CN108070647B

CN108070647B - 与hbv感染相关的基因单体型及其应用

Info

Publication number: CN108070647B
Application number: CN201711416885.3A
Authority: CN
Inventors: 胡军; 潘洪玉; 赵锦; 陈琳; 杨峥嵘; 李艺; 赵广录; 石向东
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2017-12-25
Filing date: 2017-12-25
Publication date: 2021-06-01
Anticipated expiration: 2037-12-25
Also published as: CN108070647A

Abstract

与HBV感染相关的基因单体型及其应用属生物技术领域，发明人通过大样本IL‑22基因的启动子区单体型的深入研究。获得了与HBV感染危险度显著相关的单体型C‑T‑G(OR＝0.12)；还获得了与HBV感染后疾病进展危险度显著相关的单体型T‑C‑A(OR＝0.54)。本发明提供的IL‑22基因相关单体型的分子标记，用于检测乙型肝炎病毒感染及感染后的肝脏相关疾病进展风险，具有很高的临床应用价值。本发明为临床评定乙型肝炎病毒感染危险度及感染后的肝脏相关疾病进展危险度提供了一种可靠、灵敏的方式，且检测流程简便、成本低廉,有利于临床推广。

Description

与HBV感染相关的基因单体型及其应用

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及乙型肝炎病毒(HBV)感染相关的IL-22基因单体型和用于构建上述单体型的SNP标记的引物对及试剂盒，以及IL-22基因单体型在检测HBV感染风险及感染后肝脏相关疾病进展风险方面的应用。

背景技术

乙肝病毒感染是人类目前最为严重的公共卫生问题之一。宿主HBV感染后免疫***的免疫耐受主要是通过HBeAg(乙型肝炎e抗原)发生并维持的，HBeAg是以隐蔽形式存在于HBV核心，由HBcAg在体内经过代谢后丢失了一部分氨基酸并改变了空间结构，形成的具有另一种抗原活性的可溶性蛋白，它是乙肝病毒复制明显和强传染性的重要血清标志物。HBeAg阳性表明宿主的免疫耐受被打破，免疫***会开始识别并攻击受HBV感染的肝脏细胞，造成免疫反应介导的肝脏损害。因此，HBeAg阳性患者往往有更高的HBV DNA滴度和更重的肝脏损害。HBeAg阳性患者5年内发生严重肝脏损害而后进展为肝硬化的几率为12％-20％；HBeAg阳性孕妇的子女“突破性”HBV感染的几率为9.26％，显著高于HBeAg阴性孕妇的子女(0.23％)，且新生儿接种疫苗后发生HBV感染的儿童更易罹患肝细胞癌；少数HBeAg阳性慢性肝炎病人甚至不经过肝硬化而直接进展为肝细胞癌(HCC)。因此，HBeAg阳性相对HBeAg阴性病人有更高的疾病传播及进展风险。

大量的分子生物学研究证明，HBV感染及发病与人体中细胞因子IL-22(白介素22)等众多基因相关联，细胞因子能与宿主细胞内入侵的病毒发生多种复杂的相互作用而影响病毒感染性疾病的发生、发展及预后。IL-22由激活的Th22、Thl7、γδT、和NK等细胞产生，IL-22受体复合物的限制成份IL-22R1强烈的表达于皮肤、肾脏、消化和呼吸***器官的封闭上皮层细胞中，这些器官的上皮细胞是与外环境永久接触的躯体外部屏障。IL-22通过与受体结合后可以激活JAK/STAT信号通路，诱导STAT1、3、5等分子的磷酸化作用；IL-22可以诱导皮肤及粘膜的上皮细胞产生多种抗菌肽，对未成熟树突状细胞(dendritic cells，DCs)和CD4⁺T细胞产生趋化作用，从而在抵抗病原体入侵的天然免疫应答过程中扮演重要角色；IL-22可以减少肝脏细胞损伤、预防肝脏衰竭、改善肝脏的脂肪变性、促进肝切除后的肝细胞增殖、抑制肝细胞的凋亡，对肝脏具有保护作用；IL-22可以促进HepG2细胞增殖并抵抗由血清饥饿诱导的细胞凋亡，这源于IL-22诱导了抗凋亡(如Bcl-xL，Mcl-1)和促有丝***(如cyclin D1，c-myc，and Rb2)的调节，在小鼠中IL-22的暂时过表达还会保护由四氯化碳和Fas活化诱导的肝脏损伤。

研究发现群体中某两个SNP等位基因同时出现的频率往往与预期的随机频率之间存在明显差异，这种连锁不平衡状态(1inkage disequilibrium,LD)使得一条染色体上或某一区域的一组相关联的SNP等位位点倾向于以一个整体遗传给后代，这些位置比较接近的多个SNP就构成单体型块(haplotype block)。实际上，大多数染色体区域只有少数几个常见的单体型，它们代表了一个群体中人与人之间的大部分多态性。单体型与SNPs的多态性不同，它通常不是二等位性质的，且包括多个SNPs的基因信息，故研究单体型的多态性与疾病的关联关系可以获得机体易感性分子机理方面更多更全面的有益信息。研究发现IFN-γ+874A/A与慢性HBV感染的易感性相关，IL-10基因启动子区ATA单体型在无症状HBV携带者组中的频率明显高于慢性乙型肝炎组和肝硬化组，与病毒感染的疾病进展关系密切。另外，IL-10基因启动子区-592A等位基因是HBV持续性感染的高危险因子，而且IL-10基因启动子区-592A等位基因和-819C等位基因与乙肝感染后的急性肝衰竭有关。IL-22基因作为IL-10基因家族的最新成员和全新类型的细胞因子，该基因的单体型与HBV感染相关的大规模群体病例对照关联研究的有意义阳性结果鲜见报道。

发明内容

本发明通过对收集的494例HBV感染者及619例健康个体，共计1113例样本的与HBV感染相关的IL-22基因的启动子区和5’非翻译区的rs2227484、rs2227485、rs2227513等3个SNP位点的深入研究。数据分析结果显示，IL-22基因的单体型C-T-G在感染组和对照组样本中的频率分布存在显著性差异，HBV感染组中单体型C-T-G分布频率显著较低[P＝0.014，OR＝0.12(CI＝0.02-0.91)]。IL-22基因的单体型T-C-A在HBeAg阳性组和对照组中的频率分布存在显著性差异，HBeAg阳性组中的单体型T-C-A频率显著较低[P＝0.02，OR＝0.12(CI＝0.54(0.32-0.91)]。本发明提供了IL-22基因相关单体型的分子标记，用于检测乙型肝炎病毒感染及感染后的肝脏相关疾病进展风险，具有很高的临床应用价值。

本发明所要解决的技术问题是，通过检测IL-22基因的有关单体型，分析受检人员乙型肝炎病毒的感染风险及感染后肝脏相关疾病的进展风险，将其从人群中筛选出来，提前告知采取相应的预防措施，达到预防为主，防治结合的目的。

发明人通过TaqMan荧光探针法对一千一百余例相关样本IL-22基因推定启动子区3个SNP位点的基因型检测，并通过PHASE软件构建个体的基因单体型。发现在群体中3个SNP位点只构成4种单体型，即C-T-A、C-C-A、T-C-A、C-T-G，其中单体型C-T-G与乙型肝炎病毒感染危险度密切相关，单体型T-C-A与HBV感染后的肝脏相关疾病进展风险密切相关。

本发明提供了一种判断HBV感染危险度和HBV感染后的肝脏相关疾病进展危险度的检测试剂，该检测试剂依据TaqMan荧光探针法检测rs2227484、rs2227485、rs2227513等3个SNP位点，根据所测个体的上述SNP位点的基因型构建个体的基因单体型，再由个体的基因单体型判断个体HBV感染危险度和感染后的肝脏相关疾病的进展危险度。当单体型为C-T-G时,被测个体属于HBV感染危险度低的人群；当单体型为T-C-A时，被测个体属于HBV感染后肝脏相关疾病进展危险度低的人群。

本发明提供了检测HBV感染危险度及感染后的肝脏相关疾病进展危险度的引物,所述引物可以扩增包括rs2227484、rs2227485、rs2227513位点在内的核苷酸序列。引物序列如下：正向引物如SEQ ID N01所示,反向引物如SEQ ID N02所示。TaqMan荧光探针引物序列如SEQ ID N03、SEQ ID N04、SEQ ID N05、SEQ ID N06、SEQ ID N07、SEQ ID N08所示。

本发明提供了单体型A-T-G在评定乙型肝炎病毒感染危险度中的应用。

本发明提供了单体型T-C-A在评定乙型肝炎病毒感染后肝脏相关疾病进展危险度中的应用。

本发明还提供了rs2227484、rs2227485、rs2227513位点在制备判断个体HBV感染危险度和HBV感染后肝脏相关疾病进展危险度检测试剂中的应用，以及在制备检测SNP位点基因型的试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种非诊断目的的检测HBV感染保护性因子及感染后肝脏相关疾病进展保护性因子的方法,所述的检测方法包括:

1)提取离体外周血的基因组DNA；

2)优选的,基因组DNA全血提取试剂盒(德国Qiagen公司)；

3)检测IL-22基因rs2227484、rs2227485、rs2227513位点基因型；

4)推断个体的基因单体型；

5)优选的，利用PHASE软件构建个体基因单体型。

所述离体外周血中IL-22基因单体型为C-T-G时,被测个体样本含有HBV感染保护性因子。所述离体外周血中IL-22基因单体型为为T-C-A时，被测个体含有HBV感染后肝脏相关疾病进展保护性因子。

本发明提供的与HBV感染相关的IL-22基因单体型，能用于大规模检测人群乙型肝炎病毒感染及肝脏相关疾病发病风险，为临床评定HBV感染危险度及感染后肝脏相关疾病进展危险度提供了一种可靠、灵敏的方式，且检测流程简便、成本低廉,有利于临床推广。

附图说明

图1为IL-22基因序列结构及包含SNP位点示意图

图2为样本外周静脉血基因组电泳图

其中：泳道1-8为基因组DNA样品，泳道9为DNA Marker DL2000；

图3为rs2227484位点C/C纯合基因型实时荧光PCR扩增曲线

图4为rs2227484位点C/T杂合基因型实时荧光PCR扩增曲线

图5为rs2227484位点T/T纯合基因型实时荧光PCR扩增曲线

图6为rs2227485位点C/C纯合基因型实时荧光PCR扩增曲线

图7为rs2227485位点C/T杂合基因型实时荧光PCR扩增曲线

图8为rs2227485位点T/T纯合基因型实时荧光PCR扩增曲线

图3至图8中：横坐标为循环数；纵坐标为第n个循环荧光报告基团的荧光值扣除基线后得到的标准化结果，即Delta Rn。

具体实施方式

下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。

实施例1

1.1研究对象

本研究收集了1113例血液标本,其中HBV感染者494例，正常对照组619例，HBV感染组及健康对照组都同时排除HIV、HCV、***感染。所有研究对象之间均无直系亲属关系，所有参加研究人员已被告知实验目的，并口头或书面同意。

1.2研究结果

病例组及对照组的一般人口特征归纳于表1，包括性别组成及年龄结构。病例组494例HBV感染者，男性280例(56.7％)，女性214例(43.3％)；平均年龄为26.61±7.11岁(极小值16岁、极大值61岁、中位数25岁)。对照组(男351例/268例)平均年龄为27.07±6.87(极小值18岁、极大值66岁、中位数26岁)，对照组与病例组的性别构成、年龄差别均无统计学差异(P＝0.528及0.507)。

病例组的血清学检测指标归纳于表2中，包括性别、血清丙氨酸转氨酶(ALT)水平及血清乙肝e抗原水平等。其中ALT≤40IU/L者304例，占比61.5％；ALT＞40IU/L者190例，占比38.5％。乙肝e抗原阴性者332例，占比67.2％；乙肝e抗原阳性者162例，占比32.8％。

表1病例组和对照组的一般人口特征

Table 1the general demographic characteristics of case and control

基本特征	病例组(％)	对照组(％)	P
				性别(M/F)	280/214(56.7％/43.3％)	345/274(55.7％/44.3％)	0.528<sup>a</sup>
年龄(years)	26.61±7.11	27.07±6.87	0.507<sup>a</sup>

M：male,F：female,a:Kolmogorov-Smirnov Z test,渐进显著性(双侧)

表2病例组的血清学检测指标

Table 2Serological detectional index of case

ALT:alanine aminotransferase，HBeAg:hepatitis B e antigen

实施例2

2.1SNPs位点的选择

基于前期的实验工作基础，选取IL-22基因为候选基因。根据国际人类基因组单体型图计划数据库(http://www.hapmap.org)数据，及所收集的73例汉族人样本的IL-22基因全基因序列测定结果，该基因在中国汉族人群IL-22基因的外显子区域没有发现SNP位点。进一步选取IL-22基因的rs2227484、rs2227485、rs2227513三个位点作为病例与对照关联分析的目标位点，其中rs2227484、rs2227485位于IL-22基因上游推定的启动子区，而rs2227513位点位于该基因的5’非翻译区第一外显子和第二外显子间的一个短小的内含子区中(图1)。

2.2引物设计

根据GenBank提供的人类IL-22基因的全序列(access No.NT_029419.11：30792244bp-30783674bp、minus strand)和rs2227484、rs2227485、rs2227513位点信息，利用Primer Premier Version 5.0(PREMIER Biosoft International,USA)软件，设计了1对PCR扩增引物(PCR扩增结果见图2)和3对TaqMan荧光探针引物并人工合成，扩增区域DNA序列及SNP位点如SEQ ID N09所示，所设计的引物序列见表3。

表3PCR扩增引物和TaqMan荧光探针引物

Table 3primers for PCR amplification and TaqMan fluorescent probeprimers

实施例3

3.1人全血基因组DNA提取

收集的2毫升加入EDTA抗凝剂的外周静脉全血放置于－80℃低温冰箱保存，直到基因组DNA的提取。利用德国QIAGEN公司的QIAamp DNA Blood mini kit基因组提取试剂盒提取200ul全血中单核细胞(PBMC)的基因组DNA。具体步骤参照QIAamp DNA Blood minikit试剂盒说明书。

随机选取部分提取后的基因组DNA样品在1％的琼脂糖凝胶上电泳检测样品提取质量(图2)。所有的基因组DNA样品在260nm和280nm紫外分光光度计下检测纯度,需控制DNA浓度大于15ng/uL,DNA的纯度在1.6-1.9之间,保存于-20℃冰箱便于下一步的实验。

3.23个SNP位点的基因分型

首先通过PCR扩增含有相应SNP位点的DNA片段，然后通过序列特异的Taqman荧光探针实现SNP的基因分型。具体过程如下：将配制好的TaqMan PCR反应液分装于荧光定量PCR专用8联管中(PCR0208-C,Axygen公司)，在ABI7500荧光定量PCR仪上进行SNP基因分型。

3.2.1rs2227484位点PCR反应体系成分及反应条件描述如下：

10ul TaqMan PCR反应体系成分

TaqMan PCR扩增反应条件：

反应结束后，根据等位基因携带的VIC和FAM荧光信号PCR扩增曲线判读各待测样本所对应的基因型(图4、图5、图6)。

3.2.2rs2227485位点PCR反应体系成分及反应条件描述如下：

10ul TaqMan PCR反应体系成分：

TaqMan PCR扩增反应条件：

反应结束后，根据等位基因携带的VIC和FAM荧光信号PCR扩增曲线判读各待测样本所对应的基因型(图7、图8)。

3.2.3rs2227513位点PCR反应体系成分及反应条件描述如下：

10ul TaqMan PCR反应体系成分：

TaqMan PCR扩增反应条件：

上述3个位点完成基因分型后的样品都须按5％比例随机抽取部分样品进行复检，以验证基因分型的准确性和重复性；此外每次检测至少需要设置3个空白对照(二次蒸馏水代替DNA模板)，阴性对照如果有扩增曲线视为实验过程中存在污染。

实施例4个体IL-22基因单体型的构建

利用Excel 2003建立所有样本3个位点的基因分型结果数据库，再利用PHASE软件针对群体的基因型数据构建基因单倍型，该软件的优点是计算的偏差更小，结果也更为准确。该软件采用Bayesian统计方法，可以处理SNP、微卫星及其他多等位形式的位点(如三态的SNP和HLA等位基因)。

该软件须借助虚拟DOS的命令提示符窗口运行。PHASE软件不用安装，在DOS下调用该程序完成计算分析。在个人电脑显示屏左下角“开始”的“运行”中输入“cmd”或者“command”进入DOS***，使用“cd”命令进入PHASE.exe所在的文件夹，键入“PHASE.exe”。将PHASE应用程序(PHASE.EXE)与数据文件放在一起，可以方便在DOS动行环境下操作，程序和待分析的数据均放置在某分区的根目录下(如放在D盘下)，运算结束后，结果生成在同一路径下。

PHASE软件识别的数据文件须为txt格式的文本文件，输入文件的格式需严格参照相应的格式，需要注意的是格式区分大小写。用记事本编辑数据，数据与数据之间统一用空格键间隔，不能出现逗号，整理好后保存为txt格式的文本。打开我的电脑>工具>文件夹选项>查看>把高级设置中的隐藏已知文件类型的扩展名前面的对号去掉，点击确定。然后将输入数据的文件名后缀由***.txt变为***.inp。文件名***最好为英文。

健康对照619个样本基因单体型构建的数据编辑格式如下：

其它待处理样本数据编辑格式参照上述格式，样本数据格式编辑好以后在虚拟DOS窗口调用相应的数据文件。进入PHASE软件和待处理数据文件所在文件夹，输入phasehealth-619.inp health-619.out，表示运行文件名为health-619的数据文件，输出到文件名为health-619的结果文件。运算结束后输出结果是以health-619为名称的若干文件，用记事本打开。其中health-619.out介绍运算中的简要情况的，health-619.out_freqs列出各单倍型频率，health-619.out_pairs列出每个人最有可能的单倍型组成。

health-619.out文件的部分运算结果如下：

实施例5单倍型频率的关联分析

统计学检验假设病例与对照都是来自于目标人群的随机独立样本。利用Haploview(version 4.2)评价个体IL-22基因3个SNPs等位点基因频率分布是否符合Hardy-Weinberg平衡规律。各组间频率比较用χ²检验，并计算比值比(Odds ratio,OR)，OR在病例对照研究中，指的是病例组中暴露与非暴露人数的比值(a/b)和对照组中暴露与非暴露人数的比值(c/d)的比，得出OR＝ad/bc，所以又叫交叉乘积比，该值可用作相对危险度的估计值。如果χ²的P<0.05或OR值的95％可信区间不包含无效假设值1，就可以认为关联是有统计学意义。上述组间资料的比较利用PASW Statistics 18.0for Windows统计软件进行。

5.1SNP位点等位基因频率和HWE检验

用Haploview(version 4.2)软件分析病例及对照组IL-22基因rs2227484、rs2227485、rs2227513位点基因频率，并进行HWE检验。两组样本各位点的杂合基因型的观察值和预期值、次等位基因的频率、基因型频率的哈迪-温伯格平衡检验的P值见表4。一般要求HWE的P值大于0.05的结果才可信，不然样本中存在种群结构使得结果有误差。从表中可知，两组样本中的3个位点基因型频率分布都符合Hardy-Weinberg平衡(Hardy-Weinbergequilibrium，HWE)。

表4两组样本3个位点的等位基因频率及HWE检验

Table 4allele frequency and HWE test for rs2227513loci in two groupsof samples

dbSNP:NCBI dbSNP database(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)

obsHET:杂合基因型观察值

PredHET:杂合基因型预期值

MAF：次等位基因频率

HWE p Val:哈迪-温伯格平衡检测的概率

5.2单体型频率的组间比较

本研究两组群体样本中IL-22基因启动子区3个SNPs位点构成4种单体型，即C-T-A、C-C-A、T-C-A、C-T-G等。在统计单体型在组间的分布差异时，以单体型C-T-A为比较基准。在HBV感染组中C-T-G频率为0.1％，相应的对照组中该基因单体型频率为0.81％(表5)，Pearsonχ²值为6.08，对应的P值为0.014(双侧检验)，说明C-T-G单体型在两组间的频率分布存在显著的差异。在HBeAg阳性组中T-C-A单体型频率为5.7％，相应的对照组中该单体型频率为9.1％(表6)，Pearsonχ²概率为0.02(双侧检验)，说明T-C-A基因单体型在乙型肝炎病毒e抗原阳性组的频率显著的低于对照组频率，组间频率差异显著。

OR值又称为比值比(odd ratio),对于发病率很低的疾病来说，它的OR值即是相对危险度的精确估计值。OR值大于1，表示该因素是一个危险因素；OR值小于1，则表示该因素是一个保护因素。HBV感染组和对照组的C-T-G单体型频率组间比较结果表明，该单体型的OR值为0.12,95％CI为0.02-0.91，上限小于1，说明携带C-T-G单体型者HBV感染风险更低，C-T-G单体型是抵抗HBV感染的保护性因子。乙型肝炎病毒e抗原阳性组和对照组的T-C-A单体型频率组间比较结果表明，该单体型的OR值为0.54，OR值的95％置信区间为0.32-0.91，置信区间上限小于1，说明携带T-C-A单体型者HBV感染后疾病传播及肝脏相关疾病进展风险更低，T-C-A单体型是HBV传播及肝脏相关疾病进展的保护性因子。

表5IL-22基因启动子区单体型在对照组及HBV病例组的频率比较

表6IL-22基因启动子区单体型频率在对照组与HBeAg阴性、及与HBeAg阳性组中的比较

a:Pearson Chi-Square Continuity Correction

b:the value of the weight variable was zero,such cases are invisibleto statistical OR

序列表

序列表

<110> 吉林大学

<120> 与HBV感染相关的基因单体型及其应用

<141> 2021-04-21

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 1

ggagatcagattttcagcattag 23

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 2

aacctggtcgaagacaacg 19

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 3

ccagacttatgtttcaaaaataact[a/g] 26

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 4

tcttggctaatctaattattgtttt 25

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 5

taaaatgttttgatctcctatagtg[a/g] 26

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 6

ctgagtaagcattttggtcacggac 25

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 7

agtatttcatcaaactaaccaattg[c/t] 26

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 8

accaagtttgccgaaacgcttacct 25

<210> 9

<211> 1140

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 9

-771 aaaattttaa gatgaactat atccatggta ttcttttatt ttaaaaaaag tttacatgtt

-711 aagaaaaaag gagatcagat tttcagcatt agtatttaca aacttaagtt gatattgatt

-651 ataattcaat taatacaatt ttaagatata tttacttctg ccttaattgt tatgatcact

-581 taaaaatagt tccaaaaagg gaagaaaaca ataattagat tagccaagac/t agttattttt

-521 gaaacataag tctggtttag aattcagcat gtttaaaaat gagataaaat tattttaata

-461 atggaatgat ctgttagctg tcattaccat ttactttaaa gcagaggata taggacatgg

-401 gtcctttttt tctgatcacc tccaatgaga taagaatcta taaagctggt aggaaaatga

-341 gtccgtgacc aaaatgctta ctcagc/tcact ataggagatc aaaacatttt atactaaatc

-281 tgaactctac taagacaaaa caattgtgtt ctttgaaaaa tatgtagggt ttagaaaatt

-221 tctgggattt gtctgtaaaa taccctccgg gctctaatag tgacgtttta gggaaacact

-161 tgcatctcaa ggtggaaagg atagaggtgg tgttttgtgg gctcctgtgg tggttaggtc

-101 gttctcagaa gacagtactg gaaattagat aattgctgat gtcatatttt tcacaattaa

-41 aaaaaagtca gtatcctggg ggctataaaa gcagcagctt ctaccttccc cgtcacaagc

20 agaatcttca gaacaggtaa gcgtttcggc aaacttggta/g caattggtta gtttgatgaa

80 atacttcttg actaattttg ttccttcacg ttgtcttcga ccaggttctc cttccccagt

140 caccagttgc tcgagttaga attgtctgca atggccgccc tgcagaaatc tgtgagctct

200 ttccttatgg ggaccctggc caccagctgc ctccttctct tggccctctt ggtacaggga

260 ggagcagctg cgcccatcag ctcccactgc aggcttgaca agtccaactt ccagcagccc

340 tatatcacca accgcacctt catgctggct aaggaggtat acatctcaat cctgctcttt

Claims

1.一种引物和探针组合在制备检测HBV感染危险度和感染后肝脏相关疾病进展危险度的试剂中的用途，其特征在于，引物和探针组合包括正向引物、反向引物和TaqMan荧光探针引物，正向引物如SEQ ID NO.1所示，反向引物如SEQ ID NO.2所示，TaqMan荧光探针引物序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；

所述试剂用于检测rs2227484、rs2227485、rs2227513三个位点的基因型是否构成单体型T-C-A。