KR20030034194A - 병원체 내에서 수용체에 대한 항체를 재유도하는리간드/수용체 특이성 교환기 - Google Patents
병원체 내에서 수용체에 대한 항체를 재유도하는리간드/수용체 특이성 교환기 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 일반적으로 병원체, 예를 들어 박테리아, 효모, 기생충, 균류, 바이러스 및 암을 포함하는 병원체(이로 제한되는 것은 아님)를 포함하는 질병을 예방 및 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 환자 내에서 병원체 상에 존재하는 수용체에 대해 기존의 항체를 재유도하는 리간드/수용체 특이성 교환기의 제조 및 용도에 관한 것이다.
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Description
병원체, 예를 들어 박테리아, 효모, 기생충, 균류 및 바이러스에 의한 감염, 및 암의 발병 및 전이는 모든 동물, 예를 들어 인간, 가축 동물 및 애완 동물에게 중요한 건강상의 문제점을 야기시킨다. 이들 건강상의 위협은 백신화 및/또는 치료에 대한 내성인 균주의 발생에 의해 악화된다. 과거, 약리학자들은 이들 질병을 치료하기 위한 안전하고 효과적인 화합물을 생성하기 위해 전통적인 약물 개발 방법에 의존하여 왔다. 전통적인 약물 개발 방법은 일반적으로 잠재 약물 후보 분자, 종종 몇몇 질병에 대해 효과적인 치료 물질로 입증될 수 있기를 희망하며 무작위 선택된 잠재 약물 후보 분자를 맹검 테스트하는 단계를 포함한다. 그러나, 분자생물학의 출현으로 인해, 약물 개발의 초점은 질병의 원인제와 관련된 분자 표적의 확인 및 이들 분자 표적과 상호작용하는 화합물의 설계로 이동되었다.
한가지 유망한 부류의 분자 표적은 박테리아, 효모, 기생충, 균류, 바이러스 및 암 세포 표면 상에서 발견되는 수용체, 구체적으로 숙주 세포 또는 숙주 단백질(예를 들어, 외세포성 매트릭스 단백질)에 부착할 수 있는 수용체이다. 이러한 분야의 연구는 주로 수용체 및 그 리간드의 확인과 상기 리간드와 수용체의 상호작용을 방해함으로써 숙주 세포 또는 단백질에 대한 부착을 차단하는 분자의 발견에 집중되었다.
예를 들어, 다수의 병원성 박테리아(예를 들어, 스타필로콕쿠스 아우레우스(Staphyloccus aureus))는 숙주의 외세포성 매트릭스 단백질(예를 들어, 피브리노겐, 피브로넥틴 및 라미닌)에 결합할 수 있는 부착 수용체(예를 들어, ClfA, Efb 및 FnBPA)를 생성한다[참조: Flock, Mol. Med. Today 5: 532-533 (1999)]. 학자들의 연구 결과, 숙주의 외세포성 매트릭스 단백질에 대한 몇몇 박테리아의 부착은 숙주 외세포성 매트릭스 단백질 부위에 상응하는 펩티드를 제공함으로써 차단할 수 있음이 확인되었다[참조: Pei 등, Infection and Immunity 67(9): 4525-4530 (1999)]. 유사하게, 다수의 바이러스는 숙주 세포의 표면 상에 존재하는 단백질과 상호작용하는 수용체를 보유하고 있다(참조: 예를 들어, 미국 특허 제5,942,606호 및 제5,929,220호). 학자들의 연구 결과, T4 당단백질(숙주 세포 단백질)의 단편은 인간 면역결핍성 바이러스(HIV)의 gp120과 상호작용할 수 있으며, T4 펩티드를 사용하여 HIV 감염을 예방 또는 치료할 수 있는 것으로 확인되었다(참조: 예를 들어 미국 특허 제6,093,539). 또한, 다수 유형의 암 세포는 숙주 외세포성 매트릭스 단백질과 상호작용하는 수용체를 발현하며, 학자들의 연구 결과, 인테그린 수용체를 차단하는 분자를 이용하여 조직 부착, 전이, 혈관생성 및 종양 성장을 억제할 수 있음을 확인하였다(참조: 예를 들어, 미국 특허 제6,066,648호; 제6,087,330호; 제5,846,536호; 제5,766,591호; 및 제5,627,263호). 이들 억제성 펩티드가 유망한 치료능을 보유함에도 불구하고, 병원체에 의한 감염 및 다른 질병을 치료 및 예방하기 위한 신규한 조성물과 방법이 여전히 요구되고 있다.
본 발명은 일반적으로 병원체, 예를 들어 박테리아, 효모, 기생충, 균류, 바이러스 및 암을 포함하는 병원체(이로 제한되는 것은 아님)를 포함하는 인간 질병을 예방 및 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명의 구체예는 환자 내에서 병원체 상에 존재하는 수용체에 대해 기존의 항체를 재유도하는 리간드/수용체 특이성 교환기의 제조 및 용도에 관한 것이다.
발명의 개요
본 발명은 병원체 상의 수용체와 결합하며, 상기 병원체에 대해 환자 내에 존재하는 항체를 재유도하는 신규 제제의 제조, 특성화 및 용도에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 하나 이상의 특이성 도메인을 보유하는 리간드/수용체 특이성 교환기에 관한 것인데, 이는 수용체에 대한 리간드와 상기 특이성 도메인에 연결된 하나 이상의 항원성 도메인을 포함하며, 상기 항원성 도메인은 독소 또는 병원체의 에피토프를 포함한다.
상기 리간드/수용체 특이성 교환기의 몇몇 구체예는 외세포성 매트릭스 단백질, 바이러스 상의 수용체에 대한 리간드 및 암 세포 상의 수용체에 대한 리간드로 구성되는 군으로부터 선택된 펩티드의 3개 이상의 연속되는 아미노산을 포함한다. 본 구체예의 몇몇 관점에서, 예를 들어 상기 펩티드는 피브리노겐, 콜라겐, 비트로넥틴, 라미닌, 플라스미노겐, 트롬보스폰딘, 및 피브로넥틴으로 구성되는 군으로부터 선택된 외세포성 매트릭스 단백질이다. 바람직하게는, 상기 외세포성 단백질은 피브리노겐의 알파 사슬의 3개 이상의 아미노산을 포함하며, 가장 바람직한 구체예에서, 상기 리간드는 아르기닌-글리신-아스파르테이트(RGD)를 포함한다.
다른 구체예에서, 상기 펩티드는 T4 당단백질 및 B형 간염 바이러스 엔벨로프 단백질로 구성되는 군으로부터 선택되는 바이러스 상의 수용체에 대한 리간드이다. 본 구체예의 다른 관점에서, 상기 펩티드는 HER-2/neu에 대한 리간드 및 인테그린 수용체에 대한 리간드로 구성되는 군으로부터 선택된 암 세포 상의 수용체에 대한 리간드이다. 바람직한 구체예는 서열 번호 1 내지 42중 하나에 의해 제공되는 서열을 포함하는 특이성 도메인을 보유한다.
본원에 기술한 리간드/수용체 교환기는 병원체 상에서 확인된 수용체와 상호작용한다. 몇몇 구체예에서, 상기 수용체는 박테리아 부착 수용체, 예를 들어 외세포성 피브리노겐 결합 단백질(Efb), 콜라겐 결합 단백질, 비트로넥틴 결합 단백질, 라미닌 결합 단백질, 플라스미노겐 결합 단백질, 트롬보스폰딘 결합 단백질, 세포 응집 인자 A(ClfA), 세포 응집 인자 B(ClfB), 피브로넥틴 결합 단백질, 코아굴라제 및 외세포성 부착 단백질로 구성되는 군으로부터 선택되는 박테리아 부착 수용체이다.
또한, 본원에 기술된 리간드/수용체 특이성 교환기는 환자 내에 존재하는 항체와 상호작용한다. 몇몇 구체예에서, 예를 들어 항원성 도메인은 허피스 심플렉스 바이러스 단백질, B형 간염 바이러스 단백질, TT 바이러스 단백질 및 폴리오바이러스 단백질로 구성되는 군으로부터 선택되는 펩티드의 3개 이상의 아미노산을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 리간드/수용체 특이성 교환기는 서열 번호 53 및 서열 번호 54로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 허피스 심플렉스 바이러스 단백질인 항원성 도메인을 보유한다. 다른 바람직한 구체예에서, 상기 항원성 도메인은 서열 번호 49, 서열 번호 50, 서열 번호 52 및 서열 번호 59중 하나에 의해 제공되는 서열을 포함하는 B형 간염 바이러스 단백질을 포함한다.
또한, 몇몇 리간드/수용체 특이성 교환기는 서열 번호 43 내지 47 및 서열 번호 55 내지 58중 하나에 의해 제공되는 서열을 포함하는 TT 바이러스 단백질인 항원성 도메인을 보유한다. 또한, 상기 리간드/수용체 특이성 교환기는 서열 번호 48 및 서열 번호 51로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 폴리오바이러스 단백질인 항원성 도메인을 포함한다. 바람직하게는, 상기 리간드/수용체 특이성 교환기는 높은 역가의 항체와 상호작용하는 항원성 도메인을 보유한다. 몇몇 구체예에서, 예를 들어 상기 항원성 도메인은 약 1:100 내지 1:1000 이상으로 희석된 동물 혈청 내에 존재하는 항체에 특이적으로 결합한다. 서열 번호 60 내지 105의 특이성 교환기는 본 발명의 구체예들이다.
또한, 본 발명의 관점은 병원체의 감염 또는 증식을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 한 방법은 박테리아 감염을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 환자에게 치료 유효량의 리간드/수용체 특이성 교환기를 제공함으로써 실시되는데, 이때 상기 리간드/수용체 특이성 교환기는 박테리아 상의 수용체와 상호작용하는 리간드와 병원체 또는 독소에 대한 에피토프를 포함하는 항원성 도메인을 포함한다. 또한, 바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 방법도 본 발명의 한 구체예이다. 따라서, 바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 방법은 환자에게 치료 유효량의 리간드/수용체 특이성 교환기를 제공함으로써 실시되는데, 이때 상기 리간드/수용체 특이성 교환기는 바이러스 상의 수용체와 상호작용하는 리간드와 병원체 또는 독소에 대한 에피토프를 포함하는 항원성 도메인을 포함한다. 유사하게, 암을 치료 또는 예방하는 방법도 본 발명의 한 구체예이다. 따라서, 암을 치료 또는 예방하는 방법은 환자에게 치료 유효량의 리간드/수용체 특이성 교환기를 제공함으로써 실시되는데, 이때 상기 리간드/수용체 특이성 교환기는 암 세포 상의 수용체와 상호작용하는 리간드와 병원체 또는 독소에 대한 에피토프를 포함하는 항원성 도메인을 포함한다.
발명의 상세한 설명
이하, 병원체 상의 수용체를 결합하며 상기 병원체에 대해 환자 내에 존재하는 항체를 재유도하는 신규한 제제의 제조, 특성화, 및 용도를 기술한다. 본원에 사용한 용어 "항원/항체 특이성 교환기"는 당업계에 공지되어 있으며, 임의의 항체가 결합하는 아미노산 서열(예를 들어, 병원체의 에피토프)에 연결된 항체의 아미노산 서열(예를 들어, 상보성 결정 부위)에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 분자를 의미한다[참조: 예를 들어, Sallberg 등,Biochemical & Biophysical Research Communications, 205: 1386-90 (1994) 및 미국 특허 제5,869,232호 및 제6,040,137호]. 항원/항체 특이성 교환기는 병원체에 대해 환자 내에 존재하는 항체를 재유도할 수 있으며, 이들 교환기 제제는 치료적 용도 및 진단적 용도로 사용할 수 있다(Id.)
본원에 기술한 구체예는 "리간드/수용체 특이성 교환기"로 칭하는 차세대 교환기 제제에 관한 것이다. 항원/항체 특이성 교환기와는 달리, 리간드/수용체 특이성 교환기는 항체 내에서 발견된 서열을 포함하지 않는다. 대신, 리간드/수용체 특이성 교환기는 수용체에 대한 리간드를 보유하는 제1 도메인 및 병원체 또는 독소의 에피토프를 보유하는 제2 도메인을 포함한다. 따라서, 본 발명의 목적을 위해, 본원에서 사용한 용어 "리간드/수용체 특이성 교환기"는 병원체 또는 독소(예를 들어, 백일해 독소 또는 콜레라 독소)의 하나 이상의 에피토프를 보유하는 "항원성 도메인"에 결합된 수용체에 대한 하나 이상의 리간드("리간드"는 항체 또는 이의 일부분은 아님)를 보유하는 "특이성 도메인"을 포함하는 교환기 제제를 의미한다.
상기 리간드/수용체 특이성 교환기는 하나 이상의 특이성 도메인과 항원성 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 몇몇 리간드/수용체 특이성 교환기는 다수의 특이성 도메인 및/또는 항원성 도메인을 포함한다. 다수의 특이성 도메인 및/또는 항원성 도메인을 보유하는 리간드/수용체 특이성 교환기는 "다량체화"되었다고 칭하는데, 그 이유는 하나 이상의 특이성 도메인 및/또는 항원성 도메인이 직렬 융합되었기 때문이다. 다른 구체예는 특이성 도메인 및 항원성 도메인 이외에 정제를 용이하게 하는 서열(예를 들어 폴리 히스티딘 꼬리), 링커(예를 들어, 비오틴 및/또는 아비딘 또는 스트렙다비딘 또는 8 파지의 가요성 팔(8-링커)) 및 상기 리간드/수용체 특이성 교환기의 안정성을 촉진시키는 서열 또는 변경(예를 들어, 프로테아제 분해에 대한 저항성을 제공하는 변경) 또는 상기 리간드/수용체 특이성교환기의 분해를 촉진시키는 서열 또는 변경(예를 들어, 프로테아제 절단 부위)을 함유하는 리간드/수용체 특이성 교환기에 관한 것이다. 상기 특이성 도메인 및 항원성 도메인은 펩티드인 것이 바람직하지만, 몇몇 리간드/수용체 특이성 교환기는 변경된 또는 유도체화된 펩티드, 펩티드유사체 또는 화학물질로 제조된 특이성 도메인 및 항원성 도메인을 보유한다.
리간드/수용체 특이성 교환기는 매우 다양한데, 그 이유는 본원에 개시된 구체예는 다수의 상이한 병원체 상의 다수의 상이한 수용체에 결합할 수 있기 때문이다. 따라서, 본원에 사용한 용어 "병원체"는 일반적으로 박테리아, 기생충, 균류, 곰팡이, 바이러스 및 암 세포(이들로 제한되는 것은 아님)를 포함하는 동물에서 질병의 원인제를 의미한다. 유사하게, 본원에 사용한 용어 "수용체"는 일반적으로 "리간드"(통상 항체에서 확인되는 서열 이외의 펩티드 이거나 또는, 탄수화물, 지질, 핵산 또는 이들의 조합물)와 상호작용하는 분자(통상 항체에서 확인되는 서열 이외의 펩티드이지만, 탄수화물, 지질 또는 핵산일 수 있음)를 의미한다. 본원에 사용한 용어 "수용체"는 신호 전달을 수행할 필요는 없으며, 부착(예를 들어, 인테그린) 및 분자 신호전달(예를 들어, 성장 인자 수용체)(이들로 제한되는 것은 아님)을 포함하는 다수의 분자 상호작용에 관련될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 특이성 도메인은 외세포성 매트릭스 단백질(예를 들어, 피브리노겐, 콜라겐, 비트로넥틴, 라미닌, 플라스미노겐, 트롬보스폰딘 및 피브로넥틴) 내에 존재하는 펩티드 서열을 보유하는 리간드를 의미하며, 몇몇 특이성 도메인은 박테리아 부착 수용체(예를 들어, 외세포성 피브리노겐 결합 단백질(Efb), 콜라겐 결합 단백질, 비트로넥틴 결합 단백질, 라미닌 결합 단백질, 플라스미노겐 결합 단백질, 트롬보스폰딘 결합 단백질, 세포 응집 인자 A(ClfA), 세포 응집 인자 B(ClfB), 피브로넥틴 결합 단백질, 코아굴라제, 및 외세포성 부착 단백질)와 상호작용하는 리간드를 포함한다.
다른 구체예에서, 특이성 도메인은 바이러스 수용체와 상호작용하는 펩티드 서열을 보유하는 리간드(예를 들어, gp120을 결합하는 T4 당단백질의 단편 또는 헤파드나바이러스 과의 gp170을 결합하는 preS 도메인의 단편)를 포함한다. 다른 구체예에서, 특이성 도메인은 암 세포 상의 수용체와 상호작용하는 리간드(예를 들어, HER-2/neu(C-erbB2)) 또는 비트로넥틴 수용체, 라미닌 수용체, 피브로넥틴 수용체, 콜라겐 수용체, 피브리노겐 수용체,수용체,수용체,수용체,수용체 및수용체와 같은 인테그린 수용체를 포함한다. 그러나, 바람직한 구체예는 피브리노겐의 알파 사슬의 8개 이상의 아미노산 및/또는 서열 아르기닌-글리신-아스파르트산(RGD)을 포함하는 특이성 도메인을 포함하며, 가장 바람직한 구체예는 서열 번호 60 내지 105로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열을 포함한다.
바람직한 항원성 도메인은 이미 환자내에 존재하는 항체에 의해 인식되는 에피토프를 보유한다. 예를 들어, 다수의 성인들은 소아 질병, 예를 들어 천연두, 홍역, 이하선염, 풍진 및 소아마비(이로 제한되는 것은 아님)에 면역화되어 있다. 따라서, 이들 병원체 상의 에피토프에 대한 항체는 면역화된 사람에 의해 생성될 수 있다. 바람직한 항원성 도메인은 이들 질병의 원인제중 하나에서 발견되는 에피토프를 보유한다.
몇몇 구체예는 환자에게 투여된 항체와 상호작용하는 항원성 도메인을 보유한다. 예를 들어, 리간드/수용체 특이성 교환기 상의 항원성 도메인과 상호작용하는 항체는 리간드/수용체 특이성 교환기와 동시 투여할 수 있다. 또한, 리간드/수용체 특이성 교환기와 상호작용하는 항체는 보통 환자 내에 존재할 수 없지만, 상기 환자는 생물학적 물질(예를 들어, 혈청, 혈액 또는 조직)의 도입에 의해 항체를 획득한다. 예를 들어, 수혈 받은 환자는 다수의 항체(이들중 몇몇은 리간드/수용체 특이성 교환기의 항원성 도메인과 상호작용할 수 있음)를 획득한다.
가장 바람직한 항원성 도메인은 높은 역가의 항체에 의해 인식되는 에피토프를 포함한다. 본원에 사용한 용어 "높은 역가의 항체"는 항원(예를 들어, 항원성 도메인 상의 에피토프)에 대해 높은 친화성을 보유하는 항체를 의미한다. 예를 들어, 고체상 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)에서, 높은 역가의 항체는 적당한 희석 완충액 중에서약 1:100 내지 1:1000, 바람직하게는 약 1:500의 희석율로 혈청을 희석한 후, 상기 분석에서 양성인 혈청 샘플 내에 존재하는 항체에 상응한다. 그러나, 바람직한 항원성 도메인은 허피스 심플렉스 바이러스 gG2 단백질, B형 간염 바이러스 s 항원(HBsAg), B형 간염 바이러스 e 항원(HBeAg), B형 간염 바이러스 c 항원(HBcAg), TT 바이러스, 및 폴리오바이러스 또는 이들의 조합물 상에서 확인되는 에피토프를 보유하거나, 서열 번호 43 내지 59로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다.
본원에 기술한 리간드/수용체 특이성 교환기는 재조합 공학 및/또는 펩티드 화학의 통상적인 기법에 의해 제조할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 특이성 도메인 및 항원성 도메인은 별도로 제조되고, 후속적으로 (예를들어, 링커에 의해 또는 통상적인 담체 분자에 의해) 함께 결합된다. 다른 구체예에서, 상기 특이성 도메인 및 항원성 도메인은 동일한 분자의 부분으로서 제조된다. 한 방법으로, 항원성 도메인에 결합된 특이성 도메인을 보유하는 리간드/수용체 특이성 교환기는 펩티드 합성기에 의해 제조된다. 다른 방법으로, 항원성 도메인에 융합된 특이성 도메인을 암호화하는 핵산은 발현 구성물 내로 클로닝되고, 세포로 형질감염되고, 리간드/수용체 특이성 교환기는 상기 세포 또는 세포 상청액으로부터 정제 또는 분리된다.
일단 리간드/수용체 특이성 교환기가 제조되면, 병원체 상의 수용체 및/또는 항원성 도메인에 특이적인 항체와 상호작용할 수 있는 그의 능력을 결정하기 위해 스크리닝할 수 있다. 따라서, 본원에 사용한 용어 "특성화 분석"은 병원체 또는 암 세포 또는 이들의 단편 상의 수용체 및/또는 항원성 도메인에 특이적인 항체와 상호작용하는 리간드/수용체 특이성 교환기의 능력의 실험 또는 평가를 의미하는데 사용된다. 예를 들어, 몇몇 특성화 분석은 상부에 배치되어 있는 병원체 또는 이의 단편의 수용체를 보유하는 지지체에 대한 결합 또는 이의 역에 대한 리간드/수용체 특이성 교환기의 능력을 평가한다. 다른 특성화 분석은 리간드/수용체 특이성 교환기의 항원성 도메인에 특이적인 항체에 결합하는 리간드/수용체 특이성 교환기의 능력을 평가한다. 또 다른 특성화 분석은 배양된 세포주 또는 죽은 세포 내에서 병원체에 의한 감염 또는 암 세포 증식을 수행하는 리간드/수용체 특이성 교환기의 능력을 평가한다.
본원에 기술된 리간드/수용체 특이성 교환기는 인간을 포함하는 동물에서 병원체 감염 뿐만 아니라 암의 치료 및 예방을 위한 약제의 활성 성분으로 사용할 수 있다. 상기 약제의 구체예는 다수의 방법으로 제제화할 수 있으며, 부형제, 결합제, 유화제, 담체 및 기타 보조제를 리간드/수용체 특이성 교환기와 함께 포함할 수 있다. 리간드/수용체 특이성 교환기를 함유하는 약제는 몇몇 경로, 예를 들어 국소, 경피, 비경구, 위장, 경기관지 및 경폐포(이로 제한되는 것은 아님)로 투여할 수 있다. 또한, 리간드/수용체 특이성 교환기는 의료 장비 및 보철물을 위한 코팅으로 사용하여 감염 또는 질병의 확산을 예방할 수 있다. 약제, 치료 프로토콜에 제공되거나, 또는 의료 장비에 적용된 리간드/수용체 특이성 교환기의 양은 용도, 환자 및 투여 빈도에 따라 달라진다.
본원에 기술된 방법중 일부는 박테리아 감염, 균류 감염, 바이러스 감염 및 암의 치료 및/또는 예방이 필요한 환자에게 리간드/수용체 특이성 교환기를 투여하는 것에 관한 것이다. 한 방법으로, 박테리아에 감염된 환자에게 박테리아 수용체와 상호작용하는 특이성 도메인을 포함하는 리간드/수용체 특이성 교환기가 제공된다. 유사하게, 바이러스에 감염된 환자에게는 바이러스 수용체와 상호작용하는 특이성 도메인을 포함하는 리간드/수용체 특이성 교환기가 제공될 수 있으며, 암 환자에게는 암 세포 상의 수용체와 상호작용하는 특이성 도메인을 포함하는 리간드/수용체 특이성 교환기가 제공된다. 일단 수용체/특이성 교환기 복합체가 형성되면, 병원체 또는 암 세포는 보체 고정 및/또는 마크로파지 분해에 의해 신체로부터 제거되는 것으로 생각된다.
본 발명은 질병(예를 들어, 박테리아 감염, 균류 감염, 및 바이러스 감염과암)의 치료 방법 및 예방 방법을 제공하는데, 본 발명의 방법은 이러한 질병에 걸린 환자나 걸릴 위험이 있는 환자를 확인하고, 그 환자에게 질병의 원인제 상에 존재하는 수용체와 상호작용하는 치료 유효량의 리간드/수용체 특이성 교환기를 제공한다. 따라서, 박테리아에 감염된 환자, 균류에 감염된 환자, 바이러스에 감염된 환자 또는 암 환자는 종래의 임상 평가 방법 및 진단 방법에 의해 확인하고, 이들에게 치료 유효량의 특정 병원체 또는 암 세포와 상호작용하는 리간드/수용체 특이성 교환기를 제공한다. 본원에 기술한 리간드/수용체 특이성 교환기는 예방을 목적으로 질병에 걸릴 위험이 있는 모든 동물에게 투여할 수 있지만, 질병에 걸리 위험이 높은 군(예를 들어, 소아, 노인 및 병원체와 근접 접촉하는 부류)에 속하는 개체에게만 리간드/수용체 특이성 교환기를 투여하는 것이 바람직하다. 상기한 바와 같이, 질병에 걸릴 위험이 높은 개체는 현재 이용할 수 있는 임상 기법 및 진단 기법으로 확인할 수 있다.
하기 절은 박테리아, 기생충, 균류, 곰팡이, 바이러스 및 암 세포의 수용체와 상호작용하는 여러 유형의 리간드/수용체 특이성 교환기에 관해 상세히 설명한다.
병원체상의 수용체와 상호작용하는 리간드/수용체 특이성 교환기
병원체 상의 수용체와 상호작용하는 리간드/수용체 특이성 교환기는 다양한 화학 구조를 보유하나, 일반적인 의미에서 이들은 상기 수용체에 결합하는 하나 이상의 영역(특이성 도메인) 및 병원체 또는 독소의 에피토프에 특이적인 항체와 상호작용하는 하나 이상의 영역(항원성 영역)을 보유하는 것을 특징으로 한다. 바람직한 리간드/수용체 특이성 교환기는 펩티드이나, 몇몇 구체예는 유도체화되거나 변경된 펩티드 또는 펩티드유사체 구조를 포함한다. 예를 들어, 전형적인 펩티드계 리간드/수용체 특이성 교환기는 변경되어 펩티드 상에서 보통 발견되지 않는 치환체를 보유하거나, 보통 펩티드 상에서 발견되나 비일반적인 영역에 혼입되는 치환체를 보유한다. 이런 맥락에서, 펩트드계 리간드/수용체 특이성 교환기는 아세틸화, 아실화 또는 아민화될 수 있으며, 펩티드를 변경하기 위해 펩티드상에 포함될 수 있는 치환체는 H, 알킬, 아릴, 알케닐, 알키닐, 방향족, 에테르, 에스테르, 치환되지 않거나 치환된 아민, 아미드, 할로겐 또는 치환되지 않거나 치환된 설포닐 또는 5원 또는 6원 지방족 고리 또는 방향족 고리(이로 제한되는 것은 아님)를 포함한다. 따라서, 본원에 사용한 용어 "리간드/수용체 특이성 교환기"는 변경되거나 변경되지 않은 펩티드 구조 뿐만 아니라 펩티드유사체와 화학 구조를 포함하는 넓은 의미로 사용된다.
여러가지 방법을 이용하여 펩티드계 리간드/수용체 특이성 교환기와 비슷한 펩티드유사체를 제조할 수 있다. 펩티드의 생물학적 생성에 사용되는 천연 아미노산은 모두 L-형이다. 합성 펩티드는 L-아미노산, D-아미노산 또는 2가지 상이한 형태의 아미노산의 여러 조합에 의해 생성될 수 있다. 펩티드의 형태와 바람직한 특징을 모방하나 바람직하지 않은 특징, 예를 들어 가요성(형태의 상실)과 결합 분해를 회피하는 합성 화합물은 "펩티드유사체"로 공지되어 있다[참조: 예를 들어, Spatola, A.F. Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, peptides and Proteins(Weistein, B, Ed.), Vol. 7, pp. 267-357, Marcel Dekker, New York(1983) - 엔케팔린 유사체내 아미드 치환체로서 메틸렌티오 바이오이소스테레 [CH2S]의 이용을 기술함; Szelke 등, In Peptides: Structure and Function, Proceedings of the Eighth American Peptide Symposium(Hruby and Rich, Eds.); pp. 579-582, Pierce Chemical Co., Rockford, III. (1983) - 앤지오텐시노겐으로부터 유도된 6-13 옥타펩티드내 Leu-Val 아미드 결합에서 메틸렌아미노 [CH2NH] 및 히드록시에틸렌 [CHOHCH2] 바이오이소스테레 둘 다를 보유하는 레닌 억제제를 기술함].
일반적으로, 리간드/수용체 특이성 교환기와 비슷한 펩티드유사체의 설계 및 합성은 리간드/수용체 특이성 교환기의 서열 및 바람직한 리간드/수용체 특이성 교환기(예를 들어, 최빈 모사 펩티드)의 형태 데이타(예를 들어, 결합 길이와 결합 각과 같은 기하학적 데이타)로 부터 출발하고, 이러한 데이타를 이용하여 펩티드유사체로 설계되어야 하는 기하구조를 결정하는 것을 포함한다. 이러한 단계를 수행하기 위한 여러가지 방법 및 기법이 당업계에 공지되어 있으며, 그중 임의의 방법이나 기법을 사용할 수 있다[참조: 예를 들어, Farmer, P. S., Drug Design(Ariens, E. J. ed.), Vol. 10, pp. 119-143(뉴욕, 런던, 토론토, 시드니 및 샌프란시스코의 아카데미 출판사) (1980); Farmer 등, in TIPS, 9/82, pp. 362-365; Verber 등, in TINS, 9/85, pp. 392-396; Kaltenbronn 등, in J. Med. Chem. 33: 838-845 (1990); 및 Spatola, A.F., in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids. Peptides, and Proteins, Vol. 7, pp. 267-357, Ch. 5, "Peptide BackboneModifications: A Structure-Activity Analysis of Peptides Containing Amide Bond Surrogates. Conformational Constraints, and Relations"(B. Weisten, ed.; Marcell Dekker: New York. pub)(1983); Kemp, D. S., "Peptidomimetics and the Template Approach to Nucleation of- sheets and- helices in Peptides", Tibech, Vol. 8, pp. 249-255 (1990)]. 추가의 교시는 미국 특허 제5,288,707호, 제5,552,534호, 제5,811,515호, 제5,817,626호, 제5,817,879호, 제5,821,231호 및 제5,874,529호에서 확인할 수 있다. 일단 펩티드유사체가 설계되면, 펩티드 화학 및/또는 유기 화학 분야의 통상적인 기법을 이용하여 제조할 수 있다.
몇몇 구체예는 다수의 특이성 도메인 및/또는 다수의 항원성 도메인을 포함한다. 다수의 특이성 도메인 및/또는 항원성 도메인을 보유하는 리간드/수용체 특이성 교환기의 한 유형은 "다량체화된 리간드/수용체 특이성 교환기"라 칭하는데, 그 이유는 동일한 분자 상에 직렬로 나타나는 다수의 특이성 도메인 및/또는 항원성 도메인을 보유하기 때문이다. 예를 들어, 다량체화된 특이성 도메인은 한가지 유형의 수용체와 상호작용하는 2 이상의 리간드, 병원체 상의 상이한 유형의 수용체와 상호작용하는 2 이상의 리간드 및 상이한 병원체 상의 상이한 유형의 수용체와 상호작용하는 2 이상의 리간드를 보유할 수 있다.
유사하게, 다량체화된 항원성 도메인은 병원체의 동일한 에피토프 또는 병원체의 상이한 에피토프로 이루어진 다량체를 보유하도록 구성될 수 있는데, 이는 다량체화될 수도 있다. 즉, 몇몇 다량체화된 항원성 도메인은 다가인데, 그 이유는 동일한 에피토프가 반복되기 때문이다. 대조적으로, 몇몇 다량체화된 항원성 도메인은 동일한 분자상에 직렬로 존재하는 하나 이상의 에피토프를 보유하나, 이들 에피토프들은 상이하다. 이 관점에서, 이들 항원성 도메인은 다량체화되나 다가는 아니다. 또한, 몇몇 다량체화된 항원성 도메인은 상이한 에피토프를 보유하도록 구성되나, 상이한 에피토프 자신들은 다가인데, 그 이유는 각각의 에피토프 유형이 반복되기 때문이다.
몇몇 리간드/수용체 특이성 교환기는 특이성 도메인 및 항원성 도메인 이외에, 정제를 용이하게 하는 서열, 더 큰 가요성을 제공하여 입체 장애를 감소시키는 링커, 및 리간드/수용체 특이성 교환기에 더 큰 안정성을 제공하는 서열(예를 들어, 프로테아제 분해에 대한 내성) 또는 분해를 촉진하는 서열(예를 들어, 프로테아제 인식 부위)과 같은 기타 요소를 포함한다. 예를 들어, 리간드/수용체 특이성 교환기는 펩티드의 세포질 방출을 촉진하는 절단가능한 신호 서열 및/또는 항체 컬럼, 글루타치온 컬럼 및 금속 컬럼 상에서의 정제를 용이하게 하는 절단가능한 서열을 포함할 수 있다.
리간드/수용체 특이성 교환기는 분자의 가요성을 촉진하여 입체 장애를 감소시키거나, 리간드/수용체 특이성 교환기가 지지체 또는 기타 분자에 부착될 수 있도록 하는 요소를 포함할 수 있다. 이들 요소는 총괄적으로 "링커"라 칭한다. 리간드/수용체 특이성 교환기와 결합할 수 있는 링커의 한 유형은 예를 들어, 아비딘 또는 스트렙타비딘(또는 그들의 리간드 - 비오틴)이다. 비오틴-아비딘/스트렙타비딘의 결합을 통해, 다수의 리간드/수용체 특이성 교환기는 함께 연결될 수 있거나(예를 들어, 수지와 같은 지지체를 통해 또는 직접적으로) 또는 개개의 특이성 도메인 및 항원성 도메인이 연결될 수 있다. 리간드/수용체 특이성 교환기내에 포함될 수 있는 링커의 다른 예는 "8 링커"라 칭하는데, 그 이유는 상기 링커가 8 파지에서 발견되는 서열을 보유하기 때문이다. 바람직한 8 서열은 상기 파지의 가요성 팔에 상응하는 서열이다. 이들 서열은 리간드/수용체 특이성 교환기내에 포함되어(예를 들어, 특이성 도메인과 항원성 도메인 사이 또는 특이성 및/또는 항원성 도메인의 다량체 사이) 더 큰 가요성을 제공함으로써 입체 장애를 감소시킬 수 있다.
또한, 리간드/수용체 특이성 교환기는 프로테아제 분해에 대한 내성을 제공하거나 프로테아제 분해를 촉진하는 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 리간드/수용체 특이성 교환기내에 다수의 시스테인을 혼입시킴으로써 프로테아제 분해에 대한 더 큰 내성을 획득할 수 있다. 리간드/수용체 특이성 교환기의 이들 구체예는 연장된 기간 동안 신체 내에서 유지되는 것으로 생각되며, 이는 몇몇 치료적 용도에서 유익할 수 있다. 대조적으로, 리간드/수용체 특이성 교환기는 신속한 분해를 촉진하는 서열을 포함하여 신체로부터 신속한 제거를 촉진할 수 있다. 세린, 시스테인 및 아스파르트산 프로테아제를 위한 인식 부위로서 작용하는 다수의 서열이 공지되어 있으며, 리간드/수용체 특이성 교환기내에 포함될 수 있다.
하기 절은 특이성 도메인을 더 상세히 설명한다.
특이성 도메인
리간드/수용체 특이성 교환기와 함께 사용할 수 있는 특이성 도메인의 유형은 다양한데, 그 이유는 매우 많은 수의 리간드가 박테리아, 기생충, 균류, 곰팡이, 바이러스 및 암 세포 상의 수용체와 상호작용하는 것으로 공지되어 있기 때문이다. 예를 들어, 많은 유형의 박테리아, 기생충, 균류, 곰팡이, 바이러스 및 암 세포는 외세포성 매트릭스 단백질과 상호작용한다. 따라서, 바람직한 특이성 도메인은 외세포성 매트릭스 단백질 내에 존재하는 펩티드 서열을 보유하는 하나 이상의 리간드를 포함한다. 즉, 특이성 도메인은 예를 들어, 피브리노겐, 콜라겐, 비트로넥틴, 라미닌, 플라스미노겐, 트롬보스폰딘 및 피브로넥틴에서 확인된 펩티드 서열을 보유하는 리간드를 보유할 수 있다.
학자들은 수개의 수용체와 상호작용하는 외세포성 매트릭스 단백질의 영역을 지도화하였다[참조: 예를 들어, McDevvit 등, Eur. J. Biochem., 247:416-424 (1997); Flock, Molecular Med. Today, 5: 532 (1999); 및 Pei 등, Infect. and Immun. 67: 4525 (1999)]. 몇몇 수용체는 외세포성 매트릭스 단백질의 동일한 영역에 결합하며, 몇몇은 중첩하는 결합 도메인을 보유하며, 몇몇은 함께 상이한 영역에 결합한다. 바람직하게는, 특이성 도메인을 구성하는 리간드는 외세포성 매트릭스 단백질에 부착하는데 관여하는 것으로 확인된 아미노산 서열을 보유한다. 그러나, 병원체 상의 임의의 수용체에 대한 공지된 리간드의 무작위 단편은 리간드/수용체 특이성 교환기를 생성하는데 사용될 수 있으며, 이들 후보 리간드/수용체 특이성 교환기는 병원체 상의 수용체와 상호작용하는 분자를 확인하기 위한 이하 기술되는 특성화 분석에서 스크리닝될 수 있다.
몇몇 특이성 도메인은 박테리아 부착 수용체, 예를 들어 외세포성 피브리노겐 결합 단백질(Efb), 콜라겐 결합 단백질, 비트로넥틴 결합 단백질, 라미닌 결합 단백질, 플라스미노겐 결합 단백질, 트롬보스폰딘 결합 단백질, 세포 응집 인자A(ClfA), 세포 응집 인자 B(ClfB), 피브로넥틴 결합 단백질, 코아굴라제 및 외세포성 부착 단백질(이로 제한되는 것은 아님)과 상호작용하는 리간드를 보유한다. 피브리노겐의 감마 사슬의 C-말단부에 상응하는 아미노산 서열을 보유하는 리간드는 ClfA, 스타필로콕쿠스 아우레우스 부착 수용체에 대한 피브리노겐의 결합을 경쟁적으로 억제하는 것으로 밝혀졌다[참조: McDevvit 등, Eur. J. Biochem., 247: 416-424 (1997)]. 또한, 스타필로콕쿠스 아우레우스 유기체는 피브리노겐의 알파 사슬에 결합하는 Efb, 피브리노겐의-사슬 및-사슬과 상호작용하는 ClfB 및 피브리노겐의-사슬에 결합하는 Fbe와 같은 다수의 부착 수용체를 생성한다[참조: Pei 등, Infect. and Immun. 67: 4525 (1999)]. 따라서, 바람직한 특이성 도메인은 박테리아 부착 수용체에 결합할 수 있는 분자(예를 들어, 피브리노겐)내에 존재하는 서열의 3개 이상의 아미노산을 포함한다.
또한, 특이성 도메인은 바이러스 수용체와 상호작용하는 리간드를 포함할 수 있다. 몇몇 바이러스 수용체 및 상응하는 리간드는 공지되어 있으며, 이들 리간드 또는 이의 단편은 리간드/수용체 특이성 교환기내에 혼입될 수 있다. 예를 들어, Tong 등은 오리 B형 간염 바이러스 엔벨로프 단백질의 pre-S 도메인과 상호작용하는 170 kd 세포 표면 당단백질인 헤파드나바이러스 수용체를 확인하였으며(미국 특허 제5,929,220호), Maddon 등은 T 세포 표면 단백질 CD4(또는 가용형 T4)가 HIV의 gp120과 상호작용함을 확인하였다(미국 특허 제6,093,539호). 따라서, 바이러스 수용체와 상호작용하는 특이성 도메인은 오리 B형 간염 바이러스 엔벨로프 단백질의 pre-S 도메인의 영역(예를 들어, 아미노산 잔기 80-102 또는 80-104) 또는 HIV의gp120과 상호작용하는 T 세포 표면 단백질 CD4(또는 T4의 가용형)(예를 들어, CD4/T4의 외세포성 도메인 또는 이의 단편)을 포함할 수 있다. 바이러스 수용체에 대한 다수의 리간드가 존재하며, 이들 분자 또는 이들의 단편은 특이성 도메인으로서 사용할 수 있다.
또한, 특이성 도메인은 암 세포 상에 존재하는 수용체와 상호작용하는 리간드를 포함할 수 있다. 프로토-온코진 HER-2/neu(C-erbB2)는 티로신 키나제 부류의 표면 성장 인자 수용체, p185HER2를 암호화한다. 유방암 환자의 20 내지 30%는 유전자 증폭에 의해 HER-2/neu(C-erbB2)를 암호화하는 유전자를 과발현한다. 따라서, HER-2/neu(C-erbB2)에 대한 리간드를 암호화하는 특이성 도메인을 포함하는 리간드/수용체 특이성 교환기가 바람직한 구체예이다. 또한, 다수 유형의 암 세포는 인테그린 수용체를 과발현하거나 차등발현한다. 다수의 바람직한 구체예는 인테그린 수용체와 상호작용하는 특이성 도메인을 포함한다. 인테그린은 외세포성 매트릭스 단백질과 우선적으로 상호작용하지만, 이들 수용체는 다른 리간드, 예를 들어 인바신, RGD를 함유하는 펩티드(즉, 아르기닌-글리신-아스파르테이트) 및 화학물질과 상호작용하는 것도 공지되어 있다[참조: 예를 들어, 미국 특허 제6,090,944호 및 제6,090,388호; Brett 등, Eur J Immunol, 23: 1608 (1993)]. 인테그린 수용체에 대한 리간드는 비트로넥틴 수용체, 라미닌 수용체, 피브로넥틴 수용체, 콜라겐 수용체, 피브리노겐 수용체,수용체,수용체,수용체,수용체, 및수용체를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 또한, 하기 표 I-1 및 II-2은 몇몇 바람직한 특이성 도메인의 목록을 제시한다. 상기한 특이성 도메인은예시적인 목적을 위해 제공한 것이며, 본원의 구체예와 함께 사용할 수 있는 특이성 도메인의 범위를 어떤 방식으로든 제한하려는 의도는 없다.
하기 절은 항원성 도메인을 좀 더 구체적으로 기술한다.
항원성 도메인
또한, 리간드/수용체 특이성 교환기내에 사용할 수 있는 항원성 도메인은 상당히 다양한데, 그 이유는 병원체 또는 독소가 다수의 상이한 에피토프를 제시할 수 있기 때문이다. 즉, 리간드/수용체 특이성 교환기 내로 혼입될 수 있는 항원성 도메인은 박테리아, 균류, 식물, 곰팡이 , 바이러스, 암 세포 및 독소에 의해 제시된 에피토프를 포함한다. 바람직한 항원성 도메인은 자연 획득 면역 또는 백신화에 의해 환자 내에 이미 존재하는 병원체의 에피토프를 포함한다. 예를 들어, 소아 질병을 유발하는 병원체의 에피토프는 항원성 도메인으로 사용할 수 있다.
몇몇 구체예는 환자에게 투여된 항체와 상호작용하는 항원성 도메인을 보유한다. 예를 들어, 특이성 교환기 상의 항원성 도메인과 상호작용하는 항체는 특이성 교환기와 동시 투여할 수 있다. 또한, 리간드/수용체 특이성 교환기와 상호작용하는 항체는 보통 환자 내에 존재하지 않을 수 있으나, 환자는 생물학적 물질(예를 들어, 혈청, 혈액 또는 조직)의 도입에 의해 항체를 획득한다. 예를 들어, 수혈받은 환자는 다수의 항체를 획득하는데, 이중 일부는 리간드/수용체 특이성 교환기의 항원성 도메인과 상호작용할 수 있다. 리간드/수용체 특이성 교환기에 사용할 수 있는 몇몇 바람직한 항원성 도메인은 바이러스 에피토프, 예를 들어 허피스 심플렉스 바이러스, B형 간염 바이러스, TT 바이러스 및 폴리오바이러스를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.
몇몇 구체예에서, 항원성 도메인은 "높은 역가의 항체"에 의해 인식되는 병원체 또는 독소의 에피토프를 포함한다. 병원체 또는 독소의 에피토프가 높은 역가의 항체에 의해 인식될 수 있는지 여부를 결정하기 위한 방법은 후술되어 있다. 리간드/수용체 특이성 교환기의 항원성 도메인 내에 포함될 수 있는 병원체의 에피토프는 스웨덴 특허 9901601-6호, 미국 특허 제5,869,232호, 및 문헌[참조: Mol. Immunol. 28: 719-726 (1991) 및 J. Med. Virol. 33: 248-252 (1991)]에 기술된 펩티드 서열 상의 에피토프를 포함한다. 하기 표 II는 몇몇 바람직한 항원성 도메인의 아미노산 서열을 제공한다.
하기 표 II는 리간드/수용체 특이성 교환기의 제조를 더 상세히 기술한다.
박테리아, 기생충, 균류, 곰팡이, 바이러스 및 암 세포 상의 수용체와 상호작용하는 리간드/수용체 특이성 교환기의 제조 방법
몇몇 구체예에서, 특이성 도메인 및 항원성 도메인은 별도로 제조되어, 후속적으로 함께 결합되며(예를 들어, 링커에 의하거나 또는 통상적인 담체 분자와의 결합을 통해), 다른 구체예에서, 특이성 도메인 및 항원성 도메인은 동일한 분자의 부분으로 제조된다. 예를 들어, 상기 표 I-1 및 I-2에 적시한 특이성 도메인중 임의의 도메인은 상기 표 II의 항원성 도메인중 임의의 도메인에 결합될 수 있다. 특이성 도메인 및 항원성 도메인은 별도로 제조되고, 링커 또는 담체 분자(예를 들어, 비오티닐화된 특이성 도메인, 스트렙타비딘, 및 비오티닐화된 항원성 도메인을 포함하는 복합체)를 통해 결합되지만, 리간드/수용체 특이성 교환기는 융합 단백질로서 제조되는 것이 바람직하다. 따라서, 바람직한 구체예는 상기 표 II의 항원성도메인중 임의의 도메인에 결합된 상기 표 I-1 및 I-2에 적시된 특이성 도메인중 임의의 도메인을 포함하는 융합 단백질을 포함한다.
리간드/수용체 특이성 교환기는 단백질 공학, 단백질 화학, 유기 화학 및 분자 생물학의 통상적인 방법에 따라 생성할 수 있다. 또한, 몇몇 기업들은 주문형 펩티드를 제조하고, 리간드/수용체 특이성 교환기는 이러한 바람직한 리간드/수용체 특이성 교환기의 서열을 상기 회사에게 제공하고, 특정 사양(예를 들어, 스위스의 바켐 아게)에 따라 상기 제제를 제조하는데 기여하는 그들의 능력을 이용함으로써 획득할 수 있다. 바람직하게는, 리간드/수용체 특이성 교환기는 당업계에 공지된 기법, 예를 들어 문헌[참조: Merrifield 등, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 (1964), Houghten 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 51-32 (1985), Stewart 및 Young, Solid phase peptide systhesis, Pierce Chem Co., Rockford, IL (1984), 및 Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman & Co., NY]에 기술된 것과 같은 기법을 이용하여 화학 합성법에 의해 ㅡ 제조한다.
한 방법으로, 고체 상 펩티드 합성은 어플라이드 바이오시스템즈 430A 펩티드 합성기(캘리포니아 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템즈)를 이용하여 수행한다. 각각의 합성은 p-메틸벤질히드릴아민 고체 상 지지체 수지(캔터기 루이스빌 소재의 펩티드 인터내쇼날)를 이용하여, 펩티드가 산 가수분해에 의해 고형 지지체로부터 분해 절단될 때, 카르복시 말단 아미드를 생성한다. 사용전에, 카르복시 말단 아미드는 제거할 수 있고, 리간드/수용체 특이성 교환기는 고성능 액체크로마토그래피(예를 들어, PepS-15 C18 컬럼(스웨덴 웁살라 소재의 파마시아)를 이용하는 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC))를 이용하여 정제하고, 어플라이드 바이오시스템스 473A 펩티드 서열결정기로 서열결정하였다. 대체적인 합성 방법은 자동화된 펩티드 합성기(독일 투빈겐 소재의 시로 멀티신테크) 및 9-플루오레닐메톡시카르보닐(fmoc) 보호된 아미노산(매사추세츠 베드포드 소재의 밀리젠)을 이용하는 방법이다.
리간드/수용체 특이성 교환기는 화학적으로 합성될 수도 있지만, 당업계에 공지된 기법을 이용하는 재조합 DNA 기법에 의해 이들 폴리펩티드를 제조하는 것이 더 효율적일 수 있다. 이러한 방법을 이용하여 리간드/수용체 특이성 교환기를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 적합한 전사 및 해독 조절 신호를 함유하는 발현 벡터를 구성할 수 있다. 이들 방법은, 예를 들어 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 유전자 재조합을 포함한다. 대안으로, 리간드/수용체 특이성 교환기를 암호화하는 RNA는 예를 들어, 합성기를 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 예를 들어, 문헌[참조: Gait, M. J., Oligonucleotide Synthesis (1984), IRL Press, Oxford.]에 기술된 기법을 참고할 수 있다.
여러가지 숙주 발현 벡터 시스템을 사용하여 리간드/수용체 특이성 교환기를 발현시킬 수 있다. 리간드/수용체 특이성 교환기가 가용성 분자인 경우, 이는 배양물, 즉 펩티드 또는 폴리펩티드가 분비되지 않는 경우 숙주 세포로부터, 펩티드 또는 폴리펩티드가 세포에 의해 분비되는 경우 배양 배지로부터 회수할 수 있다. 그러나, 상기 발현 시스템은 막 결합 리간드/수용체 특이성 교환기를 발현하는 조작된 숙주 세포를 포함한다. 이러한 발현 시스템으로부터 리간드/수용체 특이성 교환기의 정제 또는 농축은 적합한 세정제와 지질 미셀 및 당업자에게 널리 알려진 방법을 이용하여 수행할 수 있다.
사용할 수 있는 발현 시스템으로는 리간드/수용체 특이성 교환기를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아(예를 들어, 이. 콜리 또는 비. 섭틸리스(B. subtilis); 리간드/수용체 특이성 교환기를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모(예를 들어, 사카로마이세스 피치아(Saccharomyces Pichia)); 리간드/수용체 특이성 교환기를 암호화하는 핵산을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 바쿨로바이러스(Baculovirus))로 감염된 곤충 세포 시스템; 또는 리간드/수용체 특이성 교환기를 암호화하는 핵산을 함유하는 재조합 발현 구성물을 보유하는 포유류 세포 시스템(예를 들어, COS, CHO, BHK, 293, 3T3)과 같은 미생물을 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
박테리아 시스템에서, 다수의 발현 벡터는 리간드/수용체 특이성 교환기에 대해 의도된 용도에 따라 유익하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 대용량이 바람직한 경우(예를 들어, 리간드/수용체 특이성 교환기의 약학 조성물의 생성), 용이하게 정제되는 융합 단백질 생성물의 높은 수준의 발현을 유도하는 벡터가 바람직할 수 있다. 이러한 벡터로는 이. 콜리 발현 벡터 pUR278[참조: Ruther 등, EMBO J. 2: 1791 (1983) - 리간드/수용체 특이성 교환기 암호 서열이 각각 lacZ 암호 영역을보유한 프레임내 벡터 내로 연결되어 융합 단백질이 생성됨]; pIN 벡터[참조: Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res., 13: 3101-3109 (1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 264: 5503-5509 (1989)] 등을 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 또한, pGEX 벡터를 사용하여 글루타치온 S-트랜스퍼라제(GST)와의 융합 단백질로서 외래 폴리펩티드를 사용할 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이며, 글루타치온-아가로즈 비드에 대한 흡착후, 유리 글루타치온의 존재 하에 용출시킴으로써 용균된 세포로부터 정제할 수 있다. pGEX 벡터는 트롬빈 또는 Xa 인자 프로테아제 절단 위치를 포함하도록 구성함으로써 클로닝된 표적 유전자를 GST 부분으로부터 방출시킬 수 있다.
곤충 시스템에서, 오토그라파 캘리포니카(Autographa californica) 핵 다각체병 바이러스(AcNPV)를 벡터로 이용하여 외래 유전자를 발현시킬 수 있다. 상기 바이러스는 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포에서 성장한다. 리간드/수용체 특이성 교환기 유전자 암호 서열은 바이러스의 비필수 영역(예를 들어, 다각체 단백질(폴리헤드린) 유전자)내에 개별적으로 클로닝되어 AcNPV 프로모터(예를 들어, 폴리헤드린 프로모터)의 조절 하에 둘 수 있다. 리간드/수용체 특이성 교환기 유전자 암호 서열의 성공적인 삽입은 폴리헤드린 유전자의 불활성화와 비폐색된 재조합 바이러스의 생성(즉, 다각체 단백질 유전자에 의해 암호화된 단백질성 코트가 없는 바이러스)을 초래할 것이다. 이어서, 이들 재조합 바이러스를 이용하여 삽입된 유전자가 발현될 스포도프테라 프루기페르다 세포를 감염시킨다[참조: 예를 들어, Smith 등, J. Virol. 46: 584 (1983); 및 미국 특허제4,215,501호(Smith)].
포유류 숙주 세포에서, 다수의 바이러스계 발현 시스템을 사용할 수 있다. 발현 벡터로서 아데노바이러스를 사용하는 경우, 리간드/수용체 특이성 교환기를 암호화하는 핵산 서열은 아데노바이러스 전사/해독 조절 복합체, 예를 들어 후기 프로모터 및 3자(tripartite) 리더 서열에 연결될 수 있다. 이어서, 상기 키메라 유전자는 시험관내 또는 생체내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈 내로 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈내 비필수 영역(예를 들어, 영역 E1 또는 E3)에서의 삽입은 감염된 숙주 내에서 리간드/수용체 특이성 교환기 유전자 생성물을 발현할 수 있으며, 생존가능한 재조합 바이러스를 생성시킬 것이다[참조: 예를 들어, Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655-3659 (1984)]. 또한, 특정 개시 신호가 삽입된 리간드/수용체 특이성 교환기 뉴클레오티드 서열의 효율적인 해독에 필요할 수 있다(예를 들어, ATG 개시 코돈 및 인접 서열). 대부분의 경우에서, 아마도 ATG 개시 코돈을 포함하는 외인성 해독 조절 서열이 제공되어야 한다. 또한, 개시 코돈은 바람직한 암호 서열의 리딩 프레임을 보유하고 있는 상태여서 완전한 삽입물의 해독을 보장하여야 한다. 이들 외인성 해독 조절 신호 및 개시 코돈은 다양한 천연원 및 합성원에서 유래한 것일 수 있다. 또한, 발현 효율은 적합한 전사 증강 요소, 해독 종결자 등을 포함시켜 증강시킬 수 있다[참조: Bittner 등, Methods in Enzymol., 153: 516-544 (1987)].
또한, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나, 유전자 생성물을 바람직한 특정 형태로 변경 및 가공하는 숙주 세포 균주를 선택할 수 있다. 이러한 단백질 생성물의변경(예를 들어, 당화) 및 가공(예를 들어, 절단)은 몇몇 구체예에서 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 생성물의 해독후 가공 및 변경을 위한 특징적이며 특이적인 메카니즘을 보유한다. 적합한 세포주 또는 숙주 시스템을 선택하여 발현된 외래 단백질의 올바른 변경 및 가공을 보장할 수 있다. 이를 달성하기 위해, 일차 전사체의 적합한 가공, 유전자 생성물의 인산화 및 당화를 위한 세포 기구를 보유하는 진핵 숙주 세포를 사용할 수 있다. 이러한 포유동물 숙주 세포의 예로는 CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3 및 WI38을 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
재조합 단백질의 장기간의 고 수율 생성을 위해서는, 발현이 안정적인 것이 바람직하다. 예를 들어, 상기한 리간드/수용체 특이성 교환기를 안정하게 발현하는 세포주를 조작할 수 있다. 바이러스 복제 원점을 함유하는 발현 벡터를 이용하는 것 보다는, 적절한 발현 조절 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선택성 마커에 의해 조절된 DNA로 형질전환할 수 있다. 외래 DNA의 도입후, 조작된 세포는 농축 배지에서 1-2일 동안 성장시키고, 이어서 선택성 배지로 교환한다. 재조합 플라스미드내 선택성 마커는 선택에 대한 내성을 보유하며, 세포가 그들의 염색체 내로 플라스미드를 안정하게 통합하고, 성장하여 차례로 클로닝되고 세포주로 성장하는 유전자좌를 형성하게 한다. 이 방법은 리간드/수용체 특이성 교환기를 발현하는 세포주를 조작하는데 유익하게 사용할 수 있다.
다수의 선택 시스템을 사용할 수 있는데, 이들의 예로는 허피스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제[참조: Wigler 등, Cell 11: 223 (1977)], 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제[참조: Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026 (1962)], 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제[참조: Lowy 등, Cell 22: 817 (1980)] 유전자를 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니며, 이들 유전자는 각각 tk.sup.-세포, hgprt.sup.-세포 또는 aprt.sup.-세포 내에서 사용할 수 있다. 또한, 항대사산물 내성은 하기 유전자를 위한 선택의 기초로서 사용할 수 있다: 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr[참조: Wigler 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567 (1980); O'Hare 등, Proc. Natl. Sci. USA 78: 1527 (1981)]; 마이코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt[참조: Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2027 (1981)]; 아미노글리코시드 G-418에 대한 내성을 부여하는 neo[참조: Colberre-Garapin 등, J. Mol. Biol. 150:1 (1981)]; 및 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro[참조: Santerre 등, Gene 30: 147 (1984)].
하기 절은 리간드/수용체 특이성 교환기 특성화 분석에 대해 더 구체적으로 기술한다.
리간드/수용체 상호작용 교환기의 특성화 분석
바람직하게는, 리간드/수용체 특이성 교환기는 수용체와 상호작용할 수 있는 그들의 능력 및/또는 환자 내에 존재할 수 있는 항체와 상호작용할 수 있는 그들의 능력에 대해 분석한다. 본원에 사용한 용어 "특성화 분석"은 리간드/수용체 특이성 교환기에 대해 이루어지는 수용체(예를 들어, 박테리아, 바이러스, 곰팡이 또는 균류에 존재하는 표면 수용체) 또는 항체(예를 들어, 병원체 상에서 확인되는 에피토프를 인식하는 항체)와 상호작용하는 리간드/수용체 특이성 교환기의 능력 또는 병원체의 증식을 수행하는 리간드/수용체 특이성 교환기의 능력을 평가하는 검정, 실험 또는 분석을 의미한다. 본원에 사용한 용어 "특성화 분석"은 결합 연구(예를 들어, 효소 면역분석(EIA), 효소결합 면역분석(ELISA), 경쟁적 결합 분석, 컴퓨터 생성된 결합 분석, 지지체 결합된 결합 연구 및 하나 또는 두개의 하이브리드 시스템) 및 감염성 연구(예를 들어, 바이러스 감염, 번식 및 숙주 세포에 대한 부착의 감소)를 포함하는 의미이다.
바람직한 결합 분석은 다량체 제제를 이용한다. 다량체 제제의 한 형태는 지지체에 부착된 리간드/수용체 특이성 교환기 또는 이의 단편을 포함하는 조성물을 고려한다. 다른 형태의 다량체 제제는 지지체 상에 배치된 리간드/수용체 특이성 교환기의 항원성 도메인에 특이적인 항체 또는 수용체를 포함하는 조성물을 고려한다. 본원에 사용한 용어 "지지체"는 담체, 단백질, 수지, 세포 막, 또는 이러한 물질을 결합하거나 고정화하는데 사용된 임의의 거대분자 구조물일 수 있다. 고형 지지체로는 반응 트레이 웰의 벽, 시험관, 폴리스티렌 비드, 마그네틱 비드, 니트로셀룰로즈 스트립, 막, 미세입자, 예를 들어 라텍스 입자, 동물 세포, 듀라사이트(등록세포), 인공 세포 등을 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 또한, 리간드/수용체 특이성 교환기는 무기 지지체, 예를 들어 산화 규소 물질(예를 들어 규소 젤, 제올라이트, 규조토 또는 아민화된 유리)에 예를 들어 히드록시, 카르복시 또는 아미노기와 지지체 상의 반응성 기와의 공유 결합에 의해 결합될 수 있다.
몇몇 다량체 제제에서, 거대분자 지지체는 소수성 비공유 상호작용에 의해 리간드/수용체 특이성 교환기의 일부분, 수용체 또는 리간드와 상호작용할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 지지체의 소수성 표면은 플라스틱이나 폴리스티렌, 폴리에틸렌 또는 폴리비닐과 같은, 소수성 기가 연결된 다른 임의의 중합체이다. 또한, 리간드/수용체 특이성 교환기, 수용체 또는 리간드/수용체 특이성 교환기의 항원성 도메인에 특이적인 항체는 단백질 및/또는 올리고당류/다당류(예를 들어, 셀룰로즈, 전분, 글리코겐, 키토산 또는 아민화된 세파로즈)를 포함하는 지지체에 공유 결합될 수 있다. 이들 후자의 다량체 제제에서, 분자 상의 반응성 기, 예를 들어 히드록시기 또는 아미노기는 담체 상의 반응성 기에 결합하는 데 사용되어 공유 결합을 형성한다. 추가의 다량체 제제는 화학적으로 활성화되어 리간드/수용체 특이성 교환기, 수용체 또는 리간드/수용체 특이성 교환기의 항원성 도메인에 특이적인 항체를 부착시키는 다른 반응성 기를 보유하는 지지체를 포함한다. 예를 들어, 시아노겐 브로마이드 활성화된 매트릭스, 에폭시 활성화된 매트릭스, 티오 및 티오프로필 젤, 니트로페닐 클로로포르메이트 및 N-히드록시 석신이미드 클로로포르메이트 연결, 또는 옥시란 아크릴 지지체를 사용할 수 있다(시그마). 또한, 몇몇 구체예에서, 리포좀 또는 지질 이중층(천연 또는 합성)이 지지체로서 고려될 수 있으며, 리간드/수용체 특이성 교환기, 수용체 또는 리간드/수용체 특이성 교환기의 항원성 도메인에 특이적인 항체는 막 표면에 결합하거나 리포좀 공학의 기법에 의해 막 내로 혼입될 수 있다. 한 방법으로서, 리포좀 다량체 지지체는 상기 표면 상에 노출된 리간드/수용체 특이성 교환기, 수용체 또는 리간드/수용체 특이성 교환기의항원성 도메인에 특이적인 항체를 포함한다.
또한, 리간드/수용체 특이성 교환기, 수용체 또는 리간드/수용체 특이성 교환기의 항원성 도메인에 특이적인 항체와 지지체 사이에 적절한 길이의 링커(예를 들어, λ파지의 가요성 영역과 비슷하도록 조작된 "λ링커")의 삽입을 고려하여 가요성을 크게 증강시켜 지지체에 의해 나타날 수 있는 임의의 입체 장애를 극복할 수 있다. 최적 결합을 위한 링커의 적합한 길이의 선택은 본원에 기술한 특성화 분석에서 링커를 변화시키면서 부착된 분자를 스크리닝함으로써 확인할 수 있다.
리간드/수용체 특이성 교환기의 특성을 분석하기 위한 몇가지 방법은 상기한 다량체를 이용한다. 예를 들어, 지지체 결합된 리간드/수용체 특이성 교환기는 "유리" 부착 수용체와 접촉할 수 있고, 이러한 결합은 직접적으로(예를 들어, 표지된 접착 수용체를 이용하여) 또는 간접적으로(예를 들어, 부착 수용체에 대해 유도된 표지된 리간드를 이용함으로써) 결정할 수 있다. 따라서, 후보 리간드/수용체 특이성 교환기는 지지체 결합된 후보 리간드/수용체 특이성 교환기와 수용체의 결합에 의해 진정한 리간드/수용체 특이성 교환기로서 확인된다. 대안으로, 지지체 결합된 부착 수용체는 "유리" 리간드/수용체 특이성 교환기와 접촉할 수 있으며, 결합된 리간드/수용체 특이성 교환기의 양은 직접적으로(예를 들어, 표지된 리간드/수용체 특이성 교환기를 이용함으로써) 또는 간접적으로(예를 들어, 리간드/수용체 특이성 교환기의 항원성 도메인에 대해 유도되고 표지된 항체를 이용함으로써) 결정할 수 있다. 유사하게, 지지체 상에 배치된 리간드/수용체 특이성 교환기의 항원성 도메인에 특이적인 항체 및 표지된 리간드/수용체 특이성 교환기(또는 제2 검출 시약,예를 들어 표지된 수용체 또는 리간드/수용체 특이성 교환기에 대한 항체)를 이용함으로써, 리간드/수용체 특이성 교환기의 항원성 도메인에 결합할 수 있는 능력을 결정할 수 있다.
몇몇 특성화 분석은 표적 수용체 및 재유도성 항체와 상호작용할 수 있는 리간드/수용체 특이성 교환기의 능력을 평가하는 반면, 다른 특성화 분석은 리간드/수용체 특이성 교환기가 표적 수용체 및 재유도성 항체 둘 다에 결합할 수 있는 지 여부를 결정하도록 설계된다. 일반적으로, 특성화 분석은 (1) 시험관내 특성화 분석, (2) 세포성 특성화 분석 및 (3) 생체내 특성화 분석으로 분류할 수 있다.
하기 절에서는 각 유형의 특성화 분석에 대해 기술한다.
시험관내 특성화 분석
리간드/수용체 특이성 교환기가 특정 수용체에 결합하는지 여부 및 환자 내에서 확인된 항체가 상기 리간드/수용체 특이성 교환기에 결합할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 다수 유형의 시험관내 분석을 사용할 수 있다. 가장 간단한 방법은 상기 수용체를 지지체(예를 들어, 페트리 디쉬)에 결합시키며, 리간드/수용체 특이성 교환기와 수용체의 결합은 상기한 바와 같이 직접적으로 또는 간접적으로 모니터링하는 방법이다. 유사하게, 리간드/수용체 특이성 교환기의 항원성 도메인에 대해 유도된 일차 항체(예를 들어, 환자 내에서 발견된 항체)는 지지체에 결합될 수 있으며, 리간드/수용체 특이성 교환기와 일차 항체의 결합은 직접적으로(예를 들어, 표지된 리간드/수용체 특이성 교환기를 이용함으로써) 또는 간접적으로(예를 들어, 상기 일차 항체에 의해 인식되는 에피토프와 경쟁하지 않는 리간드/수용체특이성 교환기 상의 에피토프와 상호작용하는 표지된 2차 항체 또는 표지된 수용체를 이용함으로써) 결정할 수 있다.
다른 방법은 샌드위치형 분석인데, 이때 수용체는 지지체에 결합되고, 리간드/수용체 특이성 교환기는 수용체에 결합되며, 일차 항체는 리간드/수용체 특이성 교환기에 결합된다. 표지된 일차 항체가 사용되는 경우, 수용체/특이성 교환기/일차 항체 복합체의 존재는 직접적으로 결정할 수 있다. 또한, 수용체/특이성 교환기/일차 항체 복합체의 존재는 예를 들어 상기 리간드/수용체 특이성 교환기에 대한 일차 항체의 결합을 방해하지 않는 에피토프에서 일차 항체와 상호작용하는 표지된 이차 항체를 이용함으로써 간접적으로 결정할 수 있다. 몇몇 경우, 표지되지 않은 이차 항체와 반응하는 표지된 삼차 항체를 이용하여 수용체/특이성 교한기/일차 항체/이차 항체/삼차 항체 복합체를 형성하는 것이 바람직할 수도 있다.
하기 실시예는 피브리노겐의 C-말단 도메인으로부터 유도된 특이성 도메인이 피브리노겐에 대한 세포 응집 인자(Clf)의 결합을 억제하는지 여부를 결정하기 위해 수행한 특성화 분석을 기술한다.
실시예 1
본 실시예에서, 피브리노겐(Fib)의 C-말단 도메인에 상응하는 수개의 펩티드는 피브리노겐에 대한 세포 응집 인자(Clf)의 결합을 차단할 수 있는 그들의 능력에 대해 분석하였다(참조: 표 III). 이들 펩티드는 fmoc 화학(독일의 시로 멀티신테크)을 이용하는 펩티드 합성에서의 표준 기법을 이용하여 제조하였다. 바람직하게는, 상기 펩티드는 역상 HPLC로 정제하였다. 이어서, 경쟁 효소 면역분석을 수행하여 상기 펩티드가 Clf와 피브리노겐 사이의 상호작용을 차단할 수 있는지 여부를 결정하였다. 이들 실험의 결과는 하기 표 III에 나타냈다. Clf와 피브리노겐 사이의 상호작용을 억제하는 것으로 확인된 가장 작은 펩티드는 HLGGAKQAGD(서열 번호 124)였다. 이들 펩티드의 최초 두 아미노산의 알라닌과 라이신으로의 치환은 Clf와 피브리노겐 사이의 상호작용을 차단할 수 있는 펩티드의 능력에 유의적인 효과를 보유하였다(예를 들어, 상기 펩티드 ALGGAKQAGD(서열 번호 123)는 Clf/피브리노겐 상호작용을 차단할 수 없었다).
하기 실시예는 리간드/수용체 특이성 교환기와 ClfA 수용체를 보유하는 박테리아와의 상호작용 여부을 결정하기 위해 수행한 특성화 분석을 기술한다.
실시예 2
피브리노겐 감마 사슬 서열의 여러 가지 영역에 상응하는 특이성 도메인(길이 약 20개의 아미노산)을 보유하는 리간드/수용체 특이성 교환기는 fmoc 화학(독일의 시로 멀티신테크)을 이용하는 펩티드 합성에서의 표준 기법을 이용하여 제조하고, 이들 리간드/수용체 특이성 교환기는 그들의 항원성 도메인에 특이적인 항체와 ClfA 수용체를 결합할 수 있는 그들의 능력에 대해 분석하였다. 이들 리간드/수용체 특이성 교환기의 서열은 표 IV-1 및 IV-2에 적시하였으며, 서열 목록(서열 번호 60-103)에 제공하였다. 이 분석에 사용된 리간드/수용체 특이성 교환기는 허피스 심플렉스 바이러스 gG2 단백질에 대한 모노클로날 항체에 의해 인식되는 허피스 심플렉스 바이러스 gG2 단백질의 에피토프를 제시하는 항원성 도메인을 보유한다. 이들 리간드/수용체 특이성 교환기의 일련의 희석물은 2 g/ml 염소 혈청(미주리 세인트 루이스 시그마 케미칼스) 및 0.5% 트윈 20(PBS-GT)을 함유하는 인산염 완충 염수(PBS) 내에서 제조하였다. 수용체 ClfA는 50 mM 탄산나트륨 완충액(pH 9)내 4℃에서 하룻밤동안 96 웰 미량역가 평판에 10 ㎍/ml로 수동적으로 흡착시켰다.
이어서, 희석된 리간드/수용체 특이성 교환기는 상기 평판 상에서 60분 동안 항온처리하였다. 수용체와 상호작용할 수 있는 상기 리간드/수용체 특이성 교환기의 능력은 상기 평판에 일차 항체를 적용하고 60분 동안 항온처리함으로써 결정하였다(허피스 심플렉스 바이러스 gG2 단백질에 대한 mAb의 1:1000 희석물). 이어서,결합된 일차 mAb는 토끼 항-마우스 IgG(시그마) 이차 항체와 퍼옥시다제 표지된 염소 항-토끼 IgG(시그마) 삼차 항체로 표지하였다. 상기 평판은 디니트로페닐렌-디아민(시그마)과 함께 항온처리하여 전개하고, 405 nm에서 흡광도를 분석하였다.
하기 표 IV-1 및 IV-2에 제공된 각각의 리간드/수용체 특이성 교환기(서열 번호 60 내지 103)은 고정된 ClfA를 현저하게 결합하였으며, 또한 HSV gG2 단백질에 특이적인 mAb의 결합을 가능하게 하였다. 부착 수용체 및 일차 항체에 대한 리간드/수용체 특이성 교환기의 친화성을 결정하기 위한 상기 방법은 임의의 특이성 도메인과 임의의 항원성 도메인을 포함하는 임의의 후보 리간드/수용체 특이성 교환기에 대해 수행할 수 있는데, 단 적합한 서열 및 부착 수용체를 사용하여야 한다.
하기 표 IV-1 및 IV-2 이후의 실시예는 리간드/수용체 특이성 교환기가 ClfA 수용체를 보유하는 박테리아와 상호작용하는지 여부를 결정하기 위해 수행된 다른 특성화 분석을 기술한다.
실시예 3
세포 응집 인자(Clf)에 결합하는 특이성 도메인과 폴리오바이러스로부터 유도된 에피토프에 상응하는 항원성 도메인을 보유하는 리간드/수용체 특이성 교환기는 fmoc 화학(독일의 시로 멀티신테크)을 이용하는 펩티드 합성에서의 표준 기법을 이용하여 제조하였다(참조: 표 V). 이들 리간드/수용체 특이성 교환기는 Clf와 피브리노겐 사이의 상호작용을 억제할 수 있는 그들의 능력에 대해 분석하였다. 이들 실험에서, 표 V에 기술한 리간드/특이성 교환기를 제조하고, 이들 분자는 여러가지농도로 Clf와 피브리노겐을 함유하는 효소 경쟁 면역분석에 첨가하였다. Clf/Fib 상호작용을 억제하는 데 필요한 최저 펩티드 농도인 최저 억제 농도를 확인하였다. 따라서, Clf/Fib 상호작용을 억제하는 데 필요한 농도가 낮으면 낮을수록 더욱 더 효과적인 억제제이다. 또한, 상기 면역분석에서 항폴리오바이러스 항체에 의해 인식되는 펩티드의 테스트된 최저 농도인 고체상 결합된 최저 펩티드 농도를 결정하였다. 사용된 펩티드의 일부(예를 들어, CPALTAVETGCTNPLAAHHLGGAKQAG(서열 번호 135), HHLGGAKQAG-AA-CPALTAVETGCTNPL(서열 번호 137), CPALTAVETGC-TNPLHHLGGAKQAG(서열 번호 139) 및 HHLGGAKQAG-CPALTAVETGCTNPL(서열 번호 141))는 표 V에서 *로 표시하였으며, 2개의 인공적으로 도입된 시스테인 잔기 사이에서 고리화되었다. 이들 실험 결과, HHLGGAKQAG-AA-CPALTAVETGCTNPL(서열 번호 137) 및 HHLGGAKQAGCPALTAVETGCTNPL(서열 번호 142)는 Clf와 피브리노겐의 상호작용을 효과적으로 억제하였으며, 기능적 폴리오바이러스 에피토프를 보유하였다.
다음 절은 리간드/수용체 친화성 교환기가 병원체의 증식에 일정 효과를 보유하는지 여부를 결정하기 위해 수행될 수 있는 몇몇 세포계 특성화 분석을 기술한다.
병원체 기초한 특성화 분석
다른 유형의 특성화 분석에서, 병원체 기초한 방법을 이용하여 병원체 및 리간드/수용체 특이성 교환기의 항원성 도메인에 대해 유도된 항체와 상호작용할 수 있는 리간드/수용체 특이성 교환기의 능력을 평가하였다. 또한, 이 분석은 병원체의 증식을 수행할 수 있는 리간드/수용체 특이성 교환기의 능력도 나타내는데, 그 이유는 환자의 신체에서 리간드/수용체 특이성 교환기와 병원체 및 상기 리간드/수용체 특이성 교환기의 항원성 도메인에 대해 유도된 항체와의 상호작용은 환자로부터 병원체를 제거하는 체액성 반응과 세포성 반응을 동반한다(예를 들어, 보체 고정 및 마크로파지 분해). 일반적으로, 병원체 기초한 특성화 분석은 배양된 병원체에 리간드/수용체 특이성 교환기를 제공하는 단계 및 리간드/수용체 특이성 교환기와 세포 또는 바이러스와의 결합을 모니터링하는 단계를 포함한다. 병원체 기초한 특성화 분석의 몇몇 유형을 사용할 수 있으며, 이하 실시예는 바람직한 특성화 분석의 몇몇 예를 더 구체적으로 기술한다.
실시예 4
한 유형의 병원체 기초한 특성화 분석은 지지체 상에 배치된 박테리아에 대한 리간드/수용체 특이성 교환기의 결합을 포함한다. 따라서, ClfA를 생성하는 박테리아(예를 들어, 스타필로코쿠스 아우레우스 또는 에스케리치아 콜리)는 배양액또는 적합한 성장 배지(예를 들어, LB 브로스, 혈액 브로스, LB 아가 또는 혈액 아가)내의 아가 평판 상에서 성장시켰다. 이어서, 상기 세포는 진공 하의 막 상에 배양물을 위치시키거나(예를 들어, 도트 블롯 매니폴드 장치를 사용하여), 이전을 허용하기에 충분한 시간 동안 콜로니 상에 막을 위치시킴으로써 막(예를 들어, 니트로셀룰로즈 또는 나일론)으로 이전시켰다. 이어서 막에 결합된 세포는 리간드/수용체 특이성 교환기의 일련의 희석액(예를 들어, 총 부피 200:1의 PBS 내에서 리간드/수용체 특이성 교환기 500 ng, 1 ㎍, 5 ㎍, 10 ㎍, 25 ㎍ 및 50 ㎍)을 제공하였다. 한 실험에서, 표 IV-1 및 IV-2 또는 V에 적시한 리간드/수용체 특이성 교환기를 사용하였다. 이어서, 희석된 리간드/수용체 특이성 교환기는 막 상에서 60분 동안 항온처리하였다. 후속적으로, 미결합 리간드/수용체 특이성 교환기는 제거하고, 막은 PBS로 세척하였다(예를 들어, 1회 세척당 PBS 2 ml를 사용하여 3회 세척함). 이어서, 리간드/수용체 특이성 교환기의 항원성 도메인과 상호작용하는 일차 항체(예를 들어, 허피스 심플렉스 바이러스 gG2 단백질에 대한 mAb)의 1:100 내지 1:1000 희석액을 제공하고, 결합 반응을 60분 동안 수행하였다. 다시, 막을 PBS로 세척하여(예를 들어, 1회 세척당 PBS 2 ml를 사용하여 3회 세척함) 미결합 일차 항체를 제거하였다. 적합한 대조군은 막 자체, 리간드/수용체 특이성 교환기를 보유하지 않는 막 상의 박테리아 및 리간드/수용체 특이성 교환기는 보유하나 일차 항체는 보유하지 않는 막 상의 박테리아를 포함한다.
막 상에서 박테리아에 결합된 리간드/수용체 특이성 교환기의 양을 검출하기 위해, 이차 항체(예를 들어, 토끼 항-마우스 IgG(시그마)) 및 삼차 항체(예를 들어, 퍼옥시다제 표지된 염소 항-토끼 IgG(시그마))를 사용하였다. 물론, 일차 항체와 상호작용하는 표지된 이차 항체를 사용할 수도 있다. 상기한 바와 같이, 이차 항체는 막과 60분 동안 접촉시키고, 비결합된 이차 항체는 PBS를 이용하여 막으로부터 세척하였다(예를 들어, 1회 세척당 2 ml의 PBS를 이용하는 3회 세척). 이어서, 삼차 항체는 막과 60분 동안 접촉시키고, 미결합 삼차 항체는 PBS를 이용하여 막으로부터 세척하였다(예를 들어, 1회 세척당 2 ml의 PBS를 이용하는 3회 세척). 결합된 삼차 항체는 막과 디니트로-페닐렌디아민(시그마)과 함께 항온처리하여 검출할 수 있다.
다른 방법은 고정화된 리간드/수용체 특이성 교환기의 이용을 포함한다. 다라서, 일차 항체(예를 들어, 허피스 심플렉스 바이러스 gG2 단백질에 대한 mAb)는 페트리 디쉬에 결합시켰다. 일단 일차 항체가 결합되면, 리간드/수용체 특이성 교환기(예를 들어, 표 IV-1 및 IV-2 또는 V에 제공된 리간드/수용체 특이성 교환기)의 여러 가지 희석액을 코팅된 디쉬에 첨가하였다. 리간드/수용체 특이성 교환기는 일차 항체와 60분 동안 결합하게 하고, 미결합 리간드/수용체 특이성 교환기는 세척 제거하였다(예를 들어, 2 ml의 PBS를 이용하는 3회 세척). 적합한 대조군은 일차 항체 또는 리간드/수용체 특이성 교환기를 보유하지 않는 페트리 접시를 포함하였다.
후속적으로, 박테리아(예를 들어, 이. 콜리)의 탁한 용액을 페트리 디쉬에 첨가하고, 60분 동안 고정된 리간드/수용체 특이성 교환기와 접촉시켰다. 이어서, 미결합 박테리아는 PBS로 세척하여 제거하였다(2 ml의 PBS를 이용하는 3회 세척).이어서, 성장 배지(예를 들어, LB 브로스)를 페트리 디쉬에 첨가하고, 배양물을 하룻밤 동안 항온처리하였다. 리간드/수용체 특이성 교환기와 박테리아의 상호작용은 시각적으로 관찰할 수 있었다(예를 들어, 아가 상에서 콜로니의 출현 또는 분광 분석을 이용하여 정량할 수 있는 탁한 성장 배지).
상기한 방법을 변경함으로써 당업자는 바이러스와 상호작용할 수 있는 리간드/수용체 특이성 교환기의 능력을 평가할 수 있다. 예를 들어, T4 당단백질의 가용성 단편은 인간 면역결핍성 바이러스(HIV) 엔벨로프 당단백질과 상호작용하는 것으로 확인되었다(참조: 예를 들어, 미국 특허 제6,093,539호). HIV 엔벨로프 당단백질과 상호작용하는 T4 당단백질의 단편(예를 들어, 미국 특허 제6,093,539호에 제공된 T4 당단백질 서열의 아미노산 1 내지 419 또는 이의 일부분)을 포함하는 특이성 도메인을 보유하는 리간드/수용체 특이성 교환기는 항원성 도메인(예를 들어, 표 II에 적시된 항원성 도메인)에 결합된 특이성 도메인을 보유하는 융합 단백질을 합성함으로써 제조할 수 있다. 펩티드 화학을 이용하여 리간드/수용체 특이성 교환기를 제조할 수 있지만, 항원성 도메인에 결합된 T4 당단백질의 단편을 보유하는 발현 구성물을 제조하고, 적절한 세포내로 형질감염시키는 것이 바람직하다. 발현 및 정제 방법은 미국 특허 제6,093,539호에 기술되어 있으며, 상기한 방법을 사용할 수도 있다.
일단 다른 리간드/수용체 특이성 교환기가 구성되면, 필터 결합 분석을 수행하였다. 따라서, 일련의 10배 HIV 접종물은 상압하의 도트 블롯 장치 내에서 막(니트로셀룰로즈 또는 나일론)에 적용시켰다. 이어서, 일련의 10배 희석물의 리간드/수용체 특이성 교환기는 결합된 HIV 입자에 적용시켰다. 리간드/수용체 특이성 교환기는 상기 입자와 60분 동안 접촉시킨 다음 진공을 적용하고, PBS로 세척하였다(1회 세척당 2 ml의 PBS를 이용하는 3회 세척). 일단 미결합 리간드/수용체 특이성 교환기가 제거되면, 항원성 도메인에 결합하는 일차 항체의 일련의 10배 희석물을 샘플에 첨가하고, 60분 동안 결합 반응을 수행하였다. 이어서, 진공을 가하고,미결합 일차 항체는 PBS로 세척하였다(1회 세척당 2 ml의 PBS를 이용하는 3회 세척). 결합된 일차 항체의 검출은 상기한 바와 같이 수행하였다.
또한, 바이러스와 상호작용할 수 있는 리간드/수용체 특이성 교환기의 능력은 샌드위치형 분석에서 평가할 수도 있다. 따라서, 리간드/수용체 특이성 교환기의 항원성 도메인과 상호작용하는 일차 항체는 미량역가 웰 내에 고정하고, 리간드/수용체 특이성 교환기의 일련의 희석물을 일차 항체에 첨가하여 상기한 바와 같이 일차 항체/특이성 교환기 복합체를 생성하였다. 이어서, HIV 접종물의 일련의 10배 희석물을 첨가하고, 60분 동안 결합 반응을 수행하였다. 미결합 HIV 입자는 PBS 내에서의 연속 세척에 의해 제거하였다. 결합된 HIV 입자의 검출은 방사능표지된 항-HIV 항체(예를 들어, HIV에 감염된 환자의 혈청에서 얻은 항체)를 이용하여 수행하였다.
상기 실시예는 박테리아 및 바이러스를 이용하는 병원체 기초한 분석을 기술하였지만, 이들 방법의 별법을 이용하여 리간드/수용체 특이성 교환기와 포유동물 세포와의 상호작용을 연구할 수 있다. 예를 들어, 암 세포 상에 존재하는 인테그린 수용체와 상호작용할 수 있는 리간드/수용체 특이성 교환기의 능력은 다음과 같이결정할 수 있다.수용체를 발현하는 흑색종 세포(예를 들어, M21 인간 흑색종 세포)는 피브리노겐을 결합하며, 이 상호작용은 RGD 함유 펩티드를 투여함으로써 차단할 수 있다[참조: 예를 들어, Katada 등, J. Biol. Chem. 272: 7720 (1997) 및 Felding-Habermann 등, J. Biol. Chem. 271: 5892-5900 (1996)]. 유사하게, 다수의 다른 유형의 암 세포는 RGD 펩티드와 상호작용하는 인테그린을 발현한다. 한 방법으로서, RGD-반응성 인테그린을 발현하는 암 세포(예를 들어, M21 인간 흑색종 세포)는 융합할때까지 배양시켰다. M21 세포는 10% 태아 소 혈청, 20 mM Hepes 및 1 mM 피루베이트를 가진 DMEM 내에서 성장시킬 수 있다.
바람직하게는, 상기 세포는 히드로에티딘(펜실베니아 와링톤 소재의 폴리사이언시즈 인크.)을 37℃에서 30분 동안 20 ㎍/ml의 최종 농도(2 x 106세포/ml)로 염색하였다. 히드로에티딘은 DNA내로 도입되어 결과적으로 세포를 적색 형광 표지화하는데, 세포의 부착 기능은 손상시키지 않는다. 상기 염색은 상기 세포에 대한 리간드/수용체 특이성 교환기의 결합을 정량하는 방법을 제공한다. 즉, 히드로에티딘 염색된 세포의 총 수는 형광 표지된 일차 항체/특이성 교환기 복합체에 결합된 세포의 수와 비교하여 결합 효율을 결정할 수 있다.
따라서, 염색된 세포는 RGD 서열(예를 들어, GRGDSPHRGGPEE(서열 번호 104) 또는 WSRGDWHRGGPEE(서열 번호 105))을 포함하는 리간드/수용체 특이성 교환기의 여러가지 희석물로 접종하였다. 60분 동안 항온처리한 후, 미결합 리간드/수용체 특이성 교환기는 10% 태아 소 혈청, 20 mM Hepes 및 1 mM 피루베이트를 보유하는 DMEM 배지 내에서 수회 세척(예를 들어, 배지 5 ml의 3회 세척)하여 제거하였다.이어서, 리간드/수용체 특이성 교환기의 항원성 도메인과 상호작용하는 일차 항체(예를 들어, 허피스 심플렉스 바이러스 gG2 단백질에 대한 항체)의 1:100 내지 1:1000 희석물을 제공하고, 60분 동안 결합 반응을 수행하였다. 후속적으로, 배지 내에서의 수차례 세척을 수행하여 임의의 미결합 일차 항체를 제거하였다. 적합한 대조군은 일차 항체를 보유하지 않은 염색된 세포 또는 리간드/수용체 특이성 교환기를 보유하지 않은 염색된 세포를 포함한다.
일차 항체의 반응후, 염소 항-마우스 FITC 표지된 항체(1:100 희석물)(시그마)를 첨가하고, 60분 동안 결합을 수행하였다. 다시, 수차례의 배치 세척을 수행하여 임의의 미결합 이차 항체를 제거하였다. 분석은 히드로에티딘에 대한 543/590 nm 및 플루오레세인에 대한 495/525 nm에서 필터 설정값을 이용하여 유동 세포계수법에 의해 수행하였다. 리간드/수용체 특이성 교환기/세포 복합체에 대한 일차 항체의 현저한 결합이 관찰될 것이며, 이는 리간드/수용체 특이성 교환기가 상기 세포에 대한 효과를 보유할 것임을 입증하는 것이다.
하기 실시예는 RGD를 함유하는 리간드/수용체 특이성 교환기가 포유동물 세포에 효과적으로 결합하고 이들 세포에 대한 항체를 재유도하는 것을 입증하는 특성화 분석을 기술한다.
실시예 5
펩티드 RGDSAATPPAYR(서열 번호 145)는 fmoc 화학(독일의 시로 멀티신테크)을 이용하는 펩티드 합성에서의 표준 기법을 이용하여 제조하였다. 이 펩티드는 인테그린 수용체를 결합하는 특이성 도메인, 스페이서(AA) 및 B형 간염 바이러스 e항원(HBeAg) 상에 존재하는 에피토프인 모노클로날 항체 57/8에 의해 인식되는 에피토프를 보유하는 항원성 도메인을 보유한다.
쥐과동물 흑색종 세포(SP2/0 세포)는 무혈청 배지 내에서 세척하고, 이어서 RGDSAATPPAYR(서열 번호 145) 펩티드 또는 c형 간염 바이러스(HCV) NS3 도메인으로부터 유도된 대조 펩티드와 함께 농도 50 ㎍/ml로 항온처리하였다. 이어서, 상기 세포는 세척하고, 표면 결합된 펩티드의 양은 57/8 항체로 세포를 표지화함으로써 검출하였다. 표면 결합된 항체는 1/500 희석된 FITC 표지된 항-마우스 IgG 접합체에 의해 표시되었으며, 표면 염색의 수준을 형광 현미경으로 결정하였다.
본 실험은 대조용 펩티드와 항온처리한 세포는 염색되지 않았음을 보여준다. 대조적으로, RGDSAATPPAYR(서열 번호 145) 펩티드와 함께 항온처리한 세포는 표면 발현된 인테그린의 위치에 부합하는 유의적인 표면 염색을 나타냈다. 따라서, RGD 함유 리간드/수용체 특이성 교환기는 인테그린을 생성하는 포유동물 세포를 효율적으로 결합하며, 이들 분자를 이용하여 종양 세포에 대한 항체를 재유도하고, 이를 종양 세포로 표적화할 수 있다.
다음 절은 동물에서 수행된 특성화 분석을 기술한다.
생체내 특성화 분석
또한, 특성화 분석은 생체 내에서 리간드/수용체 특이성 교환기를 평가하는 실험을 포함한다. 병원체 감염을 억제할 수 있는 리간드/수용체 특이성 교환기의 능력을 평가하기에 적합한 다수의 동물 모델이 존재한다. 마우스가 바람직한데, 그 이유는 마우스는 관리하기 쉽고, 박테리아나 바이러스에 감염되기 쉽고, 암이 발생하기도 용이하기 때문이다. 침팬지도 바람직한데, 그 이유는 그들이 사람과 유전적으로 밀접한 관련이 있기 때문이다.
마우스에서 리간드/수용체 특이성 교환기의 효능을 평가하기 위한 한 방법을 다음 실시예에 제공한다.
실시예 6
박테리아 감염을 치료할 수 있는 리간드/수용체 특이성 교환기의 능력을 테스트하기 위해, 다음과 같은 특성화 분석을 수행할 수 있다. 약 8주된 체중 25 g의 몇몇 암컷 CF-1 이계교배 마우스(챨스 리버 래버레토리즈)는 테스트하려는 리간드/수용체 특이성 교환기의 항원성 도메인으로 백신화하였다. 바람직하게는, 상기 항원성 도메인은 담체에 커플링하고, 보조제와 함게 투여하였다. 예를 들어, 상기 항원성 도메인은 둘다 담체 및 보조제로서 작용하는 키홀 림펫 해모시아닌 또는 소 혈청 알부민에 융합시키거나, 프레운트 보조제, 수산화알루미늄 또는 리소레시틴과 같은 보조제를 사용하였다. 일단 높은 역가의 항체가 예를 들어 EIA 또는 면역확산에 의해 입증될 수 있으면, 면역화된 마우스는 스타필로콕쿠스 아우레우스 NTCC 10649의 하룻밤 배양물로 복강내 접종하였다. 접종물은 에. 아우레우스에 대해 약 100 x LD50또는 log 6.6을 산출하도록 조정하였다.
리간드/수용체 특이성 교환기(예를 들어, 표 IV-1 및 IV-2에 제공된 리간드/수용체 특이성 교환기)의 일련의 희석물은 주사용 멸균수 내에서 제조하였으며, 피하(SC) 또는 경구(PO)로 감염후 1시간 및 5시간에 투여하였다. 각 실험과 동시에,챌린지 LD50은 박테리아 접종물의 로그 희석물을 이용하는 미처리한 미우스의 접종에 의해 확인하였다. 바람직하게는 5개 로그 희석 범위의 박테리아 챌린지는 각각 10 마리의 마우스로 이루어진 5개의 군에 접종하였다(로그 희석 당 10마리의 마우스). 100 x LD50챌린지 접종물로 접종한 모든 미처리 마우스에서 사망율은 100%일 것이다. 마우스는 7일 동안 사망율에 대해 매일 모니터링하였다. 마우스의 50%를 보호하는 평균 유효 투여량(ED50)은 문헌[참조: Antimicrob. Agents Chemother. 31: 1768-1774 및 Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1994, 57, 261-264]에 기술된 생존률 대 투여량에 대해 플롯한 곡선의 로그 이득 분석에 의해 누적 사망율로부터 계산할 수 있다. 당업자는 적절하고 유사한 방법을 이용하여 바이러스 감염 및 암을 억제할 수 있는 리간드/수용체 특이성 교환기의 능력을 테스트할 수 있다.
본원에 기술한 리간드/수용체 특이성 교환기는 약제로 제형화할 수 있고, 병원체의 증식을 억제하는 제제가 필요한 환자에게 투여할 수 있다. 하기 절은 병원체 상의 수용체와 상호작용하는 리간드/수용체 특이성 교환기를 포함하는 몇몇 약제를 기술한다.
병원체 상의 수용체와 상호작용하는 리간드/수용체 교환기를 포함하는 약제
본원에 기술한 리간드/수용체 특이성 교환기는 병원체에 의한 감염을 치료 또는 예방하는 화합물을 필요로 하는 환자에게 투여하기 위한 약제내에 혼입하기에 적합하다. 이들 약리학적으로 활성인 화합물은 종래의 생약 제조법에 따라 처리하여 인간을 포함하는 포유동물에게 투여하기 위한 약제를 제조할 수 있다. 상기 활성 제제는 변경을 가하거나 변경을 가하지 않고 약품내에 혼입시킬 수 있다. 또한, 여러 가지 경로로 본 발명의 약리학적으로 활성인 화합물을 전달하는 약제 또는 치료제의 제조는 본 발명의 한 관점이다. 예를 들어, 병원체 상의 수용체와 상호작용하는 리간드/수용체 특이성 교환기를 암호화하는 서열을 보유하는 DNA, RNA 및 바이러스 벡터(이로 제한되는 것은 아님)는 본 발명의 구체예와 함께 사용된다. 리간드/수용체 특이성 교환기를 암호화하는 핵산은 단독으로 또는 다른 활성 성분과 함께 투여할 수 있다.
상기 화합물은 통상적인 부형제, 즉 약학적으로 허용가능한 유기 또는 무기 담체 물질로서 비경구, 경구 또는 국소 투여에 적합하며, 본원의 약학적으로 활성인 화합물과 유해하게 반응하지 않는 물질과 혼합하여 사용할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용가능한 담체는 물, 염 용액, 알콜, 아라비아 검, 식물성 오일, 벤질 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 탄수화물(예, 락토즈, 아밀로즈 또는 전분), 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 규산, 점성 파라핀, 향유, 지방산 모노글리세라이드 및 디글리세라이드, 펜타에리트리톨 지방산 에스테르, 히드록시 메틸셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈 등을 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 사용할 수 있는 다수의 비히클은 문헌[참조: Remmington's Pharmaceutical Sciences, 15판, 이스턴 맥 퍼블리싱 컴퍼니, 1405-1412 및 1461-1487 (1975) 및 The National Formulary XIV, 14판, 워싱톤 아메리칸 파마슈티칼 어소시에이션 (1975)]에 기술되어 있다. 상기 약학 제제는 멸균할 수 있으며, 필요에 따라 보조제, 예를 들어 활제, 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 삼투압을 증강시키기 위한 염, 착색제, 향미제 및/또는 방향제 등과 혼합할 수 있는데, 단 상기 보조제는 리간드/수용체 특이성 교환기와 유해한 반응을 일으키지 않아야 한다.
리간드/수용체 특이성 교환기를 보유하는 특정 약제의 유효 투여량 및 투여 방법은 환자 개개의 요구 및 치료 또는 예방 정도에 따라 달라질 수 있다. 이러한 화합물의 치료 효능 및 독성은 세포 배양물 또는 실험 동물에서 이루어지는 표준 약학 절차에 의해 결정될 수 있다(예를 들어, 군집의 50%에 치료적으로 유효한 투여량인 ED50의 결정). 예를 들어, 리간드/수용체 특이성 교환기의 유효량은 상기한 특성화 분석을 이용하여 평가할 수 있다. 이어서, 이들 분석으로부터 얻은 자료를 이용하여 인간을 포함하는 기타 유기체에 사용하기 위한 투여량의 범위를 결정할 수 있다. 이러한 화합물의 투여량은 독성없이 ED50을 포함하는 순환 농도 범위인 것이 바람직하다. 투여량은 리간드/수용체 특이성 교환기의 유형, 사용된 투여 형태, 유기체의 민감도 및 투여 경로에 따라 상기 범위 내에서 달라질 것이다.
리간드/수용체 특이성 교환기의 정상적인 투여량은 투여 경로에 따라 약 1 대 100,000 ㎍ 범위 내에서 달라질 수 있으며, 총 투여량은 약 10 g 이하이다. 바람직한 투여량은 약 250 ㎍ 내지 1 mg, 약 50 mg 내지 200 mg 및 약 250 mg 내지 500 mg이다.
몇몇 구체예에서, 리간드/수용체 특이성 교환기의 투여는 0.1 μM 내지 500 mM의 조직 농도 또는 혈액 농도 또는 둘 다를 생성한다. 바람직한 투여는 1 μM 내지 800 μM의 조직 농도 또는 혈액 농도 또는 둘 다를 생성한다. 바람직한 투여는약 10 μM 내지 약 500 μM 이상의 조직 농도 또는 혈액 농도를 생성한다. 800 μM 보다 더 큰 조직 농도를 사용하는 것은 바람직하지 않지만, 그러한 농도를 사용할 수도 있다. 또한, 리간드/수용체 특이성 교환기의 일정하게 주입하여 혈액 수준에 의해 측정되는 바와 같이 조직 내에서 안정한 농도를 유지할 수도 있다.
정확한 투여량은 치료하려는 환자의 관점에서 개개의 치료의가 선택한다. 투여량과 투여 방식을 조정하여 활성 부분의 충분한 수준을 제공하거나 목적하는 효과를 유지한다. 고려할 수 있는 추가의 인자는 질병의 경중, 치료하려는 유기체의 연령, 유기체의 체중과 크기, 식이요법, 투여 시간 및 투여 빈도, 약물 배합(들), 반응 민감성, 및 치료법에 대한 용인/반응을 들 수 있다. 단기 작용성 약학 조성물은 매일 또는 더 잦은 빈도로 투여하는 반면, 장기 작용성 약학 조성물은 이틀 이상의 주기로, 주 1회, 또는 2주마다 한번씩 또는 더 드문 빈도로 투여한다.
약제의 투여 경로로는 국소, 경피, 비경구, 위장관, 경기관지 및 경폐포 투여를 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 경막 투여는 리간드/수용체 특이성 교환기를 피투에 투과시킬 수 있는 크림, 린스, 젤 등의 도포를 수반한다. 비경구 투여 경로는 중추 정맥 라인 내로의 직접 주사와 같은 전기 또는 직접 주사, 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피내 주사 또는 피하 주사를 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 위장관 투여 경로로는 경구 섭취 또는 직장 투여를 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 경기관지 및 경폐포 투여 경로로는 입 또는 비강내 경로에 의한 흡입을 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
경피 투여 또는 국소 투여에 적합한 리간드/수용체 특이성 교환기를 보유하는 조성물로는 직접 피부에 적용하거나 경피 디바이스("경피 패취")와 같은 보호성 담체 내로 혼입된 약학적으로 허용가능한 현탁액, 오일, 크림 및 연고를 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 적합한 크림, 연고 등의 예는 예를 들어 의사의 데스크 레퍼런스에서 확인할 수 있다. 적합한 경피 디바이스의 예는 예를 들어, 미국 특허 제4,818,540호(Chinen 등, 1989. 4. 4)에 기재되어 있다.
비경구 투여에 적합한 약리학적으로 활성인 화합물을 보유하는 조성물은 약학적으로 허용가능한 멸균 등장 용액을 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 이러한 용액은 중추 정맥 라인내로의 주사, 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피내 주사 또는 피하 주사를 위한 염수 및 인산염 완충 염수를 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
경기관지 및 경폐포 투여에 적합한 약리학적으로 활성인 화합물을 보유하는 화합물은 여러가지 유형의 흡입용 에어로졸을 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 이들중 경기관지 및 경폐포 투여에 적합한 디바이스도 한 구체예이다. 이러한 디비아스로는 아토마이저 및 베이퍼라이저를 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 다수 형태의 현재 이용할 수 있는 아토마이저 및 베이포라이저는 본원에 기술한 리간드/수용체 특이성 교환기를 보유하는 조성물을 전달하는데 용이하게 적용할 수 있다.
위장관 투여에 적합한 약리학적으로 활성인 화합물을 보유하는 조성물로는 구강 섭취용의 약학적으로 허용가능한 분말, 필 또는 액체 및 직장 투여용 좌약을 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 사용이 용이하기 때문에 위장관 투여,특히 경구를 통한 위장관 투여가 바람직하다. 일단 리간드/수용체 특이성 교환기를 포함하는 약제가 얻어지면, 병원체 감염을 치료 또는 예방할 필요가 있는 환자에게 투여할 수 있다.
또한, 본 발명의 관점은 보철물, 이식물 및 기구와 같은 의료 장비를 위한 코팅을 포함한다. 의료 장비에 사용하기에 적합한 코팅은 리간드/수용체 특이성 교환기를 함유하는 젤 또는 분말, 또는 리간드/수용체 특이성 교환기가 내부에 현탁된 중합체 코팅에 의해 제공될 수 있다. 의료 장비의 코팅을 위해 적합한 중합체 물질은 생리적으로 허용가능한 것을 포함하며, 이들 통해 치료 유효량의 리간드/수용체 특이성 교환기가 확산될 수 있다. 적합한 중합체로는 폴리우레탄, 폴리메타크릴레이트, 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리비닐-클로라이드, 셀룰로즈 아세테이트, 실리콘 엘라스토머, 콜라겐, 실크 등을 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 이러한 코팅은 예를 들어, 미국 특허 제4,612,337호에 기술되어 있다.
하기 절은 본원에 기술된 리간드/수용체 특이성 교환기를 이용하여 질병을 치료 및 예방하는 방법을 기술한다.
리간드/수용체 특이성 교환기를 이용하는 질병의 치료 및 예방
리간드/수용체 특이성 교환기를 포함하는 약제는 수용체를 보유하는 병원체에 의한 감염을 치료 및/또는 예방할 필요가 있는 환자에게 투여할 수 있다. 투여의 필요성이 있는 환자는 병원체와 접촉할 필요가 있는 개체 또는 병원체에 이미 감염된 개체를 포함한다. 이들 개체는 표준 임상 기법 또는 진단 기법에 의해 확인할 수 있다.
예를 들어, 한 방법으로, 박테리아에 감염된 환자는 병원체의 증식을 억제하는 제제가 필요한 환자로 확인된다. 이러한 환자에게는 치료 유효량의 리간드/수용체 특이성 교환기를 제공한다. 본 방법에서 사용된 리간드/수용체 특이성 교환기는 박테리아 상에 존재하는 수용체(예를 들어, 외세포성 피브리노겐 결합 단백질(Efb), 콜라겐 결합 단백질, 비트로넥틴 결합 단백질, 라미닌 결합 단백질, 플라스미노겐 결합 단백질, 트롬보스폰딘 결합 단백질, 세포 응집 인자 A(ClfA), 세포 응집 인자 B(ClfB), 피브로넥틴 결합 단백질, 코아굴라제 및 외세포성 부착 단백질)와 상호작용하는 특이성 도메인을 포함한다. 또한, 상기 리간드/수용체 특이성 교환기는 병원체 또는 독소의 에피토프, 바람직하게는 대상 환자내에 존재하는 높은 역가의 항체에 의해 인식되는 에피토프를 보유하는 항원성 도메인을 포함한다. 또한, 상기 대상 환자에게 리간드/수용체 특이성 교환기를 제공하기 전에 항원성 도메인을 인식하는 높은 역가의 항체의 존재에 대해 상기 대상 환자를 스크리닝하는 것도 바람직할 수 있다. 이러한 스크리닝은 상기한 바와 같이 고정화된 항원성 도메인 또는 리간드/수용체 특이성 교환기를 이용하는 EIA 또는 ELISA에 의해 수행할 수 있다.
유사하게, 바이러스 감염을 억제하는 제제가 필요한 환자에게 특정 질병의 원인제 상에 존재하는 수용체를 인식하는 리간드/수용체 특이성 교환기를 투여할 수 있다. 따라서, 바이러스 감염을 억제하는 제제가 필요한 환자는 표준 임상 기법 또는 진단 기법에 의해 확인된다. 이어서, 상기 대상 환자에게 개체를 감염하는 바이러스 유형 상에 존재하는 수용체와 상호작용하는 치료 유효량의 리간드/수용체 특이성 교환기를 제공한다. 상기한 바와 같이, 상기 환자가 리간드/수용체 특이성 교환기를 투여하기 이전에 리간드/수용체 특이성 교환기의 항원성 도메인과 상호작용하기에 충분한 역가의 항체를 보유하는 지 여부를 결정하는 것이 바람직할 수 있다.
동일한 맥락에서, 암의 증식을 억제하는 제제가 필요한 환자에게 암 세포 상에 존재하는 수용체와 상호작용하는 리간드/수용체 특이성 교환기를 투여할 수 있다. 예를 들어, 암의 증식을 억제하는 제제가 필요한 환자는 표준 임상 기법 또는 진단 기법에 의해 확인되며; 이어서, 대상 환자에게 상기 환자를 감염시키는 암 세포 상에 존재하는 수용체와 상호작용하는 치료 유효량의 리간드/수용체 특이성 교환기를 제공한다. 상기한 바와 같이, 상기 환자가 리간드/수용체 특이성 교환기를 투여하기 이전에 리간드/수용체 특이성 교환기의 항원성 도메인과 상호작용하기에 충분한 역가의 항체를 보유하는 지 여부를 결정하는 것이 바람직할 수 있다.
또한, 본원에 기술한 리간드/수용체 특이성 교환기는 발병을 예방하는 예방제로 환자에게 투여할 수도 있다. 실질적으로, (예를 들어, 박테리아 감염, 바이러스 감염 또는 암의 예방을 위해) 예방적 목적으로 본원에 기술한 리간드/수용체 특이성 교환기를 누구에게나 투여할 수 있다. 그러나, 특정 질병에 걸릴 위험이 높은 환자를 확인하고, 이 환자에게 리간드/수용체 특이성 교환기를 제공하는 것이 바람직하다. 질병에 걸릴 위험이 높은 환자에는 질병에 대한 가족력을 가진 개체, 노인 또는 청소년, 병원체와 빈번하게 접촉하는 개체(예를 들어, 의료 계통 종사자)를들 수 있다. 따라서, 수용체를 가진 병원체에 감염될 위험이 있는 개체를 확인하고, 이어서 치료 유효량의 리간드/수용체 특이성 교환기를 제공한다.
본원에 기술한 리간드/수용체 특이성 교환기에 대한 한 예방적 용도는 의료 장비 또는 이식물에 리간드/수용체 특이성 교환기를 코팅하거나 교차결합시키는 것을 고려한다. 이식가능한 의료 장비는 다수의 박테리아 종에게 감염 병소로서 작용할 수 있다. 이러한 장비 관련 감염은 상기 장비의 표면에 부착하고 콜로니화하는 이들 유기체의 경향에 의해 촉진된다. 결과적으로, 전형적으로 의료 장비의 이식을 수반하는 유해한 생물학적 반응을 촉진하는 경향이 적은 표면을 개발할 상당한 필요성이 존재한다.
한 방법으로서, 상기 의료 장비는 리간드/수용체 특이성 교환기를 함유하는 용액 내에서 코팅할 수 있다. 이식 이전에, 의료 장비(예를 들어, 보철 밸브)는 예를 들어 리간드/수용체 특이성 교환기를 보유하는 용액 내에 저장할 수 있다. 또한, 의료 장비는 리간드/수용체 특이성 교환기를 보유하는 분말 또는 젤 내에서 코팅할 수 있다. 예를 들어, 장갑, 콘돔 및 자궁내 장비는 박테리아 또는 바이러스 수용체와 상호작용하는 리간드/수용체 특이성 교환기를 함유하는 분말 또는 젤 내에서 코팅할 수 있다. 일단 체내 이식되면, 이들 리간드/수용체 특이성 교환기는 병원체 감염에 대한 예방적 배리어를 제공한다.
몇몇 구체예에서, 리간드/수용체 특이성 교환기는 의료 장비에 고정화된다. 상기한 바와 같이, 상기 의료 장비는 리간드/수용체 특이성 교환기가 부착될 수 있는 지지체이다. 고정화는 리간드/수용체 특이성 교환기와 의료 장비 사이의 소수성상호작용에 의해 발생할 수 있지만, 공유 결합을 이용하여 의료 장비에 리간드/수용체 특이성 교환기를 고정화하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 의료 장비는 특이성 교환기 상에 존재하는 반응성 기와 상호작용하는 반응성 기를 보유하도록 제조할 수 있다.
한 방법으로, 페리오데이트는 2-아미노알콜 부분을 포함하는 리간드/수용체 특이성 교환기와 연합하여 pH 약 4 내지 약 9 및 온도 약 0 내지 약 50℃의 수용액 내에서 알데히드-작용성 교환기를 형성한다. 이어서, 상기 알데히드-작용성 교환기는 일차 아민 부분을 포함하는 의료 장비의 생물질 표면과 연합하여 이민 부분을 통해 지지체 표면 상에 리간드/수용체 특이성 교환기를 고정화시킨다. 이어서, 상기 이민 부분은 환원제와 반응하여 이차아민 결합을 통해 생물질 표면 상에 고정화된 리간드/수용체 특이성 교환기를 형성한다. 의료 장비에 분자를 교차 결합시키기 위한 다른 방법(예를 들어, 미국 특허 제6,017,741호)을 변경하여 상기한 리간드/수용체 특이성 교환기를 고정화시킬 수 있다.
지금까지 구체예와 실시예를 참조하여 본 발명을 기술하였지만, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않은 한도내에서 다양한 변형 실시가 가능할 것이다. 따라서, 본 발명의 보호 범위는 하기하는 특허청구의 범위에 의해서만 한정된다.
Claims (22)
- 수용체에 대한 리간드를 포함하는 하나 이상의 특이성 도메인; 및병원체 또는 독소의 에피토프를 포함하며, 상기 특이성 도메인에 결합된 하나 이상의 항원성 도메인을 포함하는 리간드/수용체 특이성 교환기.
- 제1항에 있어서, 상기 특이성 도메인은 외세포성 매트릭스 단백질, 바이러스상의 수용체에 대한 리간드 및 암 세포 상의 수용체에 대한 리간드로 구성되는 군으로부터 선택되는 펩티드의 3개 이상의 연속되는 아미노산을 포함하는 것인 리간드/수용체 특이성 교환기.
- 제2항에 있어서, 상기 펩티드는 피브리노겐, 콜라겐, 비트로넥틴, 라미닌, 플라스미노겐, 트롬보스폰딘 및 피브로넥틴으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 외세포성 매트릭스 단백질인 리간드/수용체 특이성 교환기.
- 제2항에 있어서, 상기 펩티드는 T4 당단백질 및 B형 간염 바이러스 엔벨로프 단백질로 구성되는 군으로부터 선택되는, 바이러스 상의 수용체에 대한 리간드인 리간드/수용체 특이성 교환기.
- 제2항에 있어서, 상기 펩티드는 HER-2/neu 및 인테그린 수용체에 대한 리간드로 구성되는 군으로부터 선택되는, 암 세포상의 수용체에 대한 리간드인 리간드/수용체 특이성 교환기.
- 제1항에 있어서, 상기 특이성 도메인은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 35, 서열 번호 36, 서열 번호 37, 서열 번호 38, 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 41, 서열 번호 42 및 서열 번호 124로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 서열을 포함하는 것인 리간드/수용체 특이성 교환기.
- 제3항에 있어서, 상기 외세포성 매트릭스 단백질은 피브리노겐의 알파 사슬의 3개 이상의 아미노산을 포함하는 것인 리간드/수용체 특이성 교환기.
- 제1항에 있어서, 상기 리간드는 아르기닌-글리신-아스파르테이트(RGD)를 포함하는 것인 리간드/수용체 특이성 교환기.
- 제1항에 있어서, 상기 수용체는 병원체 상에서 발견되는 것인 리간드/수용체 특이성 교환기.
- 제1항에 있어서, 상기 수용체는 박테리아 부착 수용체인 리간드/수용체 특이성 교환기.
- 제10항에 있어서, 상기 박테리아 부착 수용체는 외세포성 피브리노겐 결합 단백질(Efb), 콜라겐 결합 단백질, 비트로넥틴 결합 단백질, 라미닌 결합 단백질, 플라스미노겐 결합 단백질, 트롬보스폰딘 결합 단백질, 세포 응집 인자 A(ClfA), 세포 응집 인자 B(ClfB), 피브로넥틴 결합 단백질, 코아굴라제 및 외세포성 부착 단백질로 구성되는 군으로부터 선태되는 것인 리간드/수용체 특이성 교환기.
- 제1항에 있어서, 상기 항원성 도메인은 허피스 심플렉스 바이러스 단백질, B형 간염 바이러스 단백질, TT 바이러스 단백질 및 폴리오바이러스 단백질로 구성되는 군으로부터 선택되는 펩티드의 3개 이상의 아미노산을 포함하는 것인 리간드/수용체 특이성 교환기.
- 제12항에 있어서, 상기 항원성 도메인은 서열 번호 53 및 서열 번호 54로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 서열을 포함하는 허피스 심플렉스 바이러스 단백질인 리간드/수용체 특이성 교환기.
- 제12항에 있어서, 상기 항원성 도메인은 서열 번호 49, 서열 번호 50, 서열 번호 52 및 서열 번호 59로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 서열을 포함하는 B형 간염 바이러스 단백질인 리간드/수용체 특이성 교환기.
- 제12항에 있어서, 상기 항원성 도메인은 서열 번호 43, 서열 번호 44, 서열 번호 45, 서열 번호 46, 서열 번호 47, 서열 번호 55, 서열 번호 56, 서열 번호 57 및 서열 번호 58로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 서열을 포함하는 TT 바이러스 단백질인 리간드/수용체 특이성 교환기.
- 제12항에 있어서, 상기 항원성 도메인이 서열 번호 48 및 서열 번호 51로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인 리간드/수용체 특이성 교환기.
- 제1항에 있어서, 상기 항원성 도메인이 높은 역가의 항체와 상호작용하는 것인 리간드/수용체 특이성 교환기.
- 제17항에 있어서, 상기 항원성 도메인은 약 1:100 내지 1:1000 이상으로 희석된 동물 혈청 내에 존재하는 항체에 특이적으로 결합하는 것인 리간드/수용체 특이성 교환기.
- 제1항에 있어서, 상기 리간드/수용체 특이성 교환기의 서열은 서열 번호 60, 서열 번호 61, 서열 번호 62, 서열 번호 63, 서열 번호 64, 서열 번호 65, 서열 번호 66, 서열 번호 67, 서열 번호 68, 서열 번호 69, 서열 번호 70, 서열 번호 71, 서열 번호 72, 서열 번호 73, 서열 번호 74, 서열 번호 75, 서열 번호 76, 서열 번호 77, 서열 번호 78, 서열 번호 79, 서열 번호 80, 서열 번호 81, 서열 번호 82, 서열 번호 83, 서열 번호 84, 서열 번호 85, 서열 번호 86, 서열 번호 87, 서열 번호 88, 서열 번호 89, 서열 번호 90, 서열 번호 91, 서열 번호 92, 서열 번호 93, 서열 번호 94, 서열 번호 95, 서열 번호 96, 서열 번호 97, 서열 번호 98, 서열 번호 99, 서열 번호 100, 서열 번호 101, 서열 번호 102, 서열 번호 103, 서열 번호 104, 서열 번호 105, 서열 번호 137 및 서열 번호 142로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 리간드/수용체 특이성 교환기.
- 환자에게 치료 유효량의 박테리아 상의 수용체와 상호작용하는 리간드를 보유하는 특이성 도메인 및 병원체 또는 독소에 대한 에피토프를 포함하는 항원성 도메인을 포함하는 리간드/수용체 특이성 교환기 제공하는 단계를 포함하는, 박테리아 감염의 치료 또는 예방 방법.
- 환자에게 치료 유효량의 바이러스 상의 수용체와 상호작용하는 리간드를 보유하는 특이성 도메인 및 병원체 또는 독소에 대한 에피토프를 포함하는 항원성 도메인을 포함하는 리간드/수용체 특이성 교환기를 제공하는 단계를 포함하는, 바이러스 감염의 치료 또는 예방 방법.
- 환자에게 치료 유효량의 암 세포 상의 수용체와 상호작용하는 리간드를 보유하는 특이성 도메인 및 병원체 또는 독소에 대한 에피토프를 포함하는 항원성 도메인을 포함하는 리간드/수용체 특이성 교환기를 제공하는 단계를 포함하는, 암의 치료 또는 예방 방법.
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