CN101591379B - 基于eiav减毒活疫苗的氨基酸突变而构建的抗hiv疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供通过参考马传染性贫血病毒减毒活疫苗的特征性氨基酸突变，运用结构生物信息学技术的指导而构建的HIV包膜蛋白的抗原性多肽、包含编码所述多肽的多核苷酸的DNA构建体和重组病毒载体、针对所述抗原性多肽的抗体、以及它们在预防和治疗HIV感染中的用途。本发明的抗原性多肽和疫苗能够诱导机体产生高滴度的广谱性、持续性的抗HIV中和抗体。

Description

基于EIAV减毒活疫苗的氨基酸突变而构建的抗HIV疫苗
技术领域
本发明涉及免疫学领域，并具体涉及衍生自人类免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiency Virus，HIV)包膜蛋白的抗原性多肽、包含编码所述多肽的多核苷酸的DNA构建体和重组病毒载体、针对所述抗原性多肽的抗体、以及它们在预防和治疗HIV感染中的用途。
背景技术
HIV是诱发人获得性免疫缺陷综合征(Acquired immunodeficiencysyndrome，AIDS)即艾滋病的病原微生物。***艾滋病规划署2007年发布的最新报告显示，目前全球共有3300多万人感染了艾滋病病毒；去年新发感染艾滋病病毒人数约为250万，平均每天增加6800多人。从地区上看，撒哈拉以南非洲地区和亚洲不发达国家仍是受艾滋病影响最大的地区。
HIV病毒在分类学上属于逆转录病毒科(Retroviridae)慢病毒属(Lentivirus)。迄今为止，行为干预仅减缓传播速度而无法终止其流行；高效抗逆转录病毒疗法也只能延缓病情发展，改善症状，不能完全清除病毒。而且，高昂的治疗性药物的应用对广大发展中国家来说并不可行。只有开发出廉价的保护性疫苗才能从根本上控制和解决艾滋病的传播。
目前，正在研究的抗HIV疫苗有：减毒活疫苗、灭活疫苗、DNA疫苗、活载体疫苗、亚单位疫苗和蛋白疫苗等等。纵观艾滋病疫苗发展史，可将其分为四个阶段：第一阶段(20世纪80年代)是艾滋病疫苗研发的起始阶段，主要特点是以单一的蛋白亚单位疫苗为主，以诱导中和抗体为主要目标，忽视了细胞免疫的作用。该类疫苗的研究在2003年2月26日美国VaxGen公司名为AIDSVAX的艾滋病疫苗在5000多人接种的三期临床试验失败后结束。第二阶段(20世纪90年代)的特点是过于强调细胞免疫而忽视了中和抗体的作用，该阶段的疫苗形式以重组病毒载体疫苗为主。该类疫苗的研究以Merk公司研发的仅含gag免疫原的腺病毒载体疫苗的IIb试验于2007年10月宣告失败而结束。第三阶段(2000-2005年)的特点是注重疫苗诱导的体液和细胞免疫反应的均衡，DNA疫苗、活载体疫苗、多价蛋白疫苗全面发展，强调各类疫苗联合免疫，显著加快了疫苗临床试验 的步伐。第四阶段(2005年至今)总结了前三个阶段的经验教训，疫苗设计更加注重抗原改造，以诱导针对保守表位的具有广谱中和活性的高滴度的可持续性的体液免疫和细胞免疫反应。目前，该阶段疫苗尚处于研发阶段。
HIV-1包膜蛋白是中和抗体的主要作用靶位，因此成为抗HIV疫苗中不可缺少的组分。但是，HIV-1野生型包膜蛋白的表达量低(Andre S，et al.Increased immune responseelicited by DNA vaccination with a synthetic gp120sequence with optimizedcodon usage.JVI 1998；72：1497-1503；余双庆等，HIV-1B亚型gp120密码子优化前后免疫原性的比较，病毒学报2004；20(3)：214-217；冯霞等，含密码子优化型HIV-1gp120基因重组腺病毒的构建及其免疫原性研究，中华实验和临床病毒学杂志2004；18(2)：113-117)。包膜蛋白上与病毒吸附和侵入有关的保守的受体及辅助受体结合位点被可变区和寡聚糖链所遮蔽(Kwong PD，et al.Structure of an HIV gp 120envelopeglycoprptein in complexwith the CD4 receptor and a neutralizing humanantobody.Nature 1998，393：648-659)；包膜蛋白构象多态性所产生的空间位阻，阻碍了保守区的提呈和B细胞对该保守区的识别(Kwong PD，et al.HIV-1 evades antibody-mediated neutralization throughconformationalmasking of receptor-binding sites.Nature 2002.420：678-682)；逆转录酶无校读活性且病毒复制周期短，在免疫压力作用下短时间内即能产生大量免疫逃逸株，逃避宿主的细胞及体液免疫(Evans DT，et al.Virus-specific cytotoxicT-lymphocyte responses select for amino-acid variation insimianimmunodeficiency virus Env and Nef.Nat.Med.1999.5：1270-1276；Parren PW，et al.The neutralizing antibody response to HIV-1：viral evasion andescapefrom humoral immunity.AIDS 1999.13(Suppl A)：S137-162)；病毒侵入细胞过程中，构象处于动态变化中，中和表位暴露不充分或暴露时间太短。这些原因都致使HIV-1天然包膜蛋白激发的体液免疫反应很难具有针对同源毒株的可持续的中和活性，更难具有对不同亚型HIV-1毒株的交叉中和活性。因此，需要对HIV-1的包膜蛋白的抗原进行优化改造。
由于HIV在自然界缺乏合适的动物模型，人体也无法进行攻毒试验，人们转而应用与HIV同科同属的其他六种动物慢病毒作为可供借鉴的动物模型来进行相关的研究。其中，马传染性贫血病毒(EIAV)在分类上与HIV同科同属，两者具有相同的基因组结构、复制方式、和相似的蛋白种类及功能。已经发现HIV-1的V1、V2区与EIAV的V3、V4区之间存在一定的对应关系(Hotzel I.Conservation of the human immunodeficiency virustype1 gp120 V1/V2 stem/loop structure in the equine infectious anemia virus(EIAV)gp90.AIDS Res Hum Retroviruses，2003，19：923-924；和Huiguang Li，et al.AConservative Domain Shared by HIV gp120 and EIAV gp90：Implications for HIVVaccine Design.AIDS Res Hum Retroviruses，2005，21：1057-1059)。
但是，由于两种病毒的致病机制存在明显差异，且与HIV疫苗不同的是，EIAV减毒活疫苗的研制过程主要是减毒而非提高免疫原性，而后者则是HIV疫苗研发中所需要的。因此，通过研究EIAV减毒活疫苗而为改造HIV包膜抗原提供指导这一研究方向一直不被看好。
基于对EIAV的致病株和疫苗株的包膜蛋白的氨基酸序列分析，并基于EIAV减毒活疫苗的特征性氨基酸突变，本发明人采用结构和功能位点对应方法，对HIV-1包膜蛋白的相应氨基酸位点进行了改造。出乎预料的是，经改造的HIV-1包膜蛋白的抗原性多肽以及基于所述多肽构建的疫苗能够诱导机体产生高滴度的、广谱性的、持续性的抗HIV中和抗体。
发明内容
在一个方面，本发明提供一种衍生自HIV-1包膜蛋白的抗原性多肽或其片段，其中所述多肽或片段包含一氨基酸序列，所述氨基酸序列在相当于SEQ ID NO：1的如下位点上包含突变，所述突变选自由以下突变组成的组：52位的亮氨酸残基被谷氨酸残基或天冬氨酸残基取代；138位的丝氨酸残基缺失；139位的天冬酰胺残基被谷氨酰胺残基取代；166位的精氨酸残基被谷氨酸残基或天冬氨酸残基取代；184位的丝氨酸残基被谷氨酸残基或天冬氨酸残基取代；185位的谷氨酸残基被赖氨酸残基、精氨酸残基或组氨酸残基取代；188位的丝氨酸残基被谷氨酰胺残基或天冬酰胺残基取代；235位的甘氨酸残基被精氨酸残基、赖氨酸残基或组氨酸残基取代；237位的甘氨酸残基被谷氨酰胺残基或天冬酰胺残基取代；240位的组氨酸残基被酪氨酸残基取代；和上述突变的任意组合。
在一个优选的实施方式中，本发明的多肽或片段的氨基酸序列至少包含如上所述的相当于SEQ ID NO：1的52位的亮氨酸残基被谷氨酸残基或天冬氨酸残基取代的突变。在一个更加优选的实施方式中，本发明的多肽或片段的氨基酸序列至少包含如上所述的相当于SEQ ID NO：1的52位的亮氨酸残基被谷氨酸残基或天冬氨酸残基取代、138位的丝氨酸残基缺失、和 139位的天冬酰胺残基被谷氨酰胺残基取代的突变。在另一个更加优选的实施方式中，本发明的多肽或片段的氨基酸序列包含如上所述的相当于SEQID NO：1中的全部10个位点的突变。
可用于本发明的HIV-1包膜蛋白包括来源于各种HIV-1毒株的gp120、gp128、gp140、gp140TM、gp145、gp150、gp160、及其等价物。例如，所述HIV-1包膜蛋白是HIV-1CN54的gp145，其具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
在一个具体的实施方式中，本发明提供一种衍生自HIV-1包膜蛋白的抗原性多肽或其片段，其中所述多肽或片段包含通过在SEQ ID NO：2中引入突变而衍生自SEQ ID NO：2的氨基酸序列，所述突变选自由以下突变组成的组：42位的亮氨酸残基被谷氨酸残基取代；128位的丝氨酸残基缺失；129位的天冬酰胺残基被谷氨酰胺残基取代；155位的精氨酸残基被谷氨酸残基取代；179位的丝氨酸残基被谷氨酸残基取代；180位的谷氨酸残基被赖氨酸残基取代；183位的丝氨酸残基被谷氨酰胺残基取代；230位的甘氨酸残基被精氨酸残基取代；232位的甘氨酸残基被谷氨酰胺残基取代；235位的组氨酸残基被酪氨酸残基取代；和上述突变的任意组合。
在一个优选的实施方式中，本发明的多肽或片段包含衍生自SEQ IDNO：2的氨基酸序列，所述氨基酸序列至少包含所述42位的亮氨酸残基被谷氨酸残基取代的突变。在一个更加优选的实施方式中，所述衍生自SEQ IDNO：2的氨基酸序列至少包含所述42位的亮氨酸残基被谷氨酸残基取代、128位的丝氨酸残基缺失、和129位的天冬酰胺残基被谷氨酰胺残基取代的突变。在另一个更加优选的实施方式中，所述衍生自SEQ ID NO：2的氨基酸序列包含如上所述的全部10个位点的突变。
本发明的抗原性多肽或其片段还可进一步包括一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加，且所述多肽或片段能够诱导保护性的免疫应答。此外，本发明的抗原性多肽或其片段，其还可包括进一步的修饰，例如糖基化位点缺失或添加、环区删除或重排、CFI区删除、及其组合。
在另一方面，本发明提供一种多肽疫苗，其包含如前所说的本发明的抗原性多肽或其片段和药用可接受的佐剂和/或载体。
在另一方面，本发明还提供一种抗体，其特异性结合如前所说的本发明的抗原性多肽或其片段，且所述抗体与HIV-1的野生型包膜蛋白诱导产生的抗体相比具有更广谱和更高的HIV-1病毒中和活性。本发明的抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体或其抗原结合片段。
在另一方面，本发明提供一种分离的多核苷酸，其包含编码如前所说的本发明的抗原性多肽或其片段的核苷酸序列。
本发明还提供一种DNA构建体，其包含可操作地连接于启动子的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码如前所说的本发明的抗原性多肽或其片段的核苷酸序列。本发明也提供包含上述DNA构建体和药用可接受的佐剂的DNA疫苗。
本发明还提供一种重组病毒载体疫苗，其包含携带一种多核苷酸的重组病毒载体和药用可接受的佐剂，所述多核苷酸包含编码如前所说的本发明的抗原性多肽或其片段的核苷酸序列。优选地，所述重组病毒载体是复制型病毒载体，例如复制型重组痘苗载体，如复制型重组天坛株痘苗。
此外，本发明还提供一种重组细菌载体疫苗，其包含携带一种多核苷酸的重组细菌载体和药用可接受的佐剂，所述多核苷酸包含编码如前所说的本发明的抗原性多肽或其片段的核苷酸序列。
在其他方面，本发明还提供一种预防或治疗HIV-1病毒感染的方法，其包括给有需要的个体施用本发明的多肽疫苗和/或DNA疫苗和/或重组病毒载体疫苗和/或重组细菌载体疫苗，或者给有需要的个体施用本发明的抗体。
附图说明：
图1：7个DNA疫苗酶切鉴定结果：
泳道1为pDRVISV145M1R酶切结果；泳道2为pDRVISV145M2R酶切结果；泳道3为pDRVISV145M3R酶切结果；泳道4为pDRVISV145M4R酶切结果；泳道5为pDRVISV145M5R酶切结果；泳道6为pDRVISV1452M酶切结果；泳道7为pDRVISV1455M酶切结果；如图所示各个疫苗载体基因大小为5Kb，***的目的基因大小为2.1Kb。
图2：7个DNA疫苗PCR鉴定图：
泳道1为pDRVISV145M1R PCR产物；泳道2为pDRVISV145M2 PCR产物；泳道3为pDRVISV145M3R PCR产物；泳道4为pDRVISV145M4RPCR产物；泳道5为pDRVISV145M5R PCR产物；泳道6为pDRVISV1452MPCR产物；泳道7为pDRVISV1455M PCR产物；如图所示各***目的基因大小为2.1Kb。
图3：各DNA疫苗免疫印迹鉴定图：
泳道1为pDRVISV145M1R表达结果；泳道2为pDRVISV145M2R表 达结果；泳道3为pDRVISV145M3R表达结果；泳道4为pDRVISV145M4R表达结果；泳道5为pDRVISV145M5R表达结果；泳道6为pDRVISV1452M表达结果；泳道7为阴性对照；泳道8为pDRVISV1455M表达结果。如图所示各***目的基因均可正确表达。
图4：重组痘苗载体PCR鉴定图：
泳道1为rTV145PCR结果；泳道2为rTV1455M PCR结果。如图所示各***目的基因为2.1Kb，大小正确。
图5：重组痘苗载体表达产物的免疫印迹鉴定图：
泳道1为鸡胚成纤维细胞(CEF)细胞表达产物，作为阴性对照；泳道2为野生型天坛株痘苗在CEF细胞中的表达结果，作为阴性对照；泳道3为rTV145在CEF细胞中的表达结果；泳道4为rTV1455M在CEF细胞中的表达结果；如图所示目的基因表达产物大小为145KD，说明***的目的基因可正确表达。
图6：ELISA法检测特异性结合抗体滴度：
抗原1455M激发的平均特异性结合抗体滴度远高于由未改造的gp145抗原激发的平均结合抗体滴度；其抗体滴度提高了3.5倍多(p＝0.0020)(*表示p值小于0.05，统计学上存在显著差异；**表示p值小于0.005，统计学上存在极显著差异)。1452M诱导的平均特异性结合抗体滴度可到2400，最高滴度可达9600，显著高于未改造的gp145(p＝0.0177)。145M1R诱导的抗体反应强度同样显著高于gp145(p＝0.0177)。
图7：第14周采集豚鼠血清1∶10稀释度下中和抗体检测：
gp145免疫组诱导的抗体表现出有限的中和活性，大约有1/4的豚鼠表现出可中和所有8个临床分离株的能力；而1455M免疫组则可使至少3/4的豚鼠表现出对所有分离株的中和活性。
图8：第16周采集豚鼠血清1∶10稀释度下中和抗体检测：
gp145免疫组诱导的抗体谱变窄，有一半的B’亚型的病毒不被中和；而1455M免疫组血清仍然有3/4的豚鼠表现出对所有分离株的中和活性。
图9：第14周采集豚鼠血清中和抗体滴度检测：
gp145免疫组仅有少数豚鼠血清在1∶10稀释度下有中和活性；而1455M免疫组绝大多数豚鼠具有中和活性且滴度高于1∶10。
图10：第16周采集豚鼠血清中和抗体滴度检测：
1455M免疫组绝大多数豚鼠血清可完全中和所有的病毒，而且最高滴度高达1∶270；而gp145免疫组豚鼠血清仅有少数抗体滴度超过1∶10。
具体实施方案
本发明人基于EIAV减毒活疫苗的特征性氨基酸突变，采用结构和功能位点对应方法，对HIV-1包膜蛋白的相应氨基酸位点进行了改造。
EIAV在分类上与HIV同科同属，两者具有相同的基因组结构、复制方式、和相似的蛋白种类及功能。因此，研究EIAV减毒活疫苗有可能为改造HIV包膜抗原提供指导。但两种病毒在致病机制等方面也存在着明显差异。同时，EIAV减毒活疫苗的研制过程主要是减毒而非免疫原性提高的过程。因此，这条改造途径一直不被HIV疫苗研发界人士看好。
中国研制的EIAV减毒活疫苗是世界上迄今为止唯一成功大规模应用的慢病毒疫苗。自1979年以来在全国应用，共免疫马属动物6000多万匹，控制了该病的流行。同时，在安全性方面，该疫苗经受住了数十年的大规模现场应用的考验。EIAV疫苗是由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所于上世纪七十年代研制出的减毒活疫苗，该疫苗是用传统的方法研制成功的，现简单地介绍其研制过程及传代过程中各毒株的命名：野毒株为辽宁省一匹感染马分离到的，称马传贫辽毒株(LN)，辽毒株先在驴体内经100代传代得到驴强毒(D510)，驴强毒随后在驴白细胞上经121代传代后，得到减毒活疫苗株(称为驴白细胞毒，DLV)，最后在驴胎皮肤细胞上适应传代10代得到驴胎皮肤细胞弱毒疫苗株(FDDV)(中国专利号CN99105852.6和CN99127532.2，美国专利号US6987020B1)。
本发明人通过对EIAV减毒活疫苗(DLV(SEQ ID NO：5)、FDDV(SEQID NO：6))和致病毒株(LN(SEQ ID NO：3)、D510(SEQ ID NO：4))的包膜蛋白进行全长测序，发现了EIAV减毒活疫苗包膜蛋白上存在10个特征性氨基酸突变位点，如表1所示。
表1：EIAV减毒活疫苗包膜蛋白上存在的10个特征性氨基酸突变及位点
-表示该氨基酸残基缺失
根据氨基酸一级序列、环区结构排列、二硫键的构成、保守性的氨基酸结构、已知的功能性位点及糖基化位点的数目、排布等，本发明人基于 EIAV减毒活疫苗的特征性氨基酸突变对HIV-1包膜蛋白进行了改造，具体如表2所示。
表2：EIAV包膜蛋白的特征性突变和改造后的HIV包膜蛋白的突变及位点
1：粗体和下划线标出的位点为突变位点；
2：-表示该氨基酸残基缺失；
3：HIV包膜蛋白的氨基酸位点对应的是HIV-1CN54的gp145的氨基酸序列(SEQ IDNO：2)的位点。
因此，在一个方面，本发明提供一种衍生自HIV-1包膜蛋白的抗原性多肽或其片段，其中所述多肽或片段包含一氨基酸序列，所述氨基酸序列在相当于SEQ ID NO：1的如下位点上包含突变，所述突变选自由以下突变组成的组：52位(位于C1区)的亮氨酸残基被酸性氨基酸谷氨酸残基或天冬氨酸残基取代；138位(位于V1区)的丝氨酸残基缺失；139位(位于V1区)的天冬酰胺残基被谷氨酰胺残基取代；166位(位于V2区)的精氨酸残基被谷氨酸残基或天冬氨酸残基取代；184位(位于V2区)的丝氨酸残基被谷氨酸残基或天冬氨酸残基取代；185位(位于V2区)的谷氨酸残基被赖氨酸残基或精氨酸残基或组氨酸残基取代；188位(位于V2区)的丝氨酸残基被谷氨酰胺残基或天冬酰胺残基取代；235位(位于C2区)的甘氨酸残基被精氨酸残基或赖氨酸残基或组氨酸残基取代；237位(位于C2区)的甘氨酸残基被谷氨酰胺残基或天冬酰胺残基取代；240位(位于C2区)的组氨酸残基被酪氨酸残基取代；以及上述突变的任意组合。
本文中所述的“多肽”一词也包括蛋白质。本文中所述的“多肽的片段”指的是所述多肽的具有免疫原性和/或抗原性的片段。
在一个优选的实施方式中，本发明的多肽或片段的氨基酸序列至少包含如上所述的相当于SEQ ID NO：1的52位的亮氨酸残基被谷氨酸残基或天冬氨酸残基取代的突变。在一个更加优选的实施方式中，本发明的多肽或 片段的氨基酸序列至少包含如上所述的相当于SEQ ID NO：1的52位的亮氨酸残基被谷氨酸残基或天冬氨酸残基取代、138位的丝氨酸残基缺失、和139位的天冬酰胺残基被谷氨酰胺残基取代的突变。在另一个更加优选的实施方式中，本发明的多肽或片段的氨基酸序列包含如上所述的相当于SEQID NO：1中的全部10个位点的突变。
在另一个优选的实施方式中，本发明的多肽或片段的氨基酸序列在相当于SEQ IDNO：1的如下位点上包含突变，所述突变选自由以下突变组成的组：52位的亮氨酸残基被谷氨酸残基或天冬氨酸残基取代、138位的丝氨酸残基缺失、139位的天冬酰胺残基被谷氨酰胺残基取代、166位的精氨酸残基被谷氨酸残基或天冬氨酸残基取代、184位的丝氨酸残基被谷氨酸残基或天冬氨酸残基取代、185位的谷氨酸残基被赖氨酸残基、精氨酸残基或组氨酸残基取代、188位的丝氨酸残基被谷氨酰胺残基或天冬酰胺残基取代、和上述突变的任意组合；并任选地包含235位的甘氨酸残基被精氨酸残基、赖氨酸残基或组氨酸残基取代、237位的甘氨酸残基被谷氨酰胺残基或天冬酰胺残基取代、240位的组氨酸残基被酪氨酸残基取代、或其组合。
上述突变的位点是参照HIV-1国际标准株HXB2(GenBank AccessionNumberK03455)的gp160的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)而定义的。本领域人员能够理解，对于其他HIV-1病毒株的包膜蛋白，可通过将其与SEQ IDNO：1进行序列比对而确定在哪些位点引入相应的突变。例如，通过以HIV-1国际标准株HXB2的gp160的氨基酸序列作为参照序列，可确定在不同的HIV-1毒株的包膜蛋白gp160中引入上述氨基酸突变的位点，由此对其加以改造。可用于本发明的所述包膜蛋白包括常见的gp120、gp128、gp140、gp140TM、gp145、gp150、gp160、及其等价物(Bimal K.et al.Modificationsof the Human ImmunodeficiencyVirus Envelope Glycoprotein EnhanceImmunogenicity for Genetic ImmunizationJOURNAL OF VIROLOGY，June2002，p.5357-5368)。本领域人员能够理解，对于上述不同形式的HIV-1包膜蛋白，也可采用类似的方式在其中引入上述氨基酸突变。
在一个具体的实施方式中，本发明所使用的包膜蛋白是HIV-1CN54包膜蛋白gp145(Genbank Accession Number AX149771)，其具有如SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列。
因此，本发明提供一种衍生自HIV-1包膜蛋白的抗原性多肽或其片段，其中所述多肽或片段包含通过在SEQ ID NO：2中引入突变而衍生自SEQ IDNO：2的氨基酸序列，所述突变选自由以下突变组成的组：42位(位于C1区) 的亮氨酸残基被谷氨酸残基取代；128位(位于V1区)的丝氨酸残基缺失；129位(位于V1区)的天冬酰胺残基被谷氨酰胺残基取代；155位(位于V2区)的精氨酸残基被谷氨酸残基取代；179位(位于V2区)的丝氨酸残基被谷氨酸残基取代；180位(位于V2区)的谷氨酸残基被赖氨酸残基取代；183位(位于V2区)的丝氨酸残基被谷氨酰胺残基取代；230位(位于C2区)的甘氨酸残基被精氨酸残基取代；232位(位于C2区)的甘氨酸残基被谷氨酰胺残基取代；235位(位于C2区)的组氨酸残基被酪氨酸残基取代；以及上述突变的任意组合。
在一个优选的实施方式中，本发明的多肽或片段包含衍生自SEQ IDNO：2的氨基酸序列，所述氨基酸序列至少包含所述42位的亮氨酸残基被谷氨酸残基取代的突变。在一个更加优选的实施方式中，所述衍生自SEQ IDNO：2的氨基酸序列至少包含所述42位的亮氨酸残基被谷氨酸残基取代、128位的丝氨酸残基缺失、和129位的天冬酰胺残基被谷氨酰胺残基取代的突变。在另一个更加优选的实施方式中，所述衍生自SEQ ID NO：2的氨基酸序列包含如上所述的全部10个位点的突变。
在另一个优选的实施方式中，本发明的多肽或片段包含通过在SEQ IDNO：2中引入突变而衍生自SEQ ID NO：2的氨基酸序列，所述突变选自由以下突变组成的组：42位的亮氨酸残基被谷氨酸残基取代、128位的丝氨酸残基缺失、129位的天冬酰胺残基被谷氨酰胺残基取代、155位的精氨酸残基被谷氨酸残基取代、179位的丝氨酸残基被谷氨酸残基取代、180位的谷氨酸残基被赖氨酸残基取代、183位的丝氨酸残基被谷氨酰胺残基取代、和上述突变的任意组合；并任选地包含230位的甘氨酸残基被精氨酸残基取代、232位的甘氨酸残基被谷氨酰胺残基取代、235位的组氨酸残基被酪氨酸残基取代、或其组合。
可采用本领域人员已知的任何合适的方法制备本发明的衍生自HIV-1包膜蛋白的抗原性多肽或其片段。例如，在确定了意欲引入的突变位点和氨基酸残基后，可利用重叠延伸PCR(gene splicing by overlap extensionPCR，简称SOE PCR)(Li CH，etal.2004.Construction of middle fragmentdeletion mutant with improved genesplicing by overlap extension；HeckmanKL，et al.2007.Gene splicing andmutagenesis by PCR-driven overlapextension.)的方法在HIV-1包膜蛋白(例如CN54gp145)的编码序列的相应位点引入所需的突变。重叠延伸PCR技术由于采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸， 将不同的扩增片段重叠拼接起来，从而得到编码本发明的抗原性多肽或其片段多核苷酸。同样，可以采用其它引入突变的方法来进行相应位点的改造，这些方法包括但不限于基因合成、基因重组、基因重排等。
因此，本发明也提供分离的多核苷酸，其包含编码上述本发明的抗原性多肽或其片段的核苷酸序列。
在获得了编码本发明的衍生自HIV-1包膜蛋白的抗原性多肽或其片段的多核苷酸之后，可将其***至合适的表达载体中，并转染至合适的宿主细胞中进行表达，最后回收得到本发明的抗原性多肽或其片段。可用于本发明制备本发明的多肽或其片段的表达***包括但不限于：大肠杆菌表达***，如：Condon菌株、Gold菌株；酵母表达***；昆虫细胞表达***；噬菌体展示表达***；哺乳动物细胞表达***，如CHO细胞、Vero细胞。
本领域人员能够理解，可以通过一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加，例如保守性氨基酸的取代，而对本发明的抗原性多肽或其片段做进一步的修饰，条件是修饰后的多肽或片段仍具有如上所述的氨基酸突变，并仍可诱导保护性的免疫应答。此外，除了引入个别的氨基酸突变以外，还可对本发明的衍生自HIV-1包膜蛋白的抗原性多肽或其片段做进一步的修饰，这些修饰包括但不限于，糖基化缺失或添加、环区删除或重排、CFI区删除(thecleavage site sequence，the fusion domain，and a part of the spacerbetween thetwo heptad repeats)等。
在另一方面，本发明提供一种多肽疫苗，其包含上述本发明的抗原性多肽或其片段和药用可接受的佐剂。合适的佐剂包括但不限于不完全福氏佐剂、铝佐剂、卡介苗(BCG)、油基乳剂(如MF59和Montanide ISA 720)、免疫刺激剂(如单磷酰脂A)、CpG寡核苷酸、皂角苷(如QS21)、以及基于细菌外毒素的粘膜佐剂等。包含本发明的抗原性多肽或其片段的疫苗的形式可以是例如多肽疫苗、脂肽疫苗、二聚体或多聚体疫苗等形式。
在另一方面，本发明还提供一种DNA构建体，其包含可操作地连接于启动子的编码上述本发明的抗原性多肽或其片段的多核苷酸。
在优选的实施方式中，本发明提供基于HIV-1CN54的gp145的氨基酸序列(SEQ IDNO：2)而构建的编码衍生自HIV-1包膜蛋白的抗原性多肽的DNA构建体。在具体的实施方式中，本发明提供如下DNA构建体：
质粒pDRVISV145M1R，其携带编码42位的亮氨酸残基被谷氨酸残基取代的SEQ IDNO：2的氨基酸序列的多核苷酸，其所编码的抗原性多肽称为“145M1R”，含有该质粒的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)于2008年5 月22日保藏于CGMCC(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，中国北京，朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCC No.2508；
质粒pDRVISV145M2R，其携带编码128位的丝氨酸残基缺失和129位的天冬酰胺残基被谷氨酰胺残基取代的SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多核苷酸，其所编码的抗原性多肽称为“145M2R”，含有该质粒的大肠埃希氏菌于2008年5月22日保藏于CGMCC，保藏号为CGMCCNo.2509；
质粒pDRVISV145M3R，其携带编码155位的精氨酸残基被谷氨酸残基取代的SEQ IDNO：2的氨基酸序列的多核苷酸，其所编码的抗原性多肽称为“145M3R”，含有该质粒的大肠埃希氏菌于2008年5月22日保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.2510；
质粒pDRVISV145M4R，其携带编码179位的丝氨酸残基被谷氨酸残基取代、180位的谷氨酸残基被赖氨酸残基取代和183位的丝氨酸残基被谷氨酰胺残基取代的SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多核苷酸，其所编码的抗原性多肽称为“145M4R”，含有该质粒的大肠埃希氏菌于2008年5月22日保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.2511；
质粒pDRVISV145M5R，其携带编码230位的甘氨酸残基被精氨酸残基取代、232位的甘氨酸残基被谷氨酰胺残基取代和235位的组氨酸残基被酪氨酸残基取代的SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多核苷酸，其所编码的抗原性多肽称为“145M5R”，含有该质粒的大肠埃希氏菌于2008年5月22日保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.2512；
质粒pDRVISV1452M，其携带编码42位的亮氨酸残基被谷氨酸残基取代、128位的丝氨酸残基缺失和129位的天冬酰胺残基被谷氨酰胺残基取代的SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多核苷酸，其所编码的抗原性多肽称为“1452M”，含有该质粒的大肠埃希氏菌于2008年5月22日保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.2513；和
质粒pDRVISV1455M，其携带的多核苷酸编码含有全部10个如前所述的突变(即，42位的亮氨酸残基被谷氨酸残基取代、128位的丝氨酸残基缺失、129位的天冬酰胺残基被谷氨酰胺残基取代、155位的精氨酸残基被谷氨酸残基取代、179位的丝氨酸残基被谷氨酸残基取代、180位的谷氨酸残基被赖氨酸残基取代、183位的丝氨酸残基被谷氨酰胺残基取代、230位的甘氨酸残基被精氨酸残基取代、232位的甘氨酸残基被谷氨酰胺残基取代、235位的组氨酸残基被酪氨酸残基取代)的SEQ ID NO：2的氨基酸序列，所编码的抗原性多肽称为“1455M”，含有该质粒的大肠埃希氏菌于2008年 5月22日保藏于CGMCC，保藏号为CGMCCNo.2514。
如后面的实施例所示，分别携带编码抗原性多肽1455M、1452M、145M1R、145M2R、145M3R、和145M4R的DNA构建体均可在BALB/c小鼠模型诱导产生显著提高的特异性结合抗体和广谱的高滴度的中和抗体水平，其中含有全部10个氨基酸突变的1455M抗原可激发最具广谱性的中和抗体。从实施例中给出的结果可以看出，42位的亮氨酸残基被谷氨酸残基取代的突变似乎是所测试的10个突变中的关键位点，含有该突变的145M1R、1452M、1455M均可诱导高滴度的广谱性中和抗体；但与1455M相比，145M1R诱导的中和抗体不能中和某些测试的HIV-1临床分离株，如XJDC6371。其它突变位点M2R、M3R、M4R在增加中和抗体的广谱性方面同样有作用。
无意于受理论的限制，但本发明人推测42位的突变增加了包膜蛋白中α螺旋结构。已有文献报道，与疫苗的保护性相关的特异性细胞毒性杀伤反应(CTL)表位高度集中于HIV-1各蛋白的α螺旋区域(Yusim，K.，et al.2002.Clustering patterns of cytotoxicT-lymphocyte epitopes in humanimmunodeficiency virus type 1(HIV-1)proteinsreveal imprints of immuneevasion on HIV-1 global variation.Journal ofvirology 76：8757-8768)。α螺旋片段结构诱导了保护性的CTL反应，同样也可能诱导了有效的中和抗体反应。另外，128位的丝氨酸残基缺失及129位突变仅造成糖基化位点的缺失，并没有引起二级结构的改变，但也可以诱导广谱性的中和抗体反应。根据已有的文献报道(Koch，M.，et al.2003.Structure-based，targeteddeglycosylation of HIV-1 gp120and effects on neutralization sensitivity andantibody recognition.Virology313：387-400)，本发明人认为，该糖基化位点的缺失可能导致包膜蛋白无法形成覆盖抗原表位的寡聚糖苷链，这使得包膜蛋白的某些中和表位暴露，从而诱导产生广谱性的中和抗体反应。
本领域人员能够制备含有所述突变的其他各种组合形式的抗原性多肽以及相应的DNA构建体并测试其保护作用。
本发明还提供DNA疫苗，其包如上所述的本发明的DNA构建体和药用可接受的佐剂。本发明的DNA疫苗在施用至体内后能够表达上述本发明的抗原性多肽或其片段。
此外，本发明还提供重组病毒载体疫苗，其包含携带如上所述的本发明的多核苷酸的重组病毒载体和药用可接受的佐剂。本发明的重组病毒载体疫苗在施用至体内后能够表达上述本发明的抗原性多肽或其片段。
可用于制备本发明的重组病毒载体疫苗的病毒载体包括但不限于痘苗载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、仙台病毒载体、单纯疱疹病毒载体、人***瘤病毒载体、和逆转录病毒载体等病毒载体。优选地，所述重组病毒载体是复制型病毒载体。优选地，所述复制型病毒载体是复制型重组痘苗载体。
在一个具体的实施方式中，本发明的重组病毒载体疫苗是复制型重组天坛株痘苗疫苗，其携带编码抗原1455M的多核苷酸。如后面的实施例所示，利用该复制型重组天坛株痘苗疫苗，在BALB/c雌鼠和Huntley豚鼠模型进行了抗原免疫原性评价，其结果显示：抗原1455M可显著激发BALB/c小鼠和豚鼠机体的特异性体液免疫反应，特别是其诱导产生的中和抗体不但抗体谱变广、抗体滴度高，而且该保护性抗体在豚鼠体内可至少持续六周。这是目前已知的在无添加佐剂条件下，获得的最好的中和抗体反应结果之一。
本领域人员能够理解，也可以将本发明的多核苷酸***至减毒的病原菌或者共生菌中，从而制备重组细菌载体疫苗。这种疫苗施用于人体后能够提呈、表达所编码的抗原。因此，本发明也涉及一种重组细菌载体疫苗，其包含携带一种多核苷酸的重组细菌载体和药用可接受的佐剂，所述多核苷酸包含编码如前所说的本发明的抗原性多肽或其片段的核苷酸序列。可用于本发明的减毒细菌载体包括但不限于减毒的沙门氏菌、牛结核分枝杆菌(BCG)、单核李斯特菌、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、百日咳杆菌、和炭疽芽孢杆菌。可用于本发明的共生菌载体包括但不限于乳酸菌、格式链球菌、葡萄球菌。
本发明还提供预防或治疗HIV-1病毒感染的方法，其包括给有需要的个体施用本发明的多肽疫苗和/或DNA疫苗和/或重组病毒载体疫苗和/或重组细菌载体疫苗。
本发明的疫苗可通过任何合适的免疫接种途径而施用，如贴敷、皮下、皮内、肌肉、静脉注射、腹腔注射等。免疫策略包括例如如粘膜免疫策略、交叉免疫策略等。本领域人员能够理解，本发明的多肽疫苗或DNA疫苗或重组病毒载体疫苗可与脂质体、纳米材料等旨在提高抗原提呈效率的物质一起使用。
在另一方面，本发明提供抗体，所述抗体特异性结合本发明的抗原性多肽或其片段，且所述抗体对HIV-1病毒的中和活性高于HIV-1野生型包膜蛋白诱导产生的抗体对HIV-1病毒的中和活性。
给动物施用包含本发明的多肽或其片段的疫苗或携带编码这些多肽或片段的多核苷酸的DNA疫苗或重组病毒载体疫苗后可诱导广谱的针对不同地区各亚型的HIV-1临床分离株病毒的保护性免疫应答，这说明诱导的抗体区别于以往大多数天然包膜蛋白诱导产生的抗体。通过杂交瘤等本领域人员已知的抗体制备技术，可以利用本发明的多肽或其片段或编码这些多肽或片段的多核苷酸来制备单克隆抗体，其中所述抗体的HIV-1中和活性高于HIV-1野生型包膜蛋白诱导产生的抗体的HIV-1中和活性。例如可以制备诸如完整免疫球蛋白分子、鼠源抗体、人源化抗体、嵌合抗体、scFv、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2、Fv、和二硫键连的Fv等单克隆抗体或其抗原结合片段。这些抗体在HIV被动免疫方面有着广泛的应用前景。
因此，本发明还提供预防或治疗HIV-1病毒感染的方法，其包括给有需要的个体施用本发明的抗体。
以下结合具体实施例对本发明做进一步的阐述。
实施例
实施例1：构建含突变的DNA疫苗
1、PCR引入突变位点
以重组质粒pDRVISV145(pDRVISV145也称为PT-gp140TM/DH5α(CGMCC No.1439))为模板PCR扩增目的片段(GeneAmp PCR System9700扩增仪(美国Applied Biosystem公司))。使用如下引物对：
反应体系：质粒模板0.5μl，Pyrobest Taq(5U/μl)0.5μl(Takara公司产品)，10×Pyrobest Taq Buffer(添加了MgCl2)5μl，dNTP(2.5mM)4μl，上游引物1μl，下游引物1μl，加ddH2O至50μl(200μl Axygen公司鼓盖PCR管)。反应条件：94℃5分钟预变性；94℃50秒，退火温度50秒，72℃2分钟，扩增35个循环；72℃延伸10分钟。除gp145上游引物145M3R位点下游引物退火温度为60℃；其余退火温度均为65℃。胶回收所获得目的基因(胶回收试剂盒为Omega公司E.Z.N.A.Gel Extraction Kit E.Z.N.ACycle-Pure Kit)。以各突变位点对应的两个基因片段为模板，gp145上游引物与gp145下游引物作为引物，PCR扩增目的基因。反应体系：质粒模板各0.5μl，Ex Taq(5U/μl)0.5μl，10×Ex Taq Buffer(MgCl2added)5μl，dNTP(2.5mM)4μl，上游引物1μl，下游引物1μl，加ddH2O至50μl。反应条件：94℃5分钟预变性；94℃50秒，68℃50秒，72℃2分钟，扩增35个循环；72℃延伸10分钟。胶回收所获得5个目的基因片段：145M1R、145M2R、145M3R、145M4R和145M5R。以145M1R为模板，145M2R位点上游引物与gp145下游引物，gp145上游引物与145M2R位点下游引物作为引物对，PCR扩增目的片段。条件同上。再以胶回收得到的两个目的基因片段为模板，gp145上游引物与gp145下游引物作为引物，PCR扩增含第二个突变位点的目的基因。条件同上。胶回收所获得的1452M片段(含145M1R和145M2R)。以1452M为模板，如上方法，进一步PCR引入突变。如此，直至获得完全引入10个突变的1455M片段。
2、用内切酶EcoR V和BamH I(Takara公司产品)对HIV-1CN54145M1R、145M2R、145M3R、145M4R、145M5R、1452M、1455M和DNA疫苗载体pDRVISV1.0(CN1560259(中国专利申请：200410028280.3)；和Haishan Li，et al.Enhancement of Gag-Specific ImmuneResponses Induced by DNA Vaccination by Incorporation of a 72-bp element fromSV40 Enhancer inthe Plasmid Vector.Chinese Medical Journal(English)2007；120(6)：496-502)进行酶切。酶切反应体系为：质粒或目的基因10μl，EcoR V 2μl，BamH I2μl，10×BamH I缓冲液K 5μl，加入ddH2O至总体积50μl，37℃孵育4小时，进行琼脂糖(GIBCO公司产品)凝胶电泳分离，切割相应长度的片段(***目的基因片段约为2.1kb，载体片段约为5kb)，琼脂糖凝胶回收(胶回收试剂盒为Omega公司E.Z.N.A.Gel Extraction Kit E.Z.N.ACycle-PureKit)。
3、连接反应体系：2×Rapid Ligation Buffer(NEB公司产品)5μl，合成目的基因片段的回收产物3μl，载体片段的回收产物1μl，T4DNA连接酶(NEB公司产品)1μl，4℃冰箱连接8小时。连接产物转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞(Takara公司)，涂布于含硫酸卡那霉素(北京第二制药厂产品)的平板(青岛α医疗器械有限公司产品)，37℃培养16小时。挑取单克隆菌落接种于3ml含60μg/ml卡那霉素的LB培养基(Amersham公司产品配制)中，37℃，200rpm振荡培养(HZQ-X100振荡培养箱为哈尔滨东联电子技术有限公司产品)16小时。利用Omega公司的E.Z.N.A.PlasmidMiniprep Kit I小量提取质粒，进行酶切、PCR鉴定，鉴定正确的质粒送Invitrogen公司进行测序确认。经鉴定好的质粒分别命名为：pDRVISV145M1R、pDRVISV145M2R、pDRVISV145M3R、pDRVISV145M4R、pDRVISV145M5R、pDRVISV1452M和pDRVISV1455M。酶切鉴定结果见图1；PCR鉴定结果见图2；由图可知所构建质粒均正确***了目的基因。
4、免疫印迹检测***目的基因的表达
1)10000rpm离心(离心机为Sigma公司产品)收集转染后的293T细胞(购自ATCC)，制备蛋白电泳样品并进行10％SDS-PAGE电泳；((29∶1)丙烯酰胺*双丙粉剂为SIGMA公司产品；恒压恒流电泳仪Hoefer EPS 2A200、垂直蛋白电泳仪PowerPAC1000均为Bio-Rad公司产品)；
2)将Whatman滤纸(Whatman公司产品)剪成与凝胶大小相同，3张浸于正极液，3张浸于负极液；(10X电转缓冲液母液：0.25M Tris(Sigma公司产品)，1.92M Glycine(Sigma公司产品)，1％SDS(Sigma公司产品)，pH8.3；正极液：7体积母液，2体积甲醇，1体积ddH2O；负极液：1体积母液，9体积ddH2O)；
3)120伏稳压电泳45分钟，结束后，将凝胶浸于负极液中；
4)PVDF膜(Sigma公司产品)于甲醇中浸泡15秒，然后用去离子水漂洗4次，将PVDF膜置于正极液中浸泡10分钟；
5)按由负极到正极：负极滤纸、凝胶、PVDF膜、正极滤纸的叠放顺序置于电转仪(Bio-Rad公司产品)上，注意赶走各层之间的气泡，10mA稳流转膜45分钟；
6)取出PVDF膜放入去离子水中漂洗3遍；
7)将膜放入用含5％脱脂奶的PBS溶液中4℃封闭12小时；
8)将膜放入PBST中漂洗3遍，然后将其放入含1％HIV-1阳性血清的封闭液中，室温反应2小时，PBST洗涤5次；
9)再将膜放入用含5％脱脂奶的PBS溶液按1∶2000稀释的羊抗人IgG-HRP(北京中杉金桥有限公司产品)中，室温反应1小时，PBST洗涤5次；
10)加入显色液(18ml ddH2O，2ml NiCl2，200μl 1M pH7.6 Tris-HCl，DAB(Sigma公司产品)6mg，H2O2 30μl)，室温显色10分钟，蒸馏水冲洗终止反应。
DNA构建体表达鉴定见图3。结果表明：7个抗原均可正确表达。
实施例2：构建含全部点突变的重组天坛株痘苗
1、穿梭质粒pSC65(保藏号是：CGMCC No.1097)的构建
用内切酶Xba I和Pml I(Takara公司产品)将HIV-1CN54的gp145和1455M基因分别由经测序确认的pDRVISV145和pDRVISV1455M上切下来，凝胶纯化后，采用高保真Taq酶(Takara公司产品)延伸法补平末端；然后以平端连接的方式与经Sma I(Takara公司产品)单酶切且经去磷酸化的pSC65载体相连。高保真酶补平体系：Pyrobest Taq酶0.5μl，dNTP(Takara公司产品)1μl，10×Pyrobest Taq Buffer(添加了MgCl2)1μl，去离子水补加至10μl。反应条件：72℃，5分钟。CIP酶(NEB公司产品)去磷酸化体系：CIP 1μl，NEB缓冲液32μl，去离子水7μl。连接产物转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞，涂布于含青霉素(北京第二制药厂产品)的平板(青岛α医疗器械有限公司产品)，37℃培养16小时。挑取单克隆菌落接种于3ml含50μg/ml青霉素的LB培养基中，37℃，200rpm振荡培养18小时。小量提取质粒，进行酶切鉴定、PCR鉴定，鉴定正确的质粒分别命名为pSC145和pSC1455M。含有质粒pSC1455M的大肠埃希氏菌于2008年5月22日保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.2515。经鉴定两个穿梭 质粒构建正确。
2、天坛株重组痘苗的构建、纯化和扩增
1)痘苗病毒天坛株(购自北京生物制品所)以0.1MOI(multiplicityofinfection)的剂量感染80％成片的143B细胞(购自ATCC)，37℃吸附1小时；
2)在两个Eppendorf管(Axygen公司)中各加入250μl无血清无抗生素的Eagle’s培养基(购自中国疾病预防控制中心病毒病所)，其中一个管中加入8μg的质粒pSC145或pSC1455M，混匀；另一个管中加10μlLipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen公司)，混匀；室温孵育5分钟；
3)将上述两个Eppendorf管中的溶液混合，室温放置30分钟；
4)将感染有痘苗病毒的细胞用5ml无血清无抗生素的Eagle’s培养基洗细胞2次，再加入3ml的无血清无抗生素的Eagle’s培养基；
5)将DNA质粒和Lipofectamin2000的混合液加入T25细胞培养瓶(Corning Costar公司产品)中，置于37℃二氧化碳培养箱(SANYO公司产品)中培养；
6)4小时后，用4ml Eagle’s维持培养基换液，再置于37℃二氧化碳培养箱中培养，在培养48小时利用低熔点琼脂糖(Gibco公司产品)铺斑；
7)配制低熔点琼脂糖溶液：2％低熔点琼脂糖，加入相同体积的2×Eagle’s完全培养基(购自中国疾病预防控制中心病毒病所)，加入X-gal(Promega公司产品)至终浓度为200μg/ml，加入中性红(购自中国疾病预防控制中心病毒病所)至终浓度50μg/ml，轻吹打混匀，避免气泡产生；
8)轻轻倒掉培养瓶中的培养基，缓慢加入40℃的铺斑溶液，待溶液凝固将培养瓶放入37℃二氧化碳培养箱(SANYO公司产品)；
9)培养4小时后观察细胞病变部位是否出现蓝色斑点；
10)挑取蓝色斑点，加入到500μl Eagle’s维持液中，反复冻融3次备用；
11)吸取冻融3次挑斑液200μl加入到80％-90％汇合成片的143B细胞，置于37℃二氧化碳培养箱中培养48小时，观察细胞病变情况，再次进行铺斑及挑斑，如此反复，进行5代以上挑斑纯化，获得纯化后的重组痘苗病毒rTV145和rTV1455M；
12)将用于鸡胚细胞培养的含10％小牛血清(Gibco公司产品)的Eagle’s培养基弃掉，换用一半体积的含2％小牛血清的Eagle’s维持培养基。以5MOI的剂量感染鸡胚细胞，混匀后，置于37℃5％CO2的细胞培养箱 中培养；2小时后，再补加另一半体积的含2％小牛血清的Eagle’s维持培养基，继续于37℃5％CO2的细胞培养箱(SANYO公司产品)中培养；
13)48小时后，将细胞培养基弃去，用无菌PBS漂洗一遍后，用1ml的PBS收毒，反复冻融两次后混匀分装，于-80℃冰箱(SANYO公司产品)保存。
纯化好的重组病毒经PCR和免疫印迹鉴定。结果见图5、6。结果显示，构建的重组痘苗可正确表达***的gp145和1455M基因。
实施例3：改造后的抗原的免疫原性比较实验
1、实验动物及免疫方案
BALB/c雌鼠(H-2d)，6-8周龄，体重18-25克，购自中国医学科学院实验动物中心，置于中国医学科学院生物技术所清洁级动物房饲养。
Huntley雌性豚鼠，6-8周龄，180g-220g，购自中国药品生物制品检定所动物中心，饲养于中国医学科学院动物所清洁级动物房。
BALB/c雌鼠每组7只，分别在0，2，4，6周进行DNA疫苗免疫，在第9周摘眼球取血，全血37℃孵育1小时后，3000rpm离心分离血清进行检测。Huntley雌性豚鼠每组4只，分别在0，2，4周进行DNA疫苗免疫，在第10周进行痘苗加强免疫，第14、16周进行心脏采血，全血37℃孵育1小时后，3000rpm离心分离血清进行检测。
每只小鼠胫骨前肌肌注DNA疫苗100微克(浓度1mg/ml)，每个后肢各50微克。Huntley雌性豚鼠两个后肢肌肉各注射250微克(浓度1mg/ml)，痘苗免疫剂量为1×107PFU(空斑形成单位)。
2、酶联免疫吸附试验(ELISA)检测特异性结合抗体
1)用包被液(Na2CO3 1.59克(Sigma公司产品)，NaHCO3 2.93克(Sigma公司产品)，加去离子水定容至1000ml，混匀后4℃保存)稀释HIV-1CN54膜蛋白gp120抗原(本科室自行表达、纯化及制备，纯度高达90％以上；制备方法参见冯劼硕士论文《重组HIV-1包膜糖蛋白gp120和gp41的表达、纯化及初步应用》)至约5μg/ml，100μl/孔加入96孔板(CorningCostar公司产品)中，4℃包被12小时，1×PBS洗涤3次，每孔加入200μl封闭液(PBST配制5％BSA(Sigma公司产品))，37℃孵育1小时。
3)1×PBST洗涤3次，免疫小鼠血清分别从1∶100和1∶200开始做双系列2倍倍比稀释，每孔加入100μl系列稀释的血清，同时每板空白、阳性对照及阴性对照各设2孔，37℃孵育1小时。
4)1×PBST洗涤5次，加入100μl 1∶2000稀释的羊抗小鼠IgG-HRP抗体(北京中杉金桥有限公司产品)，37℃孵育小时。
5)1×PBST洗涤5次，加入OPD显色底物(Sigma公司产品)100μl，室温避光显色15分钟。
6)每孔加入50μl 2M硫酸(购自北京化学试剂公司)终止反应，用酶标仪(ThermoElectron Coporation Multiscan ascent plate reader 354)在492nm波长检测每孔吸光度(A)值。若实验孔吸光值/对照孔吸光值大于2∶1，该孔判定为阳性孔。
结果见图6。结果显示，单独由1455M DNA疫苗激发的平均特异性结合抗体滴度远高于单独由gp145 DNA疫苗激发的平均结合抗体滴度；其抗体滴度提高了3.5倍多(p＝0.0020)。并且，在进一步的实验中证实，结合抗体的提高是由1452M所含的突变引起的；1452M疫苗可诱导产生显著高于gp145激发的平均结合抗体滴度，其平均抗体滴度可到2400，最高滴度可达9600。而其它疫苗如145M3R，145M4R，145M5R免疫后不但没有提高抗体滴度，反而结合抗体反应强度有所下降。第三次实验数据显示，145M1R疫苗可诱导产生与1452M疫苗相类似的结合抗体滴度；经统计学分析两组特异性结合抗体滴度显著高于为未改造的gp145(p＝0.0177，N＝8；p＝0.0083，N＝8)。而且数据显示145M1R疫苗诱导的抗体滴度略高于1452M疫苗组，其反应强度与未改造的gp145构成非常显著差异(p＝0.0083，N＝8)。两项灵长类动物实验结果和一项临床试验结果提醒特异性结合抗体与免疫保护相关。我们改造后的抗原1455M(含全部10个氨基酸突变位点)、1452M、145M1R均可显著提高BALB/c小鼠的特异性结合抗体反应强度。
3、BALB/c雌鼠和血清的中和抗体检测
1)每组BALB/c血清等体积混合；待测小鼠血清与豚鼠血清56℃灭活半小时；
2)取15μl血清加至135μl含1μM indinavir的DMEM培养基(Gibco公司产品)中；然后作2倍(小鼠血清)、3倍(豚鼠血清)梯度稀释；
3)每孔加入50μl 200TCID50的病毒，CO2孵箱37℃孵育一小时；
4)每孔加入1×104TZM-bl细胞(购自ATCC)，CO2孵箱37℃孵育48小时；
5)将每孔中培养基移弃，每孔加200微升PBS洗两遍；每孔加入稀释好的细胞裂解液(Promega公司产品货号E1531)50μl；显微镜(IX70荧光显微镜：日本OLYMPUS公司产品)下观察细胞完全裂解后，将裂解液转 至96孔读数板(PerkinElmer Life Sciences flat-bottomed 96-well plate)中。每孔加入配制好的100μl荧光素酶底物(Bright-Glosubstrate and buffer)(Promega公司产品货号E1501)，5分钟内完成自发荧光检测(Victor 3luminometer为PerkinElmer公司产品)。
6)按公式[1-(实验组RLU-细胞对照RLU)/(对照组RLU-细胞对照RLU)]×100％计算RLU衰减值；如该值大于50％，则该稀释度下该血清中和反应判定为阳性。
BALB/c雌鼠血清中和抗体检测结果见表3
表3：BALB/c雌鼠血清中和抗体检测结果
完全改造后的抗原1455M能够诱导产生最广谱(可中和所有来自新疆、北京和安徽的B′和B’/C亚型的临床分离株)，并且可高滴度的中和所有病毒(针对所有分离株中和滴度均大于1∶12)；未改造的gp145仅能中和一个B’亚型的病毒，对其它分离株均不具备任何中和能力。1452M、145M1R抗原诱导的抗体可广谱有效地中和大多数的临床分离株，但其光谱性不及1455M组。145M2R抗原能够诱导产生具有广谱的中和活性抗体；该位点改造诱导的中和抗体强度在1∶12左右。145M3R、145M4R抗原能够诱导中和抗体谱变广。
结果显示：含10个氨基酸突变的抗原1455M可显著提高中和抗体的广谱性、反应强度。通过进一步的研究发现所诱导的该保护性反应主要是由含前两个突变区的1452M引起的，并最终确定主要是由第一个点突变145M1R引起的。其它位点如145M2R、145M3R、145M4R等位点突变后也有使其中和抗体谱变广的效果。
Huntley豚鼠第14、16周血清中和结果见图7、8、9、10。
图7、图8显示：1455M抗原诱导该组大多数豚鼠产生了广谱性(针对所有8个HIV临床分离株)的中和抗体，而且该反应可至少持续6周。这意味着该抗原同样会在人体内诱导产生针对众多HIV亚型的广谱性、长时效的中和抗体保护。
图9、图10显示：1455M抗原诱导该组大多数豚鼠产生了高滴度(针对所有8个HIV临床分离株)的中和抗体，最强可达到1∶270；而且该反应可至少持续6周。这意味着该抗原同样会在人体内诱导产生针对众多HIV亚型的高滴度、长时效的中和抗体保护。
以上实施例仅用于说明本发明，其无意于对本发明的范围做出任何限制。显然，在不脱离本发明的精神和实质的情况下，本领域人员可以对本发明做出多种改动和变化，因此，这些改动和变化同样在本申请要求保护的范围内。
序列表

Claims (17)

1.一种衍生自HIV-1包膜蛋白的抗原性多肽或其片段，其中所述多肽或片段通过在SEQID NO：2中引入突变而衍生自SEQ ID NO：2的氨基酸序列，其中所述多肽或片段至少包含42位的亮氨酸残基被谷氨酸残基取代，且任选地包含选自由以下突变组成的组的突变：
128位的丝氨酸残基缺失；
129位的天冬酰胺残基被谷氨酰胺残基取代；
155位的精氨酸残基被谷氨酸残基取代；
179位的丝氨酸残基被谷氨酸残基取代；
180位的谷氨酸残基被赖氨酸残基取代；
183位的丝氨酸残基被谷氨酰胺残基取代；和
上述突变的任意组合。
2.权利要求1的抗原性多肽或其片段，其中所述多肽或片段至少包含所述42位的亮氨酸残基被谷氨酸残基取代、128位的丝氨酸残基缺失、和129位的天冬酰胺残基被谷氨酰胺残基取代的突变。
3.权利要求1的抗原性多肽或其片段，其中所述多肽或片段包含以下突变：
42位的亮氨酸残基被谷氨酸残基取代；
128位的丝氨酸残基缺失；
129位的天冬酰胺残基被谷氨酰胺残基取代；
155位的精氨酸残基被谷氨酸残基取代；
179位的丝氨酸残基被谷氨酸残基取代；
180位的谷氨酸残基被赖氨酸残基取代；
183位的丝氨酸残基被谷氨酰胺残基取代；
230位的甘氨酸残基被精氨酸残基取代；
232位的甘氨酸残基被谷氨酰胺残基取代；和
235位的组氨酸残基被酪氨酸残基取代。
4.权利要求1至3中任一项的抗原性多肽或其片段，其进一步包括一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加，且所述多肽或片段能够诱导保护性的免疫应答。
5.权利要求1至3中任一项的抗原性多肽或其片段，其还包含选自以下一组的修饰：糖基化位点缺失或添加、环区删除或重排、CFI区删除、及其组合。
6.一种多肽疫苗，其包含权利要求1至5中任一项的抗原性多肽或其片段和药用可接受的佐剂和/或载体。
7.一种分离的多核苷酸，其包含编码权利要求1至5中任一项的抗原性多肽或其片段的核苷酸序列。
8.一种DNA构建体，其包含可操作地连接于启动子的权利要求7的多核苷酸。
9.权利要求8的DNA构建体，其选自pDRVISV145M1R(CGMCC No.2508)、pDRVISV1452M(CGMCC No.2513)、和pDRVISV1455M(CGMCC No.2514)。
10.一种DNA疫苗，其包含权利要求8或9的DNA构建体和药用可接受的佐剂。
11.一种重组病毒载体疫苗，其包含携带权利要求7的多核苷酸的重组病毒载体和药用可接受的佐剂。
12.权利要求11的重组病毒载体疫苗，其中所述重组病毒载体选自痘苗载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、仙台病毒载体、单纯疱疹病毒载体、人***瘤病毒载体、和逆转录病毒载体。
13.权利要求11或12的重组病毒载体疫苗，其中所述重组病毒载体是复制型病毒载体。
14.权利要求13的重组病毒载体疫苗，其中所述复制型病毒载体是复制型重组痘苗载体。
15.权利要求14的重组病毒载体疫苗，其中所述复制型重组痘苗载体是复制型重组天坛株痘苗。
16.一种重组细菌载体疫苗，其包含携带权利要求7的多核苷酸的重组细菌载体和药用可接受的佐剂。
17.权利要求6的多肽疫苗和/或权利要求10的DNA疫苗和/或权利要求11至15中任一项的重组病毒载体疫苗和/或权利要求16的重组细菌载体疫苗在制备用于预防或治疗HIV-1病毒感染的疫苗组合物中的用途。
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