ES2204900T3 - Estructura inmuinogena de doble vector. - Google Patents

Estructura inmuinogena de doble vector.

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ES2204900T3 ES93906033T ES93906033T ES2204900T3 ES 2204900 T3 ES2204900 T3 ES 2204900T3 ES 93906033 T ES93906033 T ES 93906033T ES 93906033 T ES93906033 T ES 93906033T ES 2204900 T3 ES2204900 T3 ES 2204900T3
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Abstract

UNA CONSTRUCCION INMUNOGENICA DE PORTADOR DOBLE, COMPRENDIDA DE, AL MENOS, UN PORTADOR PRIMARIO QUE TIENE MOLECULA DE PESO MOLECULAR GRANDE, MAYOR DE UN PESO MOLECULAR DE 70 KD, Y AL MENOS UN PORTADOR SECUNDARIO QUE TIENE UN ANTIGENO T-DEPENDIENTE CONJUGADO RESPECTO A UN PORTADOR PRIMARIO. LA CONSTRUCCION INMUNOGENICA DE PORTADOR DOBLE PUEDE ADEMAS TENER MITADES TALES COMO HAPTENOS (ANTIGENOS PARCIALES) Y ANTIGENOS. TALES CONSTRUCCIONES INMUNOGENICAS SON ADECUADAS PARA USO EN DIAGNOSIS, TRATAMIENTO Y PREVENCION DE ENFERMEDADES.

Description

Estructura inmunógena de doble vector.
I. Campo de la invención
Esta invención se refiere a un constructo inmunogénico portador dual que intensifica la eficacia de la inmunización activa en animales y humanos y al desarrollo de anticuerpos que se van a utilizar para la inmunoprofilaxis o la terapia pasiva y como reactivos científicos o de diagnóstico.
II. Antecedentes de la invención
En el procedimiento de vacunación, la ciencia médica utiliza la capacidad innata del organismo para protegerse a sí mismo frente a los agentes invasores inmunizando el organismo con antígenos que no provocarán la enfermedad pero estimularán la formación de anticuerpos que lo protegerán de la enfermedad. Por ejemplo, se inyectan organismos muertos para proteger frente a las enfermedades bacterianas tales como la fiebre tifoidea y la tos ferina, se inyectan toxinas para proteger frente al tétanos o el botulismo, y se inyectan organismos atenuados para proteger frente a enfermedades virales tales como la poliomelitis y el sarampión.
Sin embargo, no siempre es posible estimular la formación de anticuerpos simplemente inyectando el agente foráneo. La preparación de vacunas debe ser inmunogénica, esto es, debe ser capaz de inducir una respuesta inmune. Ciertos agentes tales como el toxoide del tétanos son inmunogénicos de forma innata, y pueden ser administrados en vacunas sin modificación. Otros agentes importantes no son inmunogénicos, sin embargo, y deben ser convertidos en moléculas inmunogénicas antes de que puedan inducir una respuesta inmune.
La respuesta inmune es una serie compleja de reacciones que pueden ser descritas generalmente como sigue:
1. el antígeno entra en el organismo y encuentra células presentadoras de antígenos que procesan el antígeno y conservan fragmentos del antígeno sobre sus superficies;
2. el fragmento de antígeno retenido sobre las células presentadoras de antígenos es reconocido por las células T que proporcionan ayuda a las células B; y
3. las células B son estimuladas a proliferar y dividirse en células formadoras de anticuerpos que secretan el anticuerpo contra el antígeno.
La mayor parte de los antígenos solo logran anticuerpos con ayuda de las células T y, por tanto, son conocidos como dependientes de T (TD en sus siglas en inglés). Estos antígenos, tales como las proteínas, pueden ser procesados por células presentadoras de antígenos y por tanto activan las células T en el procedimiento descrito antes. Son ejemplos de tales antígenos dependientes de T los toxoides del tétanos y la difteria.
Algunos antígenos, tales como los polisacáridos, no pueden ser apropiadamente procesados por las células presentadoras de antígenos y no son reconocidos por las células T. Estos antígenos no requieren ayuda de las células T para lograr la formación de anticuerpos pero pueden activar las células B directamente y, por tanto, son conocidos como antígenos independientes de T (TI en sus siglas en inglés). Entre tales antígenos independientes se incluyen el polirribosil-ribitol-fosfato de tipo b de H. influenzae y los polisacáridos capsulares neumocócicos.
Los antígenos dependientes de T se desvían de los antígenos independientes de T de varias formas. Muy notablemente, los antígenos se desvían en su necesidad de un coadyuvante, un compuesto que intensificará no específicamente la respuesta inmune. La gran mayoría de los antígenos dependientes de T solubles logran solo respuestas de anticuerpos a un bajo nivel a menos que se administren con un coadyuvante. Es por esta razón que la vacuna DPT estándar (difteria, pertussis, tétanos) se administra con alumbre coadyuvante. La insolubilización de los antígenos TD en una forma agregada también puede intensificar su inmunogenicidad, incluso en ausencia de coadyuvantes. (Golub ES y WO Weigle, J. Immunol. 102:389, 1969). En contraste, los antígenos independientes de T pueden estimular respuestas de anticuerpos cuando se administran en ausencia de coadyuvante, pero la respuesta es generalmente de menor magnitud y duración más corta.
Otras cuatro diferencias entre los antígenos independientes de T y dependientes de T son:
a) los antígenos dependientes de T pueden cebar una respuesta inmune de manera que se pueda lograr la respuesta de memoria tras una sensibilización secundaria con el mismo antígeno. Las respuestas de memoria o secundarias son estimuladas muy rápidamente y alcanzan títulos significativamente superiores de anticuerpo que los observados en las respuestas primarias. Los antígenos independientes de T son incapaces de cebar el sistema inmune para una sensibilidad secundaria.
b) La afinidad del anticuerpo para el antígeno aumenta con el tiempo después de la inmunización con antígenos dependientes de T pero no con los independientes de T.
c) Los antígenos dependientes de T estimulan un sistema inmune inmaduro o neonato más eficazmente que los antígenos independientes de T.
d) Los antígenos dependientes de T estimulan normalmente los anticuerpos IgM, IgG1, IgG2a, e IgE, mientras los antígenos independientes de T estimulan los anticuerpos IgM, IgG1, IgG2b, e IgG3.
Estas características de los antígenos dependientes de T vs. independientes de T proporcionan distintas ventajas y desventajas en su uso como vacunas eficaces. Los antígenos dependientes de T pueden estimular respuestas primarias y secundarias que tienen una vida larga tanto en sistemas inmunes de adultos como de neonatos, pero deben ser administrados frecuentemente con coadyuvantes. Así, se han preparado vacunas utilizando sólo un antígeno, tal como el toxoide de la difteria o el tétanos, pero semejantes vacunas pueden requerir el uso de coadyuvantes, tales como alumbre para estimular las respuestas óptimas. Los coadyuvantes están asociados a menudo con la toxicidad y se ha demostrado que estimulan el sistema inmune no específicamente, induciendo por tanto anticuerpos de especificidades que pueden ser no deseables.
Otra desventaja asociada con los antígenos dependientes de T es que las proteínas muy pequeñas, tales como los péptidos, son raramente inmunogénicos, incluso cuando se administran con coadyuvantes. Esto resulta especialmente desafortunado debido a que muchos péptidos sintéticos asequibles hoy han sido cuidadosamente sintetizados para representar los determinantes antigénicos primarios de diversos patógenos, y de otro modo habrían sido vacunas muy específicas y altamente eficaces.
En contraste, los antígenos independientes de T, tales como los polisacáridos, son capaces de estimular respuestas inmunes en ausencia de coadyuvantes. Desafortunadamente, sin embargo, tales antígenos independientes de T no pueden estimular respuestas de anticuerpos de elevado nivel o prolongadas. Una desventaja incluso mayor es su incapacidad para estimular un sistema inmune inmaduro o carente de células B (Mond J.J., Immunological Reviews 64:99, 1982) (Mosier DE, y col., J. Immunol. 119:1874, 1977). De este modo, la respuesta inmune tanto a los antígenos independientes de T como dependientes de T no es satisfactoria para muchas aplicaciones.
Con respecto a los antígenos independientes de T, es crítico proporcionar inmunidad protectora frente a muchos antígenos en niños, especialmente frente a polisacáridos tales como H. influenzae y S. penumoniae. Con respecto a los antígenos de T, es crítico desarrollar vacunas basadas en péptidos sintéticos que representan los determinantes antigénicos primarios de diversos patógenos.
Un enfoque para intensificar la respuesta inmune a antígenos independientes de T implica conjugar polisacáridos tales como PRP de H. influenzae (Cruse J.M., Lewis R.E. Jr. ed., Conjugate vaccines in Contributions to Microbiology and Immunology, vol. 10, 1.989) o antígenos oligosacáridos (Anderson PW, y col., J. Immunol. 142:2464, 1989) para un único antígeno dependiente de T tal como el toxoide del tétanos o la difteria. Se ha demostrado que el reclutamiento de la ayuda de células T de este modo proporciona una intensificación de la inmunidad en muchos lactantes que han sido inmunizados. Desafortunadamente, sólo se logran bajos títulos de anticuerpo, y sólo algunos lactantes responden a las inmunizaciones iniciales. Así, se requieren numerosas inmunizaciones y la inmunidad protectora se demora a menudo durante meses. Por otra parte, las múltiples visitas para recibir las inmunizaciones también pueden resultar difíciles para las familias que viven lejos de las instalaciones médicas (especialmente en los países subdesarrollados). Finalmente, los bebés de menos de 2 meses de edad pueden organizar una respuesta de anticuerpos pequeña o nula incluso tras una inmunización repetida.
La solución actual para los antígenos dependientes de T proteicos o peptídicos es similarmente desventajosa. Los antígenos dependientes de T son incorporados a menudo en sistemas coadyuvantes u otros sistemas de liberación. Sin embargo, semejante enfoque puede ser tóxico o puede inducir una intensificación no específica de la respuesta de anticuerpos (Dancey GF, y col., J. Immunol. 122:638, 1979).
Por otra parte, estos enfoques con antígenos tanto dependientes de T como independientes de T incorporan sólo un único portador dependiente de T para potenciar la respuesta inmune. Tales enfoques no maximizan el reclutamiento de ayuda de células T. Por otra parte, estos métodos son extraordinariamente limitados y confinados por la incapacidad para administrar múltiples antígenos sobre un portador, y por tanto se requieren numerosas inyecciones.
En otro enfoque, los investigadores han conjugado un hapteno tal como Trinitrofenilo (TNP) con un portador independiente de T tal como Ficoll® (un polímero de elevado peso molecular no ionizado sintético inerte) de peso molecular 400 kDa. Se ha descubierto que semejante producto conjugado estimula una respuesta independiente de T en ratones en ausencia de coadyuvante (Mosier DE, y col., J. Exp. Med. 139:1354 (1974)). Este producto conjugado solo, sin embargo, no podría estimular respuestas inmunes en ratones neonatos o en ratones carentes de células B en el sistema inmune (Mosier DE, y col., J. Immunol. 119:1874, 1977). Las respuestas de los ratones carentes de sistema inmune a este producto conjugado sólo podían ser inducidas en presencia de un coadyuvante concreto (Ahmad A y Mond JJ, J. Immunol. 136:1223, 1986). Esto resulta desventajoso por las razones comentadas previamente.
En un estudio adicional, se conjugó TNP sobre partículas insolubles y se encontró que era un inmunógeno eficaz in vitro para los ratones neonatos y ratones carentes de sistema inmune, pero solo a una densidad muy elevada de hapteno por cuenta (Mond JJ, y col., J. Immunol. 123:239, 1979). Otro laboratorio, Dintzis y col., demostraron que la proporción de hapteno a portador, así como la masa molecular del portador, influyen intensamente en la inmunogenicidad de un producto conjugado independiente de T y en las respuestas de anticuerpos que estimula (Dintzis RZ, y col., J. Immunol. 143:1239, 1989).
Otro producto conjugado probado implicaba un anticuerpo anti-inmunoglobulina (anti-Ig) conjugado con un dextrano (un polímero de glucosa) de elevado peso molecular (2x10^{6} daltons) para formar un producto conjugado "anti-Ig Dex". Se encontró que el producto conjugado activaba las células B neonatales y maduras así como las células B de ratones carentes de sistema inmune a concentraciones muy bajas (Brunswick M, y col., J. Immunol. 140:3364, 1988). Sin embargo, puesto que anti-Ig Dex estimula poco o nada la ayuda derivada de las células T y puesto que activa todas las células B sin considerar la especificidad, no podría proporcionar un vehículo eficaz para una vacuna.
En WO 88/08429 se describen métodos y composiciones inmunoterapéuticas y, específicamente, métodos para lograr respuestas de anticuerpos específicas en pacientes inmunodeficientes. Los inmunógenos utilizados en estos métodos comprenden un producto conjugado de un portador primario y péptidos de la región env del genoma de HIV. El portador primario es independiente de las células T y puede ser por ejemplo Ficoll®, lipopolisacárido, dextrano y bacterias completas. En la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.713.240 se describen composiciones de vacuna que comprenden al menos un antígeno ligado químicamente a un soporte. El soporte es insoluble en agua y puede ser un polímero tal como poliacrilamida.
Beuvery y col. (J. Infect. 6, 247-255, 1983) informan sobre la potencial vacuna de un producto conjugado de polisacárido del grupo C meningocócico-toxoide del tétanos. En esta publicación se describe la combinación de un polisacárido del grupo C de Neisseria meningitidis con un toxoide del tétanos. En la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.644.059 se describe otro producto conjugado que consta de un hapteno polisacárido de H. influenza b capsular activado con haluro.
Finalmente, en la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.894.229 se describe una sustancia portadora aumentadora de la inmunogenicidad para determinantes inmunogénicos. Estos productos conjugados comprenden células gram-negativas, que están sustancialmente desprovistas de sus determinantes inmunogénicos naturales o los tienen reducidos, y haptenos inmunogénicos que comprenden los determinantes inmunogénicos deseados contra los cuales se van a obtener los anticuerpos en las células productoras de anticuerpos.
Ninguno de estos enfoques resolvía el problema debido a que los constructos optimizaban sólo un tipo de respuesta inmune. Por ejemplo, los haptenos de bajo peso molecular conjugados sobre portadores independientes de T optimizarán sólo el componente independiente de T de la respuesta anti-hapteno, y las moléculas independientes de T escasamente inmunogénicas conjugadas sobre portadores dependientes de T tendrán que contar con la estimulación de la inmunidad dependiente de T y en forma soluble este complejo puede estar muy limitado en la activación de las células T. Así, persiste la necesidad en la técnica de constructos que optimicen ambos componentes. Semejante constructo optimizaría tanto el componente independiente de T para estimular específicamente elevados niveles de activación en las células B específicas del antígeno como también optimizaría el componente dependiente de T para reclutar simultáneamente la ayuda de las células T. Además, semejante constructo dual induciría rápidamente elevados niveles de anticuerpo para los anticuerpos tanto dependientes de T como independientes de T en animales y humanos neonatos, adultos e inmunodeficientes.
Asimismo existe la necesidad en la técnica de un constructo al que se puedan anclar múltiples antígenos de manera que el número de antígenos pueda ser presentado en una inyección. Una vacuna que pudiera inmunizar a un individuo con múltiples antígenos en un sólo constructo sería extremadamente valiosa.
En suma, existe la necesidad en la técnica (a) de un constructo que optimice los componentes antigénicos tanto independientes de T como dependientes de T para estimular una respuesta de los anticuerpos muy rápida y extensa que persista durante largos períodos de tiempo tanto en niños como en adultos, así como en individuos que tengan inmunodeficiencias (b) de un constructo al que se puedan anclar múltiples antígenos u otros coadyuvantes intensificadores inmunes; y (c) de un constructo que pueda estimular rápidamente a los anticuerpos, ya sean monoclonales o policlonales, que pueda ser empleados para una inmunoprofilaxis o terapia pasiva, y con fines de diagnóstico o de investigación.
IV. Compendio de la invención
La presente invención supera los problemas y desventajas de los constructos anteriores proporcionando una composición inmunogénica portadora dual que mejora la inmunogenicidad. La composición inmunogénica portadora dual comprende al menos un portador primario que comprende una molécula que tiene un peso molecular igual o superior a 70 kDa y que tiene características de antígeno independiente de T; al menos un portador secundario que comprende un antígeno dependiente de T químicamente conjugado con el primer portador, y al menos un radical,
donde dicho radical, siendo distinto del segundo portador, se selecciona del grupo formado por haptenos, antígenos, y combinaciones de los mismos, y se conjuga o bien con el primer portador o bien con el segundo portador,
donde la composición intensifica una respuesta de anticuerpos para el primer portador, para el segundo portador, y para el radical.
La inmunogenicidad de la composición es mayor que al menos la de un portador solo.
El portador primario permite la presentación de múltiples copias del portador secundario a una densidad antigénica relativamente elevada a las células tanto T como B. Además, dicha gran matriz esqueleto actúa como un portador eficaz para muchos y diferentes portadores secundarios de manera que un único constructo podría contener múltiples especificidades antigénicas.
El portador secundario es un antígeno dependiente de T. En cuanto al antígeno dependiente de T, el portador secundario activa y recluta células T para aumentar la producción de anticuerpos para si mismo así como para otros determinantes que puedan estar conjugados con él mismo o con el portador primario. Se pueden conjugar múltiples copias de portadores secundarios con el portador primario para intensificar significativamente la activación de las células T y de ese modo aumentar la producción de anticuerpo frente al portador secundario.
La conjugación de al menos un radical o bien con el portador primario o bien con el portador secundario permite que el radical se beneficie de la ayuda de las células T generada por el portador secundario.
En una realización de la composición inmunogénica portadora dual según la invención, al menos un portador primario se selecciona del grupo formado por dextrano y un polisacárido microbiano. Entre los polisacáridos microbianos útiles para la presente invención se incluyen el polirribosil-ribitol fosfato de H. influenzae de tipo b y el polisacárido capsular neumocócico.
En una realización adicional de la composición inmunogénica portadora dual según la invención, al menos un portador secundario es una proteína o un péptido. La proteína o el péptido pueden ser seleccionados del grupo formado por proteínas o péptidos virales, bacterianos, parásitos, animales y fúngicos. Preferiblemente, la proteína o péptido se selecciona del grupo formado por el toxoide de la difteria, el toxoide de pertussis, el toxoide del tétanos, la proteína de la membrana externa bacteriana, la proteína de la membrana externa viral, y combinaciones de las mismas. En una realización adicional de la composición según la invención, al menos un radical es acoplado o bien a un portador primario o bien a un portador secundario. La inmunogenicidad del radical conjugado es mayor que la de los radicales no conjugados. En otra realización, al menos un radical primario está conjugado con uno o más portadores secundarios.
En una realización adicional de la composición inmunogénica portadora dual según la invención, al menos uno de los portadores secundarios conjugados químicamente con el portador primario está acoplado adicionalmente al menos a un hapteno. La composición de la invención puede comprender adicionalmente un coadyuvante.
Preferiblemente, al menos un portador primario tiene un peso molecular igual o mayor de 300 kDa, más preferiblemente, igual o mayor de 500 kDa.
La composición inmunogénica portadora dual de la invención también permite la conversión de moléculas no inmunogénicas o débilmente inmunogénicas en moléculas intensamente inmunogénicas conjugando las moléculas sobre el constructo portador dual. Además, es posible conjugar coadyuvantes intensificadores inmunes sobre cualquiera de los portadores para intensificar adicionalmente su inmunogenicidad. Preferiblemente, semejante constructo inmunogénico portador dual se prepara a partir de componentes no tóxicos. Además, semejante constructo inmunogénico portador dual puede reducir las alteraciones de los sitios antigénicos, puesto que la conjugación de proteínas con el portador primario, tal como el dextrano, implica una alteración mínima para el portador.
Finalmente, el constructo inmunogénico portador dual de la invención puede ser aplicado a la terapia, la profilaxis, la diagnosis, y la investigación.
Las ventajas y aspectos adicionales de la invención se mostrarán en la descripción detallada que sigue, se derivará de esa descripción detallada, o se aprenderá mediante la práctica de la invención.
Otro aspecto de la invención hace referencia a una vacuna que comprende una cantidad inmunoestimuladora de al menos una de las composiciones inmunogénicas portadoras duales según la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. Un aspecto adicional de la invención hace referencia al uso de la vacuna según la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un paciente, donde la vacuna se administra a un paciente en una cantidad inmunoestimuladora. La vacuna puede ser administrada intravenosamente, intramuscularmente, o subcutáneamente.
La composición inmunogénica portadora dual puede ser administrada con un coadyuvante familiar para los expertos en la técnica, tal como sales de aluminio que han sido aprobadas para su uso en humanos.
Otros aspecto de la invención hace referencia a un método para preparar anticuerpos frente a enfermedades causadas por bacterias, ricketsias, virus, parásitos, hongos o productos químicos mediante la inmunización de un huésped con la vacuna de manera que se produzcan esos anticuerpos dirigidos contra los inmunógenos y después el aislamiento de los anticuerpos o células B que pueden ser utilizados para producir anticuerpos monoclonales a partir del donador. En un aspecto adicional, la invención hace referencia a una composición inmunoterapéutica que comprende semejantes anticuerpos. Preferiblemente, se utilizan células B para producir los anticuerpos monoclonales.
En un aspecto adicional, la invención se refiere al uso de la composición inmunoterapéutica según la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un paciente, donde la composición se administra al paciente en una cantidad terapéuticamente eficaz.
En otro aspecto, la invención se refiere a un reactivo de diagnóstico o investigación que comprende semejantes anticuerpos.
Los dibujos adjuntos, que se incorporan y constituyen una parte de esta memoria, ilustran numerosas realizaciones ejemplares de la invención y, junto con la descripción, sirven para explicar los principios de la invención.
Los objetos anteriores y otros diversos objetos, rasgos y muchas de las ventajas relacionadas de la invención se comprenderán mejor tras leer la siguiente descripción detallada cuando se considera en relación con los dibujos adjuntos.
V. Breve descripción de los dibujos
Fig. 1 Representación ilustrativa de los dos tipos clásicos de antígenos basados en sus requerimientos de células T. Los antígenos independientes de T (y antígenos haptenados TI) estimulan respuestas en ausencia de células T, y los antígenos dependientes de T (y antígenos haptenados TD) requieren la participación de las células T para lograr respuestas de anticuerpos óptimas.
Fig. 2 Dibujo esquemático de la composición inmunogénica portadora dual
- el portador primario es un polímero de elevado peso molecular (HMWP), por ejemplo Dextrano (Dex);
- el portador secundario, conjugado con Dex, puede ser cualquier sustancia que estimule elevados niveles de activación de las células T;
- el hapteno es cualquier molécula de bajo peso molecular, tal como un oligosacárido, polisacárido, péptido, fármaco, etc., que esté conjugado con el portador secundario.
Fig. 3 Representación gráfica de la respuesta a la dosis para el producto conjugado BSA-Dex. Se midieron los títulos de anticuerpo anti-IgG1 en suero para la seralbúmina bovina (BSA) en ratones inmunizados intravenosamente con BSA-Dex en productos conjugados con PBS a dosis que oscilan entre 10 y 500 \mug/ratón. Los ratones fueron desangrados 14 días después de la inmunización y los títulos de anticuerpo determinados mediante ELISA. La BSA no conjugada no es inmunogénica en ratones. Esta figura muestra que la conjugación con Dex convierte la BSA en un inmunógeno altamente potente.
Fig. 4 Diagrama que representa proteínas de diversos tamaños que fueron conjugadas con Dex e inyectadas intravenosamente (IV) en ratones a las dosis indicadas. Se determinaron los títulos de anticuerpo IgG del suero mediante ELISA. En contraste con las proteínas conjugadas, la inmunización de los ratones con antígenos no acoplados a dextrano dio una formación de anticuerpos no detectable (los títulos fueron de menos de 10) excepto para la inmunización con la toxina del cólera que dio títulos detectables, aunque significativamente menores que los del producto conjugado con Dex. Esta figura muestra que la conjugación de diferentes proteínas con Dex las convierte en 
\hbox{inmunógenos eficaces.}
Fig. 5 Representación gráfica de la respuesta a BSA haptenada. Se inmunizaron ratones con BSA trinitrofenilada (TNP-BSA) (50 \mug) o con TNP-BSA conjugada con Dex (TNP-BSA Dex) (50 \mug) y se desangraron 21 días más tarde. Se midieron los títulos anti-TNP mediante ELISA. Esta figura demuestra que se logra una buena respuesta de anticuerpos tanto a BSA como a TNP utilizando Dex como portador primario y BSA como portador secundario. Así, la conjugación de TNP a la molécula portadora de proteína secundaria acoplada con la conjugación de este complejo al portador primario convertía la TNP en un inmunógeno eficaz.
Fig. 6 Representación gráfica de la respuesta anti-péptido. Este estudio apoya el estudio previo mostrado en la Fig. 5. Se muestra que la conjugación del péptido derivado de la malaria P74 al portador secundario, BSA, y la conjugación de este complejo al portador primario Dex, convierte un péptido no inmunogénico (P74) en un inmunógeno eficaz. Esto es particularmente relevante al demostrar la utilidad de este constructo para péptidos sintéticos.
Fig. 7 Representación gráfica de antígenos múltiples conjugados con dextrano. Este estudio evalúa la respuesta de anticuerpos a un complejo de Dex que ha sido preparado conjugando tres moléculas antigénicamente diferentes con Dex. En este estudio, se conjugaron TNP acoplado con ovoalbúmina (OVA), más lisozima (Lys) con Dex y 50 \mug de este producto conjugado se inyectaron IV en ratones. Nueve días más tarde los ratones fueron desangrados y los sueros fueron titulados mediante ELISA para los títulos de anticuerpos anti-OVA, anti-TNP y anti-Lys. Este estudio demuestra que se puede elaborar una preparación de vacuna conjugando múltiples antígenos no relacionados sobre el portador Dex primario.
Fig. 8 Representación gráfica del refuerzo de BSA-Dex haptenado. Se inmunizaron ratones con (TNP-BSA) Dex (50 \mug) y después se reforzaron con una segunda inyección o bien de TNP-BSA solo o bien con TNP-BSA conjugado con Dex. Los ratones fueron desangrados 14 días después y los sueros fueron titulados para los anticuerpos anti-TNP y anti-BSA. Esta figura muestra que una vez que los ratones son inmunizados con el producto conjugado con Dex (constando un constructo tanto de portador primario como secundario), se logra una buena respuesta de refuerzo y que el refuerzo de anticuerpos se puede lograr tan eficazmente con el TNP-BSA no conjugado (solo portador secundario) que con el producto conjugado con el constructo de vacuna completo. Esto demuestra que una vez que se ha estimulado una respuesta primaria con el producto conjugado, se puede lograr una fuerte respuesta secundaria mediante el antígeno no conjugado o natural.
Fig. 9 Representación gráfica de la cinética de BSA-Dex reforzado con BSA. Se inmunizaron ratones con 50 \mug de BSA-Dex (portador primario y secundario) y 5 semanas más tarde se reforzaron con 50 \mug de BSA (sólo portador secundario). Los ratones fueron desangrados en diferentes momentos y los sueros fueron titulados mediante ELISA para los títulos de anticuerpo para BSA, el portador secundario. Esta figura muestra que las respuestas de anticuerpos secundarios puede ser lograda sólo por BSA, el portador secundario no conjugado con dextrano, y que la respuesta es de muy larga duración y persiste durante más de 11 semanas.
Fig. 10 Representación gráfica de la respuesta de los anticuerpos al portador. Se inyectaron productos conjugados BSA-Dex (50 \mug) en ratones normales o carentes de sistema inmune que no eran sensibles a Dex. Los ratones fueron desangrados 11, 20 y 29 días más tarde, y los títulos de suero anti-BSA fueron medidos mediante ELISA. Este estudio demuestra que el portador Dex puede proporcionar simplemente una matriz para presentar el antígeno a las células en una disposición multivalente, que la respuesta del anticuerpo al producto conjugado con Dex no depende de la capacidad de los ratones para organizar respuestas de anticuerpos al portador de dextrano, que las células del sistema inmune no necesitan reconocer el Dex como un inmunógeno para sí mismo para funcionar como un portador eficaz, e importantemente que el producto conjugado de BSA-Dex puede estimular respuestas en ratones carentes de sistema inmune.
Fig. 11 Representación gráfica de la inmunogenicidad de BSA-Dex en crías de ratón. Se inyectaron intraperitonealmente a ratones tanto de 2 semanas de edad como adultos 50 \mug de BSA-Dex y se desangraron 12 días más tarde. Se midieron los títulos anti-BSA del suero mediante ELISA. Este estudio muestra que incluso los ratones que son inmunológicamente inmaduros puede ser eficazmente inmunizados con este producto conjugado de proteína-portador con Dex y lograr buenas respuestas de anticuerpos al portador secundario (BSA).
Fig. 12 Representación gráfica del efecto del peso molecular. Se elaboraron productos conjugados BSA-Dex utilizando Dex separados por tamaños de PM 70 kDa, 500 kDa, o 2000 kDa. Se inyectaron IV 50 \mug de los diferentes productos conjugados a los ratones y se desangraron 14 días más tarde. Se determinaron los títulos de anticuerpos del suero mediante ELISA. Esta figura muestra que el Dex debe tener un tamaño > de 70 kDa para proporcionar una molécula portadora eficaz y que, aunque con 500 kDa se logra una buena respuesta, es aún más eficaz una molécula portadora de mayor peso molecular.
Fig. 13 Representación gráfica del efecto del modo de inyección. Se inmunizaron ratones con BSA-Dex por medio de tres rutas diferentes: intravenosamente (IV), subcutáneamente (SC), o intramuscularmente (IM). Los ratones fueron desangrados 14 días más tarde y se determinaron los títulos en suero mediante ELISA. Este estudio muestra que el producto conjugado proteína-portador con Dex (complejo de portador primario y secundario) estimula respuestas comparables se administre IV, SC o IM.
Fig. 14 Dibujo esquemático del constructo inmunogénico portador dual con el cual se conjugan múltiples y diferentes portadores secundarios (toxoide del tétanos, proteína de la membrana externa meningocócica, y proteína viral) con al menos un portador primario. Los portadores secundarios pueden ser o no haptenados adicionalmente.
Fig. 15 Representación gráfica del éxito de la conjugación de la toxina de pertussis con dextrano. El perfil es el de PT-dex aplicado a una columna de filtración en gel S400SF equilibrada con solución salina y azida. La velocidad de flujo era de 0,2 ml/min., 25 gotas/tubo. La flecha indica la posición del toxoide no conjugado. La DO 280 es una medida de la proteína y CPM/50 \mul hace referencia a las cuentas por minuto presentes en una alícuota de 50 \mul, una medida de la cantidad de dextrano tritiado presente.
Fig. 16 Diagrama que representa la respuesta anti-dextrano de ratones a los que se ha inyectado una única dosis de toxoide del tétanos-dextrano, toxoide de la difteria-dextrano, o toxoide de pertussis-dextrano en forma de fluido o absorbido sobre el coadyuvante fosfato de aluminio. El diagrama muestra que los ratones generaban anticuerpos, predominantemente IgG1, IgG2, e IgM, en dos semanas y que los anticuerpos persistían durante al menos ocho semanas.
Fig. 17 Demostración gráfica en tres partes de la respuesta de anticuerpos a los portadores secundarios, toxoide de la difteria, toxoide del tétanos, y toxoide pertussis cuando se conjugan con dextrano de elevado peso molecular. Como con los anticuerpos anti-dextrano, los anticuerpos contra estas proteínas fueron logrados en al menos dos semanas y persistieron durante al menos ocho semanas. Juntas, las Fig. 15 y 16 demuestran la intensificación dual y recíproca lograda con los productos conjugados de la invención. (Ver el Ejemplo 9 para los detalles).
Fig. 18 Representación gráfica del efecto de neutralización del toxoide del tétanos, que muestra que el producto conjugado generaba niveles protectores de anticuerpos anti-toxina.
Fig. 19 Demostración gráfica en dos partes de la intensificación inmune dual y recíproca lograda con los productos conjugados de la invención con dos dosis de producto conjugado administradas según la Fig. 19a. En la Parte (a) se muestran los niveles de anticuerpo anti-proteína inducidos por los portadores secundarios. En la Parte (b) se muestran los niveles de anticuerpo anti-dextrano categorizados por isotipos.
Fig. 20 Representación gráfica de la conjugación de la toxina de la difteria con PRP. El perfil es de DT-PRP aplicado a una columna de filtración en gel S300SF equilibrada con PBS. La velocidad de flujo era de 0,25 ml/min., 25 gotas/tubo. La flecha indica la posición del toxoide no conjugado. La DO 280 es una medida de la proteína y la DO 430 hace referencia a la absorbancia producida en el análisis del carbohidrato resorcinol (Dubois, H. y col. Anal. Chem. 28:350 (1956)) y es una medida de la cantidad relativa de PRP.
VI. Descripción detallada de las realizaciones preferidas
A continuación se hará referencia con detalle a las realizaciones actualmente preferidas de la invención, cuyos ejemplos se ilustran en los dibujos adjuntos.
La invención hace referencia a un constructo inmunogénico elaborado hasta con al menos dos portadores, al menos un portador primario que es una molécula de peso molecular elevado de más de 70 kDa de peso molecular y que tiene características de antígeno independiente de T, y un portador secundario que es un antígeno dependiente de T conjugado con este como se representa en la Figura 2, y al menos un radical, donde dicho radical, siendo distinto del portador secundario, se selecciona del grupo formado por haptenos, antígenos, y combinaciones de los mismos, y conjugado o bien con un portador primario o bien con un portador secundario;
donde la composición intensifica la respuesta de anticuerpos al portador primario, al portador secundario, y al radical.
Un portador es cualquier sustancia a la que se pueden anclar otras sustancias de manera que la inmunogenicidad de las sustancias ancladas se intensifique.
La inmunogenicidad del constructo es mayor que la inmunogenicidad de al menos un portador solo. Los métodos para medir la inmunogenicidad son bien conocidos por los expertos en la técnica y entre ellos se incluyen principalmente la medida de anticuerpos en suero incluyendo la medida de la cantidad, la avidez y la distribución del isotipo en diversos momentos tras la inyección del constructo. La mayor inmunogenicidad puede ser reflejada por un título elevado y/o una persistencia de la respuesta de anticuerpos. La inmunogenicidad también puede ser medida mediante la capacidad para inducir protección frente a la sensibilización con sustancias u organismos nocivos. La inmunogenicidad también puede ser medida mediante la capacidad para inmunizar ratones neonatos y/o carentes de sistema inmune. La inmunogenicidad puede ser medida en la población de pacientes que va a ser tratada o en una población que imite la respuesta inmune de la población de pacientes.
Como resultado de las contribuciones de ambos tipos de portadores, la composición portadora dual es un activador extremadamente potente de la ayuda de las células T por medio de mecanismos tales como la presentación de antígenos intensificada por las células B, los macrófagos u otras células presentadoras de antígenos. Semejante composición logrará una formación de anticuerpos muy rápida y prolongada en adultos, niños, y aquellos con sistemas inmunes inmaduros o inmunodeficientes.
La composición de la invención es preferiblemente soluble en agua o puede ser mantenida en medio acuoso. La solubilidad puede derivar del uso de reactivos solubilizantes durante la síntesis de la composición. Además, la composición de la invención puede ser mantenida en medio acuoso mediante el uso de reactivos solubilizantes.
El proceso de síntesis de la composición de la invención permite controlar ventajosamente las propiedades físicas y químicas del producto final. Entre las propiedades que pueden ser controladas se incluyen la modificación de la carga en los portadores primario y secundario (una ventaja a la luz de la evidencia de que las proteínas cationizadas pueden ser más inmunogénicas), variación del tamaño del constructo variando el tamaño de los portadores primarios, selección del grado de entrecruzamiento del constructo (para obtener variaciones del tamaño y la vida media en circulación), selección del número de copias de portadores secundarios conjugados con portadores primarios, y dirección hacia poblaciones de células seleccionadas (tales como macrófagos para intensificar la presentación de antígenos).
La respuesta inmune a la composición de la invención puede ser intensificada adicionalmente mediante la adición de inmunomoduladores y/o radicales dirigidos a células. Entre estas entidades se incluyen, por ejemplo, (1) lipopolisacáridos o derivados destoxificados, (2) muramildipéptidos, (3) carbohidratos, lípidos, y péptidos que pueden interaccionar con determinantes de la superficie celular para dirigir la composición a células inmunológicamente relevantes, (4) interleuquinas, y (5) anticuerpos que pueden interaccionar con componentes de la superficie celular.
Como se representa en la Figura 2, la composición de la invención se elabora al menos con un portador primario que proporciona una matriz esqueleto grande con la que se pueden conjugar una o más copias de portador secundario, y al menos con un radical, donde dicho radical, siendo distinto del portador secundario, se selecciona del grupo formado por haptenos, antígenos, y combinaciones de los mismos, y se conjuga o bien con un portador primario o bien con un portador secundario. Como se discutirá más abajo, uno o más portadores primarios o secundarios están adicionalmente conjugados con radicales. Los métodos de conjugación son bien conocidos por los expertos normales en la técnica, y entre ellos se incluyen las técnicas de heteroligadura de Brunswick M., y col., J. Immunol. 140:3364 (1988) y Mongini P.K., y col., J. Immunol. 148:3892 (1992). Ver también Wong, S.S. Chemistry of Protein Conjugates and Crosslinking CRC Press, Boston (1991). Los autores de la presente invención han encontrado, sin embargo, que estos métodos, aunque bien conocidos en la técnica para conjugar proteínas, pueden requerir ciertas modificaciones para optimizar su aplicación a la síntesis de vacunas de productos conjugados.
Como los expertos en la técnica pueden apreciar, los antígenos utilizados en la preparación de vacunas de productos conjugados son valiosos. Por lo tanto, es deseable utilizar procedimientos químicos que proporcionen un elevado rendimiento de producto y que modifiquen mínimamente los epítopos importantes. En muchos protocolos para conjugar proteína con carbohidratos se utilizan carbodiimidas para formar conexiones amida (Cruse J.M., Lewis R.E. Jr. ed., Conjugate vaccines in Contributions to Microbiology and Immunology, vol. 10, 1989). Este reactivo no es selectivo, ocasiona una modificación extensa y una polimerización potencialmente indeseable de la proteína. Los rendimientos son a menudo bajos. Otros procedimientos dan como resultado enlaces disulfuro, que son menos estables que el enlace tio-éter (Cruse J.M., Lewis R.E. Jr. ed., Conjugate vaccines in Contributions to Microbiology and Immunology, vol. 10, 1989).
En contraste, la química descrita más abajo evita probablemente estas dificultades. Los elementos de un protocolo preferido son (1) transformación del portador secundario (tal como una proteína toxina) con tiol, (2) transformación del polímero portador primario con reactivos que reaccionan con tiol; v.g., maleimida, yodoacetato, (3) formación de una conexión tio-éter y (4) separación del producto conjugado del polímero y la proteína no conjugados.
La transformación de la proteína y el carbohidrato está seguida normalmente de una etapa de eliminación de las sales en columna y concentración. Una alternativa, que ha sido utilizada con éxito, es realizar todas las etapas, o preferiblemente las etapas 1-3, con un dispositivo de ultrafiltración (v.g., filtración a presión de Amicon) utilizando filtros de corte del peso molecular adecuados. Esto minimiza la manipulación y las transferencias.
Controlando el número de grupos reactivos y las concentraciones de los componentes y otros detalles, esta química permite un control relativamente fácil del grado de entrecruzamiento intercadena, el grado de polimerización y la agregación para dar como resultado un método rápido que logra un elevado rendimiento y una mínima modificación de los epítopos clave.
Como reconocerá el artesano experto, la metodología de conjugación específica puede variar dependiendo de los portadores primario y secundario individuales y de los radicales individuales pero, dadas las presentes enseñanzas y el conocimiento de los expertos en la técnica, cualquier otra metodología o modificación necesaria a las metodologías presentadas aquí está dentro del conocimiento práctico de los expertos en la técnica. Para ayudar a la persona experta, sin embargo, se muestran aquí los mecanismos de conjugación representativos para los portadores primarios concretos. Estos mecanismos están dirigidos a los portadores primarios de dextrano (ver la sección titulada "Método") y el polisacárido de haemophilus influenzae (PRP) (ver el Ejemplo 11), aunque los mecanismos pueden ser utilizados con otros portadores primarios descritos más abajo. Se pueden utilizar otros mecanismos químicos con dextrano o PRP y otros portadores primarios, como los conocidos por los expertos en la técnica.
La conjugación de portadores en esta invención puede proporcionar una desorganización mínima de los epítopos críticos sobre los portadores, puesto que la conjugación de proteínas con un portador primario, tal como el dextrano, implica alteraciones mínimas para el dextrano. Además, un portador primario de la invención también puede incluir grupos funcionales o, alternativamente, puede ser manipulado químicamente para que porte grupos funcionales. Como se hace con el dextrano y el PRP, la presencia de grupos funcionales puede facilitar la conjugación covalente de un portador primario con uno o más portadores secundarios. Entre tales grupos funcionales se incluyen, pero no están limitados a, grupos amino, grupos carboxilo, aldehídos, hidrazidas, epóxidos, y tioles.
El esqueleto grande de cada portador primario proporciona una matriz ideal para muchos portadores secundarios de manera que una vacuna pueda contener múltiples especificidades antigénicas. Por otra parte, el portador primario estimula la producción de anticuerpos presentando numerosas copias de portadores secundarios a una densidad antigénica relativamente elevada para las células tanto B como T. Asimismo puede proporcionar otras ventajas incluyendo la dirección del constructo a macrófagos u otros tipos celulares para permitir una preparación de antígeno mejorada.
En una realización preferida, el peso molecular de al menos un portador primario oscila entre más de 70.000 y 2.000.000 de Da y más. Como se expone en la Figura 12, un peso molecular más preferido es de 500.000 Da y más, y un peso molecular aun más preferido es de 2.000.000 de Da. La conjugación del portador primario con al menos un portador secundario puede dar como resultado el entrecruzamiento del portador primario. Semejante entrecruzamiento puede permitir el uso de portadores de peso molecular más bajo (tal como 70.000 Da) con tal que el constructo final tenga un peso molecular superior. Basándose en las enseñanzas contenidas aquí junto con el conocimiento práctico normal en la técnica, el artesano experto sabrá cómo seleccionar el peso molecular óptimo para el constructo concreto deseado.
Según la invención, al menos un portador primario es un antígeno independiente de T, que combina de ese modo las ventajas de los antígenos independientes de T y dependientes de T. Semejante portador puede a su vez activar directamente y potentemente las células B y puede servir como esqueleto grande pero relativamente no degradable para llevar muchos portadores secundarios. Como se detalla más abajo, sin embargo, la invención se puede poner en práctica, no obstante, con un portador primario que no sea inmunogénico por si mismo.
Un portador primario puede ser una molécula de elevado peso molecular de origen natural, semisintético o totalmente sintético. Entre los portadores primarios útiles para la presente invención se incluyen dextrano, carboximetilcelulosa, agarosa, Ficoll®, poliacrilamida, polisacáridos de origen natural, y combinaciones de los mismos.
En una realización preferida, el portador primario es un dextrano. Según se utiliza aquí, dextrano ("dex") hace referencia a un polisacárido compuesto por un único azúcar y puede ser obtenido de cualquier número de fuentes, incluyendo Pharmacia. Ficoll®, un ejemplo de un polímero semi-sintético, es un polímero de elevado peso molecular no ionizado semi-sintético. Entre los polímeros sintéticos se incluyen la poliacrilamida (un polímero de resina acrílica de elevado peso molecular soluble en agua), poli(lactida-co-glicólido), poli(alcohol vinílico), poli(acetato de vinilo) parcialmente hidrolizado y polivinilpirrolidina. En otra realización preferida, el portador primario es un polisacárido microbiano. En otra realización más, los polisacáridos microbianos derivan de microorganismos patógenos. En una realización preferida adicional, el portador primario se selecciona del grupo formado por polisacáridos capsulares Pneumocócicos (incluyendo el tipo III), serotipos de Streptococcus del Grupo B, mucoexopolisacáridos de Pseudomonas aeruginosa, polisacáridos capsulares de P. aeruginosa (incluyendo la cepa Fisher de tipo 1), polisacárido de Haemophilus influenzae (incluyendo PRP), y combinaciones de los mismos. En una realización preferida adicional, el portador primario es el polisacárido de haemophilus influenzae (PRP).
El portador secundario de la composición según la invención también proporciona ventajas específicas para lograr buenas respuestas de anticuerpos. Como antígeno dependiente de T, el portador secundario puede activar y reclutar células T y de ese modo aumentar la producción de anticuerpos dependiente de las células T. El portador secundario no necesita, sin embargo, ser fuertemente inmunogénico por sí mismo, aunque los portadores fuertemente inmunogénicos están dentro del alcance de esta invención. El acoplamiento de múltiples copias del portador secundario con el portador primario aumenta significativamente la producción de anticuerpo frente a los portadores secundarios incluso en ausencia de coadyuvantes.
En una realización preferida, el portador secundario es una proteína, un péptido, un coadyuvante de las células T o cualquier otro compuesto susceptible de activar y reclutar la ayuda de las células T. El portador secundario puede ser seleccionado del grupo formado por, pero no limitado a los constituyentes virales, bacterianos, parásitos, animales y fúngicos. En una realización más preferida, el portador secundario es una proteína tal como albúmina (tal como seralbúmina bovina), el toxoide del tétanos, el toxoide de la difteria, el toxoide de pertussis o la proteína de la membrana externa bacteriana, todos los cuales pueden ser obtenidos de compañías de suministro bioquímico o farmacéutico o preparadas mediante metodología estándar (Cruse, J.M. y Lewis, R.E., Jr. (eds.) Conjugate Vaccines in Contributions to Microbiology and Immunology vol. 10 (1989)).
Otros componentes que podrían funcionar como portadores secundarios serán conocidos por los expertos normales en la técnica de la inmunología.
Los portadores secundarios útiles en la invención son susceptibles de ser conjugados al menos con un portador primario. Los portadores secundarios o bien pueden contener grupos funcionales que pueden reaccionar con los portadores primarios o bien los portadores secundarios pueden ser químicamente manipulados para que sean susceptibles de reaccionar con los portadores primarios tratados antes.
Como se ha descrito antes, se pueden conjugar con el portador primario numerosas copias de los portadores secundarios específicos así como una variedad de portadores secundarios. El acoplamiento de múltiples copias del portador secundario con el portador primario aumenta significativamente la producción de anticuerpos para el portador secundario.
Los portadores secundarios útiles para la invención son preferiblemente solubles en agua, ya sea conjugados o no conjugados o acoplados con los inmunógenos tratados más abajo.
Según la invención, al menos un radical está conjugado con uno o más de los portadores primarios y/o secundarios, como se representa en la Figura 2. Semejante conjugación promueve respuestas de anticuerpos intensificadas para el radical. Los mecanismos para conjugar semejantes radicales con los portadores primario y secundario son bien conocidos por los expertos en la técnica, y entre ellos se incluyen, en parte, el acoplamiento por medio de grupos funcionales asequibles (tales como los grupos amino, carboxilo, tio y aldehído). Ver S.S. Wong, Chemistry of Protein Conjugate and Crosslinking CRC Press (1991), y Brenkeley y col., Brief Survey of Methods for Preparing Protein Conjugates Eith Dyes, Haptens and Cross-Linking Agentes, Bioconjugate Chemistry 3 #1 (Enero 1992).
Los haptenos de la invención pueden ser conjugados primero con el portador secundario (que comprende un antígeno dependiente de T y después acoplado con el portador primario (que comprende una molécula con características de antígeno independiente de T) que son acoplados después. Alternativamente, el portador secundario puede ser conjugado primero con el portador primario y después lo haptenos conjugados con este constructo. Este segundo método puede ayudar a minimizar la modificación de ciertos haptenos tales como haptenos peptídicos que contienen grupos amino.
Según se utiliza aquí, radical es cualquier sustancia que sea capaz de estimular el sistema inmune o bien por si misma o bien una vez acoplada. Entre los radicales se incluyen haptenos, antígenos, o combinaciones de los mismos. Los haptenos hacen referencia a moléculas pequeñas, tales como productos químicos, polvo, y alérgenos, que no son capaces de lograr por sí mismos una respuesta inmune, pero pueden una vez acoplados con un portador. Un antígeno es cualquier molécula que, en las circunstancias correctas, pueden inducir la formación de anticuerpos. Estos haptenos y antígenos pueden derivar de, pero no están limitados a, bacterias, rickettsias, hongos, virus, parásitos, fármacos, o productos químicos. Se pueden incluir, por ejemplo, pequeñas moléculas tales como péptidos, sacáridos, oligosacáridos (por ejemplo el polirribosil-ribitol-fosfato de H. influenzae), toxinas, endotoxinas, etc.
En otra realización, la invención hace referencia a vacunas que están hechas de la composición inmunogénica portadora dual junto con un portador farmacéuticamente aceptable. Tales vacunas contendrán una cantidad terapéutica eficaz de la composición inmunogénica portadora dual junto con una cantidad adecuada de portador con el fin de proporcionar la forma de administración apropiada para el paciente.
Los portadores farmacéuticamente aceptables pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo los de petróleo, los de origen animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es el portador preferido cuando la composición se administra intravenosamente. Las soluciones salinas y las soluciones de dextrosa y glicerol acuosas también pueden ser empleadas como portadores líquidos, concretamente para soluciones inyectables. Los portadores farmacéuticos adecuados se describen en Martin, E.W., Remington's Pharmaceutical Sciences.
Entre las vacunas que pueden ser construidas a partir de la composición inmunogénica portadora dual de la invención se pueden incluir, pero no están limitadas a, las vacunas mostradas en el Diagrama 1.
Diagrama 1
Vacuna de la difteria
Vacuna Pertussis (subunidad)
Vacuna del tétanos
H. influenzae, tipo b (polirribosa fosfato)
S. penumoniae, todos los serotipos
E. coli, endotoxina o antígeno J5 (LPS, Lípido A y Gentabiosa)
E. coli, polisacáridos O (serotipo específico) Klebsiella, polisacáridos (serotipo específico)
S. aureus, tipos 5 y 8 (serotipo específico y antígenos protectores comunes)
S. epidermidis, polisacárido de serotipo I, II y III (y antígenos protectores comunes)
N. meningitidis, serotipo específico o antígenos proteicos
Vacuna de polio
Vacuna de paperas, sarampión, rubéola Virus respiratorio Sincitial Rabia
Hepatitis A, B, C, y otras
Virus de la Inmunodeficiencia humana I y II (GP120, GP41, GP160, p24, otros)
Herpes simplex tipos 1 y 2
CMV
EBV
Varicela/Zoster
Malaria
Tuberculosis
Candida albicans, otros candida
Pneumocystis carinii
Mycoplasma
Virus de la influenza A y B
Adenovirus
Streptococcus del grupo A
Streptococcus del grupo B, serotipos, Ia, Ib, II y III
Pseudomonas aerynosa (serotipo específico)
Rhinovirus
Parainfluenzae, tipos 1, 2 y 3
Coronavirus
Salmonella Shigella
Rotavirus
Enterovirus
Chlamydia trachomatis & pneumoniae (TWAR)
La invención también se refiere al uso de la vacuna de la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un paciente, donde la vacuna se administra al paciente en una cantidad inmunoestimuladora.
Paciente hace referencia a cualquier sujeto para el cual el tratamiento puede resultar beneficioso y se incluyen mamíferos, especialmente humanos, caballos, vacas, perros, y gatos así como otros animales, tales como pollos. Una cantidad inmunoestimuladora hace referencia a la cantidad de vacuna que es capaz de estimular la respuesta inmune del paciente para la prevención, alivio, o tratamiento de enfermedades. La vacuna de la invención puede ser administrada por cualquier ruta, pero se administra preferiblemente mediante inyecciones intravenosas, intramusculares, y subcutáneas.
La invención también hace referencia a un método para preparar una composición inmunoterapéutica frente a infecciones causadas por bacterias, virus, parásitos, hongos, o productos químicos inmunizando un huésped con la vacuna descrita antes de manera que el donador produzca anticuerpos dirigidos contra la vacuna. Los anticuerpos serían aislados o se podrían obtener las células B para más tarde fusionarlas con células de mieloma para elaborar anticuerpos monoclonales. El método para elaborar anticuerpos monoclonales es bien conocido en la técnica, Kohler y Milstein, Nature 256:495 (1975), y no necesita una descripción adicional aquí. Según se utiliza aquí, la composición inmunoterapéutica hace referencia a una composición de anticuerpos que están dirigidos contra inmunógenos específicos para su uso en el tratamiento pasivo de pacientes. Un donador de plasma es cualquier sujeto al que se inyecta una vacuna para la producción de anticuerpos contra los inmunógenos contenidos en la vacuna.
Asimismo la invención se refiere al uso de la composición inmunoterapéutica de la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un paciente, donde la composición se administra al paciente en una cantidad terapéuticamente eficaz. Semejante tratamiento es pasivo ya que no induce al paciente a producir anticuerpos contra un inmunógeno, sino que en lugar de eso utiliza anticuerpos producidos por el donador de plasma contra el inmunógeno. La cantidad de anticuerpos terapéuticos es terapéuticamente eficaz si presenta un número suficiente de anticuerpos que eviten, alivien, o traten la enfermedad causada por el inmunógeno. Semejante cantidad puede ser determinada por los expertos normales en la técnica y varía basándose en las características del paciente y el perfil de la enfermedad.
Asimismo la invención se refiere a un reactivo de diagnóstico y/o investigación para detectar agentes que son característicos de enfermedades causadas, por ejemplo, por bacterias, virus, hongos, parásitos o productos químicos, obtenidos inmunizando un huésped con una vacuna descrita antes de manera que el huésped produce anticuerpos (o células B) contra los agentes. Los anticuerpos y/o las células B pueden ser aislados como se ha descrito antes. Según se utiliza aquí, un reactivo de diagnóstico hace referencia a una composición de anticuerpos (policlonales o monoclonales) que puede ser utilizada para detectar agentes que son característicos de enfermedades. Según se utiliza aquí, reactivo de investigación hace referencia a una composición de anticuerpos (policlonales o monoclonales) que puede ser utilizada en el laboratorio.
Los ejemplos ofrecidos aquí proporcionan métodos para ilustrar, sin implicar ninguna limitación, la puesta en práctica de la invención en la producción de vacunas para producir anticuerpos ya sean monoclonales o policlonales, que podrían ser empleados para la profilaxis o la terapia activa o pasiva, y con fines de diagnóstico o investigación.
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El perfil de los experimentos representativos ha sido seleccionado para ilustrar los métodos para producir una composición inmunogénica portadora dual y los conceptos de función.
Métodos
I. Se utilizaron ratones (DBA/2J) de 8 semanas de edad a menos que se observe lo contrario y se inmunizaron con 0,1 ml y una solución salina de diversos antígenos intravenosamente, subcutáneamente, o intramuscularmente. En todos los experimentos se utilizaron 5 ratones por grupo. El desangrado era por la vena de la cola.
II. Aminoetilcarbamil Dex (AECM Dex)
Se preparó aminoetilcarbamil dextrano (AECM Dex) esencialmente como describen Brunswick y col., J. Immunol. 140:3363 (1988), incorporado aquí específicamente como referencia. Se hizo pasar AECM T2000 dextrano (Pharmacia) a lo largo de una columna de penetración en gel (columna CL2B 2,5 x 105 cm). El material de la primera a la tercera columnas se reunió y se determinó que tenía un peso molecular medio de 2.000.000 daltons. Este material es referido ahora como HMW AECM Dextrano. Los AECM dextranos también fueron preparados a partir de dextrano T70 y T500 (Pharmacia) y fraccionados en columnas CL6B y CL4B, respectivamente. Se cogió un corte central, se concentró y se hizo circular de nuevo para obtener una preparación relativamente homogénea. Se utilizó ácido trinitrobencenosulfónico (TNBS) para determinar el número medio de grupos amino por molécula de dextrano. Las preparaciones de dextrano de elevado peso molecular tenían de 150 a 200 grupos amino por 2.000.000 daltons. La preparación de AECM T500 tenía una media de 150 grupos amino por 500.000 daltons y la preparación de AECM T70 tenía una media de 35 grupos amino por 70.000 daltons. Con el fin de facilitar la determinación de las concentraciones de dextrano, se marcó radiactivamente de una manera rutinaria el AECM dextrano mediante reacción con una pequeña cantidad propionato de N-succinimidilo [3H-2,3] (Amersham) [3H-NSP]. Aproximadamente una de 10.000 moléculas de dextrano era modificada. (3H-AECM HMW Dex) fue ligeramente trinitrofenilada como sigue: se añadieron 50 \mul de TNBS 0,01M recién preparado en borato de sodio 0,01 M pH 9,3 a una solución agitada de 20 mg de HMW AECM-Dex en 2 ml de tampón HEPES [HEPES 0,15 M, EDTA 2 mM, azida al 0,02%, pH 7,5] más 0,5 ml de tampón borato de sodio 0,1 M pH 9,3. Al cabo de 2 horas en la oscuridad a la temperatura ambiente, los reactivos fueron separados sobre una columna de eliminación de sal P6DG (BioRad) y el dextrano marcado fue concentrado mediante ultrafiltración utilizando un Centricon 30 (Amicon). Utilizando un coeficiente de extinción molar de 11.000 a 366 nm, se determinó la razón de TNP con respecto a HMW dextrano para que fuera de 40:1. Esto dejaba aproximadamente 100-150 grupos amino libres para una reacción adicional.
Las modificaciones de este método pueden ser útiles para otros portadores primarios. Por ejemplo, el mucoexopolisacárido de Pseudomonas aeruginosa (MEP), que es una molécula de 500 kDa que contiene grupos carboxilo, puede ser primero parcialmente transformado con etilendiamina y carbodiimida soluble en agua. En contraste, el polisacárido de Fisher de tipo 1 de P. aeruginosa que contiene grupos amino, puede responder bien al protocolo estándar pero puede ser ayudado por la presencia de una elevada concentración de sal.
III. Conjugación de proteínas con AECM Dex
Las proteínas fueron conjugadas con AECM dextrano utilizando mecanismos de heteroligadura (Brunswick M, y col., J. Immunol. 140:3364, 1988).
La proteína fue acetiltiolada y el dextrano yodoacetilado con el reactivo SIAP (Brunswick M, y col., J. Immunol. 140:3364, 1988) pero también se podrían utilizar otros reactivos tales como éster de ácido yodoacético y N-hidroxisuccinimida (IANHS).
Las proteínas se hicieron reaccionar típicamente con un exceso molar de 4-8 veces de reactivo SATA (Calbiochem) durante 1-2 horas. Los dextranos y la proteína activados fueron sometidos cada uno a eliminación de la sal en tampón acetato (Na Acetato 10 mM, NaCl 0,1 M, EDTA 2 mM, Azida de sodio al 0,02%, pH 5,0) para eliminar el exceso de reactivo y se concentraron utilizando un Centricon 30. La proteína y los dextranos se mezclaron típicamente a razones molares de 30-60:1, el pH se elevó a 7,5 con tampón HEPES concentrado + hidroxilamina. Las concentraciones finales eran HEPES 75 mM, EDTA 2 mM, azida al 0,02% e hidroxilamina 50 mM. Tras reaccionar durante la noche a 4ºC, el producto conjugado se trató con mercaptoetanol 0,2 mM durante 1 hora (para consumir cualquier grupo yodoacetilo restante) seguido de yodoacetamida 10 mM (para consumir todos los grupos tiol), se concentró adicionalmente cuando fue necesario (por ejemplo, mediante un dispositivo de centrifugación o una ultrafiltración a presión), y se hizo pasar a lo largo de una columna de filtración en gel de 1 x 58 cm, se equilibró con PBS, conteniendo S200SF, S300SF o S400SF (Pharmacia), dependiendo del peso molecular de la proteína. El pico de la columna vacío radiactivo se reunió y se concentró cuando fue necesario. Las soluciones se esterilizaron haciéndolas pasar a través de un filtro HV o GV Millex (Millipore).
El péptido P74 (CNIGKVPNVQDQNK, código de aminoácidos de una sola letra), fue conjugado con BSA como sigue. Se llevaron 11,6 mg de BSA (Pentex) en 400 \mul de tampón HEPES a una concentración 10 mM en yodoacetamida. Esto fue para bloquear cualquier grupo tiol nativo que pudiera reaccionar con el reactivo heterobifuncional y ocasionar la polimerización. Al cabo de 10 minutos de incubación, la proteína fue sometida a yodoacetilación añadiendo un exceso 12 veces molar de SIAP. Al cabo de una hora, la solución fue sometida a eliminación de sal en tampón acetato y concentrada a 39 mg/ml.
El péptido tiolado fue marcado radiactivamente de manera que se pudiera estimar la cantidad de péptido conjugado con BSA. El péptido fue disuelto en tampón HEPES y se añadió un exceso 1,5 veces molar de reactivo de Ellman's para bloquear el tiol. Al cabo de 30 minutos, se añadió un exceso 10 veces molar de N-metilmaleimida para consumir los tioles del semi-reactivo de Ellman's liberado. Una hora más tarde el péptido protegido con tiol fue marcado radiactivamente con [H^{3}-2,3]-propionato de succinimidilo (H^{3}-NSP) (Amersham). Justo antes de la conjugación, se llevó la solución peptídica a una concentración 50 mM en ditiotreitol y todos los reactivos se separaron en una columna G-10 de 1 x 38 cm (Pharmacia). El pico radiactivo que circulaba en el volumen vacío se reunió. La actividad específica del péptido era aproximadamente 2,5 x 10^{11} cpm/mol. El tiol-péptido marcado radiactivamente se añadió a 4,5 mg de BSA yodoacetilada a una razón molar de 15:1 y el pH se elevó a 7,5 mediante la adición de 5 x tampón HEPES. El volumen final era de 1,2 ml. Tras reaccionar durante la noche, la solución se trató con mercaptoetanol 0,2 mM durante 1 hora y el péptido que no había reaccionado se eliminó en una columna P6DG de 1 x 15 cm equilibrada con PBS. Se determinó que la proporción final de péptido BSA era 6:1. Este producto conjugado péptido-proteína fue acoplado después con dextrano como se ha descrito para la BSA.
Se obtuvieron B-lactoglobulina B, aprotinina, ovoalbúmina (OVA) y lisozima de Sigma. La seralbúmina bovina (BSA) era de Pentex o Amresco (calidad Biotech). La proteína vacuna fue una generosa donación de la Dra. Isabella Quarkyi (Georgetown University Medical School).
Se prepararon TNP-OVA y TNP-BSA añadiendo un exceso 4-12 veces molar (de una solución de partida 0,25 M) de TNBS en NaBorato 0,1 M, NaCl 0,2 M, NaAzida al 0,02%, pH 9,1) a una solución de 50 mg/ml de OVA o BSA respectivamente en el mismo tampón. Tras reaccionar durante la noche a 4ºC, la proteína se sometió a diálisis en tampón HEPES. Se determinó la proporción a partir de la DO a 366 nm y corrigiendo la contribución de hapteno a 280 nm. (DO280 = 0,32 x DO 366).
IV. Se determinaron los títulos de IgG1, e IgM anti-TNP en suero mediante ELISA. Este análisis se realizó de un modo similar al análisis de los autores de la presente invención descrito previamente, excepto que en este caso los autores de la presente invención utilizaron anticuerpos conjugados con fosfatasa alcalina y los pocillos de microtitulación se revistieron durante 2 horas con 10 \mug/ml de TNP Ficoll® para medir los anticuerpos anti TNP o con 10 \mug/ml de BSA para medir los anticuerpos anti-BSA. También se revistió con otras proteínas de ensayo a una concentración de 10 \mug/ml. Tras el tratamiento con anticuerpos conjugados con fosfatasa alcalina, los pocillos de las placas de microtitulación fueron rellenados con 200 \mul de fosfato de p-nitrofenilo (1 mg/ml en Tris 1 M, pH 9,8), incubados durante 1/2 a 1 hora a la temperatura ambiente, y la A_{405} de la solución en cada pocillo fue determinada con un Titertek Multiskan Spectrophotometer (Flow Laboratories, McLean, VA). Los títulos para el ELISA fueron calculados como se ha descrito previamente (Ver Current Protocols in Immunology, Vol. I, ed. J. Coligan, A. Kruisbeck, D. Margulies, E. Shevach y W. Strober. J. Wiley & Sons, 1991).
Ejemplo 1
Las vacunas actuales tienen muchas deficiencias ya que incluyen una escasa inmunogenicidad, la necesidad de constructos de vacuna separados para cada antígeno y el requerimiento de múltiples inyecciones de refuerzo para lograr una buena producción de anticuerpos. Se utilizó un polímero de elevado peso molecular (HMWP) como portador para el antígeno primario para proporcionar el esqueleto de la vacuna. Si bien se podía utilizar cualquier HMWP, Dex fue la elección para estos estudios. El HMWP Dex fue utilizado para proporcionar una presentación de elevada densidad del portador secundario para las células T y las células B y para proporcionar un portador para muchos otros antígenos diferentes (Figuras 1 & 2).
Cuando los antígenos se acoplan con el portador primario HMWP la respuesta de anticuerpos a estos antígenos se intensifica (Fig. 3 y 4). Si bien una única inyección de BSA no conjugada logra una respuesta de anticuerpos no detectable, la BSA conjugada con Dex logra una buena respuesta de anticuerpos a 10-500 \mug/dosis (Figura 3). La conjugación de diferentes proteínas con Dex, el portador primario, las hace más intensamente inmunogénicas (Figura 4). Estos estudios incluían antígenos virales (Vaccinia-Dex), antígenos y toxinas bacterianos (toxina de cólera-Dex) y otras sustancias que eran escasamente inmunogénicas. Por lo tanto, un segundo portador de proteína podría incluir una amplia variedad de proteínas tales como BSA o toxinas/toxoides tales como cólera, tétanos o difteria. El peso molecular del portador primario con Dex puede variar, pero debe ser > 70 kDa y es una molécula portadora muy eficaz a un tamaño de aproximadamente 500 y 2.000 kDa (Figura 12). Sin embargo, el tamaño óptimo para HMWP puede variar dependiendo del portador primario específico utilizado. El HMWP Dex es un polisacárido y los ratones carentes de sistema inmune no organizan una respuesta inmune contra él. Sin embargo, tanto los ratones normales como los carentes de sistema inmune producen igualmente buenas respuestas inmunes para la BSA acoplada con Dex (Fig. 10). Esto demuestra que Dex como portador primario puede simplemente proporcionar una matriz para presentar uno o varios antígenos a las células en una disposición multivalente y a su vez no necesita ser inmunogénico. Estos estudios también muestran que se podría utilizar una variedad de proteínas como portadores secundarios y que el portador secundario podría servir como antígeno para la vacuna y como portador para antígenos no inmunogénicos.
Ejemplo 2
La composición de vacuna portadora dual se demuestra completamente utilizando TNP (Figura 5). Los ratones son inmunizados con TNP acoplado con el portador secundario BSA (TNP-BSA) y TNP-BSA también es acoplado con el portador primario HMWP (Dex). La conjugación de TNP con el portador secundario BSA solo no intensificaba la respuesta de anticuerpos a TNP. Sin embargo, el acoplamiento del complejo portador secundario/TNP con el portador primario para proporcionar [(TNP-BSA)-Dex] intensificaba la inmunogenicidad de TNP. Además BSA (el portador secundario) era inmunogénico cuando se acoplaba con Dex solo o con Dex y TNP. Por lo tanto utilizando la composición de vacuna portadora dual un HMWP puede portar el portador secundario y otros antígenos pueden ser acoplados con el portador secundario. Se lograrán anticuerpos para el portador secundario así como se volverán inmunogénicos el antígeno conjugado con él y las moléculas hapténicas no inmunogénicas. Esto podría ser particularmente importante si el portador secundario es un antígeno para el cual el anticuerpo proporcionara inmunidad protectora, tal como el toxoide del tétanos o la difteria. Esta composición de vacuna también permite conjugar múltiples antígenos no relacionados con el portador primario (Figura 7). El TNP fue acoplado con OVA (el portador secundario) y después conjugado con Dex (el portador primario). Asimismo se conjugó directamente LYS independientemente con Dex. Se lograron anticuerpos para cada uno de los antígenos. Así el esqueleto de HMWP de esta composición de vacuna es adecuado para producir vacunas multivalentes con una disposición de proteínas portadoras secundarias y/o muchos antígenos diferentes acoplados con el portador secundario. (vacuna multiportadora/multiantígeno).
Ejemplo 3
En los ejemplos previos se demostró que la composición de vacuna portadora dual era eficaz con una variedad de antígenos. Este dato se apoya y se amplía utilizando un antígeno peptídico derivado de parásito (malaria) (p74). Se demostró que la composición de vacuna portadora dual era significativamente mejor que el antígeno peptídico sólo o el péptido conjugado con el portador secundario BSA (Figura 6). Se logró una buena respuesta de anticuerpos para este pequeño antígeno sólo después de que el producto conjugado P74-BSA se acoplara con el portador primario HMWP (Dex). Sin embargo, el portador HMWP simplemente proporciona una matriz para presentar los antígenos a las células y no necesita ser inmunogénico (Fig. 10).
Ejemplo 4
Para que una vacuna intensifique eficazmente la inmunidad durante un largo período de tiempo, es importante una buena respuesta al refuerzo. Tras una primera inmunización con la vacuna portadora dual, se puede lograr una respuesta de anticuerpos de refuerzo incluso con el portador secundario no conjugado (Figura 8). Además, cuando se empleaba un portador haptenado se observaba una respuesta de refuerzo tanto al TNP como al portador secundario BSA. El análisis adicional muestra que la respuesta de anticuerpos primaria y secundaria al portador secundario BSA es de larga duración (Figura 9).
Ejemplo 5
Se analizó el producto conjugado BSA-Dex para evaluar el efecto del estado inmune del huésped y de la ruta de inmunización sobre la respuesta de anticuerpos. Tanto los ratones inmunológicamente maduros como las crías inmunológicamente inmaduras fueron eficazmente inmunizadas con el complejo de portador primario y secundario demostrando que la vacuna portadora dual logrará una respuesta de anticuerpos incluso en crías y lactantes jóvenes con una inmunidad inmadura (Figura 11). La respuesta de anticuerpos a la BSA (el portador secundario) es similar en ratones tanto adultos como crías. Además las rutas IV, IM, y SC lograban todas una buena respuesta de anticuerpos a la BSA (Figura 13). La ruta de administración de la vacuna no está limitada por lo tanto a cualquier tipo de inoculación individual y no está limitada por la edad o el estado inmunológico del receptor de la vacuna. Sin embargo, el tamaño del HMWP es crítico para proporcionar un constructo de vacuna eficaz. Por ejemplo para el HMWP Dex el tamaño deber ser >70.000 Da, preferiblemente >500.000 Da (Fig. 12).
Ejemplo 6
La preparación de una vacuna portadora múltiple se ilustra en la Figura 14. En este sistema se emplean tres portadores secundarios, dos de los cuales se conjugan adicionalmente con otro radical. El PRP de H. influenzae se acopla a un portador secundario de toxoide del tétanos, un derivado peptídico de malaria se acopla a una proteína de la membrana externa meningocócica, y una proteína viral (tal como la proteínas RSV-F) se deja sin conjugar. Después uno o más de cada uno de los portadores secundarios se conjuga con el esqueleto de polímero de elevado peso molecular.
Ejemplo 7
Se puede diseñar una vacuna para que porte múltiples especificidades bajo cualquiera de los siguientes cuatro enfoques:
(1) Dos o más constructos, constando cada uno de diferentes portadores secundarios conjugados con los mismo portadores primarios;
(2) Dos o más constructos diferentes, constando cada uno del mismo portador primario y secundario pero diferentes radicales;
(3) Dos o más constructos diferentes, constando cada uno de diferentes portadores primarios, los mismos portadores secundarios, y diferentes radicales; y
(4) Dos o más constructos diferentes, constando cada uno de diferentes portadores primarios y secundarios y diferentes radicales.
Ejemplo 8
Como se muestra en los Diagramas 2 y 3 de más abajo, la inmunización con dextrano-conjugado con TNP-BSA intensificaba enormemente muchos parámetros de la respuesta de anticuerpos, incluyendo la magnitud, la persistencia de la respuesta etc. (Diagrama 2). De un modo similar, la inmunización con BSA-dextrano o TNP-BSA dextrano intensificaba enormemente muchos parámetros de la respuesta de anticuerpos (Diagrama 3).
Diagrama 2
Comparación de las respuestas de anticuerpos logradas por TNP-dextrano y BSA-dextrano o TNP-BSA dextrano
inmunizado con:
TNP-BSA TNP-BSA dextrano
(no coadyuvante)
títulos anti-TNP
A. Magnitud de
la respuesta ____ ++++
B. Persistencia de
la respuesta ____ ++++
C. Capacidad de
reforzar la
respuesta secundaria ____ ++++
D. Capacidad de
inmunizar neonatos ____ ++++
E. Capacidad de
inmunizar ratones
carente de
células B ____ ++++
F. Actividad de los
anticuerpos ____ ++++
G. Capacidad de
inmunizar
subcutáneamente ____ ++++
Diagrama 3
Comparación de las respuestas de anticuerpos logradas por TNP-dextrano, BSA-dextrano o TNP-BSA dextrano
inmunizado con:
TNP-dextrano BSA-dextrano o
TNP-BSA dextrano
título anti-TNP Título anti-TNP o BSA
A. Magnitud de
la respuesta + ++++
B. Persistencia de
la respuesta 7-10 d 40-60 d
C. Capacidad de
reforzar la
respuesta secundaria ___ ++++
D. Capacidad de
inmunizar neonatos ___ ++++
E. Capacidad de
inmunizar ratones
carente de
células B ___ ++++
F. Actividad de los
anticuerpos Baja Alta
G. Capacidad de
inmunizar
subcutáneamente + ++++
Ejemplo 9
Se prepararon tres constructos duales con dextrano como primer portador y toxoide de la difteria (DT), toxoide de pertussis (PT), y toxoide del tétanos (TT) como portadores secundarios. Estos productos conjugados fueron analizados primero en cuanto a la concentración de dextrano y proteína para evaluar el éxito de la conjugación. Después de eso, los productos conjugados se inyectaron en dos grupos de ratones para determinar la respuesta inmune a los constructos inmunogénicos portadores duales.
A. Materiales y métodos 1. Animales
Ratones hembra destetados (CD-1), 4 semanas de edad, fueron adquiridos de Charles River, Wilmington, MA.
2. Reactivos
Se recibió suero de ratón anti-TT hiperinmunizado del Dr. S.C. Szu, Laboratory of Developmental and Molecular Immunity, NIH, Bethesda. Las IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 e IgM de ratón purificadas así como los productos conjugados con fosfatasa alcalina de IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM anti-ratón de cabra eran de Fisher Biotechnology, Springfield, NJ. La IgG, la IgG anti-ratón de cabra purificada (específica de Fab), la seralbúmina bovina (BSA), la avidina de clara de huevo, Brij-35 y el sustrato de la fosfatasa eran de Sigma Chemical Co., St. Louis, MO. El toxoide del tétanos (TT), el toxoide de pertussis (PT) y el toxoide de la difteria (DT) cromatográficamente purificados fueron proporcionados por Massachussets Public Health Biological Laboratories (MPHBL) tanto para preparar los portadores secundarios como para revestir las placas de ELISA como se describe más abajo.
Se preparó suero de ratón de referencia anti-dextrano inyectando en los ratones producto conjugado de dextrano-toxoide de pertussis (PT) (preparado como se ha descrito antes) dos veces a intervalos de 31 días y desangrando los ratones 2 semanas después de la segunda inyección. Los sueros de varios ratones fueron reunidos en volúmenes iguales. De un modo similar, se preparó suero de ratón de referencia anti-DT inyectando en los ratones DT o DP adsorbido en fosfato de aluminio (proceso de adsorción descrito más abajo).
B. Preparación de proteínas portadoras secundarias
MPHBL preparó las proteínas portadoras secundarias, DT, PT, y TT, mediante los siguientes mecanismos de purificación y destoxificación:
El toxoide del tétanos se preparó purificando primero la toxina del tétanos mediante fraccionamiento con sulfato de amonio y filtración en gel a través de Sephadex G-50 y cromatografía en columna de DEAE. La toxina del tétanos purificada fue destoxificada después con formalina. El toxoide de la difteria se preparó destoxificando primero la toxina de la difteria con formalina y purificando después DT mediante fraccionamiento con sulfato de amonio y cromatografía en columna de DEAE. El toxoide de pertussis se preparó purificando la toxina de pertussis mediante cromatografía de afinidad y destoxificando después la toxina de pertussis con tetranitrometano.
Utilizando un dispositivo Centricon 30 (de Amicon), se concentró el toxoide de la difteria a 10 mg/ml, y el toxoide del tétanos a 4,7 mg/ml, y el toxoide de pertussis a 2,8 mg/ml.
Se añadió un volumen 1/9 de producto concentrado de tampón HEPES (HEPES 0,75 M, EDTA 10 mM, pH 7,5) a cada solución de toxoide y se añadió lentamente una razón molar 12-14 de SATA (Calbiochem) de una solución de partida 25 mM o 0,1 M en dimetilformamida (DMF). Quizás debido a que muchos de los grupos amino fácilmente accesibles estaban bloqueados durante el procedimiento de destoxificación, fueron necesarias proporciones mayores de reactivo con respecto a proteína que las descritas antes en Métodos con el fin de obtener buenos rendimientos de producto conjugado. Al cabo de una hora a la temperatura ambiente, los toxoides transformados fueron intercambiados en tampón acetato sobre una columna P6DG (BioRad) y la proteína del volumen vacío fue concentrada utilizando un Centricon 30. Antes de que se pudiera concentrar el toxoide de pertussis, se aclaró inicialmente la turbidez mediante la adición de 1/9 volumen de tampón HEPES para aumentar el pH. En la preparación posterior, el toxoide de pertussis se intercambió en tampón HEPES a pH 7,5. La solución permanecía clara.
B. Preparación del portador primario
El portador primario se preparó como se ha descrito antes en Métodos. En resumen, el aminoetilcarbamil-dextrano de elevado peso molecular (aprox. 2 millones de daltons), ligeramente radiomarcado con tritio, fue yodoacetilado con SIAP e intercambiado en tampón acetato (acetato de sodio 10 mM, EDTA 2 mM, NaCl 0,1 M, azida de sodio al 0,02%) y concentrado.
C. Conjugación de toxoides con dextrano
Los productos conjugados fueron preparados utilizando una variación de la química de la heteroligadura referida antes (Brunswick y col., Mongini y col.). En resumen el toxoide acetil-tioacetilado se añadió a una solución sometida a vórtice débilmente del dextrano yodoacetilado. El pH se elevó y el tiol se desprotegió mediante la adición de aproximadamente 1/9 el volumen de tampón HEPES concentrado conteniendo hidroxilamina 0,5 M. La solución contenía cantidades aproximadamente iguales de toxoide y dextrano basándose en el peso. Las concentraciones finales de toxoide eran de 5 mg/ml (DT), 1,1 mg/ml (PT) y 5,9 mg/ml (TT).
Tras reaccionar durante la noche a 4ºC, los productos conjugados se trataron durante 1 hora con mercaptoetanol 0,2 mM seguido de yodoacetamida 10 mM durante 10 minutos. Los productos conjugados fueron fraccionados después mediante filtración en gel sobre una columna de 1 x 58 cm o bien de S300SF o bien S400SF (Pharmacia), equilibrada con PBS. El pico de volumen vacío que contenía el producto conjugado se reunió después y se filtró en condiciones estériles utilizando un filtro Millex HV (0,45 \mum) (Millipore).
De los tres toxoides, el de pertussis respondía particularmente bien al protocolo de conjugación. Como se muestra en la Fig. 15, un elevado porcentaje de toxoide de pertussis se convertía en un producto conjugado de elevado peso molecular con dextrano. Se estima que un máximo de 15 grupos amino, y probablemente muchos menos, eran modificados en el toxoide.
D. Determinación del éxito de la conjugación
Las concentraciones de proteína de cada uno de los tres productos conjugados fueron determinadas mediante DO 280 y confirmadas mediante el análisis BCA micro (Pierce) utilizando los toxoides purificados obtenidos de MPHBL como patrones. Se determinaron las concentraciones de dextrano a partir de la actividad específica del AECM dextrano tritiado. Estos resultados se exponen más abajo:
Proteína Proteína/dex Proteína/dex
(mg/ml) (Molar) (p/p)
1. Dtxd-dex 0,34 12 0,6
2. Ptxd-dex 0,73 14 0,7
3. Ttxd-dex 0,43 22 1,1
La proporción peso/peso de proteína con respecto a dextrano indica que los métodos de conjugación acoplaban con éxito los toxoides al dextrano. Estos resultados fueron confirmados mediante análisis sobre placas de Ouchterlony.
D. Adsorción de productos conjugados sobre fosfato de aluminio
Además de los productos conjugados fluidos correspondientes a cada toxoide, se adsorbieron muestras de cada producto conjugado sobre el coadyuvante fosfato de aluminio. Cada muestra fue adsorbida sobre 4 mg/ml de gel de fosfato de aluminio recién preparado (pH 6,0) elaborado mediante precipitación de cloruro de aluminio y fosfato trisódico. Se añadió timerosal a una concentración final del 0,01% (p/v). Las preparaciones fueron sacudidas durante la noche a la temperatura ambiente.
E. Inmunización de ratones
Se llevaron a cabo dos grupos de experimentos de inmunogenicidad.
1. Para el primer experimento, se inyectaron grupos de 5 ratones con diversos productos conjugados en forma de fluido o adsorbido sobre el coadyuvante fosfato de aluminio. Las dosis de los diversos productos conjugados para los ratones fueron seleccionadas basándose en la dosis de proteína que produciría respuesta de anticuerpos a las proteínas en los ratones. La Figura 16 muestra las dosis de diversos productos conjugados inyectados en ratones. Se utilizaron las mismas dosis para los productos conjugados fluidos y adsorbidos en fosfato de aluminio. Para las preparaciones adsorbidas, la dosis de fosfato de aluminio para cada ratón era de 0,4 mg/ml, que es 1/5 de la dosis humana de coadyuvante utilizada en el MPHBL para el toxoide del tétanos adsorbido. Se inyectó subcutáneamente a cada ratón 0,1 ml de producto conjugado fluido o adsorbido a las concentraciones apropiadas.
Los ratones fueron desangrados a las 2, 4 y 8 semanas y los sueros fueron separados. Los sueros de un grupo fueron reunidos en volúmenes iguales.
2. El segundo experimento se realizó para estudiar la respuesta inmune de los ratones a la misma dosis de dextrano presente en diversos productos conjugados y para evaluar el efecto de una dosis de refuerzo del producto conjugado. Se inyectaron subcutáneamente dos veces, separadas por un intervalo de 31 días, 2 \mug por ratón de dextrano en diversos productos conjugados o sin dextrano como se muestra en la Figura 19a. Los ratones fueron desangrados 4 semanas después de la primera inyección y 2 semanas después de la segunda inyección. Los sueros fueron separados y los sueros de los ratones individuales fueron analizados en cuanto a los anticuerpo anti-dextrano o anti-proteína mediante ELISA, como se describe más abajo.
F. Análisis de inmunoabsorción con enzima ligada
El suero de ratón de referencia anti-dextrano fue normalizado para los respectivos isotipos de IgG, IgM e IgG específicos del antígeno. El suero de ratón de referencia anti-toxoide del tétanos hiperinmunizado, el suero de ratón de referencia anti-toxoide de la difteria y el suero de ratón de referencia anti-toxoide de pertussis fueron normalizados para la respectiva IgG específica del antígeno mediante el método mostrado en W.D. Bollinger y J.W. Boslego, A general approach to standardization of the solid-fase immunoassay for quantitation of class-specific antibodies, J. Immunol. Methods 1981, 46, 129-140 con modificaciones.
El ELISA se realizó en placas de microtitulación de alta unión y lavado fácil (Corning Glass Works, Corning, NY) revestidas con 100 \mul de antígeno concreto, aquí TT, PT o DT, diluido hasta 5 \mug/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,2 a la temperatura ambiente durante la noche. Las placas fueron lavadas entre todas las etapas con PBS conteniendo between 20 al 0,05%. Se realizaron diluciones seriadas al doble del suero de referencia y los sueros de ensayo en PBS conteniendo Brij 35 al 0,1% y BSA al 0,5% (PBB) en las placas. Las placas se mantuvieron a la temperatura ambiente durante 2 horas y se lavaron. Se añadieron a las respectivas placas las IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 o IgM anti-ratón de cabra marcadas con fosfatasa alcalina diluidas en PBS. De nuevo las placas se mantuvieron a la temperatura ambiente durante 2 horas y se lavaron. Finalmente se añadieron a cada pocillo 100 \mul de sustrato de fosfatasa diluido a 1 mg/ml en tampón dietanolamina 1 M-cloruro de magnesio 0,5 mM, pH 9,8. Las placas fueron leídas a una longitud de onda de 405 nm en un lector ELISA (Titertek Multiscan Plus, Flow Laboratories). Los anticuerpos específicos de los antígenos (\mug/ml) fueron extrapolados a partir de la curva patrón utilizando la transformación de Rodbard. Para el ELISA anti-dextrano, las placas fueron revestidas inicialmente con avidina durante la noche y después se añadió 1 \mug/ml de solución de dextrano biotinilado en PBS a la temperatura ambiente durante 1 hora. Este ELISA dio resultados muy similares de IgG anti-dextrano para 30 reservas de suero a los de las placas revestidas con dextrano directamente. Por lo tanto, la mayoría de los experimentos fueron llevados a cabo revistiendo las placas con dextrano directamente.
G. Resultados 1. La inyección individual
A diferencia de los ratones utilizados en los ejemplos anteriores, este experimento estaba enfocado a ratones jóvenes que, como se muestra en la Introducción y en la Figura 11, no responden bien al dextrano no conjugado y otros antígenos independientes de T. Como saben los expertos en la técnica, los niños pequeños menores de dos años de edad tampoco responden bien a los antígenos independientes de T de tipo 2. Estos resultados, por lo tanto, son más directamente aplicables a los niños pequeños.
Estos ratones lograban anticuerpos en dos semanas y persistían a elevados niveles durante la menos 8 semanas. Como se muestra en la Fig. 16, los principales isotipos logrados eran IgG1, IgG3, e IgGM. Además, los ratones a los que se había inyectado PT-dex lograban bajos niveles de IgG2a e IgG2b. En la Fig.16 también se demuestra que los ratones que recibían productos conjugados adsorbidos sobre fosfato de aluminio manifestaban niveles superiores de anticuerpos IgG e IgM que los que recibían las preparaciones fluidas.
Además, las respuestas de anticuerpos a los portadores secundarios, DT, TT, y PT, fueron evaluadas y se muestran en la Fig. 17(a), (b), y (c). En cada caso, los ratones que recibían los productos conjugados mostraban anticuerpos para el componente proteico en al menos dos semanas y la persistencia de esos anticuerpos era de al menos ocho semanas. De un modo similar, la absorción a fosfato de aluminio intensificaba la respuesta inmune.
Por otra parte, estos datos demuestran claramente una respuesta anamnéstica para cada componente del producto conjugado dual.
Como se esperaba con el toxoide el tétanos inmunogénico, había una respuesta de anticuerpos tanto a las formas conjugadas como no conjugadas. Sin embargo, con los toxoides de la difteria y de pertussis escasamente inmunogénicos, había un marcado aumento de la respuesta inmune a la forma conjugada.
Juntas, las Figs. 16 y 17 demuestran la intensificación inmune dual y recíproca lograda con los productos conjugados de la invención.
Más significativamente, la actividad neutralizadora del toxoide del tétanos fue evaluada como se muestra en la Fig. 18. Se considera que un nivel en sangre de 0,01 unidades anti-toxina (Au) o mayor proporciona protección frente a la toxina del tétanos. Así, el producto conjugado lograba niveles protectores de anticuerpo contra el toxoide del tétanos en cuatro semanas para el fluido y en dos semanas para el producto conjugado absorbido sobre el coadyuvante fosfato de aluminio a dosis de 0,1 y 1,0 \mug.
2. La inyección de refuerzo
Como se muestra en la Fig. 19(a), se inyectaron en ratones cantidades constantes de dextrano con respecto a cantidades variables de proteína. Este diagrama también demuestra que cada producto conjugado lograba una respuesta inmune frente al portador secundario (el toxoide). La Fig. 19(b) muestra que el dextrano no conjugado sólo logra niveles muy bajos de IgG3 e IgM después de dos dosis en comparación con los niveles de anticuerpo anti-dextrano logrados por los diversos productos conjugados. Como se observa en el primer experimento, el producto conjugado dextrano-PT inducía niveles relativamente mayores de IgG2a e IgG2b que otros productos conjugados.
Juntas, las partes (a) y (b) de la Fig. 19 demuestran la intensificación inmune dual y recíproca lograda con los productos conjugados de la invención, es decir, la conjugación del portador secundario proporcionaba una respuesta intensificada al portador primario y vice-versa.
Ejemplo 10
A continuación se ilustra la síntesis del constructo inmunogénico portador dual con toxoide de difteria, pertussis y tétanos, que son portadores secundarios proteicos clínicamente relevantes, conjugados con el carbohidrato (polirribosil riboitol fosfato "PRP") de tipo b de haemophilus influenzae portador primario de elevado peso molecular, que también tiene relevancia clínica. Obsérvese que todos los componentes individuales ya han sido aprobados para su uso en humanos.
A. Preparación de los portadores secundarios
Se concentraron los toxoides utilizando un Centricon 30. El toxoide de la difteria (DT) fue concentrado a 5,25 mg/ml, el toxoide de pertussis (PT) a 2,6 mg/ml y el toxoide del tétanos (TT) a 3,2 mg/ml. Se añadió 1/9 del volumen de un tampón HEPES concentrado. Se añadió SPDP (asequible de Sigma o Calbiochem) a una solución sometida a vórtice suave de DT a un exceso molar de 16:1, y a TT a un exceso molar de 20:1. Para PT, se añadió el reactivo SATA a una razón 11:1 (a partir de una solución de partida en DMP) a una solución sometida a vórtice suave.
Los dos reactivos, SATA y SPDP, rinden diferentes tioles protegidos, con diferentes ventajas conocidas por los expertos en la técnica. En resumen, el producto de SATA es un acetiltiol, que es desprotegido lentamente con hidroxilamina, mientras el producto de SPDP es un grupo tio-piridilo. Este último es rápidamente eliminado con DTT para rendir un producto con una absorbancia, permitiendo la fácil cuantificación del número de grupos tiol. SATA puede ser el reactivo de elección cuando el carbohidrato está yodoacetilado, puesto que el reactivo desprotector de tiol, la hidroxilamina, es compatible. Se puede preferir SPDP cuando el carbohidrato es transformado con maleimida y el reactivo desprotector debe ser eliminado antes de la conjugación.
Al cabo de 1-2 horas, las soluciones de DT y TT fueron intercambiadas en tampón acetato sobre una columna P6DG, concentradas y llevadas a una concentración 50 mM en ditiotreitol (DTT) durante 20 minutos. La solución de PT se llevó a una concentración 50 mM en hidroxilamina durante 30 minutos y después se eliminaron las sales en una columna P6DG equilibrada con tampón HEPES, ya que PT puede precipitar a pH bajo. Los toxoides tiolados fueron concentrados con un Centricon 30. La razón molar de tiol con respecto a toxoide era de 6,5 para DT y de 4,7 para TT. No se determinó para PT.
B. Preparación del portador primario
Se transformó el carbohidrato (polirribosil riboitol fosfato "PRP") de tipo b de haemophilus influenzae de elevado peso molecular con dihidrazida adípica (PRP-AH) utilizando el método del bromuro de cianógeno seguido del fraccionamiento por tamaños mediante filtración en gel. (Cruse J.M., Lewis R.E. Jr ed., Conjugate vaccines in Contributions to Microbiology and Immunology, vol. 10, 1989). El producto final tenía un peso molecular medio de 300 kDa y aproximadamente 16 grupos hidrazida/300 kDa de carbohidrato. El PRP-AH fue una donación de Massachusetts Public Health Biological Laboratories (MPHBL), Boston, Mass.
El PRP-AH fue transformado adicionalmente según el siguiente método. Se utilizaron cantidades superiores de reactivo de entrecruzamiento y/o tiempos de incubación más largos para compensar la reducción de reactividad del grupo hidrazida en comparación con la del radical amino de AECM-dextrano.
Para la mayoría de las preparaciones, el PRP-AH se volvió reactivo con tiol mediante maleimidación con el reactivo GMBS (Calbiochem) en lugar de mediante yodoacetilación (con SIAP) debido a que la concentración de maleimida puede ser fácilmente determinada a partir de su absorbancia a 304 nm (coeficiente de extinción - 620 M^{-1} (Kitagawa, T., y col. J. Biochem. 94:1160 (1983)). Adicionalmente, el grupo maleimida es (1) más reactivo que el grupo yodoacetilo, permitiendo tiempos de reacción más cortos y (2) hidroliza y por tanto no necesita ser sofocado necesariamente con mercaptoetanol, una ventaja para las proteínas sensibles al tiol. La desventaja del grupo maleimida es su volumen relativo, que podría introducir epítopos adicionales, y que la hidrólisis reduce el número de grupos activos, lo que podría disminuir el grado de entrecruzamiento. Sin embargo, se seleccionaron reactivos y condiciones concretos para mejorar la estabilidad (v.g., una alquilmaleimida, elevada concentración de reactivo y tiempo de reacción corto y etapa de eliminación de la sal a pH 5). Los productos conjugados con PRP-AH también han sido preparados utilizando el reactivo de yodoacetilación, SIAP, como el utilizado con los productos conjugados con dextrano.
Un ejemplo de maleimida-PRP es como sigue. Se añadieron 40 \mul del reactivo de maleimida GMBS (0,1 M en DMF) (CalBiochem) a una solución sometida a vórtice de 2 mg de PRP-AH en 157 \mul de tampón HEPES (concentración final: HEPES 75 mM, EDTA 1 mM, azida al 0,02%, pH 7,5). Al cabo de 2 horas a la temperatura ambiente, la solución se sometió a eliminación de las sales en una columna P6DG (BioRad) equilibrada con tampón acetato (acetato de sodio 10 mM, NaCl 0,1 M, EDTA 2 mM, azida de sodio al 0,02%) y el volumen vacío fue concentrado a 0,47 ml con un Centricon 30 (Amicon). Utilizando un coeficiente de extinción de 620 M^{-1} a 304 nm, se estimó que la concentración de maleimida era 225 \muM. Se estimó que el contenido en hidrazida residual utilizando un análisis TNBS (coeficiente de extinción = 17400 M^{-1} a 498 nm para las hidrazidas), era de menos de 4 \muM. Así, se evaluó que la transformación era esencialmente completa. En la preparación del producto conjugado con el toxoide de pertussis, el PRP transformado fue sometido a eliminación de sales con una columna equilibrada con tampón HEPES a pH 7,5 en lugar de acetato.
C. Conjugación de los portadores secundarios con PRP
Se añadieron DT y TT tiolados a soluciones agitadas de PRP-maleimida desoxigenada en atmósfera de nitrógeno y el pH se elevó mediante la adición de 1/9 del volumen de tampón HEPES concentrado y se agitó durante la noche a la temperatura ambiente. El PT tiolado se añadió a una solución sometida a vórtice de PRP-maleimida y se dejó durante la noche a 4ºC. Tras reaccionar durante la noche, las soluciones se llevaron a una concentración 0,2 mM en mercaptoetanol durante una hora (para asegurar la eliminación incompleta de la maleimida no hidrolizada) seguido de 10 minutos en yodoacetamida 10 mM (para consumir todos los tioles libres). Las soluciones fueron fraccionados mediante filtración en gel sobre una columna S300SF o S400SF para eliminar el PRP y el toxoide no conjugados. El producto conjugado de elevado peso molecular se concentró con un Centricón 30 y se filtró en condiciones estériles.
Como se muestra en la Fig. 20, el toxoide de la difteria se convertía con mucho éxito en un producto conjugado con PRP de elevado peso molecular. Se estimaba que menos de siete grupos amino fueron modificados en el toxoide.
La composición de los productos finales era:
Toxoide Toxoide/PRP (molar) Toxoide
(para PRP = 300 kDa) (peso/peso)
DT 4,5 0,8
PT 5,4 2,9
TT 3,9 1,9
Estos datos, concretamente las medidas de peso/peso, demuestran el éxito de la conjugación.
Los autores de la presente invención creen que este método difiere de otros productos conjugados conocidos en (1) detalles de la química, principalmente el uso de un enlace tio-éter y (2) el uso de un PRP de elevado peso molecular, (3) el uso de toxoides purificados cromatográficamente y (4) en particular, el uso de un toxoide de pertussis acelular.
Otras realizaciones de la invención se harán evidentes para los expertos en la técnica a partir de las consideración de la memoria y de la práctica de la invención descrita aquí. Se pretende que la memoria y los ejemplos puedan ser considerados como meros ejemplos, estando indicado el alcance y el espíritu reales de la invención por las siguientes reivindicaciones.

Claims (21)

1. Una composición inmunogénica portadora dual, que comprende:
al menos un portador primario que comprende una molécula que tiene un peso molecular igual o mayor de 70 kDa y que tiene características de antígeno independiente de T;
al menos un portador secundario que comprende un antígeno dependiente de T conjugado químicamente con el portador primario; y
al menos un radical,
donde dicho radical, siendo distinto del portador secundario, se selecciona del grupo formado por haptenos, antígenos, y combinaciones de los mismos, y se conjuga o bien con un portador primario o bien con un portador secundario;
donde la composición intensifica una respuesta de anticuerpos al portador primario, al portador secundario, y al radical.
2. La composición inmunogénica portadora dual de la reivindicación 1, donde al menos un portador primario se selecciona del grupo formado por dextrano y un polisacárido microbiano.
3. La composición inmunogénica portadora dual de la reivindicación 2, donde al menos un portador primario es dextrano.
4. La composición inmunogénica portadora dual de la reivindicación 2, donde al menos un portador primario es un polisacárido microbiano.
5. La composición inmunogénica portadora dual de la reivindicación 4, donde al menos un portador primario es polirribosil-ribitol-fosfato de tipo b de H. influenzae.
6. La composición inmunogénica portadora dual de la reivindicación 4, donde al menos un portador primario es un polisacárido capsular neumocócico.
7. La composición inmunogénica portadora dual de la reivindicación 1, donde al menos un portador secundario es una proteína o un péptido.
8. La composición inmunogénica portadora dual de la reivindicación 7, donde la proteína o péptido se selecciona del grupo formado por proteínas o péptidos virales, bacterianos, parásitos, animales y fúngicos.
9. La composición inmunogénica portadora dual de la reivindicación 8, donde la proteína o péptido se selecciona del grupo formado por el toxoide de la difteria, el toxoide de pertussis, el toxoide del tétanos, la proteína de la membrana externa bacteriana, la proteína de la membrana externa viral, y combinaciones de los mismos.
10. La composición inmunogénica portadora dual de la reivindicación 1, donde al menos un radical es acoplado con un portador primario.
11. La composición inmunogénica portadora dual de la reivindicación 1, donde al menos un radical es acoplado químicamente con un portador secundario.
12. La composición inmunogénica portadora dual de la reivindicación 1, donde al menos un portador primario es conjugado con uno o más portadores secundarios.
13. La composición inmunogénica portadora dual de la reivindicación 1, donde al menos uno de los portadores secundarios químicamente conjugados con un portador primario es acoplado adicionalmente al menos con un hapteno.
14. La composición inmunogénica portadora dual de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente un coadyuvante.
15. La composición inmunogénica portadora dual de cualquiera de las reivindicaciones 1-14, donde al menos un portador primario tiene un peso molecular igual o mayor de 300 kDa.
16. La composición inmunogénica portadora dual de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y 6-14, donde al menos un portador primario tiene un peso molecular igual o mayor de 500 kDa.
17. Una vacuna que comprende:
una cantidad inmunoestimuladora de al menos una de las composiciones inmunogénicas portadoras duales de las reivindicaciones 1 a 16, y
un portador farmacéuticamente aceptable.
18. El uso de la vacuna de la reivindicación 17 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un paciente donde la vacuna se administra al paciente en una cantidad inmunoestimuladora.
19. El uso de la reivindicación 18, donde la vacuna se administra intravenosamente, intramuscularmente, o subcutáneamente.
20. Un método para preparar anticuerpos contra enfermedades causadas por bacterias, ricketsias, virus, parásitos, hongos, o productos químicos, que comprende las etapas de:
inmunizar un huésped con la vacuna de reivindicación 17 para producir anticuerpos dirigidos contra el inmunógeno, y
aislar los anticuerpos de las células B del donador.
21. Una composición inmunoterapéutica, que comprende los anticuerpos preparados mediante el método de la reivindicación 20.
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