ES2299276T3 - Polipeptidos env del vih modificados. - Google Patents
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Abstract
Un polinucleótido codificante de un polipéptido Env del VIH modificado en el que el polipéptido tiene al menos un aminoácido eliminado o reemplazado en comparación con el tipo salvaje de la región correspondiente a los residuos 420 a 436 numerados en relación con HXB-2 (SEQ ID NO: 1).
Description
Polipéptidos Env del VIH modificados.
La invención se refiere en general a
polipéptidos de la envoltura (Env) del VIH modificados que son
útiles como agentes inmunizantes o para generar una respuesta
inmune en un sujeto, por ejemplo, una respuesta inmune celular o
una respuesta inmune protectora. Más concretamente, la invención se
refiere a polipéptidos Env tales como gp120, gp140 o gp160, en los
que se ha modificado al menos una de las configuraciones nativas de
la lámina \beta. La invención también se refiere a procedimientos
de uso de estos polipéptidos para provocar una respuesta inmune
contra una amplia variedad de subtipos del VIH.
El virus de la inmunodeficiencia humana
(VIH-1, también denominado HTLV-III,
LAV o HTLV-III/LAV) es el agente etiológico del
síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y los trastornos
relacionados (véase, p. ej., Barre-Sinoussi, et
al., (1983) Science 220: 868-871; Gallo
et al. (1984) Science 224: 500-503;
Levy et al., (1984) Science 225:
840-842; Siegal et al., (1981) N. Engl. J.
Med. 305: 1439-1444). Los pacientes de SIDA,
habitualmente, tienen un prolongado período asintomático seguido por
la degeneración progresiva del sistema inmunológico y del sistema
nervioso central. La replicación del virus está altamente regulada,
y tanto la infección latente como la lítica del subconjunto auxiliar
positivo CD4 de los linfocitos T tienen lugar en cultivo tisular
(Zagury et al., (1986) Science 231:
850-853). Los estudios moleculares del
VIH-1 muestran que codifica un número de genes
(Ratner et al., (1985) Nature 313:
277-284; Sanchez-Pescador et
al., (1985) Science 227: 484- 492), que incluye tres
genes estructurales (gag, pol y env) que son comunes en todos los
retrovirus. Las secuencias de nucleótidos de los genomas víricos de
otros retrovirus, particularmente del VIH-2 y el
virus de la inmunodeficiencia del simio, VIS (anteriormente
denominado STLV-III), también contienen estos genes
estructurales. (Guyader et al., (1987) Nature 326:
662-669; Chakrabarti et al., (1987)
Nature).
La proteína de la envoltura del
VIH-1, VIH-2 y VIS es una
glicoproteína de aproximadamente 160 kD (gp160). Durante la
infección vírica de la célula huésped, la gp160 es escindida por las
proteasas de la célula huésped para formar la gp120 y la proteína
de la membrana integral, la gp41. La parte de la gp41 es anclada a
la bicapa membranosa del virión, mientras que el segmento de la
gp120 sobresale hacia el medio de alrededor. La gp120 y la gp41
están asociadas más covalentemente, pudiéndose liberar gp120 de la
superficie de los viriones y las células infectadas.
Según lo representado en la figura 1, estudios
cristalográficos del polipéptido del núcleo gp120 indican que este
polipéptido está plegado en dos dominios principales que tienen
ciertas estructuras emanantes. El dominio interior (interior con
respecto a los terminales N y C) presenta un paquete bicatenario de
dos hélices con un pequeño sándwich \beta de cinco cadenas en su
extremo terminal-proximal y una proyección en el
extremo distal desde el que emana el tallo V1/V2. El dominio
exterior es un cilindro doble atado tendido al lado del dominio
interno de manera que los ejes del cilindro exterior y del paquete
interior son aproximadamente paralelos. Entre el dominio interior
distal y el dominio exterior distal hay una lámina de unión de
cuatro cadenas que sujeta un peculiar minidominio en contacto con
el, pero distinto del, dominio interior, del dominio exterior y del
dominio V1/V2. La lámina de unión está compuesta de cuatro
estructuras de cadena \beta (\beta-3,
\beta-2, \beta-21,
\beta-20 mostradas en la figura 1). La región de
unión se puede observar en la figura 1, empaquetándose
fundamentalmente sobre el dominio interior, aunque hay algunos
residuos superficiales del dominio exterior, tales como Phe 382,
que alcanzan la lámina de unión para formar parte de su núcleo
hidrófobo.
La unidad básica de la configuración de lámina
\beta de la región de la lámina de unión es la cadena \beta,
que existe como una hélice menos enrollada con 2,0 residuos por
vuelta. La configuración de la cadena \beta sólo es estable
cuando está incorporada en una lámina \beta en la que se forman
enlaces de hidrógeno con una geometría casi óptima entre los grupos
peptídicos de las cadenas \beta adyacentes; los momentos dipolares
de las cadenas también están alineados favorablemente. Las cadenas
laterales de los residuos adyacentes de la misma cadena sobresalen
por los lados opuestos de la lámina y no interactúan entre sí, pero
tienen significativas interacciones con el eje central y con las
cadenas laterales de las cadenas vecinas. Para una descripción
general de las láminas \beta, véase, p. ej., T. E. Creighton,
"Proteins: Structures and Molecular Properties" (W. H. Freeman
and Company, 1993); y A. L. Lehninger, Biochemistry (Worth
Publishers, Inc., 1975).
El polipéptido gp120 juega un papel decisivo en
la mediación de la entrada a la célula huésped. Estudios recientes
han indicado que la unión de CD4 a gp120 induce a un cambio en la
configuración de Env que permite la unión a un
co-receptor (p. ej., un receptor de la quimioquina)
y a la entrada posterior del virus en la célula. (Wyatt, R., et
al., (1998) Nature 393: 705-711; Kwong,
P., et al., (1998) Nature 393:
648-659). Haciendo referencia de nuevo a la figura
1, CD4 está unido en una depresión formada en el punto de contacto
del dominio exterior, el dominio interior y la lámina de unión de la
gp120.
También se ha estudiado la inmunogenicidad del
polipéptido gp120. Por ejemplo, los individuos infectados por el
VIH-1 suelen desarrollar anticuerpos que pueden
neutralizar el virus en análisis in vitro, y esta respuesta
está fundamentalmente dirigida contra determinantes neutralizantes
lineales del tercer bucle variable de la glicoproteína gp120
(Javaherian, K., et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci.
86: 6786-6772; Matsushita, M., et al. (1988)
J. Virol. 62: 2107-2144; Putney, S., et
al., (1986) Science 234: 1392-1395;
Rushe, J. R., et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA
85: 3198-3202). Sin embargo, estos anticuerpos
generalmente presentan la capacidad de neutralizar únicamente un
número limitado de cadenas de VIH-1 (Matthews, T.
(1986) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 83: 9709- 9713; Nara, P.
L., et al., (1988) J. Virol., 62:
2622-2628; Palker, T. J., et al., (1988)
Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 85: 1932-1936).
Más tarde durante la infección por VIH en seres humanos, aparecen
los anticuerpos capaces de neutralizar una mayor variedad de
aislados del VIH-1 (Barre-Sinoussi,
F., et al., (1983) Science 220:
868-871; Robert-Guroff, M., et
al., (1985) Nature (Londres) 316: 72-74;
Weis, R., et al., (1985) Nature (Londres) 316:
69-72; Weis, R., et al., (1986) Nature
(Londres) 324: 572-575).
Un trabajo reciente realizado por Stamatatos
et al, (1998) "AIDS Res Hum Retroviruses" 14 (13):
1129-39, muestra que una eliminación de la región
variable 2 de un virus VIH-1_{SF162}, que utiliza
el co-receptor CCR-5 para la entrada
vírica, vuelve al virus altamente susceptible a la neutralización
mediada por el suero. Este virus con la V2 eliminada también fue
neutralizado por el suero obtenido en pacientes infectados no sólo
por aislados del subtipo B del VIH-1, sino también
por aislados de los subtipos A, C, D y F del VIH-1.
Sin embargo, la eliminación de la región variable 1 no tiene ningún
efecto. La eliminación de las regiones variables 1 y 2 de un
aislado de LAI VIH-1_{IIIB} también aumentó la
susceptibilidad a la neutralización por anticuerpos monoclonales
cuyos epitopes se localizan en el bucle V3, el sitio de unión a CD4
y las regiones de gp120 conservadas (Wyatt, R., et al.
(1995) J Virol., 69: 5723-5733). Estudios de
inmunogenicidad en conejos realizados con virus del
VIH-1 con eliminaciones en las regiones V1/V2 y V3
de la cepa LAI, que usa el co-receptor CXCR4 para
la entrada vírica, no muestran ninguna mejoría en la capacidad de
Env para aumentar los anticuerpos neutralizantes (Leu et al.
(1998) "AIDS Res. and Human Retroviruses". 14:
151-155).
Además, un subconjunto de los anticuerpos
ampliamente reactivos encontrado en la mayoría de los individuos
infectados interfiere en la unión de gp120 y CD4 (Kang, C.-Y., et
al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 88:
6171-6175; McDougal, J. S., et al., (1986)
J. Immunol. 137: 2937- 2944). Se cree que otros anticuerpos
se unen a la región de unión a los receptores de quimioquinas una
vez que CD4 se ha unido a Env (Thali et al., (1993) J.
Virol. 67: 3978-3988). El hecho de que los
anticuerpos neutralizantes generados durante la infección por VIH
no proporcionen un efecto antivírico permanente puede deberse en
parte a la generación de mutantes del virus que "se escapan de la
neutralización" y al descenso general del sistema inmunológico
del huésped asociado con la patogénesis. Por el contrario, la
presencia de anticuerpos neutralizantes ya existentes tras la
exposición inicial al VIH-1 tendrá probablemente un
efecto protector.
Comúnmente, se cree que una vacuna satisfactoria
debería ser capaz de provocar una potente respuesta de anticuerpos
ampliamente neutralizantes contra las diversas cepas del
VIH-1 (Montefiori y Evans (1999) AIDS Res. Hum.
Ret. 15 (8): 689-698; Bolognesi, D., P., et
al. (1994) Ann. Int. Med., 8: 603-611;
Haynes, B., F., et al., (1996) Science; 271:
324-328). Los anticuerpos neutralizantes, mediante
su unión a los viriones entrantes, pueden reducir o incluso
prevenir su infectividad hacia las células diana y prevenir la
propagación entre las células del virus en cultivo tisular (Hu
et al., (1992) Science 255: 456- 459; Burton, D., R.
y Montefiori, D. (1997) AIDS 11 (supl. A):
587-598). Sin embargo, según lo descrito
anteriormente, los anticuerpos dirigidos contra gp120 generalmente
no muestran respuestas amplias de los anticuerpos contra las
diferentes cepas del VIH.
Actualmente, el foco del desarrollo de la
vacuna, desde la perspectiva de la inmunidad humoral, está en la
neutralización de los aislados primarios que utilizan el
co-receptor de quimioquinas CCR5 de quien se cree
que tiene importancia en la entrada vírica (Zhu, T., et al.,
(1993) Science 261: 1179- 1181; Fiore, J., et al.,
(1994) Virology; 204: 297-303). Estos virus son
generalmente mucho más resistentes a la neutralización de los
anticuerpos que las cepas adaptadas a la línea de células T que usan
el co-receptor CXCR4, aunque ambos pueden ser
neutralizados in vitro por ciertos anticuerpos monoclonales
de actuación amplia y potente, tales como IgG1b12, 2G12 and 2F5
(Trkola, A., et al. (1995) J. Virol. 69:
6609-6617; D'Sousa PM., et al (1997) J
Infect. Dis. 175: 1062-1075). Estos
anticuerpos monoclonales se dirigen al sitio de unión a CD4, un
sitio de glicosilación y al dominio de fusión a gp41,
respectivamente. Sin embargo, queda el problema de que no se sabe
cómo producir los anticuerpos de la especificidad apropiada mediante
la vacuna. Los anticuerpos generados por la glicoproteína gp120
desde un aislado dado, habitualmente, sólo son capaces de
neutralizar virus cercanos, generalmente, de un subtipo del
VIH-1 similar, y habitualmente, del mismo
subtipo.
A pesar de los enfoques anteriores, sigue
existiendo la necesidad de antígenos de Env que puedan provocar una
respuesta inmune (p. ej., anticuerpos neutralizantes y/o
protectores) en un sujeto contra las múltiples cepas y subtipos del
VIH, por ejemplo, cuando se administran como vacuna. La presente
invención resuelve éstos y otros problemas proporcionando
polipéptidos Env modificados (p. ej., gp120) para dejar al
descubierto los epitopes en o cerca del sitio de unión a CD4.
\vskip1.000000\baselineskip
Según la presente invención, se proporcionan
polipéptidos Env del VIH modificados. En concreto, se hacen
eliminaciones y/o mutaciones en una o más de las 4 láminas de unión
antiparalelas \beta del polipéptido Env del VIH. De este modo, se
deja suficiente estructura como para permitir el pliegue correcto
del polipéptido, por ejemplo, de gp120, aunque se elimina
suficiente lámina de unión como para poner al descubierto el surco
de CD4, permitiendo la generación de una respuesta inmune contra
los epitopes en o cerca del sitio de unión a CD4 del polipéptido Env
(p. ej., gp120).
En un aspecto, la invención incluye un
polinucleótido que codifica un polipéptido Env del VIH modificado,
teniendo el polipéptido al menos un residuo de aminoácido modificado
(p. ej., borrado o reemplazado) borrado en la región
correspondiente a los residuos 421 a 436 en relación con
HXB-2, por ejemplo, los constructos representados
en las figuras 6-29 (SEQ ID NO: 3 a 26). En ciertas
realizaciones, el polinucleótido también tiene la región
correspondiente a los residuos 124-198 del
polipéptido HXB-2 (p. ej., V1/V2) borrada y al menos
un aminoácido borrado o reemplazado en las regiones
correspondientes a los residuos 119 a 123 y 199 a 210 en relación
con el HXB-2. En otras realizaciones, estos
polinucleótidos codifican polipéptidos Env que tienen al menos un
aminoácido del bucle pequeño de la lámina de unión (p. ej., los
residuos de aminoácido 427 a 429 en relación con
HXB-2) borrado o reemplazado. Las secuencias de
aminoácidos de los polipéptidos modificados codificados por los
polinucleótidos de la presente invención pueden estar basadas en
cualquier variante del VIH, por ejemplo, en SF162.
En otro aspecto, la invención incluye
polipéptidos Env del VIH modificados inmunogénicos que tienen al
menos un residuo de aminoácido modificado (p. ej., borrado o
reemplazado) borrado en la región correspondiente a los residuos
421 a 436 en relación con HXB-2, por ejemplo, una
eliminación o un reemplazo de los aminoácidos de la región del
bucle pequeño (p. ej., los residuos de aminoácido 427 a 429 en
relación con HXB-2). Estos polipéptidos pueden
tener modificaciones (p. ej., una eliminación o un reemplazo) de al
menos un aminoácido entre aproximadamente el residuo de aminoácido
420 y el residuo de aminoácido 436 en relación con
HXB-2, y, opcionalmente, pueden tener eliminaciones
o truncamientos de las regiones V1 y/o V2. Los polipéptidos
modificados inmunogénicos de la presente invención pueden estar
basados en cualquier variante del VIH, por ejemplo, en SF162.
En otro aspecto, la invención incluye una
composición vacunal que comprende cualquiera de los polinucleótidos
codificantes de los polipéptidos Env modificados descritos
anteriormente. Las composiciones vacunales que comprenden los
polipéptidos Env modificados y, opcionalmente, un adyuvante también
se incluyen en la invención.
En otro aspecto más, la invención incluye un
procedimiento para provocar una respuesta inmune en un sujeto que
comprende administrar uno o más de los polinucleótidos o los
constructos descritos anteriormente en una cantidad suficiente para
provocar una respuesta inmune en el sujeto. En ciertas
realizaciones, el procedimiento comprende además administrar un
adyuvante al sujeto.
En otro aspecto, la invención incluye un
procedimiento para provocar una respuesta inmune en un sujeto que
comprende administrar una composición que comprende cualquiera de
los polipéptidos Env modificados descritos anteriormente y un
adyuvante. La composición se administra en una cantidad suficiente
para provocar una respuesta inmune en el sujeto.
En otro aspecto, la invención incluye un
procedimiento para provocar una respuesta inmune en un sujeto que
comprende:
- (a)
- administrar una primera composición que comprende cualquiera de los polinucleótidos anteriormente descritos en una etapa de cebado y
- (b)
- administrar una segunda composición que comprende cualquiera de los polipéptidos Env modificados descritos anteriormente, como un refuerzo, en una cantidad suficiente para provocar una respuesta inmune en el sujeto. En ciertas realizaciones, la primera composición, la segunda composición o ambas, la primera y la segunda composición, comprenden además un adyuvante.
Estas y otras realizaciones de la presente
invención tendrán lugar fácilmente para los expertos en la técnica a
la luz de la revelación de la presente memoria.
La figura 1 es una representación esquemática de
la estructura terciaria del polipéptido gp120 Env del
VIH-1_{HXB-2}, según lo
determinado por estudios cristalográficos.
Las figuras 2A-C representan el
alineamiento de la secuencia de aminoácidos del polipéptido gp160
Env del VIH-1_{HXB-2} de tipo
salvaje (SEQ ID NO: 1) con la secuencia de aminoácidos de las
variantes del VIH SF162 (mostradas como "162" (SEQ ID NO: 2),
SF2, CM236 y US4. Las flechas indican las regiones que están
eliminadas o reemplazadas de los polipéptidos modificados. Los
puntos negros indican los residuos de cisteína conservados. El
asterisco indica la posición del último aminoácido en gp120.
Las figuras 3A-J representan el
alineamiento de las secuencias de nucleótidos de los polinucleótidos
que codifican los polipéptidos Env modificados que tienen
eliminaciones de V1/V2. Los residuos de aminoácido sin modificar
codificados por estas secuencias corresponden a los residuos de
SF162 de tipo salvaje, pero están numerados en relación con
HXB-2.
Las figuras 4A-M representan el
alineamiento de las secuencias de nucleótidos de los polinucleótidos
que codifican los polipéptidos Env modificados que tienen
eliminaciones o reemplazos en el bucle pequeño. Los residuos de
aminoácido sin modificar codificados por estas secuencias
corresponden a los residuos de SF162 de tipo salvaje, pero están
numerados en relación con HXB-2.
Las figuras 5A-N representan el
alineamiento de las secuencias de nucleótidos de los polinucleótidos
que codifican los polipéptidos Env modificados que tienen
eliminaciones de ambas V1/V2 y, además, eliminaciones o reemplazos
en el bucle pequeño. Los residuos de aminoácido sin modificar
codificados por estas secuencias corresponden a los residuos de
SF162 de tipo salvaje, pero están numerados en relación con
HXB-2.
La figura 6 representa la secuencia de
nucleótidos del constructo designado por
Val120-Ala204 (SEQ ID NO: 3).
La figura 7 representa la secuencia de
nucleótidos del constructo designado por
VaI120-Ile201 (SEQ ID NO: 4).
La figura 8 representa la secuencia de
nucleótidos del constructo designado por
Val120-Ile201B (SEQ ID NO: 5).
La figura 9 representa la secuencia de
nucleótidos del constructo designado por
Lys121-Val200 (SEQ ID NO: 6).
La figura 10 representa la secuencia de
nucleótidos del constructo designado por
Leu122-Ser199 (SEQ ID NO: 7).
La figura 11 representa la secuencia de
nucleótidos del constructo designado por
Val120-Thr202 (SEQ ID NO: 8).
La figura 12 representa la secuencia de
nucleótidos del constructo designado por
Trp427-Gly431 (SEQ ID NO: 9).
La figura 13 representa la secuencia de
nucleótidos del constructo designado por
Arg426-Gly431 (SEQ ID NO: 10).
La figura 14 representa la secuencia de
nucleótidos del constructo designado por Arg426- Gly431B (SEQ ID NO:
11).
La figura 15 representa la secuencia de
nucleótidos del constructo designado por
Arg426-Lys432 (SEQ ID NO: 12).
La figura 16 representa la secuencia de
nucleótidos del constructo designado por
Asn425-Lys432 (SEQ ID NO: 13).
La figura 17 representa la secuencia de
nucleótidos del constructo designado por
Ile424-Ala433 (SEQ ID NO: 14).
La figura 18 representa la secuencia de
nucleótidos del constructo designado por
Ile423-Met434 (SEQ ID NO: 15).
La figura 19 representa la secuencia de
nucleótidos del constructo designado por
Gin422-Tyr435 (SEQ ID NO: 16).
La figura 20 representa la secuencia de
nucleótidos del constructo designado por
Gin422-Tyr435B (SEQ ID NO: 17).
La figura 21 representa la secuencia de
nucleótidos del constructo designado por Leu122- Ser199;
Arg426-Gly431 (SEQ ID NO: 18).
La figura 22 representa la secuencia de
nucleótidos del constructo designado por Leu122- Ser199;
Arg426-Lys432 (SEQ ID NO: 19).
La figura 23 representa la secuencia de
nucleótidos del constructo designado por
Leu122-Ser199; Trp427-Gly431 (SEQ ID
NO: 20).
La figura 24 representa la secuencia de
nucleótidos del constructo designado por
Lys121-Val200; Asn425-Lys432 (SEQ ID
NO: 21).
La figura 25 representa la secuencia de
nucleótidos del constructo designado por
Val120-Ile201; Ile424-Ala433 (SEQ ID
NO: 22).
La figura 26 representa la secuencia de
nucleótidos del constructo designado por Val120- Ile201B;
Ile424-Ala433 (SEQ ID NO: 23).
La figura 27 representa la secuencia de
nucleótidos del constructo designado por
Val120-Thr202; Ile424-Ala433 (SEQ ID
NO: 24).
La figura 28 representa la secuencia de
nucleótidos del constructo designado por
Val127-Asn195 (SEQ ID NO: 25).
La figura 29 representa la secuencia de
nucleótidos del constructo designado por Val127- Asn195;
Arg426-Gly431 (SEQ ID NO: 26).
La práctica de la presente invención empleará, a
no ser que se indique lo contrario, procedimientos convencionales
de química de proteínas, inmunología vírica, biología molecular y
técnicas de ADN recombinante pertenecientes al alcance de la
técnica. Tales técnicas están completamente explicadas en la
bibliografía. Véase, p. ej., T. E. Creighton, "Proteins:
Structures and Molecular Properties" (W. H. Freeman and Company,
1993); Nelson L. M. y Jerome H. K. "HIV Protocols in Methods in
Molecular Medicine", vol. 17, 1999; Sambrook, et al.,
"Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor
Laboratory, 1989); F. M. Ausubel et al. "Current Protocols
in Molecular Biology", Greene Publishing Associates & Wiley
Interscience New York; y Lipkowitz y Boyd, "Reviews in
Computational Chemistry", volúmenes 1-presente
(Wiley-VCH, Nueva York, Nueva York, 1999).
Debe indicarse que, como se usan en esta memoria
y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares de los
artículos definidos e indefinidos incluyen los referentes en plural,
a no ser que el contenido indique claramente lo contrario. De este
modo, por ejemplo, la referencia a "un polipéptido" incluye una
mezcla de dos o más polipéptidos, y similares.
\vskip1.000000\baselineskip
En la descripción de la presente invención, se
emplearán los siguientes términos, estando destinados a ser
definidos según lo indicado a continuación.
Los términos "polipéptido" y
"proteína" se usan indistintamente en la presente memoria para
denotar cualquier polímero de residuos de aminoácido. Los términos
engloban péptidos, oligopéptidos, dímeros, multímeros y similares.
Tales polipéptidos pueden tener un origen natural, o pueden estar
sintetizados o producidos recombinantemente. Los términos también
incluyen modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido,
por ejemplo, glicosilación, acetilación, fosforilación, etc.
Un polipéptido según lo definido en la presente
memoria está generalmente formado por los 20 aminoácidos naturales
Ala (A), Arg (R), Asn (N), Asp (D), Cys (C), Gln (Q), Glu (E), Gly
(G), His (H), Ile (I), Leu (L), Lys (K), Met (M), Phe (F), Pro (P),
Ser (S), Thr (T), Trp (W), Tyr (Y) y Val (V), y también puede
incluir cualquiera de los diversos análogos de aminoácido
conocidos, análogos tanto naturales como sintetizados, tales como,
pero sin limitarse a, homoisoleucina, asaleucina,
2-(metilenciclopropil)glicina, S-metilcisteína,
S-(prop-1-enil)cisteína,
homoserina, ornitina, norleucina, norvalina, homoarginina,
3-(3-carboxifenil)alanina, ciclohexilalanina,
mimosina, ácido pipecólico, ácido 4-metilglutámico,
canavanina, ácido 2,3-diaminopropiónico, y
similares. Más adelante, se exponen otros ejemplos de agentes
polipeptídicos que encontrarán un uso en la presente invención.
"Geometría" o "estructura terciaria"
de un polipéptido o una proteína pretende significar la
configuración tridimensional global de la proteína. Según lo
descrito en la presente memoria, la geometría puede ser
determinada, por ejemplo, mediante estudios cristalográficos o
usando diversos programas o algoritmos que predigan la geometría en
base a las interacciones entre los aminoácidos que constituyen las
estructuras primaria y secundaria.
Polipéptido, agente polipeptídico o fármaco
polipeptídico de "tipo salvaje" pretende significar una
secuencia polipeptídica natural y su correspondiente estructura
secundaria. Una proteína o un polipéptido "aislado" o
"purificado" es una proteína que está separada y diferenciada
de un organismo entero con el que la proteína está normalmente
asociada en la naturaleza. Resulta evidente que el término denota
proteínas de diversos niveles de pureza. Comúnmente, una composición
que contenga una proteína purificada será una en la que al menos
aproximadamente el 35%, preferiblemente, al menos aproximadamente el
40-50%, más preferiblemente, al menos
aproximadamente el 75-85%, y lo más preferible, al
menos aproximadamente el 90% o más, de la proteína total de la
composición sea la proteína en cuestión.
"Polipéptido Env" pretende significar una
molécula derivada de una proteína de la envoltura, preferiblemente,
de la envoltura del VIH. La proteína de la envoltura del
VIH-1 es una glicoproteína de aproximadamente 160
kD (gp160). Durante la infección vírica de la célula huésped, la
gp160 es escindida por las proteasas de la célula huésped para
formar la gp120 y la proteína de la membrana integral, la gp41. La
parte de la gp41 está anclada a (y se extiende sobre) la bicapa
membranosa del virión, mientras que el segmento de la gp120
sobresale hacia el medio de alrededor. Como no existe un enlace
covalente entre la gp120 y la gp41, se libera gp120 de la
superficie de los viriones y las células infectadas. Los
polipéptidos Env también pueden incluir polipéptidos gp140. Los
polipéptidos Env pueden existir como monómeros, dímeros y
multímeros.
"Polipéptido gp120" pretende significar una
molécula derivada de una región gp120 del polipéptido Env.
Preferiblemente, el polipéptido gp120 deriva de Env del VIH. La
secuencia primaria de aminoácidos de gp120 es de aproximadamente
511 aminoácidos, con un núcleo polipeptídico de aproximadamente
60.000 daltons. El polipéptido es ampliamente modificado mediante
glicosilación ligada a N para aumentar el peso molecular aparente
de la molécula hasta 120.000 daltons. La secuencia de aminoácidos de
gp120 contiene cinco dominios relativamente conservados
intercalados con cinco dominios hipervariables. Las posiciones de
los 18 residuos de cisteína de la secuencia primaria de gp120 de la
cepa VIH-1_{HXB-2} (en lo
sucesivo, "HXB-2") y las posiciones de 13 de
los aproximadamente 24 sitios de glicosilación ligados a N de la
secuencia de gp120 son comunes en la mayoría, si no en todas, las
secuencias de gp120. Los dominios hipervariables contienen extensas
sustituciones, inserciones y eliminaciones de aminoácidos. A pesar
de esta variación, la mayoría, si no todas, las secuencias de gp120
conservan la capacidad del virus de unirse al receptor vírico CD4.
Un "polipéptido gp120" incluye tanto subunidades simples
como
multímeros.
multímeros.
Los polipéptidos Env (p. ej., gp120, gp140 y
gp160) incluyen una "lámina de unión" comprendida por 4
cadenas anti-paralelas (\beta-2,
\beta-3, \beta-20 y
\beta-21) que forman una lámina \beta.
Extrudiendo de un par de cadenas \beta (\beta-2
y \beta-3) hay dos bucles, V1 y V2. La lámina
\beta-2 tiene lugar aproximadamente del residuo
de aminoácido 119 (Cys) al residuo de aminoácido 123 (Thr), mientras
que la \beta-3 tiene lugar aproximadamente del
residuo de aminoácido 199 (Ser) al residuo de aminoácido 201 (IIe),
en relación con HXB-2. La "región V1/V2" tiene
lugar aproximadamente de las posiciones de aminoácido 126 (Cys) al
residuo 196 (Cys), en relación con HXB-2). (Véase,
p. ej., Wyatt et al., (1995) J. Virol. 69:
5723-5733; Stamatatos et al., (1998) J.
Virol. 72: 7840-7845). Extrudiendo del segundo
par de cadenas \beta (\beta-20 y
\beta-21) hay una estructura de "pequeño
bucle", también denominada en la presente memoria "bucle
pequeño de la lámina de unión". En HXB-2,
\beta-20 se extiende desde aproximadamente el
residuo de aminoácido 422 (Gln) hasta el residuo de aminoácido 426
(Met), mientras que la \beta-21 se extiende desde
aproximadamente el residuo de aminoácido 430 (Val) hasta el residuo
de aminoácido 435 (Tyr). En la variante SF162,
Met-426 es un residuo de Arg (R). El "bucle
pequeño" se extiende desde aproximadamente el residuo de
aminoácido 427 (Trp) hasta 429 (Lys) en relación con
HXB-2. En la figura 1, se muestra un diagrama
representativo de gp120 que muestra la lámina de unión, el bucle
pequeño y V1/V2. Además, en las figuras 2A-C se
muestra el alineamiento de las secuencias de aminoácidos del
polipéptido Env gp160 de las variantes seleccionadas, en relación
con HXB-2.
Además, un "polipéptido Env" o un
"polipéptido gp120", según lo definido en la presente memoria,
no se limita a un polipéptido que tenga la secuencia exacta descrita
en la presente memoria. De hecho, el genoma del VIH está en un
estado de flujo constante y contiene varios dominios variables que
presentan grados relativamente elevados de variabilidad entre los
aislados. Resulta evidente que los términos engloban polipéptidos
Env (p. ej., gp120) de cualquiera de los aislados del VIH
identificados, así como de los aislados recién identificados y los
subtipos de estos aislados. En la presente memoria, se ofrecen
descripciones de las características estructurales con referencia a
HXB-2. Cualquier experto habitual en la técnica, en
vista de las enseñanzas de la presente revelación y de la técnica,
puede determinar las regiones correspondientes de otras variantes
del VIH (p. ej., aislados VIH_{IIIb}, VIH_{SF2},
VIH-1_{SF162}, VIH-1_{SF170},
VIH_{LAV}, VIH_{LA1}, VIH_{MN},
VIH-1_{CM235''}, VIH_{US4}, otras cepas de
VIH-1 de los diversos subtipos (p. ej., los
subtipos de A a G y O), cepas del VIH-2 y los
diversos subtipos (p. ej., HN-2_{UC1} y
VIH-2_{UC2}) y virus de la inmunodeficiencia del
simio (VIS). (Véase, p. ej., "Virology", 3ª Edición (W. K.
Joklik ed. 1988); "Fundamental Virology", 2ª Edición (B. N.
Fields y D. M. Knipe, eds. 1991); "Virology", 3ª Edición
(Fields, BN, DM Knipe, PM Howley, Editores, 1996,
Lippincott-Raven, Filadelfia, PA) para una
descripción de éstos y de otros virus relacionados), usando, por
ejemplo, programas de comparación secuencial (p. ej., BLAST y otros
descritos en la presente memoria) o la identificación y el
alineamiento de características estructurales (p. ej., un programa
tal como el programa "ALB" descrito en la presente memoria que
puede identificar regiones de lámina \beta). Las secuencias de
aminoácidos reales de los polipéptidos Env pueden estar basadas en
cualquier variante del VIH.
Además, el término "polipéptido Env" (p.
ej., "polipéptido gp120" engloba proteínas que incluyen otras
modificaciones en la secuencia nativa, tales como otras
eliminaciones, adiciones y sustituciones internas. Estas
modificaciones pueden ser deliberadas, como a través de mutagénesis
de sitio dirigida, o pueden ser accidentales, tal como a través de
hechos mutacionales naturales. De este modo, por ejemplo, si se va
a usar el polipéptido Env en composiciones vacunales, las
modificaciones deben ser tales que no se pierda la actividad
inmunológica (i.e., la capacidad de provocar una respuesta de los
anticuerpos hacia el polipéptido). De manera similar, si se van a
usar los polipéptidos a efectos de diagnóstico, se debe conservar
tal capacidad.
Por lo tanto, un "polipéptido Env
modificado" es un polipéptido Env (p. ej., gp120 según lo
definido anteriormente), que ha sido manipulado para eliminar o
reemplazar toda o una parte de la porción de lámina de unión y,
opcionalmente, las regiones variables V1 y V2. Generalmente, los
polipéptidos Env modificados (p. ej., gp120) tienen suficiente
lámina de unión eliminada como para dejar al descubierto el sitio de
unión a CD4, pero dejar suficiente estructura como para permitir el
correcto plegamiento (p. ej., la geometría correcta). De este modo,
se prefieren las modificaciones de las regiones de
\beta-20 y \beta-21 (entre
aproximadamente los residuos de aminoácido 420 y 435 en relación
con HXB-2). Además, también se pueden hacer
modificaciones en las regiones de \beta-2 y
\beta-3 (entre aproximadamente los residuos de
aminoácido 119 (Cys) y 201 (IIe)) y modificaciones (p. ej.,
truncamientos) en las regiones del bucle V1 y V2. Aunque no se
ejemplifican en la presente memoria todas las modificaciones
posibles de la lámina \beta y V1-V2, se entenderá
que también quedan englobadas por la presente invención otras
modificaciones perturbadoras.
Normalmente, tal polipéptido modificado es capaz
de secretarse en el medio de crecimiento en el que se cultive un
organismo que exprese la proteína. Sin embargo, a efectos de la
presente invención, también es posible recuperar tales polipéptidos
intracelularmente. La secreción en medios de crecimiento se
determina fácilmente usando un número de técnicas de detección,
incluyendo, p. ej., la electroforesis sobre gel de poliacrilamida y
similares, así como técnicas inmunológicas tales como la
transferencia Western y los análisis de inmunoprecipitación según
lo descrito en, p. ej., la publicación internacional n.º WO
96/04301, publicada el 15 de febrero de 1996.
Un gp120 u otro polipéptido Env se produce
"intracelularmente" cuando se encuentra dentro de la célula,
bien asociado con componentes de la célula, tal como en asociación
con el retículo endoplasmático (RE) o el aparato de Golgi, o cuando
está presente en la fracción celular soluble. El gp120 y otros
polipéptidos Env de la presente invención también pueden ser
secretados en medio de crecimiento siempre y cuando queden
presentes suficientes cantidades de polipéptidos dentro de la célula
tal que puedan purificarse a partir de lisados celulares usando
técnicas descritas en la presente memoria.
Una gp120 u otra proteína Env
"inmunogénica" es una molécula que incluye al menos un epitope
tal que la molécula es capaz bien de provocar una reacción
inmunológica en un individuo al que se administra la proteína o, en
un contexto de diagnóstico, es capaz de reaccionar con anticuerpos
dirigidos contra el VIH en cuestión.
"Epitope" pretende significar un sitio en
un antígeno al que responden células B y/o células T específicas,
convirtiendo a la molécula, incluyendo tal epitope, en capaz de
provocar una reacción inmunológica o capaz de reaccionar con
anticuerpos de VIH presentes en una muestra biológica. El término
también se usa indistintamente con "determinante antigénico" o
"sitio determinante antigénico". Un epitope puede comprender 3
o más aminoácidos en una configuración espacial única para el
epitope. Generalmente, un epitope está constituido por al menos 5
de tales aminoácidos y, más habitualmente, está constituido por al
menos 8-10 de tales aminoácidos. Los procedimientos
para determinar la configuración espacial de los aminoácidos son
conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, cristalografía por
rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional. Además, la
identificación de los epitopes en una proteína dada se realiza
fácilmente usando técnicas conocidas en la técnica, tales como
mediante el uso de estudios de hidrofobicidad y serología de sitio
dirigida. Véase, también, Geysen et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. EE.UU. (1984) 81: 3998-4002 (procedimiento
general para sintetizar rápidamente péptidos destinados a determinar
la localización de epitopes inmunogénicos en un antígeno dado); la
patente estadounidense n.º: 4.708.871 (procedimientos para
identificar y sintetizar químicamente epitopes de antígenos); y
Geysen et al., Molecular Immunology (1986) 23:
709-715 (técnica para identificar péptidos con una
afinidad elevada por un anticuerpo dado). Los anticuerpos que
reconocen el mismo epitope pueden ser identificados en un simple
inmunoanálisis que muestre la capacidad de un anticuerpo para
bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana.
Una "respuesta inmunológica" o una
"respuesta inmune", como se usan en la presente memoria, es el
desarrollo en el sujeto de una respuesta inmune humoral y/o celular
hacia el polipéptido Env (p. ej., gp120) cuando el polipéptido está
presente en una composición vacunal. Estos anticuerpos también
pueden neutralizar la infectividad y/o mediar la citotoxicidad
celular dependiente de anticuerpo-complemento o de
los anticuerpos para proporcionar una protección a un huésped
inmunizado. Es posible determinar la reactividad inmunológica en
inmunoanálisis estándar tales como los análisis de competición,
conocidos en la técnica.
Las técnicas para determinar la "similitud"
entre secuencias de aminoácidos son conocidas en la técnica. En
general, "similitud" significa la comparación exacta de
aminoácido a aminoácido de dos o más polipéptidos en un lugar
apropiado, en la que los aminoácidos son idénticos o poseen
propiedades químicas y/o físicas similares tales como la carga o la
hidrofobicidad. Entonces es posible determinar el denominado
"porcentaje de similitud" entre las secuencias de polipéptidos
comparadas. Las técnicas para determinar la identidad entre
secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos también son conocidas
en la técnica e incluyen determinar la secuencia de nucleótidos del
ARNm para ese gen (habitualmente, mediante un producto intermedio
de ADNc) y determinar la secuencia de aminoácidos codificada por la
misma, así como comparar ésta con una segunda secuencia de
aminoácidos. En general, "identidad" se refiere a una
correspondencia exacta de nucleótido a nucleótido o de aminoácido a
aminoácido de dos polinucleótidos o secuencias polipeptídicas,
respectivamente.
Se pueden comparar dos o más secuencias de
polinucleótidos determinando su "porcentaje de identidad".
Asimismo, se pueden comparar dos o más secuencias de aminoácidos
determinando su "porcentaje de identidad". El porcentaje de
identidad de dos secuencias, bien secuencias de ácidos nucleicos o
de péptidos, se describe generalmente como el número de
coincidencias exactas entre dos secuencias alineadas dividido entre
la longitud de la secuencia más corta y multiplicado por 100. El
algoritmo de homologías locales de Smith y Waterman, "Advances in
Applied Mathematics" 2: 482-489 (1981),
proporciona un alineamiento aproximado para las secuencias de
ácidos nucleicos. El uso de este algoritmo puede extenderse a las
secuencias peptídicas usando la matriz de puntuación desarrollada
por Dayhoff, "Atlas of Protein Sequences and Structure", M. O.
Dayhoff ed., 5 supl. 3: 353-358, National Biomedical
Research Foundation, Washington, D.C., EE.UU., y normalizada por
Gribskov, Nucl. Acids Res. 14 (6): 6745-6763
(1986). El grupo Genetics Computer Group (Madison, WI) en su
aplicación de utilidad BestFit proporciona la puesta en práctica de
este algoritmo para secuencias de ácidos nucleicos y de péptidos.
Los parámetros por defecto para este procedimiento están descritos
en el manual "Wisconsin Sequence Analysis Package Program
Manual", versión 8 (1995) (disponible en Genetics Computer
Group, Madison, WI). Hay otros programas igualmente adecuados para
calcular el porcentaje de identidad y la similitud entre secuencias
que son generalmente conocidos en la técnica.
Por ejemplo, se puede determinar el porcentaje
de identidad de una determinada secuencia de nucleótidos con una
secuencia de referencia usando el algoritmo de homologías de Smith y
Waterman con una tabla de puntuación por defecto y una penalización
por hueco de seis posiciones de nucleótido. Otro procedimiento para
establecer el porcentaje de identidad en el contexto de la presente
invención consiste en usar el paquete de programas MPSRCH cuyos
derechos están registrados por la Universidad de Edimburgo,
desarrollado por John F. Collins y Shane S. Sturrok, y distribuido
por IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). A partir de este
juego de paquetes, se puede emplear el algoritmo de
Smith-Waterman en el que se usan los parámetros por
defecto para la tabla de puntuación (por ejemplo, una penalización
por apertura de hueco de 12, una penalización por extensión de
hueco de uno y un hueco de seis). A partir de los datos generados,
el valor de "coincidencia" refleja la "identidad
secuencial". En general, se conocen otros programas adecuados
para calcular el porcentaje de identidad o la similitud entre
secuencias, tales como el programa de alineamiento BLAST, que puede
ser usado con los parámetros por defecto. Por ejemplo, el BLASTN y
el PLASTP se pueden usar con los siguientes parámetros por defecto:
código genético = patrón; filtro = ninguno; cadena = ambas; corte =
60; esperado = 10; matriz = BLOSUM62; descripciones = 50 secuencias;
clasificado por = HIGH SCORE; bases de datos = no redundantes,
GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + Swiss
protein + Spupdate + PIR. Se puede encontrar información sobre
estos programas en la siguiente dirección de Internet:
http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST.
Un experto en la técnica puede determinar
fácilmente los parámetros de búsqueda adecuados para usarlos para
una secuencia dada en los programas anteriores. Por ejemplo, los
parámetros de búsqueda pueden variar en base al tamaño de la
secuencia en cuestión. De este modo, por ejemplo, una realización
representativa de la presente invención incluiría un polinucleótido
aislado que tuviera X nucleótidos contiguos, en el que (i) los X
nucleótidos contiguos tuvieran una identidad de al menos
aproximadamente el 50% con Y nucleótidos contiguos derivados de
cualquiera de las secuencias descritas en la presente memoria; (ii)
X fuera igual a Y; y (iii) X fuera mayor de o igual a 6 nucleótidos
y hasta 5.000 nucleótidos, preferiblemente, mayor de o igual a 8
nucleótidos y hasta 5.000 nucleótidos, más preferiblemente,
10-12 nucleótidos y hasta 5.000 nucleótidos, y
todavía más preferiblemente, 15-20 nucleótidos,
hasta el número de nucleótidos presente en las secuencias de
longitud completa descritas en la presente memoria (p. ej., véanse
el listado secuencial y las reivindicaciones), incluyendo todos los
valores enteros pertenecientes a los intervalos anteriormente
descritos.
Los casetes de expresión sintéticos (y los
polinucleótidos purificados) de la presente invención incluyen
secuencias de polinucleótidos relacionadas que tienen
aproximadamente del 80% al 100%, más del 80-85%,
preferiblemente, más del 90-92%, más
preferiblemente más del 95%, y lo más preferible, más del 98% de
identidad secuencial (incluyendo todos los valores enteros
pertenecientes a estos intervalos descritos) con las secuencias de
los casetes de expresión sintéticos reveladas en la presente
memoria (por ejemplo, con las secuencias reivindicadas u otras
secuencias de la presente invención) cuando se usan las secuencias
de la presente invención como la secuencia problema.
También hay programas informáticos disponibles
para determinar la probabilidad de que ciertos polipéptidos formen
estructuras tales como láminas \beta. Uno de tales programas,
descrito en la presente memoria, es el programa "ALB" para el
cálculo y la predicción de estructuras secundarias de proteínas y
polipéptidos. Además, se puede predecir la estructura proteica
secundaria a partir de la secuencia primaria de aminoácidos, por
ejemplo, usando la estructura cristalina de la proteína y alineando
la secuencia proteica relacionada con la estructura cristalina (p.
ej., usando programas MOE (Molecular Operating Environment)
disponibles en Chemical Computing Group Inc., Montreal, P. Q.,
Canadá). En, por ejemplo, Garnier et al., (1996) Methods
Enzymol. 266: 540-553; Geourjon et al.
(1995) Comput. Applic. Biosci. 11: 681-684;
Levin (1997) Protein Eng. 10: 771-776; y Rost et
al., (1993) J. Molec. Biol. 232: 584-599,
se describen otros procedimientos para predecir las estructuras
secundarias.
También es posible determinar la homología
mediante la hibridación de polinucleótidos en condiciones que formen
dúplex estables entre las regiones homólogas, seguida por la
digestión con nucleasa o nucleasas específicas monocatenarias y la
determinación del tamaño de los fragmentos digeridos. Dos secuencias
de ADN o dos secuencias polipeptídicas son "sustancialmente
homólogas" entre sí cuando las secuencias muestran al menos
aproximadamente del 80-85%, preferiblemente, al
menos aproximadamente el 90%, y lo más preferible, al menos
aproximadamente el 95-98% de identidad secuencial en
una longitud definida de las moléculas, determinada usando los
procedimientos anteriores. Como se usa en la presente memoria,
sustancialmente homólogas también se refiere a secuencias que
muestran una identidad completa con la secuencia de ADN o
polipeptídica especificada. Las secuencias de ADN que son
sustancialmente homólogas pueden ser identificadas en un experimento
de hibridación Southern en, por ejemplo, condiciones restrictivas,
según lo definido para el sistema en concreto. La definición de las
condiciones de hibridación apropiadas pertenece al alcance del
experto en la técnica. Véase, p. ej., Sambrook et al., supra;
"DNA Cloning", supra; "Nucleic Acid Hybridization",
supra.
Una "secuencia codificante" o una secuencia
que "codifica" un polipéptido seleccionado es una secuencia de
ácidos nucleicos que es transcrita (en el caso de ADN) y traducida
(en el caso de ARNm) en un polipéptido in vitro o in
vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras
apropiadas. Las fronteras de la secuencia codificante están
determinadas por un codón de iniciación en el terminal (amino) 5' y
un codón de terminación de la traducción en el terminal (carboxilo)
3'. Una secuencia codificante puede incluir, pero no se limita a,
ADNc de secuencias de nucleótidos víricos, así como secuencias de
ADN sintético y semisintético, y secuencias que incluyen análogos
básicos. Una secuencia de terminación de la transcripción puede
estar localizada en 3' con respecto a la secuencia codificante.
Los "elementos de control" se refieren
colectivamente a secuencias promotoras, sitios de unión a
ribosomas, señales de poliadenilación, secuencias de terminación de
la transcripción, dominios reguladores secuencia arriba,
potenciadotes y similares que proporcionan colectivamente la
transcripción y la traducción de una secuencia codificante en una
célula huésped. No todos estos elementos de control tienen que estar
siempre presentes siempre y cuando el gen deseado sea capaz de ser
transcrito y traducido.
Un "elemento de control" dirige la
transcripción de una secuencia codificante de una célula cuando la
ARN polimerasa se vaya a unir a la secuencia promotora y transcribir
la secuencia codificante en ARNm, que luego es traducido en el
polipéptido codificado por la secuencia codificante.
"Ligados operativamente" se refiere a una
disposición de los elementos en la que los componentes así
descritos están configurados para que realicen su función habitual.
Así, los elementos de control que están ligados operativamente a
una secuencia codificante son capaces de afectar a la expresión de
la secuencia codificante cuando la ARN polimerasa esté presente.
Los elementos de control no necesitan estar contiguos a la
secuencia codificante, siempre y cuando funcionen para dirigir la
expresión de la misma. De este modo, por ejemplo, pueden estar
presentes secuencias no traducidas aunque transcritas intercaladas
entre, p. ej., la secuencia promotora y la secuencia codificante, y
la secuencia promotora puede seguir siendo considerada "ligada
operativamente" a la secuencia codificante.
"Recombinante" como se usa en la presente
memoria para describir una molécula de ácido nucleico significa un
polinucleótido de origen genómico, ADNc, semisintético o sintético
que, en virtud de su origen o manipulación: (1) no está asociado
con todo o una parte del polinucleótido con el que está asociado en
la naturaleza; y/o (2) está ligado a un polinucleótido distinto del
que está ligado en la naturaleza. El término "recombinante"
como se usa con respecto a una proteína o un polipéptido significa
un polipéptido producido por la expresión de un polinucleótido
recombinante. Los términos de "células huésped recombinantes",
"células huésped", "células", "líneas celulares",
"cultivos celulares" y otros términos tales que denotan
microorganismos procariotas o líneas celulares eucariotas cultivados
como entidades unicelulares se usan indistintamente y se refieren a
células que pueden ser, o han sido, usadas como receptores de
vectores recombinantes u otro ADN de transferencia, e incluyen la
progenie de la célula original que ha sido transfectada. Se
entiende que la progenie de una única célula parental puede no ser
necesariamente completamente idéntica en morfología o en
complemento de ADN total o genómico al padre original, debido a
mutaciones accidentales o deliberadas. La progenie de la célula
parental que es suficientemente similar al padre que será
caracterizada por la propiedad relevante, tal como la presencia de
una secuencia de nucleótidos codificante de un péptido deseado,
está incluida en la progenie englobada por esta definición y está
cubierta por los términos
anteriores.
anteriores.
"Sujeto vertebrado" pretende significar
cualquier miembro del subfilum cordata, incluyendo sin limitación,
seres humanos u otros primates, incluyendo primates no humanos tales
como chimpancés u otros simios y especies de monos; animales de
granja tales como ganado, ovejas, cerdos, cabras y caballos;
mamíferos domésticos tales como perros y gatos; animales de
laboratorio incluyendo roedores tales como ratones, ratas y cerdos
de guinea; aves, incluyendo aves domésticas, salvajes y de caza
tales como pollos, pavos y otras aves gallináceas, patos, gansos y
similares. El término no denota una edad en concreto. De ese modo,
se pretende cubrir tanto individuos adultos como recién nacidos.
Como se usa en la presente memoria, "muestra
biológica" se refiere a una muestra de tejido o de fluido
aislada de un individuo, incluyendo pero no limitándose a, por
ejemplo, sangre, plasma, suero, materia fecal, orina, médula ósea,
bilis, fluido espinal, fluido linfático, muestras de piel,
secreciones externas de la piel, de los tractos respiratorio,
intestinal y genitourinario, muestras derivadas del epitelio
gástrico y la mucosa gástrica, lágrimas, saliva, leche, células
sanguíneas, órganos, biopsias y también muestras de constituyentes
de cultivos celulares in vitro, incluyendo pero no
limitándose a medios acondicionados que resultan del crecimiento de
células y tejidos en medio de cultivo, p. ej., células recombinantes
y componentes celulares.
Los términos "etiqueta" y "etiqueta
detectable" se refieren a una molécula que se puede detectar,
incluyendo, pero no limitándose a, isótopos radiactivos,
fluorescentes, quimioluminiscentes, enzimas, sustratos enzimáticos,
cofactores enzimáticos, inhibidores enzimáticos, cromóforos, tintes,
iones metálicos, soles metálicos, ligandos (p. ej., biotina o
haptenos) y similares. El término "fluorescente" se refiere a
una sustancia o una porción de la misma que es capaz de presentar
fluorescencia en el intervalo detectable. Los ejemplos particulares
de etiquetas que pueden ser usadas con la invención incluyen, pero
no se limitan a, la fluoresceína, rodamina, dansil, umbeliferona,
rojo Texas, luminol, ésteres de acradimum, NADPH,
\alpha-\beta-galactosidasa,
peroxidasa de rábano picante, glucosa-oxidasa,
fosfatasa alcalina y ureasa.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere a moléculas de
polipéptido Env modificado (p. ej., glicoproteína ("gp")120.
Sin quedar vinculados a ninguna teoría en particular, parece que ha
sido difícil generar respuestas inmunológicas contra Env, porque el
sitio de unión a CD4 está enterrado entre el dominio exterior, el
dominio interior y los dominios V1/V2. Por lo tanto, aunque la
eliminación del dominio V1/V2 puede volver al virus más susceptible
a la neutralización por un anticuerpo monoclonal dirigido al sitio
de CD4, la lámina de unión que cubre la mayoría del dominio de
unión a CD4 puede evitar una respuesta de los anticuerpos. De este
modo, la presente invención proporciona polipéptidos Env que siguen
mantienen su estructura global general aún dejando al descubierto
el dominio de unión a CD4. Esto permite la generación de una
respuesta inmune (p. ej., una respuesta de los anticuerpo) a
epitopes en o cerca del sitio de unión a CD4.
Se pueden combinar diversas formas de las
diferentes realizaciones de la invención descritas en la presente
memoria.
\vskip1.000000\baselineskip
En la presente invención, se identificaron la
localización de las estructuras de lámina \beta en relación con
la estructura (cristalina) tridimensional de una proteína Env
cristalizada de HXB-2 (véase el ejemplo 1A). En
base a esta estructura, se diseñaron constructos codificantes de
polipéptidos que tenían reemplazos y/o escisiones que mantenían la
geometría global a la vez que dejaban al descubierto el sitio de
unión a CD4. En concreto, la estructura cristalina de
HXB-2 fue descargada de la base de datos Brookhaven.
Usando los parámetros por defecto de la opción de Búsqueda de
bucles del módulo Biopolímero del paquete de modelización molecular
Sybyl, se determinaron la homología y el ajuste de los aminoácidos
que podrían reemplazar a los bucles nativos entre las láminas
\beta aún manteniendo la estructura terciaria global. Entonces se
diseñaron los constructos codificantes de los polipéptidos Env
modificados (ejemplo 1.B).
De ese modo, los polipéptidos Env modificados
tienen suficiente lámina de unión eliminada como para dejar al
descubierto el surco de CD4, pero tienen suficiente estructura como
para permitir el correcto plegamiento de la glicoproteína Env. A
continuación, se describen ejemplos de los constructos.
Los polipéptidos de la presente invención pueden
ser producidos en cualquier número de procedimientos que sean
conocidos en la técnica.
En una realización, se generan los polipéptidos
usando técnicas recombinantes conocidas en la técnica. A este
respecto, se pueden crear sondas de oligonucleótido basadas en las
secuencias conocidas del genoma del polipéptido Env (p. ej.,
gp120), y usarlas para sondar genotecas genómicas o de ADNc para los
genes Env. Entonces se puede aislar más el gen usando técnicas
estándar y, p. ej., enzimas de restricción empleadas para truncar el
gen en las porciones deseadas de la secuencia de longitud completa.
De manera similar, el gen o los genes Env pueden ser aislados
directamente a partir de células y tejidos que contengan los mismos,
usando técnicas conocidas, tales como la extracción con fenol,
pudiéndose manipular más la secuencia para producir los
truncamientos deseados. Véase, p. ej., Sambrook et al.,
supra, para una descripción de las técnicas usadas para obtener
un ADN aislado.
Los genes codificantes de los polipéptidos
modificados (p. ej., truncados y/o sustituidos) pueden producirse
sintéticamente, en base a secuencias conocidas. Se puede diseñar la
secuencia de nucleótidos con los codones apropiados para una
secuencia de aminoácidos concreta deseada. Generalmente, se ensambla
la secuencia completa desde los oligonucléotidos solapantes
preparados mediante procedimientos estándar, y se ensambla en una
secuencia codificante completa. Véase, p. ej., Edge (1981)
Nature 292: 756; Nambair et al., (1984) Science
223: 1299; Jay et al., (1984) J. Biol. Chem., 259:
6311; Stemmer et al., (1995) Gene 164:
49-53.
Las técnicas recombinantes se usan fácilmente
para clonar un gen codificante de un gen de un polipéptido Env que
luego puede ser sometido a mutagénesis in vitro mediante el
reemplazo del par o de los pares de bases apropiados para dar como
resultado el codón para el aminoácido deseado. Tal cambio puede
incluir tan poco como un par de bases, efectuando un cambio en un
único aminoácido, o puede englobar cambios en varios pares de
bases. Alternativamente, las mutaciones pueden efectuarse usando un
cebador no emparejado que se hibride a una secuencia de nucleótidos
padre (generalmente, ADNc correspondiente a la secuencia de ARN), a
una temperatura menor de la temperatura de fusión del dúplex no
emparejado. Se puede hacer específico el cebador manteniendo la
longitud del cebador y la composición de las bases dentro de unos
límites relativamente reducidos y manteniendo la base mutante
localizada en el centro. Véase, p. ej., Innis et al, (1990)
"PCR Applications: Protocols for Functional Genomics"; Zoller
y Smith, Methods Enzymol. (1983) 100: 468. La ampliación del
cebador se efectúa usando ADN polimerasa, el producto clonado y los
clones que contienen el ADN mutado, derivado mediante la
segregación de la cadena ampliada del cebador, seleccionado. Se
puede realizar la selección usando el cebador mutante como una
sonda de hibridación. La técnica también es aplicable a la
generación de múltiples mutaciones puntuales. Véase, p. ej.,
Dalbie-McFarland et al. Proc. Natl., Acad.
Sci EE.UU. (1982) 79: 6409.
Una vez aisladas o sintetizadas las secuencias
codificantes para las proteínas deseadas, éstas pueden ser clonadas
en cualquier vector o replicón adecuado para su expresión. Como
resultará evidente a partir de las enseñanzas de la presente
memoria, es posible generar una gran variedad de vectores
codificantes de polipéptidos modificados mediante la creación de
constructos de expresión que liguen operativamente, en diversas
combinaciones, polinucleótidos codificantes de los polipéptidos Env
que tengan eliminaciones o mutaciones en los mismos. De ese modo,
es posible ligar operativamente polinucleótidos codificantes de una
determinada región V1/V2 eliminada con polinucleótidos codificantes
de polipéptidos que tengan eliminaciones o reemplazos en la región
del bucle pequeño y el constructo introducido en una célula huésped
para la expresión de polipéptidos. En los ejemplo, se tratan
ejemplos no restrictivos de tales combinaciones.
Los expertos en la técnica conocen numerosos
vectores de clonación, dejando a su elección la selección de un
vector de clonación apropiado. Los ejemplos de vectores de ADN
recombinante para la clonación y de las células huésped que éstos
pueden transformar incluyen el bacteriófago \lambda (E.
coli), pBR322 (E. coli), pACYC177 (E. coli),
pKT230 (bacteria Gram-negativa), pGV1106 (bacteria
Gram-negativa), pLAFR1 (bacteria
Gram-negativa), pME290 (bacteria
Gram-negativa no E. coli), pHV14 (E.
coli y Bacillus subtilis), pBD9 (Bacillus), pIJ61
(Streptomyces), pUC6 (Streptomyces), YIp5
(Saccharomyces), YCp19 (Saccharomyces) y el virus del
papiloma bovino (células de mamífero). Véase, en general, "DNA
Cloning": Vol. I y II, supra; Sambrook et al.,
supra; B. Perbal, supra.
También se pueden usar sistemas de expresión de
células de insectos, tales como sistemas de baculovirus, y son
conocidos por los expertos en la técnica, estando descritos en, p.
ej., Summers y Smith, "Texas Agricultural Experiment Station
Bulletin No. 1555" (1987). Los materiales y los procedimientos
para los sistemas de expresión de células de baculovirus/insectos
se encuentran disponibles comercialmente en un equipo de, entre
otros, Invitrogen, San Diego CA (equipo "MaxBac").
También es posible usar sistemas de expresión de
plantas para producir las proteínas Env modificadas. En general,
tales sistemas usan vectores basados en virus para transfectar las
células vegetales con genes heterólogos. Para una descripción de
tales sistemas, véase, p. ej., Porta et al., Mol.
Biotech. (1996) 5: 209-221; y Hackland et
al., Arch. Virol. (1994) 139: 1-22.
Los sistemas víricos, tales como un sistema de
infección/transfección vacunal, según lo descrito en Tomei et
al., J. Virol. (1993) 67: 4017-4026 y Selby
et al., J. Gen. Virol., (1993) 74: 1103-1113,
también encontrarán un uso en la presente invención. En estos
sistemas, primero se transfectan las células in vitro con
un recombinante de virus vacunal que codifique la ARN polimerasa del
bacteriófago T7. Esta polimerasa manifiesta una exquisita
especificidad, pues sólo transcribe moldes que llevan promotores T7.
Tras la infección, las células son transfectadas con el ADN de
interés, acción conducida por un promotor T7. La polimerasa
expresada en el citoplasma procedente del recombinante de virus
vacunal transcribe el ADN transfectado en ARN, que luego es
traducido a proteína mediante la maquinaria de traducción del
huésped. El procedimiento proporciona una producción citoplasmática
transitoria de alto nivel de grandes cantidades de ARN y su producto
o productos de traducción.
Se puede colocar el gen bajo el control de un
promotor, del sitio de unión al ribosoma (para la expresión
bacteriana) y, opcionalmente, de un operador (conjuntamente
denominados en la presente memoria elementos de "control"), de
manera que se transcriba la secuencia de ADN codificante del
polipéptido Env deseado en ARN en la célula huésped transformada
por un vector que contenga esta construcción de expresión. La
secuencia codificante puede o no contener un péptido señal o una
secuencia líder. Con la presente invención, se pueden usar tanto
los péptidos señal naturales como las secuencias heterólogas. El
huésped puede eliminar las secuencias líder en un procesamiento
post-traducional. Véanse, p. ej., las patentes
estadounidenses n.º: 4.431.739; 4.425.437; 4.338.397. Tales
secuencias incluyen, pero no se limitan a, líder de TPA, así como la
secuencia señal de la melitina de la abeja.
También se pueden desear otras secuencias
reguladoras que permitan la regulación de la expresión de las
secuencias proteicas relativas al crecimiento de la célula huésped.
Tales secuencias reguladores son conocidas por los expertos en la
técnica, y los ejemplos incluyen aquéllas que hacen que la expresión
de un gen sea activada o desactivada en respuesta a un estímulo
químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador.
También pueden estar presentes otros tipos de elementos reguladores
en el vector, por ejemplo, secuencias potenciadoras.
Las secuencias control y otras secuencias
reguladoras pueden ser ligadas a la secuencia codificante antes de
su inserción en un vector. Alternativamente, se puede clonar la
secuencia coficante directamente en un vector de expresión que ya
contenga las secuencias control y un sitio de restricción
apropiado.
En algunos casos, puede ser necesario modificar
la secuencia codificante para que pueda ser unida a las secuencias
control con la orientación apropiada, i.e., para mantener el marco
de lectura adecuado. Se pueden preparar mutantes o análogos
mediante la eliminación de una parte de la secuencia codificante de
la proteína, mediante la inserción de una secuencia y/o mediante la
sustitución de uno o más nucleótidos dentro de la secuencia. Las
técnicas para modificar las secuencias de nucleótidos, tales como la
mutagénesis de sitio dirigida, son conocidas por los expertos en la
técnica. Véase, p. ej., Sambrook et al., supra; "DNA
Cloning", Vol. I y II, supra; "Nucleic Acid
Hybridization", supra.
Entonces se usa el vector de expresión para
transformar una célula huésped apropiada. Hay un número de líneas
celulares de mamíferos conocidas en la técnica, e incluyen las
líneas celulares inmortalizadas de la colección americana de
cultivos tipo (ATCC), tales como, pero sin limitarse a, células de
ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células renales de
cachorro de hámster (BHK), células renales de mono (COS), células de
carcinoma hepatocelular humano (p. ej., Hep G2), células Vero293,
así como otras. De manera similar, los huéspedes bacterianos tales
como E. coli, Bacillus subtilis y Streptococcus spp.,
encontrarán un uso con los presentes constructos de expresión. Los
huéspedes de levadura útiles en la presente invención incluyen,
entre otros, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida
maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis,
Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris,
Schizosaccharomyces pombe y Yarrowia lipolytica. Las
células de insecto para su uso con vectores de expresión de
baculovirus incluyen, entre otras, Aedes aegypti, Autographe
californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster,
Spodopterafrugiperda y Trichoplusia ni.
En función del sistema de expresión y del
huésped seleccionados, las proteínas de la presente invención son
producidas mediante el cultivo de células huésped transformadas por
un vector de expresión descrito anteriormente en condiciones
mediante las que se exprese la proteína de interés. La selección de
las condiciones de crecimiento apropiadas pertenece al alcance de la
técnica.
En una realización, las células transformadas
secretan el producto polipeptídico en el medio circundante. Se
pueden incluir ciertas secuencias reguladores en el vector para
aumentar la secreción del producto proteico, por ejemplo, usando
una secuencia líder de activador de plasminogenes titulares (TPA),
una secuencia señal de interferón \gamma u otras secuencias
peptídicas señal procedentes de proteínas secretoras conocidas. Se
puede aislar entonces el producto polipeptídico secretado mediante
diversas técnicas descritas en la presente memoria, por ejemplo,
usando técnicas de purificación estándar tales como, pero sin
limitarse a, resinas de hidroxiapatita, cromatografía en columna,
cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por
tamaño, electroforesis, CLAR, técnicas de inmunoadsorbencia,
cromatografía de afinidad, inmunoprecipitación y similares.
Alternativamente, se interrumpen las células
transformadas usando procedimientos químicos, físicos o mecánicos,
que lisan las células aún manteniendo los polipéptidos Env
sustancialmente intactos. También se pueden obtener proteínas
intracelulares eliminando los componentes de la pared o la membrana
celular, p. ej., mediante el uso de detergentes o disolventes
orgánicos, tal que se produzca la fuga de los polipéptidos Env.
Tales procedimientos son conocidos por los expertos en la técnica y
están descritos en, p. ej., "Protein Purification Applications: A
Practical Approach", (E. L. V. Harris y S. Angal, Eds.,
1990).
Por ejemplo, los procedimientos para interrumpir
células para su uso con la presente invención incluyen, pero no se
limitan a: sonicación o ultrasonicación; agitación; extrusión de
líquidos o sólidos; tratamiento térmico;
congelación-descongelación; desecación;
descompresión con explosivos; choque osmótico; tratamiento con
enzimas líticas incluyendo proteasas tales como la tripsina, la
neuraminidasa y la lisozima; tratamiento alcalino; y el uso de
detergentes y disolventes tales como sales biliares, dodecilsulfato
de sodio, Tritón, NP40 y CHAPS. La técnica concreta usada para
interrumpir las células es en gran medida una cuestión de gusto, y
dependerá del tipo de la célula en la que se exprese el
polipéptido, de las condiciones de cultivo y del pretratamiento
usado.
Tras la interrupción de las células, se retiran
los residuos celulares, generalmente, mediante centrifugación, y se
purifican en mayor profundidad los polipéptidos Env producidos
intracelularmente usando técnicas de purificación estándar tales
como, pero sin limitarse a, cromatografía en columna, cromatografía
de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaño,
electroforesis, CLAR, técnicas de inmunoadsorbencia, cromatografía
de afinidad, inmunoprecipitación y similares.
Por ejemplo, un procedimiento para obtener los
polipéptidos Env intracelularmente de la presente invención supone
la purificación por afinidad, tal como mediante cromatografía de
inmunoafinidad usando anticuerpos específicos contra Env, o
mediante cromatografía de afinidad a la lectina. Las resinas de
lectina particularmente preferidas son aquéllas que reconocen
restos de manosa tales como, pero sin limitarse a, las resinas
derivadas de aglutinina Galanthus nivalis (GNA), aglutinina
Lens culinaris (LCA o lectina de lenteja), aglutinina
Pisum sativum (PSA o lectina de guisante), aglutinina
Narcissus pseudonarcissus (NPA) y aglutinina Allium
ursinum (AUA). La elección de una resina de afinidad adecuada
pertenece al alcance de la técnica. Tras la purificación por
afinidad, se pueden purificar en mayor profundidad los polipéptidos
Env usando técnicas convencionales conocidas en la técnica, tales
como mediante cualquiera de las técnicas anteriormente
descritas.
Puede ser deseable producir complejos Env (p.
ej., gp120), bien con ellos mismos o con otras proteínas. Tales
complejos se producen fácilmente, p. ej., transfectando
conjuntamente células huésped con constructos codificantes de los
polipéptidos Env (p. ej., gp120) y/o otros polipéptidos del complejo
deseado. La transfección conjunta puede realizarse bien en
trans o en cis, i.e., usando vectores separados o
usando un único vector que lleve tanto el gen Env como otro gen. Si
se hace usando un único vector, ambos genes pueden ser transportados
por un único conjunto de elementos de control o, alternativamente,
los genes pueden estar presentes en el vector en casetes de
expresión individuales, transportados por elementos de control
individuales. Tras la expresión, las proteínas se asociarán
espontáneamente. Alternativamente, es posible formar los complejos
mezclando las proteínas individuales que han sido producidas por
separado, bien en forma purificada o
semi-purificada, o incluso mezclando los medios de
cultivo en los que se hayan cultivado las células huésped que
expresan las proteínas. Véase la publicación internacional n.º: WO
96/04301, publicada el 15 de febrero de 1996, para una descripción
de tales complejos.
Es posible sintetizar químicamente
convenientemente polipéptidos relativamente pequeños, i. e., de
hasta aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, por ejemplo,
mediante cualquiera de las diversas técnicas conocidas por aquéllos
expertos en la técnica de los péptidos. En general, estos
procedimientos emplean la adición secuencial de uno o más
aminoácidos a una cadena peptídica en crecimiento. Normalmente, bien
el grupo amino o el grupo carboxilo del primer aminoácido está
protegido por un grupo protector adecuado. Entonces el aminoácido
protegido o derivado puede ser bien unido a un soporte sólido
inerte o utilizado en solución añadiendo el siguiente aminoácido de
la secuencia que tenga el grupo (amino o carboxilo) complementario
adecuadamente protegido, en condiciones que permitan la formación
de un enlace tipo amida. Entonces se elimina el grupo protector del
resido de aminoácido recién añadido y se añade el siguiente
aminoácido (adecuadamente protegido), y así sucesivamente. Una vez
que los aminoácidos deseados han sido enlazados en la secuencia
apropiada, se elimina cualquier grupo protector (y cualquier
soporte sólido, si se usan técnicas de síntesis en fase sólida)
consecutiva o simultáneamente para obtener el polipéptido final.
Mediante la simple modificación de este procedimiento general, es
posible añadir más de un aminoácido a la vez a una cadena en
crecimiento, por ejemplo, mediante el acoplamiento (en condiciones
que no racemicen los centros quirales) de un tripéptido protegido
con un dipéptido adecuadamente protegido para formar, tras la
desprotección, un pentapéptido. Véase, p. ej., J. M. Stewart y J. D.
Young, "Solid Phase Peptide Synthesis" (Pierce Chemical Co.,
Rockford, IL 1984), y G. Barany y R. B. Merrifield, "The
Peptides: Analysis. Synthesis, Biology", editores E. Gross y J.
Meienhofer, Vol. 2, (Academic Press, Nueva York, 1980), pp.
3-254, para las técnicas de síntesis de péptidos en
fase sólida; y M. Bodansky, "Principles of Peptide Synthesis",
(Springer-Verlag, Berlín 1984), y E. Gross y J.
Meienhofer, Eds., "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology",
Vol. 1, para la síntesis clásica en disolución.
Los grupos protectores típicos incluyen
t-butiloxicarbonilo (Boc), 9- fluorenilmetoxicarbonilo
(Fmoc), benciloxicarbonilo (Cbz); p-toluensulfonilo (Tx);
2,4-dinitrofenilo; bencilo (Bzl);
bifenilisopropiloxicarboxi-carbonilo, t-
amiloxicarbonilo, isoborniloxicarbonilo,
o-bromobenciloxicarbonilo, ciclohexilo, isopropilo, acetilo,
o-nitrofenilsulfonilo y similares.
Los soportes sólidos son soportes poliméricos
entrecruzados. Éstos pueden incluir polímeros basados estireno
entrecruzado con divinilbenceno, por ejemplo, copolímeros de
divinilbenceno-hidroximetilestireno, copolímeros de
divinilbenceno-clorometilestireno y copolímeros de
divinilbenceno-benzhidrilaminopoliestireno.
Los análogos de polipéptido de la presente
invención también pueden ser preparados químicamente mediante otros
procedimientos tales como mediante el procedimiento de síntesis
simultánea de múltiples péptidos. Véase, p. ej., Houghten Proc.
Natl. Acad. Sci. EE.UU. (1985) 82: 5131-5135;
Patente estadounidense n.º: 4.631.211.
Es posible usar los polipéptidos Env producidos
intracelularmente de la presente invención, los complejos de los
mismos o los polinucleótidos codificantes de los mismos para un
número de objetos diagnósticos y terapéuticos. Por ejemplo, se
pueden usar las proteínas y los polinucleótidos, o los anticuerpos
generados contra los mismos, en un variedad de análisis para
determinar la presencia de anticuerpos reactivos y/o proteínas Env
en una muestra biológica con el fin de ayudar en el diagnóstico de
la infección por o el estado patológico del VIH, o como medida de la
respuesta a la inmunización.
La presencia de anticuerpos reactivos con los
polipéptidos Env (p. ej., gp120) y, a la inversa, de antígenos
reactivos con los anticuerpos generados para los mismos, puede ser
detectada usando técnicas electroforéticas y de inmunodiagnóstico
estándar, incluyendo inmunoanálisis tales como análisis de tipo
competición, reacción directa o sándwich. Tales análisis incluyen,
pero no se limitan a, transferencias Western; análisis de
aglutinación; inmunoanálisis marcados con o mediados por enzimas,
tales como ELISA; análisis de tipo biotina/avidina;
radioinmunoanálisis; inmunoelectroforesis; inmunoprecipitación, etc.
Las reacciones incluyen generalmente etiquetas reveladoras tales
como etiquetas fluorescentes, quimioluminiscentes, radiactivas o
enzimáticas, o moléculas de tinte, u otros procedimientos para
detectar la formación de un complejo entre el antígeno y el
anticuerpo, o de anticuerpos reaccionados con los mismos.
Se pueden usar soportes sólidos en los análisis
tales como nitrocelulosa, en forma de membrana o de pozos de
microvaloración; polivinilcloruro, en láminas o en pozos de
microvaloración; látex de poliestireno, en perlas o en placas de
microvaloración; fluoruro de polivinilideno; papel diazotizado;
membranas de nylon; perlas activadas y similares.
Comúnmente, primero se hace reaccionar el
soporte sólido con la muestra biológica (o las proteínas gp120), se
lava y luego se aplican los anticuerpos (o una muestra sospechosa de
contener anticuerpos). Tras el lavado para eliminar cualquier
ligando no enlazado, se añade un resto aglutinante secundario en
condiciones de unión adecuadas, tales que el aglutinante secundario
sea capaz de asociarse selectivamente con el ligando unido. La
presencia del aglutinante secundario puede ser entonces detectada
usando técnicas conocidas en la técnica. Comúnmente, el aglutinante
secundario comprenderá un anticuerpo dirigido contra los ligandos de
anticuerpo. Hay un número de moléculas de inmunoglobulina (Ig)
anti-humana que son conocidas en la técnica (p. ej.,
Ig anti-humana de cabra o Ig
anti-humana de conejo disponibles comercialmente).
Las moléculas de Ig para su uso en la presente memoria serán
preferiblemente del tipo IgG o IgA, sin embargo, la IgM también
puede ser apropiada en algunos casos. Las moléculas de Ig pueden
ser fácilmente conjugadas con una etiqueta enzimática detectable,
tal como peroxidasa de rábano picante,
glucosa-oxidasa, beta-galactosidasa,
fosfatasa alcalina y ureasa, entre otras, usando procedimientos
conocidos por aquéllos expertos en la técnica. Entonces se usa un
sustrato enzimático apropiado para generar una señal detectable.
Alternativamente, se puede usar un análisis de
"sándwich de dos anticuerpos" para detectar las proteínas de
la presente invención. En esta técnica, se hace reaccionar primero
el soporte sólido con uno o más de los anticuerpos dirigidos contra
Env (p. ej., gp120), se lava y luego se expone a la muestra de
análisis. Se vuelven a añadir los anticuerpos y se visualiza la
reacción usando bien una reacción de color directo o usando un
segundo anticuerpo marcado, tal como
anti-inmunoglobulina marcada con peroxidasa de
rábano picante, fosfatasa alcalina o ureasa.
También es posible realizar los análisis en
disolución, tal que las proteínas víricas y los anticuerpos de las
mismas formen complejos en condiciones de precipitación. Entonces se
pueden separar los complejos precipitados de la muestra de
análisis, por ejemplo, mediante centrifugación. Se puede analizar la
mezcla de reacción para determinar la presencia o la ausencia de
complejos anticuerpo-antígeno usando cualquiera de
entre un número de procedimientos estándar, tales como aquellos
procedimientos de inmunodiagnóstico descritos anteriormente.
Se pueden proporcionar las proteínas Env
modificadas, producidas según lo descrito anteriormente, o los
anticuerpos contra las proteínas en equipos con las instrucciones
adecuadas y otros reactivos necesarios, con el fin de realizar los
inmunoanálisis según lo descrito anteriormente. El equipo también
puede contener, en función del inmunoanálisis usado en concreto,
etiquetas adecuadas, y otros reactivos y materiales envasados (i.
e., tampones de lavado y similares). Con el uso de estos equipos se
pueden realizar inmunoanálisis estándar, tales como los descritos
anteriormente.
También se pueden usar los polipéptidos y los
polinucleótidos Env codificantes de los polipéptidos en
composiciones vacunales, individualmente o en combinación, en p.
ej., vacunas profilácticas (i. e., para prevenir la infección) o
vacunas terapéuticas (para tratar el VIH tras la infección). Las
vacunas pueden comprender mezclas de una o más proteínas Env
modificadas (o secuencias de nucleótidos codificantes de las
proteínas), tales como proteínas Env (p. ej., gp120) derivadas de
más de un aislado vírico. También es posible administrar la vacuna
en combinación con otros antígenos y agentes inmunorreguladores,
por ejemplo, inmunoglobulinas, citoquinas, linfoquinas y
quimioquinas, incluyendo, pero no limitándose a,
IL-2, IL-2 modificada
(cys125-ser125), GM-CSF,
IL-12, \gamma-interferón,
IP-10, MIP1\beta y RANTES. Las vacunas pueden ser
administradas como polipéptidos o, alternativamente, como vacunas
de ácidos nucleicos desnudos (p. ej., ADN), usando vectores víricos
(p. ej., vectores retrovíricos, vectores adenovíricos, vectores
víricos adeno-asociados) o vectores no víricos (p.
ej., liposomas, partículas revestidas con ácido nucleico o
proteína). Las vacunas también pueden comprender una mezcla de
proteína y ácido nucleico, que a su vez puede se administrada
usando el mismo o diferentes vehículos. Es posible administrar la
vacuna más de una vez (p. ej., una administración "de cebado"
seguida por uno o más "refuerzos") para lograr los efectos
deseados. La misma composición puede ser administrada como el cebado
y como uno o más refuerzos. Alternativamente, se pueden usar
diferentes composiciones para el cebado y los refuerzos.
Las vacunas incluirán generalmente uno o más
"excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables" tales
como agua, solución salina, glicerol, etanol, etc. Además, en tales
vehículos pueden estar presentes sustancias auxiliares tales como
agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponadoras del pH
y similares.
Hay un vehículo opcionalmente presente que es
una molécula que por sí misma no provoca la producción de
anticuerpos dañinos para el individuo que recibe la composición.
Tales vehículos son comúnmente grandes macromoléculas metabolizadas
lentamente tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos,
ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de
aminoácidos, agregados lipídicos (tales como pequeñas gotas de
aceite o liposomas) y partículas de virus inactivos. Tales
vehículos son conocidos por los expertos habituales en la técnica.
Además, el polipéptido Env puede estar conjugado a un toxoide
bacteriano, tal como un toxoide de difteria, tétanos, cólera,
etc.
También se pueden usar adyuvantes para aumentar
la eficacia de las vacunas. Tales adyuvantes incluyen, pero no se
limitan a: (1) sales de aluminio (alumbre), tales como hidróxido de
aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, etc.; (2)
formulaciones de emulsiones de aceite en agua (con o sin otros
agentes inmunoestimulantes específicos tales como péptidos de
muramilo (véase más adelante) o componentes de la pared celular
bacteriana), tales como, por ejemplo (a) MF59 (Publicación
internacional n.º. WO 90/14837), que contiene Squalene al 5%,
Tween 80 al 0,5% y Span 85 al 0,5% (que contiene opcionalmente
diversas cantidades de MTP-PE [véase más adelante],
aunque no sean necesarias), formulado en partículas submicrométricas
usando un microfluidizador tal como el microfluidizador modelo 110Y
(Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, que contiene Squalene al 10%,
Tween 80 al 0,4%, polímero en bloques de Pluronic al 5% L121 y
thr-MDP (véase más adelante), bien microfluidizado
en una emulsión submicrométrica o sometido a turbulencias para
generar una emulsión de mayor tamaño de partícula y (c) sistema de
adyuvantes Ribi® (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) que contiene
Squalene al 2%, Tween 80 al 0,2% y uno o más componentes de la
pared celular bacteriana procedentes del grupo constituido por
monofosforilípido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM) y
esqueleto de la pared celular (EPC), preferiblemente, MPL + EPC
(Detox®); (3) se pueden usar adyuvantes de saponina, tales como
Stimulon® (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) o partículas
generadas por los mismos tales como ISCOM (complejos
inmunoestimulantes); (4) adyuvante de Freunds Completo (AFC) y
Adyuvante de Freunds Incompleto (AFI); (5) citoquinas, tales como
interleuquinas (IL-1, IL-2, etc.),
factor estimulante de colonias de macrófagos
(FEC-M), factor de necrosis tumoral (FNT), etc.; (6)
mutantes destoxificados de una toxina ribosilante del ADP
bacteriano tal como una toxina del cólera (TC), toxina de la
tosferina (TP) o toxina lábil al calor de E. coli (TL),
particularmente, LT-K63 (en la que la lisina está
sustituida por el aminoácido de tipo salvaje en la posición 63)
LT-R72 (en la que la arginina está sustituida por
el aminoácido de tipo salvaje en la posición 72),
CT-S 109 (en la que la serina está sustituida por el
aminoácido de tipo salvaje en la posición 109) y
PT-K9/G129 (en la que la lisina está sustituida por
el aminoácido de tipo salvaje en la posición 9 y la glicina está
sustituida en la posición 129) (véase, p. ej., las publicaciones
internacionales n.º: W093/13202 y W092/19265); y (7) otras
sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes para aumentar
la eficacia de la composición.
Los péptidos de muramilo incluyen, pero no se
limitan a,
N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina
(thr-MDP),
N-acetil-nomuramil-L-alanil-D-isoglutamina
(no-MDP),
N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-
2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), etc.
2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), etc.
Comúnmente, las composiciones vacunales se
preparan como inyectables, bien como soluciones o como suspensiones
líquidas; también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para
su disolución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de su
inyección. La preparación también puede ser emulsionada o
encapsulada en liposomas para un mayor efecto adyuvante, según lo
tratado anteriormente.
Las vacunas comprenderán una cantidad
terapéuticamente eficaz de proteínas Env modificadas, o de complejos
de las proteínas o de secuencias de nucleótidos codificantes de las
mismas, y cualquier otro de los componentes anteriormente
mencionados, según lo necesario. "Cantidad terapéuticamente
eficaz" pretende significar una cantidad de una proteína Env
modificada (p. ej., gp120) que provoque una respuesta inmune
protectora en el individuo sin infectar, infectado o no expuesto al
que se le administra. Tal respuesta generalmente dará como
resultado el desarrollo en el sujeto de una respuesta inmune
secretora, celular y/o mediada por anticuerpos hacia la vacuna.
Habitualmente, tal respuesta incluye, pero no se limita a, uno o más
de los siguientes efectos; la producción de anticuerpos de
cualquiera de las clases inmunológicas, tales como inmunoglobulinas
A, D, E, G o M; la proliferación de linfocitos B y T; el suministro
de señales de activación, de crecimiento y de diferenciación hacia
células inmunológicas; la expansión de la célula T auxiliar, de la
célula T supresora y/o de la célula T citotóxica.
Preferiblemente, la cantidad eficaz es
suficiente para llevar a cabo el tratamiento o la prevención de los
síntomas de la enfermedad. La cantidad exacta necesaria variará en
función del sujeto que esté siendo tratado; de la edad y del estado
general del individuo que se vaya a tratar; de la capacidad del
sistema inmunológico del individuo para sintetizar los anticuerpos;
del grado de protección deseado; de la gravedad de la condición que
esté siendo tratada; del polipéptido Env concreto seleccionado y de
su modo de administración, entre otros factores. Un experto en la
técnica puede determinar fácilmente una cantidad eficaz apropiada.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" caerá en un intervalo
relativamente amplio que puede ser determinado a través de pruebas
rutinarias.
Una vez formuladas, las vacunas de ácido
nucleico pueden ser realizadas con o sin vectores víricos, según lo
descrito anteriormente, mediante inyección usando bien una jeringa
convencional o una pistola de genes, tal como el sistema de
administración de genes Accell® (PowderJect Technologies, Inc.,
Oxford, Inglaterra). La administración del ADN en células de la
epidermis es particularmente preferible, pues este procedimiento de
administración proporciona acceso a las células linfoides asociadas
con la piel y proporciona una presencia transitoria del ADN en el
receptor. Tanto los ácidos nucleicos como los péptidos pueden ser
inyectados bien subcutánea, epidérmica, intradérmica, intramucosa,
tal como nasal, rectal y vaginalmente, intraperitoneal,
intravenosa, oral o intramuscularmente. Otros procedimientos de
administración incluyen la administración oral o pulmonar, la
aplicación de supositorios, de inyección sin aguja, transcutánea y
transdérmica. El tratamiento posológico puede ser un régimen
posológico simple o un régimen posológico múltiple. La
administración de ácidos nucleicos puede ser además combinada con
la administración de péptidos u otras sustancias.
Aunque la invención haya sido descrita en
combinación con las realizaciones específicas preferidas de la
misma, se entenderá que la descripción precedente, así como los
ejemplos que figuran a continuación, pretenden ilustrar y no
limitar el alcance de la invención. Hay otros aspectos, ventajas y
modificaciones pertenecientes al ámbito de la invención que
resultarán evidentes para aquéllos expertos en la técnica a la que
pertenece la invención.
A continuación, se presentan ejemplos de las
realizaciones específicas para llevar a cabo la presente invención.
Estos ejemplos se ofrecen únicamente a efectos ilustrativos y no
están, en ningún modo, destinados a limitar el ámbito de la presente
invención.
Se han hecho esfuerzos por garantizar la
exactitud respecto a los números usados (p. ej., las cantidades, las
temperaturas, etc.), pero, por supuesto, se deberían permitir
algunos errores y desviaciones experimentales.
La estructura cristalina de la gp120 de
HXB-2 fue descargada de la base de datos Brookhaven.
(COMPLEJO (PROTEÍNA DE LA ENVOLTURA DEL VIH/CD4/FAB)
15-JUN-98 1GC1 TÍTULO: NÚCLEO DE LA
GP120 DEL VIH-1 COMPLEJADO CON CD4 Y UN ANTICUERPO
HUMANO NEUTRALIZANTE). Las cadenas beta 3, 2, 21 y 20 de gp120
forman una lámina cerca del sitio de unión a CD4. Las cadenas
\beta-3 y \beta-2 están
conectadas por el bucle V1/V2. Las cadenas
\beta-21 y \beta-20 están
conectadas por otro bucle pequeño. Los enlaces de tipo H del punto
de unión entre las cadenas \beta-2 y
\beta-21 son la única conexión entre los dominios
de la mitad "inferior" de la proteína (hélice de unión alfa 1
al sitio de unión a CD4). Esta lámina beta y estos bucles ocultan
algunos antígenos (p. ej., antígenos que pueden generar anticuerpos
neutralizantes) que sólo quedan al descubierto durante la unión a
CD4.
Se diseñaron constructos que eliminan suficiente
lámina beta como para dejar al descubierto los antígenos en el
sitio de unión a CD4, aún dejando la suficiente proteína como para
permitir su correcto plegamiento. Se dirigieron específicamente
modificaciones en el bucle pequeño y la eliminación opcional de los
bucles V1/V2. Se diseñaron tres tipos diferentes de constructos:
(1) constructos codificantes de los polipéptidos que dejan intacto
el número de residuos que constituyen la lámina beta entera de 4
cadenas, pero reemplazan uno o más residuos; (2) constructos que
codifican el polipéptido que tiene al menos un residuo de al menos
una cadena beta escindido o (3) constructos codificantes de
polipéptidos que tienen al menos dos residuos de al menos una
cadena beta escindidos. De ese modo, se necesitó un total de 6
vueltas diferentes para volver a unir los extremos de las
cadenas.
Inicialmente, se modificaron los residuos del
bucle pequeño (residuos 427-430, en relación con
HXB-2) y las cadenas beta conectadas
(\beta-20 y \beta-21) para que
contuvieran Gly y Pro (comunes en las vueltas beta). Entonces se
usaron estas secuencias como diana para el ajuste en cada búsqueda.
Se ajustó la geometría de la diana con proteínas conocidas del
banco de datos de proteínas de Brookhaven. En concreto, se buscaron
en las bases de datos vueltas de 5 residuos (incluyendo un residuo
simple solapante del terminal N, la vuelta diana de 2 residuos y 2
residuos solapantes del terminal C). En otras palabras, estos bucles
modificados añaden una vuelta de 2 residuos que debería ser capaz
de soportar una geometría que mantuviera la estructura de lámina
beta de la proteína de tipo salvaje. Los cálculos fueron realizados
usando los parámetros por defecto de la opción de Búsqueda de
bucles del módulo Biopolímero del paquete de modelización molecular
Sybyl. En cada caso, sólo se revisaron los 25 mejores ajustes
basados en la geometría y, de ésos, se seleccionaron varios para la
homología y el ajuste.
Además, también se determinaron las
modificaciones que se podrían hacer para eliminar la mayor parte del
bucle V1/V2 (residuos 124-198, relativos a
HXB-2) aún dejando la geometría de la proteína
intacta. Como con el bucle pequeño, también se diseñaron
constructos que escindían uno o más residuos de la cadena
\beta-2 (residuos 119-123 de
HXB-2), de la cadena \beta-3
(residuos 199-201 de HXB-2) o de
\beta-2 y \beta-3. Para estos
constructos, se buscaron bucles conocidos para hacerlos coincidir
con la geometría de un pentámero (incluyendo dos residuos restantes
del lado del terminal N, una vuelta de dos residuos y un residuo del
terminal C). Para estas búsquedas, se prefirió
Gly-Gly como el inserto junto al menos una
sustitución del terminal C.
En un aspecto, se reemplazó la secuencia nativa
con residuos que dejaron al descubierto el sitio de unión a CD4,
pero dejando la geometría global de la proteína relativamente
intacta. Para los reemplazos del bucle pequeño, la diana a la que
ajustarse fue:
ASN425-MET426-GLY427-GLY428-GLY431.
En la tabla 1, se resumen los resultados de la búsqueda.
En base a estos resultados, se recomendaron los
constructos codificantes de Gly-Gly (n.º 7),
Gly-Ser (n.º 12) o
Gly-Gly-Asn (n.º 7).
Como también son opcionalmente eliminados V1/V2
y uno o más residuos de \beta-1 y
\beta-3 en los polipéptidos modificados de la
invención, también se buscaron bucles conocidos para ajustarlos a la
geometría del bucle V1/V2. El bucle V1/V2, la diana a la que
ajustarse fue:
Lys121-Leu-122-Gly123-Gly124-Ser199.
En la tabla 2, se muestran algunas coincidencias notables:
En base a estas búsquedas, se recomendaron los
constructos codificantes de Gly-Asn en lugar de
V1/V2.
Para un bucle pequeño ligeramente truncado, se
recortó otro residuo más de cada cadena beta para acortar
ligeramente la lámina beta. La diana a la que ajustarse fue:
ILE424-ASN425-GLY426-GLY427-LYS432.
En la tabla 3, se muestran los resultados.
\vskip1.000000\baselineskip
Aunque estas búsquedas mostraron más variación y
peores ajustes que el truncamiento anterior, los constructos
codificantes de Pro-Val o Pro-Leu
fueron muy similares. Por consiguiente, se recomendaron los
constructos codificantes de Ala-Pro.
También se buscaron las secuencias codificantes
de los polipéptidos gp120 que tenían V1/V2 eliminada y un resido más
de \beta-2 o \beta-3 escindido.
El bucle V1/V2, la diana a la que ajustarse fue:
VAL120-LYS121-GLY122-GLY123-VAL200.
En la tabla 4, se muestran algunas coincidencias notables.
\vskip1.000000\baselineskip
Se recomendó el constructo codificante de
Ala-Pro (p. ej., n.º: 7).
\vskip1.000000\baselineskip
En otro truncamiento más, se recortó otro
residuo de las cadenas \beta-20 y
\beta-21 para acortar más la lámina beta. La diana
a la que ajustarse fue
ILE423-ILE424-GLY425-
GLY426-ALA433. En la figura 5, se muestran las
coincidencias notables.
\vskip1.000000\baselineskip
Se recomendó un constructo codificante de
Gly-Gly (p. ej., n.º: 3), que tiene una homología
del 100%.
También se buscaron secuencias codificantes de
una región V1/V2 eliminada y al menos dos residuos escindidos de
\beta-2, \beta-3 o al menos un
residuo escindido de \beta-2 y
\beta-3. La diana a la que ajustarse fue:
CYS119-VAL120-GLY121-GLY122-ILE201.
En la tabla 6, se muestran las coincidencias notables.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó que se usarían ambos
constructos.
\vskip1.000000\baselineskip
Según lo descrito anteriormente, los bucles
nativos que se extrudían de 4 cadenas antiparalelas \beta fueron
escindidos y reemplazos por de 1 a 3 vueltas de residuo. Los bucles
fueron reemplazados para dejar las cadenas \beta enteras o
escindidas recortando uno o más aminoácidos de cada lado de las
cadenas conectadas. Se volvieron a unir los extremos de las cadenas
con vueltas que conservan la misma geometría del eje central (p.
ej., estructura terciaria de \beta-20 y
\beta-21), según lo determinado por la búsqueda en
el banco de datos de proteínas de Brookhaven.
La tabla 7A es un resumen de los truncamientos
de las regiones variables 1 y 2 recomendados en este estudio, según
lo determinado en el ejemplo 1.A. anterior.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se indica anteriormente, los polipéptidos
codificados por los constructos de la presente invención están
numerados en relación con HXB2, pero el residuo de aminoácido
particular de los polipéptidos codificados por estos constructos
ejemplares se basa en SF-162. De ese modo, por
ejemplo, aunque el residuo de aminoácido 195 de
HXB-2 es una serina (S), los constructos
codificantes de polipéptidos que tienen entonces la secuencia SF162
salvaje tendrán una asparagina (N) en esta posición. La tabla 7B
sólo muestra tres de las variaciones en la secuencia de aminoácidos
entre las cadenas HXB-2 y SF162. En el alineamiento
de la figura 2, se muestran las secuencias completas, incluyendo
las diferencias en el número de residuo y de aminoácido de
HXB-2 y SF162 (SEQ ID NO: 1 y 2).
También se realizaron los constructos que
contenían eliminaciones en la cadena \beta-20, la
cadena \beta-21 y el bucle pequeño. En la tabla
8, se muestran los constructos codificantes de los truncamientos de
estas regiones. Los constructos de la tabla 8 están numerados en
relación con HXB-2, pero la secuencia de aminoácidos
no modificada se basa en SF162. Por lo tanto, el constructo
codifica una arginina (Arg) como se encuentra en SF162 en la
posición de aminoácido numerada como 426 en relación con
HXB-2 (véase además la tabla 7B). Los cambios del
tipo salvaje (SF162) se pueden ver en negrita en la tabla 8B.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizan los constructos de eliminación
mostrados en las tablas 7 y 8 de cada una de las cadenas \beta y
las combinaciones de las mismas. Estas eliminaciones serán
analizadas en las formas Env gp120, gp140 y gp160 de diferentes
cepas de VIH como las cepas del subtipo B (p. ej., SF162, US4, SF2),
las cepas del subtipo E (p. ej., CM235) y cepas del subtipo C (p.
ej., AF110968 o AF110975). En la figuras, se muestran los ejemplos
de constructos para SF162, que están resumidos en la tabla 9. Como
se indica anteriormente en la figura 2 y en la tabla 7B, en la
región de la lámina de unión, la secuencia de aminoácidos de SF162
difiere de HXB-2 en que el Met426 de
HXB-2 es una Arg en SF162. En la tabla 9, V1/V2 se
refiere a las eliminaciones de la región V1/V2; # bsm se refiere a
una modificación del bucle pequeño de la lámina de unión.
Las combinaciones de las eliminaciones de V1/V2
y las modificaciones del bucle pequeño de la lámina de unión además
de aquéllas mostradas específicamente en la tabla 9 también
pertenecen al ámbito de la presente invención. Se pueden combinar
las diversas formas de las diferentes realizaciones de la invención
descritas en la presente memoria.
El primer rastreo se efectuará tras la expresión
transitoria en células COS-7, RD y/o 293. Las
proteínas que sean expresadas serán analizadas mediante
inmunotransferencia, ELISA y en cuanto a la unión a anticuerpos M
dirigidos contra el sitio de unión a CD4 y otros epitopes
importantes sobre gp120 para determinar la integridad de la
estructura. También serán analizados en un análisis de unión a CD4
y, además, la unión de anticuerpos neutralizantes, por ejemplo,
usando suero del paciente o anticuerpos M 448D (dirigidos contra
Glu370 y Tyr384, una región del surco de unión a CD4 que no está
alterada por las eliminaciones).
Se analizará la inmunogenicidad de estas nuevas
glicoproteínas Env en roedores y primates. Las estructuras serán
administradas como vacunas de ADN o vacunas de proteínas con
adyuvantes, o en modalidades combinadas. El objetivo de estas
vacunaciones consistirá en alcanzar respuestas ampliamente reactivas
de los anticuerpos neutralizantes.
<110> Chiron Corporation
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> POLIPÉPTIDOS ENV DEL VIH
MODIFICADOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 1605.100
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 856
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la inmunodeficiencia
humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 847
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la inmunodeficiencia
humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2310
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Val120-Ala204
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2316
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Val120-IIe201
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2322
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Val120-IIe201B
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2328
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Lys121-Val200
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2334
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Leu122-Ser199
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2316
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Val120-Thr202
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2541
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Trp427-Gly431
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2541
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Arg426-Gly431
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2541
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Arg426-Gly431B
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2541
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Arg426-Lys432
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2535
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Asn425-Lys432
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2529
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: IIe424-Ala433
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2523
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: IIe423-Met434
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2517
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Gin422-Tyr435
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2517
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Gin422-Tyr435B
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2322
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Leu122-Ser199;
Arg426-Gly431
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2322
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Leu122-Ser199;
Arg426-Lys432
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2322
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Leu122-Ser199;
Trp427-Gly431
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2310
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Lys121-Val200;
Asn425-Lys432
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2298
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Val120-IIe201;
IIe424-Ala433
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2298
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Val120-IIe201B;
IIe424-Ala433
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2298
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Val120-Thr202;
IIe424-Ala433
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2358
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Val127-Asn195
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2352
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Val127-Asn195;
Arg426-Gly431
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (27)
1. Un polinucleótido codificante de un
polipéptido Env del VIH modificado en el que el polipéptido tiene al
menos un aminoácido eliminado o reemplazado en comparación con el
tipo salvaje de la región correspondiente a los residuos 420 a 436
numerados en relación con HXB-2 (SEQ ID NO: 1).
2. El polinucleótido de la reivindicación 1 en
el que además está eliminada la región correspondiente a los
residuos 124-198 numerados en relación con
HXB-2 en comparación con el tipo salvaje y también
está eliminado o reemplazado al menos un aminoácido en comparación
con el tipo salvaje de las regiones correspondientes a los residuos
119 a 123 y 199 a 210 numerados en relación con
HXB-2 (SEQ ID NO: 1).
3. El polinucleótido de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, en el que al menos un aminoácido de la
región correspondiente a los residuos 427 a 429 en relación con
HXB-2 (SEQ ID NO: 1) está eliminado o reemplazado en
comparación con el tipo salvaje.
4. El polinucleótido de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, en el que la secuencia de aminoácidos del
polipéptido Env del VIH modificado se basa en la cepa SF162.
5. Un polipéptido Env del VIH modificado
inmunogénico que tiene al menos un aminoácido eliminado o
reemplazado en comparación con el tipo salvaje de la región
correspondiente a los residuos 420 a 436, en relación con
HXB-2 (SEQ ID NO: 1).
6. El polipéptido de la reivindicación 5, en el
que un aminoácido está eliminado en la región correspondiente a los
residuos 420 a 436, en relación con HXB-2 (SEQ ID
NO: 1).
7. El polipéptido de la reivindicación 5, en el
que más de un aminoácido está eliminado en la región correspondiente
a los residuos 420 a 436, en relación con HXB-2 (SEQ
ID NO: 1).
8. El polipéptido de la reivindicación 5, en el
que al menos un aminoácido está reemplazado en la región
correspondiente a los residuos 420 a 436, en relación con
HXB-2 (SEQ ID NO: 1).
9. El polipéptido de la reivindicación 5, en el
que al menos un residuo de aminoácido está eliminado o reemplazado
en la región correspondiente a los residuos de aminoácido 427 a
429, en relación con HXB-2 (SEQ ID NO: 1).
10. El polipéptido de una cualquiera de las
reivindicaciones 5-9, en el que las regiones V1 y V2
del polipéptido están truncadas.
11. El polipéptido de una cualquiera de las
reivindicaciones 5-10, en el que la secuencia de
aminoácidos el polipéptido Env del VIH modificado se basa en la cepa
SF162.
12. Un constructo útil para estimular una
respuesta inmune, comprendiendo el constructo: secuencias control
que regulan la transcripción y la traducción, una secuencia
codificante regulada por las secuencias control, potenciadotes,
secuencias de poliadenilación, en las que la secuencia codificante
comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo
constituido por: la secuencia de nucleótidos representada en la
figura 6 (SEQ ID NO: 3); la secuencia de nucleótidos representada en
la figura 7 (SEQ ID NO: 4), la secuencia de nucleótidos representada
en la figura 8 (SEQ ID NO: 5), la secuencia de nucleótidos
representada en la figura 9 (SEQ ID NO: 6), la secuencia de
nucleótidos representada en la figura 10 (SEQ ID NO: 7), la
secuencia de nucleótidos representada en la figura 11 (SEQ ID NO:
8), la secuencia de nucleótidos representada en la figura 12 (SEQ ID
NO: 9), la secuencia de nucleótidos representada en la figura 13
(SEQ ID NO: 10), la secuencia de nucleótidos representada en la
figura 14 (SEQ ID NO: 11), la secuencia de nucleótidos representada
en la figura 15 (SEQ ID NO: 12), la secuencia de nucleótidos
representada en la figura 16 (SEQ ID NO: 13), la secuencia de
nucleótidos representada en la figura 17 (SEQ ID NO: 14), la
secuencia de nucleótidos representada en la figura 18 (SEQ ID NO:
15), la secuencia de nucleótidos representada en la figura 19 (SEQ
ID NO: 16), la secuencia de nucleótidos representada en la figura 20
(SEQ ID NO: 17), la secuencia de nucleótidos representada en la
figura 21 (SEQ ID NO: 18), la secuencia de nucleótidos representada
en la figura 22 (SEQ ID NO: 19), la secuencia de nucleótidos
representada en la figura 23 (SEQ ID NO: 20), la secuencia de
nucleótidos representada en la figura 24 (SEQ ID NO: 21), la
secuencia de nucleótidos representada en la figura 25 (SEQ ID NO:
22), la secuencia de nucleótidos representada en la figura 26 (SEQ
ID NO: 23), la secuencia de nucleótidos representada en la figura 27
(SEQ ID NO: 24), la secuencia de nucleótidos representada en la
figura 28 (SEQ ID NO: 25) y la secuencia de nucleótidos representada
en la figura 29 (SEQ ID NO: 26).
13. Una composición vacunal que comprende un
polinucleótido codificante de un polipéptido Env modificado según
una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
14. Una composición vacunal que comprende un
constructo de polinucleótido codificante de un polipéptido Env
modificado según la reivindicación 12.
\newpage
15. Una composición vacunal que comprende un
polipéptido Env modificado según cualquiera de las reivindicaciones
5-11.
16. La composición vacunal de cualquiera de las
reivindicaciones 13-15, que comprende además un
adyuvante.
17. Un polinucleótido codificante de un
polipéptido Env del VIH modificado según una cualquiera de las
reivindicaciones 5-11 para su uso en la estimulación
de una respuesta inmune.
18. Un constructo de polinucleótido según la
reivindicación 12 para su uso en la estimulación de una respuesta
inmune.
19. Un polipéptido que comprende un polipéptido
Env del VIH modificado según una cualquiera de las reivindicaciones
5-11 para su uso en la estimulación de una respuesta
inmune.
20. Uso de un polinucleótido o un constructo de
polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones
1-4 ó 12 en la preparación de un medicamento para
provocar una respuesta inmune.
21. Uso de un polipéptido según cualquiera de
las reivindicaciones 5-11 en la preparación de un
medicamento para provocar una respuesta inmune.
22. El uso según la reivindicación 20 o la
reivindicación 21, en el que el polinucleótido, el constructo de
polinucleótido o el polipéptido es administrado conjuntamente con un
adyuvante.
23. Uso de una composición que comprende un
polinucleótido Env modificado o un constructo de polinucleótido
según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 ó
12, en la fabricación de un medicamento para provocar una respuesta
inmune, siendo dicho medicamento para ser administrado en una etapa
de cebado y para ser seguido por una etapa de refuerzo.
24. Uso de una composición que comprende un
polinucleótido Env modificado o un constructo de polinucleótido
según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 ó
12, en la fabricación de un medicamento para provocar una respuesta
inmune, siendo dicho medicamento para ser administrado en una etapa
de refuerzo y para ser precedido por una etapa de cebado.
25. Uso de una composición que comprende un
polipéptido Env modificado según una cualquiera de las
reivindicaciones 5-11, en la fabricación de un
medicamento para provocar una respuesta inmune, siendo dicho
medicamento para ser administrado en una etapa de cebado y para ser
seguido por una etapa de refuerzo.
26. Uso de una composición que comprende un
polipéptido Env modificado según una cualquiera de las
reivindicaciones 5-11, en la fabricación de un
medicamento para provocar una respuesta inmune, siendo dicho
medicamento para ser administrado en una etapa de refuerzo y para
ser precedido por una etapa de cebado.
27. El uso de las reivindicaciones
23-26, en el que dicha composición comprende además
un adyuvante.
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