CN107630086B

CN107630086B - 一种与hbv感染相关的snp分子标记及其应用

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Publication number: CN107630086B
Application number: CN201711110782.4A
Authority: CN
Inventors: 胡军; 赵锦; 陈琳; 杨峥嵘; 赵广录; 石向东
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2017-11-13
Filing date: 2017-11-13
Publication date: 2020-11-03
Anticipated expiration: 2037-11-13
Also published as: CN107630086A

Abstract

一种与HBV感染相关的SNP分子标记及其应用属生物技术领域，本发明的一种判断HBV感染危险度的检测试剂检测SNP位点为rs2227513位点；所述检测试剂检测rs2227513位点是否是AG基因型；一种检测HBV感染危险度的引物，其正向引物、反向引物分别如SEQ ID N01‑2所示，TaqMan荧光探针引物序列如SEQ ID N03和SEQ ID N04所示；一种检测HBV感染危险度的检测试剂盒包括检测rs2227513位点是否是AG基因型的检测试剂及以上所述的引物；本发明为临床评定乙型肝炎病毒感染危险度提供了一种可靠、灵敏的方式，且检测流程简便、成本低廉,有利于临床推广。

Description

一种与HBV感染相关的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及乙型肝炎病毒(HBV)感染相关的SNP标记和用于检测上述SNP标记的引物对及试剂盒，以及在HBV易感性检测和预防乙型肝炎病毒感染方面的应用。

背景技术

乙肝病毒感染是人类目前最为严重的健康问题之一。全世界累计有20亿人口曾受HBV感染，约有3.5亿人口现行慢性感染，每年有约100万人死于由乙肝病毒感染引起的肝脏疾病。中国是乙肝病毒感染的高危区，据估计我国有1.2亿人长期携带乙肝病毒，乙肝病毒感染不仅严重危害了人类的健康，同时也引发了一系列社会和经济的问题，是中国现阶段最为突出的公共卫生问题之一。

病毒与机体是矛盾对立的两个方面，在HBV的传染及发病过程中，病毒之所以能够感染人首先是因为机体中存在与感染性相关的基因。大量的分子生物学方面研究证明，乙肝病毒的感染与人体中细胞因子IL-22(白介素22)等众多基因相关联，细胞因子能与宿主细胞内入侵的病毒发生多种复杂的相互作用而影响病毒感染性疾病的发生、发展及预后。IL-22由激活的Th22、Thl7、γδT、和NK等细胞产生，IL-22受体复合物的限制成份IL-22R1强烈的表达于皮肤、肾脏、消化和呼吸***器官的封闭上皮层细胞中，这些器官的上皮细胞是与外环境永久接触的躯体外部屏障。研究表明IL-22通过与受体结合后可以激活JAK/STAT信号通路，诱导STAT1、3、5等分子的磷酸化作用；IL-22可以诱导皮肤及粘膜的上皮细胞产生多种抗菌肽，对未成熟树突状细胞(dendritic cells，DCs)和CD4⁺T细胞产生趋化作用，从而在抵抗病原体入侵的天然免疫应答过程中扮演重要角色；IL-22可以减少肝脏细胞损伤、预防肝脏衰竭、改善肝脏的脂肪变性、促进肝切除后的肝细胞增殖、抑制肝细胞的凋亡，对肝脏具有保护作用；IL-22可以促进HepG2细胞增殖并抵抗由血清饥饿诱导的细胞凋亡，这源于IL-22诱导了抗凋亡(如Bcl-xL，Mcl-1)和促有丝***(如cyclin D1，c-myc，andRb2)的调节，在小鼠中IL-22的暂时过表达还会保护由四氯化碳和Fas活化诱导的肝脏损伤。

SNP(single nucleotide polymorphisms，单核苷酸多态性)是由单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性，包括碱基的转换、颠换、***和缺失等形式。通常SNP都是2等位基因多态性的，SNP具备突变稳定，易于大规模高通量的快速检测，所以它在研究宿主基因异质性与病毒易感性之间关系时具备明显的优势。近年来，许多研究表明细胞因子基因多态性能够影响个体间细胞因子的差异表达和分泌，进而引发个体间对于乙型肝炎病毒感染免疫应答的不同，最终影响病毒感染后的结局。有研究发现IFN-γ+874A/A与慢性HBV感染的易感性相关，IL-10基因启动子区ATA单体型在无症状HBV携带者组中的频率明显高于慢性乙型肝炎组和肝硬化组，与病毒感染的疾病进展关系密切。另外，IL-10基因启动子区-592A等位基因是HBV持续性感染的高危险因子，而且IL-10基因启动子区-592A等位基因和-819C等位基因与乙肝感染后的急性肝衰竭有关。IL-22基因作为IL-10基因家族的最新成员和全新类型的细胞因子，该基因的SNP与HBV易感性的大规模群体病例对照关联研究的有意义阳性结果鲜见报道。

发明内容

本发明通过对收集的494例HBV感染者及619例健康人群，共计1113例样本的与HBV感染相关的IL-22基因的5’非翻译区的一个SNP位点的深入分析。统计结果显示，IL-22基因的rs2227513位点在两组样本中的基因型频率分布存在显著性差异，健康对照组中AG基因型频率显著较高。本发明提供了一种标记，用于检测乙型肝炎病毒感染风险，具有很高的临床应用价值。

本发明所要解决的技术问题是，通过检测与乙型肝炎病毒感染相关的SNP位点，检测和分析受检人员是否有感染风险，将其从人群中筛选出来，提前告知采取相应的预防措施，达到预防为主，防治结合的目的。

发明人通过对1113例样本(其中494例HBV感染者，健康对照组619例)的深入研究，发现了IL-22基因的SNP位点rs2227513和乙型肝炎病毒感染危险度密切相关，并据此开发了能够判断HBV感染危险度的试剂盒。

本发明提供了一种判断HBV感染危险度的检测试剂，其检测SNP位点为rs2227513位点，所述检测试剂可以检测rs2227513位点是否是AG基因型。

本发明还提供了一种检测HBV感染危险度的引物,所述引物包括可以扩增rs2227513位点在内的核普酸序列,引物序列如下：正向引物如SEQ ID N01所示,反向引物如SEQ ID N02所示。TaqMan荧光探针引物如SEQ ID N03和SEQ ID N04所示。

本发明还提供了用于检测SNP位点基因型的试剂盒,该试剂盒包括采用本领域已知的任何技术检测SNP所需的试剂,只要其能够检测样本中rs2227513位点的基因型。优选的,所述的试剂盒包括检测rs2227513位点是否是AG基因型的检测试剂。

本发明提供了用于判断HBV感染危险度的检测试剂盒，该试剂盒的判断原理是利用试剂盒中的试剂检测rs2227513位点的基因型，根据所测个体的上述SNP位点的基因型判断其HBV感染危险度。当rs2227513位点基因型为杂合AG时,被测个体属于HBV感染危险度低的人群，该SNP位点能评定乙型肝炎病毒感染危险度。

本发明还提供了rs2227513位点在制备一种判断个体HBV感染危险度的检测试剂中的应用以及在制备检测SNP位点基因型的试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种非诊断目的的检测HBV感染保护因子的方法,所述的检测方法包括:

1)提取离体外周血的基因组DNA；

2)检测rs2227513位点是否是AG基因型；

3)优选的,基因组DNA全血提取试剂盒(德国Qiagen公司)；

4)进一步可通过本领域技术人员熟知的检测单核普酸多态性的方法检测rs2227513位点是否是AG基因型,包括杂交法、熔解法、电泳法、测序法、化学法、酶学法、物理法以及它们的组合方法。

所述离体外周血中rs2227513位点基因型为杂合AG时,被测个体样本含有HBV感染保护性因子。

本发明提供的一种与HBV感染相关的SNP标记，能用于大规模检测人群乙型肝炎病毒感染发病风险，为临床评定乙型肝炎病毒感染危险度提供了一种可靠、灵敏的方式，且检测流程简便、成本低廉,有利于临床推广。

附图说明

图1为IL-22基因序列结构及包含SNP位点示意图

图2为扩增引物PCR结果电泳图

其中：泳道1-8为PCR扩增片段，泳道9为分子量标记100bp DNA；

图3为样本外周静脉血基因组电泳图

其中：泳道1-8为基因组DNA样品，泳道9为DNA Marker DL2000；

图4为rs2227513位点A/A纯合基因型实时荧光PCR扩增曲线

图5为rs2227513位点A/G杂合基因型实时荧光PCR扩增曲线

图4和图5中：横坐标为循环数；纵坐标为第n个循环荧光报告基团的荧光值扣除基线

后得到的标准化结果，即Delta Rn。

具体实施方式

下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。

实施例1

1.1研究对象

本研究收集了1113例血液标本,其中HBV感染者494例，正常对照组619例，HBV感染组及健康对照组都同时排除HIV、HCV、***感染。所有研究对象之间均无直系亲属关系，所有参加研究人员已被告知实验目的，并口头或书面同意。

1.2研究方法

1.2.1健康组HIV、HBV、HCV、TP感染的排除:

1.2.1.1HIV抗体的筛查和确定

采用珠海丽珠试剂有限公司生产的HIV抗体的诊断试剂盒(双抗原夹心酶联免疫法)进行HIV抗体的筛查。

利用MP生物医学亚太私人有限公司生产的HIV(HIV1+2型)抗体免疫印迹试剂盒对HIV(HIV1+2型)抗体进行确认。采用定性酶免疫技术，对人血清或血浆中HIV-1和HIV-2抗体进行体外检测。

1.2.1.2乙型肝炎病毒表面抗原筛查

采用北京万泰生物药业股份有限公司生产的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)诊断试剂盒(酶联免疫法)对HBsAg进行筛查。

1.2.1.3丙型肝炎病毒抗体筛查

采用珠海丽珠试剂有限公司生产的丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒(酶联免疫法)筛查HCV抗体。

1.2.1.4***抗体筛查

采用北京万泰生物药业股份有限公司生产的***抗体诊断试剂盒进行***抗体筛查。

1.2.2病例组临床血清学检验

血清HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb的检测通过商品化的酶联免疫吸附试剂盒(北京万泰生物药业有限公司)。血清丙氨酸转氨酶水平检测由临床化学实验室完成。其正常范围是0～40IU/L。

1.3研究结果

病例组及对照组的一般人口特征归纳于表1，包括性别组成及年龄结构。病例组494例HBV感染者，男性280例(56.7％)，女性214例(43.3％)；平均年龄为26.61±7.11岁(极小值16岁、极大值61岁、中位数25岁)。对照组(男351例/268例)平均年龄为27.07±6.87(极小值18岁、极大值66岁、中位数26岁)，对照组与病例组的性别构成、年龄差别均无统计学差异(P＝0.528及0.507)。

病例组的血清学检测指标归纳于表2中，包括性别、血清丙氨酸转氨酶(ALT)水平及血清乙肝e抗原水平等。其中ALT≤40IU/L者304例，占比61.5％；ALT＞40IU/L者190例，占比38.5％。乙肝e抗原阴性者332例，占比67.2％；乙肝e抗原阳性者162例，占比32.8％。

表1病例组和对照组的一般人口特征

Table 1the general demographic characteristics of case and control

基本特征	病例组(％)	对照组(％)	P
				性别(M/F)	280/214(56.7％/43.3％)	345/274(55.7％/44.3％)	0.528<sup>a</sup>
年龄(years)	26.61±7.11	27.07±6.87	0.507<sup>a</sup>

M：male,F：female,a:Kolmogorov-Smirnov Z test,渐进显著性(双侧)

表2病例组的血清学检测指标

Table 2Serological detectional index of case

ALT:alanine aminotransferase，HBeAg:hepatitis B e antigen

实施例2

2.1SNPs位点的选择

基于前期的实验工作基础，选取IL-22基因为候选基因，进一步选取IL-22基因的rs2227513位点。根据国际人类基因组单体型图计划数据库(http://www.hapmap.org)数据，及所收集的73例汉族人样本的IL-22基因全基因序列测定结果显示，该基因在中国汉族人群IL-22基因的外显子区域没有发现SNP位点，而rs2227513位点位于该基因的5’非翻译区第一外显子和第二外显子间的一个短小的内含子区中(图1)。

2.2引物设计

根据GenBank提供的人类IL-22基因的全序列(access No.NT_029419.11：30792244bp-30783674bp、minus strand)和rs2227513位点信息，利用Primer PremierVersion 5.0(PREMIER Biosoft International,USA)软件，设计了1对PCR扩增引物(PCR扩增结果见图2)和1对TaqMan荧光探针引物并人工合成，扩增区域DNA序列及SNP位点如SEQID N05所示，所设计的引物序列见表3。

表3PCR扩增引物和TaqMan荧光探针引物

Table 3primers for PCR amplification and TaqMan fluorescent probeprimers

实施例3

3.1人全血基因组DNA提取

收集的2毫升加入EDTA抗凝剂的外周静脉全血放置于－80℃低温冰箱保存，直到基因组DNA的提取。利用德国QIAGEN公司的QIAamp DNA Blood mini kit基因组提取试剂盒提取200ul全血中单核细胞(PBMC)的基因组DNA。具体步骤如下：

(1)将样品、AE缓冲液或水在使用前回复到室温。

(2)确定AWl、AW2缓冲液和QIAGEN蛋白酶已按要求配制。

(3)如果AL缓冲液中有沉淀形成，于70℃孵育溶解。

(4)所有的离心均在室温下进行。

(5)将20ul的蛋白酶K加入到1.5ml微量离心管底部。

(6)加入200ul全血样品与蛋白酶K充分混匀。

(7)加入200ul AL缓冲液，振荡混匀15秒。

(8)56℃孵育10分钟。

(9)快速离心lO秒。

(10)加入200u1(96～100％)乙醇到样品中，振荡混匀15秒，快速离心10秒。

(11)小心地将第⑤步中的混合物加入到QIAamp柱中(该柱位于一个2ml的收集管上)，不要弄湿边缘，关上盖子，8000rpm(6000×g)离心1分钟，将QIAamp柱放在一个干净的2ml收集管上。

(12)小心地打开QIAamp柱，加入500ml AWl缓冲液，不要弄湿边缘。关上盖子，8000rpm(6000×g)离心1分钟，更换新的收集管。

(13)小心地打开QIAamp柱，加入500ul AW2缓冲液，不要弄湿边缘。盖上盖子，全速离心14000rpm(20000×g)3分钟。确保全部AW2缓冲液脱离离心管中间的滤膜。

(14)将QIAamp柱子置于一个干净的1.5ml微量离心管上，小心地打开QIAamp管的盖子，加入200ul AE缓冲液或无菌水，室温放置3分钟。8000rpm(6000×g)离心1分钟，收集DNA样品。

随机选取部分提取后的基因组DNA样品在1％的琼脂糖凝胶上电泳检测样品提取质量(图3)。所有的基因组DNA样品在260nm和280nm紫外分光光度计下检测纯度,需控制DNA浓度大于15ng/uL,DNA的纯度在1.6-1.9之间,保存于-20℃冰箱便于下一步的实验。

3.2SNP基因分型

首先通过PCR扩增含有SNP的基因组片段，然后通过序列特异的Taqman荧光探针实现SNP的基因分型。具体过程如下：将配制好的TaqMan PCR反应液分装于荧光定量PCR专用8联管中(PCR0208-C,Axygen公司)，在ABI7500荧光定量PCR仪上进行SNP基因分型。反应结束后，根据等位基因携带的VIC和FAM荧光信号PCR扩增曲线判读各待测样本所对应的基因型(图4和图5)。

从已经完成基因分型的样品中随机抽取5％的比例进行复检，以验证基因分型的准确性和重复性；此外每次检测至少需要设置3个空白对照(二次蒸馏水代替DNA模板)，阴性对照如果有扩增曲线视为实验过程中存在污染。

10ul TaqMan PCR反应体系成分描述如下：

TaqMan PCR扩增反应条件描述如下：

实施例4

4.1数据分析

利用Excel 2003建立基因分型结果数据库，统计学检验假设病例与对照都是来自于目标人群的随机独立样本。利用Haploview(version 4.2)评价基因型频率分布是否符合Hardy-Weinberg平衡规律。各组间频率比较用χ²检验，并计算比值比(Odds ratio,OR)，OR在病例对照研究中，指的是病例组中暴露与非暴露人数的比值(a/b)和对照组中暴露与非暴露人数的比值(c/d)的比，得出OR＝ad/bc，所以又叫交叉乘积比，该值可用作相对危险度的估计值。如果χ²的P<0.05或OR值的95％可信区间不包含无效假设值1，就可以认为关联是有统计学意义。上述组间资料的比较利用PASW Statistics 18.0for Windows统计软件进行。

4.2SNP位点等位基因频率和HWE检验

用Haploview(version 4.2)软件分析病例及对照组IL-22基因rs2227513位点基因频率，并进行HWE检验。两组样本的rs2227513位点的杂合基因型的观察值和预期值、次等位基因的频率、基因型频率的哈迪-温伯格平衡检验的P值见表4。一般要求HWE的P值大于0.05的结果才可信，不然样本中存在种群结构使得结果有误差。从表中可知，两组样本的rs2227513位点基因型频率分布都符合Hardy-Weinberg平衡(Hardy-Weinbergequilibrium，HWE)。

表4两组样本rs2227513位点的等位基因频率及HWE检验

Table 4allele frequency and HWE test for rs2227513loci in two groupsof samples

dbSNP:NCBI dbSNP database(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)

obsHET:杂合基因型观察值

PredHET:杂合基因型预期值

MAF：次等位基因频率

HWE p Val:哈迪-温伯格平衡检测的概率

4.3SNP位点的组间比较

rs2227513位点在病例组与对照组中只发现A/A、A/G两种基因型，在统计组间的基因型频率分布差异时，以A/A基因型和A等位基因为计算基准。在494例HBV感染者中发现1例A/G杂合基因型，相应的对照组中该基因型频率为1.62％(表5)。A/G杂合基因型与G等位基因在“HBV感染组”与“对照组”的组间差异Pearsonχ²值分别为5.61和5.042，对应的P值分别为0.018和0.025(双侧检验)，说明AG杂合基因型和G等位基因在两组间的频率分布存在显著的差异。OR值又称为比值比(odd ratio),对于发病率很低的疾病来说，它的OR值即是相对危险度的精确估计值。OR值大于1，表示该因素是一个危险因素；OR值小于1，则表示该因素是一个保护因素。因此，494例HBV感染者及619例健康人群的rs2227513位点的基因型频率组间比较结果表明，基因型AG的OR值为0.12,95％CI为0.016-0.968，上限小于1，说明携带AG基因型者HBV感染风险更低，AG基因型是抵抗HBV感染的保护因子。

表5rs2227513基因多态性组间频率的比较

Table 5Comparison of frequencies of rs2227513polymorphism between twogroups

序列表

---------------------------------------------------------------------

SEQ ID NO.1的序列

(i)序列特征：(A)长度：-679至-702bp；(B)类型：核苷酸；(C)链性：单链。

(ii)分子类型：核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.1

GGAGATCAGATTTTCAGCATTAG

SEQ ID NO.2的序列

(i)序列特征：(A)长度：+109至+128；(B)类型：核苷酸；(C)链性：单链。

(ii)分子类型：核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.2

AACCTGGTCGAAGACAACG

SEQ ID NO.3的序列

(i)序列特征：(A)长度：+59bp至+85bp；(B)类型：核苷酸；(C)链性：单链。

(ii)分子类型：核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.3

AGTATTTCATCAAACTAACCAATTG[C/T]

SEQ ID NO.4的序列

(i)序列特征：(A)长度：+34bp至+59bp；(B)类型：核苷酸；(C)链性：单链。

(ii)分子类型：核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.4

ACCAAGTTTGCCGAAACGCTTACCT

SEQ ID NO.5的序列

(i)序列特征：(A)长度：-1bp至-771bp；+1bp至+400bp；(B)类型：核苷酸；(C)链性：单链。

(ii)分子类型：核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.5

序列表

SEQ ID NO.1的序列

（i）序列特征：（A）长度：-679至-702bp；（B）类型：核苷酸；（C）链性：单链。

（ii）分子类型：核苷酸

（iii）序列描述：SEQ ID NO.1

GGAGATCAGATTTTCAGCATTAG

SEQ ID NO.2的序列

（i）序列特征：（A）长度：+109至+128；（B）类型：核苷酸；（C）链性：单链。

（ii）分子类型：核苷酸

（iii）序列描述：SEQ ID NO.2

AACCTGGTCGAAGACAACG

SEQ ID NO.3的序列

（i）序列特征：（A）长度：+59bp至+85bp；（B）类型：核苷酸；（C）链性：单链。

（ii）分子类型：核苷酸

（iii）序列描述：SEQ ID NO.3

AGTATTTCATCAAACTAACCAATTG[C/T]

SEQ ID NO.4的序列

（i）序列特征：（A）长度：+34bp至+59bp；（B）类型：核苷酸；（C）链性：单链。

（ii）分子类型：核苷酸

（iii）序列描述：SEQ ID NO.4

ACCAAGTTTGCCGAAACGCTTACCT

SEQ ID NO.5的序列

（i）序列特征：（A）长度：-1bp至-771bp；+1bp至+400bp；（B）类型：核苷酸；（C）链性：单链。

（ii）分子类型：核苷酸

（iii）序列描述：SEQ ID NO.5

-771 AAAATTTTAA GATGAACTAT ATCCATGGTA TTCTTTTATT TTAAAAAAAG TTTACATGTT

-711 AAGAAAAAAG GAGATCAGAT TTTCAGCATT AGTATTTACA AACTTAAGTT GATATTGATT

-651 ATAATTCAAT TAATACAATT TTAAGATATA TTTACTTCTG CCTTAATTGT TATGATCACT

-581 TAAAAATAGT TCCAAAAAGG GAAGAAAACA ATAATTAGAT TAGCCAAGAC AGTTATTTTT

-521 GAAACATAAG TCTGGTTTAG AATTCAGCAT GTTTAAAAAT GAGATAAAAT TATTTTAATA

-461 ATGGAATGAT CTGTTAGCTG TCATTACCAT TTACTTTAAA GCAGAGGATA TAGGACATGG

-401 GTCCTTTTTT TCTGATCACC TCCAATGAGA TAAGAATCTA TAAAGCTGGT AGGAAAATGA

-341 GTCCGTGACC AAAATGCTTA CTCAGCCACT ATAGGAGATC AAAACATTTT ATACTAAATC

-281 TGAACTCTAC TAAGACAAAA CAATTGTGTT CTTTGAAAAA TATGTAGGGT TTAGAAAATT

-221 TCTGGGATTT GTCTGTAAAA TACCCTCCGG GCTCTAATAG TGACGTTTTA GGGAAACACT

-161 TGCATCTCAA GGTGGAAAGG ATAGAGGTGG TGTTTTGTGG GCTCCTGTGG TGGTTAGGTC

-101 GTTCTCAGAA GACAGTACTG GAAATTAGAT AATTGCTGAT GTCATATTTT TCACAATTAA

-41 AAAAAAGTCA GTATCCTGGG GGCTATAAAA GCAGCAGCTT CTACCTTCCC CGTCACAAGC

20 AGAATCTTCA GAACAGGTAA GCGTTTCGGC AAACTTGGTA/G CAATTGGTTA GTTTGATGAA

80 ATACTTCTTG ACTAATTTTG TTCCTTCACG TTGTCTTCGA CCAGGTTCTC CTTCCCCAGT

140 CACCAGTTGC TCGAGTTAGA ATTGTCTGCA ATGGCCGCCC TGCAGAAATC TGTGAGCTCT

200 TTCCTTATGG GGACCCTGGC CACCAGCTGC CTCCTTCTCT TGGCCCTCTT GGTACAGGGA

260 GGAGCAGCTG CGCCCATCAG CTCCCACTGC AGGCTTGACA AGTCCAACTT CCAGCAGCCC

340 TATATCACCA ACCGCACCTT CATGCTGGCT AAGGAGGTAT ACATCTCAAT CCTGCTCTTT

Claims

1.一种检测SNP位点rs2227513是否为A/G基因型的试剂在制备判断乙型肝炎病毒感染危险度试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒包括检测所述SNP位点的引物，正向引物如SEQ ID N01所示，反向引物如SEQ ID N02所示，TaqMan荧光探针引物序列如SEQ ID N03和SEQ ID N04所示。