ES2263199T3 - Analogos del factor x con un sitio de ruptura de proteasa modificado. - Google Patents
Analogos del factor x con un sitio de ruptura de proteasa modificado.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A ANALOGOS DEL FACTOR X QUE TIENEN UNA MODIFICACION EN EL AREA DEL FACTOR XA QUE OCURRE NATURALMENTE, ACTIVANDO EL LUGAR DE LA EXCISION, REPRESENTADO DICHA MODIFICACION UN LUGAR DE PROTEASA QUE NO SE EXCINDE NATURALMENTE EN ESTA ZONA DE LA SECUENCIA DEL FACTOR X. LA INVENCION SE REFIERE IGUALMENTE A PREPARADOS QUE CONTIENEN ANALOGOS INNOVADORES DEL FACTOR X Y A LOS PROCEDIMIENTOS PARA SU PRODUCCION.
Description
Análogos del factor X con un sitio de ruptura de
proteasa modificado.
La invención se refiere a análogos de factor X
con una modificación en la zona del péptido de activación, a un
preparado que contiene análogos de factor X según la invención y a
un procedimiento para la producción de análogos de factor X de
cadena simple y de cadena doble.
Una vez iniciado el proceso de coagulación de la
sangre, la cascada de coagulación se produce gracias a la activación
secuencial de diferentes proenzimas (zimógenos) sanguíneas en sus
formas activas, las serina-proteasas. Entre ellas se
encuentran, entre otras, el factor XII/XIIa, el factor XI/XIa, el
factor IX/IXa, el factor X/Xa, el factor VII/VIIa y
protrombina/trombina. La mayoría de estas enzimas sólo son activas
en estado fisiológico cuando están asociadas a un complejo en la
superficie de membrana. En muchos de estos procesos intervienen
iones calcio. La coagulación de la sangre se produce fácilmente o
bien según un proceso intrínseco, en el que todos los componentes
proteínicos están presentes en la sangre, o bien por un proceso
extrínseco, en el que el factor tisular de la membrana celular tiene
un papel crítico. El cierre de la herida tiene lugar finalmente
mediante la segmentación de fibrinógeno en fibrina por la acción de
la trombina.
El complejo protrombinasa es responsable de la
activación de protrombina en trombina. La trombina es una importante
enzima que puede actuar tanto a modo de procoagulante como a modo de
anticoagulante. El complejo protrombinasa, en el que intervienen
entre otros el factor Va (como cofactor) y el factor Xa (como
serina-proteasa), se agrupa en una asociación
dependiente del Ca en la superficie de los fosfolípidos. Está en
discusión si el componente catalítico del complejo protrombinasa es
el factor Xa.
El factor X (factor Stuart/Prower) es una
glicoproteína de coagulación dependiente de la vitamina K que se
puede activar mediante la cascada de coagulación de la sangre tanto
intrínseca como extrínseca. El producto de traducción primaria del
factor X (pre-pro-FX) posee 488
aminoácidos y es sintetizado en el hígado o en células de hepatoma
humano primero en forma de una proteína precursora de 75 kD de
cadena simple.
En el plasma, el factor X se encuentra, en gran
parte, en forma de molécula de cadena doble (Fair y col., 1984,
Blood 64:194-204).
Durante la biosíntesis, después de la
segmentación de la presecuencia mediante una peptidasa señal (entre
Ser 23/Leu 24) y del propéptido (entre Arg 40/Ala 41), la molécula
de factor X de cadena simple se segmenta mediante procesamiento y
eliminación del tripéptido Arg 180-Lys
181-Arg 182 en forma de cadena doble, consistente en
una cadena ligera de aproximadamente 22 kD y otra cadena pesada de
aproximadamente 50 kD unidas entre sí a través de un puente
disulfuro (Figura 2). Por ello, el factor X circula en el plasma en
forma de una molécula de cadena
doble.
doble.
Durante el proceso de coagulación sanguínea, el
factor X del zimógeno inactivo se convierte en el factor Xa de
proteasa activo mediante proteolisis limitada, pudiendo tener lugar
la activación del factor X en el factor Xa en uno de 2 complejos
unidos a la membrana: en el complejo extrínseco factor VIIa/factor
tisular o en el complejo intrínseco factor
VIIIa-factor
IXa-fosfolípido-Ca o "complejo
tenasa" (Mertens y col., 1980, Biochem. J.
185:647-658). La segmentación proteolítica entre los
aminoácidos Arg 234/Ile 235 conduce a la liberación de un péptido de
activación con una longitud de 52 aminoácidos
N-terminal de la cadena pesada y, en consecuencia, a
la formación de la enzima activa, el factor Xa. El centro catalítico
del factor Xa está localizado en la cadena pesada.
La activación a través del complejo factor
VIIa-FT (extrínseco) conduce a la formación del
factor Xa\alpha (35 kD) y del factor Xa\beta (31 kD) y, en caso
de pequeñas concentraciones de factor VIIa en el complejo, también
se genera un polipéptido de 42 kD. La formación del factor
Xa\alpha se produce por una segmentación en Arg 234/Ile 235 de la
cadena pesada y constituye la activación del factor X en el factor
Xa. Probablemente, la aparición del factor Xa\beta es el resultado
de una segmentación autocatalítica en Arg 469/Gly 470 en el
C-terminal de la cadena pesada del factor Xa\alpha
y de la segmentación de un péptido de 4,5 kD. El factor Xa\beta,
al igual que el factor Xa\alpha, posee actividad catalítica. Sin
embargo, se ha comprobado que por segmentación del factor
Xa\alpha en el factor Xa\beta se produce un sitio de unión
plasminógeno y presentando el factor Xa\beta, en caso dado,
actividad fibrinolítica o interviniendo como cofactor en la
fibrinólisis. No obstante, la conversión del factor Xa\alpha en
factor Xa\beta es más lenta que la formación de trombina, lo que
impide que se inicie una fibrinólisis antes de que se forme un
coágulo de sangre (Pryzdial y col., 1996, J. Biol. Chem.
271:16614-16620; Pryzdial y col., 1996, J. Biol.
Chem. 271:16621-16626).
El polipéptido de 42 kD resulta de procesar, en
el C-terminal, la cadena pesada entre Arg 469/Gly
470 sin procesamiento previo entre Arg 234/Ile 235. Al igual que un
fragmento de factor Xa\gamma formado por proteólisis Lys 370, este
producto intermedio no posee ninguna actividad catalítica (Mertens y
col., 1980, Biochem. J. 185:647-658; Pryzdial y
col., 1996, J. Biol. Chem. 271:16614-16620).
La activación del factor X en la vía intrínseca
se cataliza a través del complejo factor IXa-factor
VIIIa. Durante la activación se obtienen los mismos productos de
procesamiento, pero el producto factor Xa\beta se obtiene en mayor
medida que otros productos de procesamiento de factor X (Jesty y
col., 1974, J. Biol. Chem. 249:5614).
El factor X se puede activar in vitro,
por ejemplo mediante veneno de víbora Russell (RVV) o tripsina
(Bajaj y col., 1973, J. Biol. Chem. 248:7729-7741) o
mediante activadores fisiológicos purificados como complejo FVIIa/FT
o complejo factor IXa/factor VIIIa (Mertens y col., 1980, Biochem.
J. 185:647-658).
En la mayoría de los casos, los productos de
factor X plasmáticos comerciales contienen una mezcla de factor
Xa\alpha y factor Xa\beta, dado que después de la activación de
factor X para formar factor Xa se produce primero factor Xa\alpha,
que se segmenta a su vez en el factor Xa\beta en un proceso
autocatalítico. Para preparar un producto de factor Xa uniforme y de
alta integridad molecular, en el documento EP 0 651 054 se proponía
la activación de factor X con RVV durante un período de tiempo más
largo, de modo que el producto final resultante contenía
esencialmente factor Xa\beta. Tanto los productos secundarios, por
ejemplo factor Xa\alpha, como las proteasas se eliminaban a
continuación mediante varios pasos cromatográficos.
El ADNc para el factor X ha sido aislado y
caracterizado (Leytus y col., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., USA,
82:3699-3702; Fung y col., 1985, Proc. Natl. Acad.
Sci., USA, 82:3591-3595). El factor X humano se ha
expresado in vitro en diferentes tipos de células como
células renales embrionarias o células CHO (Rudolph y col., 1997,
Prot. Expr. Purif. 10: 373-378; Wolf y col.; 1991,
J. Biol. Chem. 266:13726-13730). Sin embargo, se ha
comprobado que, en la expresión recombinante de factor X humano, el
procesamiento en la posición Arg 40/Ala 41 se produce de forma
ineficiente, al contrario que en la situación in vivo, y se
forman diferentes N-terminales en la misma cadena de
factor X (Wolf y col., 1991, J. Biol. Chem.
266:13726-13730). El factor X recombinante (rFX) se
activó in vitro mediante RVV para formar factor Xa
recombinante (rFXa) o se expresó directamente el rFXa, habiéndose
eliminado el péptido de activación desde el aminoácido 183 hasta el
aminoácido 234 y sustituyéndose por un tripéptido para posibilitar
su procesamiento directamente en forma de rFXa de cadena doble.
Aproximadamente un 70% de rFX purificado se procesó en cadena ligera
y cadena pesada, mientras que el 30% restante representaban rFX de
cadena simple de 75 kD. La expresión directa de rFXa condujo a la
formación de factor Xa activo, peor también a productos intermedios
inactivos. Wolf y col. (1991, J. Biol. Chem.
266:13726-13730) también comprobaron una actividad
reducida del factor X recombinante, que atribuyeron a la peor
capacidad de activación del rFX por RVV y a la población inactiva de
proteínas y polipéptidos de la molécula precursora de cadena simple.
En particular, detectaron una alta inestabilidad de rFXa en la
expresión por células recombinantes, que atribuyeron al alto índice
de auto-
proteolisis.
proteolisis.
Eby y col. (1992, Blood 80 (Supl. 1): 1214 A)
introdujeron un codón de terminación en la posición Gly 430 de la
secuencia de factor X para analizar la función del péptido
C-terminal del factor Xa\alpha. Sin embargo, no
hallaron ninguna diferencia entre el índice de activación de factor
Xa (FXa\alpha) con péptido b y el de un mutante de deleción sin
péptido \beta (FXa\beta).
El factor Xa es un componente importante del
complejo protrombinasa y, por consiguiente, podría utilizarse para
el tratamiento de pacientes con trastornos de la coagulación
sanguínea, por ejemplo en casos de hemofilia.
En particular, el tratamiento con concentrados
de factores producidos a partir de plasma de pacientes hemofílicos
con deficiencia de factor VIII o de factor IX con frecuencia se
complica en terapias prolongadas debido a la formación de
anticuerpos inhibidores contra dichos factores. Por ello se
desarrolló una serie de alternativas para tratar a pacientes
hemofílicos con factores con una actividad bypass. Por
ejemplo, se propuso la utilización de concentrado de complejo de
protrombina, complejo de protrombinasa parcialmente activado (APPC),
factor VIIa o FEIBA. Por ejemplo, FEIBA® o Autoplex® son preparados
comerciales con actividad bypass de factor VIII (FEIBA).
FEIBA contiene aproximadamente cantidades comparables de factor II,
factor VII, factor IX, factor X y FEIBA, pequeñas cantidades de
factor VIII y factor V y trazas de factores de coagulación activados
como trombina y factor Xa o factores de actividad similar al factor
X (Elsinger, 1982, Activated Prothrombin Complex Concentrates. Ed.
Mariani, Russo, Mandelli, pp. 77-87). Elsinger
apunta principalmente a la importancia de una actividad "similar
al factor Xa" en FEIBA. Giles y col. (1988, British J.
Haematology 9:491-497) mostraron la actividad
bypass del factor VIII para una combinación de factor Xa
purificado y fosfolípidos en un modelo animal.
Por todo ello existe una gran necesidad y una
serie de campos de aplicación diferentes para el factor X/Xa o
proteínas análogas al factor X/Xa, bien individualmente o bien como
componente de un complejo de coagulación en la terapia
hemostática.
La vida media del factor Xa en comparación con
el zimógeno es muy reducida tanto in vivo como in
vitro. Por ejemplo, el factor X se puede conservar de forma
estable en glicerina durante 18 meses, mientras que el factor Xa
sólo permanece estable durante 5 meses bajo las mismas condiciones
(Bajaj y col., 1973, J. Biol. Chem. 248:7729-2241),
si se conserva en glicerina a 4ºC después de 8 meses muestra una
reducción de la actividad en más de un 60% (Teng y col., 1981,
Thrombosis Res. 22: 213-220). La vida media del
factor Xa en suero es de sólo 30 segundos.
Debido a la inestabilidad del factor Xa se
propuso la administración de preparados de factor X (US 4,501,731).
Sin embargo, en caso de hemorragias con peligro de muerte, en
particular en caso de pacientes hemofílicos, la administración de
factor X es ineficaz ya que, debido a la falta del "complejo
tenasa" funcional en la vía de coagulación sanguínea intrínseca,
es imposible lograr una activación suficiente del factor X para
formar factor Xa, y la activación a través de la vía extrínseca con
frecuencia tiene lugar demasiado despacio como para lograr un efecto
rápido. Además, en el caso de los pacientes hemofílicos, hay una
cantidad suficiente de factor X, pero éste presenta una actividad
protrombinasa 1.000 veces menor que el factor Xa. En estos casos es
necesario administrar directamente factor Xa activado, en caso dado
junto con fosfolípidos, tal como se describe en Giles y col. (1988.
British J. Haematology 9:491-497), o con otros
factores de coagulación, por ejemplo con actividad bypass de
factor VIII.
Hasta ahora, para producir factor Xa a partir de
factor X, en la mayoría de los casos, la activación se realizaba a
través de activadores no fisiológicos de origen animal como RVV o
tripsina, debiendo tenerse la seguridad absoluta de que el producto
final estaba completamente libre de dichas proteasas. Como ya se ha
mencionado anteriormente, durante la activación de factor X para
formar factor Xa también se forman numerosos productos intermedios
parcialmente inactivos (Bajaj y col., 1973, J. Bio. Chem.
248:7729-7741, Mertens y col., 1980, Biochem. J.
185:647-658). La presencia de estos productos
intermedios conduce a una disminución de la actividad específica del
producto y, en caso dado, también a productos intermedios que pueden
actuar como antagonistas de la serina-proteasa
activa. Por consiguiente, para preparar un producto puro y uniforme
de alta actividad específica siguiendo los métodos convencionales se
requieren procedimientos costosos de activación y purificación
cromatográfica.
Por consiguiente, el objetivo de la presente
invención consiste en poner a disposición un preparado que contenga
un polipéptido con actividad de factor X/Xa que presente una alta
estabilidad y que se pueda activar para formar factor Xa sin
utilizar ninguna de las proteasas habituales, en particular aquellas
de origen animal como RVV o tripsina, por ejemplo. Otro objetivo
consiste en poner a disposición un preparado farmacéutico con
actividad bypass de factor VIII.
Según la invención, el objetivo se resuelve
poniendo a disposición un análogo de factor X que presenta una
modificación de la activación de factor Xa en la zona del sitio de
ruptura presente de forma natural. La modificación en la zona del
sitio de ruptura de activación consiste en un sitio de
reconocimiento o procesamiento nuevo para una proteasa que
normalmente no segmenta el polipéptido en dicho sitio, sitio que no
está presente de forma natural en esta posición en el
polipéptido.
El análogo de factor X según la invención
presenta una modificación en particular en el péptido de activación
que se segmenta cuando el factor X se activa en el factor Xa. La
modificación afecta como mínimo a un aminoácido dentro de la
secuencia de aminoácidos del péptido de activación del factor X. La
modificación se encuentra especialmente en el área
C-terminal del péptido de activación y consiste en
como mínimo una sustitución de al menos un aminoácido entre las
posiciones Gly 228 y Arg 234 de la secuencia de aminoácidos del
factor X. La posición de los aminoácidos se refiere a la numeración
de acuerdo con la secuencia representada en la Figura 1 comenzando
con Met 1 y terminando con Lys 488.
Preferentemente, la modificación en el análogo
de factor X según la invención consiste en sustituir un sitio de
procesamiento de factor VIIa o factor IXa, presente en ese sitio,
por un sitio de ruptura alternativo de otra proteasa. La
modificación puede consistir en una sustitución de como mínimo un
aminoácido o en una inserción de una secuencia de péptidos que
constituye un sitio de reconocimiento de proteasa o de un sitio de
ruptura. Preferentemente, la modificación en el análogo de factor X
según la invención es tal que constituye una secuencia de
reconocimiento o una secuencia de ruptura para una proteasa del
grupo de las endoproteasas, por ejemplo Kexin/Kex2, furina/PACE,
PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7 (tal como se describe en Barr y
col., 1991, Cell 66:1-3 o en el documento US
5,460,950), de las serina-proteasas, por ejemplo
factor XIIa, factor XIa, factor IIa, factor Xa o de calicreína, o un
derivado de estas proteasas.
La modificación se elige preferentemente de tal
modo que el procesamiento mediante una de estas proteasas conduzca a
un polipéptido correspondiente al factor Xa nativo, en esencia
análogo a la secuencia de factor Xa natural y que también presente
actividad de factor Xa.
Para lograr un procesamiento óptimo, en
determinados casos puede ser necesario sustituir además el
aminoácido Ile 235. No obstante, después de la activación,
preferentemente se debería conservar el aminoácido isoleucina
NH_{2}-terminal de la cadena pesada, ya que este
aminoácido desempeña una función esencial en la formación de la
cadena de unión del sustrato (Watzke y col., 1995, Molecular Basis
of Thrombosis and Hemostasis, ed. Katherine High & Harold
Roberts). Los análogos de factor X según la invención presentan una
diferencia estructural, en particular a nivel de aminoácidos, en
comparación con la secuencia del factor X nativo, pero poseen una
capacidad de activación comparable a la del factor X natural o
actividad de factor Xa después de la activación.
La invención pone a disposición, por ejemplo,
diversos análogos de factor X que presentan una modificación en el
péptido de activación con respecto a la secuencia del factor X
natural y una especificidad de proteasa modificada.
Las modificaciones se pueden encontrar en una o
más posiciones en la zona entre los aminoácidos Gly 228 y Arg 234, y
en caso dado Ile 235, con respecto a la secuencia de factor X,
numerado desde Met 1 hasta Lys 488 según la Figura 1. Las
sustituciones de aminoácidos se pueden encontrar en las posiciones
Ile 235 (R1), Arg 234, Thr 233, (R2), Leu 232 (R3), Asn 231 (R4),
Asn 230 (R5) y Asp 229 (R6), pero Arg 234 preferentemente
permanece
invariable.
invariable.
Los análogos de factor X según la invención
contienen preferentemente una secuencia de factor X Gly
228-R6-R5-R4-R3-R2-Arg
234, siendo R1 = Ile, Val, Ala, Ser o Thr; R2 = Thr, Pro, Gly, Lys o
Arg; R3 = Leu, Phe, Lys, Glu, Met, Gln, Ser, Val, Arg o Pro; R4 =
Asn, Asp, Ile, Ser, Met, Pro, Thr, Lys o Arg; R5 = Asn, Lys, Ser,
Glu, Ala, Gln, His o Arg; y R6 = Asp, Phe, Thr, Arg, Leu o Ser.
Algunas formas de realización preferentes de los
análogos de factor X según la invención son análogos de factor X que
presentan una modificación con
- a)
- R1 = Val, R2 = Thr, R3 = Phe, R4 = Asp, R5 = Asn y en caso dado R6 = Phe (Figura 2 A), y es procesado por el factor XIa;
- b)
- R1 = Ser, R2 = Arg, R3 = Thr, R4 = Leu (Figura 2 B), y es procesado por FIIa;
- c)
- R1 = Ile, R2 = Pro, R3 = Lys, R4 = Ile y en caso dado R5 = Lys y/o R6 = Thr (Figura 2 C) o
- R1 = Ile, R2 = Thr, R3 = Ser, R4 = Thr y en caso dado R5 = Lys y/o R6 = Thr (Figura 2 I), y son procesados por el factor XIIa;
- d)
- R1 = Ile, R2 = Thr, R3 = Met, R4 = Ser y en caso dado R5 = Ser y/o R6 = Leu (Figura 2 D), y es procesado por calicreína;
- e)
- R1 = Ile, R2 = Gly, R3 = Gln, R4 = Pro y en caso dado R5 = Lys y/o R6 = Ser (Figura 2 H) o
- R1 = Ile, R2 = Thr, R3 = Lys y R4 = Met (Figura 2 E) o
- R1 = Ile, R2 = Gly, R3 = Glu y R4 = Ile (Figura 2 F),
- y son procesados por el factor Xa;
- f)
- R1 = Ile, R2 = Lys, R3 = Arg, R4 = Arg y en caso dado R5 = Glu y/o R6 = Leu o
- R1 = Ile, R2 = Thr, R3 = Val, R4 = Arg y en caso dado R5 = Ala y/o R6 = Leu o
- R1 = Ile, R2 = Arg, R3 = Val, R4 = Arg y en caso dado R5 = Gln y/o R6 = Leu o
- R1 = Ile, R2 = Arg, R3 = Arg, R4 = Arg y en caso dado R5 = His y/o R6 = Leu o
- R1 = Ile, R2 = Lys, R3 = Pro, R4 = Arg y en caso dado R5 = Asn y/o R6 = Leu o
- R1 = Ile, R2 = Lys, R3 = Arg, R4 = Ile y en caso dado R5 = Arg y/o R6 = Leu o
- R1 = Ile, R2 = Lys, R3 = Ser y R4 = Arg o
- R1 = Ile, R2 = Thr, R3 = Val y R4 = Arg o
- R1 = Ile, R2 = Lys, R3 = Leu y R4 = Arg (véanse todos en Figura 2 G);
siendo procesados los mencionados
en f) por una endoproteasa bibásica como furina, PACE, Kexin/Kex2,
furina/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7 o un derivado de una
de estas
proteasas.
En las Figuras 2 A-I se indica
una selección posible de modificaciones y sustituciones de
aminoácidos que conducen a un cambio de la especificidad de
proteasa.
Las modificaciones se pueden realizar, por
ejemplo, mediante mutagénesis dirigidas in vitro o por PCR, o
mediante otros métodos de ingeniería genética conocidos en el estado
actual de la técnica que sean adecuados para modificar
específicamente una secuencia de ADN con el fin de realizar
sustituciones de aminoácidos selectivamente.
Preferentemente, la activación del análogo de
factor X según la invención en un factor Xa nativo o en un análogo
de factor Xa se realiza según la invención mediante una proteasa
seleccionada de entre el grupo de las endoproteasas, por ejemplo
Kexin/Kex2, furina/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, del
grupo de las serina-proteasas, por ejemplo factor
XIIa, factor XIa, factor Xa, factor IIa o de calicreína, o de un
derivado de estas protea-
sas.
sas.
Una de las dificultades de la producción de
factor Xa activo radica en su inestabilidad, dado que, debido a la
autocatálisis, además de factor Xa\alpha y factor Xa\beta
también se forman otros productos intermedios inactivos. Por ello,
para preparar factor X/Xa activo esencialmente inalterado o
moléculas análogas al factor X/Xa sería deseable obtener sólo
aquellas proteínas que conducen a productos finales estables.
Es sabido que un sitio de ruptura preferente
para el procesamiento de factor Xa\alpha (Fxa\alpha) para formar
factor Xa\beta (Fxa\beta) se encuentra entre Arg 469/Gly 470. De
acuerdo con investigaciones de Eby y col. (1992, Blood. Vol. 80,
Suppl. 1, 1214), junto con un péptido
carboxi-terminal prominente (restos aminoácidos
476-487) de factor X se encuentra otro péptido más
corto (restos aminoácidos 474 a 477) formado por autocatálisis del
factor Xa\alpha.
Los análogos de factor X según la invención en
caso dado presentan otras modificaciones para focalizar un
procesamiento selectivo de factor X inalterado para formar factor Xa
esencialmente activo, sin obtenerse además productos intermedios de
procesamiento inactivos.
Por consiguiente, de acuerdo con una forma de
realización especial, el análogo de factor X según la invención
presenta otra modificación en el área C-terminal de
la secuencia de aminoácidos del factor X.
De acuerdo con una forma de realización, un
análogo de factor X del tipo arriba descrito presenta un péptido
\beta intacto (Fx\alpha). El análogo de factor X según la
invención tiene, en particular, una modificación en la zona del
sitio de ruptura del péptido \beta C-terminal que
impide que después de la activación del factor X para formar factor
Xa se produzca una segmentación del péptido \beta del factor X. De
este modo se obtiene una molécula de factor Xa que se puede aislar
hasta en un 100% como molécula de factor Xa\alpha intacta.
La modificación puede consistir en una mutación,
deleción o inserción en la zona de la secuencia de aminoácidos del
factor X entre las posiciones de los aminoácidos Arg 469 y Ser 476,
y en caso dado de Lys 370. No obstante, es preferente una
sustitución de aminoácidos en la que no se pueda producir ningún
plegamiento del polipéptido que influya en la estructura debido al
cambio de aminoácidos y, en consecuencia, en caso dado, de la
función y de la actividad de la proteína.
De acuerdo con una forma de realización, los
análogos de factor X según la invención presentan una sustitución de
uno de los aminoácidos en la posición Arg 469 y/o Gly 470, estando
sustituido Arg 469 preferentemente por Lys, His o Ile, y Gly 470
preferentemente por Ser, Ala, Val o Thr.
Los análogos de factor X según la invención,
además de una mutación en la posición Arg 469 y/o Gly 470, también
pueden presentar otra mutación en las posiciones Lys 370 y/o Lys 475
y/o Ser 476.
Sustituyendo aminoácidos en una de estas
posiciones se evita un procesamiento de factor Xa\alpha en factor
Xa\beta o factor Xa\gamma, ya que la o las secuencias de
procesamiento naturales aparecen modificadas de tal modo que ya no
puede producirse ninguna ruptura, dado el caso autocatalítica, del
péptico carboxi-terminal.
De acuerdo con otra forma de realización, el
análogo de factor X según la invención presenta una deleción del
péptido \beta carboxi-terminal (FX\beta). Los
análogos de factor X de este tipo se pueden producir mediante la
expresión de un ADNc codificador de un análogo de factor X en un
sistema de expresión recombinante, clonándose sólo las secuencias
que codifican los aminoácidos Met 1 a Arg 469.
De acuerdo con otra forma de realización, el
análogo de factor X según la invención presenta una señal de
terminación de traducción en el área C-terminal de
la secuencia del factor X. La señal de terminación de traducción
está preferentemente en una posición que sigue a un aminoácido
C-terminal formado después de un procesamiento
natural. Por consiguiente, la señal de terminación de traducción se
encuentra preferentemente en la posición del aminoácido 470 de la
secuencia del factor X para conservar el Arg 469 terminal del factor
Xa\beta. Para ello, el codón GGC codificador del aminoácido Gly
470 se sustituye por TAA, TAG o TGA.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a análogos del factor X que se activan para formar factor Xa nativo,
o un análogo de factor Xa, mediante tratamiento con la proteasa
correspondiente in vitro. Dependiendo del análogo de factor X
utilizado y activado se obtiene el polipéptido correspondiente al
factor Xa nativo y esencialmente idéntico o un polipéptido que, si
bien presenta actividad de factor Xa, también presenta
modificaciones con respecto a la secuencia de factor Xa nativa que,
sin embargo, no influyen negativamente en su actividad biológica.
Si se activan análogos de factor X que presentan la modificación en
el área del péptido de activación de la secuencia del péptido de
activación, se obtienen exclusivamente polipéptidos correspondientes
a la molécula del factor Xa nativo. Si un análogo de factor X de
este tipo presenta también, en caso dado, una señal de terminación
de traducción en el área C-terminal del péptido
\beta, se obtienen moléculas homólogas al factor Xa\beta. Sin
embargo, si se utiliza un análogo de factor X con una o más
modificaciones dentro de la secuencia del péptido \beta que han
hecho que el péptido \beta no se segmente, se obtiene un análogo
de factor Xa\alpha con una sustitución de aminoácido en el
C-terminal de la molécula.
Los análogos de factor X según la invención
presentan exclusivamente modificaciones que cambian la especificidad
de la capacidad de activación y no influyen en la actividad. Por
ello, en cualquier caso se obtienen moléculas de factor Xa o
análogos de factor X biológicos y funcionalmente activos.
La activación in vitro puede realizarse
mediante una proteasa seleccionada de entre el grupo de las
endoproteasas, por ejemplo Kexin/Kex2, furina/PACE, PC1/PC3, PC2,
PC4, PACE 4, LPC/PC7, del grupo de las
serina-proteasas, por ejemplo factor XIIa, factor
XIa, factor Xa, o de calicreína, o de un derivado de estas
proteasas. No obstante, en el marco de la presente invención se
puede utilizar cualquier proteasa, excepto RVV, tripsina, factor IXa
o factor VIIa, siempre que sea adecuada para procesar el análogo de
factor X según la invención para obtener factor Xa.
De acuerdo con otra forma de realización de la
invención, el análogo de factor X incluye una modificación que
permite la activación in vivo del análogo de factor X para
obtener factor Xa, preferentemente factor Xa nativo. En este
contexto, factor Xa "nativo" significa que el factor Xa
activado, derivado del análogo de factor X según la invención,
presenta la secuencia de aminoácidos correspondiente y homóloga al
factor Xa nativo y posee actividad de factor Xa. La modificación se
elige de tal modo que se produzca un procesamiento de factor X en
factor Xa mediante una proteasa in vivo, es decir presente en
el cuerpo, preferentemente mediante una proteasa presente en la
cascada de coagulación sanguínea. La proteasa puede ser una proteasa
seleccionada de entre el grupo de las
serina-proteasas, por ejemplo factor IIa, factor
XIIa, factor XIa, factor Xa o calicreína. Como ya se ha descrito
anteriormente, algunos análogos de factor X que además de la
modificación en el péptido de activación presentan una modificación
en el área C-terminal de la molécula de factor X
también se activan in vivo formando los análogos de factor Xa
correspondientes.
Aunque por ejemplo Wolf y col. (1991, J. Biol.
Chem. 266: 13726-137309) supusieron que en el
procesamiento del mutante por deleción de factor Xa descrito por
este grupo interviene una endopeptidasa tal como Kex2, furina o
PACE, no dan ningún tipo de indicación sobre la influencia de alguna
de estas proteasas en el procesamiento de factor X. Del mismo modo,
en el documento US 5,660,950 se describe la producción recombinante
de PACE y la utilización de la proteasa para mejorar el
procesamiento de proteínas dependientes de la vitamina K. En una
serie de enumeraciones con otros factores sanguíneos también se
menciona el factor X, pero faltan datos que verifiquen esta
indicación.
En el marco de la presente invención se ha
demostrado, por primera vez inequívocamente, que la proteasa
necesaria para el proceso de maduración del factor X es una
endoproteasa bibásica, en particular furina, presente en forma
endógena. In vivo, la endoproteasa interviene principalmente
en la segmentación de la molécula de factor X de cadena simple para
producir la forma madura, consistente en una cadena pesada y una
cadena ligera. In vitro interviene además en la segmentación
de la secuencia de propéptido de factor X (Ejemplo 2).
Los análogos de factor X según la invención que
presentan un sitio de ruptura de proteasa para una proteasa que no
está presente de forma natural en una célula se segmentan mediante
una reacción de procesamiento selectivo sólo en los sitios que
también se segmentan en el factor X nativo. De este modo se obtiene
una molécula de factor X recombinante que consiste únicamente en la
cadena ligera de 22 kD y la cadena pesada de aproximadamente 50 kD y
no presenta moléculas de factor X inactivo producidas por un
procesamiento no específico. Estas moléculas de factor X
modificadas, al igual que las moléculas de factor X nativas, no son
activadas en factor Xa por la proteasa intracelular. Sólo son
activadas después por las proteasas
correspondientes(preferentemente
serina-proteasas o proteasas relacionadas con la
subtilisina) para formar factor Xa.
Por consiguiente y de acuerdo con una forma de
realización, se pone a disposición un análogo de factor X de cadena
doble.
De acuerdo con una forma de realización
especial, se ponen a disposición análogos de factor X, que
preferentemente se encuentran purificados, en forma de moléculas de
cadena simple. Mediante la expresión de análogo de factor X en una
célula con deficiencia de una proteasa bibásica se obtiene
pro-factor X en forma de una molécula de cadena
simple. La molécula de factor X de cadena simple se caracteriza por
su alta estabilidad e integridad molecular. Hasta ahora no se podían
aislar moléculas de factor X de cadena simple purificadas, dado que
éstas se procesan muy rápidamente en la forma de cadena doble (Fair
y col., 1984, Blood 64:194-204). Los análogos de
factor X de cadena simple recombinantes se pueden procesar en formas
de factor X de cadena doble mediante procesamiento específico y a
continuación activarse para obtener factor Xa o análogos de factor
Xa. Esto se puede llevar a cabo poniendo en contacto una molécula de
factor X recombinante de cadena simple aislada de una célula con
deficiencia de proteasa con una proteasa bibásica, por ejemplo
furina/PACE o Kex2, y procesándola para obtener un análogo de factor
X de cadena doble.
El análogo de factor X de cadena doble se puede
activar para formar factor Xa o análogo de factor Xa. Esto se puede
llevar a cabo, por ejemplo, de la siguiente manera: un análogo de
factor X que presenta un sitio de ruptura específico de furina
mediante una modificación en el área del péptido de activación se
aísla como molécula de cadena simple de una célula con deficiencia
de furina y a continuación se procesa poniéndolo en contacto con una
endoproteasa para obtener una molécula de factor Xa.
Del mismo modo, un análogo de factor X de cadena
simple aislado que presenta una modificación en el péptido de
activación, que posibilita un procesamiento alternativo mediante una
proteasa del grupo de las serina-proteasas o
calicreína, primero se puede segmentar mediante tratamiento con una
endoproteasa bibásica, por ejemplo furina, para obtener una molécula
de factor X de cadena doble, y ésta se puede poner después en
contacto con una serina-proteasa de tal modo que se
produzca una activación en factor Xa o análogo de factor Xa.
Un análogo de factor X aislado de un cultivo
celular en forma de una molécula de cadena doble se puede tratar
directamente con la proteasa específica para su activación.
Un factor Xa o análogo de factor Xa obtenido de
este modo presenta una alta estabilidad e integridad estructural
gracias a la reacción de procesamiento selectiva y dirigida, y está
principalmente libre de productos intermedios de análogos de factor
X/Xa inactivos y productos de descomposición autoproteolíticos.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
al ADN recombinante codificador de los análogos de factor X según la
invención. El ADN recombinante resulta después de la expresión en un
análogo de factor X con una secuencia de aminoácidos correspondiente
al factor X humano, a no ser que presente una modificación que
influya en la especificidad de procesamiento y los productos de
procesamiento, mientras que la actividad de coagulación biológica
permanece esencialmente inalterada.
De acuerdo con otro aspecto también se ponen a
disposición células transformadas que contienen el ADN
recombinante.
Otro aspecto de la invención se refiere a un
preparado que contiene un análogo de factor X purificado o una
proteína precursora de éste, que presenta una modificación en la
zona del sitio de activación de factor Xa presente de forma natural.
La modificación en la zona del sitio de ruptura de activación es un
sitio de reconocimiento o de ruptura nuevo, no presente de forma
natural en el polipéptido en esa posición, para una proteasa que
normalmente no procesa el polipéptido en ese sitio. El preparado
puede consistir en un preparado purificado de análogo de factor X
de cadena simple o de cadena doble, obteniéndose los polipéptidos a
partir de un sistema de cultivo celular después de aislarlos bien
del sobrenadante o de un extracto del mismo. Un análogo de factor X
recombinante prepurificado procedente de un sistema de cultivo
celular se puede purificar adicionalmente mediante procedimientos
conocidos en el estado actual de la técnica. Para ello son
particularmente adecuados los procedimientos cromatográficos como
filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico o
cromatografía de afinidad.
De acuerdo con una forma de realización, el
preparado según la invención contiene el análogo de factor X
preferentemente en forma de molécula de cadena simple aislada. Un
preparado de este tipo se produce de la siguiente manera: un análogo
de factor X obtenido mediante producción recombinante se aísla en
forma de molécula de cadena simple a partir de un sistema celular,
preferentemente de un cultivo de células que carecen de la
endoproteasa que segmenta la cadena simple en las cadenas pesada y
ligera.
De acuerdo con un aspecto especial, el preparado
contiene análogo de factor X de cadena simple con una modificación
que permite una activación in vitro para obtener factor Xa
mediante una de las proteasas seleccionadas de entre el grupo de las
endoproteasas bibásicas, por ejemplo Kexin/Kex2, furina/PACE,
PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7. La activación tiene lugar
poniendo en contacto el análogo de factor X con la proteasa. Debido
al procesamiento natural se produce una segmentación en la forma de
factor X madura y a través de la modificación se produce una
segmentación del péptido de activación, con lo que se forma factor
Xa o el análogo de factor Xa.
El análogo de factor X se puede encontrar en el
preparado según la invención como una molécula de cadena simple bien
como factor X\alpha (FX\alpha) o bien con una deleción del
péptido \beta. El preparado contiene principalmente análogo de
factor X en forma enzimáticamente inactiva con una pureza de como
mínimo el 80%, preferentemente del 90% y en especial del 95%, y no
contiene ningún producto intermedio proteolítico inactivo de análogo
de factor X/Xa.
De acuerdo con otra forma de realización, el
preparado según la invención contiene el análogo de factor X
preferentemente en forma de una molécula de cadena doble aislada.
Para ello, por ejemplo un análogo de factor X, obtenido a partir de
un sistema celular mediante producción recombinante en forma de una
molécula de cadena simple, se segmenta in vitro, es decir,
fuera de la célula, mediante una proteasa, preferentemente una
proteasa bibásica, para obtener la forma de cadena doble. Esto se
puede llevar a cabo mezclando la proteasa directamente con el
sobrenadante del cultivo de los clones que expresan el análogo de
factor, o bien mezclando la proteasa purificada o un sobrenadante de
un cultivo celular que expresa la proteasa en forma recombinante, o
bien mediante cultivo conjunto de clones que expresan análogo de
factor X y proteasa.
Del mismo modo, el sobrenadante del cultivo
celular que contiene el análogo de factor X o el análogo de factor X
purificado se puede poner en contacto con una proteasa inmovilizada,
con lo que se produce un procesamiento en la forma de cadena doble.
En este procedimiento, la proteasa preferentemente está unida a una
matriz y a través de dicha matriz se conduce el sobrenadante de
cultivo celular o un preparado purificado que contiene el análogo de
factor X. No obstante, también se puede concebir la inmovilización
del análogo de factor X mientras que la proteasa está en la fase
móvil. También es posible mezclar los reactantes (análogo de factor
X y proteasa) e incubarlos a lo largo de un período determinado. A
continuación se retira la proteasa de la mezcla, por ejemplo
mediante cromatografía de afinidad.
La forma de cadena doble del análogo de factor X
también se puede obtener, y en caso dado purificar, mediante
coexpresión de la proteasa y del análogo de factor X directamente en
una célula dada.
De acuerdo con una forma de realización especial
de la invención, el preparado contiene un análogo de factor X de
cadena simple o de cadena doble con una modificación que permite una
activación in vitro para obtener factor Xa o análogo de
factor Xa. La activación de análogo de factor X para obtener factor
Xa o análogo de factor Xa puede se puede llevar a cabo poniendo en
contacto el análogo de factor X con una proteasa seleccionada de
entre el grupo de las endoproteasas bibásicas, por ejemplo
Kexin/Kex2, furina/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, del
grupo de las serina-proteasas, por ejemplo factor
XIIa, factor XIa, factor IIa, factor Xa, o de calicreína, o un
derivado de estas proteasas. La proteasa puede estar inmovilizada en
un soporte.
El preparado según la invención puede servir
como material de partida para la producción y obtención del factor
Xa. Para ello, el preparado que contiene análogo de factor X de
cadena simple o doble se pone en contacto, a escala industrial, por
ejemplo con una proteasa, dado el caso inmovilizada, bajo
condiciones que permiten una activación óptima de análogo de factor
X en factor Xa, y se obtiene factor Xa o análogo de factor Xa. A
continuación, el factor Xa/análogo de factor Xa así obtenido se
puede formular mediante métodos generalmente conocidos para obtener
una composición farmacéutica.
De acuerdo con una realización especial, el
preparado que contiene el análogo de factor X de cadena simple o
doble purificado incluye un vehículo fisiológicamente aceptable y en
caso dado está formulado como preparado farmacéutico. La formulación
puede tener lugar de forma conocida en sí y se puede mezclar con un
tampón que contiene sales, como NaCl, CaCl_{2}, y aminoácidos,
como glicina y/o lisina, a un valor pH entre 6 y 8, y formularse
como preparado farmacéutico. El preparado purificado que contiene
análogo de factor X se puede presentar como producto almacenable en
forma de solución acabada, como liofilizado o se puede congelar
hasta su uso definitivo. Preferentemente, el preparado se almacena
en forma liofilizada y se disuelve con una solución de
reconstitución adecuada para obtener una solución visualmente
transparente.
No obstante, el preparado según la presente
invención también se puede poner a disposición como preparado
líquido o en forma de líquido congelado. El preparado según la
invención es especialmente estable, es decir, se puede dejar reposar
en forma disuelta durante largo tiempo antes de su administración.
Se ha demostrado que el preparado según la invención no muestra
ningún tipo de pérdida de actividad durante varias horas e incluso
días.
El preparado según la invención se puede
presentar en un dispositivo adecuado, preferentemente un dispositivo
de administración, en combinación con una proteasa seleccionada de
entre el grupo de las endoproteasas, por ejemplo Kexin/Kex2,
furina/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, el grupo de las
serina-proteasas, por ejemplo factor IIa, factor
XIIa, factor XIa, factor Xa, o de calicreína, o un derivado de estas
proteasas.
El preparado según la invención, que contiene un
análogo de factor X en combinación con una proteasa capaz de activar
el análogo de factor X para obtener factor Xa o análogo de factor
Xa, se puede poner a disposición en forma de un preparado combinado
consistente en un recipiente que contiene una proteasa inmovilizada
en un soporte, dado el caso en forma de minicolumna o de jeringuilla
provista de una proteasa, y un recipiente que contiene el preparado
farmacéutico con análogo de factor X. Para activar el análogo de
factor X, la solución que contiene el análogo de factor X, por
ejemplo, se introduce a presión a través de la proteasa
inmovilizada. En este caso, durante el almacenamiento del
preparado, la solución que contiene el análogo de factor X
preferentemente está separada de la proteasa. El preparado según la
invención se puede encontrar en el mismo recipiente que la proteasa,
estando separados los componentes por una pared de separación
impermeable que se puede retirar fácilmente en caso uso. Las
soluciones también se pueden conservar en recipientes propios y
poner en contacto entre sí poco antes de su uso.
En una forma de realización especial, la
proteasa utilizada para la activación es una serina proteasa que
también interviene de forma natural en la coagulación sanguínea, por
ejemplo factor XIIa o factor XIa, ya que no es necesario separarla
del factor Xa activado antes de la administración, sino que puede
ser administrada con éste.
La activación del análogo de factor X para
obtener factor Xa se puede llevar a cabo poco antes del uso directo,
es decir, antes de la administración al paciente. La activación
puede realizarse poniéndolo en contacto con una proteasa
inmovilizada, o mezclando soluciones que contienen una proteasa por
una parte y análogo de factor X por otra. Por consiguiente, los dos
componentes se pueden conservar en solución separados entre sí y
mezclar después mediante un dispositivo de infusión adecuado, en el
que los componentes entran en contacto entre sí durante su paso por
el mismo, para activar así la molécula correspondiente y obtener
factor Xa o análogo de factor Xa. De este modo, al paciente se le
administra una mezcla de factor Xa y otra
serina-proteasa que ha producido la activación. En
este caso se ha de prestar una atención especial a la dosificación,
dado que mediante la administración adicional de una
serina-proteasa también se activa factor X endógeno,
lo que puede acortar el tiempo de coagulación.
De acuerdo con una forma de realización
preferente, el preparado farmacéutico se presenta en un dispositivo
adecuado, preferentemente un dispositivo de administración, bien en
forma de líquido congelado, bien en forma liofilizada. En este
contexto, un dispositivo de administración adecuado puede consistir
en un cuerpo de jeringuilla de cámara doble tal como se describe en
AT 366 916 o AT 382 783.
De acuerdo con un aspecto de la invención, el
preparado contiene un análogo de factor X con una modificación que
permite la activación in vivo de análogo de factor X para
formar un factor Xa. Los análogos de factor X del preparado según la
invención en particular presentan una modificación que constituye un
sitio de reconocimiento/sitio de ruptura para una proteasa
seleccionada de entre el grupo de las
serina-proteasas, por ejemplo factor XIIa, factor
XIa, factor Xa, o de calicreína, y son segmentados in vivo
por una de las proteasas mencionadas para formar factor Xa nativo o
análogo de factor Xa. Para la aplicación terapéutica son
especialmente ventajosos los análogos de factor X que presentan un
sitio de reconocimiento/ruptura para una proteasa independiente del
complejo de factor VIIa/tejido y el complejo tenasa dentro de la
cascada de coagulación. De este modo, el preparado según la
invención se puede utilizar para la hemostasia en caso de pacientes
con deficiencias de factor IX, factor VII y también factor VIII. En
caso de pacientes que presentan un trastorno de la coagulación
sanguínea debido a una deficiencia de factor XI o factor XII no se
deben utilizar preparados farmacéuticos que contengan análogos de
factor X que se activen a través del factor XIIa o el factor XIa.
Por ejemplo, en caso de una deficiencia de factor XI se podría
utilizar un análogo de factor X con un sitio de ruptura de factor
XIIa.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, el
preparado según la invención contiene, en caso dado como componente
adicional, un factor sanguíneo en forma del zimógeno o una
serina-proteasa activa. En este contexto, como
componente adicional se utilizan preferentemente componentes con
actividad bypass de factor VIII. Entre éstos se encuentran en
particular el factor II, factor VII, factor IX, factor VIII, factor
V y/o las serina-proteasas activas de los mismos. No
obstante, los componentes adicionales también pueden consistir en
fosfolípidos o iones Ca entre otros. De acuerdo con una forma de
realización especial de la invención, el preparado según la
invención contiene como mínimo otro componente con actividad
bypass de factor VIII.
El preparado según la invención se puede
presentar como preparado farmacéutico con actividad de factor Xa en
forma de un preparado de un solo componente o, en combinación con
otros factores, en forma de un preparado multicomponente.
Antes de su elaboración en un preparado
farmacéutico, la proteína purificada se somete a los controles de
calidad habituales y se dispone en una forma adecuada para su
administración terapéutica. En la producción recombinante, el
preparado purificado se analiza en particular en cuanto a la
ausencia de ácidos nucleicos celulares y procedentes del vector de
expresión, preferentemente de acuerdo con un procedimiento tal como
el descrito en el documento EP 0 714 987.
Dado que en principio todo material biológico
puede estar contaminado con gérmenes infecciosos, para producir un
preparado seguro éste se trata, en caso dado, para llevar a cabo una
inactivación o empobrecimiento viral.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención se pone a disposición un preparado que contiene análogo de
factor Xa con alta estabilidad e integridad estructural, que está
principalmente libre de productos intermedios de análogos de factor
X/Xa inactivos y productos de descomposición autoproteolíticos, y
que se puede obtener mediante la activación de un análogo de factor
X del tipo arriba descrito y su elaboración para formar un preparado
correspondiente.
Otro aspecto de la invención se refiere a la
utilización de un preparado del tipo arriba descrito para la
producción de un medicamento. Un medicamento que contenga un análogo
de factor X o análogo de factor Xa según la invención es
especialmente adecuado para el tratamiento de pacientes con
trastornos de la coagulación sanguínea, por ejemplo pacientes
hemofílicos o pacientes que hayan desarrollado anticuerpos
inhibidores contra el factor VIII y/o IX utilizado habitualmente
para el tratamiento, y en particular como preparado con actividad
bypass de factor VIII.
Otro aspecto de la invención se refiere a la
utilización de un ácido nucleico que contiene las secuencias
codificadoras de los análogos de factor X según la invención para la
producción de un medicamento. El ácido nucleico, siempre que
contenga secuencias de control de expresión adecuadas, puede
administrarse como ácido nucleico desnudo, estar integrado en un
vector de expresión recombinante o estar unido a un vehículo, bien
un fosfolípido, bien una partícula viral. El ácido nucleico se puede
utilizar para producir un medicamento especialmente adecuado para el
tratamiento de pacientes con trastornos de la coagulación sanguínea,
por ejemplo pacientes hemofílicos o pacientes hemofílicos con
anticuerpos inhibidores. También es concebible la utilización del
ácido nucleico en terapias
genéticas.
genéticas.
Otro aspecto de la invención se refiere a un
procedimiento para producir los análogos de factor X según la
invención y a un preparado que contiene un análogo de factor X según
la invención. Para ello se introduce una secuencia codificadora de
un análogo de factor X en un sistema de expresión adecuado, y unas
células correspondientes, preferentemente líneas celulares
permanentes, se someten a transfección con el ADN recombinante. Las
células se cultivan bajo condiciones óptimas para la expresión
genética y los análogos de factor X se aíslan del extracto del
cultivo celular o de su sobrenadante. La purificación de la molécula
recombinante se puede llevar a cabo mediante todos los
procedimientos cromatográficos conocidos, como cromatografía de
intercambio de aniones o cationes, de afinidad o inmunoafinidad, o
una combinación de éstos.
Para producir los análogos de factor X según la
invención, el ADNc completo codificador de factor X se clona en un
vector de expresión. Esto se lleva a cabo según técnicas de
clonación en general conocidas. A continuación, la secuencia de
nucleótidos codificadora del factor X se modifica de tal modo que la
secuencia codificadora se varía en la zona del péptido de activación
y en caso dado también en el área C-terminal del
péptido \beta de forma que se puede producir una molécula de
factor X del tipo arriba descrito. Esto se realiza utilizando
métodos de ingeniería genética conocidos en el estado actual de la
técnica, como mutagénesis in vitro dirigida específica, o
deleción de secuencias, por ejemplo mediante digestión de
restricción por endonucleasas e inserción de otras secuencias
modificadas, o mediante PCR. Después, los mutantes de factor X así
producidos se insertan y expresan en un sistema de expresión
adecuado para la expresión recombinante.
Los análogos de factor X según la invención
también se pueden producir mediante síntesis química.
Los análogos de factor X se producen
preferentemente mediante expresión recombinante. La producción por
ingeniería genética se puede llevar a cabo con todos los sistemas de
expresión habituales, por ejemplo líneas celulares permanentes o
sistemas de expresión virales. Las líneas celulares permanentes se
generan integrando de forma estable el ADN extraño en el cromosoma
de la célula huésped, por ejemplo Vero, MRC5, CHO, BHK, 293,
Sk-Hep1, en particular células hepáticas y renales,
o mediante un vector episomal derivado por ejemplo del virus de
papiloma. También se pueden utilizar sistemas de expresión virales,
por ejemplo virus de vaccinia, baculovirus o sistemas retrovirales.
Como líneas celulares se utilizan generalmente Vero, MRC5, CHO, BHK,
293, Sk-Hep1, células glandulares, hepáticas y
renales. Como sistemas de expresión eucarióticos también se pueden
utilizar levaduras, glándulas endógenas (por ejemplo glándulas de
animales transgénicos) y otros tipos de células. Naturalmente,
también se pueden utilizar animales transgénicos para la expresión
de los polipéptidos según la invención o derivados de éstos. Se ha
comprobado que para la expresión de proteínas recombinantes son
especialmente adecuadas las células CHO-DHFR^{-}
(Urlaub y col., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci., USA,
77:4216-4220).
Para la producción recombinante de los análogos
de factor X según la invención también se pueden utilizar sistemas
de expresión procarióticos. Para ello son particularmente adecuados
los sistemas que permiten una expresión en E. coli o B.
subtilis.
Los análogos de factor X se expresan en los
sistemas de expresión correspondientes bajo el control de un
promotor adecuado. En caso de expresión en eucariotas, son adecuados
todos los promotores conocidos como SV40, CMV, RSV, HSV, EBV,
\beta-actina, hGH o promotores inducibles, por
ejemplo promotor hsp o metalotioneína. Preferentemente, los análogos
de factor X se expresan bajo el control del promotor de
\beta-actina en células CHO.
De acuerdo con una forma de realización de la
invención, el procedimiento para producir el preparado según la
invención incluye los siguientes pasos: preparación de un ADN
codificador de un análogo de factor X, transformación de una célula
con el ADN recombinante, expresión del análogo de factor X, dado el
caso en presencia de una proteasa, aislamiento del análogo de factor
X, y en caso dado purificación mediante un procedimiento
cromatográfico.
De acuerdo con una forma de realización del
procedimiento, el análogo de factor X se aísla en forma de una
molécula de cadena doble. Para ello, el análogo de factor X se
expresa en una célula que permite un procesamiento de análogo de
pro-factor X para obtener análogo de factor X de
cadena doble. Preferentemente la célula consiste en una célula que
expresa una proteasa apta para procesar el precursor de factor X,
por ejemplo una proteasa bibásica como furina o un derivado de ésta.
En caso dado, para aumentar o mejorar la eficacia de procesamiento,
la célula se puede modificar de tal modo que se intensifique la
expresión de la proteasa. Esto se puede conseguir, por ejemplo,
mediante coexpresión de una endoproteasa bibásica correspondiente,
por ejemplo furina/PACE, Kex2 o un derivado de éstas. El análogo de
factor X según la invención se puede expresar igualmente en una
célula con una concentración endógena normal o subóptima para el
procesamiento, con lo que se produce un procesamiento incompleto en
la forma de cadena doble. En este caso, siempre que se segregue
análogo de factor X de cadena simple en el sobrenadante celular, el
procesamiento subsiguiente en cadenas pesada y ligera se produce tal
como se ha descrito anteriormente, mediante cultivo conjunto con
células que expresan proteasa o poniéndolo en contacto con una
proteasa, dado el caso inmovilizada. El sobrenadante celular también
se puede bombear a través de una matriz de soporte en la que está
fijada una proteasa, con lo que en el eluato se obtiene análogo de
factor X de cadena doble. Los reactantes también se pueden mezclar
en solución e incubar durante un período determinado para retirar a
continuación las proteasas, por ejemplo a través de una matriz de
afinidad.
A continuación, el análogo de factor X de cadena
doble así obtenido se puede aislar, purificar y almacenar de forma
estable hasta su posterior utilización, tal como se describe más
arriba.
En una forma de realización especial, un análogo
de factor X de cadena doble, dado el caso purificado, se pone en
contacto in vitro con una proteasa seleccionada de entre el
grupo de las endoproteasas, por ejemplo Kexin/Kex2, furina/PACE,
PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, del grupo de las
serina-proteasas, por ejemplo factor XIIa, factor
XIa, factor Xa, factor IIa, o de calicreína, o un derivado de estas
proteasas, bajo condiciones en las que el análogo de factor X se
activa para formar factor Xa nativo o un análogo de factor Xa.
De acuerdo con una forma de realización, la
activación tiene lugar en un paso cromatográfico donde la proteasa
está inmovilizada en un soporte. Para ello, el análogo de factor X
de cadena doble purificado se conduce a través de una matriz en la
que está fijada la proteasa, y a partir del eluato se aísla factor
Xa purificado.
De acuerdo con otra forma de realización, los
componentes se mezclan y la proteasa se separa selectivamente de la
mezcla.
Evidentemente también se puede emplear una
combinación de un procesamiento de análogo de
pro-factor X de cadena simple para obtener la forma
de análogo de factor X de cadena doble y una activación en factor Xa
en un único proceso. Para ello, un análogo de factor X de cadena
simple, o un precursor de éste, se pone en contacto directamente con
una proteasa bibásica, preferentemente furina o un derivado de ésta,
que permita un procesamiento en cadena pesada y en cadena ligera y
una activación para obtener factor Xa. Un análogo de factor X que no
presenta ningún sitio de ruptura para furina o un derivado de ella
en el péptido de activación se pone en contacto, en caso dado, con
otra proteasa diferente de la primera pero que permite una
activación. Las proteasas se pueden encontrar en forma de mezcla,
por ejemplo de furina y factor XIa.
La activación también se puede llevar a cabo
mediante una combinación de los dos pasos a través de dispositivos
conectados directamente entre sí uno detrás de otro, preferentemente
soportes, por ejemplo columnas donde la o las proteasas están
inmovilizadas. En este caso, en el primer soporte se produce una
segmentación del factor X en cadena pesada y cadena ligera y en el
segundo soporte se produce una activación en factor Xa mediante la
proteasa inmovilizada. Los soportes se pueden acoplar entre sí
conectándolos directamente desde la salida de la primera columna a
la entrada de la segunda.
Los especialistas pueden optimizar fácilmente
las condiciones de reacción para la o las reacciones de
procesamiento y para la activación, en función del modo de ensayo,
de las condiciones básicas dadas. Para la duración del contacto es
especialmente importante la velocidad de flujo de los reactantes
presentes. Idealmente, ésta debería oscilar entre 0,01 ml/min y 1
ml/min. Otros parámetros importantes son la temperatura, el pH y las
condiciones de elución. Después del ciclo, el factor Xa activado se
puede purificar adicionalmente, en caso dado, mediante cromatografía
selectiva. Por ello es especialmente ventajosa la realización del
procedimiento en cada caso con una proteasa unida a un soporte, ya
que la disposición de reacción utilizando un soporte,
preferentemente columnas de cromatografía, posibilita la realización
de un paso de purificación adicional.
De acuerdo con otro aspecto de la producción de
un análogo de factor X, el análogo de factor X se aísla en forma de
una molécula de cadena simple. Para ello, el análogo de factor X se
expresa en una célula que no favorezca el procesamiento de la cadena
simple en una cadena ligera y una cadena pesada. Esta célula
presenta, preferentemente, una deficiencia de una endoproteasa
bibásica, por ejemplo Kexin, furina, PACE. Como se ha comprobado en
el marco de la invención, la furina es una de las proteasas
esenciales responsables de la segmentación del factor X en cadena
ligera y cadena pesada. A partir de una célula mutante de este tipo
con deficiencia de endoproteasa se puede aislar análogo de factor X
en forma de una molécula de cadena simple. A continuación, el
análogo de factor X aislado, y dado el caso purificado, se pone en
contacto con una proteasa seleccionada de entre el grupo de las
endoproteasas, por ejemplo Kexin/Kex2, furina/PACE, PC1/PC3, PC2,
PC4, PACE 4, LPC/PC7, bajo condiciones en las que el análogo de
factor X de cadena simple se segmenta en la forma de factor X de
cadena doble. Mediante este procedimiento, los análogos de factor X
según la invención que presentan en la zona del péptido de
activación una modificación que posibilita una segmentación por una
de dichas endoproteasas, se pueden activar, en caso dado poniéndolos
directamente en contacto con la endoproteasa, pasando de análogo de
factor X de cadena simple a factor Xa o análogo de factor Xa.
Los análogos de factor X según la invención que
presentan en la zona del péptido de activación una modificación que
posibilita una segmentación por una serina proteasa o calicreína,
después de su elaboración para formar análogo de factor X de cadena
doble, se ponen en contacto con otra proteasa diferente de la
primera y se activan para obtener análogo de factor Xa.
De acuerdo con un aspecto de la invención,
mediante el procedimiento se obtiene un preparado que contiene
factor Xa activo o un análogo de factor Xa activo cuando un análogo
de factor X producido tal como se describe más arriba se somete a un
paso de activación y el polipéptido activado se procesa para obtener
un preparado purificado que, en caso dado, está formulado como una
composición farmacéutica.
Con los análogos de factor X según la invención,
que se activan formando factor Xa mediante el proceso arriba
descrito, se obtiene factor Xa o análogo de factor Xa purificado de
alta estabilidad e integridad estructural y esencialmente libre de
productos intermedios de factor X/Xa inactivos.
La invención se describe más detalladamente
mediante los siguientes ejemplos y figuras. No obstante, la
invención no está limitada a estos ejemplos de realización
particulares.
El Ejemplo 1 describe la construcción y
expresión de un factor Xr; el Ejemplo 2 describe el procesamiento de
factor Xr en cadena pesada y cadena ligera mediante furina; el
Ejemplo 3 describe el procesamiento de pro-factor X
mediante una proteasa inmovilizada; el Ejemplo 4 describe la
actividad del factor Xr procesado in vitro; el Ejemplo 5
describe la expresión de factor Xr en células con deficiencia de
furina; el Ejemplo 6 describe la construcción y expresión de
análogos de factor Xr; el Ejemplo 7 describe la determinación de los
N-terminales de los productos de procesamiento de
factor X; el Ejemplo 8 describe la expresión y caracterización del
análogo de FX con el sitio de ruptura de furina
Arg-Arg-Lys-Arg/Ile
(rFX^{RRKR/I}); el Ejemplo 9 describe la activación in
vitro de la proteína rFX^{RRKR/I} mediante derivados de
r-furina; el Ejemplo 10 describe la funcionalidad
del análogo de FX recombinante activado in vitro
rFX^{RRKR/I}; el Ejemplo 11 describe la activación in
vitro del análogo de rFX con el sitio de ruptura de FXIa
Asp-Phe-Thr-Arg/Val
para FXIa.
Las figuras muestran:
Figura 1: Secuencia de nucleótidos y aminoácidos
de factor X
Figura 2: Representación esquemática de los
análogos de factor X con sitios de corte de proteasas modificados en
la zona del péptido de activación.
Figura 3: Representación esquemática del vector
de expresión phAct-rFX.
Figura 4: Análisis Western Blot del factor Xr
expresado en células CHO antes y después de la amplificación.
Figura 5: Análisis Western Blot del factor Xr
después de segmentación in vitro con derivados de furina.
Figura 6: Análisis Western Blot de moléculas de
factor Xr expresadas en células que contienen furina y con
deficiencia de furina.
Figura 7: Representación esquemática de
constructos de análogo de rFX/rFXa con modificación
C-terminal en la cadena pesada.
Figura 8: Representación esquemática de los
N-terminales de los productos de procesamiento de
factor Xr de células CHO que contienen furina y con deficiencia de
furina, antes y después del tratamiento con
r-furina.
Figura 9: Análisis Western Blot del factor
r-FX^{RRKR/I} expresado en células CHO.
Figura 10: Análisis Western Blot del factor
r-FX^{RRKR/I} después de activación in
vitro con un derivado de furina.
Figura 11: Análisis Western Blot del factor
r-FX^{DFTR/V} después de activación in
vitro con un derivado de furina.
Los vectores de expresión se elaboraron mediante
técnicas de clonación estándar (Maniatis y col., "Molecular
Cloning" - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, New York, USA, 1983). La producción de
fragmentos de ADN por reacción en cadena de polimerasa (PCR) se
llevó a cabo mediante métodos generales (Clackson y col., 1991, PCR
A practical approach. ED. McPherson, Quirke, Taylor, pp.
187-214).
Para producir FX recombinante (rFX) se aisló
ADNc de FX de un banco de ADNc Lambda hepático humano, de acuerdo
con la descripción de Messier y col. (1991, Gene
99:291-294). A partir de un clon positivo y mediante
PCR con el oligonucleótido #2911
| (5'-ATTACTCGAGAAGCTTACCATGGGGCGCCCACTG-3') | (ID.SEC. Nº 1) |
como cebador 5' y el oligonucleótido #2912
| (5'-ATTACAATTGCTGCAGGGATCCAC-3') | (ID. SEC. Nº 2) |
como cebador 3' se amplificó un
fragmento de ADN que contenía la secuencia codificadora de FX de
1,467 kB y también 39 pb de la región 3' no traducida, flanqueados
por un sitio de corte XhoI en el extremo 5' y un sitio de corte MfeI
en el extremo 3'. Además, a través del cebador #2911 se incorporó la
secuencia ACC delante de la ATG, de modo que se formó una secuencia
de iniciación de traducción Kozak óptima. A continuación, este
producto PCR se clonó como fragmento XhoI/MfeI en el vector de
expresión phAct cortado con SalI y EcoRI. El plásmido de expresión
resultante se denominó phAct-rFX (Figura 3). El
vector de expresión phAct incluye el promotor de
beta-actina humano, 78 pb 5'UTR y también el intrón,
un sitio de corte de clonación múltiple y el sitio de
poliadenilación
SV40.
Para establecer una línea celular que expresara
rFX estable se utilizaron células CHO con deficiencia en dhfr, que
se sometieron a cotransfección con el plásmido de expresión
phAct-rFX y el plásmido marcador de selección
pSV-dhfr. Para todos los demás análisis de expresión
y función, los cultivos celulares se incubaron durante 24 horas en
un medio de selección libre de suero en presencia de 10 \mug/ml de
vitamina K. La expresión de rFX en los clones celulares resultantes
se determinó mediante la cantidad de antígeno (ELISA, Asserachrom,
Boehringer Mannheim) y, a continuación, se caracterizó la proteína
recombinante con SDS-PAGE (Figuras 4 A y B). Como
se puede reconocer en el Western Blot (Figura 4 A), en los clones
iniciales y subclones se encuentra la proteína FX recombinante en
forma de una cadena ligera (LC) de 22 kD y de una cadena pesada (HC)
de aproximadamente 50 kD, que son idénticas a la proteína de factor
X plasmática. Además se puede reconocer una banda de proteína en 75
kD, que corresponde a la molécula de cadena simple (SC) y cuya
presencia ha sido descrita en células CHO sometidas a transfección
con FX (Wolf y col., J. Biol: Chem. 266:13726-13730,
1991) y también en plasma humano (Fair y col., Blood
64:194-204, 1984). Para producir clones con alto
nivel de expresión, los clones iniciales se amplificaron con
cantidades crecientes de metotrexato y a continuación se subclonaron
hasta su estabilización. La expresión se pudo aumentar de
aproximadamente 200-500 ng/10^{6} células o 1
\mug/ml a 78 \mug/10^{6} células o 120 \mug/ml cada 24
horas. El análisis Western Blot de estos sobrenadantes de clones
celulares con alto nivel de expresión (Figura 4 B y Figura 5 A Pista
2) muestra un enriquecimiento de la molécula de rFX de cadena simple
y también la presencia de formas adicionales de la cadena ligera.
Además de la forma de 22 kD de la cadena ligera, que corresponde a
la forma plasmática (completamente carboxilada y sin propéptido),
están presentes otras tres variantes de la cadena ligera con
aproximadamente 21 kD, 22,5 kD y 20 kD. La heterogeneidad de la
cadena ligera en estos clones se pudo atribuir, mediante
secuenciación N-terminal del material recombinante,
a una segmentación incompleta del propéptido (en este caso:
aproximadamente el 50% del material de rFX) y a una
subcarboxilación (en este caso aproximadamente un 50% del rFX). La
proteína de 21 kD es una forma de la cadena ligera que contiene
propéptido subcarboxilado y la proteína de 20 kD es una forma de la
cadena ligera libre de propéptido subcarboxilado, mientras que la
banda de 22,5 kD representa la forma LC completamente carboxilada
pero conteniendo propéptido.
Debido a la similitud de los sitios de ruptura
entre propéptido de factor X/N-terminal de la cadena
ligera (RVTR\downarrowA) y entre cadena ligera/pesada
(RRKR\downarrowS) con la secuencia de reconocimiento de consenso
de furina (RXK/RR\downarrowX), existía la posibilidad de mejorar
in vitro el procesamiento de moléculas de rFX tanto de cadena
simple como las que contenían propéptido mediante derivados de
r-furina. En la literatura se han supuesto proteasas
para los dos pasos de procesamiento, pero no se trata de furinas
(Rehemtulla y col., 1992, Blood 79:2349-2355; Wallin
y col., 1994, Thromb. Res. 1994: 395-403).
Se mezclaron sobrenadantes de cultivo celular de
CHO-rFX y
CHO-r-furina \DeltaTM6xHis
(solicitud de patente EP 0 775 750 A2) y también
CHO-rFX y CHO no transfectado (como control
negativo) en una proporción 1:1 y se incubaron a 37ºC. Antes de la
incubación (t = 0) y después de diferentes períodos de incubación (t
= 2, 4, 6 horas) se examinaron partes alícuotas de las cargas de
reacción mediante análisis Western Blot para determinar el rFX
procesado (Figura 5). La determinación del rFX en los sobrenadantes
de los cultivos celulares se llevó a cabo con un antisuero FX
antihumano (Figura 5 A) o con un anticuerpo monoclonal específico
para la cadena ligera de FX (Figura 5 B).
Al contrario que la mezcla de
CHO-rFX/CHO, la mezcla de
CHO-rFX/CHO-r-furina
ya presentaba un procesamiento casi completo después de dos horas de
incubación a 37ºC (Figura 5 A, Pista 7; Figura 5 B, Pista 8). La
mayor parte del rFX de cadena simple se había transformado en la
forma de cadena ligera y cadena pesada. En el área de la cadena
ligera ya sólo se hallaron las formas procesadas libres de
polipéptidos de 22 kD (forma carboxilada) y 20 kD (forma
subcarboxilada) en una proporción de aproximadamente 50:50. Esta
proporción se puede mejorar a favor de la forma carboxilada
optimizando las condiciones del cultivo celular. La segmentación
correcta de la pro-secuencia entre
Arg-1 y Ala+1 y la homogeneidad del
N-terminal de la cadena ligera se determinaron
mediante secuenciación N-terminal. En el experimento
de control, en el que se mezcló CHO-rFX con
sobrenadantes de CHO, no se observó ninguna modificación del patrón
de banda de rFX después de 6 horas de incubación (Figura 5A, Pista
5; Figura 5B, Pista 6). De este modo se demostró que la
r-furina es biológicamente activa en el sobrenadante
de células CHO y que puede realizar tanto el procesamiento del
propéptido como de la cadena pesada/ligera de rFX.
Para determinar si un sustrato se puede
segmentar mediante un derivado de r-furina unido a
una columna se investigó si como matriz de columna en lugar de
Ni^{2+}-NTA-agarosa en una carga
experimental se puede utilizar gel de tentáculo Fractogel EMD®
(firma Merck). Dado que, en este caso, en comparación con
Ni^{2+}-NTA-agarosa, los iones
metálicos están más alejados de la matriz de columna propiamente
dicha, esto posibilitó una mejor accesibilidad estérica del sustrato
al derivado de r-furina unido. En esta carga se
procesó pro-factor X mediante derivado de
r-furina unido al gel de tentáculo: el gel de
tentáculo Fractogel EMD® se cargó con iones Ni^{2+} de acuerdo con
las instrucciones del fabricante y se equilibró con un medio de
cultivo celular fresco libre de suero. A continuación, la columna se
cargó con sobrenadante de CHO-derivado de
r-furina. Después se llevaron a cabo pasos de lavado
con un medio de cultivo celular libre de suero que contenía
concentraciones crecientes de imidazol de hasta 40 mM. A
continuación, a través de la columna se condujo
pro-factor X en forma de sobrenadante de CHO libre
de suero. El procesamiento de pro-factor X en factor
X de cadena doble durante el paso por la columna se demostró
mediante análisis Western Blot con un antisuero específico de factor
X.
Se incubó un precursor de factor X recombinante
a 4ºC con y sin r-furina. En diferentes momentos se
tomaron muestras y se congelaron a -20ºC. Una vez finalizada la
incubación (después de 4 días), todas las muestras se examinaron en
cuanto a la actividad de FX mediante un FX-Coatest
Kit (firma Chromogenix). Para ello, 50 \mul de cada sobrenadante
se mezclaron con 50 \mul de plasma humano con deficiencia de FX y,
de acuerdo con el protocolo del fabricante, el rFX se transformó en
rFXa con veneno de serpiente (RVV) en presencia de CaCl_{2}; el
rFXa hidroliza a continuación el substrato cromógeno
(S-2337) y conduce a la liberación de
para-nitroanilina, de color amarillo. Dado que la
cantidad de rFXa y la intensidad del color son proporcionales, la
cantidad de rFX activable en rFXa/ml de sobrenadante de cultivo
celular se puede determinar mediante una línea de calibrado
interpolada a partir de valores de una serie de dilución en plasma.
Con estos resultados y la cantidad conocida de antígeno de rFX
(datos ELISA) se puede calcular la proporción en % de
r-factor activado en factor Xa. La Tabla 1 muestra
los resultados.
Para excluir la posibilidad de una actividad
proteolítica no específica en sobrenadantes de CHO y
CHO-r-furina, también se analizó la
mezcla de estos dos sobrenadantes de cultivo celular.
Después de cuatro días de incubación,
CHO-rFX incubado con sobrenadantes de CHO (sin
r-furina) como control no mostró ninguna variación
esencial de la actividad de rFXa, que a causa de las fluctuaciones
experimentales era de aproximadamente 800 mU/ml y correspondía a un
55%-61% de rFX funcional. En cambio, cuando se incubó
CHO-rFX con CHO-r-furina, durante el tiempo de incubación se produjo un incremento constante de la actividad de rFX, que aumentó de aproximadamente un 61% (tiempo t = 0) a un 86% (Tabla 1).
CHO-rFX con CHO-r-furina, durante el tiempo de incubación se produjo un incremento constante de la actividad de rFX, que aumentó de aproximadamente un 61% (tiempo t = 0) a un 86% (Tabla 1).
De este modo se demostró que mediante el
procesamiento in vitro de CHO-rFX de clones
con alto nivel de expresión a través de un derivado de
r-furina se mejora esencialmente la proporción de
rFX que se puede activar en rFXa funcional.
| Incubación | Actividad | Cantidad de | Proporción | |
| (días) | (mU) | antígeno (\mug/ml) | funcional rFX (%) | |
| CHO-rFX + CHO | 0 | 814 | 14 | 58 |
| 1 | 847 | 14 | 61 | |
| 2 | 835 | 14 | 60 | |
| 3 | 790 | 14 | 56 | |
| 4 | 763 | 14 | 55 | |
| CHO-rFX + CHO-r-furina | 0 | 853 | 14 | 61 |
| 1 | 1.018 | 14 | 73 | |
| 2 | 1.099 | 14 | 79 | |
| 3 | 1.135 | 14 | 81 | |
| 4 | 1.198 | 14 | 86 | |
| CHO + CHO-r-furina | 0 | |||
| FX plasmático 500 mU | 585 |
En la proteína precursora de factor X, la furina
promueve tanto la segmentación de propéptido como la segmentación de
la cadena simple en cadena ligera/pesada, tal como se ha mostrado en
los ejemplos anteriores. Esto hace suponer que estos pasos también
se producen de forma endógena en la célula mediante la furina de
presencia ubicua, con diferente eficacia en función de la cantidad
de factor r-X expresada en cada caso. Esto conduce a
su vez a la producción de una mezcla de formas heterogéneas de
factor r-X.
Un método para generar una forma lo más
homogénea posible y además estable de moléculas de factor
r-X consiste en impedir la segmentación de factor
r-X mediante proteasas endógenas, principalmente
furina, y producir así un precursor de factor r-X
inactivo funcional (que se puede transformar con posterioridad,
idealmente directamente antes de su uso, en su forma activa
funcional mediante un procesamiento "downstream" (aguas
abajo)).
Este procedimiento será especialmente útil para
producir análogos de FX que contienen un sitio de ruptura de furina
en lugar del sitio de activación original. En estas constructos, la
activación de un mutante de rFX recombinante de este tipo puede
realizarse in vivo mediante la furina endógena y conducir a
la secreción de formas de rFX activadas más inestables. La
degradación de estas formas a través de
CHO-proteasas, por ejemplo en condiciones de cultivo
celular con alta lisis celular, durante el almacenamiento de los
sobrenadantes de cultivo celular o durante el procedimiento de
purificación, o mediante autoproteolisis, podría formar productos de
descomposición inactivos (Wolf y col., 1991).
Este objetivo se puede lograr, por ejemplo,
complementando el medio de cultivo celular con agentes que pueden
reducir o eliminar la actividad de furina intracelular.
Otra posibilidad consiste en utilizar células
con deficiencia de furina a priori (Möhring y col., 1983, Infect.
Immun. 41:998-1009; Ohnishi y col., 1994, J. Virol.
68:4075-4079; Gordon y col. 1995, Infect. Immun.
63:82-87).
Para ello, un clon celular de CHO FD11 con
deficiencia en furina (Gordon y col., 1995, Infect. Immun.
63:82-87) se sometió a cotransfección con 20 \mug
de phAct-FX y 1 \mug de pUCSV-neo
(que contenía el gen de resistencia a la neomicina en el vector pUC
bajo el control del promotor SV40). El medio se complementó con 0,8
\mug de G418/ml para obtener clones estables. Al comparar
moléculas de factor r-X segregadas en sobrenadantes
libres de suero de un clon de CHO que contenía furina y de otro
deficiente en furina, el análisis Western Blot muestra que en las
células con deficiencia en furina no se produce ningún procesamiento
de precursor de factor r-X y sólo hay presencia de
precursor de factor X de cadena simple (Figura 6); en cambio, el
factor r-X de células "normales" todavía se
procesa de forma completa con una expresión moderada, pero en caso
de una expresión mayor sólo se continúa procesando de forma muy
limitada a pesar de la furina endógena. Debido al bajo grado de
expresión de rFX del clon celular utilizado, en el Blot no se
observa la cadena ligera del factor r-X.
Para producir análogos de factor
r-X, el sitio de ruptura
Asn-Leu-Thr-Arg/Ile
(aminoácidos 231 a 235), que sirve para la activación del factor X
en factor Xa, se sustituyó por un sitio de ruptura específico para
otra proteasa, como furina FXIa, FXa, FXIIa, FIIa o calicreína.
Todos los plásmidos de expresión para estos análogos de factor X se
derivaron del plásmido phAct-FX (descrito en el
Ejemplo 1).
Para simplificar la clonación de los plásmidos
de expresión de factor X, el fragmento de ADN
HindIII-NaeI del plásmido de expresión de FX phAct,
que abarca la región codificadora del factor X desde la posición +1
hasta la +1116, se insertó en los sitios de corte de restricción
HindIII/SmaI del plásmido pUC19. El plásmido resultante se denominó
pUC/FX.
De este modo, la secuencia de factor X del
nucleótido en las posiciones 508 a 705 (aminoácidos 160 a 235) se
pudo separar fácilmente del plásmido pUC/FX y sustituir por
diferentes fragmentos de ADN de factor X mutado. Estos fragmentos de
ADN son idénticos a la secuencia de factor X de tipo salvaje con
deleción, excepto en las posiciones 691 a 705 (aminoácidos 231 a
235), que codifican nuevos sitios de ruptura.
La secuencia de factor X de tipo salvaje se
separó del plásmido pUC/FX mediante cortes de restricción Bsp120I y
BstXI. El excedente 3' del sitio BstXI se eliminó además con
nucleasa de judía mung (Biolab).
Los fragmentos de ADN de factor X mutados se
produjeron mediante PCR. El cebador 5' es idéntico para todas las
clonaciones y contiene la secuencia del factor X desde la posición
496 hasta la 516. Los cebadores 3' contienen una secuencia
complementaria al factor X (posiciones 676 a 690) y un excedente 5'
no complementario que porta las secuencias para un nuevo sitio de
ruptura y un sitio de corte de restricción. A continuación, el
producto de PCR amplificado se cortó con la o las enzimas de
restricción correspondientes y se clonó en el vector pUC/FX
preparado (véase más arriba).
A continuación, los fragmentos de ADN de factor
X mutados se subclonaron mediante HindIII-AgeI de
los plásmidos pUC/FX en el vector phAct-FX. En las
Figuras 2.1 y 2.2 se representan esquemáticamente los constructos
finales. Como constructo de referencia se indica el factor X de tipo
salvaje. Los aminoácidos están indicados en código de una letra y
las posiciones mutadas además están sombreadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Para producir un sitio de segmentación de FXIa
Asp-Phe-Thr-Arg/Val,
como cebador 5' se utilizó el oligonucleótido #1001
| (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') | (ID. SEC Nº 3) |
y como cebador 3' se utilizó el oligonucleótido
#1002
| (5'-ACCA GTT AAC CCT GGT GAA GTC GTT GTC GCC CCT CTC-3') | (ID. SEC Nº 4). |
Por ello, los aminoácidos Asn, Leu e Ile en las
posiciones 231, 232 y 235 de la secuencia del factor X se
sustituyeron por Asp, Phe y Val. El fragmento de PCR se cortó
posteriormente con Bst120I y HpaI (Figura 2 A).
\vskip1.000000\baselineskip
Para producir un sitio de ruptura de FIIa
Arg/Ser, como cebador 5' se utilizó el oligonucleótido #1001
| (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') | (ID. SEC Nº 3) |
y como cebador 3' se utilizó el oligonucleótido
#1003
| (5'-ACCA TCG CGA CCT GGT CAG GTT GTT GTC-3') | (ID. SEC. Nº 5). |
Por ello, el aminoácido Ile en la posición 235
se mutó en Ser. El fragmento de PCR se cortó posteriormente mediante
Bsp120I y NruI (Figura 2 B).
\vskip1.000000\baselineskip
Para producir un sitio de ruptura de FXIIa
Ile-Lys-Pro-Arg/Ile,
como cebador 5' se utilizó el oligonucleótido #1001
| (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') | (ID. SEC Nº 3) |
y como cebador 3' se utilizó el oligonucleótido
#1004
| (5'-ACC AGA ATC GAT TCT GGG TTT GAT GTT GTC GCC CCT CTC-3') | (ID. SEC Nº 6). |
Por ello, los aminoácidos Asn, Leu y Thr en las
posiciones 231, 232 y 233 de la secuencia de FX se mutaron en Ile,
Lys y Pro. El fragmento de PCR se cortó posteriormente de forma
parcial con Bst120I y XmnI (Figura 2 C).
\vskip1.000000\baselineskip
Para producir un sitio de suptura de calicreína
Ser-Met-Thr-Arg/Ile,
como cebador 5' se utilizó el oligonucleótido #1001
| (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') | (ID. SEC Nº 3) |
y como cebador 3' se utilizó el oligonucleótido
#1005
| (5'-ACC AGA ATC GAT TCT GGT CAT GCT GTT GTC GCC CCT CTC-3') | (ID. SEC Nº 7). |
Por ello, los aminoácidos Asn y Leu en las
posiciones 231 y 232 de la secuencia del factor X se mutaron en Ser
y Met. El fragmento de PCR se cortó posteriormente de forma parcial
con Bst120I y XmnI (Figura 2 D).
\vskip1.000000\baselineskip
Para producir un sitio de ruptura de FXa
Pro-Gln-Gly-Arg/Ile,
como cebador 5' se utilizó el oligonucleótido #1001
| (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') | (ID. SEC Nº 3) |
y como cebador 3' se utilizó el oligonucleótido
#1016
| (5'-ACC AGA ATC GAT TCT TCC TTG GGG GTT GTC GCC CCT CTC-3') | (ID. SEC Nº 8). |
Por ello, los aminoácidos Asn, Leu y Thr en las
posiciones 231, 232 y 233 de la proteína de FX se mutaron en Pro,
Gln y Gly. El fragmento de PCR se cortó posteriormente de forma
parcial con Bst120I y XmnI (Figura 2 H).
\vskip1.000000\baselineskip
Para producir un sitio de ruptura de FXa
Met-Lys-Thr-Arg/Ile,
como cebador 5' se utilizó el oligonucleótido #1001
| (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') | (ID. SEC Nº 3) |
y como cebador 3' se utilizó el oligonucleótido
#1014
| (5'-ACC AGA ATC GAT TCT CGT TTT CAT GTT GTC GCC CCT CTC-3') | (ID. SEC Nº 9). |
Por ello, los aminoácidos Asn y Leu en las
posiciones 231 y 232 de la proteína de FX se mutaron en Met y Lys.
El fragmento de PCR se cortó posteriormente de forma parcial con
Bst120I y XmnI (Figura 2 E).
\vskip1.000000\baselineskip
Para producir un sitio de ruptura de FXa
Ile-Glu-Gly-Arg/Ile,
como cebador 5' se utilizó el oligonucleótido #1001
| (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') | (ID. SEC Nº 3) |
y como cebador 3' se utilizó el oligonucleótido
#1015
| (5'-ACC AGA ATC GAT TCT TCC CTC GAT GTT GTC GCC CCT CTC-3') | (ID. SEC Nº 10). |
Por ello, los aminoácidos Asn, Leu y Thr en las
posiciones 231 a 233 de la proteína de FX se mutaron en Ile, Glu y
Gly. El fragmento de PCR se cortó posteriormente de forma parcial
con Bst120I y XmnI (Figura 2 F).
\vskip1.000000\baselineskip
Para producir un sitio de ruptura de furina
Arg-Arg-Lys-Arg/Ile,
como cebador 5' se utilizó el oligonucleótido #1001
| (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') | (ID. SEC Nº 3) |
y como cebador 3' se utilizó el oligonucleótido
#1006
| (5'-ACC AGA ATC GAT TCT TTT CCT CCT GTT GTC GCC CCT CTC-3') | (ID. SEC Nº 11). |
Por ello, los aminoácidos Asn, Leu y Thr en las
posiciones 231 a 233 se mutaron en Arg, Arg y Lys. El fragmento de
PCR se cortó posteriormente con Bsp120I y XmnI (Figura 2 G).
\vskip1.000000\baselineskip
Para producir un sitio de ruptura de furina
Arg-Val-Arg-Arg/Ile,
como cebador 5' se utilizó el oligonucleótido #1001
| (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') | (ID. SEC Nº 3) |
y como cebador 3' se utilizó el oligonucleótido
#1007
| (5'-ACC AGA ATC GAT TCT CCT CAC CCT GTT GTC GCC CCT CTC-3') | (ID. SEC Nº 12). |
Por ello, los aminoácidos Asn, Leu y Thr en las
posiciones 231 a 233 se mutaron en Arg, Val y Arg. El fragmento de
PCR se cortó posteriormente de forma parcial con Bsp120I y XmnI
(Figura 2 G).
\vskip1.000000\baselineskip
Para producir un sitio de ruptura de furina
Arg-Arg-Arg-Arg/Ile,
como cebador 5' se utilizó el oligonucleótido #1001
| (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') | (ID. SEC Nº 3) |
y como cebador 3' se utilizó el oligonucleótido
#1008
| (5'-ACC AGA ATC GAT TCT CCT CCT CCT GTT GTC GCC CCT CTC-3') | (ID. SEC Nº 13). |
Por ello, los aminoácidos Asn, Leu y Thr en las
posiciones 231 a 233 se mutaron en Arg, Arg y Arg. El fragmento de
PCR se cortó posteriormente de forma parcial con Bsp120I y XmnI
(Figura 2 G).
\vskip1.000000\baselineskip
Para producir un sitio de ruptura de furina
Arg-Pro-Lys-Arg/Ile,
como cebador 5' se utilizó el oligonucleótido #1001
| (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') | (ID. SEC Nº 3) |
y como cebador 3' se utilizó el oligonucleótido
#1009
| (5'-ACC AGA ATC GAT TCT TTT GGG CCT GTT GTC GCC CCT CTC-3') | (ID. SEC Nº 14). |
Por ello, los aminoácidos Asn, Leu y Thr en las
posiciones 231 a 233 se mutaron en Arg, Pro y Lys. El fragmento de
PCR se cortó posteriormente de forma parcial con Bsp120I y XmnI
(Figura 2 G).
\vskip1.000000\baselineskip
Para producir un sitio de ruptura de furina
Ile-Arg-Lys-Arg/Ile,
como cebador 5' se utilizó el oligonucleótido #1001
| (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') | (ID. SEC Nº 3) |
y como cebador 3' se utilizó el oligonucleótido
#1010
| (5'-ACC AGA ATC GAT TCT TTT CCT GAT GTT GTC GCC CCT CTC-3') | (ID. SEC Nº 15). |
Por ello, los aminoácidos Asn, Leu y Thr en las
posiciones 231 a 233 se mutaron en Ile, Arg y Lys. El fragmento de
PCR se cortó posteriormente de forma parcial con Bsp120I y XmnI
(Figura 2 G).
\vskip1.000000\baselineskip
Para producir un sitio de ruptura de furina
Arg-Ser-Lys-Arg/Ile,
como cebador 5' se utilizó el oligonucleótido #1001
| (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') | (ID. SEC Nº 3) |
y como cebador 3' se utilizó el oligonucleótido
#1011
| (5'-ACC AGA ATC GAT TCT TTT GCT CCT GTT GTC GCC CCT CTC-3') | (ID. SEC Nº 16). |
Por ello, los aminoácidos Asn, Leu y Thr en las
posiciones 231 a 233 se mutaron en Arg, Ser y Lys. El fragmento de
PCR se cortó posteriormente de forma parcial con Bsp120I y XmnI
(Figura 2 G).
\vskip1.000000\baselineskip
Para producir un sitio de ruptura de furina
Arg-Val-Thr-Arg/Ile,
como cebador 5' se utilizó el oligonucleótido #1001
| (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') | (ID. SEC Nº 3) |
y como cebador 3' se utilizó el oligonucleótido
#1012
| (5'-ACC AGA ATC GAT TCT GGT CAC CCT GTT GTC GCC CCT CTC-3') | (ID. SEC Nº 17). |
Por ello, los aminoácidos Asn y Leu en las
posiciones 231 y 232 se mutaron en Arg y Val. El fragmento de PCR se
cortó posteriormente de forma parcial con Bsp120I y XmnI (Figura 2
G).
\vskip1.000000\baselineskip
Para producir un sitio de ruptura de furina
Arg-Leu-Lys-Arg/Ile,
como cebador 5' se utilizó el oligonucleótido #1001
| (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') | (ID. SEC Nº 3) |
y como cebador 3' se utilizó el oligonucleótido
#1013
| (5'-ACC AGA ATC GAT TCT TTT GAG CCT GTT GTC GCC CCT CTC-3') | (ID. SEC Nº 18). |
Por ello, los aminoácidos Asn y Thr en las
posiciones 231 y 233 se mutaron en Arg y Lys. El fragmento de PCR se
cortó posteriormente de forma parcial con Bsp120I y XmnI (Figura 2
G).
\vskip1.000000\baselineskip
Para producir un sitio de ruptura de FXIIa
Thr-Ser-Thr-Arg/Ile,
como cebador 5' se utilizó el oligonucleótido #1001
| (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') | (ID. SEC Nº 3) |
y como cebador 3' se utilizó el oligonucleótido
#1017
| (5'-ACC AGA ATC GAT TCT CGT GCT CGT GTT GTC GCC CCT CTC-3') | (ID. SEC Nº 19). |
Por ello, los aminoácidos Asn y Leu en las
posiciones 231 y 232 de la proteína de FX se mutaron en Ile, Lys. El
fragmento de PCR se cortó posteriormente de forma parcial con
Bst120I y XmnI (Figura 2 I).
Estos constructos se derivaron de los
constructos de análogos de factor X arriba descritos, mediante la
incorporación de un codón de terminación TGA en posición 470. Para
ello, los aminoácidos desde la posición 457 a nivel de ADNc hasta el
codón de terminación se separaron mediante SpeI y digestión parcial
con BstEII y se sustituyeron por el par de oligonucleótidos
#0003
| (5'-GTC ACC GCC TTC CTC AAG TGG ATC GAC AGG TCC ATG AAA ACC AGG TGA A-3') | ||
| (ID. SEC. Nº 20) |
y #0004
| (5'-CTA GTT CAC CTG GTT TTC ATG GAC CTG TCG ATC CAC TTG AGG AAG GCG-3') | ||
| (ID. SEC. Nº 21). |
La Figura 7 muestra una representación
esquemática de los constructos de análogos de factor X\beta. Para
simplificar la imagen, todos los análogos de factor X\beta se han
representado como un constructo general, estando indicados los
aminoácidos variables como "X" sombreadas en la región del
sitio se ruptura.
Con la activación del factor X mediante la
segmentación del péptido de activación de 4,5 kD en el extremo
N-terminal de la cadena pesada se produce la forma
de factor Xa\alpha. Esta forma se transforma después en la forma
FXa\beta mediante actividad autoproteolítica y segmentación del
C-terminal de la cadena pesada entre Arg 469 y Gly
470. Para preparar plásmidos de expresión de factor X que condujeran
a la producción de un factor X que después de la activación se
encontrara exclusivamente en forma FXa\alpha con péptido \beta
intacto, el aminoácido Arg 469 se mutó en Lys, de modo que ya no
podía tener lugar ningún procesamiento en el área
C-terminal de la cadena pesada.
Para ello, la secuencia de aminoácidos
C-terminal del factor X desde la posición 1363 hasta
la señal de terminación se eliminó mediante digestión parcial con
BstEII-SpeI y se sustituyó por dos pares de
oligonucleótidos ligados entre sí. El oligonucleótido #0005
| (5'-GTC ACC GCC TTC CTC AAG TGG ATC GAC AGG TCC ATG AAA ACC AAG GGC TTG CCC AAG-3' | |
| (ID. SEC. Nº 22) |
y el oligonucleótido #0006
| (5'-TTG GCC TTG GGC AAG CCC TTG GTT TTC ATG GAC CTG TCG ATC CAC TTG AGG AAG GCG-3') | |
| (ID SEC. Nº 23) |
se ligaron con el oligonucleótido #0007
| (5'-GCC AAG AGC CAT GCC CCG GAG GTC ATA ACG TCC TCT CCA TTA AAG TGA GAT CCC A-3') | |
| (ID. SEC. Nº 24) |
y el oligonucleótido #0008
| (5'-CTA GTG GGA TCT CAC TTT AAT GGA GAG GAC GTT ATG ACC TCC GGG GCA TGG CTC-3') | |
| (ID. SEC. Nº 25). |
La mutación del aminoácido Arg 469 se introdujo
mediante el par de oligonucleótidos #0005-#0006. La Figura 7 muestra
una representación esquemática de los análogos de FX.
El factor X recombinante se expresó en células
CHO con furina endógena, tal como se describe en el Ejemplo 1, o con
células con deficiencia de furina, tal como se describe en el
Ejemplo 5. El factor r-X se aisló a partir de a)
sobrenadante de cultivo celular sin tratamiento previo, b)
sobrenadante de cultivo celular incubado durante otras 12 horas a
37ºC y c) sobrenadante de cultivo celular de clones de
CHO-rFX con alto nivel de expresión, previamente
tratado durante 12 horas a 37ºC con sobrenadante de
CHO-r-furina, y también a partir de
d) sobrenadante de cultivo celular de clones de
CHO-FD11-rFX, sin tratamiento
previo, e) previamente tratado durante 12 horas a 37ºC con
sobrenadante de CHO-r-furina. Los
aminoácidos N-terminales de factor X y productos de
procesamiento de las cargas de reacción individuales a) a e) se
determinaron mediante análisis Edman. La Figura 8 muestra una
representación esquemática de los resultados.
El factor r-X de células CHO con
alto nivel de expresión aparece en forma de las cadenas pesadas y
ligeras maduras, y también en forma de cadena simple, en parte
todavía con contenido de propéptido. Después de incubar estos
sobrenadantes de cultivo celular durante 12 horas a 37ºC (b)
aparecen adicionalmente, como ya describieron Wolf y col. (1991, J.
Bio. Chem. 266:13726-13730),
N-terminales defectuosos de la cadena ligera de rFX
con 3 aminoácidos adicionales Val38 - Thr39 - Arg40. Estos extremos
crípticos también se encuentran en la secuenciación de material de
rFX de células CHO-FD11 no tratadas previamente.
Esta observación muestra que la aparición de estos
N-terminales defectuosos se puede evitar empleando
condiciones optimizadas o condiciones de cultivo celular,
almacenamiento y procedimientos de purificación optimizados para
reducir al mínimo la proteolisis de rFX mediante proteasas CHO.
A diferencia del material purificado de células
CHO (a y b), el rFX de células con deficiencia de furina no
amplificadas (d) sólo está presente en forma de precursores de
cadena simple no procesados. Tampoco se encuentra ninguna secuencia
N-terminal correspondiente a la proporción de
propéptido. De este modo se demostró que el procesamiento de
precursores de rFX de cadena simple para formar cadena ligera/pesada
en células CHO con deficiencia de furina (d) no tiene lugar, lo que
permite concluir que la endoproteasa furina desempeña un papel
central en este paso de procesamiento in vivo.
Además se demostró que el procesamiento de
moléculas de rFX con contenido de propéptido también tiene lugar en
células CHO con deficiencia de furina y, por consiguiente, la furina
no representa ningún papel esencial en este paso de procedimiento.
Mediante la incubación de rFX de células CHO (c) y células
CHO-FD11 (e) en presencia de furina sólo se
encuentran cadenas ligeras y pesadas con
N-terminales correctos. De este modo se demostró que
tanto los precursores de FX de cadena simple como las moléculas de
rFX con contenido de propéptido se transforman mediante
procesamiento in vitro en factor X maduro y homogéneo. Por
consiguiente, el factor X procesado en presencia de furina presenta
una extraordinaria integridad estructural y homogeneidad.
Para producir proteína rFX^{RRKR/I}
recombinante, el plásmido de expresión FX con el sitio de
segmentación
Arg-Arg-Lys-Arg/Ile
(véase el Ejemplo 6.1, Figura 2 G) y el plásmido de selección
pSV/dhfr se sometieron a cotransfección en células CHO, tal como se
describe en el Ejemplo 1. El análisis Western Blot de los
sobrenadantes del cultivo celular (Figura 9) muestra que la proteína
recombinante se encuentra predominantemente en la forma de cadena
doble. En comparación con el FX de plasma, la cadena pesada está a
46 kD en lugar de 50 kD, lo que probablemente se debe a una
glucosación diferente de la proteína recombinante. Además, como ya
se ha observado en la expresión de rFX de tipo salvaje (Ejemplo
1.b.), También son visibles pequeñas cantidades de precursor de
cadena simple (SC) y también la isoforma LC4 de la cadena ligera.
Estas formas moleculares del análogo de rFX indican una limitación
tanto del procesamiento del precursor de FX de cadena simple por
proteasas endógenas como de la
\gamma-carboxilación de la cadena ligera. Aunque
el sitio de ruptura insertado en el análogo de FX representa una
secuencia de consenso de furina, no hay ninguna banda de proteína
visible correspondiente a las formas activas de la proteína (35 kD,
31 kD). La estructura en el área del sitio de ruptura y la secuencia
de aminoácidos inmediata podrían indicar que el procesamiento del
sitio de activación modificado por furina sólo representa
condiciones subóptimas.
La capacidad de activación del análogo de FX
recombinante en las formas de FXa \alpha (35 kD) y \beta (31 kD)
mediante r-furina in vitro se examinó tal
como se describe en el Ejemplo 2 para experimentos mixtos, con la
diferencia de que se utilizaron derivados de
r-furina
r-furina\DeltaCys-Spacer-10xHis
purificados, descritos en la solicitud de patente EP 0 775 750 A2,
en Hepes 10 mM, pH 7,0, NaCl 150 mM, CaCl_{2} 2 mM y 0,2% BSA, en
lugar de sobrenadantes de
CHO-r-furina. En el experimento de
control sin r-furina, el sobrenadante de análogo de
CHO-rFX se mezcló con el tampón Hepes 10 mM, pH 7,0,
NaCl 150 mM, CaCl_{2} 2 mM y 0,2% BSA, en una proporción 1:1. Se
tomaron partes alícuotas de las cargas antes y después de un tiempo
de incubación de 6, 24, 48 y 72 (t = 0, 6, 24, 48, 72) horas a 37ºC
y se examinaron mediante Western Blot en cuanto a la activación de
rFX (Figura 10). Mientras que el patrón de bandas de rFX^{RRKR/I}
en ausencia del derivado de r-furina permanece
invariable incluso después de 72 horas de incubación (Figura 10 B),
después de 6 horas en presencia de r-furina (Figura
10 A, Pista 5) ya se puede ver una banda de proteína de 35 kD, que
corresponde a la forma \alpha del FX plasmático, (Figura 10 A,
Pista 9). Esta forma \alpha se acumula en el curso de la
incubación y, después de 72 horas de incubación (Figura 10 A, Pista
8), aproximadamente un 50% del material de partida (HC) se ha
transformado en la forma activa. La banda de proteína de 31 kD
adicional, que se puede ver después de 24 horas (Figura 10 A, Pista
6) y que corresponde a la forma \beta del FX de plasma activado
(Figura 10 A, Pista 9), muestra que la forma \alpha producida a
partir de análogo de FX recombinante posee una actividad
autoproteolítica y, por consiguiente, es funcional.
Estos resultados indican que el sitio de ruptura
de activación heterólogo
Arg-Arg-Lys-Arg/Ile
en el análogo de rFX es reconocido de forma específica y segmentado
correctamente in vitro por derivados de
r-furina y que, por consiguiente, es adecuado para
la activación del análogo de rFX en moléculas
\alpha-FXa y \beta-FXa.
Partes alícuotas de los experimentos mixtos del
Ejemplo 9 se examinaron en cuanto a la actividad de FXa con un
ensayo cromógeno. Para ello, las partes alícuotas se mezclaron con
el sustrato cromógeno S2337 (600 \muM) en Tris 50 mM, pH 7,3, CaCl
150 mM, 0,1% BSA. Después de un período de incubación de 3 minutos a
37ºC, la reacción se interrumpió con ácido acético al 20% y a
continuación se midió la OD a 405 nm. La magnitud de la actividad de
FXa recombinante en las cargas de reacción se determinó mediante
comparación con una línea de calibrado producida mediante FXa de
plasma activado con RVV y purificado. La Tabla 2 muestra los
resultados de estos análisis, las cantidades de antígeno utilizadas
(valores ELISA) y la actividad específica calculada a partir de
ello.
Para excluir actividades amidolíticas no
específicas en la solución de r-furina y en el
sobrenadante de cultivo celular de CHO, la mezcla de un sobrenadante
de células CHO no transfectadas con derivado de
r-furina purificado también se examinó en cuanto a
la actividad de FXa (CHO + r-furina). En esta
mezcla, al igual que en el caso de la mezcla de análogo de
rFX/tampón (rFX^{RRKR/I} + tampón), tampoco se pudo medir ninguna
actividad de FXa después de 72 horas. En cambio, en el caso de la
reacción de rFX^{RRKR/I}/r-furina, después de 6
horas de incubación ya se pudo medir una actividad de rFXa de 56
mU, que fue aumentando constantemente en el curso de la reacción y
después de 72 horas llegó a 133 mU. Aunque en ese momento, de
acuerdo con el Western Blot, sólo había sido transformada
aproximadamente la mitad del análogo de rFX en las formas \alpha y
\beta activadas (Figura 10 A, Pista 8), el material de análogo de
rFX activado in vitro alcanzó con 190 mU/\mug una actividad
específica mucho mayor que el FX de plasma activado por completo con
RVV (153 mU/\mug). Los aumentos de actividad medidos se reflejan
en la aparición de las formas \alpha y \beta en el Western Blot
(Figura 10 A, Pistas 5-8).
Esto demuestra que en la proteasa heteróloga de
FX se pueden incorporar sitios de corte, que éstos son reconocidos y
segmentados por la proteasa correspondiente y que se puede producir
de forma recombinante rFXa de alta calidad (o en caso dado análogos
de rFXa con actividad de FXa).
| Incubación | Actividad | Cantidad de | Actividad específica | |
| (horas) | (mU/ml) | antígeno (\mug/ml) | (mU/\mug) | |
| rFX^{RRKR/I} + tampón | 0 | <25 | 0,7 | 0 |
| 6 | <25 | 0,7 | 0 | |
| 24 | <25 | 0,7 | 0 | |
| 48 | <25 | 0,7 | 0 | |
| 72 | <25 | 0,7 | 0 | |
| rFX^{RRKR/I} + r-furina | 0 | <25 | 0,7 | 0 |
| 6 | 56 | 0,7 | 80 | |
| 24 | 101 | 0,7 | 144 | |
| 48 | 124 | 0,7 | 177 | |
| 72 | 133 | 0,7 | 190 | |
| CHO + r-furina | 0 | <25 | 0 | |
| 6 | <25 | 0 | ||
| 24 | <25 | 0 | ||
| 48 | <25 | 0 | ||
| 72 | <25 | 0 | ||
| FX de plasma activado | 614 | 4 | 153 | |
| con RVV |
Se produjo un constructo de análogo de FX
mediante mutagénesis de la secuencia de activación de FX en un sitio
de ruptura de FXIa. A continuación se prepararon clones celulares de
CHO estables que expresan estas moléculas. Un sobrenadante de
cultivo celular de CHO con rFX^{DFTR/V} se mezcló con FXIa
plasmático purificado (100 \mug/ml) en presencia de Tris 10 mM, pH
7,3, NaCl 150 mM, CaCl_{2} 8 mM, PCPS y 0,1% BSA y se incubó a
37ºC durante diferentes períodos de tiempo. Como control negativo,
el sobrenadante de cultivo celular se incubó únicamente en tampón
con BSA. La proteína rFX^{DFTR/V} y los productos de activación
resultantes se caracterizaron mediante análisis Western Blot (Figura
11). Como se puede reconocer en la mezcla sin FXIa antes de la
incubación (t = 0), la proteína recombinante (Figura 11, Pista 5) se
segrega en la forma de cadena doble prácticamente idéntica al FX
plasmático (Pista 2), con la diferencia de que la cadena pesada (HC)
tiene un peso molecular ligeramente menor de 50 kD, como ya se
observó en el caso del rFX^{RRKR} del Ejemplo 8. Durante la
incubación de esta mezcla a 37ºC (Figura 11, Pista 6) no se observa
ninguna variación esencial del patrón de las bandas. En la mezcla de
CHO-FXIa, poco antes de la adición de FXIa
purificado pero antes de la incubación propiamente dicha del
sobrenadante de cultivo celular (Figura 11, Pista 3), ya se observan
bandas de proteína de 35 kD y 31 kD que corresponden al tamaño de
las formas \alpha y \beta plasmáticas de la cadena pesada
(Figura 11, Pista 9). Después de 4 horas de incubación con FXIa,
estas dos formas se incrementan mucho (Figura 11, Pista 4).
De este modo se demuestra que un análogo de FX
que porta el sitio de corte de proteasa heterólogo para una enzima
proteolítica activa en la cascada de coagulación puede ser procesado
con éxito por esta última.
Además, mediante la aparición de la banda de
rFXa\beta, resultado de la actividad autoproteolítica del análogo
de rFXa\alpha, se demuestra con éxito la actividad funcional del
análogo de rFXa\alpha resultante.
(1) DATOS GENERALES:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: IMMUNO AG
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Industriestrasse 67
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- LOCALIDAD: Viena
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- REGIÓN: Austria
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Austria
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 1220
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Michelle Himmelspach
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Breitstetten 19
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- LOCALIDAD: Leopoldsdorf
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- REGIÓN: Austria
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Austria
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 2285
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Uwe Schlokat
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Hauptstrasse 51
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- LOCALIDAD: Orth/Donau
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- REGIÓN: Austria
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Austria
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 2304
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Andreas Fisch
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Wiener Strasse 14
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- LOCALIDAD: Orth/Donau
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- REGIÓN: Austria
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Austria
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 2304
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Friedrich Dorner
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Peterlinigasse 17
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- LOCALIDAD: Viena
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- REGIÓN: Austria
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Austria
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 1238
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Johan Eibl
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Gustav Tschermakgasse 2
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- LOCALIDAD: Viena
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- REGIÓN: Austria
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Austria
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 1180
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- DENOMINACIÓN DE LA INVENCIÓN: Análogos de factor X con sitio de segmentación de proteasa modificado
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- CANTIDAD DE SECUENCIAS: 27
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- VERSIÓN PARA ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- SOPORTE DE DATOS: Diskette
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (EPA)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA ID. SEC. Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: Cadena simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATTACTCGAG AAGCTTACCA TGGGGCGCCC ACTG
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA ID. SEC. Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: Cadena simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATTACAATTG CTGCAGGGAT CCAC
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA ID. SEC. Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: Cadena simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCACAGGGC CCTACCCCTG T
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA ID. SEC. Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 37 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: Cadena simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCAGTTAAC CCTGGTGAAG TCGTTGTCGC CCCTCTC
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA ID. SEC. Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: Cadena simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCATCGCGA CCTGGTCAGG TTGTTGTC
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA ID. SEC. Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: Cadena simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCAGAATCG ATTCTGGGTT TGATGTTGTC GCCCCTCTC
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA ID. SEC. Nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: Cadena simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCAGAATCG ATTCTGGTCA TGCTGTTGTC GCCCCTCTC
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA ID. SEC. Nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: Cadena simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCAGAATCG ATTCTTCCTT GGGGGTTGTC GCCCCTCTC
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA ID. SEC. Nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: Cadena simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCAGAATCG ATTCTCGTTT TCATGTTGTC GCCCCTCTC
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA ID. SEC. Nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: Cadena simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCAGAATCG ATTCTTCCCT CGATGTTGTC GCCCCTCTC
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA ID. SEC. Nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: Cadena simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCAGAATCG ATTCTTTTCC TCCTGTTGTC GCCCCTCTC
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA ID. SEC. Nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: Cadena simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCAGAATCG ATTCTCCTCA CCCTGTTGTC GCCCCTCTC
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA ID. SEC. Nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: Cadena simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCAGAATCG ATTCTCCTCC TCCTGTTGTC GCCCCTCTC
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA ID. SEC. Nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: Cadena simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCAGAATCG ATTCTTTTGG GCCTGTTGTC GCCCCTCTC
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA ID. SEC. Nº 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: Cadena simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCAGAATCG ATTCTTTTCC TGATGTTGTC GCCCCTCTC
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA ID. SEC. Nº 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: Cadena simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCAGAATCG ATTCTTTTGC TCCTGTTGTC GCCCCTCTC
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA ID. SEC. Nº 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: Cadena simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCAGAATCG ATTCTGGTCA CCCTGTTGTC GCCCCTCTC
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA ID. SEC. Nº 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: Cadena simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCAGAATCG ATTCTTTTGA GCCTGTTGTC GCCCCTCTC
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA ID. SEC. Nº 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: Cadena simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCAGAATCG ATTCTCGTGC TCGTGTTGTC GCCCCTCTC
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA ID. SEC. Nº 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 49 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: Cadena simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCACCGCCT TCCTCAAGTG GATCGACAGG TCCATGAAAA CCAGGTGAA
\hfill49
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA ID. SEC. Nº 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 48 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: Cadena simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTAGTTCACC TGGTTTTCAT GGACCTGTCG ATCCACTTGA GGAAGGCG
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA ID. SEC. Nº 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 57 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: Cadena simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCACCGCCT TCCTCAAGTG GATCGACAGG TCCATGAAAA CCAAGGGCTT GCCCAAG
\hfill57
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA ID. SEC. Nº 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 57 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: Cadena simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTGGCCTTGG GCAAGCCCTT GGTTTTCATG GACCTGTCGA TCCACTTGAG GAAGGCG
\hfill57
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA ID. SEC. Nº 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 55 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: Cadena simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCAAGAGCC ATGCCCCGGA GGTCATAACG TCCTCTCCAT TAAAGTGAGA TCCCA
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA ID. SEC. Nº 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 54 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: Cadena simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTAGTGGGAT CTCACTTTAA TGGAGAGGAC GTTATGACCT CCGGGGCATG GCTC
\hfill54
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA ID. SEC. Nº 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1467 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: Cadena simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1 . . 1467
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA ID. SEC. Nº 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 489 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 27:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (49)
1. Análogo de factor X, caracterizado
porque presenta una modificación en la zona del sitio de ruptura de
activación de factor Xa natural con una secuencia de factor X
Gly228-R6-R5-R4-R3-R2-Arg234-R1,
con respecto a la numeración de aminoácidos de acuerdo con la Figura
1, consistiendo la modificación en un sitio de procesamiento de una
proteasa que segmenta la secuencia de factor X en esta área de forma
no natural y
- a)
- R1 es un aminoácido seleccionado entre el grupo Ile, Val, Ser, Thr o Ala,
- b)
- R2 es un aminoácido seleccionado entre el grupo Pro, Gly, Lys o Arg,
- c)
- R3 es un aminoácido seleccionado entre el grupo Phe, Lys, Met, Gln, Glu, Ser, Val, Arg o Pro,
- d)
- R4 es un aminoácido seleccionado entre el grupo Asp, Ile, Ser, Met, Pro, Thr, Arg o Lys,
- e)
- R5 es un aminoácido seleccionado entre el grupo Asn, Lys, Ser, Glu, Ala, Gln, His o Arg, y
- f)
- R6 es un aminoácido seleccionado entre el grupo Asp, Phe, Thr, Arg, Leu o Ser.
2. Análogo de factor X según la reivindicación
1, caracterizado porque la modificación afecta como mínimo a
un aminoácido dentro de la secuencia de aminoácidos del péptido de
activación.
3. Análogo de factor X según una de las
reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque la modificación
consiste en una sustitución de como mínimo uno de los aminoácidos
entre Gly 228 y Arg 234, y en caso dado Ile 235, con respecto a la
numeración de aminoácidos de acuerdo con la Figura 1.
4. Análogo de factor X según una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la modificación
consiste en un sitio de procesamiento para una proteasa seleccionada
de entre el grupo de las endoproteasas, por ejemplo Kexin/Kex2,
furina/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, de las
serina-proteasas, por ejemplo factor IIa, factor
XIIa, factor XIa, factor Xa o de calicreína, o un derivado de estas
proteasas.
5. Análogo de factor X según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque presenta otra
modificación en la zona de la secuencia de aminoácidos
C-terminal del factor X.
6. Análogo de factor X según la reivindicación
5, caracterizado porque presenta una modificación en la zona
C-terminal del sitio de ruptura de péptido
\beta.
7. Análogo de factor X según la reivindicación
6, caracterizado porque la modificación consiste en una
mutación, deleción o inserción en la zona de la secuencia de
aminoácidos del factor X entre las posiciones de aminoácidos Arg 469
y Ser 476.
8. Análogo de factor X según una de las
reivindicaciones 5 a 7, caracterizado porque la modificación
impide una segmentación del péptido \beta.
9. Análogo de factor X según la reivindicación
5, caracterizado porque presenta una deleción del péptido
\beta del factor X.
10. Análogo de factor X según la reivindicación
5, caracterizado porque presenta una señal de interrupción de
traducción en la zona C-terminal de la secuencia del
factor X.
11. Análogo de factor X según la reivindicación
10, caracterizado porque presenta una señal de interrupción
de traducción en la posición del aminoácido 470 de la secuencia del
factor X.
12. Análogo de factor X según una de las
reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque la modificación
en la zona del péptido de activación permite una activación del
análogo de factor X para formar factor Xa nativo o un análogo de
factor Xa in vitro.
13. Análogo de factor X según la reivindicación
12, caracterizado porque la modificación permite una
activación a través de una proteasa seleccionada de entre el grupo
de las endoproteasas, por ejemplo Kexin/Kex2, furina/PACE, PC1/PC3,
PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, del grupo de las
serina-proteasas, por ejemplo factor IIa, factor
XIIa, factor XIa, factor Xa, o de calicreína, o un derivado de estas
proteasas.
14. Análogo de factor X según una de las
reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque la modificación
permite una activación del análogo de factor X para formar factor Xa
nativo o un análogo de factor Xa in vivo.
\newpage
15. Análogo de factor X según la reivindicación
14, caracterizado porque la modificación permite una
activación a través de una proteasa seleccionada de entre el grupo
de las serina-proteasas, por ejemplo factor XIIa,
factor XIa, factor IIa, factor Xa, o de calicreína.
16. Análogo de factor X según una de las
reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque se encuentra en
forma de análogo de factor X con péptido \beta intacto o en forma
de un análogo de factor acortado en el
C-terminal.
17. Análogo de factor X según una de las
reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque se encuentra en
forma de molécula de cadena simple.
18. ADN recombinante codificador de un análogo
de factor X según una de las reivindicaciones 1 a 17, incluido en un
vector para la expresión recombinante de la proteína codificada.
19. Preparado que contiene un análogo de factor
X purificado o una proteína precursora del mismo con una
modificación en la zona del sitio de ruptura de activación de factor
Xa natural con una secuencia de factor X con
Gly228-R6-R5-R4-R3-R2-Arg234-R1,
con respecto a la numeración de aminoácidos de acuerdo con la Figura
1, consistiendo la modificación en un sitio de procesamiento de una
proteasa que segmenta la secuencia de factor X en esta área de forma
no natural y
- a)
- R1 es un aminoácido seleccionado entre el grupo Ile, Val, Ser, Thr o Ala,
- b)
- R2 es un aminoácido seleccionado entre el grupo Pro, Gly, Lys o Arg,
- c)
- R3 es un aminoácido seleccionado entre el grupo Phe, Lys, Met, Gln, Glu, Ser, Val, Arg o Pro,
- d)
- R4 es un aminoácido seleccionado entre el grupo Asp, Ile, Ser, Met, Pro, Thr, Arg o Lys,
- e)
- R5 es un aminoácido seleccionado entre el grupo Asn, Lys, Ser, Glu, Ala, Gln, His o Arg, y
- f)
- R6 es un aminoácido seleccionado entre el grupo Asp, Phe, Thr, Arg, Leu o Ser.
20. Preparado según la reivindicación 19,
caracterizado porque la modificación consiste en un sitio de
segmentación para una proteasa seleccionada de entre el grupo de las
endoproteasas bibásicas, por ejemplo Kexin/Kex2, furina/PACE,
PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, de las
serina-proteasas, por ejemplo factor IIa, factor
XIIa, factor XIa, factor Xa, o de calicreína.
21. Preparado según una de las reivindicaciones
19 ó 20, caracterizado porque el análogo de factor X se
encuentra en forma de análogo de factor X\alpha.
22. Preparado según una de las reivindicaciones
19 ó 20, caracterizado porque el análogo de factor X se
encuentra en forma de análogo de factor X acortado en el
C-terminal.
23. Preparado según una de las reivindicaciones
19 a 22, caracterizado porque contiene el análogo de factor X
en forma de una molécula de cadena simple aislada.
24. Preparado según una de las reivindicaciones
19 a 23, caracterizado porque contiene un análogo de factor X
de cadena simple en forma enzimáticamente inactiva con una pureza de
como mínimo un 80%, preferentemente de un 90%, en especial de un
95%, y no contiene ningún producto intermedio proteolítico inactivo
de análogo de factor X/Xa.
25. Preparado según una de las reivindicaciones
19 a 24, caracterizado porque contiene el análogo de factor X
en forma de una molécula de cadena doble aislada.
26. Preparado según una de las reivindicaciones
19 a 25, caracterizado porque contiene un análogo de factor X
que presenta una modificación que permite una activación del análogo
de factor X para formar factor Xa nativo o un análogo de factor Xa
in vitro.
27. Preparado según una de las reivindicaciones
19 a 26, caracterizado porque está formulado como preparado
farmacéutico.
28. Preparado según una de las reivindicaciones
19 a 27, caracterizado porque se presenta en un dispositivo
adecuado, preferentemente un dispositivo de administración, en
combinación con una proteasa seleccionada de entre el grupo de las
endoproteasas, por ejemplo Kexin/Kex2, furina/PACE, PC1/PC3, PC2,
PC4, PACE 4, LPC/PC7, del grupo de las
serina-proteasas, por ejemplo factor XIIa, factor
XIa, factor Xa, factor IIa, o de calicreína, o un derivado de estas
proteasas.
29. Preparado según la reivindicación 28,
caracterizado porque los componentes están separados entre
sí.
30. Preparado según una de las reivindicaciones
19 a 25, caracterizado porque presenta una modificación que
permite una activación del análogo de factor X para formar factor Xa
nativo o un análogo de factor Xa in vivo.
31. Preparado que contiene análogo de factor Xa,
que está esencialmente libre de productos intermedios de análogo de
factor X/Xa inactivo y productos de descomposición de factor X
autoproteolíticos y que se puede obtener mediante la activación de
un análogo de factor X según una de las reivindicaciones 1 a 18.
32. Preparado según una de las reivindicaciones
19 a 31, caracterizado porque contiene un vehículo
fisiológicamente aceptable y se encuentra en una forma estable al
almacenamiento.
33. Preparado según una de las reivindicaciones
19 a 32, caracterizado porque, en caso dado, como componente
adicional contiene un factor sanguíneo o una forma activada de un
factor sanguíneo.
34. Preparado según la reivindicación 33,
caracterizado porque contiene como componente adicional como
mínimo un componente con actividad bypass de factor VIII.
35. Preparado según una de las reivindicaciones
19 a 34, caracterizado porque está formulado como una
composición farmacéutica y en caso dado se presenta como un
preparado multicomponente.
36. Utilización de un preparado según una de las
reivindicaciones 19 a 35 para la producción de un medicamento.
37. Utilización de un ácido nucleico según la
reivindicación 18 para producir un medicamento.
38. Procedimiento para producir un preparado que
contiene análogo de factor X recombinante purificado,
caracterizado porque se aísla un análogo de factor X según
una de las reivindicaciones 1 a 17 obtenido mediante producción
recombinante y se purifica a través de un procedimiento
cromatográfico.
39. Procedimiento según la reivindicación 38,
caracterizado porque incluye los siguientes pasos:
- -
- preparación de un ácido nucleico según la reivindicación 18,
- -
- transformación de una célula adecuada,
- -
- expresión de un análogo de factor X,
- -
- dado el caso incubación del análogo de factor X con una proteasa,
- -
- aislamiento del análogo de factor X y
- -
- purificación del análogo de factor X mediante un procedimiento cromatográfico.
40. Procedimiento según la reivindicación 39,
caracterizado porque el análogo de factor X se aísla como
molécula de cadena doble.
41. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 38 a 40, caracterizado porque el análogo de
factor X de cadena doble se pone en contacto con una proteasa
seleccionada de entre el grupo de las endoproteasas, por ejemplo
Kexin/Kex2, furina/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, del
grupo de las serina-proteasas, por ejemplo factor
IIa, factor XIIa, factor XIa, factor Xa, o de calicreína, o un
derivado de estas proteasas, bajo condiciones en las que el análogo
de factor X se segmenta para formar factor Xa nativo o un análogo de
factor Xa.
42. Procedimiento según la reivindicación 41,
caracterizado porque la célula es una célula que no expresa
una proteasa que puede producir una segmentación de la cadena simple
en una cadena ligera y una cadena pesada de factor X o de un análogo
de factor X, y que en caso dado presenta una deficiencia de la
proteasa.
43. Procedimiento según la reivindicación 42,
caracterizado porque la célula no expresa ninguna
endoproteasa, por ejemplo Kexin, furina PACE o un derivado de
éstas.
44. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 42 ó 43, caracterizado porque la célula el
análogo de factor X se aísla en forma de una molécula de cadena
simple.
45. Procedimiento según la reivindicación 44,
caracterizado porque el análogo de factor X de cadena simple,
aislado en caso dado, se pone en contacto con una proteasa
seleccionada de entre el grupo de las endoproteasas, por ejemplo
Kexin/Kex2, furina/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, o un
derivado de estas proteasas, bajo condiciones en las que el análogo
de factor X de cadena simple se segmenta en la forma de factor X de
cadena doble.
46. Procedimiento según la reivindicación 45,
caracterizado porque el análogo de factor X de cadena simple
en caso dado se activa directamente poniéndolo en contacto con la
proteasa para formar factor Xa o análogo de factor Xa.
47. Procedimiento según la reivindicación 45,
caracterizado porque el análogo de factor X de cadena doble
se pone en contacto con otra proteasa, diferente de la primera, y se
activa para formar análogo de factor Xa o factor Xa nativo.
48. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 38 a 47, caracterizado porque la proteasa
está inmovilizada.
49. Procedimiento para producir un preparado con
contenido de factor Xa o análogo de factor Xa activo,
caracterizado porque un análogo de factor X producido
mediante un procedimiento según una de las reivindicaciones 38 a 45
se somete a un paso de activación.
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