CN106047806B - 一种适用于高密度细胞培养体系的外周血细胞培养基 - Google Patents

一种适用于高密度细胞培养体系的外周血细胞培养基 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种适用于高密度细胞培养体系的外周血细胞培养基，其包括基础培养基和添加组分，其中，基础培养基为RMPI 1640培养基，添加组分及其浓度如下：牛血清，160‑220ml/L；PHA‑植物血球凝集素，16‑30g/L；L‑谷氨酰胺，8‑12g/L；谷胱甘肽，8‑14g/L；亚油酸，0.1‑0.3g/L；硫辛酸，0.1‑0.3g/L；各添加组分的浓度以外周血细胞培养基的总体积为基准。与现有技术相比，本发明的外周血细胞培养基能够使得外周血细胞快速、大量的增殖，增殖效果好，培养时间短，特别适合外周血细胞的高密度细胞培养体系。

Description

一种适用于高密度细胞培养体系的外周血细胞培养基
技术领域
本发明涉及一种适用于高密度细胞培养体系的外周血细胞培养基，属于细胞培养技术领域。
背景技术
细胞培养现已广泛应用于生物学、医学、新药研发等各个领域，成为最重要的基础科学之一。
关于体外细胞培养体系，现有技术中除了常规的培养板、培养皿、培养瓶等二维的细胞培养体系，现在已研发出三维培养体系，例如目前市售的高密度细胞培养桶，是一种既可以适用于贴壁细胞，又可以适用于悬浮细胞的三维培养体系，可以快速地培养大量细胞，且可以进行为期半年以上的长期细胞培养，不需要经常更换耗材，与传统的培养板、培养皿和培养瓶相比，更方便、成本更低，因此受到本领域研发人员的广泛关注。
然而，现有技术中的传统的外周血细胞培养基大多适用于中等规模的细胞培养体系，一般来说无法适用于大规模的、高密度的细胞培养；另一方面，现有的无血清培养基仅适用于培养板、培养皿、培养瓶等二维的细胞培养体系，无法适用于高密度细胞培养桶这样的三维培养体系。
现在亟待开发专用于高密度细胞培养体系的外周血细胞培养基。
发明内容
鉴于相关技术的上述问题和/或其他问题，本发明一方面提供了一种适用于高密度细胞培养体系的外周血细胞培养基，其包括基础培养基和添加组分，其中，所述基础培养基为RMPI 1640培养基；所述添加组分及其浓度如下：牛血清，160-220ml/L；PHA-植物血球凝集素，16-30g/L；L-谷氨酰胺，8-12g/L；谷胱甘肽，8-14g/L；亚油酸，0.1-0.3g/L；硫辛酸，0.1-0.3g/L；各添加组分的浓度以所述外周血细胞培养基的总体积为基准。
优选的，以所述外周血细胞培养基的总体积为基准，所述RMPI 1640培养基的干粉量为10-15g/L。更优选的，以所述外周血细胞培养基的总体积为基准，所述RMPI 1640培养基的干粉量为13.6g/L。
优选的，所述添加组分中，所述牛血清的浓度为200ml/L，所述PHA-植物血球凝集素的浓度为24g/L，所述L-谷氨酰胺的浓度为11g/L，且所述谷胱甘肽的浓度为12g/L。
优选的，所述添加组分中，所述亚油酸的浓度为0.2g/L，所述硫辛酸的浓度为0.2g/L。
优选的，所述添加组分还包括青霉素和链霉素，所述青霉素的浓度为1×105-4×105IU/L，所述链霉素的浓度为1×105-4×105IU/L。
优选的，所述添加组分还包括酚红钠，所述酚红钠的浓度为5-7mg/L。
优选的，所述外周血细胞培养基的pH值为7.3～7.5。
本发明另一方面提供了上述的外周血细胞培养基在高密度细胞培养体系中的应用。
优选的，所述高密度细胞培养体系为高密度细胞培养桶。
本发明的适用于高密度细胞培养体系的外周血细胞培养基，采用RMPI1640培养基作为基础培养基以及特定的添加组分的组合，尤其是牛血清、PHA-植物血球凝集素、L-谷氨酰胺和谷胱甘肽，四者同时满足上述的浓度范围时，能够使得外周血细胞快速、大量的增殖，特别适合外周血细胞的高密度细胞培养体系。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于这些具体实施方式。
在本发明的一个具体实施方案中，一种适用于高密度细胞培养体系的外周血细胞培养基，其包括基础培养基和添加组分，其中，所述基础培养基为RMPI 1640培养基；所述添加组分及其浓度如下：牛血清，160-220ml/L；PHA-植物血球凝集素，16-30g/L；L-谷氨酰胺，8-12g/L；谷胱甘肽，8-14g/L；亚油酸，0.1-0.3g/L；硫辛酸，0.1-0.3g/L；各添加组分的浓度以所述外周血细胞培养基的总体积为基准。
本发明的发明人经过大量的研究试验发现，当外周血细胞培养基采用RMPI 1640培养基作为基础培养基以及上述特定的添加组分的组合，尤其是牛血清、PHA-植物血球凝集素、L-谷氨酰胺和谷胱甘肽，四者同时满足上述的浓度范围时，能够使得外周血细胞快速、大量的增殖，特别适合外周血细胞的高密度细胞培养体系。
在本发明的一个优选实施方案中，以所述外周血细胞培养基的总体积为基准，所述RMPI 1640培养基的干粉量为10-15g/L。
在本发明的一个更优选的实施方案中，所述RMPI 1640培养基的干粉量为13.6g/L。
在本发明的另一个更优选的实施方案中，所述添加组分中，所述牛血清的浓度为200ml/L，所述PHA-植物血球凝集素的浓度为24g/L，所述L-谷氨酰胺的浓度为11g/L，且所述谷胱甘肽的浓度为12g/L。当本发明的外周血细胞培养基中，RMPI 1640培养基的浓度，以及牛血清、PHA-植物血球凝集素、L-谷氨酰胺和谷胱甘肽同时采用上述特定的浓度时，符合外周血细胞的高密度培养的营养需求，特别适合外周血细胞的高密度细胞培养体系，尤其是诸如高密度细胞培养桶之类的三维培养体系，具有较好的增殖效果。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述添加组分中，所述亚油酸的浓度为0.2g/L，所述硫辛酸的浓度为0.2g/L。这两种物质以及特定浓度的组合对于外周血细胞的生长起到保护作用，尤其对于外周血细胞的高密度培养体系，能够增加外周血细胞的存活率。
在本发明的一个优选实施方案中，所述添加组分还可以抗生素，例如包括青霉素和链霉素；所述青霉素的浓度为1×105-4×105IU/L，所述的链霉素浓度为1×105-4×105IU/L。更优选的，青霉素的浓度为2×105IU/L，链霉素浓度为2×105IU/L。这两种抗生素组合及其特定的浓度，特别适合外周血细胞的高密度细胞培养体系，抗菌效果优异，细胞存活率高。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述添加组分还包括酚红钠，所述酚红钠的浓度为5-7mg/L。
在本发明的一个优选实施方案中，将该无血清培养基的pH值控制在7.3～7.5。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的外周细胞培养基是专用于高密度细胞培养桶的外周细胞培养基。
实施例1
实施例1的适用于高密度细胞培养体系的外周血细胞培养基的配制过程如下：
步骤1)：在无菌条件下将合成的RPMI1640干粉在电子天平上称取136g后置于消毒容器内，加7.5L重蒸水稀释后搅拌均匀获得基础培养基；
步骤2)：将添加组分：2L牛血清、240g PHA-植物血球凝集素、110g L-谷氨酰胺、120g谷胱甘肽、1.2g青霉素(相当于2×106IU)、2g链霉素(相当于2×106IU)、2g亚油酸、2g硫辛酸和60mg酚红钠依次加入步骤1)获得的基础培养基中，充分混匀；
步骤3)：过滤灭菌，再调节pH值至7.4±0.1，最后加入重蒸水将体积调节至10L；
步骤4)：培养基配制完成后，过滤灭菌，分装、封口，最后冷藏(-20℃环境)备用。
实施例2
实施例2的适用于高密度细胞培养体系的外周血细胞培养基的配制过程如下：
步骤1)：在无菌条件下将合成的RPMI1640干粉在电子天平上称取140g后置于消毒容器内，加7.5L重蒸水稀释后搅拌均匀获得基础培养基；
步骤2)：将添加组分：1.7L牛血清、260g PHA-植物血球凝集素、100g L-谷氨酰胺、110g谷胱甘肽、2g青霉素(相当于3.3×106IU)、3g链霉素(相当于3×106IU)、1.8g亚油酸、1.8g硫辛酸和66mg酚红钠依次加入步骤1)获得的基础培养基中，充分混匀；
步骤3)：过滤灭菌，再调节pH值至7.4±0.1，最后加入重蒸水将体积调节至10L；
步骤4)：培养基配制完成后，过滤灭菌，分装、封口，最后冷藏(-20℃环境)备用。
应用例1
用酒精消毒手指皮肤，用采血针刺破皮肤，用含肝素钠的中空采血管采集外周血，轻轻摇晃混匀，将5ml外周血加入至上述实施例1获得的外周血细胞培养基中，并将外周血细胞浓度稀释至1.2×106个/ml。
采用市售的FiberCell品牌C2025型号的高密度细胞培养桶(参见FiberCell细胞培养***产品销售网页)，以及本发明实施例1获得的外周血细胞培养基进行培养。
将5ml外周血细胞浓度为1.2×106个/ml的培养基用注射器载入上述的高密度细胞培养桶中，再将25ml外周血培养基加入到50ml高密度细胞培养桶储液瓶中(外周血细胞的接种密度为2×105个/ml)；具体地，储液瓶中的培养基通过硅胶管与细胞培养桶连接，在蠕动泵的作用下，持续循环流动，培养基通过细胞培养桶的中空纤维进行交换，给细胞培养桶内的细胞不断的提供营养物质；将整个高密度细胞培养桶放入5％CO2，37℃的培养箱中培养。
应用例2：具体过程与应用例1相同，不同在于采用实施例2获得的外周血细胞培养基进行外周血细胞的培养。
效果数据
对比例1：采用市售的FiberCell品牌C2025型号的高密度细胞培养桶以及市售的青岛莱佛品牌的RPMI 1640外周血细胞培养基，培养过程与应用例1相同，具体不再赘述。
对比例A：采用市售的Corning品牌T25型号的细胞培养瓶，以及市售的青岛莱佛品牌的RPMI 1640外周血细胞培养基，将5ml莱佛品牌的外周血细胞培养基用移液管转移至T25培养瓶中，再加入1ml外周血细胞浓度为1.2×106个/ml的培养基(外周血细胞的接种密度为2×105个/ml)进行悬浮培养，将培养瓶放入5％CO2，37℃的培养箱中培养72小时。
分别检测应用例1、应用例2、对比例1和对比例A的细胞增殖速率以及细胞存活率。
检测细胞增殖速率
应用例1和应用例2，以及对比例1和对比例A，均在培养1、3和6天后，分别取样培养液，进行细胞浓度的检测，检测结果参见下表1。
表1
检测细胞存活率
培养6天后，收集各组的培养液，进行流式检测。检测结果如下：
应用例1的细胞存活率：98.4％；应用例2的细胞存活率：96.7％；对比例1的细胞存活率：84.2％；对比例A的细胞存活率：88.6％。
将表1中的结果进行对比可以看出，一方面，对比例1的细胞增殖速率以及细胞存活率(细胞培养效果)的结果稍劣于对比例A的结果，这说明：常规培养基更适合于诸如细胞瓶之类的传统小规模培养体系，不适合高密度细胞培养体系；另一方面，本发明应用例1的细胞增殖速率和细胞存活率远高于对比例1的，这说明：本发明实施例的外周血细胞培养基相比常规的RMPI外周血细胞培养基更适合于高密度细胞培养体系。
应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种适用于高密度细胞培养体系的外周血细胞培养基，其包括基础培养基和添加组分，其中，
所述基础培养基为RMPI 1640培养基；
所述添加组分及其浓度如下：
牛血清，170-200ml/L；
PHA-植物血球凝集素，24-26g/L；
L-谷氨酰胺，10-11g/L；
谷胱甘肽，11-12g/L；
亚油酸，0.18-0.2g/L；
硫辛酸，0.18-0.2g/L；
各添加组分的浓度以所述外周血细胞培养基的总体积为基准；
以所述外周血细胞培养基的总体积为基准，所述RMPI 1640培养基的干粉量为10-15g/L；
所述外周血细胞培养基的pH值为7.3～7.5。
2.如权利要求1所述的外周血细胞培养基，其特征在于：
以所述外周血细胞培养基的总体积为基准，所述RMPI 1640培养基的干粉量为13.6g/L。
3.如权利要求1所述的外周血细胞培养基，其特征在于：
所述添加组分中，所述牛血清的浓度为200ml/L，所述PHA-植物血球凝集素的浓度为24g/L，所述L-谷氨酰胺的浓度为11g/L，且所述谷胱甘肽的浓度为12g/L。
4.如权利要求1所述的外周血细胞培养基，其特征在于：
所述添加组分中，所述亚油酸的浓度为0.2g/L，所述硫辛酸的浓度为0.2g/L。
5.如权利要求1至4中任意一项所述的外周血细胞培养基，其特征在于：
所述添加组分还包括青霉素和链霉素，所述青霉素的浓度为1×105-4×105IU/L，所述链霉素的浓度为1×105-4×105IU/L。
6.如权利要求1至4中任意一项所述的外周血细胞培养基，其特征在于：
所述添加组分还包括酚红钠，所述酚红钠的浓度为5-7mg/L。
7.如权利要求1至6中任意一项所述的外周血细胞培养基在用于外周血细胞的高密度细胞培养体系中的应用。
8.如权利要求7所述应用，其特征在于：所述高密度细胞培养体系为高密度细胞培养桶。
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