ES2280809T3 - Composicion inmunogenica. - Google Patents
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Abstract
Una composición inmunogénica que comprende el virus de la polio inactivado, un polisacárido u oligosacárido bacteriano y un agente de estabilización, todos formulados como una composición secada, que tras la reconstitución, puede generar una respuesta inmunitaria frente al virus de la polio.
Description
Composición inmunogénica.
La presente invención se refiere a composiciones
inmunogénicas que comprenden una formulación sólida secada o
líquida de alta viscosidad de virus de la polio inactivado (VPI) que
retiene su inmunogenicidad. La invención incluye también una vacuna
que comprende una formulación sólida secada o líquida de alta
viscosidad de VIP. Un aspecto adicional de la invención es un
procedimiento para conservar el virus de la polio inactivado (VPI)
como un sólido secado o un líquido de alta viscosidad. Este
procedimiento comprende preparar una muestra suspendiendo o
disolviendo VPI y un polisacárido bacteriano en una disolución de un
agente de estabilización y someter a la muestra a condiciones de
temperatura y presión que den como resultado que se pierda
disolvente de la muestra. Se mantienen o se ajustan las condiciones
de presión y temperatura de modo que se elimina disolvente y se
seca la muestra para formar un sólido o un líquido de alta
viscosidad. Formulaciones de este tipo pueden reconstituirse antes
de su uso o usarse directamente.
Se conoce bien el VIP como un componente de
vacunas, sin embargo, se formula como un líquido, por ejemplo en
Infanrix penta ®. Se ha asociado el procedimiento de liofilización
con la pérdida de antigenicidad de modo que es difícil formular una
vacuna eficaz que comprende una forma secada de VPI. Se conocen
formulaciones de vacuna secada, particularmente en el caso de
polisacáridos bacterianos. El polisacárido PRP de Haemophilus
influenzae b (Hib) se formula frecuentemente como un sólido
secado, por ejemplo en Infanrix hexa ® (documento WO99/48525).
Hay varias razones por las que una formulación
secada de VPI sería ventajosa. Las formulaciones secadas tienen
buenas propiedades de almacenamiento y pueden aumentar la vida útil
de almacenamiento de una vacuna que contiene VPI. La posibilidad de
secar VPI también hace a VPI un constituyente de vacuna más flexible
y permite que se formule en nuevas vacunas de combinación que no
eran posibles anteriormente. Algunas vacunas contienen componentes
líquido y sólidos secados que se mezclan justo antes de la
administración (por ejemplo Infanrix hexa ®). Infanrix Hexa
contiene un componente de Hib secado que se reconstituye con
DTPa-HepB-VPI justo antes de su
uso. Mediante la formulación de VPI junto con Hib como un sólido
secado, sería posible añadir componentes adicionales a la parte
líquida de la vacuna, que serían de otro modo incompatibles con
VPI.
Se conocen en la técnica varias técnicas para
secar componentes de vacunas. Tradicionalmente, esto se ha
conseguido usando el procedimiento de criodesecación en el que se
prepara una disolución de la sustancia y se congela la muestra.
Durante la fase de secado primaria, se elimina la mayor parte del
agua mediante sublimación de hielo en condiciones de presión
reducida y se forma una "torta" porosa. A esto le sigue
generalmente una fase de secado secundaria cuando se cambian la
presión y temperatura y se evapora el agua de la "torta"
sólida. La muestra liofilizada resultante tiene una estabilidad
mejorada en comparación con una formulación líquida. Sin embargo,
el procedimiento de criodesecación es largo y puede ser la etapa
limitante de la velocidad en un procedimiento de producción.
La variabilidad del producto también es un
problema cuando muchas muestras se liofilizan por lotes en una
unidad de secado grande. Las condiciones en los anaqueles del
criodesecador varían entre diferentes posiciones que conducen a
muestras que se liofilizan a diferentes velocidades en diferentes
condiciones. Para ciertos materiales biológicos, tales como virus
vivos, puede haber una pérdida de actividad significativa durante
el procedimiento de criodesecación (Pikal (1994) ACS Symposium 567:
120-133). Muchas sustancias criodesecadas todavía
son inestables a temperatura ambiente (Carpenter et al (1994)
ACS Symposium 567; 134-147).
El daño causado por el procedimiento de
congelación puede salvarse hasta cierto grado mediante el uso de
crioprotectores tales como polioles. Se han realizado mejoras
adicionales en el procedimiento de liofilización evitando la
congelación de la muestra durante el procedimiento y eliminando agua
mediante ebullición (documento WO96/40077; documento US6306345).
Este procedimiento supone preparar una mezcla de un material que
forma una matriz vítrea en un disolvente adecuado junto con la
muestra que va a conservarse, evaporar el disolvente en masa de la
mezcla para obtener un jarabe, exponer el jarabe a una presión y
temperatura suficientes para producir la ebullición del jarabe y
eliminar el disolvente residual.
Se describió un procedimiento similar en el
documento US5.766.520, en el que el procedimiento supone eliminar
parcialmente el agua para formar un fluido viscoso y someter
adicionalmente el jarabe a vacío para producir su "ebullición"
y secado adicional a temperaturas sustancialmente inferiores a
100ºC. Este procedimiento padece todavía de algunos de los
problemas de la criodesecación convencional. Cuando se lleva a cabo
el procedimiento en un criodesecador grande, se secarán las
muestras a diferentes velocidades dependiendo de su posición en el
anaquel y esto conduce a diferentes muestras que pierden diferente
cantidad de actividad durante el procedimiento de secado. Esto
conduce a una falta de regularidad dentro de un lote.
Hasta la fecha, no se ha notificado un ejemplo
satisfactorio de preparación de una formulación de vacuna sólida
secada de VPI que retiene un alto grado de antigenicidad y/o
inmunogenicidad.
En consecuencia, la presente invención describe
una composición inmunogénica que comprende VPI y un agente de
estabilización, formulada como una composición secada o un líquido
sumamente viscoso, que tras la reconstitución puede generar una
respuesta inmunitaria frente al virus de la polio. La presencia de
un agente de estabilización es crucial para la conservación de
antígenos y se ha demostrado que los polioles son eficaces. Se seca
preferiblemente el VPI en presencia de un polisacárido bacteriano
que conduce a la retención de un porcentaje superior de los
antígenos originales en cuanto a la antigenicidad y/o
inmunogenicidad. La presente invención engloba procedimientos de
conservación de una composición que comprende VPI, preferiblemente
en presencia de un poliol y un polisacárido bacteriano, en el que
se retiene la antigenicidad y/o inmunogenicidad de VPI. La
liofilización de VPI en presencia de polisacáridos conduce a una
mejora en la retención de antígenos por VPI comparado con la
liofilización de VPI solo. Además, también se potencia la
inmunogenicidad de Hib formulándolo junto con VPI como un sólido
secado o líquido sumamente viscoso. En particular, cuando se
reconstituye de manera extemporánea con vacunas DTP líquidas
(descritas a continuación), los inventores han encontrado que los
títulos de Hib no se reducen tanto por el componente de hidróxido
de aluminio de la vacuna DTP como hubiera sido el caso sin la
presencia de VPI.
El procedimiento de secado usado puede también
influir en la retención de la antigenicidad y/o inmunogenicidad de
VPI. Un procedimiento de secado de espuma para secar VPI fue más
eficaz en la retención de la antigenicidad de VPI que técnicas de
criodesecación convencionales. Sorprendentemente, la inclusión de
una etapa de congelación en el procedimiento de secado de espuma no
condujo a la pérdida de antigenicidad sino que condujo al desarrollo
de un procedimiento de conservación eficaz y rápido. Un
procedimiento preferido adicional de la invención retiene niveles
altos de antigenicidad y/o inmunogenicidad de VPI mediante el secado
de la muestra que contiene VPI sin congelación o formación de
espuma, dando como resultado la formación de una formulación secada,
preferiblemente una formulación líquida sumamente viscosa.
La invención proporciona una formulación secada
de VPI que tendrá beneficios de estabilidad en almacenamiento. La
formulación secada puede reconstituirse rápida y fácilmente justo
antes de la administración. Cuando se usa el procedimiento de
secado de espuma preferido, se reconstituye una torta de espuma de
forma particularmente fácil debido a la mayor área superficial de
la torta.
Los beneficios adicionales de una formulación
sólida secada o líquida sumamente viscosa de VPI y Hib incluyen la
inmunogenicidad potenciada del componente de Hib. Se conoce bien que
en vacunas multicomponentes, otras partes de la formulación de
vacuna pueden conducir a interferencia con la inmunogenicidad de Hib
(documento WO96/40242, documento WO97/00697). La inclusión de VPI
en una formulación secada con Hib puede reducir este problema,
especialmente si se mezcla la composición de VPI-Hib
secada con componentes de difteria, tétano y tos ferina antes de la
administración.
Aunque es posible la liofilización de VPI en
presencia de un polisacárido bacteriano usando un enfoque de
criodesecación convencional, se prefiere usar una técnica de secado
de espuma o un procedimiento de secado suave que no supone la
congelación o la formación de espuma. Estos procedimientos dan como
resultado una retención de la antigenicidad y/o inmunogenicidad
incluso mayor en VPI y la torta resultante también se reconstituye
más fácil y rápidamente. Los procedimientos también tienen ventajas
por ser más rápidos y de mayor eficiencia energética que las
técnicas de criodesecación habituales. Puesto que la etapa de
liofilización es a menudo la etapa limitante de la velocidad en la
producción de vacunas, el uso de los procedimientos preferidos daría
como resultado niveles superiores de producción de vacunas sin una
inversión adicional en la planta. La introducción de una etapa de
congelación en los procedimientos de secado de espuma preferidos
conduce también a reproducibilidad mejorada en los
lotes.
lotes.
Figura 1 - fotografías de viales que contienen
la muestra de conservación en diferentes fases del procedimiento de
secado de espuma.
A - muestra el aspecto de las muestras de
conservación introducidas en la criodesecación como una formulación
líquida.
B - muestra el aspecto de las muestras de
conservación a medida que se reduce la presión a 1.500 Pa. Las
muestras comienzan a congelarse a velocidades ligeramente
diferentes debido a condiciones diferentes en cada vial.
C - muestra el aspecto de las muestras de
conservación a 10 Pa, en los que todas las muestras han llegado a
congelarse completamente.
D - muestra el aspecto de las muestras de
conservación a medida que se aumenta la presión hasta 80 - 350 Pa.
Se forma un vidrio espuma a medida que la muestra de conservación
forma espuma y se evapora el disolvente.
Figura 2 - Fotografía del líquido sumamente
viscoso en viales invertidos.
La invención incluye composiciones
inmunogénicas, formuladas como un sólido secado o un líquido
sumamente viscoso que comprende VPI y un agente de estabilización,
en los que se retiene la antigenicidad y/o inmunogenicidad de VPI
tras la reconstitución. Una formulación sólida secada o líquida
sumamente viscosa de VPI puede generar una respuesta inmunitaria,
preferiblemente una respuesta inmunitaria protectora, frente al
virus de la polio, preferiblemente después de la reconstitución y
la inoculación.
Se define VPI como virus de la polio inactivado
(comprendiendo preferiblemente los tipos 1, 2 y 3 como es habitual
en la técnica de las vacunas, lo más preferiblemente la vacuna de
Salk contra la polio). Una dosis de vacuna de VPI contiene
20-80, preferiblemente 40-80
unidades de antígeno D de tipo 1 (Mahoney), 4-16,
preferiblemente 8 ó 16 unidades de antígeno de tipo 2
(MEF-1) y 20-64, preferiblemente 32
ó 64 unidades de antígeno D de tipo 3
(Saukett).
(Saukett).
Cuando se seca mediante un procedimiento de la
invención, preferiblemente se retiene la antigenicidad de 1, 2, o
los 3 de los tipos 1, 2, y 3 de virus de la polio; más
preferiblemente se retiene la antigenicidad de tipo 1; tipo 2; tipo
3; tipo 1 y tipo 2; tipo 1 y tipo 3; tipo 2 y tipo 3; o tipo 1, tipo
2 y tipo 3 a un nivel de al menos el 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%,
95% o 98% de la antigenicidad de una muestra de referencia que no
se ha sometido al procedimiento de secado. Esto puede medirse, tras
la reconstitución del sólido secado o líquido sumamente viscoso con
una disolución acuosa, mediante cualquier procedimiento adecuado
incluyendo mediante ELISA usando anticuerpos policlonales y/o
monoclonales contra el virus de la polio de tipo 1, 2 y/o 3.
Cuando se seca mediante un procedimiento de la
invención, preferiblemente se retiene la inmunogenicidad de 1, 2, o
los 3 de los tipos 1, 2 y 3 del virus de la polio; más
preferiblemente se retiene la inmunogenicidad de tipo 1; tipo 2;
tipo 3; tipo 1 y tipo 2; tipo 1 y tipo 3; tipo 2 y tipo 3; o tipo 1,
tipo 2 y tipo 3 a un nivel de al menos el 40%, 50%, 60%, 70%, 80%,
90%, 95% o 98% de la inmunogenicidad de una muestra de referencia
que no se ha sometido a un procedimiento de secado. Esto puede
medirse, tras la reconstitución del sólido secado o líquido
sumamente viscoso con una disolución acuosa, mediante cualquier
procedimiento adecuado. En un procedimiento preferido, se
reconstituye la formulación secada con una disolución acuosa y se
inocula en un animal, preferiblemente una rata. Después de un
periodo de tiempo adecuado, se recogen antisueros de los animales
inoculados y se somete a prueba la seroconversión. Preferiblemente,
se alcanza una potencia relativa de al menos 0,4, 0,5, 0,6, 0,7,
0,8 ó 0,9, comparado con una muestra de referencia no secada.
Una composición sólida secada es una formulación
de la que se ha eliminado el disolvente mediante un procedimiento
de liofilización, sublimación, evaporación o desecación de modo que
permanece menos del o igual al 15%, 12%, 10%, 7%, 5%, 4%,
preferiblemente el 3%, 2% o lo más preferiblemente el 1% de
disolvente. El término "sólido secado" comprende vidrios,
cauchos o sólidos cristalinos con un aspecto de sólido. Puede usarse
cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente para
preparar dicho sólido secado. Se elimina el disolvente mediante
sublimación, ebullición o evaporación, preferiblemente mediante
evaporación.
Un líquido sumamente viscoso se define como un
material con un contenido de disolvente inferior o igual al 15, 12,
10, preferiblemente el 8, 5, 4, 3, 2 ó 1%. El líquido sumamente
viscoso tiene un contenido de disolvente lo suficientemente bajo de
tal manera que se conserva el agente activo en un estado estable
durante al menos 3, 6, 9, 12 ó 24 meses a 4ºC, permitiendo que el
agente activo retenga al menos el 40, 50, 60, preferiblemente el
70, 80, 90, 95% de su antigenicidad y/o inmunogenidad durante este
periodo. No se ha expuesto el líquido sumamente viscoso a la
formación de burbujas que está implicada en la formación de espuma.
Preferiblemente, el líquido sumamente viscoso tiene un aspecto de
sólido pero es un vidrio y puede fluir muy lentamente durante un
periodo de días, preferiblemente semanas, más preferiblemente
meses.
Se formulan composiciones inmunogénicas de la
invención como un sólido secado o un líquido sumamente viscoso que
comprende VPI y un agente de estabilización y preferiblemente un
polisacárido bacteriano. El agente de estabilización es cualquiera
de las composiciones descritas a continuación. El polisacárido
bacteriano comprende polisacáridos capsulares derivados de
cualquier bacteria, preferiblemente una o más de Neisseria
meningitidis, Haemophilus influenzae b, Streptococcus
pneumoniae, estreptococos del grupo A, estreptococos del grupo
B, Staphylococcus aureus o Staphylococcus
epidermidis.
Preferiblemente, el polisacárido capsular PRP de
Haemophilus influenzae b están presente como un sólido secado
o un líquido sumamente viscoso. En una realización preferida
adicional, la composición inmunogénica comprende formulaciones
sólidas secadas o líquidas sumamente viscosas de polisacáridos
capsulares derivados de uno o más de los serogrupos A, C,
W-135 e Y de Neisseria meningitidis
(polisacáridos meningocócicos). Una realización preferida adicional
comprende formulaciones sólidas secadas o líquidas sumamente
viscosas de polisacáridos capsulares derivados de Streptococcus
pneumoniae. Se seleccionan preferiblemente los antígenos de
polisacáridos capsulares neumocócicos de los serotipos 1, 2, 3, 4,
5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F,
20, 22F, 23F y 33F (más preferiblemente de los serotipos 1, 3, 4, 5,
6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y 23F). Una realización preferida
adicional contiene los polisacáridos capsulares de tipo 5, tipo 8 o
336 de Staphylococcus aureus. Una realización preferida
adicional contiene los polisacáridos capsulares de tipo I, tipo II
o tipo III de Staphylococcus epidermidis. Una realización
preferida adicional contiene los polisacáridos capsulares de tipo
1a, tipo 1c, tipo II o tipo III de estreptococos del
grupo B. Una realización preferida adicional contiene los polisacáridos capsulares de estreptococos del grupo A, que preferiblemente comprende además al menos una proteína M y más preferiblemente múltiples tipos de proteína M.
grupo B. Una realización preferida adicional contiene los polisacáridos capsulares de estreptococos del grupo A, que preferiblemente comprende además al menos una proteína M y más preferiblemente múltiples tipos de proteína M.
En una realización de la invención, los
polisacáridos bacterianos son de longitud completa, siendo
polisacáridos nativos purificados. En una realización alternativa
de la invención, se les da un tamaño a los polisacáridos de entre 2
y 20 veces, preferiblemente 2-5 veces,
5-10 veces, 10-15 veces o
15-20 veces, de modo que los polisacáridos son más
pequeños en tamaño para una mayor manejabilidad. Se usan
oligosacáridos en una realización preferida. Los oligosacáridos
contienen normalmente entre 2 y 20 unidades de repetición.
La invención incluye además composiciones
inmunogénicas que comprenden más de un polisacárido bacteriano y
VPI como un sólido secado o un líquido sumamente viscoso.
Preferiblemente, se combina VPI con uno o más de polisacáridos PRP
de Hib (Haemophilus influenzae de tipo b) y/o polisacáridos
meningocócicos A, C, W y/o Y y/o polisacáridos neumocócicos. Más
preferiblemente los agentes activos comprenden, VPI e Hib; VPI y
MenC; VPI e Hib y Men C; VPI y Men A y C; VPI e Hib y Men A y C;
VPI e Hib y Men A y C e Y; o VPI e Hib y Men C e Y.
Los agentes activos particularizados
anteriormente pueden comprender también uno o más polisacáridos
capsulares neumocócicos tal como se describe a continuación.
En las composiciones anteriores en las que se
usan polisacáridos, también pueden emplearse oligosacáridos (tal
como se definieron anteriormente).
Aunque estas composiciones pueden complementarse
(tal como se describe a continuación), preferiblemente no se
complementan o preferiblemente no comprenden sales de aluminio.
Preferiblemente se conjugan los polisacáridos u
oligosacáridos con un péptido o proteína transportadora que
comprende epítopos de linfocitos T cooperadores (tal como se
describe a continuación).
Los polisacáridos capsulares presentes en las
composiciones inmunogénicas de la invención no se conjugan o se
conjugan con una proteína transportadora tal como toxoide tetánico,
fragmento C de toxoide tetánico, toxoide diftérico, CRM197,
neumolisina, proteína D (documento US6342224). Se detoxifican la
toxina tetánica, toxina diftérica y neumolisina o bien mediante
mutación genética y/o preferiblemente mediante tratamiento químico.
Una realización preferida de la invención tiene Hib conjugado con
toxoide tetánico.
Cuando está presente más de un polisacárido
conjugado en la composición inmunogénica de la invención, se
conjugan los polisacáridos con la misma proteína transportadora o
con diferentes proteínas transportadoras. Realizaciones preferidas
de la invención contienen polisacáridos meningocócicos conjugados
con una proteína transportadora. Cuando están presentes
polisacáridos meningocócicos e Hib conjugados, se conjugan con la
misma proteína transportadora o con diferentes proteínas
transportadoras.
El conjugado de polisacárido puede preparase
mediante cualquier técnica de acoplamiento conocida. En una técnica
de acoplamiento preferida, el polisacárido se acopla por medio de un
enlace tioéter. Este procedimiento de conjugación se basa en la
activación del polisacárido con tetrafluoroborato de
1-ciano-4-dimetilaminopiridinio
(CDAP) para formar un éster de cianato. El polisacárido activado
puede así estar acoplado directamente o por medio de un grupo
espaciador a un grupo amino en la proteína transportadora.
Preferiblemente, se acopla el éster de cianato con hexanodiamina y
se conjuga el polisacárido amino derivatizado con la proteína
transportadora usando química de heteroligamiento que supone la
formación del enlace tioéter. Se describen los conjugados de este
tipo en la solicitud publicada PCT WO93/15760, Universidad de
servicios uniformados ("Uniformed Services University").
También pueden prepararse los conjugados
mediante procedimientos de aminación reductora directos tal como se
describen en los documentos US 4365170 (Jennings) y US 4673574
(Anderson). Se describen otros procedimientos en los documentos
EP-0161-188,
EP-208375 y
EP-0-477508.
Un procedimiento adicional supone el
acoplamiento de un polisacárido activado de bromuro de cianógeno
derivatizado con hidrazida de ácido adípico (ADH) a la proteína
transportadora mediante condensación de carbodiimida (Chu C. et
al., Infect. Immunity, 1983 245-256).
Los polisacáridos que se incorporan como partes
de la composición inmunogénica de la invención pueden estar no
absorbidos o absorbidos sobre un adyuvante, preferiblemente una sal
de aluminio (fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio), lo más
preferiblemente fosfato de aluminio.
Composiciones inmunogénicas de la invención
comprenden un agente de estabilización que puede ayudar a evitar el
daño durante el procedimiento de desecación. Cualquiera de los
agentes de estabilización descritos a continuación, incluyendo
polioles que forman vidrio pueden incorporarse en la composición
inmunogénica, tanto como un sólido secado, un vidrio espuma o una
composición líquida sumamente viscosa usando los procedimientos de
la invención. Agentes de estabilización preferidos incluyen
sacarosa, sorbitol, lactosa y trehalosa.
Las combinaciones preferidas, secadas mediante
los procedimientos de la invención pueden combinarse con otros
antígenos, en una vacuna de combinación que se deseca o
formulaciones líquidas que se usan para reconstituir los componentes
secados.
Las formulaciones líquidas sumamente viscosas o
sólidas secadas de la invención que incorporan VPI y un agente de
estabilización pueden formularse adicionalmente con componentes de
vacunas adicionales. Una vacuna preferida contiene una formulación
líquida sumamente viscosa o sólida secada de VPI y un polisacárido
bacteriano que puede mezclarse con una formulación líquida que
comprende componentes de vacuna adicionales. Tras la reconstitución
de los componentes sólidos con los componentes líquidos, se
administra la vacuna completa mediante inyección.
Los componentes adicionales incluyen
polisacáridos capsulares derivados de uno o más de Neisseria
meningitidis, Streptococcus pneumoniae, estreptococos del grupo
A, estreptococos del grupo B, Staphylococcus aureus o
Staphylococcus epidermidis. En una realización preferida, la
composición inmunogénica comprende polisacáridos capsulares
derivados de uno o más de los serogrupos A, C, W-135
e Y de Neisseria meningitidis. Una realización adicional
preferida comprende polisacáridos capsulares derivados de
Streptococcus pneumoniae. Los antígenos de polisacáridos
capsulares de neumococos se seleccionan preferiblemente de los
serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B,
17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33F (lo más preferiblemente de
los serotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y 23F). Una
realización adicional preferida contiene los polisacáridos
capsulares del tipo 5, tipo 8 o 336 de Staphylococcus
aureus. Una realización adicional preferida contiene los
polisacáridos capsulares del tipo I, tipo II o tipo III de
Staphylococcus epidermis. Una realización adicional preferida
contiene los polisacáridos capsulares del tipo Ia, tipo Ic, tipo II
o tipo III de estreptococos del grupo B. Una realización preferida
adicional contendría los polisacáridos capsulares de estreptococos
del grupo A, comprendiendo además preferiblemente al menos una
proteína M y más preferiblemente múltiples tipos de proteína M.
La composición inmunogénica de la invención
puede formulase con antígenos de proteína. Antígenos de proteínas
de neumococos preferidos son aquellas proteínas de neumococos que se
exponen sobre la superficie exterior de los neumococos (que pueden
reconocerse mediante un sistema inmunitario del huésped durante al
menos parte del ciclo vital del neumococos), o son proteínas que se
secretan o eliminan mediante el neumococos. Lo más preferiblemente,
la proteína es una toxina, adhesina, transductor de señal de dos
componentes, o lipoproteína de Streptococcus pneumoniae, o
fragmentos de los mismos. Proteínas particularmente preferidas
incluyen, pero no se limitan a: neumolisina (preferiblemente
detoxificada mediante tratamiento químico o mutación) [Mitchell
et al. Nucleic Acids Res. 1990 Jul 11; 18(13): 4010
"Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus
pneumoniae types 1 and 2.", Mitchell et al. Biochim
Biophys Acta 1989 Jan 23; 1007(1): 67-72
"Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coli:
rapid purification and biological properties.", WO 96/05859 (A.
Cyanamid), WO 90/06951 (Paton et al), WO 99/03884 (NAVA)];
PspA y variantes de deleción de transmembrana de la misma (US
5804193 - Briles et al.); PspC y variantes de deleción de
transmembrana de la misma (WO 97/09994 - Briles et al); PsaA
y variantes de deleción de transmembrana de la misma (Berry &
Paton, Infect Immun 1996 Dec; 64(12):5255-62
"Sequence heterogeneity of PsaA, a 37-kilodalton
putative adhesin essential for virulence of Streptococcus
pneumoniae"); proteínas de unión a colina de neumococos y
variantes de deleción de transmembrana de las mismas; CbpA y
variantes de deleción del mismo (WO 97/41151; WO 99/51266);
gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa
(Infect. Immun. 1996 64:3544); HSP70 (WO 96/40928); PcpA
(Sanchez-Beato et al. FEMS Microbiol
Lett 1998, 164:207-14); proteína tipo M, (EP
0837130) y adhesina 18627, (EP 0834568). Antígenos adicionales de
proteínas de neumococos preferidos son aquellos que se describen en
el documento WO 98/18931, particularmente aquellos seleccionados en
los documentos WO 98/18930 y PCT/US99/30390.
Las proteínas de Neisseria preferidas que
van a formularse con la composición inmunogénica de la invención
incluyen TbpA (WO93/06861; EP586266; WO92/03467; US5912336), TbpB
(WO93/06861; EP586266), Hsf(WO99/
31132), NspA (WO96/29412), Hap (PCT/EP99/02766), PorA, PorB, OMP85 (también conocidos como D15) (WO00/
23595), PilQ (PCT/EP99/03603), PldA (PCT/EP99/06718), FrpB (WO96/31618 véase la SEQ ID NO:38), FrpA o FrpC o una porción conservada en común a ambos de al menos 30, 50, 100, 500, 750 aminoácidos (WO92/01460), LbpA y/o LbpB (PCT/BP98/05117; Schryvers et al Med. Microbiol. 1999 32: 1117), FhaB (WO98/02547), HasR (PCT/EP99/05989), lipo02 (PCT/EP99/08315), MltA (WO99/57280) y ctrA (PCT/EP00/00135). La proteína de
Neisseria puede añadirse como proteínas purificadas o como parte de una preparación de vesícula de membrana exterior.
31132), NspA (WO96/29412), Hap (PCT/EP99/02766), PorA, PorB, OMP85 (también conocidos como D15) (WO00/
23595), PilQ (PCT/EP99/03603), PldA (PCT/EP99/06718), FrpB (WO96/31618 véase la SEQ ID NO:38), FrpA o FrpC o una porción conservada en común a ambos de al menos 30, 50, 100, 500, 750 aminoácidos (WO92/01460), LbpA y/o LbpB (PCT/BP98/05117; Schryvers et al Med. Microbiol. 1999 32: 1117), FhaB (WO98/02547), HasR (PCT/EP99/05989), lipo02 (PCT/EP99/08315), MltA (WO99/57280) y ctrA (PCT/EP00/00135). La proteína de
Neisseria puede añadirse como proteínas purificadas o como parte de una preparación de vesícula de membrana exterior.
Se formula preferiblemente la composición
inmunogénica con antígenos que proporcionan protección contra una o
más de las infecciones de difteria, tétanos y por Bordetella
pertussis. El componente de la tos ferina puede ser célula
B. pertussis completa muerta (Pw) o es preferiblemente tos
ferina acelular (Pa) que contiene al menos un antígeno
(preferiblemente dos o los tres) de PT, FHA y pertactina de 69 KDa,
ciertas otras vacunas acelulares también contienen aglutinógenos,
tales como Fim 2 y Fim 3 y estas vacunas también se contemplan para
su uso en la invención. Normalmente, los antígenos que proporcionan
protección contra la difteria y el tétanos, son el toxoide
diftérico y el toxoide tetánico. Los toxoides son toxinas
químicamente inactivadas, por ejemplo, tras el tratamiento con
formaldehído, o toxinas inactivadas mediante la introducción de una
o más mutaciones puntuales.
Alternativamente, la composición inmunogénica de
la invención puede proporcionarse como un kit con el sólido secado,
vidrio espuma o líquido sumamente viscoso en un recipiente y líquido
DTPa o DTPw en otro recipiente. Kits de este tipo pueden, por
ejemplo, comprender una jeringa de cámara dual con los componentes
secados y líquidos contenidos en la misma jeringa pero en
diferentes cámaras. Se reconstituye a continuación el componente
secado con la vacuna líquida inmediatamente antes de la inyección
como una única vacuna. Así, por ejemplo, se reconstituye el sólido
secado, vidrio espuma o líquido sumamente viscoso de la invención
con la vacuna líquida DTPa o DTPw (preferiblemente
extemporáneamente) y administrada como una única vacuna. La vacuna
DTPa o DTPw normalmente se complementa al menos en parte con una
sal de aluminio, tal como fosfato de aluminio y/o hidróxido de
aluminio (por ejemplo vacunas Infanrix ® y Tritanrix ® de
GlaxoSmithKline Biologicals s.a.).
La composición inmunogénica se formula
opcionalmente con uno o más antígenos que pueden proteger un huésped
frente Haemophilus influenzae no tipificado, VSR y/o uno o
más antígenos que pueden proteger un huésped frente al virus de la
gripe. Antígenos de proteína preferidos H. influenzae no
tipificados incluyen proteína de fimbrina (documento US 5766608) y
fusiones que comprenden péptidos de las mismas (por ejemplo, fusión
LB1) (documento US 5843464 - Ohio State Research Foundation),
OMP26, P6, proteína D, TbpA, TbpB, Hia, Hmw1, Hmw2, Hap, y D15.
Antígenos del virus de la gripe preferidos
incluyen virus completos, vivos, o inactivados, virus de la gripe
fraccionado, que crece en huevos o células MDCK, o células Vero o
virosomas de gripe completos (tal como se describen por R. Gluck,
Vaccine, 1992, 10, 915-920) o proteínas
recombinantes o purificadas de los mismos, tales como proteínas HA,
NP, NA, o M, o combinaciones de las mismas.
Antígenos de VSR (virus sincitial respiratorio)
preferidos incluyen la glucoproteína F, la glucoproteína G, la
proteína HN, la proteína M o derivados de las mismas.
Se conocen en la técnica vacunas de combinación
que comprenden DTP-Hib. Sin embargo, existen
problemas asociados con ciertas formulaciones que suponen la simple
mezcla de Hib con otros antígenos. A menos que se formule
cuidadosamente, los títulos de anticuerpos que surgen frente al
componente Hib pueden ser inferiores que aquellos obtenidos
mediante la misma dosis de Hib inoculado por separado, debido a la
interferencia con otros componentes de la vacuna. Aunque se conoce
bien este problema en la técnica y se ha tratado de diversas
maneras, las composiciones inmunogénicas de la invención en las que
se formulan Hib y VPI juntos como un sólido secado o líquido
sumamente viscoso proporcionan una solución alternativa a este
problema.
Las composiciones inmunogénicas de la invención
pueden formar parte de un kit de vacunas en el que el VPI y el Hib
están presentes en un componente del kit y componentes adicionales,
tal como se describen anteriormente, están presentes en un segundo
componente, por ejemplo, una jeringa de cámara dual tal como se
describe en el presente documento. Se mezclan los dos componentes
juntos justo antes de la administración de la vacuna. En
formulaciones de este tipo, el componente que comprende Hib y VPI es
preferiblemente un sólido secado, un vidrio espuma o un líquido
sumamente viscoso, aunque se formula opcionalmente como un líquido.
Esta formulación da como resultado títulos de anticuerpos frente al
componente Hib que son clínicamente aceptables para proporcionar
protección frente al patógeno Haemophilus influenzae b.
Normalmente, el título de anticuerpo en la vacuna de combinación es
al menos el 85%, el 90%, preferiblemente aproximadamente el 100% o
más de aquellos obtenidos mediante la misma dosis de Hib en una
vacuna de Hib monovalente.
Las composiciones inmunogénicas de la invención
descritas anteriormente se formulan preferiblemente como una
vacuna. Preferiblemente, la vacuna contiene una cantidad de
adyuvante suficiente para potenciar la respuesta inmunitaria frente
al inmunógeno. Adyuvantes adecuados incluyen, pero no se limitan a,
sales de aluminio tales como hidróxido de aluminio y fosfato de
aluminio, mezclas de escualeno (SAF-1), péptido de
muramilo, derivados de saponina, preparaciones de paredes celulares
de mycobacterium, lípido A monofosforilo, derivados de ácido
micólico, tensioactivos de copolímeros de bloque no iónicos, Quil A,
subunidad B de la toxina de cólera, polifosfazeno y derivados, y
complejos inmunoestimuladores (ISCOM) tales como aquellos descritos
por Takahashi et al. (1990) Nature
344:873-875. Para uso veterinario y para la
producción de anticuerpos en animales, pueden usarse componentes
mitogénicos de adyuvante de Freund.
Las formulaciones de vacuna de la invención se
reconstituyen preferiblemente antes de su uso. La reconstitución
supone mezclar un componente líquido de la vacuna con la formulación
sólida secada, vidrio espuma o líquido sumamente viscoso de la
invención. La invención también engloba un recipiente con una
superficie interna repelente al agua que contiene la composición
inmunogénica o vacuna de la invención. El uso de un recipiente de
este tipo es ventajoso debido a que conduce a la composición secada
asentada en el fondo del tubo en una forma en la que es más fácil de
reconstituir.
Es ventajoso incorporar un tinte coloreado en la
muestra de conservación con el fin de permitir una visualización
más fácil de la composición secada de la invención. Esto es
particularmente importante durante la reconstitución para
garantizar que se reconstituye el sólido secado o líquido sumamente
viscoso completamente antes de su uso. Preferiblemente, el tinte
coloreado mantiene su color a un pH neutro y es compatible con la
inyección en un paciente. Lo más preferiblemente el tinte coloreado
es rojo de fenol.
Tal como con todas las composiciones
inmunogénicas o vacunas, las cantidades inmunológicamente eficaces
de los inmunógenos deben determinarse empíricamente. Los factores
que han de considerarse incluyen la inmunogenicidad, tanto si el
inmunógeno puede formar complejos con o unirse covalentemente a un
adyuvante o proteína transportadora u otro vehículo como si no, la
ruta de administraciones y el número de dosificaciones inmunitarias
que han de administrarse. Se conocen tales factores en la técnica
de las vacunas y entra dentro de la habilidad de inmunólogos
realizar tales determinaciones sin demasiada experimentación.
La sustancia puede estar presente en
concentraciones variables en la composición inmunogénica de la
invención. Normalmente, la concentración mínima de la sustancia es
una cantidad necesaria para alcanzar su uso previsto, mientras que
la concentración máxima es la cantidad máxima que permanecerá en
disolución o suspendida homogéneamente dentro de la mezcla inicial.
Por ejemplo, la cantidad mínima de un agente terapéutico es
preferiblemente una que proporcionará una dosis única
terapéuticamente eficaz. También pueden usarse disoluciones
supersaturadas si se forma un vidrio espuma antes de la
cristalización. Para sustancias bioactivas, la concentración mínima
es una cantidad necesaria para la bioactividad durante la
reconstitución y la concentración máxima está en el punto en el que
no puede mantenerse una suspensión homogénea. En el caso de unidades
de dosis única, la cantidad es la de una aplicación terapéutica
única. Generalmente, se espera que cada dosis comprenda
1-100 \mug de antígeno de proteína,
preferiblemente 5-50 \mug y lo más preferiblemente
5,25 \mug. Dosis preferidas de polisacáridos bacterianos son
10-20 \mug, 10-5 \mug,
5-2,5 \mug o 2,5-1 \mug. La
cantidad preferida de la sustancia varía de sustancia a sustancia
pero puede determinarse fácilmente por un experto en la técnica.
Los procedimientos de la invención son para
conservar una composición que comprende VPI y un agente de
estabilización, dando como resultado una composición en la que se
retiene la antigenicidad de VPI. Preferiblemente, se incorpora un
polisacárido bacteriano en la muestra que va a secarse.
En una realización, el procedimiento de la
invención supone secar VPI y comprende las etapas de:
- \bullet
- preparar una muestra de conservación suspendiendo o disolviendo VPI en una disolución de un agente de estabilización; preferiblemente un polisacárido bacteriano y/o un poliol que forma vidrio está presente en la muestra de conservación;
- \bullet
- someter la muestra de conservación a condiciones de temperatura y presión tales que se pierde el disolvente de la muestra de conservación; y
- \bullet
- eliminar disolvente hasta que se seca la muestra de conservación para formar un sólido o un líquido sumamente viscoso en el que se retiene la antigenicidad y/o inmunogenicidad de VPI.
En una realización preferida, la muestra de
conservación se inserta en un recipiente con un interior repelente
al agua antes del secado.
Un procedimiento adicional de la invención
supone secado de espuma, que comprende las etapas de:
- \bullet
- preparar una muestra de conservación suspendiendo o disolviendo VPI en una disolución de un agente de estabilización; preferiblemente un polisacárido bacteriano y/o un poliol que forma vidrio están presentes en la muestra de conservación;
- \bullet
- someter la muestra de conservación a condiciones de temperatura y presión tales que la muestra de conservación forma una espuma; y
- \bullet
- eliminar disolvente hasta que se seca la espuma para formar un sólido en el que se retiene la antigenicidad y/o inmunogenicidad de VPI.
Un procedimiento de secado de espuma preferido
de la invención usa un recipiente con una superficie interior
repelente al agua y contiene las etapas de:
- \bullet
- preparar una muestra de conservación suspendiendo o disolviendo VPI y preferiblemente un polisacárido bacteriano en una disolución de un agente de estabilización;
- \bullet
- introducir la muestra de conservación en un recipiente con una superficie interior repelente al agua;
- \bullet
- someter el recipiente que contiene la muestra de conservación a condiciones de temperatura y presión de tal modo que la muestra de conservación forma una espuma;
- \bullet
- eliminar disolvente hasta que se seca la espuma para formar un sólido en el que se retiene la antigenicidad y/o inmunogenicidad de VPI.
Los procedimientos de secado de espuma de la
invención descritos anteriormente comprenden opcionalmente una
etapa de congelación. La muestra de congelación puede estar total o
parcialmente congelada. Por tanto, algunos procedimientos de la
invención comprenden las etapas de:
- \bullet
- preparar una muestra de conservación al menos parcialmente congelada suspendiendo o disolviendo VPI y preferiblemente un polisacárido bacteriano en una disolución de un agente de estabilización y congelar la mezcla;
- \bullet
- someter la muestra de conservación al menos parcialmente congelada a condiciones de temperatura y presión tales que la muestra de conservación forma una espuma; y
- \bullet
- eliminar disolvente hasta que se seca la espuma para formar un sólido en el que se retiene la antigenicidad y/o inmunogenicidad de VPI.
La etapa de congelación del procedimiento
anterior es preferiblemente mediante el procedimiento de congelación
por enfriamiento brusco en el que la reducción de la presión es la
causa de la congelación por evaporación. Esto provoca la
congelación rápida de la muestra lo que conduce a menos pérdida de
antígeno. Por tanto un procedimiento de la invención incluye las
etapas de:
- \bullet
- preparar una muestra de conservación suspendiendo o disolviendo VPI y preferiblemente un polisacárido bacteriano en una disolución de un agente de estabilización;
- \bullet
- someter la muestra de conservación a presión reducida de tal manera que la muestra de conservación llega a congelarse al menos parcialmente;
- \bullet
- someter la muestra de conservación al menos parcialmente congelada a condiciones de temperatura y presión tales que la muestra de conservación forma una espuma; y
- \bullet
- eliminar disolvente hasta que se seca la espuma para formar un sólido en el que se retiene la antigenicidad y/o inmunogenicidad de VPI.
Se usa un procedimiento preferido adicional de
la invención para conservar VPI y comprende las etapas de:
- \bullet
- preparar una muestra de conservación suspendiendo o disolviendo VPI en una disolución de un agente de estabilización;
- \bullet
- someter la muestra de conservación a condiciones de temperatura y presión tales que la muestra de conservación pierde el disolvente por evaporación, sin formar burbujas para formar una espuma y preferiblemente sin congelarse;
- \bullet
- eliminar disolvente hasta que se seca la espuma para formar un líquido sumamente viscoso en el que se retiene la antigenicidad y/o inmunogenicidad de VPI.
Los procedimientos de la invención proporcionan
una formulación de VPI que puede resistir el almacenamiento
prolongado durante el que se mantiene la antigenicidad y/o
inmunogenicidad de VPI. Preferiblemente, el VPI retiene al menos el
40, 50, 60, 70, preferiblemente el 80, 90, 95% de su antigenicidad
y/o inmunogenicidad original durante un periodo de tiempo de
almacenamiento de al menos 3, 6, 9, 12, 24 meses de almacenamiento
a 4ºC. Se miden la antigenicidad e inmunogenicidad tras la
reconstitución de VPI en una disolución acuosa adecuada, y usando
un procedimiento adecuado, por ejemplo, aquellos descritos
anteriormente.
El procedimiento de secado sin congelación o
formación de espuma puede aplicarse en particular para su uso
cuando los agentes activos que han de secarse son propensos a la
pérdida de actividad y/o antigenicidad durante el procedimiento de
secado debido a la exposición a la congelación o formación de
burbujas asociada con la formación de espuma. En particular también
puede aplicarse para su uso cuando una concentración inferior del
poliol que forma vidrio es ventajosa y/o cuando se prefiere un
procedimiento de secado más corto.
El agente de estabilización que ha de usarse en
los procedimientos de la invención comprenderá preferiblemente
polioles que forman vidrio. Materiales adecuados incluyen, pero no
se limitan a, todos los polioles, incluyendo polioles derivados de
hidratos de carbono y no derivados de hidratos de carbono.
Preferiblemente, el poliol de estabilización permite que se
almacene el agente activo sin pérdida sustancial de de actividad por
desnaturalización, agregación u otros medios. Materiales
particularmente adecuados incluyen azúcares, alcoholes de azúcares y
derivados de hidratos de carbono. Preferiblemente, el poliol que
forma vidrio es un hidrato de carbono o derivados de los mismos,
incluyendo glucosa, maltulosa, isomaltulosa, lactulosa, sacarosa,
maltosa, lactosa, isomaltosa, maltitol, lactitol, palatinita,
trehalosa, rafinosa, estaquiosa, melezitosa o dextrano, más
preferiblemente trehalosa, sacarosa, sorbitol, rafinosa, manitol,
lactosa, lactitol o palatinita.
Los polisacáridos bacterianos actúan como un
agente de estabilización y las realizaciones preferidas de la
invención incorporan polisacáridos bacterianos como un constituyente
del agente de estabilización. El polisacárido bacteriano desempeña
un papel dual de agente de estabilización e inmunógeno en esta
realización.
Los hidratos de carbono incluyen, pero no se
limitan a, monosacáridos, disacáridos, trisacáridos, oligosacáridos
y sus correspondientes alcoholes de azúcares, compuestos de
polihidroxilo tales como derivados de hidratos de carbono e
hidratos de carbono modificados químicamente, hidroxietilalmidón y
copolímeros de azúcares. Tanto los hidratos de carbono naturales
como los sintéticos son adecuados para su uso. Los hidratos de
carbono sintéticos incluyen, pero no se limitan a, aquellos que
tienen el enlace glucosídico sustituido por un tiol o un enlace de
carbono. Puede usarse tanto la forma D como la L de los hidratos de
carbono. El hidrato de carbono puede ser reductor o no reductor.
Cuando se usa un hidrato de carbono reductor, se prefiere la adición
de inhibidores de la reacción Maillard.
Hidratos de carbono reductores adecuados para su
uso en la invención son aquellos conocidos en la técnica e
incluyen, pero no se limitan a, glucosa, maltosa, lactosa, fructosa,
galactosa, manosa, maltulosa y lactulosa. Los hidratos de carbono
no reductores incluyen, pero no se limitan a, glucósidos no
reductores de compuestos de polihidroxilo seleccionados de
alcoholes de azúcares y otros polialcoholes de cadena lineal. Otros
hidratos de carbono útiles incluyen rafinosa, estaquiosa,
melezitosa, dextrano, sacarosa, celobiosa, manobiosa y alcoholes de
azúcares. Los glucósidos de alcoholes de azúcares son
preferiblemente monoglucósidos, en particular los compuestos
obtenidos mediante la reducción de disacáridos tales como lactosa,
maltosa, lactulosa y maltulosa.
Hidratos de carbono particularmente preferidos
son trehalosa, sacarosa, sorbitol, maltitol, lactitol, palatinita y
glucopiranosil-1\rightarrow6-manitol.
Los aminoácidos puede actuar como agentes de
estabilización y pueden usarse por ellos mismos y preferiblemente
en combinación con un poliol. Aminoácidos preferidos incluyen
glicina, alanina, arginina, lisina y glutamina aunque cualquier
aminoácido o combinación de aminoácidos, péptido, proteína o
proteínas hidrolizadas tales como seroalbúmina pueden actuar como
agente de estabilización.
Preferiblemente, la muestra de conservación
contendrá un componente que puede inhibir la formación de cristales
en el sólido secado o líquido sumamente viscoso de la invención.
Sales y otras moléculas que incluyen aminoácidos y rojo de fenol
inhiben la formación de cristales.
La concentración del agente de estabilización
usado en el procedimiento de la invención puede estar entre el 1% y
el 50% peso/volumen, preferiblemente 1-5%,
5-10%, 5-10%,
15-20%, 20-25% o
25-50%, lo más preferiblemente inferior al 25%
(p/v). La cantidad de agente de estabilización requerida es
proporcional a la cantidad de sales presentes. Por tanto, aunque se
prefieren niveles de agente de estabilización entre el 3% y el 10%,
concentraciones superiores del 10% al 25% (p/v) pueden requerirse
para secar muestras con un alto contenido en sales.
Diferentes mezclas y varias formas y tamaños de
recipiente pueden procesarse simultáneamente. Idealmente, el tamaño
del recipiente usado es suficiente para contener la mezcla inicial y
alojar el volumen de la formulación secada formada de la misma.
Normalmente, esto se determina mediante la masa del material que
forma vidrio, el área de superficie del recipiente y las
condiciones de temperatura y presión, que determinan si se produce
la formación de espuma. El material que forma vidrio debe ser
suficiente para proporcionar un jarabe viscoso, que opcionalmente
va a formar espuma lo que se traduce prácticamente como una masa
mínima por área unitaria de la superficie del recipiente. Esta
razón varía de mezcla a mezcla y recipiente usado, pero se determina
fácilmente de manera empírica por un experto en la técnica
siguiendo los procedimientos expuestos en el presente documento.
Puede usarse cualquier recipiente de este tipo incluyendo viales
moldeados de Wheaton y cortados en tubo.
Los procedimientos de la invención usan
preferiblemente recipientes con una superficie interior repelente
al agua. Esto se consigue recubriendo la superficie interior con una
composición hidrófoba, por ejemplo, mediante siliconización. Se
consigue la siliconización mediante procedimientos que se conocen
bien por aquellos expertos en la técnica. En un procedimiento, el
recipiente se siliconiza elevando el interior del contenedor con una
emulsión de silicona, seguida del procesamiento en un horno a alta
temperatura, normalmente 350ºC. Alternativamente, se consigue la
superficie interior repelente al agua fabricándose el recipiente de
una composición repelente al agua.
La superficie interior repelente al agua del
recipiente hace más probable que se produzca la formación de espuma
y más reproducible. Esto permite que se usen concentraciones de
polioles inferiores en la muestra de conservación lo que a su vez
disminuye la longitud de tiempo necesaria para secar la muestra,
reduce el efecto de las reacciones de Maillard u otras
interacciones con el poliol que dañan al agente activo. Cuando las
muestras de conservación comprenden una vacuna, el vidrio espuma
resultante se reconstituye rápida y fácilmente debido a la cantidad
inferior de poliol presente y la disolución de vacuna resultante es
menos viscosa, lo que permite una administración más fácil. La
superficie interior repelente al agua permite una reconstitución más
fácil del sólido seco o líquido sumamente viscoso puesto que
estimula a la muestra para permanecer en el fondo del recipiente de
tal manera que es más fácil reconstituir eficazmente.
Aunque pueden usarse formas singulares en el
presente documento, pueden estar presentes más de un agente de
estabilización, más de un aditivo, y más de una sustancia. Las
cantidades eficaces de estos componentes se determinan fácilmente
por un experto en la técnica.
Se prepara la muestra de conservación
disolviendo/suspendiendo VPI y un agente de estabilización en agua
para preparar una disolución acuosa. Preferiblemente, el agua está
presente en la muestra de conservación a un nivel del 5 al 98% en
volumen, más preferiblemente del 80-90% en volumen,
lo más preferiblemente del 85-98% en volumen.
El volumen de disolvente puede variar y
dependerá del agente de estabilización y de la sustancia que ha de
incorporarse así como de cualquier aditivo. El volumen mínimo
requerido es una cantidad necesaria para solubilizar los diversos
componentes. Sin embargo, suspensiones dispersadas de forma
homogénea de la(s) sustancia(s) también pueden
usarse. Pueden determinarse las cantidades adecuadas de los
componentes en las realizaciones específicas fácilmente por
aquellos expertos en la técnica a la luz de los ejemplos
proporcionados en el presente documento.
Pueden ponerse varios aditivos en la muestra de
conservación. Normalmente, los aditivos potencian la formación de
espuma y/o el procedimiento de secado y/o contribuyen a la
solubilización de la sustancia. Alternativamente, los aditivos
contribuyen a la estabilidad de la sustancia incorporada dentro del
sólido. Pueden estar presentes uno o más aditivos.
A modo de ejemplo, la adición de sales
volátiles/efervescentes permite volúmenes iniciales más grandes y da
como resultado un área de superficie mayor dentro del vidrio
espuma, llevando a cabo así una formación de espuma superior y un
secado más rápido. Tal como se usa en el presente documento, las
sales volátiles son sales que volatilizan en las condiciones usadas
para producir un vidrio espuma. Ejemplos de sales volátiles
adecuadas incluyen, pero no se limitan a, acetato de amonio,
bicarbonato de amonio y carbonato de amonio. Sales que se
descomponen para dar productos gaseosos también llevan a cabo una
formación de espuma potenciada y un secado más rápido. Ejemplos de
sales de este tipo son bicarbonato de sodio y metabisulfito de
sodio. Preferiblemente, las sales volátiles están presentes en una
cantidad de desde aproximadamente 0,01 hasta 5 M. Concentraciones
de hasta 5 M son adecuadas para su uso en el presente documento. El
vidrio espuma resultante tiene una conformación de espuma uniforme
y está significativamente más seco en comparación con vidrio espuma
en el que no se usan sales volátiles/efervescentes.
Otro aditivo adecuado es un agente de
estabilización de espuma, que puede usarse en combinación con la sal
o bien volátil o bien de descomposición. Esto puede o bien ser un
componente tensioactivo tal como una molécula anfipática (es decir,
tal como fosfolípidos y tensioactivos) o un agente para aumentar la
viscosidad del jarabe de espuma, tal como un agente espesante tal
como goma guar y sus derivados.
Otro aditivo es un inhibidor de la reacción de
Maillard. Preferiblemente, si la sustancia y/o material que forma
una matriz de vidrio contiene grupos carbonilo y amino, imino o
guanidino, las composiciones contienen además al menos un inhibidor
fisiológicamente aceptable de la reacción de Maillard en una
cantidad eficaz para impedir sustancialmente la condensación de
grupos amino y grupos carbonilo reactivos en la composición. El
inhibidor de la reacción de Maillard puede ser cualquiera conocido
en la técnica. El inhibidor está presente en una cantidad
suficiente para impedir, o impedir sustancialmente, la condensación
de grupos amino y grupos carbonilo reactivos. Normalmente, los
grupos amino están presentes en la sustancia y los grupos carbonilo
están presentes en el material que forma la matriz de vidrio, o al
revés. Sin embargo, los aminoácidos y grupos carbonilo puede ser
intramoleculares con o bien la sustancia o bien el hidrato de
carbono.
Se conocen varias clases de compuestos que
muestran un efecto inhibidor en la reacción de Maillard y por tanto
que pueden ser de uso en las composiciones descritas en el presente
documento. Estos compuestos son generalmente inhibidores o bien
competitivos o bien no competitivos de la reacción de Maillard. Los
inhibidores competitivos incluyen, pero no se limitan a, residuos
de aminoácidos (tanto D como L), combinaciones de residuos de
aminoácidos y péptidos. Se prefieren en particular la lisina,
arginina, histidina y triptófano. La lisina y arginina son los más
eficaces. Hay muchos inhibidores no competitivos conocidos. Estos
incluyen, pero no se limitan a, aminoguanidina y derivados y
anfotericina B. El documento EP-A-0
433 679 también describe inhibidores de Maillard adecuados que
incluyen derivados de
4-hidroxi-5,8-dioxoquinolina.
Los procedimientos de la invención se usan para
conservar el virus de la polio inactivado (VPI - que comprende
preferiblemente los tipos 1, 2 y 3 tal como es habitual en la
técnica de las vacunas, lo más preferiblemente la vacuna de Salk
contra la polio). VPI contiene 20-80,
preferiblemente 40 u 8 unidades de antígeno D de tipo 1 (Mahoney),
4-20, preferiblemente 8 o 16 unidades de antígeno D
de tipo 2 (MEF-1) y 20-64,
preferiblemente 32 ó 64 unidades de antígeno D de tipo 3 (Saukett).
La formulación de vacunas VPI es adecuada para la inyección tras la
reconstitución en una disolución acuosa que contiene preferiblemente
componentes de vacuna adicionales.
El polisacárido bacteriano incorporado mediante
el proceso de la invención son por ejemplo polisacáridos capsulares
derivados de uno o más de Neisseria meningitidis,
Haemophilus influenzae b, Streptococcus pneumoniae,
estreptococos del grupo A, estreptococos del grupo B,
Staphylococcus aureus o Staphylococcus epidermidis,
preferiblemente los polisacáridos capsulares PRP de Haemophilus
influenzae. Polisacáridos capsulares preferidos incluyen también
aquellos derivados de uno o más de los serogrupos A, C,
W-135 e Y de Neisseria meningitidis.
Polisacáridos capsulares adicionales preferidos se derivan de
Streptococcus pneumoniae. Los antígenos de polisacáridos
capsulares de neumococos se seleccionan preferiblemente de los
serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B,
17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33F (lo más preferiblemente de
los serotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y 23F). Una
realización preferida adicional contiene polisacáridos capsulares
del tipo 5, tipo 8 o 336 de Staphylococcus aureus.
Polisacáridos preferidos adicionales incluyen polisacáridos
capsulares del tipo I, tipo II o tipo III de Staphylococcus
epidermidis, polisacáridos capsulares del tipo Ia, tipo Ic,
tipo II o tipo III de estreptococos del grupo B. Polisacáridos
preferidos adicionales incluyen los polisacáridos capsulares de
estreptococos del grupo A, que además comprenden preferiblemente al
menos una proteína M y más preferiblemente múltiples tipos de
proteínas M.
Las combinaciones preferidas de agentes activos
que han de conservarse que usan los procedimientos de la invención
comprenden VPI. Preferiblemente, se combina VPI con polisacáridos
bacterianos que comprenden uno o más de los polisacáridos PRP de
Hib y/o polisacáridos meningocócicos A, C, W y/o Y y/o polisacáridos
neumocócicos. Las combinaciones preferidas incluyen VPI e Hib; VPI
y MenC; VPI y MenA y C; VPI e Hib y Men C o VPI, Hib, Men A y C.
Cada polisacárido bacteriano puede estar presente en dosis de
1-5 \mug, 5-10 \mug,
10-20 \mug o 20-40 \mug.
Los polisacáridos bacterianos se conjugan o no
se conjugan con una proteína transportadora tal como toxoide
tetánico, fragmento C de toxoide tetánico, toxoide diftérico,
CRM197, neumolisina o proteína D (documento US6342224).
Se preparan los polisacáridos conjugados
mediante cualquier técnica de acoplamiento conocida. Un
procedimiento de conjugación preferido se basa en la activación del
polisacárido a tetrafluoroborato de
1-ciano-4-dimetilaminopiridinio
(CDAP) para formar un éster de cianato. El polisacárido está
acoplado directamente o por medio de un grupo espaciador a un grupo
amino en la proteína transportadora. Preferiblemente, se acopla el
éster de cianato con hexanodiamina y se conjuga el polisacárido
amino derivatizado con la proteína transportadora usando química de
heteroligamiento que supone la formación del enlace tioéter. Se
describen los conjugados de este tipo en la solicitud publicada PCT
WO93/15760, Universidad de servicios uniformados ("Uniformed
Services University").
Pueden prepararse los conjugados opcionalmente
mediante procedimientos de aminación reductora directa tal como se
describe los documentos US 4365170 (Jennings) y US 4673574
(Anderson). Se describen otros procedimientos en los documentos
EP-0161-188,
EP-208375 y
EP-0-477508.
Un procedimiento adicional supone el
acoplamiento de un polisacárido activado de bromuro de cianógeno
derivatizado con hidrazida de ácido adípico (ADH) a la proteína
transportadora mediante condensación de carbodiimida (Chu C. et
al., Infect. Immunity, 1983 245-256).
En una realización, el procedimiento de la
invención supone secar el VPI en presencia de un agente de
estabilización, preferiblemente en presencia de un polisacárido
bacteriano. En este procedimiento, se somete la muestra de
conservación a condiciones de temperatura y presión reducidas. La
temperatura se reduce a inferior a 20ºC o 0ºC, preferiblemente
inferior a -10ºC o -20ºC, más preferiblemente de -40ºC o -60ºC. La
presión se reduce por inferior a 100 Pa, preferiblemente una
presión de o inferior a 50, 10, más preferiblemente 5 ó 1 Pa. Las
condiciones de temperatura y presión reducidas se mantienen durante
al menos 10, 12, 16, 20, preferiblemente 24, 36, más
preferiblemente 48 ó 72 horas. El disolvente se elimina hasta que se
seca la muestra de conservación para formar un sólido.
En toda esta solicitud, el sólido incluye
vidrios, cauchos y cristales que se forman a medida que se seca la
muestra. Tales sólidos preferiblemente retienen un contenido de agua
del 10-20% o el 5-10%,
preferiblemente el 5-6%, 4-5%, o el
3-4%, o el 2-3%, más preferiblemente
el 1-2% o el 0-1% (p/p).
Un procedimiento preferido de la invención
supone someter la muestra de conservación a condiciones de
temperatura y presión tales de modo que la muestra comienza a
burbujear, formando una espuma.
La temperatura dentro de la muestra de
conservación será diferente a la externa a la muestra debido a la
naturaleza endotérmica del proceso de evaporación. Las referencias
a la temperatura se hacen a las condiciones externas a la muestra
de conservación, por ejemplo, cuando se usa un criodesecador
industrial grande, a la temperatura del anaquel. Esto corresponde
normalmente al ajuste de temperatura del criodesecador.
Una realización preferida de la invención
consigue esto reduciendo la presión mientras se mantienen las
condiciones de temperatura. La presión se ajusta a o inferior a
800, 700, 600, preferiblemente 500, 400, 300, más preferiblemente
200, 150, 100, lo más preferiblemente 80 ó 50 Pa, mientras se
mantiene el ajuste de temperatura a una temperatura superior a 0ºC,
preferiblemente de entre 10ºC y 15ºC; 15ºC y 20ºC; 20ºC y 25ºC; 25ºC
y 30ºC; o 30ºC y 37ºC. Se mantienen estas condiciones durante al
menos 1, 2, 3, 4, 5, 8, 10, 12, 16 ó 24 horas.
Otra realización de la invención consigue la
formación de espuma cambiando la temperatura mientras se mantienen
reducidas las condiciones de presión. Se aumenta el ajuste de
temperatura hasta superior a 20ºC, preferiblemente hasta entre 20ºC
y 30ºC; 30ºC y 40ºC; 40ºC y 50ºC; o 50ºC y 70ºC; o el ajuste de
temperatura está en el intervalo de 10-50ºC,
preferiblemente de 20-40ºC, más preferiblemente de
25-35ºC. Se mantienen las condiciones de presión a
un nivel reducido de o inferior a 800, 700, 600, preferiblemente
500, 400, 300, más preferiblemente 200, 150, 100, lo más
preferiblemente 80 ó 50 Pa. Se mantienen estas condiciones durante
al menos 1, 2, 3, 4, 5, 8, 10, 12, 16 ó 24 horas.
Una fase posterior del procedimiento de secado
de espuma de la invención supone eliminar disolvente hasta que se
seca la espuma para formar un sólido. En una realización de la
invención, esto puede conseguirse manteniendo las condiciones de
presión y temperatura en las aplicadas con el fin de conseguir la
formación de espuma. Por ejemplo, la presión se mantiene a o
inferior a 800, 700, 600, preferiblemente 500, 400, 300, más
preferiblemente 200, 150, 100, lo más preferiblemente 80 ó 50 Pa
mientras se mantiene el ajuste de temperatura superior a 0ºC,
preferiblemente entre 2ºC y 10ºC, 10ºC y 20ºC; 20ºC y 30ºC; 30ºC y
35ºC, 35ºC y 40ºC lo más preferiblemente entre 5ºC y 25ºC. Se
mantienen estas condiciones de temperatura y presión durante 1, 2,
3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 18 horas o más con el fin de obtener un
sólido con un contenido de disolvente inferior o igual al 10, 8, 5,
4, preferiblemente el 3, 2 o más preferiblemente el 1% (p/p).
Otra realización de la invención aumenta el
ajuste de temperatura durante la eliminación de disolvente a un
ajuste de temperatura superior que el que se mantuvo anteriormente
en el procedimiento. Esto permite de forma ventajosa que el
disolvente abandone la muestra a una velocidad más rápida de modo
que el procedimiento de la invención puede completarse en un tiempo
más corto. Por ejemplo, se aumenta el ajuste de temperatura hasta
superior a 0ºC, preferiblemente entre 2ºC y 10ºC; 10ºC y 20ºC; 20ºC
y 30ºC; 30ºC y 40ºC; 40ºC y 50ºC; 50ºC y 60ºC mientras se mantiene
la presión a o inferior a 800, 700, 600, preferiblemente 500, 400,
300, más preferiblemente 200, 150, 100, lo más preferiblemente 80 ó
50 Pa. Se mantienen estas condiciones de presión y temperatura
durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 18 horas o más con el fin de
obtener un sólido con un contenido de agua inferior al 10, 8, 5, 4,
preferiblemente el 3, 2 o lo más preferiblemente el 1% (p/p).
Otra realización de la invención reduce el
ajuste de presión durante la eliminación de disolvente a un ajuste
de presión inferior que el usado durante la formación de espuma.
Esto permite de forma ventajosa que el disolvente abandone la
muestra a una velocidad más rápida de modo que el procedimiento de
la invención puede completarse en un tiempo más corto. Por ejemplo,
el ajuste de presión se disminuye hasta o inferior a 500, 400, 300,
preferiblemente 200, 100, 80, más preferiblemente 50, 10, lo más
preferiblemente 5 ó 1 Pa, mientras se mantiene la temperatura a o
superior a 0ºC, preferiblemente entre 10ºC y 20ºC; 20ºC y 30ºC; 30ºC
y 35ºC o superior a 40ºC. Se mantienen estas condiciones de presión
y temperatura durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 18 horas o más
con el fin de obtener un sólido con un contenido de disolvente
inferior o igual al 5, 4, preferiblemente el 3 ó 2 o más
preferiblemente el 1%
(p/p).
(p/p).
El procedimiento de la invención supone
opcionalmente congelar la muestra. Congelar la muestra antes del
secado de espuma tiene la ventaja de una reproducibilidad aumentada
entre muestras en un lote. Esto se debe a que todas las muestras
empiezan el procedimiento a partir de la misma condición física de
estar congelados. Las muestras de conservación pueden estar total o
parcialmente congeladas.
La congelación se lleva a cabo opcionalmente
antes de someter la muestra a presión reducida poniendo la muestra
de conservación a una temperatura inferior a 0ºC durante una
cantidad de tiempo adecuada para permitir que se congele la
muestra. Preferiblemente, la temperatura usada está en o es inferior
a -10ºC, -15ºC, -20ºC, -30ºC, -40ºC, -70ºC o -140ºC. Puede dejarse
la muestra a una temperatura inferior a 0ºC durante 1, 2, 3, 4, 5,
8, 16 o más horas para permitir que se produzca la congelación.
Para algunas muestras, en particular las
muestras que se dañan fácilmente mediante la formación de cristales
de disolvente tales como preparaciones celulares u otros sistemas
biológicos, es preferible congelar la muestra lentamente a una
velocidad inferior o igual a 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5ºC por hora. Se
conservan otras composiciones más eficazmente congelando
instantáneamente, por ejemplo, mediante congelación ultrarrápida en
nitrógeno líquido. Este procedimiento es particularmente
beneficioso para proteínas o partículas virales. La congelación por
evaporación también da como resultado la congelación rápida de la
muestra.
Alternativamente, se congela la muestra de
conservación sometiendo la muestra a presión reducida de tal manera
que la muestra llega a congelarse total o parcialmente. Se lleva a
cabo una congelación por enfriamiento brusco de este tipo dentro de
un aparato de criodesecación en masa, a una temperatura de anaquel
de o superior a 0ºC, 10ºC, 15ºC, 20ºC, 30ºC, 37ºC. Preferiblemente,
la temperatura de anaquel está entre 5 y 35ºC, más preferiblemente
entre 10 y 20ºC, lo más preferiblemente a 15ºC. Opcionalmente se
reduce la presión inicialmente hasta 20.000 Pa durante 5, 10, 20,
30, 60 minutos o más para permitir la desgasificación. Con el fin de
congelar la muestra, se reduce la presión adicionalmente hasta una
presión igual o inferior a 200, 100, 50, 20, 10 Pa. Se mantiene
esta presión durante al menos 5, 10, 20 ó 30 minutos hasta que la
muestra se congela total o parcialmente.
Las etapas posteriores de formación de espuma y
eliminación de disolvente para formar un sólido son tal como se
describieron anteriormente.
En una realización preferida de la invención,
las etapas de congelar la muestra dentro del criodesecador y
formación de espuma se realizan a temperatura constante,
preferiblemente modificando las condiciones de presión.
En una realización preferida adicional, se
realizan las etapas de congelar la muestra dentro del criodesecador,
formación de espuma y eliminación de disolvente para formar un
sólido, a temperatura constante, preferiblemente modificando las
condiciones de presión.
En una realización adicional de la invención,
las condiciones tanto de temperatura como de presión son diferentes
durante las etapas de congelar la muestra, formación de espuma y
eliminación de disolvente para formar un sólido.
Los procedimientos de la invención usan
preferiblemente recipientes con una superficie interior repelente
al agua. Esto se consigue recubriendo la superficie interior con una
composición hidrófoba, por ejemplo, mediante siliconización. Se
consigue la siliconización mediante procesos que se conocen bien por
los expertos en la técnica. Alternativamente, se consigue la
superficie interior repelente al agua fabricando el recipiente de
una composición repelente al agua.
La presencia de una superficie interior del
recipiente repelente al agua hace más probable que se produzca la
formación de espuma y más reproducible. Esto permite que se usen
concentraciones inferiores de poliol en la muestra de conservación
lo que a su vez disminuye la duración de tiempo necesaria para secar
la muestra, reduce el efecto de las reacciones de Maillard u otras
interacciones perjudiciales entre el poliol y el agente activo.
Cuando las muestras de conservación comprenden una vacuna, se
reconstituye el sólido resultante rápidamente debido a la cantidad
inferior de poliol presente y la disolución de vacuna resultante es
menos viscosa, permitiendo una administración más fácil.
Un procedimiento de la invención particularmente
preferido supone el secado de VPI en presencia de un agente de
estabilización, y preferiblemente un polisacárido bacteriano, usando
un procedimiento de secado suave que evita la exposición de VPI a
congelación o formación de espuma, de modo que se somete el VPI a
menor tensión durante el procedimiento de secado y se retiene un
alto grado de antigenicidad.
El método puede aplicarse en particular para su
uso cuando es ventajosa una concentración inferior de poliol que
forma vidrio, por ejemplo, a una concentración inferior al 10%
(p/v), más preferiblemente inferior al 5% (p/v) y se prefiere un
tiempo de secado más corto.
El procedimiento de secado sin congelación o
formación de espuma supone someter la muestra de conservación a
condiciones de temperatura y presión tales que la muestra de
conservación pierde disolvente por evaporación, sin que la muestra
se congele o burbujee para formar una espuma.
La temperatura dentro de la muestra de
conservación será, a veces, diferente a la externa a la muestra
debido a la naturaleza endotérmica del proceso de evaporación. Las
referencias a la temperatura se hacen a las condiciones externas a
la muestra de conservación, por ejemplo, cuando se usa un
criodesecador industrial grande, a la temperatura del anaquel. Esta
corresponde normalmente al ajuste de temperatura del
criodesecador.
Opcionalmente, está presente una etapa
preliminar de desgasificación de la muestra de conservación en el
procedimiento de la invención. Se reduce la presión hasta o
inferior a 20.000 Pa, preferiblemente entre 20.000 y 3.500 Pa,
durante un periodo de al menos 5 minutos antes de que la presión se
reduzca adicionalmente.
Una realización preferida de la invención
consigue el secado por evaporación reduciendo la presión mientras
se controlan las condiciones de temperatura. Se ajusta la presión a
o inferior a 3.000, 2.500, 2.000, preferiblemente 1.500, 1.200, lo
más preferiblemente 1.000, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 ó 100
Pa, mientras se mantiene el ajuste de temperatura a una temperatura
superior a 0ºC, preferiblemente de entre 4ºC y 37ºC, 4ºC y 10ºC,
10ºC y 15ºC; 15ºC y 20ºC; 20ºC y 25ºC; 25ºC y 30ºC; o 30ºC y 37ºC; o
37ºC y 45ºC. Se mantienen estas condiciones durante al menos 1, 2,
3, 4, 5, 8, 10, 12, 16 ó 24 horas, preferiblemente durante entre
2-4 horas, 4-6 horas,
6-8 horas, 8-12 horas o
12-18 horas. En una realización particularmente
preferida, se mantiene la presión superior a 200 Pa cuando el
ajuste de temperatura es de 15ºC con el fin de impedir la
congelación de la muestra. En una realización preferida, se
mantiene la temperatura a 15ºC y se fija la presión a entre
500-1.000 Pa, más preferiblemente
600-900 Pa, lo más preferiblemente de
aproximadamente 800 Pa. Cuando se usa un ajuste de temperatura
superior, es posible una presión ligeramente menor sin congelar la
muestra y cuando se usa un ajuste de temperatura inferior, la
presión debe mantenerse en el nivel superior para impedir la
congelación. Preferiblemente, se mantienen las condiciones durante
un periodo de tiempo suficiente de modo que la velocidad de
evaporación se ha ralentizado de modo que la temperatura de la
muestra es aproximadamente la misma que la externa a la muestra.
Preferiblemente, la muestra de conservación no
debe congelarse o producirse la ebullición para formar una espuma y
pierde disolvente para formar un líquido viscoso o un líquido
sumamente viscoso.
Una fase posterior del procedimiento de la
invención supone la eliminación del disolvente hasta que se seca la
muestra de conservación para formar un líquido sumamente viscoso sin
formación de espuma y preferiblemente sin congelación.
En una realización de la invención, esto se
consigue manteniendo las condiciones de presión y temperatura a
aquellas aplicadas en la primera fase de secado por evaporación. Por
ejemplo, se mantiene la presión a o inferior a o por debajo de
3.000, 2.500, 2.000, preferiblemente 1.500, 1.200, lo más
preferiblemente 1.000, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 ó 100 Pa,
mientras se mantiene el ajuste de temperatura a una temperatura
superior a 0ºC, preferiblemente de entre 5ºC y 37ºC, 5ºC y 10ºC,
10ºC y 15ºC; 15ºC y 20ºC; 20ºC y 25ºC; 25ºC y 30ºC; o 30ºC y 37ºC.
Para un ajuste de temperatura de 15ºC, se mantiene una presión de
500-1.000 Pa, preferiblemente de
600-900 Pa, lo más preferiblemente de
aproximadamente 800 Pa durante entre 4-24 horas,
preferiblemente 1-4, 4-8,
8-12 ó 12-16 horas. Estas
condiciones de presión y temperatura se mantienen durante 1, 2, 3,
4, 5, 6, 8, 10, 12, 18 horas o más con el fin de obtener un líquido
sumamente viscoso con un contenido de disolvente inferior o igual
al 15, 12, preferiblemente el 10, 8, 5, 4, 3, 2 ó 1% (p/p).
Otra realización de la invención aumenta el
ajuste de temperatura durante la eliminación de disolvente hasta un
ajuste de temperatura superior que el mantenido anteriormente en el
procedimiento. Esto permite que el disolvente abandone la muestra a
una velocidad más rápida de modo que puede completarse el
procedimiento de la invención en un tiempo más corto. Por ejemplo,
el ajuste de temperatura se aumenta hasta superior a 0ºC, más
preferiblemente superior a 20ºC, preferiblemente entre 5ºC y 37ºC,
5ºC y 10ºC, 10ºC y 20ºC; 20ºC y 30ºC; más preferiblemente 30ºC y
40ºC; más preferiblemente 40ºC y 50ºC; lo más preferiblemente 50ºC y
60ºC mientras se mantiene la presión a o inferior a 3.000, 2.500,
2.000, preferiblemente 1.500, 1.200, lo más preferiblemente 1.000,
800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 ó 100 Pa. Se mantienen estas
condiciones de temperatura y presión durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8,
10, 12, 18 horas o más con el fin de obtener un sólido con menos de
o igual al 15, 12, preferiblemente el 10, 8, 5, 4, 3, 2 ó 1%. Esta
realización requiere que el agente activo sea estable frente al
calor a la temperatura usada para que se lleve a cabo el
procedimiento satisfactoriamente.
Una realización preferida de la invención reduce
el ajuste de presión durante la eliminación del disolvente (etapa
c) hasta un ajuste de presión inferior que el usado previamente en
el procedimiento (etapa b). Esto permite que el disolvente abandone
la muestra a una velocidad más rápida, de modo que el procedimiento
de la invención puede completarse en un tiempo más corto. También
permite que se pierda una mayor proporción del disolvente. Por
ejemplo, se fija el ajuste de presión a o inferior a 700, 600,
preferiblemente 500, 400, 300, más preferiblemente 200, 150, 100,
lo más preferiblemente 80, 50, 20, 10, 5, 2, 1 ó 0,5 Pa, mientras
se mantiene la temperatura a o inferior a 0ºC, preferiblemente entre
10ºC y 20ºC; 20ºC y 30ºC; 30ºC y 35ºC o superior a 40ºC. Se
mantienen estas condiciones de temperatura y presión durante 1, 2,
3, 4, 5, 6, 8, 10, 12 ó 18 horas o más con el fin de obtener un
sólido con un contenido de disolvente inferior o igual al 15, 12,
preferiblemente el 10, 8, 5, 4, 3, 2 ó 1% (p/p) preferiblemente
determinado mediante el analizador colorimétrico de humedad de Karl
Fischer (Eur. J. Pharm. Biopharm. (2000) 50;
277-284).
277-284).
Preferiblemente, deben completarse las etapas b)
y c) igual o inferior a 18 horas, más preferiblemente 16, 14, 12,
lo más preferiblemente 10, 8, 6 ó 4 horas.
Una composición secada es una composición de la
que se ha eliminado el disolvente por evaporación, ebullición o
sublimación, dejando un contenido de disolvente inferior o igual al
15, 12, 10, más preferiblemente el 8, 5, 4, 3, 2 ó 1% (p/p),
preferiblemente determinado mediante el método de Karl Fischer. Los
intervalos de contenido de disolvente preferidos son del
1-3%, 3-5%, 5-10% o
10-15% (p/p). El término incluye líquidos sumamente
viscosos así como vidrio espuma secado y sólidos liofilizados.
Un líquido sumamente viscoso se define como un
material del que se ha eliminado el disolvente por evaporación sin
ebullición, dejando un contenido de disolvente inferior o igual al
15, 12, 10, más preferiblemente el 8, 5, 4, 3, 2 ó 1% (p/p),
preferiblemente determinado mediante el método de Karl Fischer. Los
intervalos de contenido de disolvente preferidos son del
1-3%, 3-5%, 5-10% o
10-15% (p/p). El líquido sumamente viscoso tiene un
contenido en disolvente lo suficientemente bajo de tal manera que el
agente activo se conserva en un estado estable durante al menos
3,6, 9,12 ó 24 meses a 4ºC, permitiendo que el agente activo retenga
al menos el 40, 50, 60, preferiblemente el 70, 80, 90 o 95% de su
actividad y/o antigenicidad durante este periodo. Preferiblemente,
el líquido sumamente viscoso tiene un aspecto de sólido pero es un
vidrio y puede fluir muy lentamente durante un periodo de 2, 4 ó 6
días, más preferiblemente 1, 2, 3, 4, 6, 7, 10 ó 12 meses. El flujo
extremadamente lento puede medirse invirtiendo un receptáculo que
contiene el líquido sumamente viscoso y dejándolo a temperatura
ambiente hasta que se observa que fluye el líquido sumamente
viscoso. En una realización preferida, no parecerá que el líquido
sumamente viscoso fluye después de 2, 4 ó 6 días, preferiblemente 2,
3 ó 4 semanas, más preferiblemente 2, 4, 6, 8, 10 ó 12 meses en una
posición
invertida.
invertida.
Un líquido viscoso se define como el producto de
la fase primaria de eliminación del disolvente, al final de la cual
se ha perdido la mayor parte del disolvente de la muestra. Este
punto puede reconocerse porque la velocidad de evaporación se
ralentiza de modo que la temperatura de la muestra vuelve a la
temperatura según se pierde el efecto endotérmico de la evaporación
en masa.
Un vidrio espuma es una composición secada que
contiene un poliol que forma vidrio, que se forma mediante un
procedimiento en el que la muestra de conservación se somete a
condiciones de temperatura y presión tales que la muestra burbujea
vigorosamente o está en ebullición de modo que se forma una espuma a
medida que se seca la muestra.
Los de a continuación se llevan a cabo usando
técnicas habituales, que se conocen bien y son rutinarias para los
expertos en la técnica, excepto cuando se describe otra cosa en
detalle. Los ejemplos son ilustrativos, pero no limitan la
invención.
Se llevó a cabo el proceso usando un
criodesecador Heto Drywinner 8-85 en el que la
temperatura de anaquel puede regularse con una precisión de 1ºC, la
temperatura final del condensador es de -85ºC, se regula la presión
con una válvula de descarga y se dispone de 6 termopares para medir
la temperatura del producto.
Se preparó una muestra de conservación añadiendo
un agente de estabilización (o bien trehalosa al 10% o bien
sacarosa al 3,5%) y un agente activo a una disolución acuosa. Se
pusieron las muestras en el criodesecador con una temperatura de
anaquel mantenida a un ajuste de temperatura fija de 15ºC en todo el
proceso. Se redujo inicialmente la presión hasta 20.000 Pa y se
mantuvo a este nivel durante 10 minutos antes de reducir
adicionalmente la presión. A 150 Pa, las disoluciones comenzaron a
congelarse debido al enfriamiento por evaporación tal como se
muestra en la figura 1. Se redujo adicionalmente la presión hasta
100 Pa para permitir que las muestras llegaran a congelarse
completamente. Entonces se aumentó la presión hasta entre 80 Pa y
350 Pa, punto en el que se formó una espuma a medida que se perdió
agua de la muestra. En las condiciones del experimento, no se
observó ebullición en una muestra control que sólo contenía agua.
Las muestras pueden estar perdiendo agua a través de evaporación en
vez de a través de ebullición. Después de 18 horas en estas
condiciones, se secan las muestras y la disolución de espuma se
convierte en un vidrio espuma.
Se realizó satisfactoriamente un proceso similar
manteniendo la temperatura de anaquel a otros ajustes de temperatura
de hasta 37ºC.
Se prepararon muestras disolviendo sacarosa en
agua para dar disoluciones al 1%, 5%, 10% y 20%. Se pusieron las
muestras en el criodesecador con una temperatura de anaquel
mantenida a 15ºC en todo el proceso. Se redujo inicialmente la
presión a 20.000 Pa y se mantuvo a este nivel durante 10 minutos
antes de reducir la presión adicionalmente a 5.000 Pa, 500 Pa, 250
Pa, 75 Pa, 40 Pa y 20 Pa. Cada nivel de presión se mantuvo durante
20 minutos para permitir que se equilibrara la temperatura y se tomó
una lectura de la temperatura de la muestra usando un termopar. Se
conectaron termopares a muestras con diferentes concentraciones de
sacarosa y las temperaturas registradas en la tabla 1 son valores
medios de las temperaturas.
Se congelaron todas las muestras entre 166 y 111
Pa, independientemente de la concentración de sacarosa presente.
Las temperaturas medidas a diferentes presiones estaban muy próximas
a las previstas a partir de la curva del punto triple. Por tanto,
la presencia de sacarosa no parece tener un gran efecto sobre la
temperatura de las muestras a diferentes presiones.
En un procedimiento preferido de la invención,
es necesario evitar la congelación de la muestra. Esto pudo
conseguirse manteniendo la presión superior a 200 Pa usando una
temperatura de anaquel de 15ºC. A temperaturas inferiores, debe
mantenerse la presión a un nivel superior mientras que el uso de una
temperatura superior permitiría que se redujera adicionalmente la
presión sin congelar las muestras.
Se prepararon muestras de conservación que
contenían sacarosa al 0%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25% y 50%. Se pusieron
las muestras en el criodesecador con una temperatura de anaquel
mantenida a 15ºC en todo el proceso. Se redujo inicialmente la
presión hasta 20.000 Pa y se mantuvo a este nivel durante 10 minutos
antes de reducir adicionalmente la presión. Se redujo
adicionalmente la presión hasta 10 Pa para permitir que las muestras
lleguen a congelarse completamente. Entonces se aumentó la presión
hasta o bien 78,8 Pa, 81,2 Pa o bien 350 Pa en el experimento
posterior. Se mantuvieron estas condiciones durante 3 horas para los
experimentos a 350 Pa y 81,2 Pa y durante 6 horas para el
experimento a 78,8 Pa. Se evaluaron las características físicas de
cada muestra.
Tal como se muestra en la tabla 2, a una presión
de 350 Pa, se requirió una alta concentración de sacarosa del 50%
para la formación fiable de espuma. Por el contrario, una presión
inferior de 80 Pa permitió la formación fiable de espuma a
concentraciones del 10-25%. El uso de una
concentración inferior de sacarosa podría ser ventajoso para
muestras conservadas que van a usarse en vacunas, por ejemplo. Por
tanto, se prefiere un proceso usando 80 Pa y un contenido de
sacarosa del 10-25%.
Se prepararon muestras de conservación que
contenían sacarosa al 5%, 10%, 15% y 25% y se añadieron a viales,
algunos de los cuales se siliconizaron. En un experimento, se
pusieron las muestras en el criodesecador con una temperatura de
anaquel mantenida a 15ºC en todo el proceso. Se redujo inicialmente
la presión hasta 20.000 Pa y se mantuvo a este nivel durante 10
minutos antes de reducir adicionalmente la presión. Se redujo
adicionalmente la presión hasta 280 Pa durante 3 horas. Durante
este periodo, la presión disminuyó hasta 200 Pa a medida que
disminuyó la presencia de vapor de agua. Se evaluaron las
características físicas de cada muestra. En un segundo experimento,
se pusieron las muestras en el criodesecador con una temperatura de
anaquel mantenida a 37ºC en todo el proceso. Se redujo inicialmente
la presión hasta 20.000 Pa y se mantuvo a este nivel durante 10
minutos antes de reducir adicionalmente la presión. Se redujo
adicionalmente la presión hasta 240 Pa durante 3 horas. Durante
este periodo, la presión disminuyó hasta 106 Pa a medida que
disminuyó la presencia de vapor de agua. Se evaluaron las
características físicas de cada muestra.
La siliconización tuvo un efecto sobre la
desgasificación de las muestras, la reducción de la presión hasta
20.000 Pa dio como resultado la desgasificación de las muestras en
viales siliconizados pero no en viales no siliconizados. La
degasificación se observó mediante el burbujeo de la muestra.
La siliconización del vial también hizo que se
produjera de manera más probable y más reproducible la formación de
espuma (tabla 3). La siliconización de los viales permitió que se
produjera la formación de espuma de manera reproducible a
concentraciones inferiores de poliol. La concentración inferior de
poliol disminuye la duración de tiempo necesaria para secar la
muestra y reduce el efecto de las reacciones de Maillard u otras
interacciones con el poliol que dañan el agente activo. Cuando la
muestra implicada es una vacuna, esto reduce la viscosidad de la
muestra y permite la administración más sencilla.
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El agente activo que iba a conservarse era una
mezcla del polisacárido PRP de Haemophilus influenzae b (Hib)
y tres cepas de virus de la polio inactivado (VPI). Se preparó la
muestra de conservación disolviendo Hib-VPI o bien
en una disolución de sacarosa al 3,15% o bien una disolución de
trehalosa al 10%.
Las muestras se liofilizaron o bien usando una
muestra de criodesecación convencional que necesitó tres días para
realizarlo en un criodesecador grande, o bien usando un
procedimiento de secado de espuma descrito en el ejemplo
1.
1.
Las muestras se reconstituyeron con agua y se
usó un ELISA para evaluar la retención de la antigenicidad de las
tres cepas del virus de la polio. Se usaron tres anticuerpos
policlonales y tres monoclonales, uno contra cada cepa, en ELISA
separados. Se presentan los resultados como un porcentaje de la
lectura dada para una muestra que no se había sometido al
procedimiento de criodesecación o secado de espuma.
Se evaluaron las muestras conservadas para
determinar su inmunogenicidad in vivo inoculando grupos de
diez ratones con el VPI-Hib reconstituido,
extrayéndoles sangre a los ratones y monitorizando los niveles de
anticuerpos contra polisacáridos de VPI e Hib, por ejemplo mediante
ELISA o inmunotransferencia de tipo Western. Se evalúa el grado de
protección en un modelo de exposición de ratón.
Usando o bien sacarosa o bien trehalosa como el
poliol, se mantuvo mejor la antigenicidad de VPI usando la técnica
de secado de espuma comparado con el uso de la criodesecación
convencional.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Se prepararon muestras de conservación que
contenían sacarosa al 3,15% y VPI o una mezcla de polisacáridos de
VPI e Hib. Se introdujeron las muestras en un criodesecador Heto
Drywinner 8-85 y se criodesecaron con un ajuste de
temperatura de -32ºC durante 40 horas seguido por secado continuo a
4ºC durante 16 horas.
Las muestras se reconstituyeron con agua y se
usó un ELISA para evaluar la retención de la antigenicidad de las
tres cepas del virus de la polio. Se usaron tres anticuerpos
monoclonales, uno contra cada cepa, en ELISA separados para evaluar
el grado de retención de antígenos en la muestra criodesecada,
reconstituida en comparación con una muestra de referencia que no
se había congelado. Se presentan los resultados como un porcentaje
de la lectura dada para una muestra que no se había sometido al
procedimiento de criodesecación o secado de espuma.
Tal como se muestra en la tabla 5, la presencia
de polisacárido de Hib en la muestra de conservación con VPI,
condujo a una mayor retención de antígenos de VPI tras la
criodesecación que la conseguida cuando se criodesecó VPI solo. Los
polisacáridos de Hib tienen un efecto de conservación sobre la
antigenicidad de VPI además del conseguido teniendo sacarosa
presente como agente de estabilización.
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Ejemplo
7
Se prepararon muestras de conservación que
contenían VPI-Hib y usando o bien sacarosa al 3,15%;
sorbitol al 2,5%, glutamina al 0,8% y MSA al 0,01%; estabilizador
MMR y lactosa; glicina al 3%, arginina al 2% y sacarosa al 4%; o
bien sacarosa al 4% y glicina al 2% como agente de estabilización.
El experimento incluyó una muestra con sacarosa al 3,15% como
agente de estabilización usando el doble de la concentración de
VPI-Hib. Las muestras se criodesecaron usando un
ciclo de criodesecación de tres días convencionales en un
criodesecador discontinuo.
Las muestras se reconstituyeron con agua y se
usó un ELISA para evaluar la retención de la antigenicidad de las
tres cepas del virus de la polio. Se usaron tres anticuerpos
policlonales y tres monoclonales, uno contra cada cepa, en ELISA
separados. Se presentan los resultados como un porcentaje de la
lectura dada para una muestra que no se había sometido al
procedimiento de criodesecación o secado de espuma.
Se evaluaron las muestras conservadas para
determinar su inmunogenicidad in vivo inoculando grupos de
diez ratones con el VPI-Hib reconstituido,
extrayéndoles sangre a los ratones y monitorizando los niveles de
anticuerpos contra polisacáridos de VPI e Hib, por ejemplo mediante
ELISA o inmunotransferencia de tipo Western. Se evalúa el grado de
protección en un modelo de exposición de ratón.
El aumento de la dosis de VPI desde 40/8/32
UD/dosis hasta 80/16/64 UD/dosis condujo a un aumento en la
retención de la antigenicidad de VPI tal como se muestra en la
tabla 6. La variación en el agente de estabilización también
influyó en la retención de antígenos con sacarosa al 4%/glicina al
2% y sorbitol al 2,5%/glutamina al 0,8%/HAS al 0,01% produciendo
HAS una mayor retención de antígenos tal como se muestra mediante
los datos de ELISA.
Se preparan muestras de conservación que
comprenden VPI, virus de las paperas, sarampión, rubeola, varicela
zóster, CMV, hepatitis, VHS1, VHS2, virus respiratorio sincitial,
dengue, virus Paramyxoviridae tales como parainfluenza, virus
Togaviridae e influenza, y/o Hib como el agente activo. El agente
activo se disuelve en una disolución acuosa que contiene un poliol.
Se conservan múltiples muestras o bien mediante criodesecación,
secado de espuma que usa una etapa de congelación siguiendo el
protocolo descrito en el ejemplo, o secado de espuma sin una etapa
de congelación usando un protocolo descrito en el ejemplo 4. Se
reconstituyen las muestras en una disolución acuosa y se evalúa su
actividad. Esto se consigue usando ensayos ELISA según se describe
en el ejemplo 5 usando anticuerpos específicos para antígenos
nativos. En el caso de virus vivos, se establece el título de cada
muestra usando el virus para infectar células huésped adecuadas y
evaluando la infectividad mediante la formación de placas o
mediante inmunocitoquímica. Cuando se secan en espuma composiciones
inmunogénicas o vacunas, puede someterse a prueba la retención de la
inmunogenicidad en un modelo animal inmunizando grupos de animales
con una vacuna que se seca en espuma o se criodeseca y reforzando la
respuesta inmunitaria, por ejemplo, 14 y 28 días después de la
primera inmunización. Se aísla el suero de los animales al final del
programa de inmunización y se somete a prueba su título frente a la
vacuna usando ensayos habituales, por ejemplo mediante ELISA,
inmunocitoquímica, inmunotransferencia de tipo Western,
inmunoprecipitación, ensayo bactericida del suero o ensayo de
aglutinación. Se reúnen los resultados, comparando en primer lugar
la actividad del agente activo después de criodesecación, secado de
espuma con una etapa de congelación o secado de espuma sin una
etapa de congelación. En segundo lugar, se evalúa el grado de
reproducibilidad de la técnica de conservación comparando la gama
de actividades después de someter las muestras a cada uno de los
tres métodos de conservación.
Se prepararon muestras de conservación que
comprendían VPI, virus de las paperas, sarampión, rubeola, varicela
zóster, CMV, hepatitis, VHS1, VHS2, virus respiratorio sincitial,
dengue, virus Paramyxoviridae tales como parainfluenza, virus
Togaviridae e influenza, y/o Hib como el agente activo. El agente
activo se disuelve en una disolución acuosa que contiene un poliol.
Se conservan múltiples muestras o bien mediante criodesecación,
secado de espuma que usa una etapa de congelación siguiendo el
protocolo descrito en el ejemplo 1, o bien secado de espuma sin una
etapa de congelación usando un protocolo descrito en el ejemplo 4.
Se envejecieron las muestras almacenándolas a 37ºC o 23ºC durante
siete días y se compararon, para determinar la actividad, con
muestras que se han mantenido a 4ºC. Se reconstituyen las muestras
con una disolución acuosa y se evalúa su actividad. Esto se
conseguirá usando ensayos ELISA según se describe en el ejemplo 5
usando anticuerpos específicos para antígenos nativos. En el caso
de virus vivos, se establece el título de cada muestra usando el
virus para infectar células huésped adecuadas y evaluando la
infectividad mediante la formación de placas o mediante
inmunocitoquímica. Se reúnen los resultados, comparando en primer
lugar la actividad del agente activo después del almacenamiento a
temperaturas elevadas con el almacenamiento a 4ºC. En segundo lugar,
se evalúa el grado de reproducibilidad de la técnica de
conservación comparando la gama de actividades después de someter
las muestras a cada conjunto de condiciones.
Se prepararon muestras de conservación que
contenían sacarosa al 5%, 10%, 15% y 25% y se añadieron a viales.
Se pusieron las muestras en un criodesecador a un ajuste de
temperatura de 15ºC en todo el proceso. Se redujo inicialmente la
presión hasta 20.000 Pa y se mantuvo a este nivel durante 10 minutos
para permitir la desgasificación antes de reducir adicionalmente la
presión. Se redujo adicionalmente la presión hasta 800 Pa durante de
dos a tres horas, tiempo durante el cual los termopares en el
interior de las muestras mostraron que la temperatura de la muestra
se redujo hasta 4ºC debido al enfriamiento por evaporación. Después
de 2-3 horas, la temperatura de las muestras volvió
a 15ºC, indicando que la evaporación en esas condiciones de
temperatura y presión estaba cerca de ser completa. Durante esta
fase del proceso, la muestra no se llevó a ebullición para formar
una espuma ni se congeló de modo que un agente activo dentro de la
muestra se exponga a la menor tensión posible. Las muestras tienen
un aspecto de sólido, similar al producto final.
Se consiguió el secado adicional de las muestras
reduciendo la presión adicionalmente hasta 10 Pa mientras se
mantenía un ajuste de la temperatura de anaquel a 15ºC. Se
mantuvieron estas condiciones durante 10-16 horas
adicionales. Durante esta fase, la temperatura de la muestra
permaneció en 15ºC puesto que la velocidad de evaporación era
lenta. Tuvo lugar un secado adicional y la muestra resultante tenía
un aspecto de sólido. Si se ponía la muestra sobre un lateral, el
contenido de la muestra disminuía muy lentamente, durante un periodo
de días o meses, lo que muestra que la muestra es un cristal
líquido de alta viscosidad. La figura 2 muestra que el recipiente
que mantiene el líquido sumamente viscoso puede invertirse sin
provocar el flujo inmediato del líquido sumamente viscoso.
Las muestras secadas según el procedimiento del
ejemplo 10 no se han sometido a tensiones asociadas con el burbujeo
que acompaña a la formación de espuma o congelación. Se realizaron
experimentos para determinar si este procedimiento produjo un alto
nivel de retención de antígenos cuando se usó para secar VPI.
Se realizaron tres experimentos separados en los
que se resuspendió VPI en una disolución acuosa con sacarosa al 10%
o trehalosa al 10% como el agente de estabilización. Las muestras se
pusieron las muestras en viales siliconizados que se situaron en un
criodesecador Heto Drywinner 8-85 y se fijó la
temperatura a 15ºC. Se redujo inicialmente la presión hasta 3.500
Pa para desgasificar la muestra. Después de 10 minutos, se redujo
adicionalmente la presión hasta 800 Pa y se mantuvo a este nivel
durante dos horas. Durante este periodo el ajuste de temperatura se
mantuvo a 15ºC y se monitorizó la temperatura en la muestra. Según
se evaporó el agua de la muestra, la temperatura disminuyó hasta
4ºC pero hacia el final de las dos horas, la temperatura volvió a
15ºC a medida que se ralentizó la velocidad de evaporación. No se
produjo burbujeo ni formación de espuma en estas condiciones.
Entonces se redujo adicionalmente la presión hasta 10 Pa y se
mantuvieron estas condiciones durante 16 horas más en los primeros
dos experimentos y 10 horas más en el tercer experimento.
Se reconstituyeron las muestras con agua y se
usó un ELISA para evaluar la retención de la antigenicidad de las
tres cepas del virus de la polio. Se usó el anticuerpo monoclonal
contra VPI de tipo 3, en un ELISA para evaluar el grado de
retención de antígenos en la muestra criodesecada, reconstituida
comparado con una muestra de referencia que no se había congelado.
Se presentan los resultados como un porcentaje de la lectura dada
para una muestra que no se había sometido a un procedimiento de
secado.
Las muestras secas tienen un aspecto de sólido,
sin embargo parecen estar en la forma de un vidrio/líquido
sumamente viscoso puesto que, durante un periodo de días, el sólido
seco pudo fluir si el recipiente se invertía a temperatura
ambiente.
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Estos niveles de retención de antígenos de VPI
de tipo 3 se comparan de manera muy favorable con los resultados de
la criodesecación mostrados a continuación en los que normalmente se
encontraron valores muy bajos en el mismo formato de ELISA, cuando
se usó un anticuerpo monoclonal contra el tipo 3.
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Ejemplo
12
Se almacenó el VPI secado usando el
procedimiento descrito en el ejemplo 11 a 4ºC durante 9 meses. Se
reconstituyeron las muestras con agua con NaCl 150 mM y se usó un
ELISA para evaluar la retención de la antigenicidad de las tres
cepas del virus de la polio. Se usaron tres anticuerpos
monoclonales, uno contra cada cepa, en ELISA separados para evaluar
el grado de retención de antígenos en la muestra almacenada
reconstituida. Se había llevado a cabo un ELISA similar con
muestras reconstituidas del mismo lote antes del almacenamiento. Se
compararon todos los resultados con una muestra de referencia que
no se había secado. Se presentan los resultados como un porcentaje
de la lectura dada para una muestra que no se había sometido a un
procedimiento de secado.
Por tanto, puede almacenarse el VPI que se ha
secado mediante el procedimiento descrito en el ejemplo 1 a 4ºC
durante al menos 9 meses sin pérdida de antigenicidad.
Se inocularon grupos de 10 ratas Wistar con
diversas diluciones de VPI que se habían secado en presencia de
sacarosa al 10% para formar un líquido sumamente viscoso usando el
procedimiento descrito en el ejemplo 10 y reconstituido. Además, se
inocularon grupos de 10 ratas Wistar con muestras de referencia de
VPI que se habían preparado de la misma manera pero que no se
habían secado.
Después de 21 días, se tomaron sueros de todas
las ratas y se sometieron a prueba los sueros en ensayos de
inmunoprecipitación separados usando virus de la polio de tipo 1,
tipo 2 y tipo 3.
Se muestran los resultados en la tabla 10 que
contiene:- a) el número de ratas que responden para cada dilución
de VPI, b) la DE50 que es la dosis que se requiere para garantizar
que el 50% de las ratas seroconvierten, tal como se evalúa mediante
el ensayo de inmunoprecipitación y c) la potencia relativa del VPI
secado y reconstituido comparado con el VPI de referencia no
secado.
La tabla 10 muestra que el número de sujetos que
responden inoculados con cada dilución de VPI es muy similar entre
los dos lotes de VPI secado y reconstituido y la muestra de
referencia no secada. En general, el VPI de tipo 1 provocó la mejor
respuesta inmunitaria, provocando el tipo 2 una respuesta
inmunitaria en ligeramente menos ratas. El tipo 3 provocó la
respuesta inmunitaria más débil.
El proceso de secado para formar un líquido
sumamente viscoso no altera la capacidad de VPI de provocar la
inmunoprecipitación de anticuerpos in vivo. Una lectura de
potencia relativa (PR) de 1,0 indica que la muestra provoca una
respuesta equivalente a la muestra de referencia. Ambas muestras
secadas producen lecturas de PR próximas a 1,0 para los tres tipos
del virus de la polio, lo que indica que el proceso de secado no
afecta a la capacidad de la muestra para provocar una respuesta
inmunitaria.
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Ejemplo
14
Se inocularon grupos de 10 ratas Wistar con VPI
que se había secado en presencia de o bien sacarosa al 10% o bien
trehalosa al 10% según se describe en el ejemplo 2, y luego se
reconstituyeron. Además, se inocularon grupos de 10 ratas Wistar
con una cantidad equivalente de VPI que no se había secado, como
muestras de referencia.
Después de 21 días, se recogieron sueros de
todas las ratas y se usó un ensayo de inmunoneutralización, según
se describe en el ejemplo 5 para evaluar la cantidad de anticuerpos
inmunoneutralizantes que se había producido contra cada uno de los
virus de la polio de tipo 1, tipo 2 y tipo 3.
Se calcularon las potencias relativas para cada
muestra comparando la respuesta inmunitaria con la provocada por la
muestra de referencia no secada.
Los resultados se muestran en la tabla 11.
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La cantidad de agua que quedaba en las muestras
fue inferior cuando se usó sacarosa como agente de estabilización
quedando una humedad de aproximadamente el 5% comparado con
aproximadamente el 10% cuando se usó trehalosa como el agente de
estabilización medido mediante el método de Karl Fischer.
Tanto la sacarosa como la trehalosa fueron
eficaces en la estabilización de VPI durante el proceso de secado,
de modo que el VPI reconstituido dio lecturas de potencia relativa
que se aproximaban a 1,0 para la mayor parte de los diferentes
tipos de virus de la polio. Las potencias relativas fueron
particularmente buenas para el virus de la polio de tipo 3 que
pierde su inmunogenicidad de manera relativamente fácil.
Se llevó a cabo el análisis en un valorímetro de
Karl Fischer (Aqua 30.00 - Elektrochemie Halle). Se pesó la muestra
y se situó en el horno con un ajuste de 80ºC. Se purgó la muestra
con gas nitrógeno y luego se añadió a reactivo Hydranal (Riedel de
Hahn) con el fin de realizar el análisis por colorimetría.
Claims (32)
1. Una composición inmunogénica que comprende el
virus de la polio inactivado, un polisacárido u oligosacárido
bacteriano y un agente de estabilización, todos formulados como una
composición secada, que tras la reconstitución, puede generar una
respuesta inmunitaria frente al virus de la polio.
2. Composición inmunogénica según la
reivindicación 1, que comprende un antígeno de polisacárido u
oligosacárido capsular de Haemophilus influenzae b (Hib).
3. Composición inmunogénica según la
reivindicación 1 ó 2, en la que el polisacárido u oligosacárido se
conjuga con una proteína transportadora.
4. Composición inmunogénica según la
reivindicación 3, en la que el polisacárido u oligosacárido se
conjuga con toxoide tetánico.
5. Composición inmunogénica según la
reivindicación 2-4, en la que se adsorbe el
polisacárido u oligosacárido sobre fosfato de aluminio.
6. Composición inmunogénica según la
reivindicación 1-5, que comprende un polisacárido u
oligosacárido capsular derivado de N. miningitidis C.
7. Composición inmunogénica según la
reivindicación 1-6, que comprende adicionalmente un
polisacárido u oligosacárido capsular derivado de cualquiera de
N. meningitidis A, Y o W o combinaciones de los mismos.
8. Composición inmunogénica según la
reivindicación 6-7, en la que se conjugan los
polisacáridos u oligosacáridos meningocócicos con una proteína
transportadora.
9. Composición inmunogénica según la
reivindicación 8, que comprende un polisacárido u oligosacárido de
Hib y al menos un polisacárido u oligosacárido meningocócico
conjugado con el mismo tipo de proteína transportadora.
10. Composición inmunogénica según la
reivindicación 8, que comprende un polisacárido u oligosacárido de
Hib y al menos un polisacárido u oligosacárido meningocócico
conjugado con diferentes proteínas transportadoras.
11. Composición inmunogénica según la
reivindicación 1-10, que comprende además rojo de
fenol.
12. Composición inmunogénica según la
reivindicación 1-11, en la que se criodeseca la
composición secada.
13. Composición inmunogénica según la
reivindicación 1-12, en la que la composición secada
es un vidrio espumado.
14. Composición inmunogénica según las
reivindicaciones 1-11, en la que la composición
secada es un líquido sumamente viscoso.
15. Composición inmunogénica según la
reivindicación 14, en la que no se ha congelado el líquido sumamente
viscoso.
16. Un procedimiento para preparar una vacuna
comprendiendo la etapa de reconstituir la composición inmunogénica
según las reivindicaciones 1-15 con una disolución
acuosa.
17. Procedimiento según la reivindicación 16, en
el que la disolución acuosa comprende toxoide diftérico, toxoide
tetánico y antígenos de tos ferina (acelulares o de célula
completa).
18. Procedimiento según la reivindicación 17, en
el que se coadyuva al menos en parte la vacuna DTP con hidróxido de
aluminio.
19. Procedimiento según la reivindicación 17 ó
18, en el que la disolución acuosa comprende el antígeno de
superficie de la hepatitis B.
20. Un kit que comprende la composición
inmunogénica según las reivindicaciones 1-15, en un
recipiente y la vacuna DTP líquida (acelular o de célula completa)
en un segundo recipiente.
21. Kit según la reivindicación 20, que
comprende además el antígeno de superficie de la hepatitis B en el
segundo recipiente.
22. Una vacuna que comprende las composiciones
inmunogénicas según las reivindicaciones 1-15.
23. Vacuna según la reivindicación 22, que se
reconstituye en una disolución acuosa antes de su uso.
24. Un recipiente con una superficie interna
repelente al agua que contiene la vacuna según la reivindicación
22-23.
25. Un procedimiento para conservar una
composición que comprende el virus de la polio inactivado (VPI), un
polisacárido u oligosacárido bacteriano y un agente de
estabilización que comprende las etapas de:
- a)
- preparar una muestra de conservación suspendiendo o disolviendo VPI y un polisacárido u oligosacárido bacteriano en una disolución de un agente de estabilización;
- b)
- someter la muestra de conservación a condiciones de temperatura y presión tales que se pierde el disolvente de la muestra de conservación; y
- c)
- eliminar el disolvente hasta que se seca la muestra de conservación para formar un sólido o líquido sumamente viscoso en el que se conserva la antigenicidad de VPI.
26. Procedimiento según la reivindicación 25, en
el que se seca la muestra de conservación en un recipiente con una
superficie interior repelente al agua.
27. Procedimiento según la reivindicación 25 ó
26, en el que se burbujea la muestra de conservación para formar
una espuma durante la etapa b).
28. Procedimiento según la reivindicación 27, en
el que la muestra se congela al menos parcialmente antes de empezar
el procedimiento de secado.
29. Procedimiento según la reivindicación 27, en
la que la muestra de conservación llega a congelarse al menos
parcialmente durante la etapa b).
30. Procedimiento según la reivindicación 25, en
el que, durante la etapa b) se somete la muestra de conservación a
tales condiciones de temperatura y presión de modo que la muestra de
conservación pierde disolvente por evaporación, sin congelamiento o
burbujeo implicados en la formación de espuma, para formar un
líquido viscoso y durante la etapa c) se elimina el disolvente
hasta que se seca la muestra de conservación para formar un líquido
sumamente viscoso.
31. Procedimiento según la reivindicación
26-30, en el que la muestra de conservación
comprende polisacárido u oligosacárido Hib.
32. Procedimiento según la reivindicación
26-31, en el que la muestra de conservación
comprende polisacárido u oligosacárido derivado de cualquiera de
N. meningitidis A, C, Y o W o combinaciones de los
mismos.
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