ES2200016T3 - Expresion de secuencias polinucleotidicas exogenas en un vertebrado. - Google Patents
Expresion de secuencias polinucleotidicas exogenas en un vertebrado.Info
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Abstract
UN METODO PARA ENVIAR UN POLINUCLEOTIDO AISLADO AL INTERIOR DE UNA CELULA EN UN VERTEBRADO, QUE INCLUYE LA INTRODUCCION INTERESTITICIA DE UN POLINUCLEOTIDO AISLADO EN UN TEJIDO DEL VERTEBRADO DONDE EL POLINUCLEOTIDO ES RECOGIDO POR LAS CELULAS DEL TEJIDO Y EJERCE UN EFECTO TERAPEUTICO EN EL VERTEBRADO. EL METODO PUEDE SER USADO PARA ENVIAR UN POLIPEPTIDO TERAPEUTICO A LAS CELULAS DEL VERTEBRADO, PARA PROPORCIONAR UNA RESPUESTA INMUNE EN LA TRANSLACION "IN VIVO" DEL POLINUCLEOTIDO, PARA ENVIAR LOS POLINUCLEOTIDOS ANTISENTIDO, ENVIAR RECEPTORES A LAS CELULAS DEL VERTEBRADO, O PARA PROPORCIONAR UNA TERAPIA GENETICA TRANSITORIA.
Description
Expresión de secuencias polinucleotídicas
exógenas en un vertebrado.
La presente invención se refiere a la
introducción de secuencias de ADN y de ARN en un mamífero para
conseguir la expresión controlada de un péptido inmunogénico.
La investigación actual en la terapia génica se
ha centrado en curas "permanentes", en las que se integra un
ADN en el genoma del paciente. Actualmente, los vectores virales son
los medios usados con más frecuencia para transformar las células
del paciente e introducir ADN en el genoma. En un método indirecto,
se usan vectores virales, que llevan nueva información genética,
para infectar células diana retiradas del cuerpo, y estas células
después se vuelven a implantar. Se ha informado sobre una
transferencia génica directa in vivo en animales recién
nacidos para formulaciones de ADN encapsulado en liposomas y ADN
atrapado en proteoliposomas que contienen proteínas receptoras de
envueltas virales (Nicolau et al., Proc. Natl. Acad Sci USA
80:1068-1072 (1983); Kaneda et al., Science
243:375-378 (1989); Mannino et al.,
Biotechniques 6:682-690 (1988). También se
han descrito resultados positivos con ADN
co-precipitado con fosfato cálcico (Benvenisty y
Reshef Proc. Natl. Acad Sci USA 83:9551-9555
(1986)).
La aplicación clínica de la terapia génica, así
como la utilización de vectores de retrovirus recombinantes, se ha
retrasado debido a consideraciones de seguridad. La integración de
ADN exógeno en el genoma de una célula puede producir lesiones en el
ADN y posibles cambios genéticos en la célula receptora que podrían
ocasionar una predisposición a una malignidad. Un método que evite
estos problemas potenciales sería significativamente beneficioso
para hacer que la terapia génica sea segura y eficaz.
La vacunación con proteínas inmunogénicas ha
eliminado o reducido la incidencia de muchas enfermedades; sin
embargo, existen dificultades importantes en el uso de proteínas
asociadas con otros patógenos y estados de enfermedad como
inmunógenos. Muchos antígenos proteicos no son intrínsecamente
inmunogénicos. Con mucha frecuencia no son eficaces como vacunas
debido a la manera en la que funciona el sistema inmune.
El sistema inmune de vertebrados consta de varios
componentes que interactúan. Las partes mejor caracterizadas y más
importantes son las ramificaciones humoral y celular (citolítica).
La inmunidad tumoral implica anticuerpos, proteínas que se secretan
en los fluidos corporales y que reconocen directamente un antígeno.
Por el contrario, el sistema celular se basa en células especiales
que reconocen y destruyen otras células que están produciendo
antígenos extraños. Esta división funcional básica refleja dos
estrategias diferentes de defensa inmune. La inmunidad humoral
principalmente se dirige a antígenos que son exógenos al animal,
mientras que el sistema celular responde a antígenos que se
sintetizan activamente dentro del animal.
Las moléculas de anticuerpo, los efectores de
inmunidad humoral, se secretan por células linfoides B especiales,
células B, en respuesta a un antígeno. Los anticuerpos se pueden
unir e inactivar el antígeno directamente (anticuerpos
neutralizadores) o activar otras células del sistema inmune para
destruir el antígeno.
El reconocimiento inmune celular está mediado por
una clase especial de células linfoides, las células T citotóxicas.
Estas células no reconocen antígenos enteros, sino que en su lugar
responden a fragmentos peptídicos degradados de los mismos que
aparecen en la superficie de la célula diana unidos a proteínas
denominadas moléculas del complejo principal de histocompatibilidad
(MHC) de clase I.Esencialmente todas las células nucleadas tienen
moléculas de clase I. Se cree que las proteínas producidas dentro
de la célula se degradan continuamente a péptidos como parte del
metabolismo celular normal. Estos fragmentos se unen a las moléculas
del MHC y se transportan a la superficie celular. De esta manera,
el sistema inmune celular está controlando constantemente los
espectros de proteínas producidos en todas las células del cuerpo y
elimina cualquier célula que produzca antígenos extraños.
La vacunación es el proceso de preparación de un
animal para responder a un antígeno. La vacunación es más compleja
que el reconocimiento inmune y no implica sólo células B y células
T citotóxicas, sino también otros tipos de células linfoides.
Durante la vacunación, las células que reconocen el antígeno
(células B o células T citotóxicas) se expanden clonalmente. Además,
también aumenta la población de células auxiliares (células T
adyuvantes) específicas para el antígeno. La vacunación también
implica células presentadores de antígeno especializadas que pueden
procesar el antígeno y presentarlo en una forma que pueda estimular
una de las dos rutas.
La vacunación ha cambiado poco desde los tiempos
de Louis Pasteur. Se introduce un antígeno extraño en un animal
donde activa células B específicas por la unión a inmunoglobulinas
de la superficie. También se absorbe por células procesadoras de
antígenos, donde se degrada, y aparece en fragmentos en la
superficie de estas células unido a moléculas del MHC de clase II.
Los péptidos unidos a las moléculas de clase II son capaces de
estimular la clase de células T adyuvantes. Para producir una
inmunización humoral activa se requieren tanto células T adyuvantes
como células B activadas. Se cree que la inmunidad celular se
estimula por un mecanismo similar pero que no se comprende bien.
\newpage
De esta manera, dos rutas diferentes y distintas
de procesamiento de antígenos producen antígenos exógenos unidos a
moléculas de MHC de clase II donde pueden estimular células T
adyuvantes, así como proteínas endógenas degradas y unidas a
moléculas del MHC de clase I y reconocidas por la clase de células
T citotóxicas.
Hay poca o ninguna diferencia en la distribución
de las moléculas del MHC. Esencialmente todas las células nucleadas
expresan moléculas de clase I, mientras que las proteínas del MHC
de clase II se restringen a algunos tipos de células linfoides.
Los esquemas de vacunación normales siempre
producirán una respuesta inmune humoral. También pueden
proporcionar inmunidad citotóxica. El sistema humoral protege a un
individuo vacunado de la exposición posterior a un patógeno y puede
prevenir la extensión de una infección intracelular si el patógeno
pasa por una fase extracelular durante su ciclo de vida; sin
embargo, puede hacer relativamente poco para eliminar los patógenos
intracelulares. La inmunidad citotóxica complementa al sistema
humoral eliminando las células infectadas. De esta manera, una
vacunación eficaz activaría los dos tipos de inmunidad.
La respuesta de células T citotóxicas es
necesaria para retirar patógenos intracelulares tales como virus,
así como células malignas. Ha resultado difícil presentar un
antígeno administrado exógenamente en concentraciones adecuadas
junto con moléculas de clase I para asegurar una respuesta
adecuada. Esto ha impedido en gran medida el desarrollo de vacunas
contra antígenos específicos de tumores (por ejemplo, en células de
cáncer de mama o de colon) y contra proteínas virales débilmente
inmunogénicas (por ejemplo VIH, herpes, hepatitis no A y no B, CMV y
EBV).
Sería deseable proporcionar una respuesta inmune
celular sola en la inmunización contra agentes tales como virus
para los que se ha demostrado que los anticuerpos potencian la
infectividad. También sería útil proporcionar tal respuesta contra
infecciones virales tanto crónicas como latentes y contra células
malignas.
El uso de vacunas peptídicas sintéticas no
soluciona estos problemas porque los péptidos no se asocian
fácilmente con las moléculas de histocompatibilidad, tienen una
corta vida media en suero, se proteolizan rápidamente, o no
localizan específicamente a monocitos y macrófagos presentadores de
antígenos. En el mejor de los casos, todos los antígenos
administrados exógenamente deben competir con el universo de
autoproteínas por la unión a los macrófagos presentadores de
antígeno.
Se realizado grandes esfuerzos para inducir
respuestas inmunes contra proteínas virales poco inmunogénicas del
virus del herpes, de la hepatitis no A y no B, del VIH y similares.
Es difícil y peligroso propagar estos patógenos in vitro.
Como se ha mencionado anteriormente, se han obtenido vacunas de
péptidos sintéticos correspondientes a proteínas codificadas por
virus, pero tienen varios fallos. También se ha intentado usar
vectores del virus de la vaccinia para expresar proteínas de otros
virus. Sin embargo, los resultados han sido decepcionantes, ya que
(a) los virus de vaccinia recombinantes pueden eliminarse
rápidamente de la circulación en individuos que ya son inmunes, y
(b) la administración de antígenos virales complejos puede inducir
un fenómeno conocido como "competición antigénica" en el que
porciones débilmente inmunogénicas del virus no pueden inducir una
respuesta inmune porque con estas porciones compiten otras regiones
más potentes del antígeno administrado.
Otro problema importante con las vacunas de
proteínas o péptidos es la reacción anafiláctica que puede
producirse cuando se repiten inyecciones de antígeno con la
intención de producir una respuesta inmune potente. En este
fenómeno, los anticuerpos IgE formados en respuesta al antígeno
producen reacciones alérgicas severas y algunas veces fatales.
Por consiguiente, existe la necesidad de un
método para invocar una respuesta inmune segura y eficaz contra
este tipo de proteína o polipéptido. Además, existe una gran
necesidad de un método que asocie estos antígenos con antígenos de
histocompatibilidad de clase I presentes en la superficie celular
para inducir una respuesta de células T citotóxicas, evitar la
anafilaxis y la proteolisis del material en el suero y facilitar la
localización del material en monocitos y macrófagos.
Un gran número de estados de enfermedad pueden
beneficiarse de la administración de péptidos terapéuticos. Tales
péptidos incluyen linfoquinas, tales como
interleuquina-2, factor de necrosis tumoral, y los
interferones; factores de crecimiento, tales como el factor de
crecimiento de nervios, el factor de crecimiento epidérmico y la
hormona de crecimiento humana; activador de plasminógeno tisular;
factor VIII:C; factor estimulador de colonias de
granulocitos-macrófagos; eritropoyetina; insulina;
calcitonina; timidina quinasa; y similares. Además, la liberación
selectiva de péptidos tóxicos (tales como ricina, toxina diftérica
o factor de veneno de cobra) en células enfermas o neoplásicas puede
tener efectos terapéuticos beneficiosos importantes. Los sistemas
de liberación de péptidos actuales tienen problemas significativos,
incluyendo la incapacidad de incorporar eficazmente receptores de la
superficie celular funcionales en las membranas celulares, y la
necesidad de administrar sistémicamente grandes cantidades del
péptido (produciéndose efectos secundarios sistémicos indeseables)
para liberar una cantidad terapéutica del péptido dentro o sobre la
célula diana.
Estos problemas descritos anteriormente asociados
con la terapia génica, la inmunización y la liberación de péptidos
terapéuticos a las células se solucionan por medio de la presente
invención.
La presente invención se refiere a la
inmunización de un vertebrado.
En un aspecto, la presente invención proporciona
el uso de un liposoma cargado positivamente y un polinucleótido
expresable que codifica para un péptido inmunogénico en la
fabricación de un medicamento para administración a un mamífero,
donde dicho medicamento se incorpora en una célula donde se forma
un producto de traducción inmunogénico del polinucleótido, y el
producto se procesa y se presenta por la célula en el contexto del
complejo de histocompatibilidad principal, induciéndose de esta
manera una respuesta inmune contra el péptido inmunogénico.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona una composición que comprende liposomas cargados
positivamente mezclados con un polinucleótido expresable que
codifica para un péptido inmunogénico, para administración a un
mamífero, donde dicha composición se incorpora en una célula donde
se forma un producto de traducción inmunogénico del polinucleótido,
y el producto se procesa y se presenta por la célula en el contexto
del complejo de histocompatibilidad principal, induciéndose de esta
manera una respuesta inmune contra el péptido inmunogénico.
El polinucleótido puede ser un ARNm.
El polinucleótido puede ser un ADN que comprende
un promotor.
El medicamento o composición puede ser para la
administración por inyección en el músculo.
El medicamento o composición puede ser para la
administración por inyección en la piel.
El medicamento o composición puede ser para la
administración por introducción en una cavidad corporal.
El mamífero puede ser un ser humano.
El liposoma puede comprender cloruro de
N-(2,3-di-(9-(Z)octadeceniloxi))-prop-1-il-N,N,N-trimetilamonio
(DOTMA) o 1,2-bis(oleoiloxi)-3-(trimetilamonio)propano (DOTAP).
(DOTMA) o 1,2-bis(oleoiloxi)-3-(trimetilamonio)propano (DOTAP).
La práctica de la presente invención requiere la
obtención de polinucleótidos que codifican operativamente un
polipéptido para incorporación en células de vertebrados. Un
polinucleótido codifica operativamente para un polipéptido cuando
tiene toda la información genética necesaria para la expresión por
una célula diana, tales como promotores y similares. Estos
polinucleótidos pueden administrarse al vertebrado por cualquier
método que suministre materiales inyectables a las células del
vertebrado, tal como por inyección en el espacio intersticial de
tejidos tales como músculos o piel, introducción en la circulación
o en las cavidades corporales, o por inhalación o insuflación. Un
polinucleótido se inyecta o se suministra de otra manera al animal
con un vehículo líquido farmacéuticamente aceptable. Para todas las
aplicaciones, el vehículo líquido es acuoso o parcialmente acuoso,
comprendiendo agua estéril sin pirógenos. El pH de la preparación
se ajusta y se tampona convenientemente.
Las realizaciones de la invención requieren el
uso de liposomas y el polinucleótido se asocia con un liposoma, de
forma que la invención requiere un material para formar liposomas
cargados positivamente, y requiere realizar preparaciones
liposomales a partir de estos materiales. Al disponerse del
material liposomal, el polinucleótido ventajosamente puede usarse
para transfectar células in vitro para uso como agentes de
inmunización, o para administrar polinucleótidos en sitios
corporales donde los liposomas pueden ser absorbidos por células
fagocitarias.
Las secuencias de ADN usadas en estos métodos
pueden ser las secuencias que no se integran en el genoma de la
célula hospedadora. Pueden ser secuencias de ADN que no se replican
o secuencias de replicación específica modificadas por ingeniería
genética para carecer de la capacidad de integración en el
genoma.
Los polinucleótidos terapéuticos proporcionados
por la invención también pueden codificar polipéptidos que
confieren inmunidad, que actúan como inmunógenos endógenos para
provocar una respuesta humoral o celular, o ambas.
Las secuencias polinucleotídicas de la invención
preferiblemente codifican polipéptidos inmunogénicos, y estas
secuencias pueden usarse en asociación con otras secuencias
polinucleotídicas que codifican proteínas reguladoras que controlan
la expresión de estos polipéptidos. La proteína reguladora puede
actuar uniéndose al ADN genómico para regular su transcripción; como
alternativa, puede actuar por unión al ARN mensajero para aumentar
o reducir su estabilidad o eficacia de traducción.
El material polinucleotídico suministrado a las
células in vivo puede tomar cualquier número de formas, y la
presente invención no se limita a ningún polinucleótido particular
que codifique ningún polipéptido o grupo de polipéptidos particular.
Puede contener sólo un fragmento de un gen, o puede codificar
múltiples secuencias polipeptídicas, y además puede contener
secuencias de reconocimiento y promotoras. En la bibliografía se
han presentado plásmidos que contienen genes que codifican un gran
número de péptidos fisiológicamente activos y antígenos o
inmunógenos, y pueden obtenerse fácilmente por los especialistas en
la técnica.
\newpage
Cuando el polinucleótido es un ADN, son bien
conocidos los promotores adecuados para uso en diversos sistemas de
vertebrados. Por ejemplo, para uso en sistemas murinos, los
promotores fuertes adecuados incluyen LTR de RSV, LTR de MPSV, IEP
de SV40, y el promotor de metalotioneína. Por otra parte, en seres
humanos pueden usarse ventajosamente promotores tales como IEP de
CMV. Dentro de los métodos contemplados por la invención se
encuentran todas las formas de ADN, tanto si son replicativas como
si son no replicativas, que no se integran en el genoma, y que son
expresables. Al disponerse de equipos de síntesis de ácidos
nucleicos automáticos, pueden sintetizarse directamente tanto ADN
como ARN cuando se conoce la secuencia de nucleótidos, o por medio
de una combinación de clonación por PCR y fermentación. Además,
cuando se conoce la secuencia del polipéptido deseado, puede
deducirse una secuencia codificante adecuada del polinucleótido.
Cuando el polinucleótido es un ARNm, puede
prepararse fácilmente a partir del ADN correspondiente in
vitro. Por ejemplo, las técnicas convencionales utilizan ARN
polimerasas de fago SP6, T3 o T7 para preparar ARNm a partir de
plantillas de ADN en presencia de los ribonucleósido trifosfatos
individuales. Un promotor de fago apropiado, tal como un sitio de
origen de replicación de T7, se pone en el ADN de plantilla
inmediatamente cadena arriba del gen a transcribir. Los sistemas
que utilizan T7 de esta manera son bien conocidos, y se describen en
la bibliografía, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular
Biology, \NAK 3.8 (Vol.1 1988). Un método particularmente
preferido para obtener el ARNm usado en la presente invención se
indica en los ejemplos 2-5. Sin embargo, en
general, será evidente que en la puesta en práctica de la presente
invención puede usarse el plásmido pXGB o cualquier plásmido
similar que pueda construirse fácilmente por los especialistas
habituales en la técnica, con un número prácticamente ilimitado de
ADNc. Tales plásmidos pueden comprender ventajosamente un promotor
para una ARN polimerasa deseada, seguido de una región 5' no
traducida, una región 3' no traducida y una plantilla para un
tracto de poli A. Debe haber un solo sitio de restricción entre
estas regiones 5' y 3' para facilitar la inserción de cualquier
ADNc deseado en el plásmido. A continuación, después de la
clonación del plásmido que contiene el gen deseado, el plásmido se
linealiza cortando en la región de poliadenilación y se transcribe
in vitro para formar transcritos de ARNm. Estos transcritos
preferiblemente se proporcionan con un grupo terminal 5', como se
demuestra en el ejemplo 5. Como alternativa, puede usarse una
secuencia 5' no traducida tal como EMC que no requiera un grupo
terminal 5'.
Aunque lo anterior representa un método preferido
para preparar el ARNm, será evidente para los especialistas en la
técnica que también existen muchos métodos alternativos. Por
ejemplo, el ARNm puede prepararse en aparatos de síntesis de
nucleótidos disponibles en el mercado. Como alternativa, puede
prepararse ARNm en forma circular. Se prefieren los ARN resistentes
a exonucleasas tales como un ARNm circular, un ARNm bloqueado
químicamente y un ARNm con un extremo 5' terminal, debido a su
mayor vida media in vivo.
En particular, un ARNm preferido es un ARNm que
se autocirculariza que tiene el gen de interés precedido por la
región 5' no traducida del virus de la polio. Se ha demostrado que
el ARNm circular tiene una vida media extremadamente larga (Harland
& Misher, Development 102: 837-852
(1988)) y que la región 5' no traducida del virus de la polio puede
promover la traducción del ARNm sin el grupo protector 5' habitual
(Pelletier & Sonnenberg, Nature 334:
320-325 (1988), incorporado en este documento como
referencia).
Este material puede prepararse a partir de una
plantilla de ADN que produce un auto-empalme y
genera ARNm de "lazo" circulares usando el método de Been &
Cech, Cell 47:206-216 (1986) (incorporado en
este documento como referencia). Nosotros modificamos ese molde
incluyendo la región 5' no traducida del virus de la polio
inmediatamente cadena arriba del gen de interés, siguiendo el
procedimiento de Maniatis, T. et al. MOLECULAR CLONING: A
LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor, Nueva York (1982).
Además, la presente invención incluye el uso de
ARNm que está bloqueado químicamente en el extremo 5' y/o 3' para
impedir el acceso por la RNAsa. (Esta enzima es una exonucleasa y,
por lo tanto, no escinde el ARN en la mitad de la cadena.) Tal
bloqueo químico puede prolongar substancialmente la vida media del
ARN in vivo. En Clonetech Laboratories, Inc., Palo Alto,
California, están disponibles dos agentes que pueden usarse para
modificar el ARN: C2 AminoModifier (N!91! de catálogo
5204-1) y
Amino-7-dUTP (Nº de catálogo
K1022-1). Estos materiales añaden grupos reactivos
al ARN. Después de la introducción de cualquiera de estos agentes
en una molécula de ARN de interés, puede asociarse un substituyente
reactivo apropiado al ARN de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Por medio de la adición de un grupo con suficiente
volumen, puede impedirse el acceso al ARN modificado químicamente
por la RNAsa.
A diferencia de las terapias génicas propuestas
en el pasado, una ventaja principal de la presente invención es la
naturaleza transitoria de la síntesis de polinucleótidos en las
células. (Nosotros la llamamos terapia génica reversible o TGT). Con
el ARNm introducido de acuerdo con la presente invención, el efecto
generalmente durará aproximadamente un día. Además, en un notable
contraste con las terapias génicas propuestas en el pasado, el ARNm
no tiene que atravesar el núcleo para dirigir la síntesis de
proteínas; por lo tanto, no tiene susceptibilidad genética.
Sin embargo, en algunas situaciones puede
desearse un efecto más prolongado sin la incorporación del ácido
polinucleico exógeno en el genoma del organismo hospedador. Para
proporcionar tal efecto, una realización preferida de la invención
proporciona la introducción de una secuencia de ADN que codifica
para un polipéptido específico en la célula. De acuerdo con los
métodos de la invención, hemos descubierto que pueden introducirse
secuencias de ADN que no se replican en las células para
proporcionar la producción del polipéptido deseado durante períodos
de hasta aproximadamente seis meses, y no hemos observado indicios
de integración de las secuencias de ADN en el genoma de las células.
Como alternativa, puede conseguirse un efecto incluso más
prolongado por medio de la introducción de la secuencia de ADN en
la célula por medio de un vector plasmídico que tiene la secuencia
de ADN insertada en su interior. Preferiblemente, el plásmido
comprende además un replicador. Tales plásmidos son bien conocidos
para los especialistas en la técnica, por ejemplo, el plásmido
pBR322, con el replicador pMB1, o el plásmido pMK16, con el
replicador ColE1 (Ausubel, Current Protocols in Molecular
Biology, John Wiley and Sons, New York (1988) \NAK
II<:1.5.2.
Los resultados de estudios del transcurso de
tiempo de la expresión del ADN y el ARNm introducido en células
musculares como se describe en los ejemplos 1 y 13, indican que la
expresión del ARNm es más rápida, aunque tiene una duración más
corta que la expresión del ADN. Puede conseguirse una expresión
génica inmediata y de larga duración por la administración a la
célula de una preparación liposomal que comprende tanto ADN como ARN
polimerasa, tales como las polimerasas de fago T7, T3 y SP6. El
liposoma también incluye una fuente inicial de la ARN polimerasa
apropiada, incluyendo la propia enzima o, como alternativa, un ARNm
que codifica para esa enzima. Cuando el liposoma se introduce en el
organismo, libera el ADN y la fuente inicial de ARN polimerasa a la
célula. La ARN polimerasa, que reconoce los promotores en el ADN
introducido, transcribe los dos genes dando como resultado
productos de traducción que comprenden más ARN polimerasa y el
polipéptido deseado. La producción de estos materiales continúa
hasta que el ADN introducido (que normalmente está en forma de un
plásmido) se degrada. De esta manera, puede conseguirse la
producción del polipéptido deseado in vivo en pocas horas y
prolongarse durante un mes o más.
Los polinucleótidos pueden suministrarse al
espacio intersticial de tejidos del cuerpo animal, incluyendo los
de músculo, piel, cerebro, pulmón, hígado, bazo, médula ósea, timo,
corazón, linfa, sangre, hueso, cartílago, páncreas, riñón, vesícula
biliar, estómago, intestino, testículo, ovario, útero, recto,
sistema nervioso, ojo, glándulas y tejido conjuntivo. El espacio
intersticial de los tejidos comprende la matriz intercelular,
fluida, de mucopolisacárido entre las fibras reticulares de los
tejidos de los órganos, las fibras elásticas de las paredes de los
vasos o cámaras, las fibras de colágeno de tejidos fibrosos o la
misma matriz dentro del tejido conjuntivo que envuelve las células
musculares en las lagunas de hueso. De forma similar, el espacio
ocupado por el plasma de la circulación y el fluido linfático de los
canales linfáticos. Se prefiere la liberación en el espacio
intersticial del tejido muscular por las razones discutidas más
adelante.
Pueden suministrarse convenientemente por
inyección en los tejidos que comprenden estas células.
Preferiblemente, se suministran y se expresan en células
persistentes sin división que están diferenciadas, aunque pueden
conseguirse el suministro y la expresión en células no
diferenciadas o diferenciadas menos completamente tales como, por
ejemplo, células madre de fibroblastos de sangre o de piel. Hemos
descubierto que las células musculares in vivo son
particularmente competentes en su capacidad de absorber y expresar
polinucleótidos. Esta capacidad puede deberse a la arquitectura
tisular singular del músculo, que comprende células multinucleadas,
retículo sarcoplásmico y sistemas tubulares transversales. Los
polinucleótidos pueden entrar en el músculo a través del sistema
tubular transversal, que contiene fluido extracelular y se extiende
profundamente en la célula muscular. También es posible que los
polinucleótidos entren en células musculares dañadas que después se
recuperan.
El músculo también se usa ventajosamente como un
sitio para el suministro y expresión de polinucleótidos en varias
aplicaciones terapéuticas porque los animales tienen una masa
muscular proporcionadamente grande a la que convenientemente se
accede por inyección directa a través de la piel; por esta razón,
puede depositarse una dosis comparativamente grande de
polinucleótidos en el músculo por inyecciones múltiples, y
fácilmente se realizan inyecciones repetitivas para prolongar la
terapia durante largos períodos de tiempo, y pueden realizarse de
forma segura y sin experiencia o dispositivos especiales.
El tejido muscular puede usarse como sitio para
inyección y expresión de polinucleótidos. En estrategias de
inmunización, a las células musculares se les pueden inyectar
polinucleótidos que codifican para péptidos inmunogénicos, y estos
péptidos se presentarán por las células musculares en el contexto
de antígenos del complejo principal de histocompatibilidad para
provocar una respuesta inmune seleccionada contra el
inmunógeno.
De acuerdo con la invención, pueden suministrarse
tanto ADN expresable como ARNm a las células para formar en las
mismas un producto de traducción polipeptídico. Si los ácidos
nucleicos contienen las secuencias de control apropiadas, dirigirán
la síntesis de cantidades relativamente grandes de la proteína
codificada. Cuando el ADN y el ARNm suministrado a las células
codifica para un péptido de inmunización, los métodos pueden
aplicarse para conseguir una inmunidad mejorada y más eficaz contra
agentes infecciosos, incluyendo virus intracelulares, y también
contra células tumorales.
Como los sistemas inmunes de todos los
vertebrados funcionan de forma similar, las aplicaciones descritas
pueden realizarse en todos los sistemas de vertebrados, que
comprenden especies de mamíferos y de aves, así como peces.
Los métodos de la invención pueden aplicarse por
inyección directa del polinucleótido en células del animal in
vivo. Los polinucleótidos pueden suministrarse a diversas
células del cuerpo del animal, incluyendo músculo, piel, cerebro,
pulmón, hígado, bazo o las células de la sangre. La liberación de
los polinucleótidos directamente in vivo preferiblemente se
realiza en células de músculo o piel. Los polinucleótidos pueden
inyectarse en músculo o piel usando una jeringa de inyección.
También pueden suministrarse en el músculo o piel usando una pistola
de vacunas.
Recientemente, se ha demostrado que, en ciertas
aplicaciones, pueden usarse lípidos catiónicos para facilitar la
transfección de las células, particularmente la transfección in
vitro. Se prefiere la tecnología de transfección basada en
lípidos catiónicos a los otros métodos; es más eficaz y conveniente
que los métodos de fosfato cálcico, DEAE dextrano o electroporación,
y la transfección mediada por virus, como se ha descrito
previamente, puede conducir a sucesos de integración en el genoma de
la célula hospedadora que ocasionan la activación de oncogenes u
otras consecuencias indeseables. El conocimiento de que la
tecnología de lípidos catiónicos funciona con el ARN mensajero es
una ventaja adicional para esta estrategia, porque el ARN se
modifica rápidamente por nucleasas intracelulares y no se integra
en el genoma del hospedador. Se prefiere un sistema de transfección
que produce altos niveles de expresión reversible a una metodología
alternativa que requiere la selección y expansión de clones
transformados de forma estable, porque muchas de las células diana
deseadas no se dividen rápidamente en cultivo.
La capacidad de transfectar células con alta
eficacia con liposomas catiónicos proporciona un método alternativo
para la inmunización. El gen para un antígeno se introduce en las
células que se han retirado de un animal. Las células transfectadas,
que ahora expresan el antígeno, se vuelven a inyectar en el animal
donde el sistema inmune puede responder al antígeno (ahora)
endógeno. El proceso posiblemente puede mejorarse por medio de la
coinyección de un adyuvante o linfoquinas para estimular
adicionalmente las células linfoides.
La vacunación con ácidos nucleicos que contienen
un gen para un antígeno también puede proporcionar una forma para
dirigir específicamente la respuesta inmune celular. Las células
que expresan proteínas que se secretan entrarán en las rutas de
procesamiento de antígenos normales y producirán tanto una
respuesta humoral como una respuesta citotóxica. La respuesta a
proteínas que no se secretan es más selectiva. Es de esperar que
las proteínas no secretadas sintetizadas en células que expresan
sólo moléculas del MHC de clase I produzcan sólo una vacunación
citotóxica. La expresión del mismo antígeno en células que llevan
moléculas tanto de clase I como de clase II puede producir una
respuesta más vigorosa por la estimulación tanto de células
citotóxicas como de células T adyuvantes. También es posible la
potenciación de la respuesta inmune por inyección del gen del
antígeno junto con un fragmento peptídico del antígeno. El antígeno
se presenta mediante moléculas del MHC de clase I al sistema inmune
celular, mientras que el péptido se presenta mediante moléculas del
MHC de clase II para estimular las células T adyuvantes. En
cualquier caso, este método proporciona una forma de estimular y
modular la respuesta inmune de una manera que previamente no se ha
podido conseguir.
Un inconveniente importante de las vacunas de
subunidad es que los antígenos de glicoproteínas rara vez se
modifican correctamente en los sistemas de expresión recombinante
usados para obtener los antígenos. La introducción del gen para un
antígeno de glicoproteína asegurará que el producto proteico se
sintetiza, se modifica y se procesa en la misma especie y en las
mismas células que la proteína patógena. De esta manera, la
expresión de un gen para una glicoproteína viral humana contendrá
el complemento correcto de restos de azúcar. Esto es importante
porque se ha demostrado que un componente substancial de los
anticuerpos neutralizadores en algunos sistemas virales se dirigen a
epítopos de carbohidrato.
Cualquier antígeno apropiado que sea un candidato
para una respuesta inmune, ya sea humoral o celular, puede usarse
en su forma de ácido nucleico. Las células pueden proceder de
fibroblastos tomados de un individuo que proporciona una fuente
conveniente de células que expresan sólo moléculas del MHC de clase
I. Como alternativa, pueden aislarse rápidamente células de sangre
periférica a partir de sangre entera para proporcionar una fuente de
células que contenga proteínas tanto del MHC de clase I como de
clase II. Si se desea, pueden fraccionarse adicionalmente en células
B, células T adyuvantes, células T citotóxicas o
macrófagos/monocitos. Las células de médula ósea pueden proporcionar
una fuente de células linfoides menos diferenciadas. En todos los
casos, la célula se transfectará con un ADN que contiene un gen
para el antígeno o por el ARNm protegido terminalmente y
poliadenilado apropiado transcrito a partir de ese gen o un ARN
circular, un ARN modificado químicamente o un ARN que no requiere
protección 5'. La elección del nucleótido de transfección puede
depender de la duración de la expresión deseada. Para la
vacunación, se prefiere una expresión reversible del péptido
inmunogénico, como ocurre con la transfección del ARNm. Las células
transfectadas se inyectan dentro del animal y las proteínas
expresadas se procesarán y presentarán al sistema inmune por las
rutas celulares normales.
Tal estrategia se ha usado para producir
inmunidad citotóxica en sistemas modelo en ratones, líneas
celulares y células malignas que crecen de forma continua, que
pueden transformarse establemente con ADN. Cuando las células se
inyectan en animales, inducen inmunidad celular al antígeno
expresado. El sistema de liberación de lípidos catiónico permitirá
extender esta estrategia a células normales no malignas tomadas de
un paciente.
Hay varias aplicaciones para esta estrategia de
dirección de inmunidad celular. La primera es la vacunación contra
virus en los que se sabe que se requieren anticuerpos o que
aumentan la infección viral. Hay dos estrategias que pueden
aplicarse en este caso. Una puede dirigir específicamente la ruta
celular durante la inmunización, eliminando de esta manera los
anticuerpos potenciadores. Como alternativa, se puede vacunar con
el gen para un antígeno truncado, eliminándose de esta manera los
epítopos humorales que aumentan la infectividad.
El uso de una terapia de vacuna de ADN o ARNm
podría proporcionar de forma similar un medio para provocar una
respuesta de células T citotóxicas eficaz contra tumores débilmente
antigénicos. Proponemos, por ejemplo, que si se expresara un
antígeno específico de tumor por un ARNm dentro de una célula en
una forma ya procesada, y se incorporara directamente en las
moléculas de clase I en la superficie celular, se induciría una
respuesta de células T citotóxicas.
Una segunda aplicación es que esta estrategia
proporciona un método para tratar infecciones virales latentes.
Varios virus (por ejemplo, hepatitis B, VIH y miembros del grupo de
los virus del herpes) pueden establecer infecciones latentes en las
que el virus se mantiene intracelularmente en una forma inactiva o
parcialmente activa. Hay pocas formas de tratar tales infecciones.
Sin embargo, por medio de la inducción de una inmunidad citolítica
contra una proteína viral latente, serán dianas y se eliminarán las
células infectadas de forma latente.
Una aplicación relacionada de esta estrategia es
para el tratamiento de infecciones patogénicas crónicas. Hay
numerosos ejemplos de patógenos que se replican lentamente y se
extienden directamente de una célula a otra. Estas infecciones son
crónicas, en algunos casos durando años o décadas. Son ejemplos de
estos patógenos los virus lentos (por ejemplo, Visna), el agente del
Scrapie y el VIH. Se pueden eliminar las células infectadas
induciendo una respuesta celular contra proteínas del patógeno.
Finalmente, esta estrategia también se puede
aplicar al tratamiento de enfermedades malignas. La vacunación para
crear una respuesta inmune celular contra una proteína específica
del estado maligno, siendo ésta un oncogen activado, un antígeno
fetal o un marcador de activación, dará como resultado la
eliminación de estas células. De esta forma, el uso de vacunas de
ADN/ARNm podría aumentar en gran medida la inmunogenicidad de
ciertas proteínas virales, y antígenos específicos del cáncer, que
normalmente inducen una respuesta inmunológica deficiente. La
técnica de vacunas de ARNm sería aplicable a la inducción de
inmunidad de células T citotóxicas contra proteínas virales poco
inmunogénicas de virus del herpes, de la hepatitis no A y no B, y
del VIH, y evitaría los riesgos y las dificultades asociadas con la
propagación in vitro de estos virus. En el caso de los
antígenos de la superficie celular, tales como proteínas de la
cubierta viral (por ejemplo, gp120 de VIH), el antígeno se
expresaría en la superficie de la célula diana en el contexto del
complejo principal de histocompatibilidad (MHC), lo cual se
esperaría que diera como resultado una respuesta inmune más
apropiada, vigorosa y real. Es este factor el que produce
respuestas inmunes más eficaces observadas frecuentemente con
vacunas de virus atenuados. El suministro de un solo gen de
antígeno por TGT sería mucho más seguro que los virus atenuados, que
pueden proporcionar una baja frecuencia de la enfermedad debido a
una atenuación inadecuada.
Hay una ventaja adicional de TGT que puede
explotarse durante la fase de desarrollo de vacunas. Una de las
dificultades que surge con el desarrollo de las vacunas es el
requisito de seleccionar diferentes variantes estructurales del
antígeno, para conseguir la respuesta inmune óptima. Si la variante
procede de una fuente recombinante, la proteína normalmente debe
expresarse y purificarse antes de que pueda ensayarse con respecto
a la antigenicidad. Éste es un proceso laborioso y que requiere
mucho tiempo. Con la mutagénesis in vitro, es posible obtener
y secuenciar numerosos clones de un antígeno dado. Si estos
antígenos pueden seleccionarse con respecto a la antigenicidad a
nivel del ADN o del ARN por TGT, el programa de desarrollo de
vacunas podría realizarse de forma mucho más rápida.
Finalmente, en el caso de las vacunas de
ADN/ARNm, el antígeno proteico nunca se expone directamente al
anticuerpo del suero, pero siempre se produce por las propias
células transfectadas después de la traducción del ARNm. Por lo
tanto, la anafilaxis no debe ser un problema. De esta manera, la
presente invención permite que el paciente se inmunice repetidamente
sin el riesgo de reacciones alérgicas. El uso de las vacunas de
ADN/ARNm de la presente invención hace que sea posible tal
inmunización.
Se pueden concebir fácilmente las formas en las
que esta tecnología puede modificarse para aumentar adicionalmente
la inmunogenicidad de antígenos. La inmunización de células T puede
aumentarse aumentando la densidad de antígenos de
histocompatibilidad de clase I y de clase II sobre el macrófago u
otras superficies celulares y/o induciendo en la célula transfectada
la liberación de citoquinas que promuevan la proliferación de
linfocitos. Para este fin, se pueden incorporar en los mismos
liposomas que contienen ARNm para el antígeno, otras especies de
ARNm que codifican interferones o interleuquina-1.
Se sabe que estas citoquinas potencian la activación de macrófagos.
Su uso sistémico se ha visto impedido debido a la aparición de
efectos secundarios. Sin embargo, cuando se encapsulan en ARNm
junto con ARNm para el antígeno, deben expresarse sólo por las
células que coexpresan el antígeno. En esta situación, la inducción
de inmunidad de células T puede aumentarse en gran medida.
Sales de polinucleótidos: dentro del alcance de
la invención se incluye la administración de sales
farmacéuticamente aceptables de los polinucleótidos descritos en
este documento. Tales sales pueden prepararse a partir de bases no
tóxicas farmacéuticamente aceptables incluyendo bases orgánicas y
bases inorgánicas. Las sales derivadas de bases inorgánicas incluyen
sodio, potasio, litio, amonio, calcio, magnesio y similares. Las
sales derivadas de bases no tóxicas orgánicas farmacéuticamente
aceptables incluyen sales de aminas primarias, secundarias y
terciarias, aminoácidos básicos y similares. Como discusión útil de
sales farmacéuticas, véase S.M. Berge et al., Journal of
Pharmaceutical Sciences 66:1- 19 (1977) cuya descripción se
incorpora en este documento como referencia.
Los polinucleótidos para inyección, una vía de
administración preferida, pueden prepararse en forma de
dosificación unitaria en ampollas o en recipientes de múltiples
dosis. Los polinucleótidos pueden presentarse en formas tales como
suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o
preferiblemente acuosos. Como alternativa, la sal de polinucleótido
puede estar en forma liofilizada para reconstituirse, en el momento
del suministro, con un vehículo adecuado, tal como agua estéril sin
pirógenos. Las formas líquidas, así como las formas liofilizadas,
que se van a reconstituir comprenderán agentes, preferiblemente
tampones, en cantidades necesarias para ajustar convenientemente el
pH de la solución inyectada. Para cualquier uso parenteral,
particularmente si la formulación se va a administrar por vía
intravenosa, la concentración total de solutos debe controlarse para
hacer la preparación isotónica, hipotónica o débilmente
hipertónica. Se prefieren materiales no iónicos, tales como
azúcares, para ajustar la tonicidad, y se prefiere particularmente
la sacarosa. Cualquiera de estas formas puede comprender
adicionalmente agentes de formulación adecuados, tales como almidón
o azúcar, glicerol o solución salina. Las composiciones por
dosificación unitaria, ya sean líquidas o sólidas, pueden contener
de un 0,1% a un 99% de material polinucleotídico.
Las ampollas de dosificación unitaria o los
recipientes de múltiples dosis, en los que los polinucleótidos se
envasan antes del uso, pueden comprender un recipiente cerrado
herméticamente que encierra una cantidad de polinucleótido o de
solución que contiene un polinucleótido adecuada para conseguir una
dosis farmacéuticamente eficaz del mismo, o múltiplos de una dosis
eficaz. El polinucleótido se envasa como una formulación estéril, y
el recipiente cerrado herméticamente se diseña para conservar la
esterilidad de la formulación hasta el uso.
El recipiente en el que se envasa el
polinucleótido se etiqueta, y la etiqueta lleva una indicación en
la forma prescrita por una agencia gubernamental, por ejemplo, la
administración de alimentos y fármacos, reflejando dicha indicación
la aprobación por la agencia según las leyes federales, de la
fabricación, uso o venta del material polinucleotídico para
administración humana.
Las leyes federales requieren que el uso de
agentes farmacéuticos en la terapia de seres humanos se apruebe por
una agencia del gobierno federal. La administración de alimentos y
fármacos, que emite regulaciones apropiadas para afianzar tal
aprobación, detalladas en 21 U.S.C. 301-392, es la
responsable de la ejecución. También se proporciona la regulación
del material biológico, que comprende productos obtenidos a partir
de tejidos de animales, según el artículo 42 U.S.C 262. En la
mayoría de los países extranjeros se requiere una aprobación
similar. Las regulaciones varían de un país a otro, pero los
procedimientos individuales son bien conocidos para los
especialistas en la técnica.
La dosificación a administrar depende en gran
medida del estado y de las dimensiones del sujeto que se va a
tratar, así como de la frecuencia de tratamiento y la vía de
administración. Los regímenes para una terapia de continuación,
incluyendo la dosis y la frecuencia, pueden guiarse por la
respuesta inicial y por el criterio clínico. Se prefiere la vía de
inyección parenteral en el espacio intersticial de tejidos, aunque
pueden requerirse otras vías parenterales, tales como inhalación de
una formulación de aerosol, en una administración específica, por
ejemplo, en las membranas mucosas de la nariz, garganta, tejidos
bronquiales o pulmones.
Al igual que los protocolos de transferencia de
genes basados en ADN requieren señales apropiadas para la
transcripción (promotores, potenciadores) y el procesamiento
(señales de empalme, señales de poliadenilación) del transcrito de
ARNm, la TGT basada en ARNm requiere los elementos estructurales y
de secuencia apropiados para una traducción eficaz y correcta, junto
con los elementos que potenciarán la estabilidad del ARNm
transfectado.
En general, se ha descubierto que la eficacia de
la traducción se regula por elementos de secuencia específicos en
la región 5' no codificante o no traducida (5'UTR) del ARN. Los
motivos de secuencia positivos incluyen la secuencia consenso de
inicio de la traducción (GCC)^{A}CCATGG (Kozak,
Nucleic Acids Res. 15:8125 (1987)) y la estructura de
protección 5^{G} 7 metil GpppG (Drummond et al., Nucleic
Acids Res. 13:7375 (1985)). Los elementos negativos incluyen
estructuras 5'UTR tallo- bucle intramoleculares estables (Muesing et
al., cell 48:691(1987)) y secuencias AUG o fases de
lectura abierta cortas precedidas por un codón AUG apropiado en el
5' UTR ((Kozak, Supra, Rao et al., Mol. and Cell. Biol.
8:284(1988)). Además, ciertos motivos de secuencia tales
como la 5' UTR de la beta globina pueden actuar para potenciar la
traducción (cuando se ponen adyacentes a una 5' UTR heteróloga) por
un mecanismo desconocido. También hay ejemplos de secuencias de 5'
UTR específicas que regulan la eficacia de la traducción eucariota
en respuesta a señales ambientales. Éstas incluyen la 5' UTR de la
ferritina humana (Hentze et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
84:6730 (1987)) y hsp^{7}0,5'UTR de drosophila
(Klemenz et al., EMBO Journal 4:2053 (1985)). Finalmente,
existen secuencias 5' UTR virales que pueden evitar la traducción
normal dependiente de grupos terminales y los controles de la
traducción y mediar una traducción eficaz de ARNm virales o
quiméricos (Dolph et al., J. of Virol. 62:2059 (1988)),
Pelletier and Sonnenberg, Nature 334, 320 (1988)). Por lo
tanto, los protocolos de la TGT basados en ARNm incluyen elementos
de la traducción 5' UTR apropiados que flanquean la secuencia
codificante para la proteína de interés. Además de los problemas de
traducción, debe considerarse la estabilidad del ARNm durante el
desarrollo de los protocolos de TGT basados en ARNm. Como
indicación general, la protección terminal y la poliadenilación 3'
son los determinantes positivos principales de la estabilidad del
ARNm eucariota (Drummond supra; Ross, Mol. Biol. Med.
5: 1 (1988)) y actúan protegiendo los extremos 5' y 3' del ARNm
de la degradación. Sin embargo, también se han definido elementos
reguladores que afectan a la estabilidad de los ARNm eucariotas y,
por lo tanto, deben considerarse en el desarrollo de protocolos de
TGT de ARNm. El más notable y el definido más claramente de éstos
son las secuencias desestabilizadoras de la región 3' no traducida
rica en uridina (3'UTR) encontradas en muchos ARNm de vida corta
(Shaw y Kamen Cell 46:659 (1986)), aunque hay indicios de
que estos no son los únicos motivos de secuencia que ocasionan la
desestabilización del ARNm (Kabnick y Housman, Mol. and Cell
Biol. 8:3244 (1988)). Además, también se han mostrado
secuencias reguladoras específicas que modulan la vida media del
ARNm celular en respuesta a estímulos ambientales. Éstas incluyen
la modulación mediada por estrógenos de la estabilidad del ARNm de
la vitelogenina (Brock y Shapiro, Cell 34:207 (1983)), la
regulación dependiente de hierro de la estabilidad del ARNm del
receptor de transferrina (Mullner y Kuhn, Cell 53:815 (1988))
que se debe a un motivo 3' UTR específico, el control mediado por
prolactina de la estabilidad del ARNm de caseína (Guyette et al.,
Cell 17:1013 (1989)), la regulación de la estabilidad del
ARNm de fibronectina en respuesta a varios estímulos (Dean et al.,
J. Cell. Biol. 106:2159 (1988)), y el control de la
estabilidad del ARNm de histonas (Graves et al., Cell 48:615
(1987)). Finalmente, como se han desarrollado secuencias de ARN
virales que evitan los controles normales de la traducción del ARNm
eucariota, de forma similar, algunas secuencias de ARN viral
parecen poder conferir estabilidad en ausencia de poliadenilación 3'
(McGrae y Woodland, Eur. J. of Biochem. 116:467 (1981)). Se
sabe que algunos 5', tales como EMC, de acuerdo con el ejemplo 21,
funcionan sin un grupo protector. Esta cacofonía de elementos
moduladores de la estabilidad también debe considerarse
cuidadosamente en el desarrollo de protocolos de TGT basados en
ARNm, y puede usarse para modular el efecto de un tratamiento de
ARNm.
En el momento actual está muy desarrollada la
ciencia de formación de liposomas. Los liposomas son vesículas
unilamelares o multilamelares que tienen una porción de membrana
formada de un material lipófilo y una porción acuosa interior. La
porción acuosa se usa en la presente invención para contener el
material polinucleotídico a suministrar a la célula diana.
Se prefiere que los materiales formadores de
liposomas usados en este documento tengan un grupo catiónico, tal
como un grupo amonio cuaternario, y uno o más grupos lipófilos,
tales como grupos alquilo saturados o insaturados que tienen de
aproximadamente 6 a aproximadamente 30 átomos de carbono. En la
Publicación de Patente Europea Nº 0187702 se describe un grupo de
materiales adecuado. Estos materiales tienen la fórmula:
donde R^{1} y R^{2} son iguales o diferentes
y son alquilo o alquenilo de 6 a 22 átomos de carbono, R^{3},
R^{4} y R^{5} son iguales o diferentes y son hidrógeno,
alquilo de 1 a 8 carbonos, arilo, aralquilo de 7 a 11 carbonos, o
cuando dos o tres de R^{3}, R^{4} y R^{5} se toman
conjuntamente, forman quinuclidino, piperidino, pirrolidino o
morfolino; n es de 1 a 8, y X es un anión farmacéuticamente
aceptable, tal como un halógeno. Estos compuestos pueden prepararse
como se detalla en la solicitud de patente identificada
anteriormente; como alternativa, al menos uno de estos compuestos,
el cloruro de
N-(2,3-di-(9-(Z)-octadeceniloxi))-prop-1-
il-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA),
está disponible en el mercado en Bethesda Research Laboratories
(BRL), Gaithersburg, Maryland 20877,
USA.
Sin embargo, estos compuestos de diéter de amonio
cuaternario tienen algunos inconvenientes. Debido a los enlaces
éter, no se metabolizan fácilmente in vivo. Cuando se
contempla la terapia a largo plazo, hay alguna posibilidad de que
estos materiales puedan acumularse en los tejidos, produciendo
finalmente enfermedades de almacenamiento de lípidos y efectos
secundarios tóxicos. Por consiguiente, una clase preferida de
composiciones para uso en la presente invención tiene la
fórmula:
donde R^{1} y R^{2} son iguales o diferentes
y son alquilo o alquenilo de 5 a 21 átomos de carbono, R^{3},
R^{4} y R^{5} son iguales o diferentes y son hidrógeno,
alquilo de 1 a 8 carbonos, arilo, aralquilo de 7 a 11 carbonos, o
cuando dos o tres de R^{3}, R^{4} y R^{5} se toman
conjuntamente, forman quinuclidino, piperidino, pirrolidino o
morfolino; n es de 1 a 8, y X es un anión farmacéuticamente
aceptable, tal como un halógeno. Estos compuestos pueden prepararse
usando técnicas convencionales, tales como substitución nucleófila
que implica un ácido carboxílico y un haluro de alquilo, por
transesterificación, o por condensación de un alcohol con un ácido
o un haluro de
ácido.
Además, en la bibliografía se describen muchos
compuestos lipídicos catiónicos formadores de liposomas adecuados.
Véase, por ejemplo, L. Stamatatos, et al., Biochemistry
27:3917-3925 (1988); H. Eibl, et al.,
Biophysical Chemistry 10:261-271 (1979).
En el mercado están disponibles liposomas
adecuados para uso en la presente invención. Los liposomas DOTMA,
por ejemplo, están disponibles con la marca comercial Lipofectin de
Bethesda Research Labs, Gaithersburg, Maryland.
Como alternativa, los liposomas pueden prepararse
a partir de materiales de partida fácilmente adquiribles o recién
sintetizados del tipo descrito previamente. La preparación de
liposomas DOTAP se detalla en el ejemplo 6. La preparación de
liposomas DOTMA se explica en la bibliografía, véase, por ejemplo,
P. Felgner, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA
84:7413-7417. Pueden usarse métodos similares
para preparar liposomas a partir de otros materiales lipídicos
catiónicos. Además, pueden usarse materiales convencionales de
formación de liposomas para preparar liposomas con carga negativa o
carga neutra. Tales materiales incluyen fosfatidil colina,
colesterol, fosfatidil-etanolamina y similares.
Ventajosamente, estos materiales también pueden mezclarse con
materiales de partida DOTAP o DOTMA en relaciones del 0% a
aproximadamente un 75%.
Pueden usarse métodos convencionales para
preparar otros liposomas no catiónicos. Estos liposomas no se
fusionan con las paredes celulares tan fácilmente como los liposomas
catiónicos. Sin embargo, se absorben por los macrófagos in
vivo y, de esta manera, son particularmente eficaces para
suministrar polinucleótidos a estas células. Por ejemplo, pueden
usarse dioleoil-fosfatidil colina (DOPC),
dioleoilfosfatidil glicerol (DOPG), y dioleoilfosfatidil etanolamina
(DOPE) en diversas combinaciones para obtener liposomas
convencionales, con o sin la adición de colesterol. De esta manera,
por ejemplo, pueden prepararse vesículas de DOPG/DOPC secando 50 mg
de cada uno del DOPG y del DOPC en una corriente de gas nitrógeno
en un vial de sonicación. La muestra se pone bajo una bomba de
vacío durante una noche y se hidrata al día siguiente con agua
desionizada. La muestra después se sonica durante 2 horas en un
vial tapado, usando un sonicador Heat Systems modelo 350 equipado
con una sonda de copa invertida (de tipo baño) a la potencia máxima
mientras que el baño se hace circular a 15ºC. Como alternativa,
pueden prepararse vesículas cargadas negativamente sin sonicación
para producir vesículas multilamelares o por extrusión a través de
membranas Nucleopore para producir vesículas unilamelares de tamaño
discreto. Se conocen otros métodos y están disponibles para los
especialistas en la técnica.
La presente invención se describe a continuación
con detalle usando los 23 ejemplos proporcionados más adelante; sin
embargo, los métodos descritos se pueden aplicar ampliamente como
se describe en este documento y no pretenden limitarse por los
ejemplos.
El material formador de liposomas catiónico
1,2-bis(oleoiloxi)-3-(trimetilamonio)propano
(DOTAP) se prepara como se indica por L. Stamatatos, et al. (supra)
o H. Eibl, et al. (supra).
En resumen, Stamatatos, et al. notifican que 1
mmol de 3-bromo-1,2 propanodiol
(Aldrich) se aciló durante 48 horas a 20ºC con 3 mmol de cloruro de
oleílo (recién preparado a partir de ácido oleico y cloruro de
oxaloílo) en éter dietílico sin alcohol, seco, (20 ml) que contenía
5 mmol de piridina seca. El precipitado de clorhidrato de piridinio
se separó por filtración y el filtrado se concentró en una
atmósfera de nitrógeno y se redisolvió en 10 ml de hexano. La
solución de hexano se lavó 3 veces con un volumen igual de una
mezcla 1:1 de metanol/NCOONa acuoso 0,1 N, pH 3,0, 3 veces con una
mezcla 1:1 de metanol/NaOH acuoso 0,1 N y una vez con NaCl acuoso
al 1%. El
3-bromo-1,2-bis-(oleoiloxi)propano
bruto después se agitó durante 72 horas en un tubo cerrado
herméticamente con una solución de trimetilamina al 15% en dimetil
sulfóxido seco (30 ml) a 25ºC. Los productos de esta reacción se
disolvieron en cloroformo (200 ml), que se lavó repetidamente con
una mezcla 1:1 de metanol/HCOONa acuoso 100 mM, pH 3,0 y después se
evaporó al vacío para producir un aceite amarillo claro. Este
material se purificó en una columna de ácido silícico
(Bio-Sil A, Bio-Rad Laboratories),
eluyendo con un gradiente del 0 al 15% de metanol en cloroformo
para dar el producto deseado en forma pura en metanol al
9-10%. El producto purificado era un aceite
incoloro viscoso que migra con un R_{f} de 0,4 en placas de
cromatografía de capa fina (gel de sílice G), que se revelaron con
50:15:5:5:2 de
CHCl_{3}/acetona/CH_{3}OH/CH_{3}COOH/H_{2}O.
Puede prepararse un ADN de plantilla adecuado
para la producción de un ARNm que codifique para un polipéptido
deseado de acuerdo con la metodología de ADN recombinante
convencional. Como se ha indicado previamente (P. Kreig, et al.,
Nucleic Acids Res. 12:7057-7070 (1984)), un
grupo protector 5' facilita la traducción del ARNm. Sin embargo, se
cree que las regiones 3' flanqueantes y la cola de poli A aumentan
la vida media del ARNm in vivo.
El vector de clonación SP6 fácilmente adquirible
proporciona regiones flanqueantes 5' y 3' procedentes de la
\beta-globina, un ARNm traducido de forma eficaz.
La construcción de este plásmido se detalla por Kreig, et al.
(supra), y se incorpora en este documento como referencia. En este
plásmido puede introducirse cualquier ADNc que contenga un codón de
iniciación, y puede prepararse ARNm a partir del ADN de plantilla
resultante. Este plásmido particular puede cortarse con BglII para
insertar cualquier ADNc deseado que codifique para un polipéptido de
interés.
Aunque pueden obtenerse buenos resultados con
pSP64T cuando se linealiza y después se transcribe in vivo
con la ARN polimerasa de SP6, preferimos usar las secuencias
flanqueantes de la \beta-globina de xenopus de
pSP64T con la ARN polimerasa del fago T7. Estas secuencias
flanqueantes se purifican a partir de pSP64T como el fragmento
HindIII a EcoRI pequeño (de aproximadamente 150 pb). Estas
secuencias después se insertan en un fragmento HindIII/EcoRI lineal
purificado (de aproximadamente 2,9 kpb) procedente de pIBI 31
(disponible en el mercado en International Biotechnologies, Inc.,
Newhaven, Connecticut 06535) con la ADN ligasa de T4. Los plásmidos
resultantes, denominados pXBG, se seleccionan con respecto a la
orientación y se utilizan para transformar células E. coli.
Estos plásmidos se adaptan para recibir cualquier gen de interés en
un solo sitio de restricción BglII, que se sitúa entre las dos
secuencias de \beta-globina de xenopus.
Un gen marcador conveniente para demostrar la
expresión in vivo de polinucleótidos exógenos es la
cloranfenicol acetiltransferasa, CAT. Se produjo un plásmido
pSP-CAT que contenía el gen CAT flanqueado por las
secuencias 5' y 3' de la \beta-globina de xenopus
añadiendo el gen CAT en el sitio BglII de pSP64T. Usamos el gen
CAT en forma del fragmento BamHI/HindIII pequeño de
pSV2-CAT (disponible en la American Type Culture
Collection, Rockville, Maryland, Nº de Acceso 37155). Sin embargo,
el gen CAT se usa comúnmente en biología molecular y está disponible
en numerosas fuentes. Tanto el fragmento BamHI/HindIII de CAT como
el pSP64T escindido con BglII se incubaron con el fragmento de
Klenow para generar extremos romos, y después se unieron con la ADN
ligasa de T4 para formar pSP-CAT.
Después se generó y se purificó el fragmento
PstI/HindIII pequeño, que comprende el gen CAT entre las secuencias
flanqueantes 5' y 3' de la \beta-globina de
pSP64T. pIBI31 (International Biotechnologies, Inc.) se escindió
con PstI y HindIII, y se purificó la secuencia lineal larga. Este
fragmento después se combinó con la secuencia que contenía el gen
CAT y los fragmentos se unieron con la ADN ligasa de T4 para formar
un plásmido denominado pT7CAT An. Los clones se seleccionan
basándose en la actividad \beta-galactosidasa con
Xgal y resistencia a ampicilina.
El ADN plasmídico del ejemplo 3 se desarrolla y
se prepara según Maniatis (supra), con la excepción de que no se
usa RNAsa, usando 2 centrifugaciones con CsCl para retirar el ARN
bacteriano. Específicamente, se cultivaron células E. coli
que contenían pT7CAT An del ejemplo 3, en medio LB que contenía
ampicilina. Las células después se sedimentaron por centrifugación a
5000 rpm durante 10 minutos en una centrífuga Sorvall
RC-5 (E.I. DuPont, Burbank, California 91510), se
resuspendieron en TE frío pH 8,0, se centrifugaron de nuevo durante
10 minutos a 5000 rpm, se resuspendieron en una solución de glucosa
a 50 mM, Tris-Cl 25 mM pH 8,0, EDTA 10 mM y lisozima
a una concentración de 40 mg/ml. Después de la incubación durante 5
a 10 minutos con inversión ocasional., se añadió NaOH 0,2 N que
contenía SDS al 1%, seguido, después de 10 minutos a 0ºC, de acetato
potásico 3 M y ácido acético 2 M. Después de 10 minutos más, el
material se centrifugó de nuevo a 6000 rpm y el sobrenadante se
retiró con una pipeta. El sedimento después se mezcló en 0,6
volúmenes de isopropanol (-20ºC), se mezcló y se almacenó a -20ºC
durante 15 minutos. El material después se centrifugó de nuevo a
10.000 rpm durante 20 minutos, esta vez en un rotor de cubo
giratorio HB4 (DuPont, supra), después de lo cual el sobrenadante
se retiró y el sedimento se lavó en EtOH al 70% y se secó a
temperatura ambiente. Después, el sedimento se resuspendió en 3,5
ml de TE, seguido de la adición de 3,4 g de CsCl y 350 \mul de
EtBr a una concentración de 5 mg/ml. El material resultante se puso
en un tubo de sellado rápido, rellenado hasta arriba con aceite
mineral. El tubo se centrifugó durante 3,5 horas a 80.000 rpm en una
centrífuga VTi80 (Beckman Instruments, Pasadena, California,
91051). La banda se retiró, y el material se centrifugó de nuevo,
constituyendo el volumen con 0,95 g de CsCl/ml y 0,1 ml de EtBr a 5
mg/ml en TE. El EtBr después se extrajo con un volumen igual de
N-Butanol saturado con TE después de añadir 3
volúmenes de TE a la banda, desechando la fase superior hasta que
la fase superior fue transparente. Después se añadieron 2,5
volúmenes de EtOH y el material se precipitó a -20ºC durante 2
horas. El precipitado de ADN resultante se usa como plantilla de
ADN para la preparación de ARNm in vitro.
El ADN del ejemplo 4 se linealizó cadena abajo de
la cola de poli A con un exceso de 5 veces de PstI. El ADN
linealizado después se purificó con dos extracciones de
fenol/cloroformo, seguido de dos extracciones de cloroformo. El ADN
después se precipitó con NaOAc (0,3 M) y 2 volúmenes de EtOH. El
sedimento se resuspendió a una concentración de aproximadamente 1
mg/ml en agua desionizada tratada con DEP.
A continuación se preparó un tampón de
transcripción, que comprendía Tris HCl 400 mM (pH 8,0), MgCl_{2}
80 mM, DTT 50 mM, y espermidina 40 mM. Después se añadieron los
siguientes materiales en orden a un volumen de agua tratada con DEP
a temperatura ambiente: 1 volumen de tampón de transcripción de T7,
preparado anteriormente; rATP, rCTP, y rUTP hasta una concentración
1 mM; rGTP hasta una concentración 0,5 mM; análogo del grupo
protector 7meG(5')ppp(5')G (New England Biolabs,
Beverly, Massachusetts, 01951) hasta una concentración 0,5 mM; la
plantilla de ADN linealizada preparada anteriormente a una
concentración de 0,5 mg/ml; RNAsin (Promega, Madison, Wisconsin)
hasta una concentración de 2000 U/ml; y ARN polimerasa de T7 (N.E.
Biolabs) hasta una concentración de 4000 U/ml.
Esta mezcla se incubó durante 1 hora a 37ºC. La
reacción de transcripción satisfactoria se indicó por el aumento de
la turbidez de la mezcla de reacción.
Después de la generación del ARNm, se añadió 2 U
RQ1 DNAsa (Promega) por microgramo de plantilla de ADN usada y se
dejó digerir la plantilla durante 15 minutos. Después, el ARN se
extrajo dos veces con cloroformo/fenol y dos veces con cloroformo.
El sobrenadante se precipitó con NaOAc 0,3 M en 2 volúmenes de
EtOH, y el sedimento se resuspendió en 100 \mul de agua
desionizada tratada con DEP por 500 \mul de producto de
transcripción. Esta solución se pasó sobre una columna de Sephadex
G50 sin RNAsa (Boehringer Mannheim Nº 100 411). El ARNm resultante
fue suficientemente puro como para usarse en la transfección de
vertebrados in vivo.
En la práctica de la presente invención, pueden
usarse ventajosamente varios métodos de preparación de liposomas.
Un liposoma particularmente preferido se obtiene a partir de DOTAP
como se indica a continuación:
Una solución de 10 mg de dioleoil
fosfatidiletanolamina (PE) y 10 mg de DOTAP (del ejemplo 1) en 1 ml
de cloroformo se evapora a sequedad bajo una corriente de nitrógeno,
y el disolvente residual se retira al vacío durante una noche. Se
preparan liposomas resuspendiendo los lípidos en agua desionizada
(2ml) y sonicando la suspensión hasta que se vuelva transparente en
un vial cerrado. Estas preparaciones son estables durante al menos 6
meses.
Se prepararon complejos polinucleotídicos
mezclando 0,5 ml de solución de polinucleótido (por ejemplo, del
ejemplo 5) a una concentración de 0,4 mg/ml por adición lenta a
través de una jeringa, con una agitación vorticial suave constante,
con una solución de 0,5 ml de liposomas DOTMA/PE o DOTAP/PE
sonicados a 20 mg/ml, a temperatura ambiente. Este procedimiento
produce complejos cargados positivamente que suministran
espontáneamente el polinucleótido en células in vivo. Pueden
usarse diferentes relaciones entre liposomas cargados positivamente
y polinucleótido para adaptarse a las necesidades particulares en
cualquier situación particular. Como alternativa, como se presenta
por Felgner et al. (supra), puede ser ventajoso diluir el
polinucleótido (ADN o ARN) con solución salina tamponada de Hepes
(NaCl 150 mM; Hepes 20 mM, pH 7,4) antes de combinar los materiales
para formar espontáneamente complejos de liposoma/polinucleótido.
Sin embargo, en muchos casos, se cree que es preferible el uso de
soluciones que tienen una baja resistencia iónica (tales como
sacarosa) en lugar de solución salina; en particular, se cree que
tales soluciones facilitan la liberación de polinucleótidos en la
célula minimizando la precipitación del complejo de
polinucleótido/lípido.
Se demostró la capacidad del ARNm que codifica
para la cloranfenicol acetil transferasa (CAT) para transfectar
células in vivo y la posterior expresión de la proteína CAT,
por inyección directa de 0,200 \mul de cada una de las
formulaciones indicadas más adelante, preparadas como se indica, en
el músculo abdominal de ratas, formando una vesícula. Se ensayaron
seis réplicas de cada formulación. Después de un período de 12 a 14
horas, se escindió el segmento del músculo abdominal en el que se
realizó la inyección, que pesaba aproximadamente de 0,1 a 0,2
gramos, se trituró y se puso en un mortero desechable de 1,5 ml
(Kontes, Morton Grove, Illinois) junto con 200 ml de una formulación
acuosa que tenía los siguientes componentes: Tris 20 mM, pH 7,6;
MgCl_{2} 2 mM; y tensioactivo Triton X-100 al
0,1%. El contenido del mortero después se trituró durante 1 minuto
con una mano desechable. El mortero después se cubrió (con
Parafilm) y se puso en una bomba de ruptura de células Parr de 1
litro (Parr Instrument Company, Moline, Illinois) y se presurizó a 6
atmósferas con nitrógeno a 4ºC. Después de 30 minutos, la presión
se liberó rápidamente para romper el tejido y producir un lisado
bruto. El lisado después se centrifugó en una microcentrífuga a
13.000 rpm, a 4ºC, durante 10 minutos. El sobrenadante después se
decantó y se almacenó a -20ºC hasta que se analizó.
Los lisados después se ensayaron con respecto a
la presencia de la proteína CAT por cromatografía de capa fina.
Primero, se incubaron 75 \mul de cada muestra (del sobrenadante
preparado anteriormente) durante dos horas a 37ºC con 5 \mul de
C^{14} cloranfenicol (Amersham), 20 \mul de Acetil CoA 4 mM; y
50 \mul de Tris 1 M, pH 7,8. Posteriormente, se añadieron 20
\mul de Acetil CoA 4 mM y la mezcla se incubó de nuevo durante 2
horas a 37ºC. La solución resultante se extrajo con 1 ml de EtOAc,
y la fase orgánica se retiró y se liofilizó en una centrífuga de
vacío (SpeedVac, Savant Co.). El sedimento se resuspendió en 20
\mul de EtOAc, y se aplicó en puntos sobre una placa de
cromatografía de capa fina de gel de sílice. La placa se reveló
durante 45 minutos en 95% de cloroformo/5% de metanol, se secó y se
pulverizó con un indicador radioluminiscente (Enhance Spray for
Surface Radiography, New England Nuclear Corp.). La placa después
se intercaló con una película kodak XAR5 con la exposición durante
una noche a -70ºC, y la película se reveló según las instrucciones
del fabricante. Se obtuvieron los siguientes resultados:
\newpage
Formulación | Expresión de ARNm |
(Nº positivo/total) | |
1. 1 ml de Optimem; 37,5 \mug de DOTMA | 0/6 |
2. 1 ml de Optimem; 15 \mug de ARN de CAT. | 3/6 |
3. Formulación 1 más 15 \mug de ARN de CAT | 4/6 |
4. Sacarosa al 10%; 37,5 \mug de DOTMA; 15 \mug de ARN de CAT | 3/6 |
5. Sacarosa al 10%; 187 \mug de DOTMA; 75 \mug de ARN de CAT | 0/6 |
Optimem: medio sin suero (Gibco Laboratories,
Life Technologies, Inc, Grand Island, N.Y. 14072)
DOTMA: (marca Lipofectin; Bethesda Research Labs,
Gaithersburg, MD)
ARN de CAT: del ejemplo 5
Todas las formulaciones se realizaron en agua sin
RNAsa tratada con DEPC (International Biotechnologies, Inc., New
Haven, CT 06535).
Se prepara una formulación liposomal que contiene
ARNm que codifica para la proteína gp120 del virus VIH de acuerdo
con los ejemplos 1 a 5, con la excepción de que el gen para gp120
(pIIIenv3-1 del Aids Research and Reagent Program,
National Institute of Allergy and Infectious Disease, Rockville, MD
20852) se inserta en el plásmido pXBG en el procedimiento del
ejemplo 4. Se inyecta un volumen de 200 \mul de una formulación,
preparada de acuerdo con el ejemplo 6 y que contiene 200 \mu g/ml
de ARNm de gp120 y 500 \mu g/ml de una mezcla 1:1 de DOTAP/PE en
sacarosa al 10%, en la vena de la cola de ratones 3 veces al día.
Aproximadamente 12-14 horas después de la última
inyección, se retira un segmento de músculo del sitio de inyección
y se prepara como un lisado celular de acuerdo con el ejemplo 7. La
proteína gp120 específica de VIH se identifica en el lisado también
de acuerdo con los procedimientos del ejemplo 7.
La capacidad del anticuerpo gp120 presente en el
suero de los ratones vacunados con ARNm para proteger contra la
infección por VIH se determina por un ensayo de reducción de placas
HT4-6C como se indica a continuación:
Se obtienen células HT4-6C
(célula CD4+ HeLa) a partir de Dr. Bruce Chesebro, (Rocky Mountain
National Lab, Montana) y se desarrollan en cultivo en medio RPMI
(BRL, Gaithersburg, MD). El grupo de células después se divide en
lotes. Algunos de los lotes se infectan con VIH añadiendo
aproximadamente de 10^{5} a 10^{6} unidades infecciosas de VIH a
aproximadamente 10^{7} células HT4-6C. Otros
lotes se ensayan con respecto al efecto protector del suero inmune
gp120 contra la infección por VIH añadiendo tanto el VIH como
aproximadamente 50 \mul de suero de un ratón vacunado con ARNm de
gp120. Después de 3 días de incubación, las células de todos los
lotes se lavan, se fijan y se tiñen con violeta de cristal, y se
cuenta el número de placas. El efecto protector del suero inmune
gp120 se determina como la reducción en el número de placas en los
lotes de células tratadas tanto con suero de ratón vacunado con
ARNm de gp120 como con VIH en comparación con el número de placas en
lotes tratados con VIH solo.
Varios ratones inmunodeficientes combinados
(ratones SCID (Molecular Biology Institute, (MBI), La Jolla, CA
92037)) se reconstituyeron con linfocitos de sangre periférica
humana adulta por inyección en la cavidad peritoneal de acuerdo con
el método de Mosier (Mosier et al., Nature 335:256 (1988)).
Después se realizó la inyección intraperitoneal de 400 a 4000
unidades infecciosas de VIH-1. Los ratones se
mantuvieron en una instalación de contención de animales de nivel P3
en cajas de manipulación con guantes cerradas herméticamente.
Se preparó ARNm que codificaba para la proteína
nef de VIH obteniendo el gen nef en forma de un
plásmido (pGM92, del NIAID, Rockville, MD 20852); retirando el gen
nef del plásmido; insertando el gen nef en el
plásmido pXBG para la transcripción; y purificando el producto de
transcripción de ARNm de nef como se describe en los ejemplos
2 a 5. El ARNm de nef después se incorporó en una
formulación de acuerdo con el ejemplo 6. Se realizaron diariamente
en animales experimentales inyecciones de 200 \mul en la vena de
la cola de una solución de sacarosa al 10% que contenía 200
\mug/ml de ARN de nef y 500 \mug/ml de una mezcla 1:1 de
DOTAP:DOPE (en forma de complejo de ARN/liposomas), mientras que a
los animales de control se les inyectaron de forma similar complejos
de ARN/liposomas que contenían 200 \mug/ml de ARNt de levadura y
500 \betag/ml de una mezcla 1:1 de liposomas DOTAP/DOPE. A las 2,
4 y 8 semanas después de la inyección, se obtuvieron muestras de
biopsia a partir de órganos linfoides inyectados y se prepararon
para un análisis de inmunohistoquímica. En los mismos puntos de
tiempo, se obtuvieron muestras de sangre y se ensayaron con respecto
a los niveles de p24 por medio de un kit ELISA (Abbott Labs,
Chicago, IL) y con respecto a la titulación de virus por el ensayo
de placas del ejemplo 8. La inmunotinción para VIH-1
se realizó como se ha descrito (Namikawa et al., Science 242:1648
(1988)) usando el suero policlonal de un paciente infectado con VIH.
Se contaron las células positivas y se determinó el número de
células infectadas por campo de alta potencia (400x). Usando estos
ensayos, se observó una reducción de al menos dos veces en el número
de células de tinción positiva a las 8 semanas, y la titulación y
expresión de p24 se redujo al menos en un 50%. Conjuntamente, estos
resultados indican un efecto antiviral moderado del tratamiento
(in vivo).
Un volumen de 200 \mul de la formulación, que
contiene 200 \mug/ml de ARNm de nef, y 500 \mug/ml de
una mezcla de 1:1 de DOTAP:DOTE en sacarosa al 10% se inyecta en la
vena de la cola de ratones SCID que contienen células madre humanas
tres veces al día. Después de la inmunización, los ratones se
exponen por infección a una dosis eficaz de virus VIH. Se retiran
periódicamente muestras de sangre de la vena de la cola y se
controlan para la producción de la proteína p24 de VIH
característica por un ensayo de kit ELISA (Abbott Labs, Chicago,
IL).
La secuencia de longitud completa para el ADNc
del gen de la adenosina desaminasa (ADA) humana se obtiene a partir
del fragmento EcoR1-Accl de 1.300 pb del clon ADA
211 (Adrian, G. et al. Mol. Cell Biol. 4:1712 (1984). Este
fragmento se transforma en un fragmento de extremos romos, se une a
engarces de BglII y después se digiere con BglII. El fragmento
modificado se inserta en el sitio BglII de pXBG. El ARNm de ADA se
transcribe y purifica de acuerdo con los ejemplos 2 a 5, y el ARNm
de ADA purificado se incorpora en una formulación de acuerdo con el
ejemplo 6. A ratones Balb 3T3 se les inyectan directamente en la
vena de la cola 200 \mul de esta formulación, que contiene 200
\mug/ml de ARNm de ADA, y 500 \mug/ml de DOTAP en sacarosa al
10%.
La presencia de ADA humana en los tejidos del
hígado, piel y músculo de los ratones se confirma por un
procedimiento de enfoque isoeléctrico (IEF). Los extractos de tejido
se electroenfocaron entre pH 4 y 5 en un gel no desnaturalizante.
El gel después se tiñó para la actividad ADA in situ como se indica
por Valerio, D. et al. Gene 31:137-143
(1984).
Se realiza una separación preliminar de ADA
humano y no humano por cromatografía líquida de proteínas rápida
(FPLC). Las proteínas se fraccionan en una columna MonoQ (HR5/5) de
Pharmacia (Piscataway, NJ) con un gradiente lineal de KCl de 0,05 a
0,5 M, Tris 20 mM (pH 7,5). La actividad para ADA dentro de las
fracciones se mide haciendo reaccionar las fracciones con
^{14}C-adenosina (Amersham, Chicago, IL) que se
convierte en inosina. Se usa cromatografía de capa fina (NaPi 0,1 M
pH 6,8, sulfato amónico saturado:alcohol
n-propílico/100:60:2) para separar la inosina
radiactiva de la adenosina del substrato.
Claims (16)
1. Uso de un liposoma cargado positivamente y un
polinucleótido expresable que codifica para un péptido
inmunogénico, en la fabricación de un medicamento para
administración a un mamífero, donde dicho medicamento se incorpora
en una célula en la que se forma un producto de traducción
inmunogénico del polinucleótido, y el producto se procesa y presenta
por la célula en el contexto del complejo principal de
histocompatibilidad, induciendo de esta manera una respuesta inmune
contra el péptido inmunogénico.
2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde
dicho polinucleótido es un ARNm.
3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde
dicho polinucleótido es una ADN que comprende un promotor.
4. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, donde el medicamento es para administración
por inyección en el músculo.
5. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, donde el medicamento es para administración
por inyección en la piel.
6. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, donde dicho medicamento es para
administración por introducción en una cavidad corporal.
7. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, donde dicho mamífero es un ser humano.
8. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, donde dicho liposoma comprende cloruro de
N-(2,3-di-(9-(Z)octadeceniloxi))-prop-1-il-N,N,N-trimetilamonio
(DOTMA) o
1,2-bis(oleoiloxi)-3-(trimetilamonio)propano
(DOTAP).
9. Una composición que comprende liposomas
cargados positivamente mezclados con un polinucleótido expresable
que codifica para un péptido inmunogénico, para administración a un
mamífero, donde dicha composición se incorpora en una célula en la
que se forma un producto de traducción inmunogénico del
polinucleótido, y el producto se procesa y presenta por la célula
en el contexto del complejo de histocompatibilidad principal,
induciendo de esta manera una respuesta inmune contra el péptido
inmunogénico.
10. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 9, donde dicho polinucleótido es un ARNm.
11. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 9, donde dicho polinucleótido es un ADN que
comprende un promotor.
12. Una composición de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 9 a 11, para la administración por
inyección en el músculo.
13. Una composición de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 9 a 11, para la administración por
inyección en la piel.
14. Una composición de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 9 a 11, para la administración por
introducción en una cavidad corporal.
15. Una composición de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 9 a 14, donde dicho mamífero es un ser
humano.
16. Una composición de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 9 a 15, donde dicho liposoma comprende
cloruro de
N-(2,3-di-(9-(Z)octadeceniloxi))-prop-1-il-N,N,N-trimetilamonio
(DOTMA) o
1,2-bis(oleoiloxi)-3-(trimetilamonio)propano
(DOTAP).
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