estándares. La espectrometría de
masas y la modificación química que utilizan la reducción y la
alquilación proporcionan métodos para determinar residuos de
cisteína asociados con las uniones disulfuro o libres de dichas
asociaciones (Bean et al., Anal. Biochem.
201:216-226, 1992; Gray, Protein Sci.
2:1732-1748, 1993; y Patterson et al.,
Anal. Chem. 66:3727-3732, 1994).
Generalmente, se cree que si una molécula modificada no tiene el
mismo patrón de cisteínas que la molécula estándar, el plegamiento
podría verse afectado. Otro método bien conocido y aceptado para la
medición del plegamiento es el dicroísmo circular (circular
dichrosism, CD). La medición y comparación del espectro del CD
generado por una molécula modificada y una molécula estándar es el
procedimiento de rutina (Johnson, Proteins
7:205-214, 1990). La cristalografía es otro
método bien conocido para el análisis del plegamiento y la
estructura. La resonancia magnética nuclear (nuclear magnetic
resonance, NMR), el mapeo de péptidos digestivos y el mapeo de
epítopos también son métodos conocidos para el análisis de las
similitudes en cuanto al plegamiento y la estructura entre las
proteínas y los polipéptidos (Schaanan et al.,
Science 257:961-964, 1992).
Puede generarse un perfil de hidrofilicidad de
Hopp/Woods de la secuencia de proteínas de la IL-28
o la IL-29 con mutación en cisteína como se muestra
en las SEC. ID. N.º 19, 21, 23, 25, 27, 29, 36, 37, 38, 39, 40, 41,
75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105,
107, 109, 111, 113, 115, 117, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135,
137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 ó 161
(Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
78:3824-3828, 1981; Hopp, J. Immun.
Meth. 88:1-18, 1986 y Triquier et
al., Protein Engineering
11:153-169, 1998). El perfil se basa en una
ventana desplazable de seis residuos. Se ignoraron los residuos
ocultos G, S y T, y los residuos expuestos H, Y y W. Los
especialistas en la materia reconocerán que la hidrofilicidad o
hidrofobicidad se tomarán en cuenta al diseñar modificaciones en la
secuencia de aminoácidos de un polipéptido de la
IL-28 o la IL-29 con mutación en
cisteína, de forma tal de no alterar el perfil estructural y
biológico general. De particular interés para el reemplazo son los
residuos hidrófobos seleccionados del grupo que consiste en Val,
Leu e Ile, o el grupo que consiste en Met, Gly, Ser, Ala, Tyr y
Trp.
Las identidades de los aminoácidos esenciales
también pueden inferirse a partir del análisis de la similitud de
secuencias entre el IFN-\alpha y los miembros de
la familia de la IL-28A, IL-28B e
IL-29 (como se muestra en las Tablas 1 y 2).
Mediante el uso de métodos como el análisis "FASTA" descrito
anteriormente, se identifican regiones de alta similitud dentro de
una familia de proteínas y se las utiliza para analizar la secuencia
de aminoácidos a fin de detectar las regiones conservadas. Un
enfoque alternativo para identificar una variante del
polinucleótido en función de la estructura es determinar si una
molécula de ácido nucleico que codifica una posible variante del
gen de la IL-28 o la IL-29 puede
hibridarse a una molécula de ácido nucleico como se analizó
anteriormente.
Otros métodos para identificar los aminoácidos
esenciales de los polipéptidos de la presente invención son los
procedimientos conocidos en la especialidad, como la mutagénesis
sitio dirigida o mutagénesis por cribaje de alanina (Cunningham y
Wells, Science 244:1081 (1989), Bass et al.,
Proc. Natl Acad. Sci. USA 88:4498 (1991), Coombs y
Corey, "Site-Directed Mutagenesis and Protein
Engineering", en Proteins: Analysis and Design, Angeletti
(ed.), páginas 259-311 (Academic Press, Inc. 1998)).
En esta última técnica, se introducen mutaciones únicas de alanina
en cada residuo de la molécula y se prueban las moléculas con
mutación en cisteína resultantes a fin de determinar su actividad
biológica o bioquímica como se divulga a continuación, para
identificar residuos de aminoácidos que resultan fundamentales para
la actividad de la molécula. Véase también, Hilton et al.,
J. Biol. Chem. 271:4699 (1996).
Los fragmentos funcionales de los polipéptidos
de la IL-28 o la IL-29 con mutación
en cisteína y las moléculas de ácido nucleico que codifican dichos
fragmentos funcionales se caracterizan por su actividad
proliferativa o de diferenciación, por su capacidad de inducir o
inhibir funciones celulares especializadas, o por su capacidad de
unirse específicamente a un anticuerpo contra la
IL-28 o la IL-29 o al receptor de la
IL-28 (ya sea soluble o inmovilizado). En la
presente se divulgan las actividades especializadas de los
polipéptidos de la IL-28 o la IL-29
con mutación en cisteína y el modo de realizar su determinación.
Como se describió previamente en la presente, los polipéptidos de
la IL-28 y la IL-29 se caracterizan
por una estructura con haz de seis hélices. Por ende, las proteínas
de fusión abarcan: (a) moléculas de polipéptidos que comprenden una
o más de las hélices descritas anteriormente; y (b) fragmentos
funcionales que comprenden una o más de estas hélices. A la otra
porción de polipéptidos de la proteína de fusión se le puede agregar
otra citocina o interferón con haz helicoidal, como el
IFN-\alpha, o un péptido señal de secreción no
originario y/o no relacionado que facilite la secreción de la
proteína de fusión.
Los polipéptidos de la IL-29 con
mutación en cisteína de la presente invención pueden producirse de
acuerdo con las técnicas convencionales usando células en las que
se introdujo un vector de expresión que codifica el polipéptido.
Tal como se lo usa en la presente, el término "células en las que
se introdujo un vector de expresión" incluye las células que se
han manipulado directamente mediante la introducción de moléculas de
ADN exógeno, y la progenie de dichas células que contiene el ADN
introducido. Las células huésped adecuadas son aquellos tipos
celulares que pueden transformarse o transfectarse con ADN exógeno y
hacerse crecer en medio de cultivo, e incluyen células bacterianas,
células fúngicas y células eucariotas superiores cultivadas. Las
técnicas para manipular moléculas de ADN clonadas e introducir ADN
exógeno en diversas células huésped se divulgan en Sambrook et
al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.a ed.,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989;
y Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular
Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987.
Dentro de otro aspecto, la presente invención,
proporciona un vector de expresión que comprende los siguientes
elementos ligados operablemente: un promotor de la transcripción; un
segmento de ADN que codifica un polipéptido, tal como se describe
en la presente; y un terminador de la transcripción.
La molécula de ADN puede además comprender una
secuencia señal de secreción ligada operablemente al segmento de
ADN. El polipéptido codificante puede además comprender una etiqueta
de afinidad como se describe en la presente. La presente invención
también proporciona una célula cultivada que contiene el vector de
expresión descrito anteriormente. El polipéptido codificado puede,
opcionalmente, tener actividad antiviral, p. ej. contra la
hepatitis B y la hepatitis C.
Dentro de otro aspecto, la presente invención
proporciona una célula cultivada que comprende un vector de
expresión como el descrito anteriormente.
Dentro de otro aspecto, la presente invención
proporciona un método para producir una proteína que comprende:
cultivar una célula como se divulga anteriormente, en condiciones
donde el segmento de ADN está expresado; y recuperar la proteína
codificada por el segmento de ADN.
En general, una secuencia de ADN que codifica un
polipéptido de la IL-29 con mutación en cisteína se
liga operablemente a otros elementos genéticos necesarios para su
expresión, entre los que generalmente se incluyen un promotor y un
terminador de la transcripción, dentro de un vector de expresión.
Por lo general, el vector también contendrá uno o más marcadores
seleccionables y uno o más orígenes de replicación, aunque los
especialistas en la materia reconocerán que dentro de determinados
sistemas pueden proporcionarse marcadores seleccionables en
vectores separados, y la replicación del ADN exógeno puede
proporcionarse mediante la integración dentro del genoma de la
célula huésped. La selección de promotores, terminadores, marcadores
seleccionables, vectores y otros elementos es una cuestión de
diseño de rutina dentro de los conocimientos generales de la
materia. Muchos de estos elementos se describen en la bibliografía
y están disponibles a través de proveedores comerciales.
Para dirigir un polipéptido de la
IL-28 o la IL-29 con mutación en
cisteína hacia la vía de secreción de una célula huésped, se
proporciona una secuencia señal de secreción (también conocida como
secuencia líder, secuencia prepro o presecuencia) en el vector de
expresión. La secuencia señal de secreción puede ser la de la
IL-28 o la IL-29 con mutación en
cisteína, p. ej. la SEC. ID. N.º 119 o la SEC. ID. N.º 121, o puede
derivarse de otra proteína segregada (p. ej. t-PA;
véase la Patente de EE. UU. N.º 5,641,655) o puede sintetizarse
de novo. La secuencia señal de secreción está ligada
operablemente a la secuencia de ADN de la IL-28 o la
IL-29 con mutación en cisteína, es decir, ambas
secuencias están unidas en el marco de lectura correcto y
posicionadas para dirigir el polipéptido nuevo sintetizado hacia la
vía de secreción de la célula huésped. Las secuencias señal de
secreción comúnmente están en posición 5' con respecto a la
secuencia de ADN que codifica el polipéptido de interés, aunque
determinadas secuencias señal pueden estar posicionadas en otro
lugar de la secuencia de ADN de interés (véase, p. ej. Welch et
al., Patente de EE. UU. N.º 5,037,743; Holland et al.,
Patente de EE. UU. N.º 5,143,830).
Una amplia variedad de células huésped
recombinantes adecuadas incluye, a modo de ejemplo, organismos
huésped procariotas gram negativos. Las cepas adecuadas de E.
coli incluyen la W3110, las cepas derivadas de K12 MM294,
TG-1, JM-107, BL21 y UT5600. Otras
cepas adecuadas incluyen: BL21(DE3),
BL21(DE3)pLysS, BL21(DE3) pLysE, DH1, DH4I,
DH5, DH5I, DH5IF', DH5IMCR, DH10B, DH10B/p3, DH11S, C600, HB101,
JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451,
ER1647, E. coli K12, E. coli K12 RV308, E. coli
K12 C600, E. coli HB101, E. coli K12 C600 R_{k-}
M_{k-}, E. coli K12 RR1 (véase, por ejemplo, Brown (ed.),
Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991)). Otros
huéspedes procariotas gram negativos pueden incluir
Serratia, Pseudomonas y Caulobacter. Los
huéspedes procariotas pueden incluir organismos gram positivos como
Bacilos, por ejemplo, B. subtilis y B.
thuringienesis, y B. thuringienesis var.
israelensis, así como Streptomyces, por ejemplo, S.
lividans, S. ambofaciens, S. fradiae y S.
griseofuscus. Las cepas adecuadas de Bacillus subtilus
incluyen BR151, YB886, MI119, MI120, y B170 (véase, por ejemplo,
Hardy, "Bacillus Cloning Methods", en DNA Cloning: A Practical
Approach, Glover (ed.) (IRL Press 1985)). Las técnicas estándares
para propagar vectores en huéspedes procariotas son bien conocidas
por los especialistas en la materia (véanse, por ejemplo, Ausubel
et al. (ed.), Short Protocols in Molecular Biology, 3ª
Edición (John Wiley & Sons 1995); Wu et al.,Methods
in Gene Biotechnology(CRC Press, Inc. 1997)). En una
aplicación, los métodos de la presente invención usan la
IL-28 o la IL-29 con mutación en
cisteína expresadas en la cepa W3110, que ha sido depositada en la
Colección Estadounidense de Cultivos de Tipos (American Type
Culture Collection, ATCC) como ATCC N.º 27325.
Cuando se requiere la producción a gran escala
de la IL-28 o la IL-29 con mutación
en cisteína usando el sistema de expresión de la presente
invención, puede utilizarse fermentación por lotes. Por lo general,
la fermentación por lotes comprende la preparación de un matraz de
siembra de primera etapa cultivando cepas de E. coli que
expresan la IL-28 o la IL-29 con
mutación en cisteína en un medio adecuado en un cultivo en matraz de
agitación para permitir el crecimiento hasta una densidad óptica
(optical density, OD) de entre 5 y 20 a 600 nm. Un medio adecuado
contendría nitrógeno de una o varias fuentes, tales como sulfato de
amonio, fosfato de amonio, cloruro de amonio, extracto de levadura,
proteínas animales hidrolizadas, proteínas vegetales hidrolizadas o
caseínas hidrolizadas. El fosfato se proporcionará a partir de
fosfato de potasio, fosfato de amonio, ácido fosfórico o fosfato de
sodio. Otros componentes serían cloruro de magnesio o sulfato de
magnesio, sulfato ferroso o cloruro ferroso y otros elementos
traza. El medio de crecimiento puede suplementarse con
carbohidratos, tales como fructosa, glucosa, galactosa, lactosa y
glicerol, para mejorar el crecimiento. Como alternativa, se utiliza
un cultivo por lote alimentado para generar un alto rendimiento de
proteína de la IL-28 o la IL-29 con
mutación en cisteína. Las cepas de E. coli productoras de la
IL-28 o la IL-29 con mutación en
cisteína se cultivan en condiciones similares a las descritas para
el recipiente de primera etapa utilizado para inocular una
fermentación por lotes.
Después de la fermentación, las células se
cosechan por centrifugación, se resuspenden en solución
amortiguadora de homogeneización y se homogeneizan, por ejemplo, en
un homogeneizador APV-Gaulin (Invensys APV,
Tonawanda, Nueva York) u otro tipo de equipo para alteración de
células, como un molinillo de vidrio o un sonicador. Como
alternativa, las células se toman directamente del fermentador y se
homogeneizan en un homogeneizador APV-Gaulin. La
preparación de cuerpos de inclusión lavados puede solubilizarse con
clorhidrato de guanidina (5-8 M) o urea
(7-8 M) con un agente de reducción como
betamercaptoetanol (10-100 mM) o ditiotreitol
(5-50 mM). Las soluciones pueden prepararse en
Tris, fosfato, HEPES u otras soluciones amortiguadoras adecuadas.
Los cuerpos de inclusión también pueden solubilizarse con urea
(2-4 M) que contenga lauril sulfato sódico
(0,1%-2%). En el proceso de recuperación de la IL-28
o la IL-29 con mutación en cisteína purificadas de
las cepas de E. coli huéspedes transformadas en las cuales
la IL-28 o la IL-29 con mutación en
cisteína se acumulan como cuerpos de inclusión refráctiles, se
alteran las células y los cuerpos de inclusión se recuperan por
centrifugación. Luego, se solubilizan los cuerpos de inclusión y se
los desnaturaliza en clorhidrato de guanidina 6 M que contiene un
agente reductor. Luego, la IL-28 o la
IL-29 con mutación en cisteína reducida se oxidan
en un paso de renaturalización controlada. La IL-28
o la IL-29 con mutación en cisteína replegada
pueden pasarse por un filtro para clarificarlas y remover la
proteína insoluble. Luego, la solución se pasa por un filtro para
clarificarla y remover la proteína insoluble. Después de que se ha
replegado y concentrado la proteína de la IL-28 o
la IL-29 con mutación en cisteína, la proteína de la
IL-28 o la IL-29 con mutación en
cisteína replegada se captura en solución amortiguadora diluida en
una columna de intercambio catiónico y se purifica mediante
cromatografía de interacción hidrófoba.
Las células cultivadas de mamíferos son
huéspedes adecuados dentro de la presente invención. Los métodos
para introducir ADN exógeno en células huésped de mamíferos
incluyen la transfección mediada por fosfato de calcio (Wigler
et al., Cell 14:725, 1978; Corsaro y Pearson,
Somatic Cell Genetics 7:603, 1981: Graham y Van der
Eb, Virology 52:456, 1973), la electroporación
(Neumann et al., EMBO J.
1:841-5, 1982), la transfección mediada por
DEAE-dextrano (Ausubel et al., ibid.)
y la transfección mediada por liposomas
(Hawley-Nelson et al., Focus 15:73, 1993;
Ciccarone et al., Focus 15:80, 1993, y vectores
virales (Miller y Rosman, BioTechniques
7:980-90, 1989; Wang y Finer, Nature
Med. 2:714-6, 1996). La producción de
polipéptidos recombinantes en células cultivadas de mamíferos ha
sido divulgada, por ejemplo, por Levinson et al., Patente de
EE. UU. N.º 4,713,339; Hagen et al., Patente de EE. UU. N.º
4,784,950; Palmiter et al., Patente de EE. UU. N.º
4,579,821; y Ringold, Patente de EE. UU. N.º 4,656,134. Las células
cultivadas de mamíferos adecuadas incluyen las líneas celulares
COS-1 (ATCC N.º CRL 1650), COS-7
(ATCC N.º CRL 1651), BHK (ATCC N.º CRL 1632), BHK 570 (ATCC N.º CRL
10314), 293 (ATCC N.º CRL 1573; Graham et al., J. Gen.
Virol. 36:59-72, 1977) y líneas
celulares de ovario de hámster chino (p. ej. CHO-K1,
ATCC N.º CCL 61). Existen otras líneas celulares adecuadas
conocidas en la especialidad y que pueden obtenerse a través de
depósitos públicos como la Colección Estadounidense de Cultivos de
Tipos (American Type Culture Collection), Manassas, VA. En general,
se prefieren los promotores de la transcripción fuertes, como los
promotores obtenidos del SV-40 o del
citomegalovirus. Véase, p. ej. la Patente de EE. UU. N.º 4,956,288.
Otros promotores adecuados incluyen los genes de la metalotioneína
(Patentes de EE. UU. N.º 4,579,821 y 4,601,978) y el principal
promotor tardío del adenovirus.
Generalmente, se utiliza la selección por
fármaco a fin de seleccionar células cultivadas de mamíferos en las
que se ha introducido ADN extraño. Dichas células suelen denominarse
"transfectantes". Las células que han sido cultivadas en
presencia del agente selectivo y pueden pasar el gen de interés a su
progenie se denominan "transfectantes estables". Un marcador
seleccionable preferido es un gen que codifica la resistencia al
antibiótico neomicina. La selección se realiza en presencia de un
fármaco del tipo de la neomicina, por ejemplo, el
G-418 o un fármaco similar. Los sistemas de
selección también pueden usarse para aumentar el nivel de expresión
del gen de interés, proceso conocido como "amplificación". La
amplificación se realiza cultivando transfectantes en presencia de
un nivel bajo del agente selectivo y luego aumentando la cantidad de
agente selectivo para seleccionar las células que producen altos
niveles de los productos de los genes introducidos. Un marcador
seleccionable amplificable preferido es la dihidrofolato reductasa,
que confiere resistencia al metotrexato. También pueden utilizarse
otros genes de resistencia a fármacos (p. ej. resistencia a la
higromicina, resistencia a múltiples fármacos, puromicina
acetiltransferasa). Los marcadores alternativos que introducen un
fenotipo alterado, como la proteína fluorescente verde o las
proteínas de superficie celular, como los CD4, los CD8, el MHC de
Clase I y la fosfatasa alcalina placentaria, pueden utilizarse para
diferenciar las células transfectadas de las no transfectadas por
medios tales como la clasificación FACS o la tecnología de
separación con perlas magnéticas.
También pueden utilizarse como huéspedes otras
células eucariotas superiores, incluidas células de origen vegetal,
células de insectos y células aviares. El uso de la Agrobacterium
rhizogenes como vector para expresar los genes en las células
de origen vegetal ha sido analizado por Sinkar et al., J.
Biosci. (Bangalore) 11:47-58,
1987. La transformación de células de insectos y la producción de
polipéptidos extraños en dichas células han sido divulgadas por
Guarino et al., Patente de EE. UU. N.º 5,162,222 y
Publicación de la WIPO WO 94/06463. Pueden infectarse células de
insectos con baculovirus recombinante, comúnmente derivados del
virus de la poliedrosis nuclear múltiple de la Autographa
californica (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus,
AcNPV). Véase King, L.A. y Possee, R.D., The Baculovirus
Expression System: A Laboratory Guide, Londres, Chapman &
Hall; O'Reilly, D.R. et al., Baculovirus Expression
Vectors: A Laboratory Manual, Nueva York, Oxford University
Press, 1994; y Richardson, C. D., ed., Baculovirus Expression
Protocols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana
Press, 1995. El segundo método para hacer baculovirus recombinantes
utiliza un sistema basado en transposones descrito por Luckow
(Luckow, V.A, et al., J Virol
67:4566-79, 1993). Este sistema se vende en
el equipo Bac-to-Bac (Life
Technologies, Rockville, MD). Este sistema utiliza un vector de
transferencia, pFastBac1^{TM} (Life Technologies), que contiene
un transposón Tn7 para trasladar el ADN que codifica el polipéptido
de la IL-28 o la IL-29 con mutación
en cisteína a un genoma de baculovirus mantenido en E. coli
como un gran plásmido denominado "bácmido". El vector de
transferencia pFastBac1^{TM} utiliza el promotor de la
poliedrina AcNPV para dirigir la expresión del gen de interés, en
este caso, la IL-28 o la IL-29 con
mutación en cisteína. Sin embargo, pFastBac1^{TM} puede
modificarse en un grado considerable. El promotor de la poliedrina
puede eliminarse y sustituirse con el promotor de la proteína básica
del baculovirus (conocido también como promotor Pcor, p6.9 o
MP), que se expresa más temprano en la infección por baculovirus y
se ha demostrado que es ventajoso para expresar proteínas
segregadas. Véase Hill-Perkins, M.S. y Possee,
R.D., J. Gen. Virol. 71:971-6, 1990; Bonning, B.C.
et al., J. Gen. Virol. 75:1551-6, 1994; y
Chazenbalk, G.D., y Rapoport, B., J. Biol. Chem.
270:1543-9, 1995. En tales constructos de vectores
de transferencia, puede utilizarse una versión corta o larga del
promotor de la proteína básica. Además, pueden construirse vectores
de transferencia que reemplacen las secuencias señal de secreción
originarias de la IL-28 o la IL-29
con secuencias señal de secreción derivadas de proteínas de
insectos. Por ejemplo, puede utilizarse una secuencia señal de
secreción de la ecdisteroide glucosiltransferasa (EGT), la melitina
de abeja melífera (Invitrogen, Carlsbad, CA) o el baculovirus gp67
(PharMingen, San Diego, CA) en constructos para reemplazar la
secuencia señal de secreción originaria de la IL-28
o la IL-29. Además, los vectores de transferencia
pueden incluir una fusión dentro del marco con ADN que codifica una
etiqueta de un epítopo en el C terminal o N terminal del
polipéptido de la IL-28 o la IL-29
con mutación en cisteína expresado, por ejemplo, una etiqueta de un
epítopo Glu-Glu (Grussenmeyer, T. et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82:7952-4, 1985).
Utilizando técnicas conocidas en la especialidad, un vector de
transferencia que contiene la IL-28 o la
IL-29 con mutación en cisteína se transforma en
E. coli, y se criba para detectar bácmidos, que contienen un
gen lacZ interrumpido que indica baculovirus recombinante. El ADN
del bácmido que contiene el genoma del baculovirus recombinante se
aísla utilizando las técnicas habituales, y se lo utiliza para
transfectar las células de Spodoptera frugiperda, p. ej. las
células de Sf9. Luego, se produce el virus recombinante que expresa
la IL-28 o la IL-29 con mutación en
cisteína. Se elaboran lotes de virus recombinante mediante métodos
utilizados comúnmente en la especialidad.
El virus recombinante se utiliza para infectar
las células huésped, habitualmente una línea celular derivada del
gusano cogollero de otoño, Spodoptera frugiperda. Véase, en
general, Glick y Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles
and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington,
D.C., 1994. Otra línea celular adecuada es la línea celular High
FiveO^{TM} (Invitrogen) derivada de Trichoplusia ni
(Patente de EE. UU. N.º 5,300,435).
Las células fúngicas, incluidas las células de
levaduras, también pueden utilizarse dentro de la presente
invención. Las especies de levaduras de interés en tal sentido
incluyen Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris y
Pichia methanolica. Los métodos para transformar células de
S. cerevisiae con ADN exógeno y producir polipéptidos
recombinantes a partir de ellas son divulgados, por ejemplo, por
Kawasaki, Patente de EE. UU. N.º 4,599,311; Kawasaki et al.,
Patente de EE. UU. N.º 4,931,373; Brake, Patente de EE. UU. N.º
4,870,008; Welch et al., Patente de EE. UU. N.º 5,037,743; y
Murray et al., Patente de EE. UU. N.º 4,845,075. Las células
transformadas se seleccionan por fenotipo determinado por el
marcador seleccionable, comúnmente la resistencia a los fármacos o
la capacidad de crecer en ausencia de un nutriente en particular
(p. ej. leucina). Un sistema de vectores preferido para usar en
Saccharomyces cerevisiae es el sistema de vectores
POT1 divulgado por Kawasaki et al. (Patente de EE. UU.
N.º 4,931,373), que permite seleccionar las células transformadas
por cultivo en un medio que contenga glucosa. Los promotores y
terminadores adecuados para usar en levaduras incluyen los de los
genes de enzimas glucolíticas (véase, p. ej. Kawasaki, Patente de
EE. UU. N.º 4,599,311; Kingsman et al., Patente de EE. UU.
N.º 4,615,974; y Bitter, Patente de EE. UU. N.º 4,977,092) y genes
de la alcohol deshidrogenasa. Véanse también las Patentes de EE. UU.
N.º 4,990,446; 5,063,154; 5,139,936 y 4,661,454. En la
especialidad, se conocen los sistemas de transformación para otras
levaduras, incluidas Hansenula polymorpha,
Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces
fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica,
Pichia guillermondii y Candida maltosa. Véanse, por
ejemplo, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol.
132:3459-65, 1986 y Cregg, Patente de EE. UU. N.º
4,882,279. Pueden utilizarse células de Aspergillus según los
métodos de McKnight et al., Patente de EE. UU. N.º
4,935,349. Los métodos para transformar Acremonium
chrysogenum han sido divulgados por Sumino et al.,
Patente de EE. UU. N.º 5,162,228. Los métodos para transformar
Neurospora son divulgados por Lambowitz, Patente de EE. UU.
N.º 4,486,533. El uso de Pichia methanolica como huésped para
la producción de proteínas recombinantes ha sido divulgado en las
Patentes de EE. UU. N.º 5,955,349, 5,888,768 y 6,001,597, Patente de
EE. UU. N.º 5,965,389 Patente de EE. UU. N.º 5,736,383 y Patente de
EE. UU. N.º 5,854,039.
Se prefiere purificar los polipéptidos y las
proteínas de la presente invención hasta una pureza de \geq80%;
más preferentemente, \geq90%; aún más preferentemente, \geq95%;
y particularmente se prefiere un estado farmacéuticamente puro, que
es una pureza mayor del 99,9% con respecto a las macromoléculas
contaminantes, en particular, otras proteínas y ácidos nucleicos, y
sin agentes infecciosos y pirogénicos. Preferentemente, un
polipéptido o una proteína purificados prácticamente no contienen
otros polipéptidos o proteínas, particularmente aquellos de origen
animal.
Las proteínas de la IL-28 o la
IL-29 con mutación en cisteína recombinante
expresadas (incluidos los polipéptidos quiméricos y las proteínas
multiméricas) se purifican mediante métodos convencionales de
purificación de proteínas, habitualmente mediante una combinación
de técnicas cromatográficas. Véanse, en general, Affinity
Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB
Biotechnology, Uppsala, Suecia, 1988; y Scopes, Protein
Purification: Principles and Practice,
Springer-Verlag, Nueva York, 1994. Las proteínas que
comprenden una etiqueta de afinidad de polihistidina (habitualmente
alrededor de 6 residuos de histidina) se purifican mediante
cromatografía de afinidad en una resina quelante de níquel. Véase,
por ejemplo, Houchuli et al., Bio/Technol. 6:
1321-1325, 1988. Las proteínas que comprenden una
etiqueta glu-glu pueden purificarse mediante
cromatografía de inmunoafinidad de acuerdo con los procedimientos
convencionales. Véase, por ejemplo, Grussenmeyer et al.,
supra. Las fusiones de proteínas de unión a maltosa se
purifican en una columna de amilosa de acuerdo con los métodos
conocidos en la especialidad.
Los polipéptidos de la IL-28 o
la IL-29 con mutación en cisteína también pueden
prepararse mediante síntesis química de acuerdo con los métodos
conocidos en la especialidad, entre los que se incluyen la síntesis
en fase sólida exclusiva, los métodos de fase sólida parcial, la
condensación de fragmentos o la síntesis de soluciones clásica.
Véanse, por ejemplo, Merrifield, J. Am. Chem. Soc.
85:2149, 1963; Stewart et al., Solid Phase Peptide
Synthesis (2.a edición), Pierce Chemical Co., Rockford, IL,
1984; Bayer y Rapp, Chem. Pept. Prot. 3:3, 1986; y Atherton
et al., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical
Approach, IRL Press, Oxford, 1989. La síntesis in vitro
resulta particularmente ventajosa para la preparación de
polipéptidos más pequeños.
Utilizando los métodos conocidos en la
especialidad, las proteínas de la IL-28 o la
IL-29 con mutación en cisteína pueden prepararse
como monómeros o multímeros; glucosilados o no glucosilados;
pegilados o no pegilados; proteínas de fusión y pueden incluir o no
un residuo de aminoácido metionina inicial. Los conjugados de la
IL-28 o la IL-29 con mutación en
cisteína utilizados para tratamiento pueden comprender fracciones
del polímero solubles en agua, farmacéuticamente aceptables. Se ha
demostrado que la conjugación de los interferones con polímeros
solubles en agua potencia la vida media del interferón en
circulación y reduce la inmunogenicidad del polipéptido (véase, por
ejemplo, Nieforth et al., Clin. Pharmacol. Ther.
59:636 (1996), Monkarsh et al., Anal. Biochem.
247:434 (1997)).
Los polímeros solubles en agua adecuados
incluyen polietilenglicol (PEG), monometoxi-PEG,
mono-(C1-C10)alcoxi-PEG,
ariloxi-PEG, poli-(N-vinil
pirrolidona)PEG, tresil monometoxi PEG, monometoxi PEG
propionaldehído, PEG propionaldehído, bis-succinimidil
carbonato PEG, homopolímeros del propilenglicol, un copolímero de
óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados
(p. ej. glicerol), monometoxi PEG butiraldehído, PEG
butiraldehído, monometoxi PEG acetaldehído, PEG acetaldehído,
metoxil PEG-succinimidil propionato, metoxil
PEG-succinimidil butanoato, alcohol polivinílico,
dextrano, celulosa u otros polímeros a base de carbohidratos. El PEG
adecuado puede tener un peso molecular de alrededor de 600 y
alrededor de 60.000, incluidos, por ejemplo, 5.000 daltons, 12.000
daltons, 20.000 daltons, 30.000 daltons y 40.000 daltons, que pueden
ser lineales o ramificados. Un conjugado de la
IL-28 o la IL-29 con mutación en
cisteína también puede comprender una mezcla de dichos polímeros
solubles en agua.
Un ejemplo de un conjugado de la
IL-28 o la IL-29 con mutación en
cisteína comprende una fracción de la IL-28 o la
IL-29 con mutación en cisteína y una fracción de
óxido de polialquilo unida al N terminal de la fracción de
la IL-28 o la IL-29 con mutación en
cisteína. El PEG es un óxido de polialquilo adecuado. A manera de
ejemplo, la IL-28 o la IL-29 con
mutación en cisteína pueden modificarse con PEG, proceso conocido
como "pegilación". La pegilación de la IL-28 o
la IL-29 con mutación en cisteína puede realizarse
mediante cualquiera de las reacciones de pegilación conocidas en la
especialidad (véanse, por ejemplo, EP 0 154 316, Delgado et
al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier
Systems 9:249 (1992), Duncan y Spreafico, Clin.
Pharmacokinet. 27:290 (1994) y Francis et al.,
Int J Hematol 68:1 (1998)). Por ejemplo, la pegilación
se puede realizar mediante una reacción de acilación o una reacción
de alquilación con una molécula de polietilenglicol reactiva. En un
enfoque alternativo, los conjugados de la IL-28 o la
IL-29 con mutación en cisteína se forman condensando
PEG activado, en el cual un grupo hidroxi o amino terminal del PEG
ha sido reemplazado por un ligador activado (véase, por ejemplo,
Karasiewicz et al., Patente de EE. UU. N.º 5,382,657).
La pegilación por acilación habitualmente
requiere hacer reaccionar un derivado éster activo del PEG con un
polipéptido de la IL-28 o la IL-29
con mutación en cisteína. Un ejemplo de un éster de PEG activado es
el PEG esterificado a N-hidroxisuccinimida. Tal como se lo
usa en la presente, el término "acilación" incluye los
siguientes tipos de ligadura entre la IL-28 o la
IL-29 con mutación en cisteína y un polímero soluble
en agua: amida, carbamato, uretano y similares. Los métodos para
preparar la IL-28 o la IL-29 con
mutación en cisteína pegilada por acilación habitualmente
comprenden los pasos de (a) hacer reaccionar un polipéptido de la
IL-28 o la IL-29 con mutación en
cisteína con PEG (por ejemplo, un éster reactivo de un derivado
aldehído del PEG) en condiciones en las cuales uno o más grupos PEG
se unen a la IL-28 o la IL-29 con
mutación en cisteína, y (b) obtener los productos de reacción. En
general, las condiciones de reacción óptimas para las reacciones de
acilación se determinan en función de los parámetros conocidos y los
resultados deseados. Por ejemplo, cuanto mayor sea la proporción de
PEG:IL-28 o IL-29 con mutación en
cisteína, mayor será el porcentaje de producto de
IL-28 o IL-29 con mutación en
cisteína polipegilado.
La pegilación por alquilación generalmente
implica hacer reaccionar un derivado aldehído terminal, p. ej.
propionaldehído, butiraldehído, acetaldehído, y similares, del PEG
con la IL-28 o la IL-29 con mutación
en cisteína en presencia de un agente reductor. Preferentemente,
los grupos PEG están unidos al polipéptido a través de un grupo
-CH_{2}-NH_{2}.
La derivatización mediante alquilación reductiva
para producir un producto monopegilado aprovecha la diferencia de
reactividad entre distintos tipos de grupos amino primarios
disponibles para la derivatización. Habitualmente, la reacción se
lleva a cabo a un pH que permite aprovechar las diferencias de pKa
entre los grupos \varepsilon-amino de los
residuos de lisina y el grupo \alpha-amino del
residuo N terminal de la proteína. Mediante dicha
derivatización selectiva se controla la unión de un polímero soluble
en agua que contiene un grupo reactivo, por ejemplo, un aldehído a
una proteína. La conjugación con el polímero se produce, en forma
predominante, en el N terminal de la proteína, sin que se
produzca una modificación significativa de otros grupos reactivos
como los grupos aminos de la cadena lateral de lisina.
La alquilación reductiva para producir una
población sustancialmente homogénea de moléculas de conjugados de
monopolímeros de la IL-28 o la IL-29
con mutación en cisteína puede abarcar los siguientes pasos: (a)
hacer reaccionar un polipéptido de la IL-28 o la
IL-29 con mutación en cisteína con un PEG reactivo
en condiciones de alquilación reductiva, a un pH adecuado para
permitir la modificación selectiva del grupo
\alpha-amino en el amino terminal de la
IL-28 o la IL-29 con mutación en
cisteína, y (b) obtener los productos de reacción. El agente
reductor utilizado para la alquilación reductiva debe ser estable en
solución acuosa y, preferentemente, debe ser capaz de reducir
únicamente la base de Schiff formada en el proceso inicial de
alquilación reductiva. Los agentes reductores preferidos incluyen
borohidruro sódico, cianoborohidruro sódico, dimetilamino borano,
trimetilamino borano y piridina borano.
Para una población sustancialmente homogénea de
conjugados de monopolímeros de la IL-28 o la
IL-29 con mutación en cisteína, las condiciones de
la reacción de alquilación reductiva son las que permiten la unión
selectiva de la fracción del polímero soluble en agua al N
terminal de la IL-28 o la IL-29 con
mutación en cisteína. Dichas condiciones de reacción, en general,
contemplan las diferencias de pKa entre los grupos amino de lisina
y el grupo \alpha-amino del N terminal. El
pH también afecta la proporción de polímero a proteína que se
utilizará. Por lo general, si el pH es más bajo, será deseable una
mayor proporción de polímero a proteína porque cuanto menos
reactivo sea el grupo \alpha del N terminal, más polímero
se necesita para lograr las condiciones óptimas. Si el pH es más
alto, no es necesario que la proporción
polímero:IL-28 o IL-29 con mutación
en cisteína sea tan grande porque hay más grupos reactivos
disponibles. Habitualmente, el pH está dentro del rango de 3 a 9 ó
3 a 6. Otro factor que debe tenerse en cuenta es el peso molecular
del polímero soluble en agua. En general, cuanto mayor es el peso
molecular del polímero, menor es la cantidad de moléculas de
polímero que pueden unirse a la proteína. Para las reacciones de
pegilación, el peso molecular habitual es de alrededor de 2 kDa y
alrededor de 100 kDa; alrededor de 5 kDa y alrededor de 50 kDa;
alrededor de 12 kDa y alrededor de 40 kDa, o alrededor de 20 kDa y
alrededor de 30 kDa. La proporción molar de polímero soluble en
agua a IL-28 o IL-29 con mutación en
cisteína se encuentra, en general, dentro del rango de entre 1:1 y
100:1. Habitualmente, la proporción molar de polímero soluble en
agua:IL-28 o IL-29 con mutación en
cisteína será de entre 1:1 y 20:1 para la polipegilación, y de
entre 1:1 y 5:1 para la monopegilación.
Los métodos generales para producir conjugados
que comprendan interferón y fracciones de polímero solubles en agua
son conocidos en la especialidad. Véanse, por ejemplo, Karasiewicz
et al., Patente de EE. UU. N.º 5,382,657, Greenwald et
al., Patente de EE. UU. N.º 5,738,846, Nieforth et al.,
Clin. Pharmacol. Ther. 59:636 (1996), Monkarsh et
al., Anal. Biochem. 247:434 (1997). Las especies
pegiladas pueden separarse de los polipéptidos de la
IL-28 o la IL-29 con mutación en
cisteína no conjugados por métodos de purificación estándar, por
ejemplo, diálisis, ultrafiltración, cromatografía de intercambio
iónico, cromatografía de afinidad, cromatografía de exclusión por
tamaño y similares.
Las moléculas de IL-29 con
mutación en cisteína de la presente invención son capaces de unirse
específicamente al receptor de la IL-28 y/o de
actuar como agente antiviral. La unión de polipéptidos de la
IL-29 con mutación en cisteína al receptor de la
IL-28 puede valorarse mediante enfoques
establecidos. Puede iodarse la IL-29 con mutación
en cisteína utilizando una perla de iodo (Pierce, Rockford, IL)
según las instrucciones del fabricante, y luego pueden utilizarse
la ^{125}I-IL-28 o la
^{125}I-IL-29 como se describe a
continuación.
En un primer enfoque, pueden combinarse
cincuenta nanogramos de
^{125}I-IL-29 con 1.000 ng de
proteína de fusión del receptor de la IL-28 con IgG
humana, en presencia o ausencia de posibles competidores por la
unión, incluida la IL-28 con mutación en cisteína,
la IL-29 con mutación en cisteína, la
IL-28 o la IL-29 no marcadas.
También se realizarían las mismas reacciones de unión sustituyendo
por fusiones de receptores de otras citocinas con IgG humana como
controles de especificidad. Después de la incubación a 4ºC, se
agrega proteína-G (Zymed, San Francisco, CA) a la
reacción, a fin de capturar las fusiones del receptor con la IgG y
las proteínas unidas a ellas, y las reacciones se incuban durante
una hora más a 4ºC. Luego se recolecta la sefarosa con proteína G,
se lava tres veces con PBS y se mide la
^{125}I-IL-29 unida con un
contador gamma (Packard Instruments, Downers Grove, IL).
En un segundo enfoque, puede valorarse la
capacidad de las moléculas de inhibir la unión de la
^{125}I-IL-29 a receptores unidos
en placa. Puede adsorberse un fragmento del receptor de la
IL-28, que representa el dominio de unión a
ligandos extracelular, a los pocillos de una placa de 96 pocillos
incubando 100 \mul de solución de receptor 1 g/ml en la placa de
un día para el otro. En una segunda forma, una fusión del receptor
con IgG humana puede unirse a los pocillos de una placa de 96
pocillos revestida con un anticuerpo dirigido contra la parte de
IgG humana de la proteína de fusión. Luego del recubrimiento de la
placa con el receptor, la placa se lava, se bloquea con SUPERBLOCK
(Pierce, Rockford, IL) y se lava nuevamente. Se agregan soluciones
que contengan una concentración fija de
^{125}I-IL-29 con o sin
concentraciones crecientes de posibles competidores por la unión
incluidas la IL-28 con mutación en cisteína, la
IL-29 con mutación en cisteína, la
IL-28 y la IL-29, y 100 \mul de
la solución a los pocillos adecuados de la placa. Después de una
hora de incubación a 4ºC se lava la placa y se determina la
cantidad de 125I-IL-28 ó
125I-IL-29 unida mediante conteo
(Topcount, Packard Instruments, Downers grove, IL). La
especificidad de la unión de la
125I-IL-28 o la
125I-IL-29 puede definirse por las
moléculas de receptor utilizadas en estas valoraciones de unión así
como por las moléculas utilizadas como inhibidores.
Además de la pegilación, puede acoplarse
genéticamente albúmina humana a un polipéptido de la presente
invención para prolongar su vida media. La albúmina humana es la
proteína sanguínea natural más prevalente en el sistema
circulatorio humano, y persiste en circulación en el cuerpo durante
más de veinte días. Las investigaciones han demostrado que las
proteínas terapéuticas fusionadas genéticamente con la albúmina
humana tienen vidas medias más prolongadas. Una proteína de fusión
de la IL28 o la IL29 con albúmina, como la pegilación, puede
brindar a los pacientes opciones de tratamiento de acción prolongada
que ofrecen un cronograma de administración más conveniente, con
eficacia y seguridad similares o mejores en comparación con los
tratamientos disponibles (Patente de EE. UU. N.º 6,165,470; Syed
et al., Blood, 89(9):3243-3253
(1997); Yeh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
89:1904-1908 (1992); y Zeisel et al.,
Horm. Res., 37:5-13 (1992)).
Como en el caso de la pegilación y la albúmina
humana antes mencionadas, puede fusionarse una porción Fc de la
molécula de IgG humana a un polipéptido de la presente invención. La
proteína de fusión resultante puede tener una mayor vida media en
circulación debido a la fracción Fc (Patente de EE. UU. N.º
5,750,375, Patente de EE. UU. N.º 5,843,725, Patente de EE. UU. N.º
6,291,646; Barouch et al., Journal of Immunology,
61:1875-1882 (1998); Barouch et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
97(8):4192-4197 (11 de abril de 2000) y Kim
et al., Transplant Proc.,
30(8):4031-4036 (Dec. 1998)).
Los métodos para la detección y el diagnóstico
de las infecciones virales son bien conocidos por los especialistas
en la materia. El método exacto utilizado para medir una reducción
del virus en respuesta a la administración de moléculas de la
presente invención dependerá de la especie de virus y de si la
infección es in vitro o in vivo. Si la infección es
in vivo, la medición y detección de la infección y los
cambios en los niveles de infección pueden variar según el sujeto
infectado, el tipo de infección viral y otras consideraciones
similares. Por ejemplo, los métodos incluyen, entre otros, la
medición de los cambios en los recuentos de células CD4, pruebas
serológicas, la medición del ADN del virus y del ARN del virus por
ensayos de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativos
convencionales y en tiempo real, niveles de anticuerpo inducidos
por el virus, inmunofluorescencia y ensayos con sustancias
inmunoabsorbentes unidas a enzimas, efectos citopáticos e
histología.
Los efectos antivirales pueden ser directos o
indirectos. Un ejemplo de un efecto antiviral directo es, por
ejemplo, cuando un polipéptido de la IL-28 o la
IL-29 con mutación en cisteína compite por un
receptor o correceptor viral para bloquear la infección viral. La
IL-28 o la IL-29 con mutación en
cisteína pueden administrarse por vía parenteral para prevenir la
infección viral o para reducir la replicación viral en curso y la
reinfección (Gayowski, T. et al., Transplantation
64:422-426, 1997). Un ejemplo de un efecto antiviral
indirecto es, por ejemplo, cuando la IL-28 o la
IL-29 con mutación en cisteína pueden unirse al
receptor de CD4 o a otro receptor leucocitario y exhibir efectos
antivirales al modular los efectos de la respuesta inmunitaria.
Resulta de particular interés el uso de la
IL-28 o la IL-29 con mutación en
cisteína como terapéutico antiviral para leucemias virales (HTLV),
SIDA (VIH) o infecciones virales gastrointestinales causadas, por
ejemplo, por rotavirus, calicivirus (p. ej. agente Norwalk) y
determinadas cepas de adenovirus patógenos, hepatitis B y C.
Otros tipos de infecciones virales para el uso
de la IL-28 o la IL-29 con mutación
en cisteína incluyen, a modo de ejemplo, infecciones virales
causadas por virus del ADN (p. ej. virus herpes, como el herpes
simple, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus;
virus eruptivos como el virus de la variola (viruela); hepadnavirus
(p. ej. virus de la hepatitis B); virus del papiloma; adenovirus);
virus del ARN (p. ej. VIH I, II; HTLV I, II; virus de la
poliomielitis; hepatitis A; coronovirus, tales como el del síndrome
respiratorio agudo súbito [sudden acute respiratory syndrome,
SARS]; ortomixovirus (p. ej. virus de la influenza); paramixovirus
(p. ej. virus del sarampión); virus de la rabia; virus de la
hepatitis C), flavivirus, virus de la influenza; calicivirus; virus
de la rabia, virus de la peste bovina, arena virus y similares.
Además, ejemplos de los tipos de enfermedades relacionadas con
virus para las cuales podría utilizarse la IL-28 o
la IL-29 con mutación en cisteína incluyen, a modo
de ejemplo, inmunodeficiencia adquirida, síndrome respiratorio agudo
severo (SARS); hepatitis; gastroenteritis; enfermedades
hemorrágicas; enteritis; carditis; encefalitis; parálisis;
bronquiolitis; enfermedad de las vías respiratorias superiores e
inferiores; papilomatosis respiratoria; artritis; enfermedad
diseminada, meningitis, mononucleosis. Además, la
IL-28 o la IL-29 con mutación en
cisteína pueden usarse en diversas aplicaciones para inmunoterapia
antiviral y junto con otras citocinas, otros antivirales proteicos o
de molécula pequeña y similares.
Clínicamente, las pruebas de diagnóstico para el
virus de la Hepatitis C (Hepatitis C Virus, HCV) incluyen
valoraciones serológicas para detectar anticuerpos y pruebas
moleculares para detectar partículas virales. Existen inmunoensayos
enzimáticos (Vrielink et al., Transfusion
37:845-849, 1997), pero es posible que se requiera
confirmación mediante pruebas adicionales como un ensayo con
inmunoblot (Pawlotsky et al., Hepatology
27:1700-1702, 1998). En general, las valoraciones
cualitativas y cuantitativas usan técnicas de reacción en cadena de
la polimerasa y se prefieren para evaluar la viremia y la respuesta
al tratamiento (Poynard et al., Lancet
352:1426-1432, 1998; McHutchinson et
al., N. Engl. J. Med. 339:1485-1492,
1998). Se dispone de varias pruebas comerciales, como por ejemplo,
RT-PCR cuantitativa (Amplicor HCV Monitor^{TM},
Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ) y un ensayo de
amplificación de señal de ADN (ácido desoxirribonucleico)
ramificado (Ensayo de ARN del HCV [bADN] Quantiplex^{TM}, Chiron
Corp., Emeryville, CA). Una prueba de laboratorio no específica
para la infección por HCV mide el nivel de alanina aminotransferasa
(ALT), es poco costosa y está fácilmente disponible (National
Institutes of Health Consensus Development Conference Panel,
Hepatology 26 (Suppl.
1):2S-10S, 1997). En general, se considera que
la evaluación histológica de la biopsia hepática es el medio más
exacto para determinar el avance del HCV (Yano et al.,
Hepatology 23:1334-1340, 1996). Para una revisión
de las pruebas clínicas para el HCV, véase, Lauer et al., N.
Engl. J. Med. 345:41-52, 2001.
Existen varios modelos in vivo para
probar el virus de la Hepatitis B (Hepatitis B Virus, HBV) y el HCV
conocidos por los especialistas en la materia. Con respecto al HCV,
por ejemplo, el modelo de HCV Replicon es un sistema basado en
células para estudiar la efectividad de un fármaco para inhibir la
replicación del HCV (Blight et al., Science,
290(5498):1972-1974 (8 de diciembre. de
2000); y Lohmann et al., Science,
285(5424):110-113 (2 de julio de 1999)).
Puede utilizarse un modelo de HBV in vitro bien conocido y
aceptado por los especialistas en la materia para determinar la
actividad contra el HBV de una molécula de prueba divulgado en
Korba et al., Antiviral Res.,
19(1):55-70 (1992) y Korba et al.,
Antiviral Res., 15(3):217-228
(1991).
Por ejemplo, los efectos de la
IL-28 o la IL-29 con mutación en
cisteína en los mamíferos infectados por el HBV pueden evaluarse
utilizando un modelo de marmota. En resumen, las marmotas con
infección crónica por el virus de hepatitis de la marmota
(woodchuck hepatitis virus, WHV) desarrollan hepatitis y carcinoma
hepatocelular que es similar a la enfermedad en los seres humanos
con infección crónica por HBV. El modelo ha sido utilizado para la
evaluación preclínica de la actividad antiviral. Se ha establecido
una cepa de WHV con infección crónica y se inoculan neonatos con el
suero para proporcionar animales para estudiar los efectos de
determinados compuestos con este modelo. (Para consultar una
revisión, véase Tannant et al., ILAR J. 42
(2):89-102, 2001). También pueden utilizarse
chimpancés para evaluar el efecto de la IL-28 o la
IL-29 con mutación en cisteína en los animales
infectados por HBV. Se realizó la caracterización del HBV utilizando
chimpancés y estos estudios demostraron que la enfermedad de los
chimpancés era notablemente similar a la enfermedad en los seres
humanos (Barker et al., J. Infect. Dis.
132:451-458, 1975 y Tabor et al.,
J. Infect. Dis. 147:531-534, 1983).
El modelo de chimpancé se ha utilizado para evaluar vacunas (Prince
et al., En: Vaccines 97, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1997). Las terapias para el VIH se prueban de
rutina utilizando primates no humanos infectados por el virus de la
inmunodeficiencia de simios (para consultar una revisión, véanse
Hirsch et al., Adv. Pharmcol.
49:437-477, 2000 y Nathanson et al.,
AIDS 13 (suppl. A):S113-S120,
1999). Para consultar una revisión sobre el uso de primates no
humanos en VIH, hepatitis, malaria, virus sincicial respiratorio y
otras enfermedades, véase Sibal et al., ILAR J.
42 (2):74-84, 2001. Un modelo de ratón
transgénico desarrollado recientemente (Guidotti et al.,
Journal of Virology 69:6158-6169,
1995) admite la replicación de altos niveles de HBV infeccioso y se
ha utilizado como modelo quimioterápico para la infección por HBV.
Se tratan ratones transgénicos con fármacos antivirales y se miden
los niveles de ADN y ARN del HBV en el hígado y el suero del ratón
transgénico después del tratamiento. También pueden medirse los
niveles de proteína del HBV en el suero del ratón transgénico
después del tratamiento. Se ha utilizado este modelo para evaluar la
efectividad de la lamivudina y el IFN-alfa para
reducir los títulos virales de HBV (Morrey et al.,
Antiviral Therapy 3:59-68, 1998).
Además, los polipéptidos y las proteínas de la
IL-29 con mutación en cisteína de la presente
invención pueden caracterizarse por su actividad, es decir, por
modulación de la proliferación, diferenciación, migración,
adhesión, expresión génica o metabolismo de los tipos celulares que
responden. La actividad biológica de los polipéptidos y las
proteínas de la IL-29 con mutación en cisteína se
valoran utilizando valoraciones in vitro o in vivo
diseñadas para detectar la proliferación, diferenciación, migración
o adhesión celular; o los cambios en la expresión génica o el
metabolismo celular (p. ej. la producción de otros factores de
crecimiento u otras macromoléculas). Se conocen en la especialidad
muchas valoraciones adecuadas, y las valoraciones representativas
se divulgan en la presente. Las valoraciones que utilizan células
cultivadas son las más convenientes para el cribaje, por ejemplo,
para determinar los efectos de las sustituciones, deleciones o
inserciones de aminoácidos.
La actividad de las proteínas de la
IL-28 o la IL-29 con mutación en
cisteína puede medirse in vitro utilizando células
cultivadas o in vivo administrando moléculas de la invención
reivindicada a un modelo animal adecuado. Las valoraciones que
miden la proliferación o diferenciación celular son bien conocidas
en la especialidad. Por ejemplo, las valoraciones que miden la
proliferación incluyen valoraciones tales como la quimiosensibilidad
al colorante rojo neutro (Cavanaugh et al.,
Investigational New Drugs 8:347-354,
1990), la incorporación de nucleótidos marcados radiactivamente
(como se divulga, p. ej. en Raines y Ross, Methods Enzymol.
109:749-773, 1985; Wahl et al.,
Mol. Cell Biol. 8:5016-5025, 1988; y
Cook et al., Analytical Biochem.
179:1-7, 1989), la incorporación de
5-bromo-2'-desoxiuridina
(BrdU) en el ADN de células proliferantes (Porstmann et al.,
J. Immunol. Methods 82:169-179, 1985),
y el uso de sales de tetrazolio (Mosmann, J. Immunol. Methods
65:55-63, 1983; Alley et al.,
Cancer Res. 48:589-601, 1988;
Marshall et al., Growth Reg.
5:69-84, 1995; y Scudiero et al.,
Cancer Res. 48:4827-4833, 1988). La
diferenciación puede valorarse utilizando células precursoras
adecuadas que puedan inducirse de modo tal que se diferencien en un
fenotipo más maduro. Las valoraciones que miden la diferenciación
incluyen, por ejemplo, la medición de marcadores de superficie
celular asociados con la expresión de un tejido específica de una
etapa, la actividad enzimática, la actividad funcional o los
cambios morfológicos (Watt, FASEB,
5:281-284, 1991; Francis,
Differentiation 57:63-75, 1994; Raes,
Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesses,
161-171, 1989; incorporados en la presente
por
referencia).
referencia).
La actividad de los polipéptidos de la
IL-28 o la IL-29 con mutación en
cisteína también puede detectarse mediante valoraciones diseñadas
para medir la producción inducida por la IL-28 y la
IL-29 de uno o más factores de crecimiento
adicionales o de otras macromoléculas. Se ha determinado que ciertos
miembros de la familia de proteínas que comprende la
IL-28 y la IL-29 aumentan las
cantidades de monocitos en circulación in vivo. La
activación de los monocitos es importante para la inmunidad innata y
adaptativa. Por ejemplo, se ha demostrado que la activación de los
monocitos estimula la presentación de antígenos por diversos
mecanismos. La presentación de antígenos promueve la activación y
la proliferación de las células T, tanto citotóxicas como
cooperadoras. La maduración y activación de las células dendríticas
también promueve la activación de las células T tanto en la
inmunidad innata como en la adaptativa. También se ha demostrado que
los aumentos en los monocitos y macrófagos activados aumentan la
actividad citolítica. Por ende, la IL-29 con
mutación en cisteína será útil como agente antiinfeccioso, para
aumentar las respuestas inmunitarias innatas, las mediadas por
células y las humorales. Se han observado aumentos en la tinción de
las moléculas de adhesión intercelular (intercellular adhesion
molecule, ICAM) en los monocitos CD14+, lo cual sugiere que la
IL-29 cumple una función en la activación de los
monocitos. Si bien los datos muestran que los miembros de la familia
promueven una respuesta antiviral a los virus, las bacterias y los
parásitos también pueden ser afectados.
Se realizan valoraciones de activación de
monocitos (1) para observar la capacidad de las proteínas de la
IL-28 o la IL-29 con mutación en
cisteína de estimular aun más la activación de monocitos, y (2) para
examinar la capacidad de las proteínas de la IL-28
o la IL-29 con mutación en cisteína de modular la
activación de monocitos inducida mediante unión o inducida mediante
endotoxinas (Fuhlbrigge et al., J. Immunol.
138: 3799-3802, 1987). Los niveles de
IL-1\alpha y TNF\alpha producidos en respuesta a
la activación se miden mediante ELISA (Biosource, Inc. Camarillo,
CA). Las células monocitos/macrófagos, en virtud del CD14 (receptor
de LPS), son intensamente sensibles a la endotoxina, y las proteínas
con niveles moderados de actividad similar a la de las endotoxinas
activarán estas células.
Los aumentos en los niveles de monocitos
sugieren que la IL-29 con mutación en cisteína puede
tener un efecto directo en las células progenitoras mieloides de la
médula ósea. La creciente diferenciación de las células
progenitoras mieloides en monocitos es esencial para restaurar la
inmunocompetencia, por ejemplo, después de la quimioterapia. Por
ende, la administración de la IL-29 con mutación en
cisteína a pacientes que reciben quimioterapia podría promover su
recuperación y su capacidad de resistir las infecciones comúnmente
asociadas con los regímenes de quimioterapia. Por ende, los
métodos para expandir las cantidades de monocitos o células
progenitoras de monocitos, ya sea mediante el cultivo de médula ósea
o de células de sangre periférica con las moléculas de la presente
invención, de modo tal que se produzca un aumento en los monocitos o
en las células progenitoras de monocitos para lograr este efecto
in vitro o ex vivo. Las presentes moléculas de la
presente invención pueden usarse para el tratamiento de un mamífero
que necesite un aumento en los monocitos o en las células
progenitoras de monocitos. El aumento en los monocitos y en las
células progenitoras de monocitos puede medirse por métodos
conocidos por clínicos, médicos y otros especialistas en la materia.
Los monocitos están incluidos en el linaje mieloide de las células
hematopoyéticas, por lo que los efectos en otras células de dicho
linaje no serían inusuales. Por ejemplo, cuando un factor facilita
la diferenciación o proliferación de un tipo de células en el
linaje mieloide o linfoide, esto puede afectar la producción de
otras células con una célula progenitora o precursora común.
La actividad hematopoyética de las proteínas de
la IL-28 o la IL-29 con mutación en
cisteína puede valorarse en diversas células hematopoyéticas en
cultivo. Las valoraciones preferidas incluyen valoraciones de
colonias de la médula ósea primarias y valoraciones de colonias
restringidas por el linaje de una etapa posterior, conocidas en la
especialidad (p. ej. Holly et al., Publicación de la WIPO WO
95/21920). Se siembran células de la médula ósea en un medio
semisólido adecuado (p. ej. 50% de metilcelulosa que contiene 15% de
suero bovino fetal, 10% de albúmina sérica bovina y 0,6% de mezcla
de antibióticos PSN) y se las incuba en presencia del polipéptido
de prueba, para luego examinarlas microscópicamente a fin de
analizar la formación de colonias. Se utilizan como controles
factores hematopoyéticos conocidos. La actividad mitogénica de los
polipéptidos de la IL-28 o la IL-29
con mutación en cisteína sobre las líneas de células hematopoyéticas
puede medirse según se divulgó anteriormente.
La migración celular se valora esencialmente
según lo divulgado por Kähler et al. (Arteriosclerosis,
Thrombosis, and Vascular Biology
17:932-939, 1997). Se considera que una
proteína es quimiotáctica si induce la migración de células de un
área de baja concentración de proteínas a un área de alta
concentración de proteínas. Se realiza una valoración típica
utilizando cámaras de Boyden modificadas con una membrana de
poliestireno que separa las dos cámaras (Transwell; Corning Costar
Corp.). La muestra de prueba, diluida en un medio que contiene BSA
al 1%, se agrega en la cámara más baja de una placa de 24 pocillos
que contiene Transwells. Luego, las células se colocan sobre el
inserto Transwell pretratado con gelatina al 0,2%. La migración
celular se mide después de 4 horas de incubación a 37ºC. Las
células que no migran se retiran de la parte superior de la
membrana Transwell, y las células adheridas a la cara inferior de la
membrana se fijan y tiñen con violeta cristal al 0,1%. A
continuación, se extraen las células teñidas con ácido acético al
10% y se mide la absorbancia a 600 nm. Luego, se calcula la
migración a partir de una curva de calibración estándar. La
migración celular también puede medirse utilizando el método
matrigel de Grant et al. ("Angiogenesis as a component of
epithelial-mesenchymal interactions" en Goldberg
y Rosen, Epithelial-Mesenchymal Interaction in
Cancer, Birkhäuser Verlag, 1995, 235-248; Baatout,
Anticancer Research 17:451-456, 1997).
La actividad de adhesión celular se valora
esencialmente según lo divulgado por LaFleur et al. (J.
Biol. Chem. 272:32798-32803, 1997). En
resumen, las placas de microtitulación se recubren con la proteína
de prueba, los sitios no específicos se bloquean con BSA, y las
células (como las células del músculo liso, los leucocitos o las
células endoteliales) se siembran a una densidad de aproximadamente
10^{4}-10^{5} células/pocillo. Los pocillos se
incuban a 37ºC (habitualmente durante alrededor de 60 minutos) y
luego se extraen las células no adherentes mediante un lavado
suave. Las células adheridas se cuantifican mediante métodos
convencionales (p. ej. tiñendo con violeta cristal, lisando las
células y determinando la densidad óptica del lisado). Los pocillos
de control se recubren con una proteína adhesiva conocida, como la
fibronectina o la vitronectina.
La expresión de los polinucléotidos de la
IL-28 o la IL-29 con mutación en
cisteína en animales proporciona modelos para estudiar en forma más
detallada los efectos biológicos de la sobreproducción o la
inhibición de la actividad de las proteínas in vivo. Pueden
introducirse polinucleótidos que codifican la IL-28
o la IL-29 y polinucleótidos no codificantes en
animales de prueba, como ratones, utilizando vectores virales o ADN
desnudo, o pueden producirse animales transgénicos.
Un enfoque in vivo para valorar las
proteínas de la presente invención utiliza sistemas de entrega
virales. Los ejemplos de virus para este fin incluyen el
adenovirus, virus herpes, retrovirus, virus de la variolovacuna y
virus adenoasociado (adeno-associated virus, AAV).
El adenovirus, un virus de ADN bicatenario, es actualmente el
vector de transferencia génica mejor estudiado para la entrega de
ácidos nucleicos heterólogos. Para consultar una revisión, véanse
Becker et al., Meth. Cell Biol.
43:161-89, 1994; y Douglas y Curiel,
Science & Medicine 4:44-53, 1997.
El sistema del adenovirus ofrece varias ventajas. El adenovirus
puede (i) aceptar insertos de ADN relativamente grandes; (ii) ser
cultivado hasta alcanzar títulos altos; (iii) infectar una amplia
gama de tipos celulares de mamíferos; y (iv) ser utilizado con
muchos promotores diferentes, incluidos los promotores ubicuos, los
específicos para determinados tejidos y los regulables. Dado que los
adenovirus son estables en el torrente sanguíneo, pueden
administrarse mediante inyección intravenosa. Véanse también, Wu
et al., J. Biol. Chem.
263:14621-14624, 1988; Wu et al.,
J. Biol. Chem. 267:963-967, 1992; y
Johnston y Tang, Meth. Cell Biol.
43:353-365, 1994.
También pueden generarse ratones transgénicos,
genomanipulados para expresar un gen de la IL-28 o
la IL-29 con mutación en cisteína, y ratones que
exhiben una ausencia completa de la función del gen de la
IL-28 o la IL-29 con mutación en
cisteína, denominados ratones genomanipulados o "knockout"
(Snouwaert et al., Science 257:1083, 1992),
(Lowell et al., Nature
366:740-742, 1993). Estos ratones pueden
utilizarse para estudiar el gen de la IL-28 o la
IL-29 con mutación en cisteína, y la proteína
codificada por este, en un sistema in vivo. Los promotores
preferidos para la expresión transgénica incluyen los promotores de
genes de la metalotioneína y la albúmina.
La mayoría de las citocinas, así como otras
proteínas producidas por los linfocitos activados, desempeñan una
función biológica importante en la diferenciación celular, la
activación, el reclutamiento y la homeostasis de las células en
todo el cuerpo. Se prevé que la IL-29 con mutación
en cisteína y los inhibidores de su actividad tendrán diversas
aplicaciones terapéuticas. Estas aplicaciones terapéuticas incluyen
el tratamiento de enfermedades que requieren regulación
inmunitaria, incluidas enfermedades autoinmunitarias como la
artritis reumatoide, la esclerosis múltiple, la miastenia grave, el
lupus eritematoso sistémico y la diabetes. La IL-29
puede ser importante en la regulación de la inflamación y, por lo
tanto, puede ser útil en el tratamiento de la artritis reumatoide,
el asma y la septicemia. Es posible que la IL-29
desempeñe una función en la mediación de la tumorigénesis, mientras
que un antagonista de la IL-29 con mutación en
cisteína podría ser de utilidad en el tratamiento del cáncer. Es
posible que la IL-29 sea de utilidad en la
modulación del sistema inmunitario, mientras que los antagonistas
de la IL-29 con mutación en cisteína podrían
utilizarse para reducir el rechazo de injertos, prevenir la
enfermedad injerto contra huésped, estimular la inmunidad a
enfermedades infecciosas, tratar a pacientes inmunocomprometidos
(p. ej. pacientes VIH+) o mejorar las vacunas.
Se ha demostrado que los integrantes de la
familia de proteínas de la presente invención tienen un efecto
antiviral similar al del interferón-\alpha. El
interferón ha sido aprobado en Estados Unidos para el tratamiento
de enfermedades autonimunitarias, condiloma acuminado, hepatitis C
crónica, carcinoma de vejiga, carcinoma cervical, papilomatosis
laríngea, micosis fungoide, hepatitis B crónica, sarcoma de Kaposi
en pacientes infectados con el virus de la inmunodeficiencia
humana, melanoma maligno, tricoleucemia y esclerosis múltiple.
Además, la IL-29 con mutación en cisteína puede
usarse para tratar formas de arterioesclerosis, tales como la
ateroesclerosis, inhibiendo la proliferación celular. En
consecuencia, la presente invención contempla el uso de proteínas,
polipéptidos y péptidos de la IL-29 con mutación en
cisteína que tengan la actividad de la IL-29 para la
fabricación de un medicamento para tratar dichas afecciones, así
como para la fabricación de un medicamento para tratar la
retinopatía. La presente invención también contempla el uso de
proteínas, polipéptidos y péptidos de la IL-29 con
mutación en cisteína que tengan la actividad de la
IL-29 para la fabricación de un medicamento para
tratar los trastornos linfoproliferativos, incluidos linfomas de
células B, leucemia linfocítica crónica, leucemia linfocítica
aguda, linfomas no Hodgkin, mieloma múltiple, leucemia mielocítica
aguda, leucemia mielocítica crónica.
También se ha demostrado que los interferones
inducen la expresión de antígenos por células cultivadas (véanse,
por ejemplo, Auth et al., Hepatology 18:546 (1993), Guadagni
et al., Int. J. Biol. Markers 9:53 (1994), Girolomoni et
al., Eur. J. Immunol. 25:2163 (1995) y Maciejewski et
al., Blood 85:3183 (1995). Esta actividad potencia la capacidad
de identificar nuevos antígenos asociados a tumores in vitro.
Además, la capacidad de los interferones de aumentar el nivel de
expresión de los antígenos tumorales humanos indica que los
interferones pueden ser útiles como adyuvantes para la
inmunoterapia o potenciar la inmunocentellografía con el uso de
anticuerpos contra antígenos tumorales (Guadagni et al.,
Cancer Immunol. Immunother. 26:222 (1988); Guadagni et al.,
Int. J. Biol. Markers 9:53 (1994)). Por ende, la presente invención
incluye el uso de proteínas, polipéptidos y péptidos de la
IL-28 o la IL-29 con mutación en
cisteína que tengan la actividad de la IL-28 y la
IL-29 como adyuvantes para inmunoterapia o para
mejorar la inmunocentellografía con el uso de anticuerpos contra
antígenos tumorales.
La actividad y el efecto de la
IL-28 o la IL-29 con mutación en
cisteína en el avance y la metástasis tumorales pueden medirse
in vivo. Se han desarrollado varios modelos de ratones
singénicos para estudiar la influencia de los polipéptidos,
compuestos u otros tratamientos en la progresión tumoral. En estos
modelos, células tumorales desarrolladas por pasaje en cultivo se
implantan en ratones de la misma cepa que el donante del tumor. Las
células se convertirán en tumores con características similares en
el ratón receptor, y también se producirá metástasis en algunos
modelos. Los modelos tumorales adecuados para nuestros estudios
incluyen el carcinoma pulmonar de Lewis (ATCC N.º
CRL-1642) y el melanoma B16 (ATCC N.º
CRL-6323), entre otros. Estos dos modelos son
líneas tumorales que se utilizan habitualmente, singénicas respecto
del ratón C57BL6, que se cultivan y manipulan fácilmente in
vitro. Los tumores resultantes de la implantación de cualquiera
de estas líneas celulares pueden hacer metástasis al pulmón en los
ratones C57BL6. El modelo de carcinoma pulmonar de Lewis se ha
utilizado recientemente en ratones para identificar un inhibidor de
la angiogénesis (O'Reilly MS, et al. Cell 79:
315-328,1994). Se tratan ratones C57BL6/J con un
agente experimental a través de una inyección diaria de una
proteína, un agonista o un antagonista recombinantes, o una
inyección por única vez de adenovirus recombinante. Tres días
después de este tratamiento, se implantan entre 10^{5} y 10^{6}
células debajo de la piel dorsal. Como alternativa, las células
pueden infectarse con el adenovirus recombinante, como por ejemplo,
uno que exprese la IL-28 y la IL-29
con mutación en cisteína, antes de la implantación, de forma tal
que la proteína se sintetice en el sitio tumoral o
intracelularmente, en lugar de sistémicamente. Normalmente, los
ratones desarrollan tumores visibles en el término de 5 días. Los
tumores se dejan crecer durante un período de hasta 3 semanas,
durante el cual pueden alcanzar un tamaño de entre 1.500 y 1.800
mm^{3} en el grupo que recibe el tratamiento de control. El
tamaño del tumor y el peso corporal se monitorean minuciosamente
durante todo el experimento. Al momento del sacrificio, el tumor se
extirpa y pesa junto con los pulmones y el hígado. Se ha observado
que el peso del pulmón se correlaciona bien con la masa tumoral
metastásica. Como medida adicional, se contabilizan las metástasis
en la superficie del pulmón. El tumor, los pulmones y el hígado
resecados se preparan para el examen histopatológico, la
inmunohistoquímica y la hibridación in situ, utilizando los
métodos conocidos en la especialidad y descritos en la presente. De
esta forma, puede evaluarse la influencia del polipéptido expresado
en cuestión, p. ej. la IL-28 y la
IL-29 con mutación en cisteína, en la capacidad del
tumor de reclutar vasculatura y sufrir metástasis. Además, aparte de
utilizar adenovirus, las células implantadas pueden transfectarse
transitoriamente con la IL-28 y la
IL-29 con mutación en cisteína. El uso de
transfectantes estables de la IL-28 o la
IL-29 con mutación en cisteína así como el uso de
promotores inducibles para activar la expresión de la
IL-28 o la IL-29 con mutación en
cisteína in vivo son conocidos en la especialidad y pueden
utilizarse en este sistema para evaluar la inducción de la
metástasis. Además, puede inyectarse directamente un medio
acondicionado con la IL-28 o la
IL-29 con mutación en cisteína purificado en este
modelo de ratón y así utilizarlo en este sistema. Para uso como
referencia general, véanse O'Reilly MS, et al. Cell
79:315-328, 1994; y Rusciano D, et al.
Murine Models of Liver Metastasis. Invasion Metastasis
14:349-361, 1995.
La IL-28 o la
IL-29 con mutación en cisteína también pueden
utilizarse para tratar la miocarditis, un trastorno que surge
cuando el corazón está comprometido en un proceso inflamatorio. Se
considera que después de una infección con virus, bacterias, hongos
o parásitos, se producen la infiltración de linfocitos y la
miocitólisis (véase, por ejemplo, Brodison et al., J.
Infection 37:99 (1998)). La IL-28 o la
IL-29 con mutación en cisteína pueden inyectarse
por vía intravenosa o subcutánea para tratar las infecciones
asociadas con la miocarditis. La IL-28 o la
IL-29 con mutación en cisteína también pueden
administrarse por vía intravenosa como citocinas inmunorreguladoras
en el tratamiento de la miocarditis autoinmune. Las dosis de
interferón pueden extrapolarse utilizando un modelo de miocarditis
autoinmune en el ratón A/J (Donermeyer, et al., J. Exp.
Med. 182:1291 (1995)).
Informes recientes han destacado la función de
los interferones tipo I en la prevención de la diabetes inducida
por virus mediante la inducción de un fuerte estado antiviral en las
células beta pancreáticas en las primeras etapas de la infección
viral (Flodstroem et al., Nature Immunology 3,
373-382 (2002)). Esto impide la pérdida de células
beta debido a la muerte celular inducida por virus y la
autoinmunidad que la acompaña. La IL-28 o la
IL-29 con mutación en cisteína también inducen un
estado antiviral en las células que expresan el receptor de la
IL-28. El receptor de la IL-28 se
expresa altamente en el tejido pancreático y, por ende, es posible
que la IL-28 y la IL-29 cumplan una
función en la prevención de la diabetes debida a la muerte de las
células beta inducida por virus. Además, la función de los
interferones tipo I en la prevención de la diabetes inducida por
virus puede ampliarse a otras enfermedades autoinmunitarias
inducidas por virus y, por lo tanto, la IL-28 y la
IL-29 también pueden cumplir una función en la
prevención de otras enfermedades tales como esclerosis muscular,
lupus y enfermedades autoinmunitarias inducidas por virus en tejidos
que expresan el receptor de la IL-28.
Los polipéptidos de la IL-28 o
la IL-29 con mutación en cisteína pueden
administrarse solos o en combinación con otros agentes
vasculogénicos o angiogénicos, incluido el VEGF. Al utilizar la
IL-28 o la IL-29 con mutación en
cisteína en combinación con un agente adicional, los dos compuestos
pueden administrarse en forma simultánea o secuencial, según sea
adecuado para la afección específica que se tratará.
La IL-28 o la
IL-29 con mutación en cisteína serán de utilidad en
el tratamiento de la tumorigénesis y, por lo tanto, serán útiles en
el tratamiento del cáncer. Una IL-28 puede inhibir
las líneas de tumores de células B, lo que sugiere que es posible
que exista un beneficio terapéutico en el tratamiento de pacientes
con la IL-28 o la IL-29 con
mutación en cisteína, a fin de inducir las células de tumores de
células B a un estado menos proliferativo. El ligando podría
administrarse en combinación con otros agentes que ya se utilizan,
incluidos los agentes quimioterápicos convencionales y los
inmunomoduladores como el interferón alfa. Se ha demostrado que los
interferones alfa/beta son efectivos en el tratamiento de algunas
leucemias y modelos de enfermedad en animales, y los efectos
inhibidores del crecimiento del interferón-alfa y la
IL-28 o la IL-29 con mutación en
cisteína pueden ser aditivos para las líneas celulares derivadas de
tumores de células B.
Dentro de otro aspecto, la presente invención
proporciona una formulación farmacéutica que comprende un
polipéptido aislado seleccionado del grupo que consiste en las SEC.
ID. N.º 27, 29, 40, 41, 83, 85, 87, 89, 95, 97, 103, 105, 111, 113,
139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 y 161, y un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
Para uso farmacéutico, las proteínas de la
IL-29 con mutación en cisteína se formulan para
administración tópica o parenteral, en particular intravenosa o
subcutánea, de acuerdo con los métodos convencionales. En general,
las formulaciones farmacéuticas incluirán un polipéptido de la
IL-29 con mutación en cisteína en combinación con
un vehículo farmacéuticamente aceptable, como solución salina,
solución salina amortiguada, dextrosa al 5% en agua, o similares.
Las formulaciones también pueden incluir uno o más excipientes,
conservantes, solubilizantes, agentes amortiguadores, albúmina para
prevenir la pérdida de proteínas en las superficies de los viales,
etc. Los métodos de formulación son bien conocidos en la
especialidad y han sido divulgados, por ejemplo, por
Remington: The Science and Practice of Pharmacy,
Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 19.ª ed., 1995.
Preferentemente, la IL-29 con mutación en cisteína
se utilizará en una concentración de entre aproximadamente 10 y 100
\mug/ml del volumen total, aunque pueden utilizarse
concentraciones dentro del rango de entre 1 ng/ml y 1.000
\mug/ml. Para la aplicación tópica, por ejemplo, para promover la
cicatrización de heridas, la proteína se aplicará dentro del rango
de entre 0,1 y 10 \mug/cm^{2} del área de la herida; la dosis
exacta será determinada por el médico clínico de acuerdo con los
estándares aceptados, teniendo en cuenta la naturaleza y gravedad
de la afección tratada, las características del paciente, etc. La
determinación de la dosis está dentro de los conocimientos
generales de la materia. Las dosis se administran todos los días o
en forma intermitente durante el período de tratamiento. La
administración intravenosa se realizará mediante inyección o
infusión en bolo durante un período típico, que durará entre una y
varias horas. También pueden utilizarse formulaciones de liberación
prolongada. En general, una cantidad terapéuticamente efectiva de la
IL-29 con mutación en cisteína es una cantidad
suficiente para producir un cambio significativo desde el punto de
vista clínico en la afección tratada, como por ejemplo, un cambio
significativo desde el punto de vista clínico en la carga viral o
en la función inmunitaria, una reducción significativa en la
morbilidad o un aumento significativo en el índice
histológico.
histológico.
A manera de ejemplo, las formulaciones
farmacéuticas pueden proporcionarse como un equipo que comprenda un
envase que incluya un polipéptido de la IL-29 de la
presente invención. Los polipéptidos terapéuticos pueden
proporcionarse en forma de una solución inyectable para una dosis
única o para múltiples dosis, o como un polvo estéril que será
reconstituido antes de la inyección. Como alternativa, dicho equipo
puede incluir un dispersante de polvo seco, un generador de aerosol
líquido o un nebulizador para la administración de un polipéptido
terapéutico. Dicho equipo puede además comprender información
escrita sobre las indicaciones y el uso de la composición
farmacéutica. Además, dicha información puede incluir una
declaración de que la formulación del polipéptido de la
IL-29 está contraindicada para pacientes con
hipersensibilidad conocida al polipéptido de la
IL-29.
Un método para producir un anticuerpo contra un
polipéptido comprende: inocular a un animal con un polipéptido
seleccionado del grupo que consiste en las SEC. ID. N.º 27, 29, 40,
41, 83, 85, 87, 89, 95, 97, 103, 105, 111, 113, 139, 141, 143, 145,
147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 y 161, donde el polipéptido
produce una respuesta inmunitaria en el animal para producir el
anticuerpo; y aislar el anticuerpo del animal. Dentro de otro
aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo (p. ej.
anticuerpo neutralizante) producible por el método divulgado
anteriormente, donde el anticuerpo se une a un polipéptido
seleccionado del grupo que consiste en las SEC. ID. N.º 27, 29, 40,
41, 83, 85, 87, 89, 95, 97, 103, 105, 111, 113, 139, 141, 143, 145,
147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 y 161. En una aplicación, el
anticuerpo divulgado anteriormente se une específicamente a un
polipéptido seleccionado del grupo que consiste en las SEC. ID. N.º
27, 29, 40, 41, 83, 85, 87, 89, 95, 97, 103, 105, 111, 113, 139,
141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 y 161. Dentro de
otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo o
fragmento de anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido
descrito en la presente. En una aplicación, el anticuerpo se
selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo policlonal, un
anticuerpo monoclonal murino, un anticuerpo humanizado derivado de
un anticuerpo monoclonal murino, un fragmento de anticuerpo y un
anticuerpo monoclonal humano. En una aplicación, el fragmento de
anticuerpo es como se describe en la presente, donde dicho fragmento
de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en
F(ab'), F(ab), Fab', Fab, Fv, scFv y la unidad mínima
de reconocimiento.
Dentro de otro aspecto, la presente invención
proporciona un anticuerpo antiidiotipo que se une específicamente
al anticuerpo según se describe en la presente.
Tal como se lo usa en la presente, el término
"anticuerpos" incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos
monoclonales, fragmentos de unión a antígenos de estos, como los
fragmentos F(ab')_{2} y Fab, anticuerpos de una sola
cadena, y similares, incluidos los anticuerpos genomanipulados.
Pueden humanizarse anticuerpos no humanos injertando regiones
determinantes de complementariedad
(complementarity-determining region, CDR) no
humanas en regiones marco y constantes humanas, o incorporando la
totalidad de los dominios variables no humanos (opcionalmente
"rodeándolos" con una superficie similar a la humana mediante
el reemplazo de los residuos expuestos, donde el resultado es un
anticuerpo "revestido"). En algunos casos, los anticuerpos
humanizados pueden retener residuos no humanos dentro de los
dominios marco de la región variable humana, a fin de potenciar las
características de unión adecuadas. A través de la humanización de
los anticuerpos, puede aumentarse la vida media biológica y se
reduce la posibilidad de que se produzcan reacciones inmunitarias
adversas en la administración a seres humanos. Un especialista en
la materia puede generar anticuerpos humanizados con dominios
constantes específicos y diferentes (es decir, subclases de Ig
diferentes) para facilitar o inhibir diversas funciones
inmunitarias asociadas con dominios constantes de anticuerpos en
particular. Se dice que los anticuerpos se unen específicamente si
se unen a un polipéptido o una proteína de la IL-29
con mutación en cisteína con una afinidad, al menos, 10 veces mayor
que la afinidad de unión al polipéptido o la proteína de control (de
la IL-29 sin mutación en cisteína). Una persona con
conocimientos generales de la materia puede determinar con
facilidad la afinidad de un anticuerpo monoclonal (véase, por
ejemplo, Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:
660-672, 1949).
Los métodos para preparar anticuerpos
policlonales y monoclonales son bien conocidos en la especialidad
(véase, por ejemplo, Hurrell, J. G. R., Ed., Monoclonal Hybridoma
Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca
Ratón, FL, 1982, que se incorpora en la presente por referencia). El
inmunógeno del polipéptido puede ser una molécula de longitud
completa o una porción de esta. Si la porción del polipéptido es de
"tipo hapteno", dicha porción puede unirse o ligarse
ventajosamente a un vehículo macromolecular (como la hemocianina de
lapa californiana (keyhole limpet hemocyanin, KLH), la albúmina de
suero bovino (bovine serum albumin, BSA) o el toxoide tetánico)
para inmunización.
Puede utilizarse una serie de valoraciones
conocidas para los especialistas en la materia para detectar
anticuerpos que se unan específicamente a los polipéptidos de la
IL-29 con mutación en cisteína. Se describen
detalladamente ejemplos de valoraciones en Using Antibodies: A
Laboratory Manual, Harlow y Lane (ed.), Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1999. Los ejemplos representativos de dichas
valoraciones incluyen: inmunoelectroforesis concurrente,
radioinmunoensayos, radioinmunoprecipitados, ensayos con sustancias
inmunoabsorbentes unidas a enzimas (enzyme-linked
immunosorbent assays, ELISA), ensayos de transferencia puntual,
análisis Western blot, valoraciones de inhibición o competencia, y
ensayos tipo sándwich.
Para determinadas aplicaciones, incluidos usos
diagnósticos in vitro e in vivo, es ventajoso utilizar
anticuerpos marcados. Los marcadores o etiquetas directos adecuados
incluyen: radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores,
inhibidores, marcadores fluorescentes, marcadores
quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares; los
marcadores o etiquetas indirectos pueden incluir el uso de
biotina-avidina u otros pares de
complemento/anticomplemento como intermediarios. Los anticuerpos de
la presente invención también pueden conjugarse directa o
indirectamente con fármacos, toxinas, radionúclidos y similares, y
estos conjugados pueden utilizarse para aplicaciones diagnósticas o
terapéuticas in vivo (p. ej. inhibición de la proliferación
celular). Véase, en general, Ramakrishnan et al., Cancer Res.
56:1324-1330, 1996.
Se ejemplifica aun más la presente invención a
través de los siguientes ejemplos no limitantes.
Se construyó un plásmido de expresión que
contenía zcyto20 y zcyto21 mediante recombinación homóloga. Se
generaron fragmentos de ADNc de zcyto20 y zcyto21 con amplificación
mediante PCR. Los cebadores de la PCR fueron los siguientes:
zcyto20/pZMP21: zc40923, y zc43152 SEC. ID. N.º
42 y 43, respectivamente; y zcyto21/pZMP21: zc40922, y zc43153 SEC.
ID. N.º 2 y 73, respectivamente.
La mezcla de reacción PCR se pasó por un gel de
agarosa al 1% y se extrajo una banda correspondiente al tamaño del
inserto con gel utilizando equipo de extracción con gel
QIAquick^{TM} Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA).
El plásmido pZMP21, que se cortó con BglII, se
utilizó para la recombinación con el fragmento de inserto de PCR.
El plásmido pZMP21 es un vector de expresión en mamíferos que
contiene un casete de expresión que tiene el promotor del virus del
sarcoma mieloproliferativo (myeloproliferative sarcoma virus, MPSV)
y múltiples sitios de restricción para la inserción de secuencias
codificantes; un origen de replicación de E. coli; una
unidad de expresión de marcadores seleccionables de mamíferos que
comprende un promotor, un potenciador y un origen de replicación
del SV40, un gen DHFR y el terminador del SV40; y las secuencias de
URA3 y CEN-ARS necesarias para la selección y
replicación en S. cerevisiae. Fue construido a partir del
pZP9 (depositado en la Colección Estadounidense de Cultivos de
Tipos, 10801 University Boulevard, Manassas, VA
20110-2209, con el N.º de Acceso 98668) con los
elementos genéticos de levaduras tomados del pRS316 (depositado en
la Colección Estadounidense de Cultivos de Tipos, 10801 University
Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, con el N.º de
Acceso 77145), un elemento de sitio de ingreso de ribosomas interno
(internal ribosome entry site, IRES) del virus de la poliomielitis,
y el dominio extracelular de la CD8 truncado en el extremo C
terminal del dominio transmembrana.
Se combinaron independientemente 100 microlitros
de células de levadura competentes (S. cerevisiae) con 10
\mul del ADN del inserto y 100 ng del vector pZMP21 cortado
mencionado más arriba, y se transfirió la mezcla a una cubeta de
electroporación de 0,2 cm. Las mezclas de levadura/ADN se
electropulsaron utilizando configuraciones de alimentación
eléctrica (BioRad Laboratories, Hercules, CA) de 0,75 kV (5 kV/cm),
\infty ohmios y 25 \muF. Se agregaron 600 \mul de sorbitol
1,2 M a la cubeta, y se sembró la levadura en una alícuota de 100
\mul y una de 300 \mul en dos placas de URA-D y
se las incubó a 30ºC. Después de aproximadamente 72 horas, los
transformantes de levadura Ura+ de una sola placa se resuspendieron
en 1 ml de H_{2}O y se los centrifugó brevemente para obtener un
sedimento de células de levadura. Luego, se resuspendió el sedimento
celular en 0,5 ml de solución amortiguadora de lisis (Triton
X-100 al 2%; SDS al 1%; NaCl 100 mM; Tris 10 mM, pH
8,0; EDTA 1 mM). Se agregaron los 500 microlitros de la mezcla de
lisis en un tubo Eppendorf que contenía 250 \mul de perlas de
vidrio lavadas con ácido y 300 \mul de
fenol-cloroformo, se los mezcló en vórtex durante 3
minutos, y se los centrifugó durante 5 minutos en una centrifugadora
Eppendorf a la velocidad máxima. Se transfirieron 300 microlitros
de la fase acuosa a un tubo nuevo y se precipitó el ADN con 600
\mul de etanol (EtOH), y 30 \mul de acetato de sodio 3 M,
seguido de centrifugación durante 30 minutos a la velocidad máxima.
El sedimento de ADN se resuspendió en 30 \mul de TE.
Se realizó la transformación de células huésped
de E. coli electrocompetentes (MC1061) con 5 \mul de la
preparación de ADN de levadura y 50 \mul de células. Las células
se electropulsaron a 2,0 kV, 25 \muF y 400 ohmios. Después de la
electroporación, se agregó 1 ml de SOC (triptona Bacto^{TM} al 2%
(Difco, Detroit, MI), extracto de levadura al 0,5% (Difco), NaCl 10
mM, KCl 2,5 mM, MgCl_{2} 10 mM, MgSO_{4} 10 mM, glucosa 20 mM)
y luego se sembraron las células en una alícuota de 50 \mul y 200
\mul en dos placas con LB/Amp (caldo de LB (Lennox), agar
Bacto^{TM} al 1,8% (Difco), ampicilina 100 mg/l).
Se sometieron los insertos de tres clones por
constructo a análisis de secuencia y se seleccionó un clon de cada
constructo, que contenía la secuencia correcta. El ADN plasmídico en
mayor escala se aisló utilizando un equipo disponible
comercialmente (QIAGEN Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA) de
acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los constructos
correctos se denominaron zcyto20/pZMP21 y zcyto21/pZMP21.
Se digirieron 200 \mug de un constructo de
zcyto20/pZMP21 y zcyto21/pZMP21 con 200 unidades de Pvu I a 37ºC
durante tres horas y luego se precipitaron con IPA y se
centrifugaron en un tubo para Microfuge de 1,5 ml. Se extrajo el
sobrenadante del sedimento por decantación, y se lavó el sedimento
con 1 ml de etanol al 70% y se dejó incubar durante 5 minutos a
temperatura ambiente. Se centrifugó el tubo en una Microfuge durante
10 minutos a 14.000 RPM y el sobrenadante se aspiró para separarlo
del sedimento. El sedimento se resuspendió en 750 \mul de medio
PF-CHO en un ambiente estéril, y se dejó incubar a
60ºC durante 30 minutos. Se centrifugaron las células CHO y se
resuspendieron utilizando la solución de medio de ADN. Se colocó la
mezcla de ADN/células en una cubeta con una abertura de 0,4 cm y se
electroporó con los siguientes parámetros: 950 \muF, alta
capacitancia y 300 V. Luego se retiró el contenido de la cubeta, se
diluyó a 25 ml con medio PF-CHO y se colocó en un
matraz de agitación de 125 ml. El matraz se colocó en una incubadora
en un agitador a 37ºC, CO2 al 6% y con agitación a 120 RPM.
Se produjo la proteína recombinante zcyto20
(IL-28A) a partir de un agrupamiento de líneas
celulares DXB11-CHO. Los cultivos se cosecharon y
los medios se filtraron en forma estéril con un filtro de 0,2
\mum.
La purificación de la proteína
zcyto20-CHO se logró mediante el uso secuencial de
una columna Poros HS 50 (Applied Biosystems, Framingham, MA), una
columna monolítica de intercambio catiónico débil (weak cation
exchange, WCX) (Isco, Inc., Lincoln, NE), una columna ToyoPearl
Butyl 650S (TosoH, Montgomeryville, PA) y una columna Superdex 75
(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Los medios de cultivo de
DXB111-CHO se ajustaron a pH 6,0 antes de cargarlos
en una columna Poros 50 HS. La columna se lavó con MES 50 mM (ácido
2-morfolinoetanosulfónico), NaCl 100 mM, pH 6 y la
proteína unida se eluyó con un gradiente lineal de 10 volúmenes de
columna (column volumes, CV) a 60% de MES 50 mM, NaCl 2 M, pH 6. Se
recolectaron las fracciones de elución y se confirmó la presencia
de la proteína zcyto20 mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (sodium dodecyl
sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,
SDS-PAGE) con tinción Coomassie. Se agruparon estas
fracciones que contenían la proteína zcyto20, se diluyeron con agua
destilada doble a una conductividad de alrededor de 20 mS y se
cargaron en una columna monolítica de WCX. Se lavó la columna con
93% de MES 50 mM, NaCl 100 mM, pH 6, y 7% de MES 50 mM, NaCl 2 M,
pH 6. La proteína unida se eluyó con un gradiente lineal de 25 CV
del 7% al 50% de MES 50 mM, NaCl 2 M, pH 6. Se recolectaron las
fracciones de elución y se confirmó la presencia de la proteína
zcyto20 mediante SDS-PAGE con tinción Coomassie. Se
agruparon las fracciones que contenían la proteína zcyto20, se
ajustaron a sulfato de amonio 1 M y se cargaron en una columna
ToyoPearl Butyl 650S. Se eluyó la zcyto20 con un gradiente de
sulfato de amonio decreciente y las fracciones que contenían la
zcyto20 pura se agruparon y se concentraron para inyección en una
columna Superdex 75. Las fracciones que contenían proteína zcyto20
de la columna de filtración de gel se agruparon, se concentraron, se
filtraron por un filtro de 0,2 \mum y se congelaron a -80ºC. La
concentración de la proteína final purificada se determinó mediante
valoración BCA (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) y análisis de
aminoácidos por cromatografía líquida de alto rendimiento (high
performance liquid chromatography, HPLC).
Se analizó la proteína zcyto20 recombinante por
SDS-PAGE (Nupage Bis-Tris al 4%-12%,
Invitrogen, Carlsbad, CA) y Western blot utilizando la IgG contra
la zcyto21-CEE-BV de conejo como
anticuerpo primario que reacciona en forma cruzada con la proteína
zcyto20-CHO. Se sometió el gel a electroforesis con
una minicelda Xcell II de Invitrogen (Carlsbad, CA) y se transfirió
a una membrana de nitrocelulosa de 0,2 \mum
(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) con el módulo
de transferencia puntual Xcell II de Invitrogen según las
indicaciones proporcionadas en el manual del instrumento. La
transferencia se realizó a 500 mA durante 50 minutos en solución
amortiguadora que contenía base Tris 25 mM, glicina 200 mM y
metanol al 20%. La membrana se bloqueó con leche desnatada en polvo
al 10% en 1xPBS durante 10 minutos y luego se sondó con el
anticuerpo primario en 1xPBS con leche desnatada en polvo al 2,5%.
Se marcó el punto durante una hora a temperatura ambiente mientras
se agitaba. Para la marcación del anticuerpo secundario, se lavó el
punto tres veces durante 10 minutos cada una con PBS y luego se
sondó con IgG anticonejo de cabra-HRP (Pierce
Chemical Co., Rockford, IL) durante una hora. Se lavó el punto tres
veces con 1xPBS durante 10 minutos cada una, se reveló con una
mezcla 1:1 de reactivos SuperSignal® ULTRA (Pierce Chemical Co.,
Rockford, IL) y la señal se capturó con un
Lumi-Imager (Boehringer Mannheim GmbH,
Alemania).
La proteína zcyto20 purificada del medio CHO
migró en forma predominante como doblete a aproximadamente 20 kDa y
un dímero triplete menor a 38 kDa en un gel Bis-Tris
al 4%-12% en condiciones de no reducción. Todos colapsaron en una
sola banda de 20 kDa en condiciones de reducción. El mapeo del
péptido por MS indicó una mezcla de dos isómeros con respecto a las
uniones disulfuro y la presencia de un sitio de glucosilación ligado
a O.
Se produjo zcyto21 recombinantes a partir de
líneas celulares DXB11-CHO estables. Los cultivos se
cosecharon y los medios se filtraron en forma estéril con un filtro
de 0,2 \mum. Las proteínas se purificaron de los medios
acondicionados comenzando con una combinación de cromatografía de
intercambio catiónico y aniónico seguida de una cromatografía de
interacción hidrófoba y una cromatografía de exclusión por tamaño.
Los medios de cultivo de DXB111-CHO se ajustaron a
pH 6,0 antes de cargarlos en una columna Poros 50 HS (Applied
Biosystems, Framingham, MA). La columna se lavó con 1xPBS, pH 6 y
la proteína unida se eluyó con 5xPBS, pH 8,4. Se recolectó la
fracción de elución y se confirmó la presencia de la proteína
zcyto21 mediante SDS-PAGE con tinción Coomassie.
Esta fracción luego se diluyó a una conductividad de 13 mS, se
ajustó el pH a 8,4 y se pasó por una columna Poros 50 HQ (Applied
Biosystems, Framingham, MA). Las células que contenían proteína
zcyto21 que pasaron se ajustaron a alrededor de 127 mS con sulfato
de amonio y se cargaron en una columna Toyopearl Phenyl 650S (TosoH,
Montgomeryville, PA). Se eluyó la proteína zcyto21 con un gradiente
de sulfato de amonio decreciente y las fracciones que contenían la
zcyto21 pura se agruparon y se concentraron para inyección en una
columna Superdex 75 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). La
concentración de la proteína final purificada se determinó mediante
valoración BCA (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) y análisis de
aminoácidos por HPLC.
Se analizó la proteína zcyto21 recombinante por
SDS-PAGE (Nupage Bis-Tris al 4%-12%,
Invitrogen, Carlsbad, CA) y Western blot utilizando la IgG contra
la zcyto21-CEE-BV de conejo como
anticuerpo primario. Se sometió el gel a electroforesis con una
minicelda Xcell II de Invitrogen (Carlsbad, CA) y se transfirió a
una membrana de nitrocelulosa de 0,2 \mum
(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) con el módulo
de transferencia puntual Xcell II de Invitrogen según las
indicaciones proporcionadas en el manual del instrumento. La
transferencia se realizó a 500 mA durante 50 minutos en solución
amortiguadora que contenía base Tris 25 mM, glicina 200 mM y
metanol al 20%. El punto transferido se bloqueó con leche desnatada
en polvo al 10% en 1xPBS durante 10 minutos y luego se sondó con el
anticuerpo primario en 1xPBS con leche desnatada en polvo al 2,5%.
Se marcó el punto durante una hora a temperatura ambiente mientras
se agitaba. Para la marcación del anticuerpo secundario, se lavó el
punto tres veces durante 10 minutos cada una con PBS y luego se
sondó con IgG anticonejo de cabra-HRP (Pierce
Chemical Co., Rockford, IL) durante una hora. Se lavó el punto tres
veces con 1xPBS durante 10 minutos cada una, se reveló con una
mezcla 1:1 de reactivos SuperSignal® ULTRA (Pierce Chemical Co.,
Rockford, IL) y la señal se capturó con un
Lumi-Imager (Boehringer Mannheim GmbH,
Alemania).
La proteína purificada zcyto21 del medio CHO
migró como dos o más bandas de, aproximadamente, 28 kDa en un gel
Bis-Tris al 4%-12% tanto en condiciones de reducción
como de no reducción. El mapeo del péptido por MS indicó una mezcla
de dos isómeros con respecto a las uniones disulfuro y la presencia
de un sitio de glucosilación ligado a N y varios sitios de
glucosilación ligados a O.
Se digirieron las fracciones pico de
agrupamientos purificados de IL-29 de un día para el
otro a 37ºC con tripsina de grado para secuenciamiento (Roche
Applied Science, Indianápolis, IN) en solución amortiguadora de
fosfato a, aproximadamente, pH 6,3 para limitar el rearreglo de las
uniones disulfuro. Cada digestión se analizó mediante HPLC con
inversión de fases (Agilent, Palo Alto, CA) conectada en línea con
un espectrómetro de masas híbrido cuadrupolo-tiempo
de vuelo (Micromass, Milford, MA). Se recolectaron los espectros, se
convirtieron de masa a relación de carga a masa, y se compararon
con todos los péptidos teóricos y las combinaciones de péptidos con
enlaces disulfuro resultantes de la digestión de la
IL-29 con tripsina. Se asignaron los disulfuros
comparando los espectros antes y después de la reducción con la
asignación de las masas adecuadas a los péptidos con enlaces
disulfuro en la IL-29. El material de la fracción
N.º 20 mostró el patrón disulfuro C15-C112 y
C49-C145 con C171 observado como una
S-glutationil cisteína (todos referidos a la SEC.
ID. N.º 4). El material de la fracción N.º 51 mostró el patrón
disulfuro C49-C145 y C112-C171 con
C15 observado como una S-glutationil cisteína (con
referencia a la SEC. ID. N.º 4).
Se generó el plásmido pTAP237 insertando un
ligador generado mediante PCR en el sitio SmaI del pTAP186 por
recombinación homóloga. El plásmido pTAP186 se derivó de los
plásmidos pRS316 (un vector transportador de Saccharomyces
cerevisiae) y pMAL-c2, un plásmido de expresión
de E. coli derivado del pKK223-3 y que
comprende el promotor tac y el terminador rrnB. El
plásmido pTAP186 contiene un gen de resistencia a la kanamicina en
el cual el sitio SmaI ha sido destruido y tiene sitios NotI y SfiI
que flanquean las secuencias de levaduras ARS-CEN6
y URA3, lo cual facilita su remoción del plásmido por digestión con
NotI. El ligador generado mediante PCR reemplazó la secuencia de
acopladores de expresión del pTAP186 por la secuencia RBS II
sintética. Se preparó a partir de 100 pmoles cada uno de los
oligonucleótidos zc29,740 y zc29,741, como se muestra en las SEC.
ID. N.º 44 y 45, respectivamente, y aproximadamente 5 pmoles cada
uno de los oligonucleótidos zc29,736 y zc29,738, como se muestra en
las SEC. ID. N.º 46 y 47, respectivamente. Estos oligonucleótidos
se combinaron mediante PCR durante diez ciclos de 94C durante 30
segundos, 50C durante 30 segundos y 72ºC durante 30 segundos,
seguidos de un remojo a 4ºC. Los productos de la PCR resultantes se
concentraron por precipitación con dos veces el volumen de etanol
al 100%. El sedimento se resuspendió en 10 \muL de agua para
utilizarse para recombinar en el vector receptor pTAP186 digerido
con SmaI para producir el constructo que contenía la secuencia RBS
II sintética. Se mezclaron juntos aproximadamente 1 \mug del
ligador generado mediante PCR y 100 ng de pTAP186 digerido con SmaI
y se transformaron en células de levadura competentes (S.
cerevisiae). Luego se sembró la levadura en placas -URA D y se
dejó a temperatura ambiente durante alrededor de 72 horas. Luego,
los transformantes de Ura+ de una sola placa se resuspendieron en 1
ml de H_{2}O y se los centrifugó brevemente para obtener un
sedimento de células de levadura. Luego, se resuspendió el sedimento
celular en 0,5 ml de solución amortiguadora de lisis. Se recuperó
el ADN y se transformó en MC1061 de E. coli. Los clones se
cribaron mediante PCR de las colonias según se divulgó
anteriormente, utilizando 20 pmoles cada uno de los
oligonucleótidos zc29,740 y zc29,741, como se muestra en la SEC. ID.
N.º 44 y 45, respectivamente. Los clones que mostraban la banda de
tamaño correcta en un gel de agarosa fueron sometidos a análisis de
secuencia. El plásmido correcto se denominó pTAP237.
La secuencia génica humana originaria de la
IL-29 no fue bien expresada en la cepa W3110 de
E. coli. El examen de los codones utilizados en la secuencia
de codificación de la IL-29 indicó que contenía un
exceso de los codones utilizados con menos frecuencia en E.
coli con un valor de índice de adaptación de codones (codon
adaptation index, CAI) igual a 0,206. El CAI es una medida
estadística del sesgo de codones sinónimos y puede usarse para
predecir el nivel de producción de proteínas (Sharp et al.,
Nucleic Acids Res.
15(3):1281-95, 1987). Los genes que
codifican proteínas altamente expresadas tienden a tener valores de
CAI altos (>0,6), mientras que las proteínas codificadas por los
genes con bajos valores de CAI (\leq0,2) generalmente se expresan
de manera ineficiente. Esto sugirió un motivo para la baja
producción de IL-29 en E. coli. Además, los
codones raros están agrupados en la segunda mitad del mensaje, lo
cual lleva a una mayor probabilidad de que se produzca un
inconveniente en la traducción, una interrupción prematura de la
traducción y un error en la incorporación de aminoácidos (Kane JF.
Curr. Opin. Biotechnol.
6(5):494-500, 1995).
Se ha demostrado que el nivel de expresión de
las proteínas cuyos genes contienen codones raros puede mejorarse
notablemente cuando se aumenta el nivel de determinados ARNt raros
dentro del huésped (Zdanovsky et al., Applied
Enviromental Microb. 66:3166-3173, 2000;
You et al., Biotechniques
27:950-954, 1999). El plásmido pRARE porta
genes que codifican los ARNt de varios codones que raramente se usan
en E. coli (argU, argW, leuW, proL, ileX y glyT). Los genes
están bajo el control de sus promotores originarios (Novy,
ibid.). La coexpresión con pRARE potenció la producción de
IL-29 en E. coli con un rendimiento de
aproximadamente 200 mg/l. Estos datos sugieren que la resíntesis
del gen que codifica la IL-29 con un uso más
adecuado de los codones proporciona un vector mejorado para la
expresión de grandes cantidades de IL-29.
La secuencia codificante de la
IL-29 con codones optimizados se construyó a partir
de dieciséis oligonucleótidos superpuestos: zc44,566 (SEC. ID. N.º
48), zc44,565 (SEC. ID. N.º 49), zc44,564 (SEC. ID. N.º 50),
zc44,563 (SEC. ID. N.º 51), zc44,562 (SEC. ID. N.º 52), zc44,561
(SEC. ID. N.º 53), zc44,560 (SEC. ID. N.º 54), zc244,559 (SEC. ID.
N.º 55), zc44,558 (SEC. ID. N.º 56), zc44,557 (SEC. ID. N.º 57). La
extensión de los cebadores de estos oligonucleótidos superpuestos
seguida de la amplificación mediante PCR produjo un gen de
IL-29 de longitud completa con codones optimizados
para expresión en E. coli. El producto final de la PCR se
insertó en el vector de expresión pTAP237 por recombinación
homóloga de levadura. Se extrajo el constructo de expresión de la
levadura y se lo transformó en MC1061 de E. coli competente.
La resistencia de los clones a la kanamicina se identificó mediante
PCR de las colonias. Se verificó un clon positivo mediante
secuenciamiento y, posteriormente, se lo transformó en la cepa
huésped de producción W3110. El vector de expresión con la secuencia
de IL-29 optimizada se denominó pSDH184. El gen
resultante se expresó muy bien en E. coli. Los niveles de
expresión con el nuevo constructo aumentaron a alrededor de 250
mg/l.
La estrategia utilizada para generar la zcyto21
con mutación en cisteína C172S se basa en el equipo de mutagénesis
sitio dirigida QuikChange Site-Directed Mutagenesis
Kit (Stratagene). Se diseñaron cebadores para introducir la
mutación C172S sobre la base de las sugerencias del fabricante.
Estos cebadores se denominaron ZG44,340 (SEC. ID. N.º 58) y
ZG44,341 (SEC. ID. N.º 59). Se realizó la PCR para generar la
zcyto21 con mutación en cisteína C172S según las instrucciones para
mutagénesis del QuikChange. Se prepararon cinco reacciones idénticas
de 50 \mul. Se utilizaron 2,5 \mul de ADN del pSDH175 (al que
le faltaba la estructura del esqueleto del vector de levadura) como
plantilla por reacción. Se preparó un cóctel para PCR con las
siguientes cantidades de reactivos: 30 \mul de 10x solución
amortiguadora de PCR; 125 ng (27,42 \mul) de ZG44,340; 125 ng
(9,18 \mul) de ZG44,341, 6 \mul de dNTP, 6 \mul de Pfu Turbo
polimerasa (Stratagene, La Jolla, CA) y 206,4 \mul de agua. Se
colocaron alícuotas de 47,5 \mul del cóctel en cada reacción. Las
condiciones de la PCR fueron las siguientes: 1 ciclo de 95ºC
durante 30 segundos seguido de 16 ciclos de 95ºC durante 30
segundos, 55ºC durante 1 minuto, 68ºC durante 7 minutos, seguidos
de 1 ciclo a 68ºC durante 7 minutos, y terminando con un
mantenimiento a 4ºC. Las cinco reacciones PCR se consolidaron en un
tubo. Según las instrucciones del fabricante, se agregaron 5 \mul
de enzima de restricción DpnI a la reacción PCR y se la incubó a
37ºC durante 2 horas. Se precipitó el ADN agregando acetato de sodio
3 Molar al 10% y dos volúmenes de etanol al 100%. La precipitación
se realizó a -20ºC durante 20 minutos. Se centrifugó el ADN a 14.000
rpm durante 5 minutos y el sedimento se secó en un sistema
Speed-Vac. Se resuspendió el sedimento de ADN en 20
\mul de agua. El ADN resultante de la PCR se transformó en la
cepa DH10B de E. coli. Se mezclaron 5 \mul de ADN con 40
\mul de células DH10B ElectroMAX (Invitrogen). Luego, se
electroporaron las células y la mezcla de ADN en una cubeta de 0,1
cm (Bio-Rad) utilizando un Bio-Rad
Gene Pulser II^{TM} a 1,75 kV, 100 \Omega y 25 \muF. Las
células electroporadas luego se dejaron crecer a 37ºC durante 1
hora. La mezcla se sembró en una placa de LB+25 \mug/ml de
kanamicina y se incubó a 37ºC de un día para el otro. Se cribaron
diez clones para determinar la presencia del inserto de la zcyto21
C172S. Se aisló el ADN de los diez clones utilizando el equipo
QIAprep^{TM} Spin Miniprep Kit (Qiagen, Valencia, CA) y se lo
analizó para determinar la presencia del inserto mediante corte con
las enzimas de restricción XbaI y PstI. Nueve clones contenían el
inserto y fueron secuenciados para asegurar que se hubiera
introducido la mutación de la zcyto21 C172S. Se verificó la
secuencia de un clon y posteriormente se lo marcó pSDH188.
Se aisló un fragmento de ADN de la
IL-29 que contenía la secuencia silvestre mediante
PCR. En la reacción se utilizaron el cebador zc41,212 (SEC. ID. N.º
60) que contenía 41 pares de bases (pb) de la secuencia flanqueante
del vector y 24 pb correspondientes al amino terminal de la
IL-29, y el cebador zc41,041 (SEC. ID. N.º 61)
contenía 38 pb correspondientes al extremo 3' del vector que
contenía el inserto de la zcyto21. Las condiciones de la PCR fueron
las siguientes: 25 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 50ºC durante
30 segundos y 72ºC durante 1 minuto; seguidos de un remojo a 4ºC.
Se pasó una pequeña muestra (2-4 \muL) de la
muestra de PCR por un gel de agarosa al 1% con 1X solución
amortiguadora TBE para su análisis, y se observó la banda esperada
del fragmento de aproximadamente 500 pb. El volumen remanente de la
reacción de 100 \muL se precipitó con 200 \muL de etanol
absoluto. Se resuspendió el sedimento en 10 \muL de agua para
usarlo para recombinación en el vector receptor pTAP238 cortado con
SmaI para producir el constructo que codifica la zcyto21 como se
divulgó anteriormente. El clon con la secuencia correcta se denominó
pTAP377. Se digirió el clon pTAP377 con Not1/Nco1 (10 \mul de
ADN; 5 \mul de solución amortiguadora 3 New England BioLabs; 2
\mul de Not 1; 2 \mul de Nco1; 31 \mul de agua durante 1 hora
a 37C) y se religó con solución amortiguadora de T4 ADN ligasa (7
\mul de la digestión anterior; 2 \mul de 5X solución
amortiguadora; 1 \mul de T4 ADN ligasa). Este paso removió la
secuencia de la levadura, CEN-ARS, para optimizar el
vector. Se digirió diagnósticamente el ADN del pTAP337 con Pvu2 y
Pst1 para confirmar la ausencia de la secuencia de la levadura. Se
transformó el ADN del p/taP377 en la cepa W3110/pRARE de E.
coli, cepa huésped que portaba copias adicionales de los genes
tRNA raros de E. coli.
Se aisló un fragmento de ADN que contenía la
secuencia silvestre de la zcyto20 (como se muestra en la SEC. ID.
N.º 1) utilizando PCR. En la reacción se utilizaron el cebador
zc43,431 (SEC. ID. N.º 62) que contenía 41 pb de la secuencia
flanqueante del vector y 24 pb correspondientes al amino terminal de
la zcyto20, y el cebador zc43,437 (SEC. ID. N.º 63) contenía 38 pb
correspondientes al extremo 3' del vector que contenía el inserto
de la zcyto20. Las condiciones de la PCR fueron las siguientes: 25
ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 50ºC durante 30 segundos y 72ºC
durante 1 minuto; seguidos de un remojo a 4ºC. Se pasó una pequeña
muestra (2-4 \mul) de la muestra de PCR por un
gel de agarosa al 1% con 1X solución amortiguadora TBE para su
análisis, y se observó la banda esperada del fragmento de
aproximadamente 500 pb. El volumen remanente de la reacción de 100
\mul se precipitó con 200 \mul de etanol absoluto. Se
resuspendió el sedimento en 10 \mul de agua para usarlo para
recombinación en el vector receptor pTAP238 cortado con SmaI para
producir el constructo que codifica la zcyto20 como se divulgó
anteriormente. El clon con la secuencia correcta se denominó pYEL7.
Se digirió con Not1/Nco1 (10 \mul de ADN; 5 \mul de solución
amortiguadora 3 New England BioLabs; 2 \mul de Not 1; 2 \mul de
Nco1; 31 \mul de agua durante 1 hora a 37C) y se religó con
solución amortiguadora de T4 ADN ligasa (7 \mul de la digestión
anterior; 2 \mul de 5X solución amortiguadora; 1 \mul de T4 ADN
ligasa). Este paso removió la secuencia de la levadura,
CEN-ARS, para optimizar el vector. Se digirió
diagnósticamente el ADN del pYEL7 relegado con Pvu2 y Pst1 para
confirmar la ausencia de la secuencia de la levadura. Se transformó
el ADN del PYEL7 en la cepa W3110/pRARE de E. coli.
La estrategia utilizada para generar la zcyto21
con mutación en cisteína C172S (SEC. ID. N.º 28) se basa en el
equipo de mutagénesis sitio dirigida QuikChange®
Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla,
CA). Se diseñaron cebadores para introducir la mutación C172S sobre
la base de las sugerencias del fabricante. Estos cebadores se
denominaron ZG44,327 y ZG44,328 (SEC. ID. N.º 64 y 65,
respectivamente); Se realizó la PCR para generar la zcyto21 con
mutación en cisteína C172S según las instrucciones para mutagénesis
del QuikChange. Se prepararon cinco reacciones idénticas de 50
\mul. Se utilizaron 2,5 \mul de ADN del pTAP377 (al que le
faltaba la estructura del esqueleto del vector de levadura) como
plantilla por reacción. Se preparó un cóctel para PCR con las
siguientes cantidades de reactivos: 30 \mul de 10x solución
amortiguadora de PCR; 125 ng (27,42 \mul) de ZG44,327 (SEC. ID.
N.º 64), 125 ng (9,18 \mul) de ZG44,328 (SEC. ID. N.º 65), 6
\mul de dNTP, 6 \mul de Pfu Turbo polimerasa (Stratagene) y
206,4 \mul de agua. Se colocaron alícuotas de 47,5 \mul del
cóctel en cada reacción. Las condiciones de la PCR fueron las
siguientes: 1 ciclo de 95ºC durante 30 segundos seguido de 16 ciclos
de 95ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 1 minuto, 68ºC durante 7
minutos, seguidos de 1 ciclo a 68ºC durante 7 minutos, y terminando
con un mantenimiento a 4ºC. Las cinco reacciones PCR se
consolidaron en un tubo. Según las instrucciones del fabricante, se
agregaron 5 \mul de enzima de restricción DpnI a la reacción PCR
y se la incubó a 37ºC durante 2 horas. Se precipitó el ADN agregando
acetato de sodio 3 Molar al 10% y dos volúmenes de etanol al 100%
(Aaper Alcohol, Shelbyville, KY). La precipitación se realizó a
-20ºC durante 20 minutos. Se centrifugó el ADN a 14.000 rpm durante
5 minutos y el sedimento se secó en un sistema
Speed-Vac. Se resuspendió el sedimento de ADN en 20
\mul de agua. El ADN resultante de la PCR se transformó en la
cepa DH10B de E. coli. Se mezclaron 5 \mul de ADN con 40
\mul de células ElectroMAX DH10B (Invitrogen, Carlsbad, CA).
Luego, se electroporaron las células y la mezcla de ADN en una
cubeta de 0,1 cm (Bio-Rad, Hercules, CA) utilizando
un Bio-Rad Gene Pulser II^{TM} a 1,75 kV,
100\Omega y 25 \muF. Las células electroporadas luego se
dejaron crecer a 37ºC durante 1 hora. La mezcla se sembró en una
placa de LB+25 \mug/ml de kanamicina y se incubó a 37ºC de un día
para el otro. Se cribaron diez clones para determinar la presencia
del inserto de la
IL-29. Se aisló el ADN de los diez clones utilizando el equipo QIAprep^{TM} Spin Miniprep Kit (Qiagen) y se lo analizó para determinar la presencia del inserto mediante corte con las enzimas de restricción XbaI (Roche) y PstI (New England Biolabs). Nueve clones contenían el inserto y fueron secuenciados para asegurar que se hubiera introducido la mutación de la zcyto21 C172S. Se verificó la secuencia de un clon (aislado N.º 6) y, posteriormente, se lo marcó como pSDH171. Puede implementarse una estrategia similar para generar una zcyto21 con mutación C15S.
IL-29. Se aisló el ADN de los diez clones utilizando el equipo QIAprep^{TM} Spin Miniprep Kit (Qiagen) y se lo analizó para determinar la presencia del inserto mediante corte con las enzimas de restricción XbaI (Roche) y PstI (New England Biolabs). Nueve clones contenían el inserto y fueron secuenciados para asegurar que se hubiera introducido la mutación de la zcyto21 C172S. Se verificó la secuencia de un clon (aislado N.º 6) y, posteriormente, se lo marcó como pSDH171. Puede implementarse una estrategia similar para generar una zcyto21 con mutación C15S.
Se generó la secuencia codificante de la zcyto20
con mutación en cisteína C49S mediante PCR de superposición (SEC.
ID. N.º 20). Las primeras 187 bases de la secuencia de
IL-28A silvestre (SEC. ID. N.º 1) se generaron por
amplificación mediante PCR utilizando el pYEL7 (SEC. ID. N.º 67)
como plantilla y los cebadores oligonucleótidos zc43,431 (SEC. ID.
N.º 62) y zc45,399 (SEC. ID. N.º 66). El segundo fragmento de ADN,
desde la base 105 hasta la 531 se generó por amplificación mediante
PCR utilizando el pYEL7 (SEC. ID. N.º 67) como plantilla y los
cebadores oligonucleótidos zc45,398 (SEC. ID. N.º 68) y zc43,437
(SEC. ID. N.º 63). Los cebadores zc45,399 (SEC. ID. N.º 66) y
zc45,398 (SEC. ID. N.º 68) contenían la secuencia modificada
específica que cambiaba la cisteína 49 a una serina. Estos dos
productos de la PCR se combinaron y se amplificaron mediante PCR de
superposición con los cebadores oligonucleótidos zc43,431 (SEC. ID.
N.º 62) y zc43,437 (SEC. ID. N.º 63). El producto final de la PCR
se insertó en el vector de expresión pTAP238 por recombinación
homóloga de levadura (Raymond et al. Biotechniques. Jan.
26(1):134-8, 140-1, 1999). Se
extrajo el constructo de expresión de la levadura y se lo
transformó en DH10B de E. coli competente. Se cribaron los
clones resistentes a la kanamicina mediante PCR de colonias. Se
verificó un clon positivo mediante secuenciamiento y,
posteriormente, se lo transformó en la cepa huésped de producción
W3110/pRARE. El constructo de expresión con la secuencia codificante
de la zcyto20 con mutación en cisteína C49S se denominó pCHAN9.
Se generó la secuencia codificante de la zcyto20
con mutación en cisteína C51S mediante PCR de superposición (SEC.
ID. N.º 24). Las primeras 193 bases de la secuencia de
IL-28A silvestre se generaron mediante amplificación
con PCR utilizando el pYEL7 (SEC. ID. N.º 67) como plantilla y los
cebadores oligonucleótidos zc43,431 (SEC. ID. N.º 62) y zc45,397
(SEC. ID. N.º 63). El segundo fragmento de ADN, desde la base 111
hasta la 531 se generó mediante amplificación mediante PCR
utilizando el pYEL7 (SEC. ID. N.º 67) como plantilla y los cebadores
oligonucleótidos zc45,396 (SEC. ID. N.º 70) y zc43,437 (SEC. ID.
N.º 63). Los cebadores zc45,397 (SEC. ID. N.º 69) y zc45,396 (SEC.
ID. N.º 70) contenían la secuencia modificada específica que
cambiaba la cisteína 51 a una serina. Estos dos productos de la PCR
se combinaron y se amplificaron mediante PCR de superposición con
los cebadores oligonucleótidos zc43,431 (SEC. ID. N.º 62) y
zc43,437 (SEC. ID. N.º 63). El producto final de la PCR se insertó
en nuestro vector de expresión interno pTAP238 por recombinación
homóloga de levadura (Raymond et al. supra). Se
extrajo el constructo de expresión de la levadura y se lo transformó
en DH10B de E. coli competente. Se cribaron los clones
resistentes a la kanamicina mediante PCR de colonias. Se verificó un
clon positivo mediante secuenciamiento y, posteriormente, se lo
transformó en la cepa huésped de producción W3110/pRARE. El
constructo de expresión con la secuencia codificante de la zcyto20
con mutación en cisteína C50S se denominó pCHAN10.
En experimentos separados, se inoculó E.
coli transformada con cada uno de los vectores de expresión
descritos en los Ejemplos 6 a 9 en 100 ml de medio Superbroth II
(Becton Dickinson, San Diego, CA) con Antifoam 289 al 0,01% (Sigma
Aldrich, St. Louis, MO), 30 \mug/ml de kanamicina, 35 \mug/ml de
cloranfenicol y se cultivó de un día para el otro a 37ºC. Se
agregaron 5 ml de inóculo a 500 ml del mismo medio en un matraz de
cultivo de 2 l que se agitó a 250 rpm a 37ºC hasta que el cultivo
alcanzó una OD600 de 4. Luego, se agregó
isopropil-\beta-D-tio-galactopiranósido
(isopropyl-\beta-D-thio-galacto-pyranoside,
IPTG) hasta una concentración final de 1 mM y se continuó agitando
durante 2,5 horas más. Se centrifugaron las células a 4.000xg
durante 10 min a 4ºC. Los sedimentos de células se congelaron a
-80ºC para usarlos en otro momento.
Se expresó la IL-29 humana
silvestre en la cepa W3110 de E. coli como cuerpos de
inclusión según se describió anteriormente. Se resuspendió un
sedimento de células de una fermentación por lotes alimentados en
Tris 50 mM, pH 7,3. Se pasó la suspensión por un homogeneizador
APV-Gaulin (Invensys APV, Tonawanda, Nueva York)
tres veces a 8.000 psi. El material insoluble se recuperó por
centrifugación a 15.000 g durante 30 minutos. El sedimento se lavó
en forma consecutiva con Tris 50 mM, Triton X100 al 1% (v/v), pH 7,3
y Urea 4 M. Luego, se dispersó el cuerpo de inclusión en Tris 50
mM, clorhidrato de guanidina 6 M, DTT 5 mM a temperatura ambiente
durante 1 hora. Luego, se centrifugó el material a 15.000 g durante
1 hora. El sobrenadante de este paso contiene IL-29
soluble reducida.
La IL-29 solubilizada se diluyó
lentamente en Tris 50 mM, pH 8; arginina 0,75 M; PEG3350 al 0,05%;
MgCl_{2} 2 mM; CaCl_{2} 2 mM; KCl 0,4 mM; NaCl 10 mM;
glutationa reducida 4 mM; glutationa oxidada 0,8 mM a temperatura
ambiente mientras se agitaba. La concentración final de
IL-29 en la solución amortiguadora de replegamiento
fue de 0,1 mg/ml. La mezcla de replegamiento se dejó a temperatura
ambiente de un día para el otro. Luego, se utilizó ácido acético
concentrado para ajustar el pH de la suspensión a 5. Luego, se
filtró la suspensión a través de un filtro de 0,2 \mum. El
análisis por RP-HPLC de la mezcla de replegamiento
mostró dos picos prominentes.
Se diluyó (1:2) la mezcla de replegamiento en
línea con NaOAc 50 mM a pH 5 y se cargó en una columna de
intercambio catiónico Pharmacia SP Sepharose Fast Flow (North
Peapack, NJ). Se lavó la columna con 3 volúmenes de columna de
NaOAc 50 mM, NaCl 400 mM, pH 5. La IL-29 unida se
eluyó con NaOAc 50 mM; NaCl 1,4 M; pH 5. Se agregó
(NH_{4})_{2}SO_{4} sólido al agrupamiento de eluidos
del paso de intercambio catiónico para que la concentración final de
(NH_{4})_{2}SO_{4} fuera 0,5 M. Luego, se cargó el
material en una columna ToyoPearl Phenyl 650S HIC (Tosoh Biosep,
Montgomery, PA). Luego, la columna se lavó con 3 volúmenes de
columna de NaOAc 50 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 1 M, pH 5.
Se utilizó un gradiente lineal de 10 volúmenes de columna desde
NaOAc 50 mM, de (NH_{4})_{2}SO_{4} 1 M, pH 5 hasta
NaOAc50 mM, pH 5 para eluir la zcyto21 unida. Se recolectaron
fracciones del eluido. Se observaron dos picos prominentes en este
paso. Se realizó el análisis por RP-HPLC de las
fracciones eluidas. Se produjeron dos productos correspondientes a
dos isómeros con uniones disulfuro después del intercambio final de
la solución amortiguadora en PBS, pH 7,3.
Como se describió en el Ejemplo 3, la
purificación de la IL-29 produjo dos isómeros con
uniones disulfuro. Se utilizó un paso de cromatografía de
integración hidrófoba cromatografía líquida de proteína rápida
(Hydrophobic Integration Chromatography Fast Protein Liquid
Chromatography, HIC FPLC) para separar las dos formas. La separación
no se resolvió al inicio. Fue necesario aplicar una considerable
"supresión de picos" para obtener isómeros sustancialmente
puros (>95%). El rendimiento de este paso y, por extensión, de
todo el proceso sufrió las consecuencias. Los rendimientos finales
fueron 8% y 9% para la forma C15-C112 y la forma
C112-C171 respectivamente. La IL-29
silvestre producida en los sistemas de CHO y baculovirus (BV)
también mostró fenómenos similares. Se estableció que la forma
C15-C112 del isómero es homóloga en sus patrones de
uniones disulfuro al IFN tipo I. La forma C15-C112
también demostró una bioactividad 30 veces mayor que la forma
C112-C171 en una valoración de elemento de
respuesta estimulada por interferón (Interferon Stimulated Response
Element, ISRE) (véase a continuación).
La preparación de cuerpos de inclusión, el
replegamiento y la purificación del polipéptido de la zcyto21 C172S
(SEC. ID. N.º 29) son esencialmente iguales que para la
IL-29 silvestre (SEC. ID. N.º 4). El análisis por
RP-HPLC de la mezcla de replegamiento de la muteína
mostró solo un pico prominente correspondiente a la forma
C15-C112 de la IL-29 silvestre. La
cromatografía HIC subsiguiente mostró solo un único pico. Por lo
tanto, no fue necesario emplear una "supresión de picos"
considerable. El rendimiento final de todo el proceso es cercano al
50%. El polipéptido de la zcyto21 Cys172Ser (SEC. ID. N.º 29) mostró
una bioactividad equivalente a la forma C15-C112 de
la IL-29 silvestre en la valoración de ISRE mostrada
en el Ejemplo 16.
\vskip1.000000\baselineskip
Las valoraciones funcionales iniciales de la
actividad antiviral se realizaron utilizando un medio acondicionado
de células de riñón embrionario humano (human embryonal kidney, HEK)
transfectadas transitoriamente. La producción de este medio
acondicionado se describe de la siguiente manera. Se clonó un ADNc
de longitud completa de IL-28A,
IL-28B o IL-29 humanas o murinas en
el vector pzp7Z utilizando procedimientos estándares. Los
constructos de IL-28A, IL-28B o
IL-29 humanas o murinas se transfectaron a células
HEK 293. En resumen, para cada constructo se sembraron 700.000
células/pocillo (placas de 6 pocillos) aproximadamente 18 h antes de
la transfección en 2 mililitros de medio esencial modificado de
Dulbecco (Dulbecco's modified essential medium, DMEM)+suero fetal
bovino al 10%. Por pocillo se agregaron 1,5 microgramos de ADN de
IL-28A, IL-28B o
IL-29 humanas o murinas y 0,5 microgramos de ADN de
pIRES2-EGFP (Clontech) a 6 microlitros de reactivo
Fugene 6 (Roche Biochemicals) en un total de 100 microlitros de
DMEM. Se usaron 2 microgramos de ADN de pIRES2-EGFP
solo como control negativo. Estas mezclas de transfección se
agregaron 30 minutos más tarde a las células 293 sembradas
previamente. Veinticuatro horas más tarde, se retiraron los medios
celulares y se agregó DMEM+albúmina de suero bovino al 0,1%. Se
recolectó el medio acondicionado después de 48 horas, se filtró a
través de un filtro de 0,45 micrones y se usó para valoraciones de
efecto antiviral y de indicador.
Las determinaciones de efecto antiviral se
realizan usando células de carcinoma cervical humano (HeLa) y
células de fibroblastos de ratón (L929). El primer día, se diluyó
el medio acondicionado que contenía IL-28A,
IL-28B o IL-29 humanas o murinas y
se sembró con 50.000 células en una placa de microtitulación de
fondo plano de 96 pocillos. Luego de una incubación de 24 horas a
37ºC, se retiró el medio y se lo reemplazó por medio que contenía
virus de la encefalomiocarditis a una multiplicidad de infección
(multiplicity of infection, MOI) de 0,1. Las células se incubaron
nuevamente durante 24 horas a 37ºC. Luego, se calificaron los
pocillos de cultivo visualmente sobre la base de una escala de 4
puntos respecto de la presencia de efecto citopático, que luego se
convirtió en porcentaje de efecto citopático (cytopathic effect,
CPE) como se muestra en la Tabla 7. Se incluyeron un medio
acondicionado de las células transfectadas con GFP solo e
interferón-a-2a humano purificado o
interferón-alfa murino como
controles.
controles.
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 8 muestra que el medio acondicionado
que contenía IL-28A, IL-28B o
IL-29 humanas o murinas inhibió la infección viral
(% de CPE) en las células HeLa de manera dependiente de la dosis,
mientras que el medio de control acondicionado con GFP no bloqueó
de manera significativa la aparición del efecto citopático. Como se
muestra en la Tabla 9, el medio acondicionado que contenía
IL-28A, IL-28B o
IL-29 humanas o murinas no inhibió la infección
viral en las células L929. En ambos experimentos el interferón
purificado mostró una respuesta antiviral positiva.
\vskip1.000000\baselineskip
La interacción de los interferones tipo I con su
receptor específico lleva a la inducción de una cantidad de genes
responsables de su actividad antiviral/antiproliferativa. Dichos
genes incluyen la 2'-5' oligoadenilato sintetasa
(2-5 OAS), la Pkr cinasa (Pkr) dependiente del ARN
bicatenario, fosfolípido escramblasa y la molécula de adhesión
intercelular-1 (ICAM-1). También se
produce la inducción de genes con una función aún desconocida, como
un producto génico estimulado por un interferón de 56 kDa
(ISG-56k). A fin de determinar si algunos o todos
estos genes son inducidos al realizar el tratamiento de las células
con la IL-28A, se trataron células linfoides Daudi
B humanas durante 72 horas con medio acondicionado de células Sf9
infectadas con baculovirus que expresaba la IL-28A.
Se utilizó medio acondicionado de células Sf9 infectadas con
baculovirus silvestre como control negativo. Después del
tratamiento, se recolectaron las células y se lisaron para aislar el
ARN total. Se convirtió un microgramo de ARN total en ADNc
utilizando transcriptasa inversa y se lo utilizó como plantilla
para la reacción en cadena de la polimerasa utilizando cebadores
oligonucleótidos específicos para los genes humanos estimulados por
el interferón descritos anteriormente. Se usaron cebadores
oligonucleótidos para la
glicerol-3-fosfato deshidrogenasa
(G3PDH) humana como control génico no estimulado por interferón.
Los resultados muestran una clara inducción de
ISG-56k, Pkr, 2-5 OAS y fosfolípido
escramblasa después del tratamiento de las células con
IL-28A. No se observó inducción de
ICAM-1 ni del control génico no estimulado con
interferón, G3PDH.
Puede utilizarse una valoración del indicador de
transducción de señal para determinar la interacción funcional de
la IL-28 y la IL-29 humanas y de
ratón con el receptor de la IL-28. Se transfectan
células de riñón embrionario humano (HEK) con un plásmido indicador
que contiene un elemento de respuesta estimulado por interferón
(ISRE) que dirige la transcripción de un gen indicador de
luciferasa en presencia o ausencia de vectores de expresión pZP7
que contienen ADNc de receptores de citocinas clase II (incluidos
los receptores humanos DIRS1, IFN\alphaR1, IFN\alphaR2 y el
receptor de la IL-28). La actividad de la luciferasa
después de la estimulación de las células transfectadas con
ligandos clase II (incluidos IL-28A (SEC. ID. N.º
2), IL-29 (SEC. ID. N.º 4), IL-28B
(SEC. ID. N.º 6), zcyto10, huIL10 y huIFNa-2a)
refleja la interacción del ligando con receptores de citocinas
transfectados y originarios en la superficie celular. Los resultados
y los métodos se describen a continuación.
Se transfectaron células HEK 293 de la siguiente
manera: se sembraron 700.000 células 293/pocillo (placas de 6
pocillos) aproximadamente 18 h antes de la transfección en 2
mililitros de DMEM+suero fetal bovino al 10%. Por pocillo, se
agregaron 1 microgramo de ADN de pISRE-luciferasa
(Stratagene), 1 microgramo de ADN de receptor de citocina y 1
microgramo de ADN de pIRES2-EGFP (Clontech,) a 9
microlitros de reactivo Fugene 6 (Roche Biochemicals) en un total
de 100 microlitros de DMEM. Se usaron dos microgramos de ADN de
pIRES2-EGFP cuando no se incluyó el receptor de
citocina. Esta mezcla de transfección se agregó, 30 minutos más
tarde, a las células 293 sembradas previamente. Veinticuatro horas
más tarde, las células transfectadas se retiraron de la placa con
tripsina-EDTA y se volvieron a sembrar a razón de
25.000 células/pocillo en placas de microtitulación de 96 pocillos.
Aproximadamente 18 h antes de la estimulación con el ligando, se
cambió el medio a DMEM+FBS al 0,5%.
Las valoraciones de los indicadores de
transducción de señal se realizaron de la siguiente manera: después
de una incubación de 18 h a 37ºC en DMEM+FBS al 0,5%, las células
transfectadas se estimularon con diluciones (en DMEM+FBS al 0,5%)
de los siguientes ligandos de clase II; IL-28A,
IL-29, IL-28B, zcyto10, huIL10 y
huIFNa-2a. Después de una incubación de 4 horas a
37ºC, se lisaron las células y se midieron las unidades de luz
relativas (relative light units, RLU) en un luminómetro después de
la adición de un sustrato de luciferasa. Los resultados obtenidos
se muestran como la cantidad de veces de inducción de las RLU de las
muestras experimentales con respecto al control con medio solamente
(RLU de las muestras experimentales/RLU de medio solo=cantidad de
veces de inducción). La Tabla 10 muestra que la
IL-28A, la IL-29 y la
IL-28B inducen la señalización de ISRE en las
células 293 transfectadas con ISRE-luciferasa lo
cual da una inducción de 15 a 17 veces en la actividad de la
luciferasa con respecto al medio solo. El agregado de ADN de la
subunidad alfa del receptor de la IL-28 (SEC. ID.
N.º 11), utilizando el CRF2-4 (SEC. ID. N.º 71)
endógeno a la mezcla de transfección tiene como resultado una
inducción adicional de 6 a 8 veces en la señalización de ISRE por
parte de la IL-28A, la IL-29 y la
IL-28B lo cual da como resultado una inducción total
de entre 104 y 125 veces. Ninguno de los ADN de los demás
receptores de citocinas clase II transfectados tuvo como resultado
un aumento en la señalización de ISRE. Estos resultados indican que
la IL-28A, la IL-29 y la
IL-28B interactúan funcionalmente con el receptor
de la citocina IL-28. La Tabla 10 también muestra
que el huIFNa-2a puede inducir la señalización de
ISRE en células 293 transfectadas con
ISRE-luciferasa lo cual da una inducción de 205
veces de la actividad de la luciferasa en comparación con el medio
solo. No obstante, la adición de ADN del receptor de la
IL-28 a la transfección produce una reducción de 11
veces en la señalización de ISRE (en comparación con el ADN de
ISRE-luciferasa solo), lo cual sugiere que la
sobreexpresión del receptor de la IL-28 afecta
negativamente la señalización del interferón, en contraposición con
los efectos positivos de la sobreexpresión del receptor de la
IL-28 sobre la señalización de la
IL-28A, la IL-29 y la
IL-28B.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para producir células HEK 293 que
sobreexpresaran el receptor de la IL-28 humana de
manera estable, las células 293 se transfectaron de la siguiente
manera: se sembraron 300.000 células 293/pocillo (placas de 6
pocillos) aproximadamente 6 h antes de la transfección en 2
mililitros de DMEM+suero fetal bovino al 10%. Por pocillo, se
agregaron 2 microgramos de un vector de expresión pZP7 que contenía
el ADNc de la subunidad alfa del receptor de la
IL-28 humana (SEC. ID. N.º 11) a 6 microlitros de
reactivo Fugene 6 (Roche Biochemicals) en un total de 100
microlitros de DMEM. Esta mezcla de transfección se agregó, 30
minutos más tarde, a las células 293 sembradas previamente.
Cuarenta y ocho horas después, las células transfectadas se
colocaron bajo selección por puromicina de 2 microgramos/mililitro.
Las células resistentes a la puromicina se llevaron como una
población de células.
Las células HEK 293 que sobreexpresaban el
receptor de la IL-28 humana se transfectaron de la
siguiente manera: se sembraron 700.000 células 293/pocillo (placas
de 6 pocillos) aproximadamente 18 h antes de la transfección en 2
mililitros de DMEM+suero fetal bovino al 10%. Por pocillo, se agregó
1 microgramo de KZ157 que contenía un elemento de respuesta
estimulado por interferón (ISRE) que dirigía la transcripción de un
gen indicador de la luciferasa a 3 microlitros de reactivo Fugene 6
(Roche Biochemicals) en un total de 100 microlitros de DMEM. Esta
mezcla de transfección se agregó 30 minutos más tarde a las células
HEK 293 previamente sembradas. Cuarenta y ocho horas más tarde, las
células transfectadas se retiraron de la placa con
tripsina-EDTA y se resembraron en 500
microgramos/ml de G418 (Geneticin, Life Technologies). Las células
resistentes a la puromicina y al G418 se llevaron como una
población de células.
Las valoraciones de los indicadores de
transducción de señal se realizaron de la siguiente manera: las
células HEK 293 que sobreexpresaban el receptor de la
IL-28 humana y contenían KZ157 se trataron con
tripsina-EDTA y se resembraron a razón de
aproximadamente 25.000 células/pocillo en placas de microtitulación
de 96 pocillos. Aproximadamente 18 h antes de la estimulación con
el ligando, se cambió el medio a DMEM+FBS al 0,5%.
Después de una incubación de 18 h a 37ºC en
DMEM+FBS al 0,5%, las células transfectadas se estimularon con
diluciones (en DMEM+FBS al 0,5%) de las diferentes formas de zcyto21
derivada de E. coli que contenían patrones de unión a
cisteína diferentes. Después de una incubación de 4 horas a 37ºC, se
lisaron las células y se midieron las unidades de luz relativas
(RLU) en un luminómetro después de la adición de un sustrato de
luciferasa. Los resultados obtenidos se muestran como la cantidad
de veces de inducción de las RLU de las muestras experimentales con
respecto al control con medio solamente (RLU de las muestras
experimentales/RLU de medio solo=cantidad de veces de
inducción).
La Tabla 11 muestra que la forma
C1-C3 (C16-C113) de la
IL-29 silvestre derivada de E. coli tiene
mejor capacidad para inducir la señalización de ISRE que la forma
C3-C5 silvestre (C113-C172) o que
una mezcla de la forma C1-C3 silvestre y la forma
C3-C5 (C16-C113,
C113-C172), todas con referencia a la SEC. ID. N.º
15.
La Tabla 12 muestra que la C1-C3
(C16-C113) de la IL-29 silvestre
derivada de E. coli y la C1-C3
(C16-C113; SEC. ID. N.º 15) de la
IL-29 con mutación en cisteína (C172S) derivada de
E. coli (SEC. ID. N.º 29) son igualmente capaces de inducir
la señalización de ISRE en las células HEK 293 que sobreexpresan el
receptor de la IL-28 humana.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron células mononucleares de sangre
periférica humana recién aisladas en presencia de ácido
poliinosínico-policitidílico (poli I:C; 100
\mug/ml) (SIGMA; St. Louis, MO), virus de la encefalomiocarditis
(encephalomyocarditis virus, EMCV) con una MOI de 0,1 o en medio
solo. Después de una incubación de 15 h se aisló el ARN total de las
células y se lo trató con DNasa sin RNasa. Se usaron 100 ng de ARN
total como plantilla para una RT-PCR de un solo
paso utilizando la Superscript One-Step
RT-PCR con el equipo Platinum Taq y cebadores
específicos para el gen sugeridos por el fabricante
(Invitrogen).
Se observaron cantidades entre bajas e
indetectables de ARN de IL-28A,
IL-28B e IL-29,
IFN-\alpha e IFN-\beta humanos
en las células no tratadas. Por contraposición, la cantidad de ARN
de IL-28A, IL-29 e
IL-28B fue aumentada por el tratamiento con poli
I:C e infección viral, como también se observó para los interferones
tipo I. Estos experimentos indican que la IL-28A,
IL-29 e IL-28B, como los
interferones tipo I, pueden ser inducidas por el ARN bicatenario o
por infección viral.
Se transfectaron células HepG2 de la siguiente
manera: se sembraron 700.000 células HepG2/pocillo (placas de 6
pocillos) aproximadamente 18 h antes de la transfección en 2
mililitros de DMEM+suero fetal bovino al 10%. Por pocillo, se
agregaron 1 microgramo de ADN de pISRE-luciferasa
(Stratagene), y 1 microgramo de ADN de pIRES2-EGFP
(Clontech) a 6 microlitros de reactivo Fugene 6 (Roche Biochemicals)
en un total de 100 microlitros de DMEM. Esta mezcla de transfección
se agregó 30 minutos más tarde a las células HepG2 previamente
sembradas. Veinticuatro horas más tarde, las células transfectadas
se retiraron de la placa con tripsina-EDTA y se
volvieron a sembrar a razón de 25.000 células/pocillo en placas de
microtitulación de 96 pocillos. Aproximadamente 18 h antes de la
estimulación con el ligando, se cambió el medio a DMEM+FBS al
0,5%.
Las valoraciones de los indicadores de
transducción de señal se realizaron de la siguiente manera: después
de una incubación de 18 h a 37ºC en DMEM+FBS al 0,5%, las células
transfectadas se estimularon con 100 ng/ml de ligandos de
IL-28A, IL-29,
IL-28B, zcyto24, zcyto25 y
huIFN-\alpha2a. Después de una incubación de 4
horas a 37ºC, se lisaron las células y se midieron las unidades de
luz relativas (relative light units, RLU) en un luminómetro después
de la adición de un sustrato de luciferasa. Los resultados obtenidos
se muestran como la cantidad de veces de inducción de las RLU de
las muestras experimentales con respecto al control con medio
solamente (RLU de las muestras experimentales/RLU de medio
solo=cantidad de veces de inducción). La Tabla 13 muestra que la
IL-28A,
IL-29, IL-28B, zcyto24 y zcyto25 inducen señalización de ISRE en las células hepáticas humanas HepG2 transfectadas con ISRE-luciferasa.
IL-29, IL-28B, zcyto24 y zcyto25 inducen señalización de ISRE en las células hepáticas humanas HepG2 transfectadas con ISRE-luciferasa.
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Se adaptó una valoración antiviral para EMCV
(American Type Culture Collection N.º VR-129B,
Manassas, VA) con células humanas (Familletti, P., et al.,
Methods Enzym. 78: 387-394, 1981). Se
sembraron las células con citocinas y se incubaron durante 24 horas
antes de estimularlas con EMCV con una multiplicidad de infección
de 0,1 a 1. Se analizó la viabilidad de las células con un bioensayo
de captación de tinción 24 horas después de la infección (Berg, K.,
et al., Apmis 98: 156-162,
1990). A las células diana se les dio bromuro de
3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio
[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
bromide, MTT] y se las incubó a 37ºC durante 2 horas. Se agregó una
solución solubilizadora, se incubó de un día para el otro a 37ºC y
se determinó la densidad óptica a 570 nm. La OD570 es directamente
proporcional a la actividad antiviral.
Los resultados muestran la actividad antiviral
cuando la IL-29 y el IFN se probaron con células
HepG2: Se agregaron IL-29,
IFN-\beta e IFN\alpha-2a en
diferentes concentraciones a células HepG2 antes de la infección
por EMCV y de la valoración de captación de tinción. Se graficaron
la media y la desviación típica de la OD570 de pocillos por
triplicado. La OD570 es directamente proporcional a la actividad
antiviral. Para la IL-29, la CE50 fue de 0,60
ng/ml; para el
IFN-\alpha2a, la CE50 fue de 0,57 ng/ml; y para el IFN-\beta, la CE50 fue de 0,46 ng/ml.
IFN-\alpha2a, la CE50 fue de 0,57 ng/ml; y para el IFN-\beta, la CE50 fue de 0,46 ng/ml.
A fin de examinar en mayor profundidad la
distribución del ARNm para el IL-28RA, se realizó
una RT-PCR semicuantitativa utilizando el sistema
SDS 7900HT (Applied Biosystems, CA). Se realizó una
RT-PCR de un solo paso con 100 ng de ARN total para
cada muestra y cebadores específicos para el gen. Se generó una
curva estándar para cada conjunto de cebadores con el ARN Bjab y
todos los valores de las muestras se normalizaron a la HPRT. Los
resultados normalizados se resumen en las Tablas 14 a 17. También
se muestran los valores normalizados para IFNAR2 y
CRF2-4.
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Como se muestra en la Tabla 14, el tejido
hepático normal y las líneas celulares derivadas del hígado normales
muestran niveles sustanciales de ARNm del IL-28RA y
de CRF2-4.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Como se muestra en la Tabla 15, las células
epiteliales de las vías aéreas primarias contienen niveles
abundantes de IL-28RA y CRF2-4.
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Como se muestra en la Tabla 16, el
IL-28RA está presente en las muestras de hígado
normales y enfermas, con una mayor expresión en tejido de muestras
infectadas con hepatitis B y hepatitis C.
Como se muestra en las Tablas 18 a 22, el
IL-28RA es detectable en las células B normales, en
las líneas de células B de linfoma, en las células T, en las líneas
de células T de linfoma (Jurkat), en los linfocitos normales y
transformados (células B y células T) y en los monocitos humanos
normales.
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\vskip1.000000\baselineskip
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Se suspendieron células Daudi humanas en
RPMI+FBS al 10% a razón de 50.000 células/mililitro y se sembraron
5.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos. Se agregaron
IL-29-CEE (IL-29
conjugada con etiqueta glu), IFN-\gamma o
IFN-\alpha2a a cada pocillo en diluciones seriadas
dos veces mayores. La IL-29-CEE se
utilizó en un rango de concentraciones de entre 1.000 ng/ml y 0,5
ng/ml. El IFN-\gamma se utilizó en un rango de
concentraciones de entre 125 ng/ml y 0,06 ng/ml. El
IFN-\alpha2a se utilizó en un rango de
concentraciones de entre 62 ng/ml y 0,03 ng/ml. Las células se
incubaron durante 72 h a 37ºC. Después de 72 h, se agregó Alamar
Blue (Accumed, Chicago, IL) a razón de 20 microlitros/pocillo. Las
placas se volvieron a incubar a 37ºC, con CO al 5%, durante 24
horas. Las placas se leyeron en la lectora de placas Fmax^{TM}
(Molecular Devices Sunnyvale, CA) utilizando el programa
SoftMax^{TM} Pro, a las longitudes de onda de 544 (Excitación) y
590 (Emisión). El Alamar Blue proporciona una lectura fluorométrica
basada en la actividad metabólica de las células y, por ende, es
una medición directa de la proliferación celular, en comparación con
un control negativo. Los resultados indican que la
IL-29-CEE, en contraposición con el
IFN-\alpha2a, no tiene un efecto significativo
sobre la proliferación de las células Daudi.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aislaron células B de ratón de 2 bazos de
ratones Balb/C (7 meses de vida) por reducción de células CD43+
utilizando perlas magnéticas MACS. Las células B purificadas se
cultivaron in vitro con anticuerpos monoclonales LPS,
anti-IgM o anti-CD40. Se agregó
IL-28 de ratón o IFN\alpha de ratón a los cultivos
y se agregó ^{3}H-timidina a las 48 horas. y se
midió la incorporación de la ^{3}H-timidina al
cabo de 72 h en cultivo.
El IFN\alpha a 10 ng/ml inhibió la
incorporación de ^{3}H-timidina por parte de las
células B de ratón estimuladas con LPS o anti-IgM.
Por el contrario, la IL-28 de ratón no inhibió la
incorporación de ^{3}H-timidina a ninguna de las
concentraciones probadas, incluida la de 1.000 ng/ml. Por
contraposición, tanto el IFN\alpham como la IL-28
de ratón aumentaron la incorporación de ^{3}H timidina por parte
de las células B de ratón estimuladas con anticuerpo monoclonal
anti-CD40.
Estos datos demuestran que la
IL-28 de ratón, a diferencia del IFNa, no muestra
actividad antiproliferativa, incluso a altas concentraciones.
Además, la zcyto24 potencia la proliferación en presencia de
anticuerpos monoclonales anti-CD40. Los resultados
ilustran que la IL-28 de ratón difiere del
IFN\alpha porque la IL-28 de ratón no muestra
actividad antiproliferativa sobre las células B de ratón, incluso a
altas concentraciones. Además, la IL-28 de ratón
potencia la proliferación en presencia de anticuerpos monoclonales
anti-CD40.
Se adhirieron células mononucleares de médula
humanas frescas (Poietic Technologies, Gaithersburg, Md.) a
plástico durante 2 h en \alphaMEM, FBS al 10%,
\beta-mercaptoetanol 50 micromolar, 2 ng/ml de
FLT3L a 37ºC. Las células no adherentes se sembraron a razón de
entre 25.000 y 45.000 células/pocillo (placas de cultivo de tejidos
de 96 pocillos) en \alphaMEM, FBS al 10%,
\beta-mercaptoetanol 50 micromolar, 2 ng/ml de
FLT3L en presencia o en ausencia de 1.000 ng/ml de
IL-29-CEE, 100 ng/ml de
IL-29-CEE, 10 ng/ml de
IL-29-CEE, 100 ng/ml de
IFN-\alpha2a, 10 ng/ml de
IFN-\alpha2a o 1 ng/ml de
IFN-\alpha2a. Estas células se incubaron con una
variedad de citocinas para probar la expansión o diferenciación de
células hematopoyéticas de la médula ósea (20 ng/ml de
IL-2, 2 ng/ml de IL-3, 20 ng/ml de
IL-4, 20 ng/ml de IL-5, 20 ng/ml de
IL-7, 20 ng/ml de IL-10, 20 ng/ml de
IL-12, 20 ng/ml de IL-15, 10 ng/ml
de IL-21 o sin citocina agregada). Después de 8 a
12 días se agregó Alamar Blue (Accumed, Chicago, Ill.) a razón de 20
microlitros/pocillo. Las placas se volvieron a incubar a 37ºC, con
CO2 al 5%, durante 24 horas. Las placas se leyeron en la lectora de
placas Fmax^{TM} (Molecular Devices Sunnyvale, Calif.) utilizando
el programa SoftMax^{TM} Pro, a las longitudes de onda de 544
(Excitación) y 590 (Emisión). El Alamar Blue proporciona una lectura
fluorométrica basada en la actividad metabólica de las células y,
por ende, es una medición directa de la proliferación celular, en
comparación con un control negativo.
El IFN-\alpha2a causó una
inhibición significativa de la expansión de la médula ósea en todas
las condiciones probadas. Por contraposición, la
IL-29 no tuvo un efecto significativo sobre la
expansión de las células de la médula ósea en presencia de
IL-3, IL-4, IL-5,
IL-7, IL-10, IL-12,
IL-21 o sin citocina agregada. Se observó una
pequeña inhibición de la expansión de las células de la médula ósea
en presencia de IL-2 o IL-15.
\vskip1.000000\baselineskip
Puede utilizarse una valoración de indicadores
de transducción de señal para mostrar las propiedades inhibidoras
de los receptores solubles homodiméricos
zcytor19-Fc4 y heterodimérico
zcytor19-Fc/CRF2-4-Fc
sobre la señalización de la zcyto20, zcyto21 y zcyto24. Se
transfectan células de riñón embrionario humano (HEK) que
sobreexpresan el receptor zcytor19 con un plásmido indicador que
contiene un elemento de respuesta estimulado por interferón (ISRE)
que dirige la transcripción de un gen indicador de luciferasa. La
actividad de la luciferasa después de la estimulación de las
células transfectadas con ligandos (incluidas la zcyto20 (SEC. ID.
N.º 2), la zcyto21 (SEC. ID. N.º 4) y la zcyto24 (SEC. ID. N.º 8))
refleja la interacción del ligando con el receptor soluble.
Se transfectaron células HEK 293 que
sobreexpresaban el zcytor19 de la siguiente manera: se sembraron
700.000 células 293/pocillo (placas de 6 pocillos) aproximadamente
18 h antes de la transfección en 2 mililitros de DMEM+
suero fetal bovino al 10%. Por pocillo, se agregaron 1 microgramo de ADN de pISRE-luciferasa (Stratagene), y 1 microgramo de ADN de pIRES2-EGFP (Clontech) a 6 microlitros de reactivo Fugene 6 (Roche Biochemicals) en un total de 100 microlitros de DMEM. Esta mezcla de transfección se agregó, 30 minutos más tarde, a las células 293 sembradas previamente. Veinticuatro horas más tarde, las células transfectadas se retiraron de la placa con tripsina-EDTA y se volvieron a sembrar a razón de 25.000 células/pocillo en placas de microtitulación de 96 pocillos. Aproximadamente 18 h antes de la estimulación con el ligando, se cambió el medio a DMEM+FBS al 0,5%.
suero fetal bovino al 10%. Por pocillo, se agregaron 1 microgramo de ADN de pISRE-luciferasa (Stratagene), y 1 microgramo de ADN de pIRES2-EGFP (Clontech) a 6 microlitros de reactivo Fugene 6 (Roche Biochemicals) en un total de 100 microlitros de DMEM. Esta mezcla de transfección se agregó, 30 minutos más tarde, a las células 293 sembradas previamente. Veinticuatro horas más tarde, las células transfectadas se retiraron de la placa con tripsina-EDTA y se volvieron a sembrar a razón de 25.000 células/pocillo en placas de microtitulación de 96 pocillos. Aproximadamente 18 h antes de la estimulación con el ligando, se cambió el medio a DMEM+FBS al 0,5%.
Las valoraciones de los indicadores de señal se
realizaron de la siguiente manera: después de una incubación de 18
h a 37ºC en DMEM+FBS al 0,5%, las células transfectadas se
estimularon con 10 ng/ml de zcyto20, zcyto21 o zcyto24 y 10
microgramos/ml de los siguientes receptores solubles, homodímero
zcytor19-Fc humano, heterodímero
zcytor19-Fc
humano/CRF2-4-Fc humano, homodímero
CRF2-4-Fc humano, homodímero
zcytor19-Ig murino. Después de una incubación de 4
horas a 37ºC, se lisaron las células y se midieron las unidades de
luz relativas (RLU) en un luminómetro después de la adición de un
sustrato de luciferasa. Los resultados obtenidos se muestran como
porcentaje de inhibición de la señalización inducida por el ligando
en presencia del receptor soluble en relación con la señalización
en presencia de PBS solamente. La Tabla 23 muestra que el receptor
soluble heterodimérico humano
zcytor19-Fc/CRF2-4 humano puede
inhibir la zcyto20, zcyto21 y la señalización inducida por la
zcyto24 entre un 16% y un 45% con respecto al control. El receptor
soluble homodimérico humano zcytor19-Fc también
puede inhibir la señalización inducida por la zcyto21 en un 45%. No
se observaron efectos significativos con los receptores solubles
homodiméricos huCRF2-4-Fc ni
muzcytor19-Ig.
El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es
un retrovirus patógeno que infecta las células del sistema
inmunitario. Las células T CD4 y los monocitos son los principales
tipos celulares infectados. Para probar la capacidad de la
IL-28 y la IL-29 de inhibir la
replicación del VIH in vitro, se infectaron PBMC de donantes
normales con el virus VIH en presencia de IL-28,
IL-29 y
MetIL-29C172S-PEG.
Se aislaron células mononucleares de sangre
periférica (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) humanas
frescas de sangre entera obtenida de donantes seleccionados que eran
seronegativos para VIH y HBV. Las células de sangre periférica se
sedimentaron y se lavaron 2-3 veces mediante
centrifugación a baja velocidad y se las resuspendió en PBS para
eliminar las plaquetas contaminantes. Las células sanguíneas lavadas
se diluyeron 1:1 con solución salina amortiguada con fosfato de
Dulbecco (Dulbecco's phosphate buffered saline,
D-PBS) y se estratificaron sobre 14 ml de medio
para separación de linfocitos (Lymphocyte Separation Medium, LSM;
cellgro^{TM} de Mediatech, Inc. Herndon, VA); densidad 1,078
+/-0,002 g/ml) en un tubo de centrifugado de 50 ml y se las
centrifugó durante 30 minutos a 600xG. Las PBMC en bandas se
aspiraron suavemente de la interfaz resultante y, posteriormente,
se lavaron 2X en PBS mediante centrifugación a baja velocidad.
Después del lavado final, se contaron las células mediante
exclusión con azul de tripán a 1x10^{7} células/ml en RPMI 1640
suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 15%,
L-glutamina 2 mM, 4 \mug/ml de
PHA-P. Se dejó incubar las células durante 48 a 72
horas a 37ºC. Después de la incubación, las PBMC se centrifugaron y
se resuspendieron en RPMI 1640 con FBS al 15%,
L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina, 100
\mug/ml de estreptomicina, 10 \mug/ml de gentamicina, y 20 U/ml
de IL-2 humana recombinante. Las PBMC se mantuvieron
en el medio a una concentración de 1-2x10^{6}
células/ml con cambios de medio bisemanales hasta que se los utilizó
en el protocolo de la valoración. Los monocitos fueron reducidos
del cultivo como consecuencia de su adhesión al matraz de cultivo de
tejidos.
Para la valoración de PBMC estándar, se
agruparon células estimuladas con PHA-P de, al
menos, dos donantes normales, diluidas en medio fresco hasta una
concentración de 1x10^{6} células/ml, y se sembraron en los
pocillos interiores de una microplaca de 96 pocillos de fondo
redondo a razón de 50 \mul/pocillo (5x10^{4} células/pocillo).
Se prepararon diluciones de prueba a una concentración de 2X en
tubos de microtitulación y se colocaron 100 \mul de cada
concentración en pocillos adecuados en formato estándar. Se
agregaron IL-28, IL-29 y
MetIL-29C172S-PEG a concentraciones
de entre 0 y 10 \mug/ml, habitualmente en diluciones de 1/2
unidad en escala logarítmica. Se colocaron 50 \mul de una dilución
predeterminada de lote de virus en cada pocillo de prueba (MOI
final de 0,1). Los pocillos en los que solo se agregaron células y
virus se utilizaron para control del virus. Se prepararon placas
idénticas por separado sin virus para estudios de citotoxicidad del
fármaco utilizando un sistema de valoración MTS. Los cultivos de
PBMC se mantuvieron durante siete días después de la infección, en
cuyo momento se recolectaron muestras de sobrenadante sin células y
se realizó la valoración de la actividad de la transcriptasa inversa
y de los niveles de antígeno p24.
Una disminución de la actividad de la
transcriptasa inversa o de los niveles de antígeno p24 con
IL-28, IL-29 y
MetIL-29C172S-PEG serían indicadores
de actividad antiviral. El resultado demostraría que la
IL-28 y la IL-29 pueden tener un
valor terapéutico para tratar el VIH y el SIDA.
El HCV es un virus del ARN perteneciente a la
familia Flaviviridae. El HCV no se replica bien ni en
cultivos ex-vivo ni in vitro y, por
lo tanto, no existen sistemas satisfactorios para probar la
actividad anti-HCV de la moléculas in vitro.
El GBV-B es un modelo sustituto atractivo para usar
en el desarrollo de agentes antivirales contra el HCV ya que tiene
un nivel relativamente alto de identidad de secuencias con el HCV y
es un virus hepatotrópico. A la fecha, el virus solo puede
cultivarse en los hepatocitos primarios de determinados primates no
humanos. Esto se consigue aislando los hepatocitos in vitro e
infectándolos con GBV-B, o aislando los hepatocitos
de monos tití infectados con el GBV-B y usándolos
directamente con compuestos antivirales.
Los efectos de la IL-28,
IL-29 y
MetIL-29C172S-PEG se valoran en
cuanto a la producción de ARN extracelular en GBV-B
mediante RT-PCR TaqMan y en cuanto a la
citotoxicidad usando el reactivo CellTiter96® (Promega, Madison,
WI) a seis diluciones de media unidad en escala logarítmica de
polipéptido de la IL-28, la IL-29 o
la MetIL-29C172S-PEG por
triplicado. Los cultivos no tratados sirven como controles celulares
y virales. Se incluyen tanto ribavirin® (200 \mug/ml a la máxima
concentración de prueba) e IFN-\alpha (5.000 UI/ml
a la máxima concentración de prueba) como compuestos control
positivo. Se aíslan los cultivos de hepatocitos primarios y se
siembran en placas recubiertas con colágeno. Al día siguiente, se
tratan los cultivos con las muestras de prueba
(IL-28, IL-29,
MetIL-29C172S-PEG, IFN\alpha, o
ribavirin®) durante 24 horas antes de exponerlos a los viriones de
GBV-B o se tratan directamente con las muestras de
prueba cuando se usan hepatocitos infectados in vivo. Las
muestras y los medios de prueba se agregan al día siguiente y se
reemplazan tres días más tarde. Tres o cuatro días mas tarde (al
menos, entre 6 y 7 días después de la adición de la muestra de
prueba) se recolecta el sobrenadante y se cuantifican las
cantidades de células con CellTiter96®. Se extrae el ARN viral del
sobrenadante y se lo cuantifica con réplicas por triplicado en una
valoración de RT-PCR TaqMan cuantitativa utilizando
un ARN transcrito in vitro que contiene la diana de la
RT-PCR como estándar. Se computa el promedio de las
muestras replicadas. Se evalúa la inhibición de la producción de
virus graficando los promedios de los valores de ARN y de la
cantidad de células de las muestras por triplicado en relación con
los controles virales y celulares no tratados. La concentración
inhibitoria de fármaco que resulta en un 50% de inhibición de la
producción de ARN del GBV-B (CI50) y la
concentración tóxica que tiene como resultado la destrucción del 50%
de las cantidades de células en relación con los valores de control
(CT50) se calculan por interpolación a partir de los gráficos
creados con los datos.
La inhibición de la producción de ARN del
GBV-B por parte de la IL-28 y la 29
es una indicación de las propiedades antivirales de la
IL-28 y la IL-29 sobre este virus
similar al de la hepatitis C en los hepatocitos, el principal
órgano de infección de la hepatitis C y los resultados positivos
sugieren que la IL-28 o la IL-29
pueden ser útiles para tratar las infecciones por HCV en seres
humanos.
\vskip1.000000\baselineskip
La hepatitis B (HBV) crónica es una de las
infecciones virales más comunes y graves de los seres humanos, que
pertenece a la familia de virus Hepadnaviridae. Para probar
las actividades antivirales de la IL-28 y la
IL-29 contra el HBV, se probaron la
IL-28, la IL-29 y la
MetIL-29C172S-PEG contra el HBV en
un sistema de infección in vitro utilizando una variante de
la línea celular hepática humana HepG2. La IL-28, la
IL-29 y la
MetIL-29C172S-PEG inhibieron la
replicación viral en este sistema, lo cual sugiere un valor
terapéutico para tratar el HBV en seres humanos.
Las células WT10 derivan de la línea celular
hepática humana HepG2 2.2.15. Las células WT10 se transfectan en
forma estable con el genoma del HBV lo cual permite una expresión
estable de los transcriptos del HBV en la línea celular (Fu y
Cheng, Antimicrobial Agents Chemother.
44(12):3402-3407, 2000). En la
valoración de las células WT10 se valorarán el fármaco en cuestión
y un control 3TC a cinco concentraciones cada una, diluidas en una
serie de media unidad en escala logarítmica. Los criterios de
valoración son PCR TaqMan para el ADN del HBV extracelular (CI50) y
las cantidades de células utilizando el reactivo CellTiter96 (CT50).
La valoración es similar a la descrita por Korba et al.
Antiviral Res. 15(3):217-228,
1991 y Korba et al., Antiviral Res.
19(1):55-70, 1992. En resumen, se
siembran células WT10 en placas de microtitulación de 96 pocillos.
Después de entre 16 y 24 horas, se lava la monocapa confluente de
células HepG2-2.2.15 y se reemplaza el medio por
medio completo que contiene diversas concentraciones de una muestra
de prueba por triplicado. El 3TC se usa como control positivo,
mientras que se agrega a las células medio solo, como control
negativo (control viral, CV). Tres días después, se reemplaza el
medio de cultivo por medio fresco que contiene las muestras de
prueba diluidas adecuadamente. Seis días después de la adición
inicial del compuesto de prueba, se recolecta el sobrenadante del
cultivo celular, se trata con pronasa y DNasa, y se lo usa en una
valoración mediante PCR TaqMan cuantitativa, en tiempo real. El ADN
del HBV amplificado mediante PCR se detecta en tiempo real
monitoreando los aumentos en las señales de fluorescencia que se
producen como resultado de la degradación exonucleolítica de una
molécula de sonda fluorescente inhibida que se hibrida al ADN del
HBV amplificado. Para cada amplificación mediante PCR, se genera
simultáneamente una curva estándar utilizando diluciones de ADN del
HBV purificado. La actividad antiviral se calcula a partir de la
reducción de los niveles de ADN del HBV (CI_{50}). Luego se
utiliza una valoración de captación de tinción para medir la
viabilidad celular que se utiliza para calcular la toxicidad
(CT_{50}). El índice terapéutico (IT) se calcula como
CT_{50}/CI_{50}.
La IL-28, la
IL-29 y la
MetIL-29C172S-PEG inhibieron la
replicación viral de HepB en las células WT10 con una CI50
<0,032 ug/ml. Esto demuestra la actividad antiviral de la
IL-28 y la IL-29 contra el HBV
desarrollado en líneas celulares hepáticas, lo cual proporciona
evidencia del valor terapéutico para tratar el HBV en
pacientes
humanos.
humanos.
\newpage
El HCV es un virus del ARN perteneciente a la
familia Flaviviridae. Otros virus pertenecientes a esta familia son
el virus de la diarrea viral bovina (bovine viral diarrhea virus,
BVDV) y el virus de la fiebre amarilla (yellow fever virus, YFV).
El HCV no se replica bien ni en cultivos
ex-vivo ni in vitro y, por lo tanto,
no existen sistemas para probar la actividad
anti-HCV in vitro. Las valoraciones del BVDV
y del YFV se usan como virus sustitutos del HCV para probar las
actividades antivirales contra la familia de virus
Flaviviridae.
Se evaluaron los efectos antivirales de la
IL-28, la IL-29 y la
MetIL-29C172S-PEG en valoraciones de
inhibición del efecto citopático (CPE). La valoración midió la
muerte celular utilizando células renales bovinas
Madin-Darby (Madin-Darby bovine
kidney cells, MDBK) después de la infección con virus BVDV
citopático y la inhibición de la muerte celular por la
IL-28, la IL-29 y la
MetIL-29C172S-PEG. Se propagaron las
células MDBK en medio esencial modificado de Dulbecco (DMEM) que
contenía rojo fenol con suero equino al 10%, glutamina al 1% y
penicilina-estreptomicina al 1%. Se realizaron
valoraciones de la inhibición del CPE en DMEM sin rojo fenol, con
FBS al 2%, glutamina al 1% y
penicilina-estreptomicina al 1%. El día anterior a
las valoraciones, se tripsinizaron las células
(tripsina-EDTA al 1%), se lavaron, contaron y
sembraron a razón de 104 células/pocillo en una placa de fondo
plano, de 96 pocillos, BioCoat® (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)
en un volumen de 100 \mul/pocillo. Al día siguiente, se retiró el
medio y se agregó a las células una alícuota de virus pretitulada.
La cantidad de virus fue la dilución máxima que matara la totalidad
de las células (>80%) en el momento del máximo desarrollo del
CPE (día 7 para el BVDV). Se determinó la viabilidad celular con un
reactivo CellTiter96® (Promega) siguiendo el protocolo del
fabricante y usando un lector de placas Vmax (Molecular Devices,
Sunnyvale, CA). Las muestras de prueba se probaron a seis
concentraciones cada una, diluidas en medio de ensayo en series de
media unidad en escala logarítmica. Se usaron IFN\alpha y
ribavirin® como controles positivos. Las muestras de prueba se
agregaron en el momento de la infección viral. Se determinaron el
fondo promedio y los datos de la muestra corregidos por color del
porcentaje de reducción del CPE y el porcentaje de viabilidad
celular a cada concentración en relación con los controles y se
calculó la CI50 en relación con la CT50.
La IL-28, la
IL-29 y la
MetIL-29C172S-PEG inhibieron la
muerte celular inducida por BVDV en células renales bovinas MDBK.
La IL-28 inhibió la muerte celular con una CI_{50}
de 0,02 \mug/ml, la IL-29 inhibió la muerte
celular con una CI_{50} de 0,19 \mug/ml, y la
MetIL-29C172S-PEG inhibió la muerte
celular con una CI_{50} de 0.45 \mug/ml. Esto demostró que la
IL-28 y la IL-29 tienen actividad
antiviral contra la familia de virus Flaviviridae.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron células mononucleares de sangre
periférica humana recién aisladas en presencia de
IL-29 (20 ng/ml), IFN\alpha2a (2 ng/ml) (PBL
Biomedical Labs, Piscataway, NJ) o en medio solo. Las células se
incubaron durante 6, 24, 48 ó 72 horas y, luego, se aisló el ARN
total y se lo trató con DNasa sin RNasa. Se usaron 100 ng de ARN
total como plantilla para One-Step
Semi-Quantitative RT-PCR® con
reactivos Taqman One-Step RT-PCR
Master Mix® y cebadores específicos para el gen, según la sugerencia
del fabricante (Applied Biosystems, Branchburg, NJ). Los
resultados se normalizaron en relación con la hipoxantina guanina
fosforibosiltransferasa (hypoxanthine guanine phosphoribosyl
transferase, HPRT) y se muestran como la cantidad de veces de
inducción con respecto al control con medio solo para cada punto en
el tiempo. La Tabla 24 muestra que la IL-29 induce
la expresión génica estimulada por interferón en células
mononucleares de sangre periférica humana en todos los puntos en el
tiempo
probados.
probados.
Se aislaron células T humanas por selección
negativa a partir de células mononucleares de sangre periférica
recién cosechadas utilizando el equipo Pan T-cell
Isolation® según las instrucciones del fabricante (Miltenyi,
Auburn, CA). Se activaron las células T y se expandieron durante 5
días con anti-CD3 unido a la placa,
anti-CD28 soluble (0,5 ug/ml), (Pharmingen, San
Diego, CA) e interleucina 2 (IL-2; 100 U/ml)
(R&D Systems, Minneapolis, MN), se lavaron y se expandieron
nuevamente por otros 5 días con IL-2. Después de la
activación y expansión, las células se estimularon con
IL-28A (20 ng/ml), IL-29 (20 ng/ml)
o medio solo durante 3, 6 ó 18 horas. Se aisló el ARN total y se
trató con DNasa sin RNasa. Se realizó la One-Step
Semi-Quantitative RT-PCR® según se
describe en el ejemplo anterior. Los resultados se normalizaron en
relación con la HPRT y se muestran como la cantidad de veces de
inducción con respecto al control con medio solo para cada punto en
el tiempo. La Tabla 25 muestra que la IL-28 y la
IL-29 inducen la expresión génica estimulada por
interferón en las células T humanas activadas en todos los puntos
en el tiempo probados.
\vskip1.000000\baselineskip
Se estimularon hepatocitos humanos recién
aislados de dos donantes distintos (Cambrex, Baltimore, MD y
CellzDirect, Tucson, AZ) con IL-28A (50 ng/ml),
IL-29 (50 ng/ml), IFN\alpha2a (50 ng/ml) o medio
solo, durante 24 horas. Después de la estimulación, se aisló el ARN
total y se trató con DNasa sin RNasa. Se realizó la
RT-PCR semicuantitativa en un solo paso según se
describe en el ejemplo anterior. Los resultados se normalizaron en
relación con la HPRT y se muestran como la cantidad de veces de
inducción con respecto al control con medio solo para cada punto en
el tiempo. La Tabla 26 muestra que la IL-28 y la
IL-29 inducen la expresión génica estimulada por
interferón en hepatocitos humanos primarios después de 24 horas de
estimulación.
Se estimularon células HepG2 y HuH7 (ATCC N.º
8065, Manassas, VA) con IL-28A (10 ng/ml),
IL-29 (10 ng/ml), IFN\alpha2a (10 ng/ml), IFNB (1
ng/ml) (PBL Biomedical, Piscataway, NJ) o medio solo durante 24 ó 48
horas. En un cultivo separado, se estimularon las células HepG2
como se describió anteriormente, con 20 ng/ml de
MetIL-29C172S-PEG o
MetIL-29-PEG. Se aisló el ARN total
y se trató con DNasa sin RNasa. Se usaron 100 ng de ARN total como
plantilla para RT-PCR semicuantitativa de un solo
paso, como se describió anteriormente. Los resultados se
normalizaron en relación con la HPRT y se muestran como la cantidad
de veces de inducción con respecto al control con medio solo para
cada punto en el tiempo. La Tabla 27 muestra que la
IL-28 y la IL-29 inducen la
expresión de la ISG en las líneas celulares de hepatoma de hígado
HepG2 y HuH7 después de 24 y 48 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos mostrados corresponden a 20 ng/ml de
las versiones de MetIL-29-PEG y
MetIL-29C172S-PEG de la
IL-29 después del cultivo durante 24 horas.
Los datos que se muestran están normalizados en
relación con la HPRT y se muestran como la cantidad de veces de
inducción con respecto a las células no estimuladas.
\vskip1.000000\baselineskip
La capacidad de los fármacos antivirales para
inhibir la replicación del HCV puede probarse in vitro en el
sistema de replicones del HCV. El sistema de replicones consta de la
línea celular de hepatoma humano Huh7 que ha sido transfectada con
replicones de ARN subgenómicos que dirigen la replicación
constitutiva de los ARN genómicos del HCV (Blight, K.J. et
al. Science 290:1972-1974, 2000). El tratamiento
de los clones replicones con IFN\alpha a 10 UI/ml reduce la
cantidad de ARN del HCV en un 85% en comparación con las líneas
celulares de control no tratadas. La capacidad de la
IL-28A y la IL-29 para reducir la
cantidad de ARN del HCV producida por los clones replicones en 72
horas indica que el estado antiviral conferido a las células Huh7
por el tratamiento con IL-28A/IL-29
es efectivo para inhibir la replicación de los replicones del HCV y,
por lo tanto, es muy probable que sea efectivo para inhibir la
replicación del HCV.
La capacidad de la IL-28A y la
IL-29 de inhibir la replicación del HCV determinada
por el equipo para ADN de cadena ramificada de Bayer, se realiza en
las siguientes condiciones:
- 1.
- IL-28 sola, a concentraciones crecientes desde (6)* hasta 1,0 \mug/ml
- 2.
- IL-29 sola, a concentraciones crecientes desde (6)* hasta 1,0 \mug/ml
- 3.
- PEGIL29 sola, a concentraciones crecientes desde (6)* hasta 1,0 \mug/ml
- 4.
- IFN\alpha2A solo a 0,3; 1,0 y 3,0 UI/ml
- 5.
- Ribavirin solo.
El control positivo es el IFN\alpha y el
control negativo es el ribavirin.
Las células se tiñen al cabo de 72 horas con
Alamar Blue para evaluar la viabilidad.
*Las concentraciones para las condiciones 1 a 3
son:
1,0 \mug/ml; 0,32 \mug/ml; 0,10 \mug/ml;
0,032 \mug/ml; 0,010 \mug/ml; 0,0032 \mug/ml.
El clon replicón (BB7) se trata 1X por día
durante 3 días consecutivos con las dosis enumeradas anteriormente.
Se mide el ARN del HCV total al cabo de 72 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizan dos métodos para valorar la
actividad antiviral in vitro de la IL-28 y la
IL-29 contra un panel de virus patógenos incluidos,
entre otros, el adenovirus, el virus parainfluenza, el virus
sincicial respiratorio, el rinovirus, el virus de Coxsackie, el
virus de la influenza, el virus de la variolovacuna, el virus del
nilo occidental, el virus del dengue, el virus de la encefalitis
equina venezolana, el virus pichinde y el virus de la
poliomielitis. Estos dos métodos son inhibición del efecto
citopático (CPE) inducido por virus determinado por examen visual
(microscópico) de las células y aumento en la captación de la
tinción rojo neutro (neutral red, NR) por las células. En el método
de la inhibición del CPE, se evalúan siete concentraciones de
fármaco de prueba (diluciones de 10 unidades en escala logarítmica,
como por ejemplo, 1.000; 100; 10; 1; 0,1; 0,01; 0,001 ng/ml) contra
cada virus en microplacas de fondo plano, de 96 pocillos, que
contienen las células huésped. Los compuestos se agregan 24 horas
antes del virus, que se usa a una concentración de aproximadamente
5 a 100 dosis infecciosas de cultivo celular por pocillo, según el
virus, lo cual equivale a una multiplicidad de infección (MOI) de
0,01 a 0,0001 partículas infecciosas por célula. Las pruebas se leen
después de la incubación a 37ºC durante un tiempo especificado,
suficiente para permitir que se desarrolle el efecto citopático
viral. En la valoración de la captación de NR, se agrega una
tinción (concentración del 0,34% en el medio) al mismo juego de
placas que se utilizan para obtener los puntajes visuales. Al cabo
de 2 h, se determina la intensidad del color de la tinción
absorbida por las células y posteriormente eluida por estas,
utilizando un lector automático de microplacas. La actividad
antiviral se expresa como la concentración 50% efectiva (inhibitoria
del virus) (CE50) determinada graficando la concentración del
compuesto en comparación con el porcentaje de inhibición en papel
milimetrado semilogarítmico. En algunos casos, los datos de
CE50/CI50 pueden determinarse utilizando un programa informático de
análisis de regresión adecuado. Por lo general, las CE50
determinadas por valoración de la NR son entre dos y cuatro veces
mayores que las obtenidas por el método del CPE.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los genes estimulados por el interferón
(Interferon stimulated genes, ISG) son genes que son inducidos por
los interferones (IFN) tipo I y también por las moléculas de la
familia de la IL-28 y la IL-29, lo
cual sugiere que el IFN y la IL-28 y la
IL-29 inducen vías similares que llevan a la
actividad antiviral. Los IFN tipo I humanos
(IFN\alpha1-4 e IFN\beta) tienen escasa o nula
actividad sobre las células de ratón, lo cual se considera es
causado por la falta de reactividad cruzada entre especies. Para
probar si la IL-28 y la IL-29
humanas tienen efectos sobre las células de ratón, se evaluó la
inducción de ISG por la IL-28 y la
IL-29 humanas mediante PCR en tiempo real en la
línea celular derivada de hígado de ratón
AML-12.
Se sembraron células AML-12 en
placas de 6 pocillos en medio DMEM completo a una concentración de
2x10^{6} células/pocillo. Veinticuatro horas después de sembrar
las células, se agregaron IL-28 e
IL-29 humanas al cultivo, a una concentración de 20
ng/ml. Como control, las células se estimularon con IFN\alpha de
ratón (control positivo) o no se estimularon (negativo). Las
células se cosecharon 8, 24, 48 y 72 horas después de la adición
de IL-28A (SEC. ID. N.º 2) o IL-29
(SEC. ID. N.º 4) humanas derivadas de CHO. Se aisló el ARN de los
sedimentos celulares usando el equipo RNAEasy-kit®
(Qiagen, Valencia, CA). El ARN se trató con DNasa (Millipore,
Billerica, MA) para limpiar el ARN de cualquier ADN contaminante. Se
generó ADNc con la mezcla Perkin-Elmer RT. Se
evaluó la inducción génica de ISG mediante PCR en tiempo real
utilizando cebadores y sondas específicos para OAS, Pkr y Mx1 de
ratón. Para obtener datos cuantitativos, se duplexó la PCR de la
HPRT en tiempo real con la PCR de ISG. Se obtuvo una curva estándar
utilizando cantidades conocidas de ARN de PBL de ratón estimulados
con IFN. Todos los datos se muestran como expresión relativa a la
expresión de HPRT interna.
La IL-28A e
IL-29 humanas estimularon la inducción de ISG en la
línea celular de hepatocitos de ratón AML-12 y
demostraron que, a diferencia de los IFN tipo I, las proteínas de la
familia de la IL-28/29 mostraron reactividad
cruzada entre especies.
Todos los datos mostrados se expresaron como
cantidad de veces en relación con la expresión del gen de la HPRT
ng de ARNm de OAS=valor normalizado de la cantidad de ARNm de
OAS en relación con el gen de ARNm del HPRT de mantenimiento
interno ng, HPRT.
A modo de ejemplo, se muestran los datos del
punto en el tiempo de 48 horas.
- \quad
- AML 12
Las células se estimularon con 20 ng/ml de
MetIL-29-PEG o
MetIL-29C172S-PEG durante 24
horas.
Los datos que se muestran están normalizados en
relación con la HPRT y se muestran como la cantidad de veces de
inducción con respecto a las células no estimuladas.
Se generaron ratones transgénicos (Tg) que
expresaban la IL-29 humana bajo el control del
promotor Eu-lck. A fin de estudiar si la
IL-29 humana tiene actividad biológica in
vivo en los ratones, se analizó la expresión de ISG mediante
PCR en tiempo real en los bazos de ratones transgénicos
IL-29 Eu-lck.
Los ratones transgénicos (C3H/C57BL/6) se
generaron utilizando un constructo que expresaba el gen de la
IL-29 humana bajo el control del promotor
Eu-lck. Este promotor es activo en las células T y
B. Los ratones transgénicos y sus compañeros de camada no
transgénicos (n=2/grupo) se sacrificaron a alrededor de las 10
semanas de vida. Se aislaron los bazos de los ratones. Se aisló el
ARN de los sedimentos celulares usando el equipo
RNAEasy-kit® (Qiagen). El ARN se trató con DNasa
para limpiar el ARN de cualquier ADN contaminante. Se generó ADNc
con la mezcla Perkin-Elmer RT®. Se evaluó la
inducción génica ISG mediante PCR en tiempo real utilizando
cebadores y sondas (5' FAM, 3' NFQ) específicos para OAS, Pkr y Mx1
de ratón. Para obtener datos cuantitativos, se duplexó la PCR de la
HPRT en tiempo real con la PCR de ISG. Además, se obtuvo una curva
estándar utilizando cantidades conocidas de PBL de ratón
estimulados con IFN. Todos los datos se muestran como expresión
relativa a la expresión de HPRT interna.
Los bazos aislados de los ratones Tg
IL-29 mostraron alta inducción de los ISG de OAS,
Pkr y Mx1 en comparación con sus compañeros de camada no Tg que
sirvieron como controles, lo cual sugiere que la
IL-29 humana es biológicamente activa in vivo
en los ratones.
Todos los datos se muestran como la cantidad de
veces de expresión en relación con la expresión del gen de la HPRT.
Se muestra la expresión promedio en dos ratones.
Para determinar si la IL-28 y la
IL-29 humanas inducen genes estimulados por
interferón in vivo, se inyectaron las proteínas
IL-28A e IL-29 humanas derivadas de
CHO en ratones. Además, se probó también la IL-29
derivada de E. coli en valoraciones in vivo como se
describió anteriormente, utilizando la
MetIL-29C172S-PEG y la
MetIL-29-PEG. En diversos puntos en
el tiempo y a dosis diferentes, se midió la inducción génica de ISG
en la sangre, el bazo y el hígado de los ratones.
Se inyectó por vía i.p. o i.v. a ratones C57BL/6
un rango de dosis (10 \mug-250 \mug) de
IL-28A e IL-29 humanas derivadas de
CHO o MetIL-29C172S-PEG y
MetIL-29C16-C113-PEG.
Los ratones fueron sacrificados en diversos puntos en el tiempo (1
h-48 h). Se aislaron los bazos y los hígados de los
ratones, y se aisló el ARN. También se aisló el ARN de las células
sanguíneas. Se sedimentaron las células y se aisló el ARN de los
sedimentos con un equipo RNAEasy® (Qiagen). El ARN se trató con
DNasa (Amicon) para limpiar el ARN de cualquier ADN contaminante.
Se generó ADNc con la mezcla Perkin-Elmer RT (Perkin
Elmer). Se midió la inducción génica de ISG mediante PCR en tiempo
real utilizando cebadores y sondas específicos para OAS, Pkr y Mx1
de ratón. Para obtener datos cuantitativos, se duplexó la PCR de la
HPRT en tiempo real con la PCR de ISG. Se calculó una curva estándar
utilizando cantidades conocidas de PBL de ratón estimulados con
IFN. Todos los datos se muestran como expresión relativa a la
expresión de HPRT interna.
La IL-29 humana indujo la
expresión génica de ISG (OAS, Pkr, Mx1) en el hígado, el bazo y la
sangre de ratones, en forma dependiente de la dosis. La expresión
de ISG alcanzó su pico entre 1 y 6 horas después de la inyección y
mostró una expresión sostenida por encima de los ratones de control
hasta 48 horas. En este experimento, la IL-28A
humana no indujo la expresión génica de ISG.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados se muestran como la cantidad de
veces de expresión en relación con la expresión del gen de la HPRT.
Se muestra, a manera de ejemplo, un conjunto de datos de la OAS
inducida en hígado por la IL-29 con una sola
inyección de 250 \mug i.v. Los datos que se muestran corresponden
a la expresión promedio de 5 animales diferentes/grupo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inyectó a los ratones 100 \mug de proteínas
i.v. Los datos mostrados corresponden a la cantidad de veces de
expresión por sobre la expresión de la HPRT de hígados de ratones.
Se obtuvieron datos similares de la sangre y el bazo de los
ratones.
Para analizar el efecto de la
IL-28 y la IL-29 humanas en la
inducción de proteína de ISG (OAS), se probaron el suero y el
plasma de ratones tratados con IL-28 e
IL-29 para determinar la actividad de OAS.
Se inyectó a ratones C57BL/6 PBS i.v. o un rango
de concentraciones (10 \mug-250 \mug) de
IL-28 o IL-29 humanas. Se aislaron
el suero y el plasma de ratones en diversos puntos en el tiempo y se
midió la actividad de la OAS con el equipo de radioinmunoensayo
(radioimmunoassay, RIA) de OAS de Eiken Chemicals (Tokio,
Japón).
La actividad de la OAS inducida por la
IL-28 y la IL-29 en el suero y el
plasma de ratones muestra que estas proteínas son biológicamente
activas in vivo.
Se muestra la actividad de la OAS en pmol/dl de
plasma para una sola concentración (250 \mug) de
IL-29 humana.
A fin de probar las actividades antivirales de
la IL-28 y la IL-29 contra virus que
infectan el hígado, las muestras de prueba se probaron en ratones
contra vectores adenovirales infecciosos que expresan un gen de
proteína fluorescente verde (green fluorescent protein, GFP)
interno. Cuando se los inyecta por vía intravenosa, estos virus
apuntan principalmente al hígado para la expresión génica. Los
adenovirus son deficientes en cuanto a la replicación, pero causan
daño hepático debido al infiltrado de células inflamatorias que
puede monitorearse midiendo los niveles en suero de las enzimas
hepáticas como la AST y la ALT o por examen directo de la patología
hepática.
Una vez por día, se administraron a ratones
C57Bl/6 inyecciones intraperitoneales de 50 \mug de
IL-28 de ratón (zcyto24 como se muestra en la SEC.
ID. N.º 8) o MetIL-29C172S- PEG durante 3 días. A
los animales de control se les inyectó PBS. Una hora después de la
3.ª dosis, se administró a los ratones una sola inyección
intravenosa por bolo en la vena caudal del vector viral, AdGFP
(1X10^{9} unidades formadoras de placa
(plaque-forming units, pfu). Después de esto, día
por medio se les dio a los ratones una dosis adicional de PBS,
IL-28 de ratón o
MetIL-29C172S-PEG por 4 dosis más
(total de 7 dosis). Una hora después de la dosis final de PBS,
IL-28 de ratón o
MetIL-29C172S-PEG se desangraron los
ratones en forma terminal y se sacrificaron. Se analizaron el suero
y el tejido hepático. El suero se analizó para determinar las
enzimas hepáticas AST y ALT. El hígado se aisló y se lo analizó
para determinar la expresión de GFP y la histología. Para la
histología, las muestras de hígado se fijaron en formalina y luego
se incluyeron en parafina, para luego teñirse con hematoxilina y
eosina. Los cortes de hígado que habían sido puestos a ciego para el
tratamiento se examinaron con un microscopio óptico. Se tomó nota
de los cambios y se los calificó en una escala diseñada para medir
la patología hepática y la inflamación.
La IL-28 y la
IL-29 de ratón inhibieron la infección y la
expresión génica adenoviral medidas por fluorescencia hepática. Los
ratones tratados con PBS (n=8) tuvieron una fluorescencia hepática
promedio relativa de 52,4 (unidades arbitrarias). En
contraposición, los ratones tratados con IL-28 (n=8)
tuvieron una fluorescencia hepática relativa de 34,5 y los ratones
tratados con IL-29 (n=8) tuvieron una fluorescencia
hepática relativa de 38,9. Una reducción en la infección y en la
expresión génica adenoviral llevó a una menor patología hepática
medida por los niveles séricos de ALT y AST y por la histología. Los
ratones tratados con PBS (n=8) tuvieron una AST sérica promedio de
234 U/l (unidades/litro) y una ALT sérica de 250 U/l. En
contraposición, los ratones tratados con IL-28
(n=8) tuvieron un promedio de AST sérica de 193 U/l y de ALT sérica
de 216 U/l, y los ratones tratados con IL-29 (n=8)
tuvieron un promedio de AST sérica de 162 U/l y de ALT sérica de 184
U/l. Además, la histología hepática indicó que los ratones a los
que se les administró IL-28 o IL-29
de ratón tuvieron menores puntajes hepáticos y de inflamación que
el grupo tratado con PBS. Los hígados del grupo tratado con
IL-29 además tenían menos proliferación de células
sinusoidales, menos figuras mitóticas y menos cambios en los
hepatocitos (p. ej. vacuolación, presencia de múltiples núcleos,
agrandamiento de los hepatocitos) que el grupo tratado con PBS.
Estos datos demuestran que la IL-28 y la
IL-29 de ratón tienen propiedades antivirales contra
un virus trófico para el hígado.
Las infecciones por el virus de la
coriomeningitis linfocítica (Lymphocytic choriomeningitis virus,
LCMV) en ratones son un excelente modelo de infección aguda y
crónica. Estos modelos se usan para evaluar el efecto de las
citocinas sobre la respuesta inmunitaria antiviral y los efectos de
la IL-28 y la IL-29 en la carga
viral y la respuesta inmunitaria antiviral. Los dos modelos
utilizados son: infección por LCMV Armstrong (agudo) e infección
por el Clon 13 del LCMV (crónico). (Véanse, p. ej. Wherry et
al., J. Virol. 77:4911-4927,
2003; Blattman et al., Nature Med.
9(5):540-547, 2003; Hoffman et
al., J. Immunol. 170:1339-1353,
2003). Hay tres etapas del desarrollo de las células T CD8 en
respuesta a los virus: 1) expansión, 2) contracción y 3) memoria
(modelo agudo). La IL-28 o la IL-29
se inyectan durante cada etapa tanto para el modelo agudo como para
el crónico. En el modelo crónico, la IL-28 o la
IL-29 se inyectan 60 días después de la infección
para evaluar el efecto de la IL-28 o la
IL-29 en la carga viral persistente. Tanto para el
modelo agudo como para el crónico, se inyectan la
IL-28 o la IL-29, y se examina la
carga viral en la sangre, el bazo y el hígado. Otros parámetros que
pueden examinarse incluyen: tinción de tetrámeros por flujo para
contar la cantidad de células T CD8+ específicas para LCMV; la
capacidad de las células tetrámero+ de producir citocinas al
estimularlas con su antígeno LCMV cognado; y la capacidad de las
células CD8+ específicas para LCMV de proliferar en respuesta a su
antígeno LCMV cognado. Las células T específicas para LCMV se
fenotipifican por citometría de flujo para evaluar el estado de
activación y diferenciación de las células. Además, se examina la
capacidad de las CTL específicas para LCMV para lisar las células
diana que llevan el antígeno LCMV cognado. También se evalúan la
cantidad y la función de las células T CD4+ específicas para
LCMV.
Se determina una reducción en la carga viral
después del tratamiento con la IL-28 o la
IL-29. Una reducción del 50% en la carga viral en
cualquier órgano, en particular en el hígado, sería significativa.
Para los ratones tratados con IL-28 o
IL-29, un aumento del 20% en el porcentaje de
células T positivas para tetrámeros que proliferen, fabriquen
citocina o exhiban un fenotipo maduro en relación con los ratones no
tratados también se consideraría significativo.
El hecho de que una inyección de
IL-28 o IL-29 produzca una reducción
en la carga viral se debe a un control más efectivo de la infección
viral, en particular en el modelo crónico, donde si los títulos
virales no son tratados, permanecen elevados durante un período
prolongado. Se considera que una reducción de dos veces en el
título viral, en relación con los ratones no tratados, es
significativa.
Para determinar la actividad antiviral de la
IL-28 o la IL-29 en la infección
aguda por el virus de la influenza, se realiza un estudio
in vivo con ratones c57B1/6 infectados con influenza,
mediante el siguiente protocolo:
Animales: Ratones BALB/c hembras de 6 semanas
(Charles River) con 148 ratones, 30 por grupo.
Grupos:
- (1)
- Control absoluto (no infectado) para funcionar en paralelo para título de anticuerpo e histopatología (2 animales por grupo)
- (2)
- Vehículo (i.p.), solución salina
- (3)
- Amantadina (control positivo) 10 mg/día durante 5 días (por vía oral) comenzando 2 horas antes de la infección
- (4)
- Tratado con IL-28 o IL-29 (5 \mug, i.p. comenzando 2 horas después de la infección)
- (5)
- IL-28 o IL-29 (25 \mug, i.p. comenzando 2 horas después de la infección)
- (6)
- IL-28 o IL-29 (125 \mug, i.p. comenzando 2 horas después de la infección)
\vskip1.000000\baselineskip
Día 0: Excepto por los controles absolutos,
todos los animales son infectados por el virus de la influenza
Para carga viral (10 a DL50)
Para estudios inmunológicos (DL30)
Día 0 a 9: Inyecciones diarias de
IL-28 o IL-29 (i.p.)
Se registran el peso corporal y el aspecto
general (3 veces/semana)
Día 3: Sacrificio de 8 animales por grupo
Carga viral en pulmón derecho (CTDI50)
Histopatología del pulmón izquierdo
Muestra de sangre para titulación de
anticuerpo
Día 10: Sacrificio de todos los animales
sobrevivientes, recolectando muestras para titulación de anticuerpo,
aislando linfocitos pulmonares (4 grupos de 3) para valoración
directa de CTL (en los 5 grupos) e inmunofenotipificación para los
siguientes marcadores: CD3/CD4, CD3/CD8, CD3/CD8/CD11b,
CD8/CD44/CD62L, CD3/DX5, GR-1/F480 y CD19.
\vskip1.000000\baselineskip
Estudio N.º 2
Grupo 1: Vehículo (i.p.)
Grupo 2: Control positivo: anticuerpo
neutralizante antiinfluenza (antiinfluenza de cabra A/USSR (H1N1)
(Chemicon International, Temecula, CA)); 40 \mug/ratón 2 h y 4 h
después de la infección (10 \mul intranasal)
Grupo 3: IL-28 o
IL-29 (5 \mug, i.p.)
Grupo 4: IL-28 o
IL-29 (25 \mug, i.p.)
Grupo 5: IL-28 o
IL-29 (125 \mug, i.p.)
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan las observaciones de seguimiento de
vida y los estudios inmunológicos:
Día 0: Todos los animales son infectados con el
virus de la Influenza (la dosis se determinó en el experimento
2)
Día 0 a 9: Inyecciones diarias de
IL-28 o IL-29 (i.p.)
Día por medio, se registraron el peso corporal y
el aspecto general
Día 10: Sacrificio de los animales
sobrevivientes y realización de la valoración viral para determinar
la carga viral en pulmón.
El aislamiento de linfocitos de pulmón (para
valoración directa de CTL en los pulmones usando
EL-4 como dianas y proporción E:T diferente (en
función de los mejores resultados de los experimentos 1 y 2)).
Tinción de tetrámeros: La cantidad de células T
CD8+ que se unen a los tetrámeros del complejo mayor de
histocompatibilidad (major histocompatibility complex, MHC) Clase I
que contienen el epítopo de la nucleoproteína (NP) de la influenza
A se evalúa usando complejos MHC Clase I con péptidos virales:
FLU-NP_{366-374}/D^{b}
(ASNENMETM), (péptido de LMCV/D^{b}).
\newpage
Inmunofenotipificación cuantitativa de los
siguientes: CD8, tetrámero, IFN\gamma intracelular, NK1.1, CD8,
tetrámero, CD62L, CD44, CD3(+ o -), NK1.1(+), IFN\gamma
intracelular, CD4, CD8, NK1.1, DX5, CD3(+o-), NK1.1, DX5,
tetrámero. Muestras de un solo color para ajuste del citómetro.
Día 30: Estudio de supervivencia con ratones
tratados durante 9 días con dosis diferentes de
IL-28 o IL-29 o con control
positivo para anticuerpo antiinfluenza. Se miden el peso corporal y
la producción de anticuerpos en las muestras de suero individuales
(Total, IgG1, IgG2a, IgG2b).
Día 0: Ambos grupos serán infectados con el
virus A/PR (1DL30).
El grupo 6 no será tratado.
El grupo 7 será tratado durante 9 días con 125
\mug de IL-28 o IL-29.
Día 30: Estudio de supervivencia
Se miden el peso corporal y la producción de
anticuerpos en las muestras de suero individuales (Total, IgG1,
IgG2a, IgG2b).
Día 60: Estudio de reestimulación
Los sobrevivientes de cada grupo se dividirán en
2 subgrupos.
Los grupos 6A y 7A serán reestimulados con virus
A/PR (1 DL30).
Los grupos 6B y 7B serán reestimulados con virus
A/PR (1 DL30).
Se realizará el seguimiento de ambos grupos y se
determinará el día del sacrificio. Se miden el peso corporal y la
producción de anticuerpos en las muestras de suero individuales
(Total, IgG1, IgG2a, IgG2b).
Un modelo de ratón transgénico (Guidotti et
al., J. Virology 69:6158-6169,
1995) acepta la replicación de altos niveles de HBV infeccioso y se
ha utilizado como modelo quimioterápico para la infección por HBV.
Se tratan ratones transgénicos con fármacos antivirales y se miden
los niveles de ADN y ARN del HBV en el hígado y el suero del ratón
transgénico después del tratamiento. También pueden medirse los
niveles de proteína del HBV en el suero del ratón transgénico
después del tratamiento. Se ha utilizado este modelo para evaluar
la efectividad de la lamivudina y del IFN-\alpha
para reducir los títulos virales del HBV.
Se administra a ratones TG (macho) con HBV
inyecciones intraperitoneales de 2,5; 25 ó 250 microgramos de
IL-28 o IL-29 día por medio durante
14 días (total de 8 dosis). Se desangran los ratones para recolectar
el suero el día del tratamiento (día 0) y el día 7. Una hora
después de la dosis final de IL-29, los ratones
desangraron en forma terminal y se sacrificaron. Se analizan el
suero y el hígado para detectar ADN del HBV en el hígado, ARN del
HBV en el hígado, ADN del HBV en suero, células de HB en suero, Hbe
en suero y HB en suero.
La reducción en el ADN del HBV en el hígado, el
ARN del HBV en el hígado, el ADN del HBV en suero, las células del
HB en hígado o las HB séricas en respuesta a la
IL-28 o la IL-29 refleja la
actividad antiviral de estos compuestos contra el HBV.
Se probaron las actividades antivirales de la
IL-28 y la IL-29 contra el
HHV-8 en un sistema de infección in vitro
utilizando una línea de células B linfoides, la
BCBL-1.
En la valoración del HHV-8 se
valoraron el compuesto de prueba y un control de ganciclovir a cinco
concentraciones cada uno, diluidas en series de media unidad en
escala logarítmica. Los criterios de valoración fueron PCR TaqMan
para el ADN del HHV-8 extracelular (CI50) y las
cantidades de células, utilizando el reactivo CellTiter96® (CT50;
Promega, Madison, WI). En resumen, se sembraron células
BCBL-1 en placas de microtitulación de 96 pocillos.
Al cabo de 16-24 horas, se lavaron las células y se
reemplazó el medio por un medio completo que contenía diversas
concentraciones del compuesto de prueba, por triplicado. El control
positivo fue ganciclovir, mientras que el control negativo fue el
medio solo (control viral, VC). Tres días después, se reemplazó el
medio de cultivo por un medio fresco que contenía el compuesto de
prueba diluido adecuadamente. Seis días después de la
administración inicial del compuesto de prueba, se recolectó el
sobrenadante del cultivo celular, se trató con pronasa y DNasa y se
lo usó en una valoración mediante PCR TaqMan cuantitativa, en tiempo
real. El ADN del HHV-8 amplificado mediante PCR se
detectó en tiempo real monitoreando los aumentos en las señales de
fluorescencia que se producen como resultado de la degradación
exonucleolítica de una molécula de sonda fluorescente inhibida que
se hibrida al ADN del HHV-8 amplificado. Para cada
amplificación mediante PCR, se generó simultáneamente una curva
estándar utilizando diluciones de ADN del HHV-8
purificado. La actividad antiviral se calculó a partir de la
reducción de los niveles de ADN del HHV-8
(CI_{50}). Luego se utilizó una nueva valoración de captación de
tinción para medir la viabilidad celular que se utilizó para
calcular la toxicidad (CT_{50}). El índice terapéutico (IT) se
calcula como CT_{50}/CI_{50}.
La IL-28 y la
IL-29 inhiben la replicación viral del
HHV-8 humano en células BCBL-1. La
IL-28A tuvo una CI_{50} de 1 \mug/ml y una
CT_{50}>10 \mug/ml (IT>10). La IL-29 tuvo
una CI_{50} de 6,5 \mug/ml y una CT_{50} >10 \mug/ml
(IT>1,85).La MetIL-29C172S-PEG
tuvo una CI_{50} de 0,14 \mug/ml y una CT_{50}>10 \mug/ml
(IT>100).
Se prueban las actividades antivirales de la
IL-28 y la IL-29 contra el EBV en un
sistema de infección in vitro en una línea de células B
linfoides, la P3HR-1. En la valoración del EBV se
valoran el compuesto de prueba y un control a cinco concentraciones
cada uno, diluidas en series de media unidad en escala logarítmica.
Los criterios de valoración son PCR TaqMan para el ADN del EBV
extracelular (CI50) y las cantidades de células,utilizando el
reactivo CellTiter96® (CT50; Promega). En resumen, se siembran
células P3HR-1 en placas de microtitulación de 96
pocillos. Al cabo de 16-24 horas se lavan las
células y se reemplaza el medio por un medio completo que contenía
diversas concentraciones del compuesto de prueba, por triplicado.
Además de un control positivo, se agrega a las células un medio
solo, como control negativo (control viral, VC). Tres días después,
se reemplaza el medio de cultivo por un medio fresco que contiene
el compuesto de prueba diluido adecuadamente. Seis días después de
la administración inicial del compuesto de prueba, se recolecta el
sobrenadante del cultivo celular, se trata con pronasa y DNasa y se
lo usa en una valoración mediante PCR TaqMan cuantitativa, en tiempo
real. El ADN del EBV amplificado mediante PCR se detecta en tiempo
real monitoreando los aumentos en las señales de fluorescencia que
se producen como resultado de la degradación exonucleolítica de una
molécula de sonda fluorescente inhibida que se hibrida al ADN del
EBV amplificado. Para cada amplificación mediante PCR, se generó
simultáneamente una curva estándar utilizando diluciones de ADN del
EBV purificado. La actividad antiviral se calcula a partir de la
reducción de los niveles de ADN del EBV (CI_{50}). Luego se
utilizó una nueva valoración de captación de tinción para medir la
viabilidad celular que se utilizó para calcular la toxicidad
(CT50). El índice terapéutico (IT) se calcula como CT50/CI50.
Se probaron las actividades antivirales de la
IL-28 y la IL-29 contra el
HSV-2 en un sistema de infección in vitro en
células Vero. Se evaluaron los efectos antivirales de la
IL-28 y la IL-29 en valoraciones de
inhibición del efecto citopático (CPE). La valoración implica que el
virus HSV-2 citopático mate las células Vero y que
la IL-28 y la IL-29 inhiban la
muerte celular. Las células Vero se propagan en medio esencial
modificado de Dulbecco (DMEM) que contiene rojo fenol con suero
equino al 10%, glutamina al 1% y
penicilina-estreptomicina al 1%, mientras que las
valoraciones de inhibición del CPE se realizan en DMEM sin rojo
fenol, con FBS al 2%, glutamina al 1% y
penicilina-estreptomicina al 1%. El día anterior a
las valoraciones, se tripsinizaron las células
(tripsina-EDTA al 1%), se lavaron, contaron y
sembraron a razón de 104 células/pocillo en una placa de fondo
plano, de 96 pocillos, BioCoat® (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)
en un volumen de 100 \mul/pocillo. A la mañana siguiente, se
retiró el medio y se agregó a las células una alícuota de virus
pretitulada. La cantidad de virus utilizada es la dilución máxima
que matar\alpha la totalidad de las células (>80%) en el
momento del máximo desarrollo del CPE. Se determina la viabilidad
celular con un reactivo CellTiter96® (Promega) siguiendo el
protocolo del fabricante y usando un lector de placas Vmax
(Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Los compuestos se prueban a
seis concentraciones cada una, diluidas en medio de ensayo en series
de media unidad en escala logarítmica. Se usó aciclovir como
control positivo. Los compuestos se agregan en el momento de la
infección viral. Se determinan el fondo promedio y los datos del
fármaco corregidos por color para el porcentaje de reducción del
CPE y el porcentaje de viabilidad celular a cada concentración en
relación con los controles y la CI50 se calculó en relación con la
CT50.
La IL-28A, la
IL-29 y la
MetIL-29C172S-PEG no inhibieron la
muerte celular (CI_{50}>10 ug/ml) en esta valoración. Tampoco
hubo actividad antiviral del IFN\gamma en la valoración.
<110> ZymoGenetics, Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PREPARACIONES HOMOGÉNEAS DE
IL-28 E IL-29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 03-10PC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EE. UU. 60/493,194
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-08-07
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EE. UU. 60/551,841
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2004-03-10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EE. UU. 60/559,142
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2004-04-02
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 161
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 734
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido señal
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (53)...(127)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido maduro
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (128)...(655)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (53)...(655)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 200
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SEÑAL
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(25)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 856
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido señal
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (98)...(154)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido maduro
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (155)...(700)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (98)...(700)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 200
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SEÑAL
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(19)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 734
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido señal
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (53)...(127)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido maduro
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (128)...(655)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (53)...(655)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 200
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SEÑAL
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(25)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 633
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido señal
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (22)...(105)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido maduro
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (106)...(630)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (22)...(630)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 202
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SEÑAL
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(28)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 632
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido señal
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (22)...(105)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido maduro
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (106)...(630)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (22)...(630)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 202
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SEÑAL
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(28)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 520
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 531
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> proteína madura de la SEC. ID. N.º
1, con 3' Met agregado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(531)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 176
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> proteína madura de la SEC. ID. N.º
1, con 3' Met agregado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 621
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> proteína madura de la SEC. ID. N.º
3, con 3' Met agregado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(549)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 182
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> proteína madura de la SEC. ID. N.º
3, con 3' Met agregado
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<400> 15
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<210> 16
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<211> 531
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> proteína madura de la SEC. ID. N.º
5, con 3' Met agregado
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<221> CDS
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<222> (1)...(531)
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<400> 16
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<210> 17
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<211> 176
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> proteína madura de la SEC. ID. N.º
5, con 3' Met agregado
\newpage
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<400> 17
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<210> 18
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<211> 528
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> IL-28A con mutación
C48S
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<221> CDS
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<222> (1)...(528)
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<400> 18
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<210> 19
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<211> 175
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> IL-28A con mutación
C48S
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<400> 19
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<210> 20
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<211> 531
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> met IL-28A con
mutación C49S
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<221> CDS
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<222> (1)...(531)
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<400> 20
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<210> 21
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<211> 176
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> met IL-28A con
mutación C49S
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<210> 22
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<211> 528
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> IL-28A con mutación
C50S
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<221> CDS
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<222> (1)...(528)
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<210> 23
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<211> 175
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> IL-28A con mutación
C50S
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<400> 23
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<210> 24
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<211> 531
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> met IL-28A con
mutación C51S
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<221> CDS
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<222> (1)...(531)
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<400> 24
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<210> 25
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<211> 176
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> met IL-28A con
mutación C51S
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<400> 25
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<210> 26
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<211> 546
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> IL-29 con mutación
C171S
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<221> CDS
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<222> (1)...(546)
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<210> 27
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<211> 181
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> IL-29 con mutación
C171S
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<400> 27
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 549
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> met IL-29 con
mutación C172S
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<221> CDS
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<222> (1)...(549)
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<400> 28
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 182
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> met IL-29 con
mutación C172S
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
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<210> 30
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<211> 525
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia degenerada de la SEC. ID.
N.º 18
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<221> misc_feature
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<222> (1)...(525)
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<223> n=A, T, C o G
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<400> 30
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<210> 31
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<211> 525
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia degenerada de la SEC. ID.
N.º 20
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<221> misc_feature
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<222> (1)...(525)
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<223> n=A, T, C o G
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<400> 31
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<210> 32
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<211> 525
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia degenerada de la SEC. ID.
N.º 22
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<221> misc_feature
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<222> (1)...(525)
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<223> n=A, T, C o G
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<400> 32
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<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 525
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia degenerada de la SEC. ID.
N.º 24
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<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(525)
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<223> n=A, T, C o G
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<211> 525
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia degenerada de la SEC. ID.
N.º 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(525)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 525
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia degenerada de la SEC. ID.
N.º 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(525)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
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<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 175
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> IL-28A con mutación
C48X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (48)...(48)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=Ser, Ala, Thr, Val o Asn
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 176
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> met IL-28A con
mutación C49X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (49)...(49)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=Ser, Ala, Thr, Val o Asn
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 175
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> IL-28A con mutación
C50X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (50)...(50)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=Ser, Ala, Thr, Val o Asn
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 176
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> met IL-28A con
mutación C51X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (51)...(51)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=Ser, Ala, Thr, Val o Asn
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 181
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> IL-29 con mutación
C171X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (171)...(171)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=Ser, Ala, Thr, Val o Asn
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 182
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> met IL-29 con
mutación C172X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (172)...(172)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=Ser, Ala, Thr, Val o Asn
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC40923
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC43152
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC29740
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC29741
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC29736
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC29738
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC44566
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC44565
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC44564
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC44563
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC44562
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC44561
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC44560
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC44559
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC44558
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC44557
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC44340
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC44341
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC41212
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC41041
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC43431
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC43437
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC44327
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC44328
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC45399
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 531
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> zcyto20 madura inicio desde
pYEL7b
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(531)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC45398
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC45397
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC45396
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1013
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)...(991)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC40922
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC43153
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 546
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> IL29 con mutación C15X, Asn169
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(546)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> variación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (44)...(45)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A, G, T o C
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 181
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)...(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=Ser, Ala, Thr, Val o Asn
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> IL29 con mutación C15X, Asn169
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 549
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Met IL29 con mutación C16X,
Asn170
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(549)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> variación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (47)...(48)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A, T, G o C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 182
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)...(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=Ser, Ala, Thr, Val o Asn
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Met IL29 con mutación C16X,
Asn170
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 546
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<212> ADN
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<400> 99
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<210> 100
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<211> 549
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Met IL29 con mutación T11P, C16X,
Asp170
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<221> CDS
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<221> variación
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<223> n=A, T, G o C
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Met IL29 con mutación T11P, C16X,
Asp170
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<221> VARIANTE
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<222> (16)...(16)
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<223> Xaa=Ser, Ala, Thr, Val o Asn
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<400> 101
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 546
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> IL29 con mutación G18D, Asn169,
C171X
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<222> (1)...(546)
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<221> variación
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<222> (512)...(513)
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<223> n=A, T, G o C
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> IL29 con mutación G18D, Asn169,
C171X
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<223> Met IL29 con mutación G19D, Asn170,
C172X
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<211> 182
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<212> PRT
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<220>
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<223> Met IL29 con mutación G19D, Asn170,
C172X
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<221> VARIANTE
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<222> (172)...(172)
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<223> Xaa=Ser, Ala, Thr, Val o Asn
\newpage
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> IL29 con mutación C15X, G18D,
Asn169
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<222> (1)...(546)
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<221> variación
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<223> n=A, T, G o C
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<400> 106
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<211> 181
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> IL29 con mutación C15X, G18D,
Asn169
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\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
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<222> (15)...(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=Ser, Ala, Thr, Val o Asn
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<400> 107
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<211> 549
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Met IL29 con mutación C16X, G19D,
Asn170
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<221> CDS
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<222> (1)...(549)
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<221> variación
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<222> (47)...(48)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A, T, G o C
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 108
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 182
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Met IL29 con mutación C16X, G19D,
Asn170
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\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
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<222> (16)...(16)
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<223> Xaa=Ser, Ala, Thr, Val o Asn
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 109
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 110
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<211> 546
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> IL29 con mutación G18D, Asp169,
C171X
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<221> CDS
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<222> (1)...(546)
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<221> variación
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<222> (512)...(513)
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<223> n=A, T, G o C
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<400> 110
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<210> 111
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<211> 181
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> IL29 con mutación G18D, Asp169,
C171X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (171)...(171)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=Ser, Ala, Thr, Val o Asn
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 111
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 112
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<211> 549
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Met IL29 con mutación G19D, Asp170,
C172X
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<221> CDS
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<222> (1)...(549)
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<221> variación
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<222> (515)...(516)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A, T, G o C
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Met IL29 con mutación G19D, Asp170,
C172X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (172)...(172)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=Ser, Ala, Thr, Val o Asn
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 113
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<211> 546
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> IL29 con mutación C15X, G18D,
Asp169
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<221> CDS
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<222> (1)...(546)
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\vskip0.400000\baselineskip
<221> variación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (44)...(45)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A, T, G o C
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 114
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 115
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<211> 181
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> IL29 con mutación C15X, G18D,
Asp169
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)...(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=Ser, Ala, Thr, Val o Asn
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 115
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 116
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<211> 549
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Met IL29 con mutación C16X, G19D,
Asp170
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(549)
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\vskip0.400000\baselineskip
<221> variación
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<222> (47)...(48)
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<223> n=A, T, G o C
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 117
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 182
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Met IL29 con mutación C16X, G19D,
Asp170
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)...(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=Ser, Ala, Thr, Val o Asn
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 117
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 118
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia señal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(57)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 118
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 119
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia señal
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia señal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(66)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 120
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 121
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia señal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 121
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 122
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 528
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> IL-28B C48S
\vskip1.000000\baselineskip
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<221> CDS
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<222> (1)...(528)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> variación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (143)...(144)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A, T, G o C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 122
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 123
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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H136Y
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<221> variación
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<222> 152, 153, 264
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<223> n=A, T, G o C
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<212> PRT
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<223> Xaa=Ser, Ala, Thr, Val o Asn
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<222> (88)...(88)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=Ser
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H136Y
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<220>
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<223> IL-29 C170X,
truncada después de Metionina y Glicina N terminales
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<223> n=A, T, G o C
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=Ser, Ala, Thr, Val o Asn
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> IL-29 C170X,
truncada después de Metionina y Glicina N terminales
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<400> 139
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\vskip1.000000\baselineskip
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<211> 540
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> IL-29 C169X,
truncada después de Metionina, Glicina y Prolina N terminales
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> variación
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<222> (506)...(507)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A, T, G o C
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<221> CDS
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<400> 140
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 141
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 179
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> VARIANTE
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=Ser, Ala, Thr, Val o Asn
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-29 C169X, truncada
después de Metionina, Glicina y Prolina N terminales
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 141
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 142
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 537
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> IL-29 C168X,
truncada después de Metionina, Glicina, Prolina y Valina N
terminales
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> variación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (503)...(504)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A, T, G o C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(537)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 142
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 143
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 178
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> IL-29 C168X,
truncada después de Metionina, Glicina, Prolina y Valina N
terminales
\vskip1.000000\baselineskip
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<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (168)...(168)
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<223> Xaa=Ser, Ala, Thr, Val o Asn
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 143
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 144
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 534
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> IL-29 C167X,
truncada después de Metionina, Glicina, Prolina, Valina y Prolina N
terminales
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> variación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (500)...(501)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A, T, G o C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(534)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 144
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 145
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 177
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> IL-29 C167X,
truncada después de Metionina, Glicina, Prolina, Valina y Prolina N
terminales
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (167)...(167)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=Ser, Ala, Thr, Val o Asn
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 145
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 146
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 531
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> IL-29 C166X,
truncada después de Metionina, Glicina, Prolina, Valina, Prolina y
Treonina N terminales
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> variación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (497)...(498)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A, T, G o C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(531)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 146
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 147
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 176
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> IL-29 C166X,
truncada después de Metionina, Glicina, Prolina, Valina, Prolina y
Treonina N terminales
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (166)...(166)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=Ser, Ala, Thr, Val o Asn
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 147
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 148
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 528
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> IL-29 C165X,
truncada después de Metionina, Glicina, Prolina, Valina, Prolina,
Treonina y Serina N terminales
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> variación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (494)...(495)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A, T, G o C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(528)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 148
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 149
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 175
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> IL-29 C165X,
truncada después de Metionina, Glicina, Prolina, Valina, Prolina,
Treonina y Serina N terminales
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (165)...(165)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=Ser, Ala, Thr, Val o Asn
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 149
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 150
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 552
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Inserto Leu de la
IL-29 después de Met N terminal, C173X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> variación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (518)...(519)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A, T, G o C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(552)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 150
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 151
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 183
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Inserto Leu de la
IL-29 después de Met N terminal, C173X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (173)...(173)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=Ser, Ala, Thr, Val o Asn
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 151
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 152
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 549
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> IL-29 G2L C172X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> variación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (515)...(516)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A, T, G o C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(549)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 152
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 153
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 182
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> IL-29 G2L C172X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (172)...(172)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=Ser, Ala, Thr, Val o Asn
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 153
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 154
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 552
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Inserto Ile de la
IL-29 después de Met N terminal, C173X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> variación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (518)...(519)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A, T, G o C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(552)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 154
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 155
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 183
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Inserto Ile de la
IL-29 después de Met N terminal, C173X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (173)...(173)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=Ser, Ala, Thr, Val o Asn
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 155
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 156
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 549
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> IL-29 G2I C172X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> variación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (515)...(516)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A, T, G o C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(549)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 156
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 157
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 182
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> IL-29 G2I C172X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (172)...(172)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=Ser, Ala, Thr, Val o Asn
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 157
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 158
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 531
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> IL-29 después de los
residuos de aminoácidos Met N terminales 2-7
delecionados, C166X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> variación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (497)...(498)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A, T, G o C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(531)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 158
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 159
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 176
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> IL-29 después de los
residuos de aminoácidos Met N terminales 2-7
delecionados, C166X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (166)...(166)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=Ser, Ala, Thr, Val o Asn
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 159
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 160
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 558
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> IL-29 Glu, Ala y Glu
de la IL-29 insertados después de Met N terminal,
C175X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> variación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (524)...(525)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A, T, G o C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(558)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 160
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 161
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 185
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> IL-29 Glu, Ala y Glu
de la IL-29 insertados después de Met N terminal,
C175X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (175)...(175)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=Ser, Ala, Thr, Val o Asn
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 161
Claims (16)
1. Un polipéptido aislado que comprende una
secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las
SEC. ID. N.º 27, 29, 40, 41, 83, 85, 87, 89, 95, 97, 103, 105, 111,
113, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 y
161.
2. El polipéptido de la Reivindicación 1, donde
el polipéptido tiene actividad contra la hepatitis.
3. El polipéptido de la Reivindicación 1, donde
el polipéptido tiene actividad contra la hepatitis B.
4. El polipéptido de la Reivindicación 1, donde
el polipéptido tiene actividad contra la hepatitis C.
5. Un polinucleótido aislado que codifica un
polipéptido, donde el polipéptido codificado comprende una secuencia
de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC. ID.
N.º 27, 29, 40, 41, 83, 85, 87, 89, 95, 97, 103, 105, 111, 113,
139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 y 161.
6. El polinucleótido aislado de la
Reivindicación 5, donde el polipéptido codificado tiene actividad
contra la hepatitis B.
7. El polinucleótido aislado de la
Reivindicación 5, donde el polipéptido codificado tiene actividad
contra la hepatitis C.
8. Un vector de expresión que comprende los
siguientes elementos ligados operablemente:
- \quad
- un promotor de la transcripción;
- \quad
- un segmento de ADN que codifica un polipéptido de la Reivindicación 1; y
- \quad
- un terminador de la transcripción.
9. Una célula cultivada en la cual se ha
introducido un vector de expresión de la Reivindicación 8, donde la
célula expresa el polipéptido codificado por el segmento de ADN.
10. Un método para producir un polipéptido que
comprende: Cultivar una célula en la cual se ha introducido un
vector de expresión de la Reivindicación 8, donde la célula expresa
el polipéptido codificado por el segmento de ADN; y la recuperación
del polipéptido expresado.
11. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que
se une específicamente al polipéptido de la Reivindicación 1.
12. El anticuerpo de la Reivindicación 11, donde
el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo
policlonal, un anticuerpo monoclonal murino, un anticuerpo
humanizado derivado de un anticuerpo monoclonal murino, un
fragmento de anticuerpo, un anticuerpo neutralizante y un anticuerpo
monoclonal humano.
13. El fragmento de anticuerpo de la
Reivindicación 11, donde el fragmento de anticuerpo se selecciona
del grupo que consiste en F(ab'), F(ab), Fab' Fab,
Fv, scFv y la unidad mínima de reconocimiento.
14. Un anticuerpo antiidiotipo que comprende un
anticuerpo antiidiotipo que se une específicamente al anticuerpo de
la Reivindicación 11.
15. Una formulación que comprende un polipéptido
aislado seleccionado del grupo que consiste en las SEC. ID. N.º 27,
29, 40, 41, 83, 85, 87, 89, 95, 97, 103, 105, 111, 113, 139, 141,
143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 y 161, y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
16. Un equipo que comprende la formulación de la
Reivindicación 15.
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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