PL190734B1

PL190734B1 - Analog czynnika X, rekombinowany DNA, kompozycje,zastosowanie rekombinowanego kwasu nukleinowego DNA oraz sposoby wytwarzania kompozycji

Info

Publication number: PL190734B1
Application number: PL98335382A
Authority: PL
Inventors: Michael Himmelspach; Uwe Schlokat; Friedrich Dorner; Andreas Fisch; Johann Eibl
Original assignee: Baxter Ag
Priority date: 1997-02-27
Filing date: 1998-02-27
Publication date: 2005-12-30
Also published as: NO327878B1; NO994139L; HUP0100652A3; AT405516B; WO1998038317A1; PL335382A1; US7220569B2; US20030181381A1; IL131346A0; AU744428B2; SK286359B6; AR012034A1; NO994139D0; AU6200298A; ES2263199T3; BR9807627A; JP2001513631A; SK117199A3; CZ303299A3; IL131346A

Abstract

1. Analog czynnika X, znamienny tym, ze posiada modyfikacje w rejonie naturalnie wy- stepujacego miejsca rozszczepienia aktywacyjnego do czynnika Xa w sekwencji czynnika X Gly228-R6-R5-R4-R3-R2-Arg234-R1, przy czym modyfikacja ta stanowi miejsce przeksztalcania dla nienaturalnie w tym rejonie sekwencji czynnika X rozszczepiajacej proteazy, a R1 oznacza aminokwas wybrany z grupy Ile, Val, Ser, Thr lub Ala R2 oznacza aminokwas wybrany z grupy Pro, Gly, Lys lub Arg R3 oznacza aminokwas wybrany z grupy Phe, Lys, Met, Gln, Glu, Ser, Val, Arg lub Pro R4 oznacza aminokwas wybrany z grupy Asp, Ile, Ser, Met, Pro, Thr, Arg lub Lys R5 oznacza aminokwas wybrany z grupy Asn, Lys, Ser, Glu, Ala, Gln, His lub Arg i R6 oznacza aminokwas wybrany z grupy Asp, Phe, Thr, Arg, Leu lub Ser. 19. Kompozycja, znamienna tym, ze zawiera oczyszczony analog czynnika X lub jego bialko prekursorowe z modyfikacja w rejonie naturalnie wystepujacego miejsca rozszczepienia aktywacyjnego czynnika X w sekwencji czynnika X w sekwencji Gly228-R6-R5-R4-R3- -R2-Arg234-R1, przy czym modyfikacja ta stanowi miejsce przeksztalcenia nienaturalnie w tym rejonie sekwencji czynnika X rozszczepiajacej proteazy, a R1 oznacza aminokwas wybrany z grupy Ile, Val, Ser, Thr lub Ala R2 oznacza aminokwas wybrany z grupy Pro, Gly, Lys lub Arg R3 oznacza aminokwas wybrany z grupy Phe, Lys, Met, Gin, Glu, Ser, V al, Arg lub Pro R4 oznacza aminokwas wybrany z grupy Asp, Ile, Ser, Met, Pro, Thr, Arg lub Lys R5 oznacza aminokwas wybrany z grupy Asn, Lys, Ser, Glu, Ala, Gln, His lub Arg i R6 oznacza aminokwas wybrany z grupy Asp, Phe, Thr, Arg, Leu lub Ser. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest analog czynnika X, rekombinowany DNA, kompozycje, zastosowanie rekombinowanego kwasu nukleinowego DNA oraz sposoby wytwarzania kompozycji.

Po zapoczątkowaniu procesu krzepnięcia krwi kaskada krzepnięcia przebiega poprzez sekwencyjne aktywowanie różnych proenzymów (zymogenów) we krwi do ich aktywnych postaci, proteaz serynowych. Należą do nich między innymi: czynnik XII/XIIa, czynnik XI/XIa, czynnik X/Xa, czynnik VII/VIIa i protrombina/trombina. Większość spośród tych enzymów jest aktywna w stanie fizjologicznym tylko wtedy, gdy tworzą one kompleks połączony z powierzchnią błony. W wiele tych procesów są włączone jony Ca. Krzepnięcie krwi następuje na szlaku wewnątrzpochodnym, na którym wszystkie składniki białkowe znajdują się we krwi, lub na szlaku zewnętrzpochodnym na którym krytyczną rolę odgrywa czynnik tkankowy błony komórkowej. Zamknięcie rany następuje ostatecznie w wyniku rozszczepienia fibrynogenu do fibryny przez trombinę.

Za aktywowanie protrombiny do trombiny jest odpowiedzialny kompleks protrombinazowy. Trombina jest ważnym enzymem, który może działać zarówno jako prokoagulant jak i jako antykoagulant. Kompleks protrombinazowy, w którym mają udział między innymi czynnik Va (jako kofaktor i czynnik Xa (jako proteaza serynowa), wchodzi w skład zależnego od Ca związku asocjacyjnego na powierzchni fosfolipidów. Przedmiotem dyskusji jest przy tym problem, czy czynnik Xa jest składnikiem katalitycznym kompleksu protrombinazowego.

Czynnik X (czynnik Stuarta/Prowera) jest zależną od witaminy K glikoproteiną koagulacyjną, która może być aktywowana przez wewnętrzną i zewnętrzną kaskadę krzepnięcia. Pierwotny produkt translacji czynnika X (prepro-FX) zawiera 488 aminokwasów i najpierw jest syntetyzowany jako jednołańcuchowe białko prekursorowe 75 kD przez wątrobę lub komórki wątrobiaka ludzkiego. W osoczu krwi czynnik X występuje w znacznym stopniu jako cząsteczka dwuhańcuchowa (Fair i wsp., 1984, Blood 64:194-204).

Podczas biosyntezy, po odszczepieniu pre-sekwencji przez peptydazę sygnałową (między Ser23/Leu24) i propeptydu (między Arg40/Ala41), rozszczepia się cząsteczkę jednołańcuchowego czynnika X przez przekształcenie i usunięcie tripeptydu Arg180-Lys181-Arg182 do postaci dwułańcuchowej, składającej się z lekkiego łańcucha około 22 kD i ciężkiego łańcucha około 50 kD, które są połączone ze sobą poprzez mostek disiarczkowy (fig. 1). Czynnik X krąży więc w osoczu jako cząsteczka dwułańcuchowa.

Podczas trwania procesu krzepnięcia krwi czynnik X ulega konwersji z nieaktywnego zymogenu w aktywny proteazowy czynnik Xa przez limitowaną proteolizę, przy czym aktywowanie czynnika X do czynnika Xa może następować w 2 kompleksach połączonych z błoną: zewnętrznym kompleksie czynnika VIIa^/czynnika tkankowego lub wewnętrznym kompleksie czynnika VIIIa-czynnika IXa-fosfolipidu-Ca lub „kompleksie tenazowym” (Mertens i wsp., 1980, Biochem. J. 185:647-658). Rozszczepienie proteolityczne między aminokwasami Arg 234/IIe235 prowadzi do uwolnienia peptydu aktywacyjnego o długości 52 aminokwasów z N-końca ciężkiego łańcucha i w efekcie do powstania aktywnego enzymu, czynnika Xa. Ośrodek katalityczny czynnika Xa jest zlokalizowany na ciężkim łańcuchu.

Aktywowanie przez kompleks czynnika VIIa-TF (zewnętrzny) prowadzi do powstania czynnika Xaa (35 kD) i czynnika XaP (31 kD), przy czym w razie małego stężenia czynnika VIIa w kompleksie występuje także polipeptyd o 42 kD. Czynnik Xaa powstaje w wyniku rozszczepienia ciężkiego łańcucha przy Arg234/Ile235 i reprezentuje aktywowanie czynnika X do czynnika Xa. Występowanie czynnika Xap jest prawdopodobnie wynikiem autokatalitycznego odszczepienia przy Arg469/Gly470 na C-końcu ciężkiego łańcucha czynnika Xaa i odszczepienia peptydu 4,5 kD. Czynnik XaP tak samo jak czynnik Xaa ma aktywność katalityczną. Wykazano jednak, że w wyniku rozszczepienia czynnika Xaa do czynnika Xap powstaje miejsce wiązania plazminogenu i czynnik Xap posiada również aktywność fibrynolityczną lub uczestniczy w fibrynolizie jako kofaktor. Przekształcanie czynnika Xaa w czynnik Xaβ jest jednak powolniejsze niż tworzenie trombiny, co stanowi przeszkodę w zapoczątkowaniu fibrynolizy przed powstaniem skrzepu krwi (Pryzdial i wsp., 1996, J. Biol. Chem. 271:16614-16620; Pryzdial i wsp., 1996, J. Biol. Chem. 271:16621-16626).

Polipeptyd 42 kD powstaje w wyniku przekształcenia w C-końcu ciężkiego łańcucha między Arg469/Gly470 bez poprzedniego przekształcenia między Arg234/Ile235. Ten produkt

190 734 pośredni, tak samo jak fragment czynnika Xay, który powstaje w wyniku proteolizy przy Lys370, nie ma aktywności katalitycznej (Mertens i wsp., 1980, Biochem J. 185:647-658; Pryzdial i wsp., 1996, J. Biol. Chem. 271:16614-16620).

Aktywowanie czynnika X na szlaku wewnątrzpochodnym jest katalizowana przez kompleks czynnika EXa-czynnika VUIa. Podczas aktywowania otrzymuje się takie same produkty przekształcenia, lecz czynnik XaP jako produkt otrzymuje się w większej ilości niż inne produkty przekształcania czynnika X (Jesty i wsp., 1974, J. Biol. Chem. 249:5614).

In vitro czynnik X można aktywować np. za pomocą jadu żmii Russelła (Vipera russelli) (RW) lub trypsyny (Bajaj i wsp., 1973, J. Biol. Chem. 248:7729-7741) albo oczyszczonych aktywatorów fizjologicznych, takich jak kompleks FVIIa/TF lub kompleks czynnika IXa/czynnika VHIa (Mertens i wsp., 1980, Biochem. J. 185:647-658).

Dostępne w handlu produkty czynnika X z osocza zawierają najczęściej mieszaninę czynnika Xaa i czynnika Χηβ, gdyż po aktywowaniu czynnika X do czynnika Xa powstaje przede wszystkim czynnik Xaa, który w procesie autokatalitycznym znowu zostaje rozszczepiony do czynnika Xap. W celu wytworzenia czynnika Xa jako jednolitego produktu o wysokiej jednorodności cząsteczkowej, zaproponowano w EP 0 651 054 aktywowanie czynnika X przez dłuższy czas przez RW, tak że powstały tak produkt końcowy zawierał głównie czynnik Xap. Zarówno produkty uboczne, np. czynnik Xaa, jak i proteazę usuwano następnie za pomocą kilku operacji chromatograficznych.

cDNA dla czynnika X został wyodrębniony i scharakteryzowany (Leytus i wsp., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82:3699-3702; Fung i wsp., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82:3591-3595). Ludzki czynnik X poddawano in vitro ekspresji w różnego rodzaju komórkach, takich jak ludzkie zarodkowe komórki nerkowe lub komórki CHO (Rudolph i wsp., 1997, Prot. Expr. Purif. 10:373-378; Wolf i wsp., 1991, J. Biol. Chem. 266:13726-13730).

Stwierdzono jednak, że przy ekspresji rekombinacyjnej ludzkiego czynnika X przekształcenie w pozycji Arg40/Ala41 w przeciwieństwie do sytuacji in vivo przebiega z małą wydajnością i w lekkim łańcuchu czynnika X powstają różne N-końce (Wolf i wsp., 1991, J. Biol. Chem. 266:13726-13730). Rekombinowany czynnik X (rFX) został aktywowany in vitro przez RW do r-czynnika Xa (rFXa) lub rFXa został bezpośrednio poddany ekspresji, przy czym peptyd aktywacyjny od aminokwasu 183 do aminokwasu 234 został poddany delecji i zastąpiony przez tripeptyd, aby umożliwić bezpośrednie przekształcenie w dwułańcuchową postać rFXa. Oczyszczony rFX został przekształcony w około 70% w lekkie i ciężkie łańcuchy, podczas gdy pozostałe 30% stanowiły jednołańcuchowe rFX o 75 kD. Wprawdzie bezpośrednia ekspresja rFXa prowadziła do powstania aktywnego czynnika Xa, to jednak także spowodowała wytworzenie się nieaktywnych produktów pośrednich. Wolf i wsp. (1991, J. Biol. Chem. 266:13726-13730) stwierdzili ponadto mniejszą aktywność rekombinowanego czynnika X, którą tłumaczyli gorszym aktywowaniem rFX przez RW oraz nieaktywną populacją białek i polipeptydów jednołańcuchowej cząsteczki prekursora wej. Stwierdzili oni zwłaszcza dużą niestabilność rFXa przy ekspresji przez rekombinowane komórki, co tłumaczyli dużą prędkością autoproteolizy.

W celu zbadania działania C-końcowego peptydu czynnika Xaa, Eby i wsp. (1992, Blodd 80 (Suppl. 1): 1214A) wprowadzili kodon zatrzymujący w pozycji Gly430 sekwencji czynnika X. Nie stwierdzili oni jednak żadnej różnicy między stopniem aktywowania czynnika Xa (FXaa) z β-peptydem a mutanta delecyjnego bez β-peptydu (FXaP).

Czynnik Xa jest ważną częścią składową kompleksu protrombinazowego, więc mógłby być stosowany do leczenia pacjentów z zaburzeniami krzepnięcia krwi, np. przy hemofilii.

Leczenie chorych na hemofilię pacjentów z niedoborem czynnika VIII lub czynnika IX przy użyciu koncentratów czynników, otrzymanych z osocza, jest jednak często trudne przy dłuższym czasie leczenia, ponieważ są wytwarzane przeciwciała hamujące przeciwko tym czynnikom. Opracowano więc cały szereg alternatywnych sposobów leczenia pacjentów chorych na hemofilię przy użyciu czynników o aktywności bypass'owej. Zaproponowano stosowanie w tym celu koncentratu kompleksu protrombinowego, częściowo aktywowanego kompleksu protrombinazowego (APPC), czynnika VIIa lub FEIBA. Dostępnymi w handlu preparatami z czynnikiem VIIa o aktywności bypass'owej (FEIBA) są np. FEIBA® lub Autoplex®. FEIBA zawiera np. porównywalne jednostki czynnika II, czynnika VII, czynnika EX,

190 734 czynnika X i FEIBA, małe ilości czynnika VIII i czynnika V, oraz śladowe ilości aktywowanych czynników koagulacyjnych, takich jak trombina i czynnik Xa lub czynnik o aktywności podobnej do aktywności czynnika X (Elsinger, 1982, Activated Prothrombin Complex Concentrates. Ed. Mariani, Russo, Mandelli, p. 77-87). Elsinger zwraca uwagę zwłaszcza na znaczenie aktywności „podobnej jak czynnika Xa” w FEIBA. Aktywność bypass'owa czynnika VIII została pokazana na modelu zwierzęcym przez Gilesa i wsp. (1988, British J. Haematology 9:491-497) dla mieszaniny oczyszczonego czynnika Xa i fosfolipidów.

Istnieje duże zapotrzebowanie i szereg różnych dziedzin stosowania dla czynnika X/X a lub białek podobnych do czynnika X/Xa, samego lub jako składnika kompleksu koagulacyjnego w terapii przeciwkrwotocznej.

Okres półtrwania czynnika Xa w porównaniu z zymogenem jest silnie obniżony zarówno in vivo jak i in vitro. Tak np. czynnik X w glicerynie może być przechowywany stabilnie przez 18 miesięcy, podczas gdy czynnik Xa w takich samych warunkach jest stabilny tylko przez 5 miesięcy (Bajaj i wsp., 1973, J. Biol. Chem 248:7729-7241) albo w glicerynie w temperaturze 4°C wykazuje po upływie 8 miesięcy zmniejszenie aktywności o powyżej 60% (Teng i wsp., 1981, Thrombosis Res. 22: 213-220). Okres półtrwania czynnika Xa w surowicy wynosi tylko 30 sekund.

Ze względu na niestabilność czynnika Xa zaproponowano podawanie preparatów czynnika X (US 4,501,731). Przy groźnych dla życia krwawieniach, zwłaszcza u pacjentów chorych na hemofilię, podawanie czynnika X jest jednak nieskuteczne, gdyż wskutek braku funkcjonalnego „kompleksu tenasowego” na wewnątrzpochodnym szklaku krzepnięcia krwi nie może nastąpić wystarczająca aktywacja czynnika X do czynnika Xa a aktywacja na szlaku zewnątrzpochodnym częstokroć przebiega za wolno, aby osiągnąć szybkie działanie.

Ponadto u pacjentów chorych na hemofilię występuje wystarczająco dużo czynnika X, który jednak w porównaniu z czynnikiem Xa ma 1000-krotnie mniejszą aktywność protrombinazową. W takich przypadkach wymagane jest bezpośrednie podawanie aktywowanego czynnika Xa, ewentualnie razem z fosfolipidami, jak pisali Giles i wsp. (1988, British J. Haematology 9:491-497), lub razem z innymi czynnikami krzepnięcia, np. z czynnikiem VIII o aktywności bypass'owej.

Wytwarzanie czynnika Xa z czynnika X odbywało się dotychczas najczęściej przez aktywację niefizjologicznymi aktywatorami o pochodzeniu zwierzęcym, takimi jak RVV lub trypsyna, przy czym jednak konieczna była absolutna pewność, że produkt końcowy jest całkowicie wolny od tych proteaz. Jak już wspomniano wyżej, podczas aktywowania czynnika X do czynnika Xa tworzy się duża ilość częściowo także nieaktywnych produktów pośrednich (Bajaj i wsp., 1973, J. Bio. Chem. 248 : 7729-7741; Mertens i wsp., 1980, Biochem. J. 185:647-658). Obecność takich produktów pośrednich powoduje zmniejszenie aktywności właściwej produktu i ewentualnie takie produkty pośrednie mogą działać jako antagoniści aktywnej proteazy serynowej. Do wytwarzania jednorodnego, czystego produktu o dużej aktywności właściwej są więc potrzebne w konwencjonalnych metodach pracochłonne sposoby aktywowania oraz oczyszczania chromatograficznego.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest analog czynnika X, charakteryzujący się tym, że posiada modyfikację w rejonie naturalnie występującego miejsca rozszczepienia aktywacyjnego do czynnika Xa w sekwencji czynnika X Gly228-R6-R5-R4-R3-IR2-Arg234-R1, przy czym modyfikacja ta stanowi miejsce przekształcania dla nienaturalnie w tym rejonie sekwencji czynnika X rozszczepiającej proteazy, a

R1 oznacza aminokwas wybrany z grupy Ile, Val, Ser, Thr lub Ala

R2 oznacza aminokwas wybrany z grupy Pro, Gly, Lys lub Arg

R3 oznacza aminokwas wybrany z grupy Phe, Lys, Met, Gln, Glu, Ser, Val, Arg lub Pro

R4 oznacza aminokwas wybrany z grupy Asp, Ile, Ser, Met, Pro, Thr, Arg lub Lys

R5 oznacza aminokwas wybrany z grupy Asn, Lys, Ser, Glu, Ala, Gln, His lub Arg i

R6 oznacza aminokwas wybrany z grupy Asp, Phe, Thr, Arg, Leu lub Ser.

Korzystnie modyfikacja dotyczy co najmniej jednego aminokwasu wewnątrz sekwencji aminokwasowej peptydu aktywacyjnego, korzystniej modyfikacja ta stanowi wymianę co najmniej jednego aminokwasu między Gly228 a Arg 234 oraz ewentualnie Ile235, w odniesieniu do numeracji aminokwasów według fig. 1.

190 734

Korzystnie modyfikacja stanowi miejsce przekształcania dla proteazy wybranej z grupy endoproteaz, takich jak np. keksyna/Kex2, furyna/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7, proteaz serynowych, takich jak np. czynnik Ha, czynnik XHa, czynnik XIa, czynnik Xa> lub kalikreiny, albo pochodnej tych proteaz.

Korzystnie analog czynnika X posiada modyfikację w rejonie C-końcowej sekwencji aminokwasowej czynnika X, korzystniej posiada modyfikację w rejonie C-końcowego miejsca rozszczepienia β-peptydu, jeszcze korzystniej modyfikację stanowi mutacja, delecją lub insercją w rejonie sekwencji aminokwasowej czynnika X między pozycjami aminokwasów Arg469 a Ser476.

Korzystnie modyfikacja zapobiega odszczepieniu β-peptydu.

Korzystnie analog czynnika X posiada delecję β-peptydu czynnika X.

Korzystnie analog czynnika X posiada sygnał zatrzymania translacji w rejonie C-końcowym sekwencji czynnika X, korzystniej posiada sygnał zatrzymania translacji w pozycji aminokwasu 470 sekwencji czynnika X.

Korzystnie analog czynnika X posiada modyfikację w rejonie peptydu aktywacyjnego umożliwiającą aktywowanie in vitro analogu czynnika X do natywnego czynnika Xa lub analogu czynnika Xa, przy czym korzystniej modyfikacja ta umożliwia aktywowanie przez proteazę wybraną z grupy endoproteaz, takich jak keksyna/Kex2, furyna/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7, grupy proteaz serynowych, takich jak np. czynnik Ha, czynnik XHa, czynnik XIa, czynnik Xa, lub kalikreinę, albo pochodną tych proteaz.

Korzystnie analog czynnika X posiada modyfikację umożliwiającą aktywowanie in vivo analogu czynnika X do natywnego czynnika Xa lub analogu czynnika Xa, przy czym korzystniej modyfikacja ta umożliwia aktywowanie przez proteazę wybraną z grupy proteaz serynowych, takich jak np. czynnik XHa, czynnik XIa, czynnik Ha, czynnik Xa, lub przez kalikreinę.

Korzystnie analog czynnika X stanowi analog czynnika X z nienaruszonym (β-peptydem lub analog czynnika X skrócony na C-końcu.

Korzystnie analog czynnika X stanowi cząsteczkę jednołańcuchową.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto rekombinowany DNA charakteryzujący się tym, że koduje analog czynnika X jak określono powyżej, zawarty w wektorze do rekombinacyjnej ekspresji kodowanego białka.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja zawierająca oczyszczony analog czynnika X lub jego białko prekursorowe z modyfikacją w rejonie naturalnie występującego miejsca rozszczepienia aktywacyjnego czynnika X w sekwencji czynnika X w sekwencji Gly228-R6-R5-R4-R3-R2-Arg234-Rl, przy czym modyfikacja ta stanowi miejsce przekształcenia nienaturalnie w tym rejonie sekwencji czynnika X rozszczepiającej proteazy, a

Rl oznacza aminokwas wybrany z grupy De, Val, Ser, Thr lub Ala

R2 oznacza aminokwas wybrany z grupy Pro, Gly, Lys lub Arg

R4 oznacza aminokwas wybrany z grupy Asp, Ile, Ser, Met, Pro, Thr, Arg lub Lys

R6 oznacza aminokwas wybrany z grupy Asp, Phe, Thr, Arg, Leu lub Ser.

Korzystnie modyfikacja stanowi miejsce rozszczepienia dla proteazy, wybranej z grupy endoproteaz dwuzasadowych, takich jak np. keksyna/Kex2, furyna/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7, proteaz serynowych, takich jak np. czynnik IIa, czynnik XHa, czynnik XIa, czynnik Xa, lub kalikreiny.

Korzystniej analog czynnika X stanowi analog FXa.

Korzystniej analog czynnika X stanowi analog czynnika X skrócony na C-końcu.

Korzystnie kompozycja zawiera analog czynnika X jako cząsteczkę jednołańcuchową w postaci wyodrębnionej, a zwłaszcza jednołańcuchowy analog czynnika X w enzymatycznie nieaktywnej postaci o czystości co najmniej 80%, korzystnie 90%, szczególnie korzystnie 95%, i nie zawiera nieaktywnych, proteolitycznych produktów pośrednich analogu czynnika X/Xa.

Korzystnie kompozycja zawiera analog czynnika X jako cząsteczkę dwułańcuchową w postaci wyodrębnionej.

190 734

Korzystnie kompozycja zawiera analog czynnika X, posiadający modyfikację, która umożliwia aktywowanie in vitro analogu czynnika X do natywnego czynnika Xa lub analogu czynnika Xa.

Korzystnie kompozycja ma postać preparatu farmaceutycznego.

Korzystnie kompozycja umieszczona jest w odpowiednim urządzeniu, zwłaszcza w urządzeniu aplikacyjnym, w kombinacji z proteazą, wybraną z grupy endoproteaz, takich jak np. keksyna/Kex2, furyna/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7, grupy proteaz serynowych, takich jak np. czynnik XIIa, czynnik XIa, czynnik Xa, lub kałkoremą, ćlll^o pochodną tych proteaz, korzystniej składniki są oddzielone od siebie przestrzennie.

Korzystnie kompozycja zawiera analog czynnika X, posiadający modyfikację, która umożliwia aktywowanie in vivo analogu czynnika X do natywnego czynnika Xa lub analogu czynnika Xa.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja charakteryzująca się tym, że zawiera analog czynnika Xa i jest wolna od nieaktywnych produktów pośrednich analogu czynnika X/Xa oraz autoproteolitycznych produktów rozkładu czynnika X, i która może być otrzymywana przez aktywowanie analogu czynnika X jak określono powyżej.

Korzystnie kompozycja zawiera dopuszczalny fizjologicznie nośnik i jest w postaci stabilnej podczas składowania.

Korzystnie kompozycja zawiera ewentualnie jako dalszą część składową czynnik krwi lub aktywowaną postać czynnika krwi, korzystniej zawiera jako dalszą część składową co najmniej jeden składnic z czynnikiem VIII o aktywności bypass'owej.

Korzystnie kompozycja stanowi składnik zestawu farmaceutycznego i ewentualnie ma postać preparatu kilku-składnikowego.

Przedmiotem wynalazku jest też zastosowanie kompozycji jak określono powyżej do wytwarzania środka leczniczego.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie rekombinowanego kwasu nukleinowego DNA kodującego analog czynnika X jak określono powyżej, i zawartego w wektorze do rekombinacyjnej ekspresji kodowanego białka do wytwarzania środka leczniczego.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania kompozycji zawierającej oczyszczony rekombinowany analog czynnika X polegający na tym, że otrzymany rekombinacją nie analog czynnika X wyodrębnia się i oczyszcza metodą chromatograficzną.

Korzystnie sposób obejmuje etapy, w których:

- dostarcza się kwas nukleinowy określony powyżej

- transformuje się odpowiednią komórkę

- poddaje się ekspresji analog czynnika X

- ewentualnie inkubuje się analog czynnika X z proteazą

- wyodrębnia się analog czynnika X i

- oczyszcza się analog czynnika X metodą chromatograficzną.

Korzystnie analog czynnika X wyodrębnia się jako cząsteczkę dwułańcuchową.

Korzystniej dwułańcuchowy analog czynnika X kontaktuje się z proteazą wybraną z grupy endoproteaz, takich jak np. keksyna/Kex2, furyna/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7, grupy proteaz serynowych, takich jak np. czynnik IIa, czynnik Xlla, czynnik XIa, czynnik Xa, lub kalikreinaą albo pochodną tych proteaz, w warunkach, w których analog czynnika X aktywuje się do natywnego czynnika Xa lub analogu czynnika Xa, i korzystniej stosuje się komórkę, która może przeprowadzać rozszczepianie pojedynczego łańcucha na lekki i ciężki łańcuch czynnika X lub analogu czynnika X, nie eksprymuje i ewentualnie posiada deficyt proteazy, a zwłaszcza stosuje się komórkę nie eksprymującą endoproteazy, takiej jak np. keksyna, furyna, PACE lub ich pochodna.

Korzystnie analog czynnika X wyodrębnia się jako cząsteczkę jednołańcuchową.

Korzystniej jednołańcuchowy ewentualnie wyodrębniony analog czynnika X kontaktuje się z proteazą wybraną z grupy endoproteaz, takich jak keksyna/Kex2, furyna/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7, lub pochodną tych proteaz, w warunkach w jakich rozszczepia się jednołańcuchowy analog czynnika X do dwułańcuchowej postaci czynnika X, korzystniej jednołańcuchowy analog czynnika X, ewentualnie przez kontaktowanie z proteazą, aktywuje się bezpośrednio do czynnika Xa lub analogu czynnika Xa.

190 734

Korzystnie dwułańcuchowy analog czynnika X kontaktuje się z dalszą inną niz poprzednia proteazą i aktywuje do analogu czynnika Xa lub natywnego czynnika Xa.

Korzystnie stosuje się proteazę unieruchomioną.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania kompozycji zawierającej aktywny czynnik Xa lub analog czynnika Xa polegający na tym, że analog czynnika X otrzymany sposobem określonym powyżej poddaje się operacji aktywowania.

Analog czynnika X według wynalzku może posiadać modyfikację w rejonie naturalnie występującego miejsca rozszczepiania aktywacyjnego czynnika Xa. Modyfikacja w rejonie miejsca rozszczepiania aktywacyjnego jest nowym, występującym nienaturalnie w tej pozycji polipeptydu miejscem rozpoznania lub przekształcenia dla proteazy, która zwykle nie rozszczepia polipeptydu w tym miejscu.

Analog czynnika X według wynalazku może posiadać przy tym modyfikację zwłaszcza w peptydzie aktywacyjnym, który zostaje odszczepiony podczas aktywowania czynnika X do czynnika Xa. Modyfikacja dotyczy przy tym co najmniej jednego aminokwasu wewnątrz sekwencji aminokwasowej peptydu aktywacyjnego czynnika X. Modyfikacja ma przy tym miejsce zwłaszcza w rejonie C-końcowym peptydu aktywacyjnego i stanowi co najmniej jedną wymianę co najmniej jednego aminokwasu między pozycjami Gly228 a Arg234 sekwencji aminokwasowej czynnika X. Pozycje aminokwasów odnoszą się przy tym do numeracji sekwencji przedstawionej na fig. 1 zaczynającej się od Met1 i kończącej na Lys488.

Modyfikację w analogu czynnika X według wynalazku stanowi przede wszystkim wymiana występującego w tym rejonie miejsca przekształcenia czynnika VIIa lub czynnika IXa na alternatywne miejsce rozszczepiania dla proteazy. Modyfikacją może być przy tym zastąpienie co najmniej jednego aminokwasu lub wstawienie sekwencji peptydowej, która stanowi miejsce rozpoznania proteazy lub miejsce odszczepienia. Modyfikacja w analogu czynnika X według wynalazku jest przy tym przeważnie tego rodzaju, że stanowi ona sekwencję rozpoznania lub odszczepienia dla proteazy z grupy endoproteaz, takich jak np. keksyna/Kex2, furyna/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7 (jak opisano w Barr i wsp., 1991, Celi 66:1-3 lub US 5,460,950), proteaz serynowych, takich jak np. czynnik XHa, czynnik XIa, czynnik IIa, czynnik Xa lub kalikreiny, albo pochodnej tych proteaz.

Modyfikacja jest dobrana przede wszystkim tak, że przekształcenie przez jedną z tych proteaz prowadzi do odpowiadającego natywnemu czynnikowi Xa polipeptydu, który zasadniczo jest podobny do występującej naturalnie sekwencji czynnika Xa i również posiada aktywność czynnika Xa.

W celu osiągnięcia optymalnego przekształcenia, może być potrzebna w pojedynczych przypadkach dodatkowa wymiana aminokwasu Ile235. Po aktywacji przeważnie powinna być jednak pozostawiona izoleucyna, NH₂-końcowy aminokwas ciężkiego łańcucha, gdyż ten aminokwas pełni ważną funkcję w tworzeniu kieszeni wiążącej substrat (Watzke i wsp., 1995, Molecular Basis of Thrombosis and Hemostasis ed. Katherine High & Harold Roberts). Analogi czynnika X według wynalazku wykazują różnicę struktualną, zwłaszcza na płaszczyźnie aminokwasowej w porównaniu z natywną sekwencją czynnika X, wykazują jednak porównywalną aktywowalność, takąjak występujący naturalnie czynnik X lub po aktywacji aktywność czynnika Xa.

Przykładowo pewna ilość analogów czynnika X według wynalazku może posiadać modyfikacje w peptydzie aktywacyjnym w stosunku do występującej naturalnie sekwencji czynnika X oraz zmienioną swoistość proteazową.

Modyfikacje mogą mieć miejsce w jednej lub kilku pozycjach w rejonie między aminokwasami Gly228 a Arg234 i ewentualnie Ile235, w odniesieniu do sekwencji czynnika X o numeracji od Met1 do L^i^^488 według fig. 1. Zastępowanie aminokwasów może się przy tym odbywać w pozycji Ile235 (R1), Arg234, Thr233 (R2), Leu232 (R3), Asn231 (R4), Asn230 (R5) i Asp229 (R6), przy czym jednak przeważnie Arg234 pozostaje bez zmiany.

Analogi czynnika X według wynalazku zawierają przeważnie sekwencję czynnika X z Gly 228-R6-R5-R4-R3-R2-Arg234 z R1=Ile, Val, Ala, Ser lub Thr; R₂ = Thr, Pro, Gly, Lys lub Arg; R3 = Leu, Phe, Lys Glu, Met, Gln, Ser, Val, Arg lub Pro; R⁴ = Asn, Asp, Ile, Ser, Met, Pro, Thr, Lys lub Arg; R⁵ = Asn, Lys, Ser, Glu, Ala, Gln, His lub Arg oraz R6 = Asp, Phe, Thr, Arg, Leu lub Ser.

190 734

Zalecaną postacią realizacji analogów czynnika X według wynalazku są analogi czynnika X, które posiadają modyfikację:

a) R1 = Val, R2 = Thr, R3 = Phe, R4 = Asp, R5 = Asn i ewentualnie R6 = Phe (fig. 2A) i przekształca się go za pomocą czynnika X3a;

b) R1 = Ser, R2 = Arg, R3 = Thr, R4 = Leu (fig. 2B) i przekształca się go za pomocą FIIa;

c) R1 = Ile, R2 = Pro, R3 = Lys, R4 = Ile i ewentualne R5 = Lys i/lub r6 = Thr (fig. 2C) albo R1 - Ile, R2 = Thr, R3 = Ser, r4 = Thr i ewentualnie R5 = Lys i/lub R6 = Thr (fig. 21) i przekształca się je za pomocą czynnika XIIa;

d) R1 = Ile, R2 = Thr, R3 = Met, R4 = Ser i ewentualnie R5 = Ser ί/lub R6 = Leu (fig. 2D) i przekształca się go za pomocą kalikreiny;

e) R1 = De, R2 = Gly, R3 = Gln, R4 = Pro i ewentualne R5 = Lys i/lub R6 = Ser (fig. 2H) albo

R1 = Ile, R2 = Thr, R3 = Lys i R4 = Met (fig. 2E) albo R1 = Ile, R2 = Gly, R3 = Glu i R4 = Ile (fig. 2F) i przekształca się go za pomocą czynnika Xa;

f) R1 = Ile, R2 = Lys, R3 = Arg, R4 = Arg i ewentualnie R5 = Glu i/lub R6 = Leu albo

R1 = Ile, R2 = Thr, R3 = Val, R4 = Arg i ewentualnie R5 = Ala i/lub R6 = Leu albo

R1 = Ile, R2 = Arg, R3 = Val, R4 = Arg i ewentualnie R5 = Gln i/lub R6 = Leu albo

R1 = Ile, R2 = Arg, R3 = Arg, R4 = Arg i ewentualnie R5 = His i/lub R6 = Leu albo

R1 = Ile, R2 = Lys, R3 = Pro, R4 = Arg i ewentualnie R5 = Asn i/lub R6 = Leu albo

R1 = Ile, R2 = Lys, Re = Arg, R4 = Ile i ewentualnie R5 = Arg i/lub R6 = Leu albo

R1 = Ile, R2 = Lys, R3 = Ser i R4 = Arg albo

R1 = Ile, R2 = Thr, R3 = Val i R4 = Arg albo

R1 = Ile, R2 = Lys, R3 = Leu i R4 = Arg (patrz wszystkie fig. 2G), przy czym grupy wymienione w f) przekształca się za pomocą endoproteazy dwuzasadowej takiej jak np. furyna, PACE, keksyna/Kex2, furyna/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7 lub pochodnej jednej z tych proteaz.

Wybór możliwych modyfikacji i wymian aminokwasów, które prowadzą do zmienionych swoistości proteaz są podane na fig. 2A-I.

Modyfikacje można przy tym wykonywać za pomocą prowadzonej in vitro mutagenazy lub PGR albo innej znanej ze stanu techniki metody genowej, które nadają się do swoistego zmieniania sekwencji DNA w celu zrealizowania docelowej wymiany aminokwasów.

Aktywowanie analogu czynnika X według wynalazku do natywnego czynnika Xa lub analogu czynnika Xa przeprowadza się według niniejszego wynalazku przeważnie za pomocą proteazy, wybranej z grupy endoproteaz, takich jak np. keksyna/Kex2, furyna/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7, grupy proteaz serynowych, takich jak np. czynnik XIIa, czynnik XIa, czynnik Xa, czynnik IIa lub kalikreiny, albo pochodnej tych proteaz.

Jedną z trudności występujących przy wytwarzaniu aktywnego czynnika Xa jest jego niestabilność, gdyż wskutek autokatalizy powstają z niego oprócz czynnika Xao i czynnika Xap także inne nieaktywne produkty pośrednie. W celu zapewnienia wytwarzania zasadniczo nienaruszonego, aktywnego czynnika X/Xa lub cząsteczek podobnych do czynnika X/Xa byłoby więc pożądane otrzymywanie tylko takich białek, które prowadzą do stabilnych produktów końcowych.

Wiadomo, że uprzywilejowane miejsce rozszczepiania do przekształcania czynnika Xaa (FXaa) w czynnik Xap (FXap) leży między Arg469/Gly470. Na podstawie badań Eby, i wsp. (1992, Blood. Vol. 80, Suppl 1, 1214) wykryto oprócz sławnego peptydu C-końcowego (rodników aminokwasów 476 do 487) czynnika X dalszy krótszy peptyd (rodniki aminokwasów 474 do 477), który powstaje w wyniku autokatalizy czynnika Xarn

W celu zapewnienia docelowego przekształcenia nienaruszonego czynnika X w zasadniczo aktywny czynnik Xa, bez równoczesnego otrzymywania nieaktywnych produktów pośrednich tego przekształcenia, analogi czynnika X według wynalazku posiadają ewentualnie dalsze modyfikacje.

Analog czynnika X według wynalazku posiada więc zgodnie ze specjalną postacią wykonania wynalazku dalszą modyfikację w rejonie C-końcowym sekwencji aminokwasowej czynnika X.

W jednej z postaci wykonania wynalazku analog czynnika X wyżej opisanego rodzaju może posiadać nieaktywny β-peptyd (FXo). Analog czynnika X według wynalazku może po12

190 734 siadać przy tym modyfikację zwłaszcza w rejonie C-końcowego miejsca odszczepienia β-peptydu, które zapobiega temu, aby po aktywacji czynnika X do czynnika Xa nastąpiło odszczepienie β-peptydu od czynnika X. Dzięki temu otrzymuje się cząsteczkę czynnika Xa, która może zostać wyodrębniona w ilości do 100% jako nieczynna cząsteczka czynnika Xaa.

Modyfikacją może być mutacja, delecja lub insercja w rejonie sekwencji aminokwasowej czynnika X między pozycją aminokwasu Arg469 a Ser476 i ewentualnie Lys370. Uprzywilejowane jest jednak takie zastąpienie aminokwasu, przy którym w wyniku wymiany aminokwasu nie może nastąpić pofałdowanie polipeptydu wpływające na strukturę i przez to ewentualnie na działanie i aktywność białka.

W jednej z postaci wykonania wynalazku analogi czynnika X według wynalazku mogą posiadać wymianę jednego z aminokwasów w pozycji Arg469 i/lub Gly470, przy czym Arg469 wymienia się zwłaszcza na Lys, His lub Ile a Gly470 zwłaszcza na Ser, Ala, Val lub Thr.

Analogi czynnika X według wynalazku mogą posiadać oprócz mutacji w pozycji Arg469 i/lub Gly470 dalszą mutację w pozycji Lys370 i/lub Lys475 i/lub Ser476.

Przez zastąpienie aminokwasu w jednej z tych pozycji unika się przekształcenia czynnika Xaa w czynnik Xae lub w czynnik Xay, ponieważ występująca(e) naturalnie sekwencja(e) przekształceniowa(e) jest(są) tak zmodyfikowana(e), że nie może już nastąpić ewentualne autokatalityczne odszczepienie peptydu C-końcowego.

W innej postaci wykonania wynalazku analog czynnika X według wynalazku może posiadać delecję C-końcowego β-peptydu (łŃfi). Taki analog czynnika X można otrzymać, gdy cDNA kodujący analog czynnika X podda się ekspresji w rekombinacyjnym układzie ekspresyjnym, przy czym zostają klonowane tylko te sekwencje, które kodują aminokwasy Met1 do Arg469.

W dalszej postaci wykonania wynalazku analog czynnika X według wynalazku może posiadać sygnał zatrzymywania translacji w rejonie C-końcowym sekwencji czynnika X. Sygnał zatrzymania translacji znajduje się przy tym przeważnie w pozycji, która następuje po aminokwasie C-końcowym powstałym w wyniku naturalnego przekształcenia. Sygnał zatrzymania translacji znajduje się więc przeważnie w pozycji aminokwasu 470 sekwencji czynnika X, przez co zostaje zachowany znajdujący się na końcu aminokwas Arg469 czynnika Xa β. Równocześnie kodon GGC kodujący aminokwas Gly470 zostaje zastąpiony przez TAA, TAG lub TGA.

Analogi czynnika X według wynalazku mogą także obejmować takie analogi czynnika X według wynalazku, które przez działanie na nie in vitro odpowiednią proteazą aktywuje się do natywnego czynnika Xa lub analogu czynnika Xa. Zależnie od rodzaju użytego i aktywowanego analogu czynnika X, otrzymuje się odpowiadający natywnemu czynnikowi Xa i zasadniczo identyczny z nim polipeptyd lub polipeptyd, który wprawdzie ma aktywność czynnika Xa, lecz w stosunku do sekwencji natywnego czynnika Xa posiada modyfikacje, które jednak nie obniżająjego aktywności biologicznej.

W wyniku aktywowania analogów czynnika X, które posiadają modyfikację w rejonie peptydu aktywacyjnego w sekwencji peptydu aktywacyjnego, otrzymuje się wyłącznie polipeptydy odpowiadające cząsteczce natywnego czynnika Xa. Jeżeli taki analog czynnika X ewentualnie posiada dodatkowo sygnał zatrzymania translacji w rejonie C-końcowym β-peptydu, wówczas otrzymuje się cząsteczki homologu czynnika Xaβ. Jeżeli jednak stosuje się analog czynnika X, który posiada modyfikację(e) wewnątrz sekwencji β-peptydu, które powodują, że β-peptyd nie zostaje odszczepiony, wtedy otrzymuje się analog czynnika Xaa z wymianą aminokwasu na C-końcu cząsteczki.

Analogi czynnika X według wynalazku posiadają wyłącznie takie modyfikacje, które zmieniają swoistość aktywowalności ale nie wpływają na aktywność. W każdym przypadku otrzymuje się więc aktywną(y) biologicznie i czynnościowo cząsteczkę czynnika Xa lub analog czynnika Xa.

Aktywowanie in vitro można wykonać za pomocą proteazy z grupy endoproteaz, takich jak np. keksyna/Kex2, furyna/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7, grupy proteaz serynowych, takich jak np. czynnik XHa, czynnik XIa, czynnik Xa, lub kalikreiny, albo pochodnej tych proteaz. W zakres niniejszego wynalazku wchodzi jednak stosowanie każdej dowolnej proteazy, z wyjątkiem RVV, trypsyny, czynnika IXa lub czynnika VIIa, jeżeli jest ona zdolna do przekształcenia analogu czynnika X w czynnik Xa.

190 734

Analog czynnika X według wynalazku może zawierać modyfikację, która umożliwia aktywowanie in vivo analogu czynnika X do czynnika Xa, zwłaszcza do natywnego czynnika Xa. „Natywny” czynnik Xa oznacza w tym kontekście, ze aktywowany czynnik Xa, wywodzący się z analogu czynnika X według wynalazku, posiada sekwencję aminokwasową odpowiadającą natywnemu czynnikowi Xa i homologiczną sekwencję aminokwasową oraz zawiera aktywność czynnika Xa. Jest przy tym wybrana taka modyfikacja, aby przekształcenie czynnika X w czynnik Xa nastąpiło w wyniku działania proteazy występującej in vivo, a więc w ciele, zwłaszcza proteazy znajdującej się w kasdadzie krzepnięcia krwi. Proteaza może być przy tym wybrana z grupy proteaz serynowych, takich jak np. czynnik IIa, czynnik XIIa, czynnik XIa, czynnik Xa lub kalikreina. Analogi czynnika X, które oprócz modyfikacji w peptydzie aktywacyjnym posiadają modyfikację w rejonie C-końcowym cząsteczki czynnika X, aktywuje się, jak wyżej opisano, także in vivo do odpowiedniego analogu czynnika Xa.

Chociaż np. Wolf i wsp. (1991, J. Biol. Chem. 266: 13726-13730) przypuścili, ze endopeptydaza taka jak Kex2, furyna lub PACE bierze udział w przekształceniu opisnego w tej grupie mutantu delecyjnego czynnika Xa, nie podali żadnych wskazówek na temat wpływu którejś z tych proteaz na przekształcanie czynnika X. W US 5,660,950 także opisano rekombinacyjne wytwarzanie PACE i stosowanie proteazy do polepszenia przekształcania białek zależnych od witaminy K. W szeregu wyliczeń wymieniono wraz z innymi czynnikami krwi także czynnik X, przy czym jednak brak jest w tej relacji danych liczbowych.

W ramach niniejszego wynalazku pokazano wyraźnie po raz pierwszy, że proteazą koniecznie potrzebną w procesie dojrzewania czynnika X jest endoproteaza dwuzasadowa, zwłaszcza występująca endogennie furyna. In vivo endoproteaza pośredniczy przede wszystkim w rozszczepieniu jednołańcuchowej cząsteczki czynnika X do dojrzałej postaci składającej się z cięższego i lżejszego łańcucha. In vitro pośredniczy ona dodatkowo w odszczepianiu sekwencji propeptydu czynnika X (przykład 2).

Analogi czynnika X według wynalazku, które posiadaj ją miejsce rozszczepiania proteazowego dla proteazy nienaturalnie występującej w komórce, rozszczepia się na drodze selektywnej reakcji przekształcania tylko w takich miejscach, które także ulegają rozszczepianiu w natywnym czynniku X. W ten sposób otrzymuje się rekombinowaną cząsteczkę czynnika X, która składa się tylko z lekkiego łańcucha 22 kD i ciężkiego łańcucha o około 50 kD i nie posiada nieaktywnej cząsteczki czynnika X powstałej w wyniku nieswoistego przekształcenia. Te modyfikowane cząsteczki czynnika X, tak samo jak natywne cząsteczki czynnika X, nie zostają aktywowane do czynnika Xa przez proteazę wewnątrzkomórkową. Zostają one aktywowane do czynnika Xa dopiero później przez odpowiednie proteazy (głównie proteazy serynowe lub proteazy spokrewnione z subtylizyną).

Analog czynnika X według wynalazku może więc mieć postać dwułańcuchowego analogu czynnika X.

Sposobem według wynalazku można wytwarzać analogi czynnika X, które występują jako cząsteczki jednołańcuchowe przeważnie w postaci oczyszczonej. Przez poddanie ekspresji analogu czynnika X w komórkach z deficytem proteazy dwuzasadowej, otrzymuje się proczynnik X w formie cząsteczki jednołańcuchowej. Jednołańcuchowa cząsteczka czynnika X odznacza się dużą stabilnością i jednorodnością cząsteczkową. Dotychczas nie można było wyodrębniać jednołańcuchowej cząsteczki czynnika X w postaci oczyszczonej, gdyż bardzo prędko ulega ona przekształceniu w postać dwułańcuchową(Fair i wsp., 1984, Blood 64:194-204). Rekombinowane jednołańcuchowe analogi czynnika X można przez specjalną obróbkę przekształcać w dwułańcuchową postać czynnika X i następnie aktywować do czynnika Xa lub analogu czynnika Xa. Można to wykonać w ten sposób, że wyodrębnioną z komórki z deficytem proteazy jednołańcuchową rekombinowaną cząsteczkę czynnika X kontaktuje się z proteazą dwuzasadową, taką jak furyna/PACE lub Kex2, i przekształca w dwułańcuchowy analog czynnika X.

Dwułańcuchowy analog czynnika X można aktywować do czynnika Xa lub analogu czynika Xa. Może to nastąpić np. w ten sposób, że analog czynnika X, który w wyniku modyfikacji w rejonie peptydu aktywacyjnego posiada swoiste furynowe miejsce rozszczepiania, wyodrębnia się jako cząsteczkę jednołańcuchową z komórki z deficytem furyny i następnie przez zetknięcie z endoproteazą przekształca w aktywowaną cząsteczkę czynnika Xa.

190 734

Można także wyodrębnić jednołańcuchowy analog czynnika X, który posiada modyfikację w peptydzie aktywacyjnym, umożliwiającą alternatywne przekształcenie przez proteazę z grupy proteaz .serynowych lub kalikreinę, rozszczepić dopiero przez działanie endoproteazą dwuzasadową, taką jak np. furyna, do dwułańcuchowej cząsteczki czynnika X i tę ostatnią, następnie tak kontaktować z proteazą serynową, aby nastąpiło aktywowanie do czynnika Xa lub analogu czynnika Xa.

Analog czynnika X wyodrębniony z hodowli komórkowej w postaci cząsteczki dwułańcuchowej można bezpośrednio poddać działaniu proteazy swoistej dla aktywowania.

Tak otrzymany czynnik Xa lub analog czynnika Xa posiada ze względu na selektywną i ukierunkowaną reakcję przekształcania dużą stabilność i jednorodność strukturalną a zwłaszcza jest wolny od nieaktywnych produktów pośrednich analogu czynnika X/Xa i autoproteolitycznych produktów rozkładu.

Rekombinowany DNA według wynalazku kodujący analog czynnika X według wynalazku daje w wyniku ekspresji analog czynnika X z sekwencją aminokwasową odpowiadająca ludzkiemu czynnikowi X, chyba że posiada on modyfikację, która wpływa na swoistość przekształcenia i produkty przekształcenia, na co zasadniczo nie wpływa aktywność biologiczna czynnika powodującego krzepnięcie krwi.

Rekombinowany kwas nukleinowy DNA może być również zawarty w komórkach transformowanych.

Kompozycja według wynalazku zawiera oczyszczony analog czynnika X lub jego białko prekursorowe, który(a) posiada modyfikację w rejonie występującego naturalnie miejsca aktywowania czynnika Xa. Modyfikacja w rejonie miejsca rozszczepienia aktywacyjnego jest nowym występującym nienaturalnie w tej pozycji w polipeptydzie miejscem rozpoznania lub rozszczepienia dla proteazy, która normalnie w tym miejscu nie przekształca polipeptydu. Kompozycja może być przy tym oczyszczoną kompozycją jednołańcuchowego lub dwułańcuchowego analogu czynnika X, przy czym polipeptydy otrzymuje się z układu hodowli komórkowej po wyodrębnieniu ich z zasobu hodowli komórkowej lub z ekstraktu hodowli komórkowej. Wstępnie oczyszczony analog czynnika X z układu hodowli komórkowej można dalej oczyścić metodą znaną ze stanu techniki. Nadają się do tego zwłaszcza metody chromatograficzne, takie jak filtracja żelowa, chromatografia na bazie wymieniaczy jonowych lub chromatografia powinowactwa.

W jednej z postaci wykonana wynalazku kompozycja według wynalazku może zawierać analog czynnika X zwłaszcza jako cząsteczkę jednołańcuchową w postaci wyodrębnionej. Kompozycję tego rodzaju można wytwarzać tak, że analog czynnika X otrzymany przez wytwarzanie rekombinacyjne jako cząsteczka jednołańcuchowa z układu komórkowego, zwłaszcza z hodowli komórek, nie zawierających endoproteazy, rozszczepia się na ciężki i lekki łańcuch.

W pewnej postaci realizacji wynalazku kompozycja może zawierać jednołańcuchowy analog czynnika X z modyfikacją, która umożliwia aktywowanie go in vitro do czynnika Xa przez jedną z proteaz, wybranych z grupy endoproteaz dwuzasadowych, takich jak np. keksyna/Kex2, ffiryna/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7. Aktywowanie następuje przy tym przez kontaktowane analogu czynnika X z proteazą, przy czym w wymku zachodzącego naturalnie przekształcenia następuje rozszczepienie do dojrzalej postaci czynnika X i przez modyfikację odszczepienie peptydu aktywacyjnego oraz powstaje czynnik Xa lub analog czynnika Xa.

W kompozycji według wynalazku analog czyimika X może występować albo jako cząsteczka jednołańcuchowa w formie czynnika Xa (FXa) albo z delecją β-peptydu. Kompozycja może zawierać zwłaszcza analog czynnika X w nieaktywnej enzymatyczne postaci o czystości co najmniej 80%, korzystnie 90%, szczególnie korzystnie 95%, i nie zawierać nieaktywnych, proteolitycznych produktów pośrednich analogu czynnika XJXa.

Kompozycja według wynalazku może zawierać analog czynnika X zwłaszcza jako cząsteczkę dwułańcuchową w wyodrębnionej postaci. W tym celu np. analog czynnika X otrzymany z układu komórkowego przez wytwarzanie rekombinacyjne jako cząsteczka jednołańcuchowa rozszczepia się do postaci dwułańcuchowej in vitro, a więc na zewnątrz komórki, za pomocą proteazy, zwłaszcza proteazy dwuzasadowej. Może się to odbywać w ten sposób, że protezę miesza się bezpośrednio z zasobem hodowli klonów poddających ekspresji analog

190 734 czynnika X, albo przez mieszanie oczyszczonej proteazy lub zasobu hodowli komórkowej z pochodzącego z hodowli komórkowej wytwarzającej przez ekspresję proteazę w postaci rekombinowanej, albo przez współhodowlę klonów dających ekspresję analogu czynnika X i proteazy.

Można także kontaktować zasób hodowli komórkowej, zawierający analog czynnika X lub oczyszczony analog czynnika X, z unieruchomioną proteazą, przy czym wtedy następuje przekształcenie w postać dwułańcuchową. W tym sposobie proteaząjest związana przeważnie z matrycą a zasób hodowli komórkowej zawierający analog czynnika X kieruje się przez tę matrycę. Możliwe jest jednak także unieruchomienie analogu czynnika X, podczas gdy proteazą znajduje się w fazie ruchomej. Można także zmieszać reagenty (analog czynnika X i proteazę) i inkubować przez pewien czas. Proteazę usuwa się następnie z mieszaniny za pomocą chromatografii powinowactwa.

Postać dwułmrcuchową analogu czynnika X można otrzymać także przez wspólekspresję proteazy i analogu czynnika X bezpośrednio w danej komórce i ewentualnie oczyścić.

Kompozycja według wynalazku może zawierać jednołańcuchowy lub dwułańcuchowy analog czynnika X z modyfikacją która umożliwia aktywowanie in vitro do czynnika Xa lub analogu czynnika Xa. Aktywowanie analogu czynnika X do czynnika Xa lub analogu czynnika Xa może przy tym nastąpić w wyniku zetknięcia analogu czynnika X z proteazą wybraną z grupy endoproteaz dwuzasadowych, takich jak np. keksyna/Kex2, furyna/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7, grupy proteaz serynowych, takich jak np. czynnik XIIa, czynnik XIa, czynnik Ra, czynnik Xa, lub kalikreiną albo z pochodną tych proteaz. Proteaza może być przy tym unieruchomiona na nośniku.

Kompozycja według wynalazku może służyć jako materiał wyjściowy do wytwarzania i otrzymywania czynnika Xa. W tym celu w dużym urządzeniu technicznym kontaktuje się kompozycję, zawierającą jednołańcuchowy lub dwułańcuchowy analog czynnika X, np. z ewentualnie unieruchomioną prroteazą w warunkach, które umożliwiają optymalne aktywowanie analogu czynnika X do czynnika Xa i otrzymywanie czynnika Xa lub analogu czynnika Xa. Tak otrzymany czynnik Xa/analog czynnika Xa można następnie zastosować do wytworzenia zestawu farmaceutycznego.

Kompozycję według wynalazku zawierającą oczyszczony jednołańcuchowy lub dwułańcuchowy analog czynnika X według wynalazku i dopuszczalny fizjologicznie nośnik można preparować jako preparat farmaceutyczny. Preparowanie można przeprowadzić w znany sposób i preparować preparat farmaceutyczny przez zmieszanie z buforem zawierającym sole, takie jak NaCl, CaCF, i aminokwasy, takie jak glicyna i/lub lizyna, przy pH w przedziale od 6 do 8. Oczyszczoną kompozycję zawierającą analog czynnika X można przygotować jako przechowywalny produkt w postaci gotowego roztworu, liofilizatu lub zamrożoną aż do całkowitego zużycia. Kompozycję przechowuje się głównie w postaci liofilizatu i rozpuszcza w odpowiednim roztworze rekonstytucyjnym otrzymując wizualnie klarowny roztwór.

Kompozycję według niniejszego wynalazku można jednak także wytwarzać jako preparat ciekły lub w postaci zamrożonego roztworu. Kompozycja według wynalazku jest szczególnie stabilna, to znaczy że w stanie rozpuszczonym może ona stać przez dłuższy czas przed jej użyciem. Okazało się, że kompozycja według wynalazku przez kilka godzin do kilku dni nie wykazuje żadnej straty aktywności.

Kompozycja według wynalazku może być umieszczona w odpowiednim urządzeniu, zwłaszcza w urządzeniu aplikacyjnym, w kombinacji z proteazą wybraną z grupy endoproteaz, takich jak np. keksyna/Kex2, furyna/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7, grupy proteaz serynowych, takich jak np. czynnik IIa, czynnik XIIa, czynnik XIa, czynnik Xa, lub kalikreiną albo z pochodną tych proteaz.

Kompozycję według wynalazku zawierającą analog czynnika X w mieszaninie z proteazą, która jest w stanie aktywować analog czynnika X do czynnika Xa lub analogu czynnika Xa, można przygotować jako preparat skojarzony, składający się ze zbiornika zawierającego proteazę unieruchomioną na nośniku, ewentualnie w postaci minikolumny lub strzykawki zawierającej proteazę i zbiornika zawierającego kompozycję farmaceutyczną z analogiem czynnika X. W celu aktywowania analogu czynnika X tłoczy się roztwór zawierający analog czynnika X np. przez unieruchomioną proteazę. Roztwór zawierający analog czynnika X jest przy tym pod16

190 734 czas składowania preparatu oddzielony przestrzennie od proteazy. Kompozycja według wynalazku może być umieszczona w tym samym zbiorniku co proteazą, przy czym składniki są jednak oddzielone od siebie przestrzennie nieprzepuszczalną ścianką działową, która w przypadku ewentualnego użycia jest łatwa do usunięcia. Roztwory można także przechowywać w oddzielnych zbiornikach i dopiero na krótko przed użyciem kontaktować je ze sobą.

Zaleca się również by proteazę stosowaną do aktywowania stanowiła proteazą serynowa uczestnicząca także w stanie naturalnym w krzepnięciu krwi, taka jak np. cynnik XHa lub czynnik XIa, która przed zastosowaniem nie musi być oddzielona od aktywowanego czynnika Xa lub może być użyta razem z nim.

Aktywowanie analogu czynnika X do czynnika Xa może nastąpić na krótko przed bezpośrednim użyciem, a więc przed podaniem pacjentowi. Aktywowanie może nastąpić przez kontaktowaie z unieruchomioną proteazą lub przez zmieszanie roztworu zawierającego proteazę z roztworem zawierającym analog czynnika X. Jest więc możliwe oddzielne trzymanie roztworów obydwóch składników i mieszanie ich za pomocą odpowiedniego urządzenia infuzyjnego, w którym podczas przepływu składniki kontaktują się ze sobą, i w ten sposób aktywowanie każdej cząsteczki do czynnika Xa lub analogu czynnika Xa. Pacjentowi podaje się więc mieszaninę czynnika Xa i dalszej proteazy serynowej, która spowodowała aktywowanie. Należy przy tym zwracać szczególną uwagę na dawkowanie, gdyż przez dodatkowe podanie proteazy serynowej zostaje aktywowany także endogenny czynnik X i przez to może zostać skrócony czas krzepnięcia.

Zaleca się szczególnie by kompozycję według wynalazku umieścić w w odpowiednim urządzeniu, zwłaszcza w urządzeniu aplikacyjnym, albo w postaci zamrożonej cieczy albo w postaci liofilizatu. Odpowiednim urządzeniem aplikacyjnym może być przy tym dwukomorowy korpus strzykawkowy opisany w opisie patentowym nr AT 366 916 lub AT 382 783.

Kompozycja według wynalazku może zawierać analog czynnika X z modyfikacją, która umożliwia aktywowanie in vivo analogu czynnika X do czynnika Xa. Analogi czynnika X w preparacji według wynalazku posiadają przeważnie modyfikację, która stanowi miejsce rozpoznania/miejsce rozszczepienia dla proteazy wybranej z grupy proteaz serynowych, takich jak np. czynnik XHa, czynnik XIa, czynnik Xa, lub kalikreina i przez jedną z wymienionych proteaz są rozszczepiane in vivo do natywnego czynnika Xa lub analogu czynnika Xa. Przy tym szczególnie korzystne do stosowania leczniczego są takie analogi czynnika X, które posiadaj ją miejsce rozpoznania/miejsce rozszczepienia dla proteazy wewnątrz kaskady krzepnięcia niezaleznej od kompleksu czynnika Vna/tkanki i kompleksu tenazowego. Dzięki temu preparację według wynalazku można stosować do zatrzymywania krwawienia u pacjentów z deficytem zarówno czynnika IX i czynnika VII jak również czynnika VIII. Pacjentom, u których występuje zaburzenie krzepnięcia krwi z powodu deficytu czynnika XI lub czynnika XII, nie należy podawać kompozycji farmaceutycznych zawierających analog czynnika X, który jest aktywowany przez czynnik XIIa lub czynnik XIa. W przypadku np. deficytu czynnika XI byłoby wskazane zastosowanie analogu czynnika X z miejscem cięcia czynnikiem XJIa.

Kompozycja według wynalazku może ewentualnie zawierać jako dalszy składnik czynnik krwi w postaci zymogenu lub aktywnej proteazy serynowej. Jako dalsze składniki są przy tym zalecane składniki z czynnikiem VIII o aktywności bypass'owej. Należą do nich zwłaszcza: czynnik II, czynnik VII, czynnik IX, czynnik VIII, czynnik V i/lub aktywne dla nich proteazy serynowe. Dalszymi składnikami mogą być jednak także fosfolipidy, jony Ca itp. W jednej z postaci wykonania wynalazku kompozycja według wynalazku może zawierać jako co najmniej jeden dalszy składnik czynnik VIII o aktywności bypass'owej.

Kompozycja według wynalazku może mieć formę kompozycji farmaceutycznej z aktywnością czynnika Xa w postaci preparatu jednoskładnikowego lub mieszaniny z innymi czynnikami jako preparat kilkuskładnikowy.

Przed wytworzeniem kompozycji farmaceutycznej oczyszczone białko poddaje się zwykłym kontrolom jakości i nadaje jej postać do podawania leczniczego. W przypadku wytwarzania rekombinacyjnego bada się oczyszczony preparat na nieobecność kwasów nukleinowych pochodzących z komórek i z wektora ekspresyjnego, głównie metodą opisaną w opisie patentowym nr EP 0 714 987.

190 734

Ponieważ zasadniczo każdy materiał biologiczny może być zanieczyszczony drobnoustrojami zakaźnymi, więc w celu wytworzenia bezpiecznego preparatu ewentualnie poddaje się kompozycję obróbce w celu dezaktywacji i usunięcia wirusów.

Kompozycję według wynalazku zawierającą analog czynnika Xa o dużej stabilności i jednorodności strukturalnej, zwłaszcza wolną od nieaktywnych produktów pośrednich analogu czynnika X/Xa i autoproteolitycznych produktów rozkładu można otrzymać w ten sposób, że aktywuje się analog czynnika X wyżej opisanego rodzaju i przygotowuje z niego odpowiednią kompozycję.

W jednej postaci realizacji wynalazku opisywane jest zastosowanie kompozycji wyżej opisanego rodzaju do wytwarzania środka leczniczego. Środek leczniczy zawierający analog czynnika X lub analog czynnika Xa według wynalazku nadaje się zwłaszcza do leczenia pacjentów z zaburzeniami krzepnięcia krwi, takich jak np. pacjenci chorzy na hemofilię lub pacjenci, którzy wytworzyli w swoim organizmie przeciwciała hamujące działające przeciwko zwykle stosowanym do leczenia czynnikom VIII i/lub IX, i zwłaszcza jako preparat z czynnikiem VIII o aktywności bypass'owej.

W jednej postaci realizacji wynalazku opisywane jest zastosowanie kwasu nukleinowego DNA według wynalazku zawierającego sekwencje kodujące analogi czynnika X według wynalazku do wytwarzania środka leczniczego. Przy tym kwas nukleinowy według wynalazku, jeżeli zawiera on odpowiednie sekwencje kontroli ekspresji, może być stosowany jako sam kwas nukleinowy, może być włączony w rekombinowany wektor ekspresyjny lub połączony z nośnikiem, takim jak fosfolipid lub cząstka wirusowa. Kwas nukleinowy według wynalazku można przy tym zastosować do wytwarzania środka leczniczego, który nadaje się zwłaszcza do leczenia pacjentów z zaburzeniami krzepnięcia krwi, takich jak np. pacjenci chorzy na hemofolię lub pacjenci hemofilni z przeciwciałami hamującymi. Możliwe jest także stosowanie kwasu nukleinowego według wynalazku w terapii genowej.

Wynalazek opisuje również sposób wytwarzania analogu czynnika X według wynalazku i kompozycji zawierającej analog c:zynrika X według wynalazku. W tym celu umieszcza się w odpowiednim układzie ekspresyjnym sekwencję kodującą analog czynnika X i transfekuje rekombinowanym DNA odpowiednie komórki, zwłaszcza trwałe linie komórkowe. Komórki hoduje się w warunkach optymalnych dla ekspresji genu i wyodrębnia analog czynnika X z ekstrdktu hodowli komórek lub z zasobu hodowli komórek. Cząsteczki rekombinowane można oczyszczać wszystkimi znanymi metodami chromatograficznymi, takimi jak chromatografia z zastosowaniem wymieniaczy anionowych lub kationowych, chromatografia powinowactwa albo chromatografia powinowactwa immunologicznego, lub kombinacja tych metod.

Dla potrzeb wytwarzania analogów czynnika X według wynalazku klonuje się w wektorze ekspresyjnym kompletny cDNA kodujący czynnik X. Wykonuje się to odpowiednimi ogólnie znanymi metodami klonowania. Sekwencję nukleotydową jodującą czynnik X modyfikuje się następnie tak, aby sekwencja kodująca została tak zmieniona w rejonie peptydu aktywacyjnego i ewentualnie także w rejonie C-końcowego β -peptydu, aby mogła być wytwarzana cząsteczka czynnika X wyżej opisanego rodzaju. Wykonuje się to metodami techniki genowej znanymi ze stanu techniki, takimi jak swoiście wyregulowana mutageneza in vitro, lub delecja sekwencji, np. przez trawienie restrykcyjne endonukleazą i włączenie innej, zmienionej sekwencji, lub za pomocą PGR. Tak otrzymane mutanty czynnika X włącza się następnie w układ ekspresyjny odpowiedni do ekspresji rekombinacyjnej i poddaje ekspresji.

Analogi czynnika X według wynalazku można także wytwarzać na drodze syntezy chemicznej.

Analogi czynnika X wytwarza się przeważnie za pomocą ekspresji rekombinacyjnej. Wytwarzanie metodami techniki genowej można realizować przy użyciu wszystkich możliwych układów ekspresyjnych, takich jak np. trwałe linie komórkowe lub wirusowe układy ekspresyjne. Trwałe linie komórkowe wytwarza się przez stabilne włączanie obcego DNA w chromosom komórki gospodarza np. z Vero, MRC5, CHO, BHK, 293, Sk-Hepl, zwłaszcza komórek wątroby i nerek, lub przez wektor episomalny, wywodzący się np. z wirusa brodawczaka. Można stosować także wirusowe układy ekspresyjne, np. takie jak wirus ospy bydlęcej, bakulowirus lub układy retrowirusowe. Jako linie komórkowe stosuje się powszechnie Vero, MRC5, CHO, BHK, 293, Sk-Hepl, komórki gruczołów, wątroby i nerek. Jako eukariotyczne

190 734 układy ekspresyjne można stosować także drożdże, gruczoły endogenne (np. gruczoły zwierząt transgenicznych) i komórki innych rodzajów. Do ekspresji polipeptydów tu opisywanych lub ich pochodnych można oczywiście stosować także zwierzęta transgeniczne. Szczególnie przydatne do ekspresji białek rekombinowanych okazały się komórki CHO-DHFR* (Uriaub i wsp., 1980, Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 77:4216-4220).

Do rekombinacyjnego wytwarzania analogów czynnika X według wynalazku można stosować także prokarioyczne układy ekspresyjne. Nadają się do tego zwłaszcza takie układy, które umożliwiają ekspresję w E. coli lub B. subtilis.

Analogi czynnika X poddaje się ekspresji w odpowiednich układach ekspresyjnych pod kontrolą odpowiedniego promotora. W przypadku ekspresji w eukariontach nadają się do tego wszystkie znane promotory, takie jak promotor SV40, CMV, RSV, HSV, EBV, promotor β-aktyny, hGH lub promotory indukowalne, takie jak np. promotor hsp lub promotor metalotioneinowy. Analogi czynnika X poddaje się ekspresji przeważnie w komórkach CHO pod kontrolą promotora β-aktyny

Sposób wytwarzania kompozycji według wynalazku może obejmować operacje wytwarzania DNA kodującego analog czynnika X, transformację komórki rekombinowanym DNA, ekspresję analogu czynnika X, ewentualnie w obecności proteazy, wyodrębnianie analogu czyn:nLka X i ewentualnie oczyszczanie metodą chromatograficzną.

Według jednej z postaci wykonania sposobu można wyodrębniać analog czynnika X jako cząsteczkę dwułańcuchową. W W tym celu analog czynnika X poddaje się ekspresji w komórce, która umożliwia przekształcenie analogu pro-czynnika X w dwułańcuchowy analog czynnika X. Komórką jest przy tym przeważnie komórka, która z ekspresją zdolnej do przekształcenia prekursora czynnika X proteazy, np. proteazy dwuzasadowej, takiej jak furyna lub jej pochodna. W celu zwiększenia lub polepszenia efektywności przekształcenia można ewentualnie tak zmodyfikować komórki, aby one silniej ekśprymowały proteazę. Może to nastąpić np. w wyniku współekspresj i odpowiedniej endoproteazy dwuzasadowej, takiej jak np. furyna/PACE, Kex2 lub ich pochodnej.

Analog czynnika X według wynalazku można także poddać ekspresji w komórce, która posiada normalne lub przez to suboptymalne dla przekształcenia stężenie endogenne proteazy i wskutek tego zachodzi niecałkowite przekształcenie w postać dwułańcuchową. Następujące po tym przekształcanie na ciężkie i lekkie łańcuchy zachodzi w tym przypadku wtedy, gdy wydzieli się z zasobu komórkowego jednołańcuchowy analog czynnika X, jak wyżej opisano, przez współhodowlę z komórkami poddającymi ekspresji proteazę lub przez zetknięcie z ewentualnie unieruchomiona proteazą. Zasób komórkowy można także tłoczyć pompą poprzez matrycę nośną z którą jest związana proteazą, w wyniku czego otrzymuje się w eluacie dwułańcuchowy analog czynnika X. Można także zmieszać reagenty w roztworze, inkubować przez pewien czas i następnie usunąć proteazę np. za pomocą matrycy powinowactwa.

Tak otrzymany dwułańcuchowy analog czynnika X można następnie wyodrębnić, oczyścić i do dalszego użycia przechowywać stabilnie, jak wyżej opisano.

Dwułańcuchowy, ewentualnie oczyszczony analog czynnika X według wynalazku można in vitro kontaktować z proteazą wybraną z grupy endoproteaz, takich jak np. keksyna/Kex2, furyna/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7 grupy proteaz serynowych, takich jak np. czynnik XIIa, czynnik XIa, czynnik Xa, czynnik IIa, lub kalikreiną, albo pochodną tych proteaz, w warunkach, w których analog czynnika X aktywuje się do natywnego czynnika Xa lub analogu czynnika Xa.

W jednej z postaci wykonania wynalazku aktywowanie może następować w ramach operacji chromatograficznej, w której proteazą jest unieruchomiona na nośniku. Oczyszczony dwułańcuchowy analog czynnika X kieruje się w tym celu przez matrycę, z którą jest związana proteazą, i wyodrębnia z eluatu oczyszczony czynnik Xa.

W innej postaci wykonania wynalazku składniki można mieszać i usuwać selektywnie proteazę z mieszaniny.

Możliwa jest oczywiście także kombinacja przekształcania jednołańcuchowego analogu pro-czynnika X w dwułańcuchową postać analogu czynnika X i aktywowania do czynnika Xa w jednym procesie. W tym celu kontaktuje się bezpośrednio jednołańcuchowy analog czynnika X lub jego prekursor z proteazą dwuzasadową, zwłaszcza z furyną lub z jej pochodną któ190 734 ra umożliwia przekształcenie w ciężki i lekki łańcuch i aktywowanie do czynnika Xa. Analog czynnika X, który nie posiada w peptydzie aktywacyjnym miejsca rozszczepienia dla furyny lub jej pochodnej, kontaktuje się ewentualnie z dalsza, inną od pierwszej proteazą, która jednak nie umożliwia aktywowania. Proteazy można stosować w postaci mieszaniny, np. furyny z czynnikiem XIa.

Aktywowanie można także przeprowadzić przez powiązanie obydwóch operacji w szeregowo połączonych bezpośrednio ze sobą urządzniach, zwłaszcza nośnikach, takich jak np. kolumny, na których jest(są) unieruchomiona(e) proteaza(y). Przy tym na pierwszym nośniku następuje rozszczepienie czynnika X na ciężkie i lekkie łańcuchy a na drugim aktywowanie do czynnika Xa przez unieruchomioną proteazę. Nośniki można przy tym sprzęgnąć ze sobą przez bezpośrednie połączenie wylotu z pierwszej kolumny z wlotem do drugiej kolumny.

Warunki reakcji przekształcania i aktywowania mogą być łatwo zoptymalizowane przez specjalistę zależnie od ustalonych doświadczalnie warunków ramowych. Dla czasu kontaktowania ma przy tym szczególnie duże znaczenie prędkość przepływu stosowanych reagentów. W idealnym przypadku powinna ona mieścić się między 0,01 ml/min i 1 ml/min. Jako dalsze parametry mają znaczenie temperatura, wartość pH i warunki eluowania. Po przepłynięciu przez urządzenie aktywowany czynnik Xa można ewentualnie dalej oczyścić przez selektywną chromatografię. Wykonanie sposobu z proteazą umieszczoną na każdym z nośników jest szczególnie zalecane dlatego, że urządzenie reakcyjne przez zastosowanie nośników, zwłaszcza kolumn chromatograficznych, umożliwia dodatkową operację oczyszczania.

W ramach wytwarzania analogu czynnika X według wynalazku można wyodrębniać analog czynnika X jako cząsteczkę jednołańcuchową. Następnie analog czynnika X poddaje się ekspresji w komórce, która nie pomaga w przekształcaniu pojedynczego łańcucha w lekki i ciężki łańcuch. Komórka ma przy tym przeważnie deficyt endoproteazy dwuzasadowej, takiej jak np. keksyna, furyna, PACE. Jak stwierdzono w ramach wynalazku, ważną i odpowiedzialną za rozszczepianie czynnika X na lekki i ciężki łańcuch ąroteazą jest furyna. Z takiej zmutowanej komórki z deficytem endoproteazy można wyodrębnić analog czynnika X w postaci cząsteczki jednołańcuchowej. Tak wyodrębniony i ewentualnie oczyszczony analog czynnika X kontaktuje się następnie z proteazą wybraną z grupy endoproteaz, takich jak np. keksyna/Kex2, furyna/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7, w warunkach w jakich rozszczepia się jednołańcuchowy analog czynnika X do dwułańcuchowej postaci czynnika X. Analogi czynnika X według wynalazku, posiadające modyfikację w rejonie peptydu aktywacyjnego, która umożliwia rozszczepianie przez jedną z tych endoproteaz, mogą ewentualnie zostać aktywowane do czynnika Xa lub analogu czynnika Xa bezpośrednio przez zetknięcie z endoproteaząjednołańcuchowego analogu czynnika X.

Analogi czynnika X według wynalazku, posiadające modyfikację w rejonie peptydu aktywacyjnego, która umożliwia rozszczepianie przez jedną z proteaz serynowych lub przez kalikreinę, po przekształceniu ich w dwułańcuchowy analog czynnika X, można kontaktować z dalszą, różną od pierwszej proteazą i aktywować do analogu czynnika Xa.

Sposobem według wynalazku można także otrzymać kompozycję zawierającą aktywny czynnik Xa lub aktywny analog czynnika Xa w taki sposób, że wytworzony jak opisano powyżej analog czynnika X poddaje się operacji aktywowania i aktywowany polipeptyd przerabia dalej na oczyszczoną kompozycję, która ewentualnie jest wytwarzana jako zestaw farmaceutyczny.

Wytwarzając analogi czynnika X według wynalazku, które aktywuje się wyżej opisanym sposobem do czynnika Xa, otrzymuje się oczyszczony czynnik Xa lub analog czynnika Xa o dużej stabilności i jednorodności strukturalnej a zwłaszcza wolny od nieaktywnych produktów pośrednich czynnika X/Xa.

Wynalazek opisują bliżej poniższe przykłady i figury rysunków, przy czym nie jest on jednak ograniczony do tych specjalnych przykładów wykonania.

Przykład 1 opisuje konstrukcję i ekspresję r-czynnika X; przykład 2 opisuje przekształcanie r-czynnika X w lekki i ciężki łańcuch przez fiirynę; przykład 3 opisuje przekształcanie pro-czynnika X za pomocą unieruchomionej proteazy; przykład 4 opisuje aktywność przekształconego in vitro r-czynnika X; przykład 5 opisuje ekspresję r-czynnika X w komórkach z deficytem furyny; przykład 6 opisuje konstrukcję i ekspresję analogów r-czynnika X; przy20

190 734 kład 7 opisuje oznaczanie N-końców produktów przekształcania czynnika X; przykład 8 opisuje ekspresję i charakterystykę analogu FX z furynowym miejscem rozszczepiania Arg-Arg-Lys-Arg/IUe (rFXRRKRi); przykład 9 opisuje aktywowanie in vitro białka rFX przez pochodną r-furyny; przykład 10 opisuje funkcjonalność aktywowanego in vitro rekombinowanego analogu FX rFX ; przykład 11 opisuje aktywowanie in vitro analogu rFX z miejscem rozszczepiania FXIa Asp-Phe-Thr-Arg/Val dla FXIa.

Figury przedstawiają:

figura 1 : sekwencję nukłeotydu i aminokwasu czynnika X figura 2 : schematyczny szkic analogów czynnika X z modyfikowanymi miejscami cięcia proteazowego w rejonie peptydu aktywacyjnego figura 3 : schematyczny szkic wektora ekspresyjnego phAct-rFX figura 4 : analizę Westernblot r-czynnika X poddanego ekspresji w komórkach CHO przed i po amplifikacji figura 5 : analizę Westernblot r-czynnika X po rozszczepieniu in vitro pochodną furyny figura 6 : analizę Westernblot cząsteczek r-czynnika X poddanego ekspresji w komór kach zawierających furynę i w komórkach z deficytem furyny figura 7: schematyczny szkic konstruktu analogonu rFX/rFXa ze zmienionymi

C-końcami ciężkiego łańcucha figura 8: schematyczny szkic N-końców produktów przekształcenia r-czynnika X w komórkach CHO zawierających furynę i w komórkach CHO z deficytem furyny przed i po działaniu r-furyny figura 9 : analizę Westernblot r-czynnika fxRRKR _(; p^dcOnego eksprej i w komórkach CHO figura 10: analizę Westernblot r-czynnika FX^RR^RR po aktywowaniu in vitro pochodną furyny figura 11 : analizę Westernblot r-czynnika Fx^DFI'R^vpo aktywowaniu in vitro pochodną furyny. Wektory ekspresyjne wytworzono standardowymi metodami klonowania (Maniatis i wsp., „Molecular Cloning” - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA, 1983). Fragmenty DNA wytworzono za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) ogólnymi metodami (Clackson i wsp., 1991 m, PCR A practical approach. ED. McPherson, Quirke, Taylor, S. 187 - 214).

Przykład 1

Ekspresja i przekształcenie jednołańcuchowego rFX w rFX z lekkim/ciężkim łańcuchem

a. Wytwarzanie wektora ekspresyjnego dla rFX

W celu otrzymania rekombinowanego FX (rFX) wyodrębniono cDNA FX z wątroby ludzkiej z banku cDNA-lambda tak, jak opisali to Messier et. al. (1991, Gene 99:291-294). Z dodatniego klonu amplifikowano za pomocą PCR z oligonukleotydem #2911 (5'-ATTACTCGAGAAGCTTACCATGGGCGCCACTG-3') (SEQ. ID. Nr 1) jako 5'-starterem i oligonukleotydem #2912 (5'-ATTACAATrG-CTGCAGGGATCCAC-3') (SEQ. ID. Nr 2) jako 3'-starterem fragment DNA, który zawierał sekwencję kodującą FX 1,467 kB oraz nie ulegający translacji rejon 3' 39 pz, flankowany przez miejsce cięcia Xhol na 5'-końcu i miejsce cięcia Mfel na 3'-końcu. Dodatkowo została wbudowana przez starter #2911 sekwencja ACC przed ATG w FX, tak że powstała optymalna sekwencja inicjacji translacji Kozak. Następnie ten produkt PCR klonowano jako fragment XhoI/MfeI w wektor ekspresyjny phAct cięty przez SalI i EcoRI. Otrzymany plazmid ekspresyjny oznaczono jako phAct-rFx (fig. 3). Wektor ekspresyjny phAct obejmuje ludzki promotor β-aktyny, 78 pz 5'UTR oraz intron, miejsce wielokrotnego klonowania i miejsce poliadenylacji SV40.

b. Ekspresja rFX w komórkach CHO

W celu założenia stabilnej linii komórkowej dającej ekspresję rFX współtransfekowano komórki CHO z deficytem dhfr za pomocą plazmidu ekspresyjnego phAct-rFX i plazmidu markera selekcyjnego pSV-dhfr. Dla wszystkich dalszych analiz ekspresji i działania inkubowano hodowle komórkowe przez 24 godziny z wolną od osocza pożywką selekcyjną w obecności 10 pg/ml witaminy K. Ekspresję rFX w wynikowych klonach komórkowych zbadano na podstawie ilości antygenu (ELISA, Asserachrom, Boehringer Mannheim) i następnie scharakteryzowano rekombinowane białko za pomocą SDS-PAGE (fig. 4A i B). W klonach wyjściowych i ich subklonach leży, co jest rozpoznawalne w Western Blot (fig. 4A), rekombinowane

190 734 białko FX w postaci lekkiego łańcucha (LC) o 22 kD i ciężkiego łańcucha HC o 50 kD, które są identyczne z białkiem FX osocza.

Dodatkowo można rozpoznać przy 75 kD smugę białkową, która odpowiada cząsteczce jednołańcuchowej (SC) i której obecność opisano w komórkach CHO transfekowanych przez FX (Wolf i wsp., J. Biol. Chem 266:13726-13730, 1991) oraz w osoczu ludzkim (Fair i wsp., Blood 64:194-204, 1984). W celu otrzymania klonów ulegających silnej ekspresji amplikowano klony wyjściowe rosnącymi ilościami metotreksatu a następnie subklonowano w celu ustabilizowania. Ekspresję można było zwiększyć z około 200 - 500 ng/10E6 komórek lub lgg/ml do 78 pg/10E6 komórek lub 120 pg/ml na 24 godziny. Analiza Western Biot tych silnie ulegających ekspresji zasobów komórkowych (fig. 4B i fig. 5A, ślad 2) pokazuje wzbogacenie w jednołańcuchowe cząsteczki rFX oraz obecność dodatkowych postaci lekkiego łańcucha.

Oprócz postaci 22 kD lekkiego łańcucha, który odpowiada postaci osoczowej (całkowicie karboksylowany i bez propeptydu) istnieją trzy dalsze warianty lekkiego łańcucha o około 21 kD, 22,5 kD i 20 kD. Heterogenność lekkiego łańcucha w tych klonach można wytłumaczyć za pomocą N-końcowego sekwencj onowania materiału rekombinowanego niecałkowitym odszczepieniem propeptydu (tu: około 50% materiału rFX) oraz do niedokarboksylowaniem (tu: około 50% rFX). Białko 21 kD jest niedokarboksylowaną zawierającą propeptyd a białko 20 kD niedokarboksylowaną wolną od propeptydu postacią lekkiego łańcucha, podczas gdy smuga 25,5 kD reprezentuje całkowicie karboksylowaną, lecz zawierającą propeptyd postać LC.

Przykład 2

Przekształcenie jednołańcuchowego rFX w rFX z lekkiem/ciężkim łańcuchem przez pochodne r-furyny

Na podstawie podobieństwa miejsc rozszczepiania między propeptydem czynnika Χ/Ν-końcem lekkiego łańcucha (RYTR^A) i między lekkim/ciężkim łańcuchem (RXKR4rS) z sekwencją rozpoznania konsensusu furyny (RXK/RR^X), istniała możliwość polepszenia przekształcania in vitro zarówno jednołańcuchowych jak i zawierających propeptyd cząsteczek rFX przez pochodne r-furyny. W literaturze wymienia się proteazy dla obydwóch operacji przekształcania, lecz nie chodzi tam o furynę (Rehemtulla i wsp., 1992, Blood 79: 2349-2355; Wallin i wsp., 1994, Thromb. Res. 1994:395-403).

Zasoby hodowli komórkowej CHO-rFX i CHO-r-furyny AATM6xHis (zgłoszenie patentowe EP 0 775 750 A2) oraz CHO-rFX i nietransfekowanych CHO (jako kontroli ujemnej) zmieszano w stosunku 1:1 i inkubowano w temperaturze 37°C. Próbki zestawów reakcyjnych zbadano przed inkubacją (t=0) i po upływie różnych czasów inkubacji (t=2, 4, 6 godzin) za pomocą analizy Western Biot na przekształcony rFX (fig. 5). rFX wykrywano w zasobach kultur komórkowych za pomocą antyludzkiej surowicy FX (fig. 5 A) lub przeciwciała monoklonalnego swoistego dla lekkiego łańcucha FX (fig. 5B).

W przeciwieństwie do mieszaniny CHO-rFX/CHO mieszanina CHO-rFX/CHO-r-furyna już po dwóch godzinach inkubacji w temperaturze 37°C (fig. 5 A, ślad 7; fig. 5B, ślad 8) została prawie całkowicie przekształcona. Jednołańcuchowy rFX został w większości przekształcony w postać z lekkim i ciężkim łańcuchem. W rejonie lekkiego łańcucha znaleziono tylko jeszcze przekształcone wolne od propeptydu postacie o 22 kD (postać karboksylowana) i 20 kD (postać niedokarboksylowaną) w stosunku około 50 : 50. Przez optymalizację warunków hodowli komórkowej można ten stosunek zwiększyć z korzyścią do postaci karboksylowanej. Prawidłowość rozszczepienia między Arg-1 i Ala+1 i jednorodność lekkiego łańcucha stwierdzono za pomocą sekwencjonowania N-końcowego. W doświadczeniu kontrolnym, w którym CHO-rFX zmieszano z zasobami CHO, nie stwierdzono nawet po 6-godzinnej inkubacji żadnej zmiany wzoru pasma rFX (fig. 5 A, ślad 5; fig. 5B, ślad 6). W ten sposób stwierdzono, że furyna w zasobie komórek CHO jest aktywna biologicznie i może przeprowadzać zarówno przekształcenie propeptydu jak i ciężkich/lekkich łańcuchów rFX.

Przykład 3

Przekształcenie czynnika X za pomocą r-furyny unieruchomionej na chelatowym żelu tentakelowym

W celu stwierdzenia, czy podłoże może zostać rozszczepione przez związaną z kolumną pochodną r-furyny, zbadano, czy jako matrycę kolumnową można zastosować w zestawie do22

190 734 świadczałnym zamiast agarozy Ni²⁺-NTA zel tantakelowy Fractogel EMD® (firmy Merck). Ponieważ w porównaniu z agaro:oąNi²⁺-NTAjony metalu są tu przestrzennie bardziej oddalone od właściwej matrycy kolumnowej, możliwa była lepsza dostępność przestrzenna podłoża do związanej pochodnej r-furyny. W niniejszym założeniu przekształcono pro-czynnik X za pomocą pochodnej r-fiiryny związanej z żelem tantalekowym: zgodnie z przepisem producenta żel tantakelowy Fractogel eMD® obładowano jonami Na2+ i zrównoważono wolną od surowicy świeżą pożywką do hodowli komórek. Następnie załadowano kolumnę wolnym od surowicy zasobem pochodnej r-furyny z CHO. Operacje przemywania wykonano wolną od surowicy pożywką do hodowli komórek zawierającą i^dazol w stężeniach wzrastających do 40 mM. Następnie przepuszczono przez kolumnę pro-czynnik X jako wolny od surowicy zasób CHO. Za pomocą analizy Western Biot ze swoistą antywsurowicą czynnika X zbadano w przepływie kolumny przekształcenie pro-czynnika X w dwułańcuchowy czynnik X.

Przykład 4

Aktywność przekstałconego in vitro rekombinowanego czynnika X

Rekombinowany prekursor czynnika X inkubowano z r-furyną i bez niej w temperaturze 4°C. W różnych odstępach czasu pobrano próbki i zamrożono je w temperaturze -20°C. Po zakończeniu inkubacji (po upływie 4 dni) zbadano aktywność wszystkich próbek za pomocą zestawu FX-Coatest Kit (firmy Chromogenix). W tym celu do 50 pl każdej próbki dodano 50 μΐ osocza ludzkiego z deficytem FX i zgodnie z protokółem producenta przekształcono rFX w rFXa przez działanie jadem żmii Russell'a (RW) w obecności CaCfe; następnie za pomocą rFXa zhydrolizowano substrat chromogenny (S-2337) powodując wydzielenie zabarwionej na żółto paranitroaniliny. Ponieważ ilość rFXa i intensywność barwy są do siebie proporcjonalne, więc za pomocą prostej wzorcowej, interpolowanej szeregiem rozcieńczeniowym osocza, oznaczono ilość rFX/ml zasobu hodowli komórkowej aktywowanego do rFX. Z tych wyników i ze znanych ilości antygenu rFX (danych testu ELISA) można było obliczyć udział procentowy rFX aktywowanego do czynnika Xa.

Wyniki są przedstawione w tabeli 1.

W celu wykluczenia nieswoistej, proteolitycznej aktywności w zasobach CHO i CHO-r-fiiryny zbadano także mieszaninę obydwóch tych zasobów hodowli komórkowych.

CHO-rFX inkubowany wraz z zasobami CHO (bez r-furyny) jako kontrola nie pokazał nawet po upływie 4 dni żadnej istotnej zmiany aktywności rFXa, która z powodu odchyleń doświadczalnych wynosiła 800 mU/ml i odpowiadała 55% - 61% funkcjonalnego rFX. Gdy dla porównania inkubowano CHO-rFX z CHO-r-furyną, wówczas nastąpił w czasie inkubacji stały wzrost aktywności rFX, która wzrosła od około 61% (chwila T=0) do 86% (tabela 1).

Tym samym udowodniono, że w wyniku przekształcenia in vitro CHO-rFX z klonów z silną ekspresją za pomocą pochodnej r-furyny udział rFX aktywowalnego do funkcjonalnego rFXa został znacznie zwiększony.

Tabela 1

Inkubacja w dniach	Aktywność w mU	Ilość antygenu w pg/ml	Udział funkcjonalnego rFX w %
CHO-rFX+CHO	0	814	14	58
	1	847	14	61
	2	835	14	60
	3	790	14	56
	4	763	14	55
CHO-rFX+CHO-r-	0	853	14	61
-furyna	1	1018	14	73
2	1099	14	79
	3	1135	14	81
	4	1198	14	86
CHO+CHO-r-furyna	0
FX z osocza 500 mU	585

190 734

Przykład 5

Ekspresja rekombinowanego czynnika X w komórkach z deficytem fiiryny

Jak pokazano w poprzednich przykładach, w przypadku białka prekursorowego czynnika X zarówno odszczepiame propeptydu jak i rozszczepianie pojedynczego łańcucha na lekki/ciężki łańcuch in vitro jest załatwiane przez furynę. To nasuwa wniosek, że te operacje są także wykonywane endogennie w komórce przez wszędzie występującą furynę, z różną efektywnością zależną od ilości r-czynnika X każdorazowo poddawanego ekspresji. To prowadzi natomiast do wytwarzania mieszaniny niejednorodnych postaci r-czynnika X.

Hamowanie rozszczepiania r-czynnika X przez proteazy endogenne, a zwłaszcza przez furynę, daje możliwość wytwarzania jednorodnej i do tego stabilnej postaci cząsteczek r-czynnika X, a więc produkowania funkcjonalnie nieaktywnego prekursora r-czynnika X (który przez późniejsze dalsze jego przekształcenie, dokładnie tuż przed użyciem, może zostać przekształcony w jego funkcjonalnie aktywną postać).

Ten sposób jest szczególnie korzystny przy wytwarzaniu analogu FX, który zawiera furynowe miejsce rozszczepiania zamiast pierwotnego miejsca aktywowania. W przypadku tych konstruktów aktywowanie takich rekombinowanych mutanów rFX może zachodzić in vivo w wyniku działania endogennej fiiryny i prowadzić do wydzielania aktywowanych niestabilnych postaci rFX. Rozkład tych postaci przez proteazy CHO, np. w warunkach hodowli komórkowej z dużą liżą komórek, podczas przechowywania zasobów hodowli komórkowej lub w trakcie operacji oczyszczania albo wskutek autoproteolizy, może prowadzić do nieaktywnych produktów rozkładu (Wolf i wsp., 1991).

Cel ten można osiągnąć np. przez uzupełnienie pożywki do hodowli komórek środkiem, który może zmniejszyć lub zlikwidować wewnątrzkomórkową aktywność furyny.

Inną możliwość stanowi stosowanie komórek z deficytem furyny (Mohring i wsp., 1983, Infect. Immun. 41:998-1009; Ohnishi i wsp., 1994, J. Yirol. 68:4075-4079; Gordon i wsp., 1995, Infect. Immun. 63:82-87).

W tym celu współtransfekowano klon komórkowy CHO FD11 mający deficyt furyny (Gordon i wsp., 1995, Infect. Immun. 63:82-87) z 20 pg phAct-FX i 1 pg pUCSV-neo (zawierającym gen oporności na neomycynę w wektorze pUC pod kontrolą promotora SV40). W celu otrzymania stabilnych klonów uzupełniono pożywkę przez dodanie 0,8 pg G418/ml. Przez porównanie oddzielonych cząsteczek r-czynnika X w wolnych od surowicy zasobach klonów CHO zawierających furynę i mających deficyt furyny okazało się w Western Biot, że w komórkach z deficytem furyny nie zachodzi przekształcanie prekursora r-czynnika X i znajduje się w nich tylko jednołańcuchowy prekursor czynnika X (fig. 6); w przeciwieństwie do tego r-czynnik X „normalnych” komórek przy skromnej ekspresji ulega jeszcze całkowicie przekształceniu, lecz przy większej ekspresji, pomimo endogennej furyny, zostaje przekształcony tylko w bardzo ograniczonym stopniu. Że względu na niski poziom ekspresji użytego klonu komórkowego nie widać w Western Biot lekkiego łańcucha r-czynnika X.

Przykład 6

Wytwarzanie analogów czynnika X (najbardziej zalecana postać realizacji)

6.1 Konstruowanie plazmidów ekspresyjnych do wytwarzania analogów czynnika X

Dla potrzeb wytwarzania rekombinacyjnego analogu r-czynnika X zastąpiono miejsce rozszczepiania Asn-Leu-Thr-Arg/Ile (aminokwasy 231 do 235), które służy do aktywowania czynnika X do czynnika Xa, miejscem rozszczepiania swoistym dla innej proteazy, takiej jak furyna, FXIa, FXa, FXIIa, FIIa lub kalikreina. Wszystkie plazmidy ekspresyjne dla tego analogu czynnika X wywodzą się z plazmidu phAct-FX (opisanego w przykładzie 1).

W celu uproszczenia klonowania plazmidu ekspresyjnego czynnika X, włączono fragment DNA HindIII-Nael z plazmidu ekspresyjnego phAct-FX, który obejmuje kodujący czynnik X rejon pozycji +1 do +1116, w miejsce cięcia restrykcyjnego HindII/SmaI plazmidu pUC19. Plazmid wynikowy oznaczono przez pUC/FX.

Dzięki temu można było łatwo usunąć z plazmidu pUC/FX sekwencję nukleotydową czynnika X w pozycjach 508 do 705 (aminokwasy 160 do 235) i zastąpić ją przez różne mutacyjne fragmenty DNA czynnika X. Te fragmenty DNA są identyczne z poddanym delecji dzikim typem sekwencji czynnika X, oprócz pozycji 691 do 705 (aminokwasy 231 do 235), które koduj ą nowe miejsca rozszczepiania.

190 734

Dziki typ sekwencji czynnika X usunięto z plazmidu pUC/FX przez cięcia restrykcyjne Bspl20I oraz BstXL 3'-występ miejsca BstX3 usunięto dodatkowo nukleaząMung Bean (Biolab).

Mutacje fragmentów DNA czynnika X wytworzono za pomocą PCR. 5'-Starter jest identyczny dla wszystkich klonowań i zawiera sekwencję czynnika X od pozycji 496 do 516. 3'-Primery zawierają sekwencję uzupełniającą czynnik X (pozycje 676 do 690) i nieuzupełniający 5'-występ, który niesie sekwencje dla nowego miejsca rozszczepiania i miejsca cięcia restrykcyjnego. Amplifikowany produkt PCR cięto następnie odpowiednim(i) enzymem(ami) restrykcyjnym(i) i klonowano w przygotowanym wektorze pUC/FX (patrz wyżej).

Mutacje fragmentów DNA czynnika X przeklonowano następnie za pomocą HindTT-Agel z plazmidu pUC/FX do wektora phAct-FX. Konstrukty końcowe są przedstawione schematycznie na fig. 2.1 i 2.2. Jako konstrukt referencyjny jest podany dziki typ czynnika X. Aminokwasy podano w kodzie jednoliterowym. Pozycje będące mutacjami są dodatkowo pocieniowane.

Do wytworzenia miejsca rozszczepienia Asp-Phe-Thr-Arg/Val dla FXIa użyto jako 5'-starter oligonukleotyd #1001 (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') (SEQ. ID. Nr 3) a jako 3'-starter oligonukleotyd # 1002 (5'-ACCA GTT AAC CCT GGT GAA GTC GTT GTC GCC CCT CTC-3') (SEQ. ID. Nr 4). Aminokwasy Asn, Leu i Ile w pozycjach 231, 232 i 235 sekwencji czynnika X zamieniono więc na Asp, Phe i Val. Fragment PCR odcięto przy użyciu Bstl20I i HpaI (fig. 2A).

Do wytworzenia miejsca rozszczepienia Arg/Ser dla FIIa użyto jako 5'-starter oligonukleotyd #1001 (5-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') (SEQ. ID. Nr 3) a jako 3'-starter oligonukleotyd #1003 (5'-ACCA TCG CGA CCT GGT CAG GTT GTT GTC-3¹) (SEQ. ID. Nr 5). Wykonano więc mutację aminokwasu Ile w pozycji 235 na Ser. Fragment PCR odcięto za pomocą Bsp 1201 i NruI (fig. 2B).

Do wytworzenia miejsca rozszczepienia Ile, Lys, Pro, Arg/Ile dla FXIIa użyto jako 5'-starter oligonukleotyd #1001 (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') (SEQ. ID. Nr 3) a jako 3'-starter oligonukleotyd #1004 (5'-ACC AGA ATC GAT TCT GGG TTT GAT GTT GTC GCC CCT CTC-3') (SEQ. ID. Nr 6). Wykonano więc mutację aminokwasów Asn, Leu i Thr w pozycjach 231, 232 i 233 sekwencji FX na Ile, Lys i Pro. Fragment PCR odcięto częściowo za pomocą Bstl20I i XmnI (fig. 2C).

Do wytworzenia miejsca rozszczepienia Ser-Met-Thr-Arg/Ile dla kalikreiny użyto jako 5’-starter oligonukleotyd #1001 (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') (SEQ. ID. Nr 3) a jako 3'-starter oligonukleotyd #1005 (5'-ACC AGA ATC GAT TCT GGT CAT GCT GTT GTC GCC CCT CTC-3' (SEQ. ED. Nr 7). Wykonano więc mutacje aminokwasów Asn, Leu w pozycjach 231, 232 sekwencji czynnika X na Ser, Met. Fragment PCR odcięto częściowo za pomocą Bst120I i XmnI (fig. 2D).

Do wytworzenia miejsca rozszczepienia Pro-Gln-Gly-Arg/He dla FXa użyto jako 5'-starter oligonukleotyd #1001 (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') (SEQ. ID. Nr 3) a jako 3'-starter oligonukleotyd #1016 (5'-ACC AGA ATC GAT TCT TCC TTG GGG GTT GTC GCC CCT CTC-3') (sEq. ID. Nr 8). Wykonano więc mutacje aminokwasów Asn, Leu i Thr w pozycjach 231, 232 i 233 białka FX na Pro, Gln i Gly. Fragment PCR odcięto częściowo za pomocą Bst120I i XmnI (fig. 2H).

Do wytworzenia miejsca rozszczepienia Met-Lys-Thr-Arg/Ile dla FXa użyto jako 5'-starter oligonukleotyd #1001 (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') (SEQ. ID. Nr 3) a jako 3'-starter oligonukleotyd #1014 (5'-ACC AGA ATC GAT TCT CGT tTt CAT GTT GTC GCC CCT CTC-3') (SEQ. ID. Nr 9). Wykonano więc mutacje aminokwasów Asn, Leu w pozycjach 231, 232 białka FX na Pro, Lys. Fragment PCR odcięto częściowo za pomocą Bst120I i Xmnf (fig. 2E).

Do wytworzenia miejsca rozszczepienia Ile-Glu-Gly-Arg/Ile dla FXa użyto jako 5'-starter oligonukleotyd #1001 (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') (SEQ. ED. Nr 3) a jako 3'-starter oligonukleotyd #1015 (5'-ACC AGA ATC GAT TCT TCC CTC GAT GTT GTC GCC CCT CTC-3) (SeQ. ID. Nr 10). Wykonano więc mutacje aminokwasów Asn, Leu, Thr w pozycjach 231 do 233 białka FX na Ile, Glu, Gly. Fragment PCR odcięto częściowo za pomocąBst120I i XmnI. (fig. 2F).

190 734

Do wytworzenia miejsca rozszczepienia Arg-Arg-Lys-Arg/De dla furyny użyto jako 5'-starter oligonukleotyd #1001 (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3) (SEQ. ID. Nr 3) a jako 3'-starter oligonukleotyd #1006 (5'-ACC AGA ATC GAT TCT TTT CCT CCT GTT GTC GCC CCT CTC-3') (SEQ. ID. Nr 11). Wykonano więc mutacje aminokwasów Asn, Leu i Thr w pozycjach 231 do 233 na Arg, Arg i Lys. Fragment PCR odcięto za pomocą Bspl20I i XmnI (fig. 2G).

Do wytworzenia miejsca rozszczepienia Arg-Val-Arg-Arg/He dla furyny użyto jako 5'-starter oligonukleotyd #1001 (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') (SEQ. ID. Nr 3) a jako 3'-starter oligonukleotyd #1007 (5'-ACC AGA ATC GAT TCT CCT CAC CCT GTT GTC GCC CCT CTC-3') (SEQ. ID. Nr 12). Wykonano więc mutacje aminokwasów Asn, Leu i Thr w pozycjach 231 do 233 na Arg, Val i Arg. Fragment PCR odcięto częściowo za pomocą Bspl20I i XmnI (fig. 2G).

Do wytworzenia miejsca rozszczepienia Arg-Arg-Arg-Arg/Ue dla furyny użyto jako 5'-starter oligonukleotyd #1001 (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') (SEQ. ID. Nr 3) a jako 3'-starter oligonukleotyd #1008 (5'-ACC AGA ATC GAT TCT CCT CCT CCT GTT GTC GCC CCT CTC-3') (SEQ. ID. Nr 13). Wykonano więc mutacje aminokwasów Asn, Leu i Thr w pozycjach 231 do 233 na Arg, Arg i Arg. Fragment PCR odcięto częściowo za pomocą Bsp120I i XmnI (fig. 2G).

Do wytworzenia miejsca rozszczepienia Arg-Pro-Lys-Arg/Ue dla furyny użyto jako 5'-starter oligonukleotyd #1001 (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') (SEQ. ID, Nr 3) a jako 3'-starter oligonukleotyd #1009 (5'-ACC AGA ATC GAT TCT TTT GGG CCT GTT GTC GCC CCT CTC-3') (SEQ. ID. Nr 14). Wykonano więc mutacje aminokwasów Asn, Leu i Thr w pozycjach 231 do 233 na Arg, Pro i Lys. Fragment PCR odcięto częściowo za pomocą Bspl20I i XmnI (fig. 2g).

Do wytworzenia miejsca rozszczepienia Ile-Ag-Lys-Ag/Ue dla furyny użyto jako 5'-starter oligonukleotyd #1001 (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') (SEQ. ID. Nr 3) a jako 3'-starter oligonukleotyd #1010 (5'-ACC AGA ATC GAT TCT TTT CCT GAT GTT GTC GCC CCT CTC-3') (SEQ. ID Nr 15). Wykonano więc mutacje aminokwasów Asn, Leu i Thr w pozycjach 231 do 233 na Ile, Arg i Lys. Fragment PCR odcięto częściowo za pomocą Bsp120I i XmnI (fig. 2G).

Do wytworzenia miejsca rozszczepienia Ag-Ser-Lys-Arg/Ile dla furyny użyto jako 5'-starter oligonukleotyd #1001 (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') (SEQ. ID. Nr 3) a jako 3'-starter oligonukleotyd #1011 (5-ACC AGA ATC GAT TCT TTT GCT CCT GTT GTC GCC CCT CTC-3') (SEQ. ID. Nr 16). Wykonano więc mutacje aminokwasów Asn, Leu i Thr w pozycjach 231 do 233 na Arg, Ser i Lys. Fragment PCR odcięto częściowo za pomocą Bsp120I i XmnI (fig. 2G).

Do wytworzenia miejsca rozszczepienia Arg-Val-Thr-Arg/Ile dla furyny użyto jako 5'-starter oligonukleotyd #1001 (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') (SEQ. ID. Nr 3) a jako 3'-starter oligonukleotyd #1012 (5'-ACC AGA ATC GAT TCT GGT CaC CCT GTT GTC GCC CCT CTC-3') (SEQ. ID. Nr 17). Wykonano więc mutację aminokwasów Asn, Leu w pozycjach 231, 232 na Arg, Val. Fragment PCR odcięto częściowo za pomocą Bsp120I i XmnI (fig. 2G).

Do wytworzenia miejsca rozszczepienia Ag-Leu-Lys-Ag/Ue dla furyny użyto jako 5'-starter oligonukleotyd #1001 (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') (SEQ. ID. Nr 3) a jako 3'-starter nukleotyd #1013 (5'-ACC AGA ATC GAT TCT TTT GAG CCT GTT GTC GCC CCT CTC-3') (SEQ ID. Nr 18). Wykonano więc mutacje aminokwasów Asn i Thr w pozycjach 231 i 233 na Arg i Lys. Fragment PCR odcięto częściowo za pomocą Bsp120I i XmnI (fig. 2G).

Do wytworzenia miejsca rozszczepienia Thr-Ser-Thr-Arg/Ile dla FXIIa użyto jako 5'-starter oligonukleotyd #1001 (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3' (SEQ. ID. Nr 3) a jako 3'-starter oligonukleotyd #1017 (5-ACC AGA ATC GAT TCT CGT GCT CGT GTT GTC GCC CCT CTC-3') (SEQ. ID. Nr 19). Wykonano więc mutacje aminokwasów Asn, Leu w pozycjach 231, 232 białka FX na Ile, Lys. Fragment PCR odcięto częściowo za pomocą Bst120I i XmnI (fig. 21).

190 734

6.2. Kontruowanie plazmidów ekspresyjnych do wytwarzania analogu ΕΧβ

Te konstrukty otrzymano z wyżej opisanych konstruktów analogu czynnika X, wbudowując kodon zatrzymujący TGA w pozycji 470. Ponadto usunięto za pomocą Spel i częściowo przez trawienie przy użyciu BstEII aminokwasy z pozycji 457 na poziomie cDNA aż do kodonu zatrzymującego i zastąpiono je parą oligonukleotydów #0003 (5'-GTC ACC GCC TTC CTC AAG TGG ATC GAC AGG TCC ATG AAA ACC AGG TGA A-3') (SEQ. ID. Nr 20) i #0004 (5'-CTA GTT CAC CTG GTT TTC ATG GAC CTG TCG ATC CAC TTG AGG AAG GCG-3') (SEQ. ID. Nr 21). Schemat konstruktów analogu czynnika χβ pokazano na fig. 7. W celu uproszczenia rysunku wszystkie analogi czynnika χβ przedstawiono jako jeden ogólny konstrukt, w którym zmienione aminokwasy w rejonach miejsc rozszczepiania podano jako zacieniowanie ,,X’.

6.3. Konstruowanie plazmidów ekspresyjnych do wytwarzania analogu FXa

Aktywując czynnik X przez odszczepienie peptydu aktywacyjnego 4,5 kD na N-końcu ciężkiego łańcucha otrzymano postać czynnika Xaa. W wyniku aktywności autoproteolitycznęj tej postaci i odszczepienia C-końca ciężkiego łańcucha między Arg 469 i Gly 470 uległa ona przekształceniu w postać ΕΧηβ. W celu otrzymania plazmidu ekspresyjnego czynnika X, który po aktywowaniu istnieje tylko w postaci FXaa z nienaruszonym β-peptydem, wykonano więc mutację aminokwasu Arg 469 na Lys, tak że nie mogło już nastąpić żadne przekształcenie w rejonie C-końcowym ciężkiego łańcucha.

Ponadto usunięto C-końcową sekwencję aminokwasów czynnika X od pozycji 1363 aż do sygnału zatrzymania przez częściowe strawienie za pomocą BstEH-Spel i zastąpiono ją parą połączonych ze sobą oligonukleotydów. Oligonukleotyd #0005 (5-GTC ACC GCC TTC CTC AAG TGG ATC GAC AGG TCC ATG AAA ACC AAG GGC TTG CCC AAG-3') (SEQ. ED. Nr 22) i Oligonukleotyd #0006 (5'-TTG GCC TTG GGC AAG CCC TTG GTT TTC ATG GAC CTG TCG ATC CAC TTG AGG AAG GCG-3') (SEQ. ID. Nr 23) zostały poddane ligacji z oligonukleotydem #0007 (5'-GCC AAG AGC CAT GCC CCG GAG GTC ATA ACG TCC TCT CCA TTA AAG TGA GAT CCC A-3’) (SEQ. ID. Nr 24) i oligonukleotydem #0008 (5-CTA GTG GGA TCT CAC TTT AAT GGA GAG GAC GTT ATG ACC TCC GGG GCA TGG CT3-3') (SEQ. ID. Nr 25). Jako mutację aminokwasu Arg 469 wprowadzono parę nukleotydów #0005-#0006. Analog FX pokazano schematycznie na fig. 7.

Przykład 7

Oznaczanie N-końców czynnika X i produktu przekształcenia za pomocą r-furyny i bez niej

Rekombinowany czynnik X poddano ekspresji w komórkach CHO z endogenną furyną (jak opisano w przykładzie 1) lub w komórkach z deficytem furyny (jak opisano w przykładzie 5). r-Czynnik X wyodrębniono zarówno z a) nie poddanego wstępnej obróbce, b) inkubowanego przez dalsze 12 godzin w temperaturze 37°C i c) poddanego przez 12 godzin wstępnej obróbce w temperaturze 37°C zasobem r-furyny z zasobu hodowli komórkowej CHO poddanych silnej ekspresji klonów rFX w CHO, jak również d) nie poddanego wstępnej obróbce i e) poddanego przez 12 godzin wstępnej obróbce w temperaturze 37°C zasobem r-furyny w CHO zasobu hodowli komórkowej klonów rFX z CHO-FD11. N-końcowe aminokwasy czynnika X i produkty przekształcenia poszczególnych zestawów reakcyjnych a) do e) zostały oznaczone przez wykonanie analizy Edmana. Wyniki przedstawiono schematycznie na fig. 8.

r-Czynnik X z poddanych silnej ekspresji komórek CHO występował w postaci dojrzałych ciężkich i lekkich łańcuchów, jak również jako jednołańcuchowy, częściowo zawierający jeszcze propeptyd. Po inkubacji tych zasobów hodowli komórkowej przez 12 godzin w temperaturze 37°C (b) występują dodatkowo, jak już opisali to Wolf i wsp. (1991, J. Bio. Chem. 266:13726-13730), wadliwe N-końce lekkiego łańcucha rFX z 3 dodatkowymi aminokwasami Vall38-Thr39-Arg40. Takie ukryte końce znaleziono także podczas sekwencjonowania materiału rFX z nie poddanych wstępnej obróbce komórek CHO-FD11 (d). Ta obserwacja pokazała, że można uniknąć tych wadliwych N-końców, gdy zastosuje się optymalne warunki lub parametry hodowli komórek, składowania i metod oczyszczania w celu zm i nimal izowania proteolizy rFX przez proteazy CHO.

190 734

W przeciwieństwie do oczyszczonego materiału z komórek CHO (a i b), rFX z nie amplifikowanych komórek z deficytem furyny (d) występuje tylko w postaci nieprzekształconych jednołańcuchowych prekursorów. Nie znaleziono także sekwencji N-końcowych, odpowiadających udziałowi propeptydu. Wykazano więc w ten sposób, że w komórkach CHO z deficytem furyny (d) nie zachodzi przekształcanie jednołańcuchowych prekursorów rFX w lekkie/ciężkie łańcuchy, co pozwala na wyciągnięcie wniosku, że w tej operacji przekształcania in vivo główną rolę pełni endoproteaza furyna.

Dodatkowo pokazano, że przekształcanie cząsteczek rFX zawierających propeptyd zachodzi także w komórkach CHO z deficytem furyny, a więc furyna nie gra in vivo istotnej roli w tej operacji przekształcania. Po inkubacji w obecności furyny rFX z komórek CHO (c) iż komórek CHO-FD11 (e) znaleziono wyłącznie lekkie i ciężkie łańcuchy z prawidłowymi N-końcami. Udowodniono więc, że zarówno jednołańcuchowe prekursory FX jak i cząsteczki rFX zawierające propeptyd przez przekształcanie in vitro zostają przetworzone w jednorodny, dojrzały czynnik X. Czynnik X przekształcony w obecności furyny posiada więc nadzwyczajną jednorodność i jednolitość strukturalną..

Przykład 8

Ekspresja i charakterystyka analogu FX z miejscem rozszczepienia przez furynę ArgArg-Lys-Arg/Ile (fETRR^)

W celu otrzymania rekombinowanego białka rFTRR poddano współtransfekcji w komórkach CHO plazmid ekspresyjny FX z miejscem rozszczepienia Arg-Arg-Lys-Arg/Ile (patrz przykład 6.1, fig. 2G) i plazmid selekcyjny pSV/dkfr, jak opisano w przykładzie 1.

Analiza Western Biot zasobów hodowli komórkowej (fig. 9) pokazała, że rekombinowane białko w przeważającym stopniu występuje w postaci dwułańcuchowej. W porównaniu z FX z osocza ciężki łańcuch ma około 46 kD zamiast 50 kD, co przypuszczalnie można wytłumaczyć różnymi scukrzeniami rekombinowanego białka. Dodatkowo są widoczne, jak już zaobserwowano przy ekspresji dzikiego typu rFX (przykład 1.b.), małe ilości prekursorów jednołańcuchowych (SC), jak również izoformy LC4 lekkiego łańcucha. Te postacie cząsteczkowe analogu rFX wskazują na ograniczenie zarówno przekształcania jednołańcuchowego prekursora FX przez proteazy endogenne jak i γ-karboksylowania lekkiego łańcucha. Chociaż miejsce rozszczepienia wstawione w analog FX reprezentuje sekwencję zgody dla furyny, to jednak nie są widoczne pasma białkowe, które odpowiadają aktywowanym postaciom białka (35 kD, 31 kD). Zarówno struktura w rejonie miejsca rozszczepienia jak i otaczająca sekwencja aminokwasowa prawdopodobnie aktywowanego doprowadziły do tego, że przekształcenie zmodyfikowanego miejsca aktywowania przez furynę tworzy tylko suboptymalne warunki.

Przykład 9

Aktywowanie in vitro białka rPX^Rx^κx^/I przez pochodne r-furyny

Zbadano in vitro aktywowalność rekombinowanego analogu FX do postaci FXaa (35 kD) i β (:31 kD) przez r-furynę, tak jak w opisie dla doświadczeń mieszanych w przykładzie 2, z tą różnicą, że użyto oczyszczoną pochodną r-furyny, a mianowicie r-furinAACys-Spacer-lOxHis, opisaną w opisie patentowym EP 0 75 750 A2, w 10 mM Hepes, pH 7,0, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl₂ i 0,2% BSA zamiast zasobu r-furyny z CHO. W doświadczeniu kontrolnym bez r-furyny zmieszano w stosunku 1: 1 zasób analogu rFX z CHO z buforem 10 mM Hepes, pH 7,0,150 mM NaCl, 2 mM CaCl₂ i 0,2% BSA. Próbki powyższych zestawów zbadano za pomocą Western Biot na aktywowanie rFX przed i po czasie inkubacji 6, 24, 48 i 72 (t=0, 6, 24, 48, 72) godziny w temperaturze 37°C (fg. 10). Podczas gdy wzór pasmowy rFX w nieobecności pochodnej r-furyny jest niezmieniony nawet po 72 godzinach inkubacji (fig. 10B) to w obecności r-furyny już po 6 godzinach (fig. 10A, ślad 5) jest widoczne ciężkie pasmo białkowe 35 kD, które odpowiada postaci a FX z osocza (fig. 10A, ślad 9). Podczas trwania inkubacji ta postać a gromadzi się i po 72 godzinach inkubacji (fig. 10a, ślad 8) około 50% materiału wyjściowego (HC) jest przetworzone w postać aktywowaną. Dodatkowe pasmo białkowe o masie 31 kD, które staje się rozpoznawalne po 24 godzinach (fig. 10A, ślad 6) i odpowiada postaci β aktywowanego FX z osocza (fig. 10a, ślad 9), pokazuje, że powstała z rekombinowanego analogu FX postać a ma aktywność autoproteolityczną a więc jest funkcjonalna.

190 734

Te wyniki dowodzą, że niejednorodne miejsce rozszczepienia aktywacyjnego Arg-ArgLys-Arg/Ile w analogu rFX jest swoiście rozpoznawane i prawidłowo rozszczepiane in vitro przez pochodną r-furyny, a więc nadaje się do aktywowania analogu rFX w cząsteczkę FIAA i cząsteczkę FXap.

Przykład 10

Funkcjonalność aktywowanego in vitro analogu FX rFXRRKR

Próbki z badań mieszanych według przykładu 9 zbadano za pomocą testu chromogenowego na aktywność FXa. W tym celu do próbek dodano substrat chromogenny S2337 (600 pM) w 50 mM tris, pH 7,3, 150 mM NaCl i 0,1% BSA. Po inkubacji trwającej 3 minuty w temperaturze 37°C zatrzymano reakcję za pomocą 20% kwasu octowego i następnie zmierzono gęstość optyczną (OD) przy 405 nm. Przez porównanie z wykresem w postaci linii prostej wzorcowej, otrzymanym za pomocą oszyszczonego, aktywowanego przy użyciu RVV FXa z osocza, oznaczono w zestawach reakcyjnych wartości aktywności rekombinowanego FXa. Wyniki tej analizy, obejmujące użyte ilości antygenu (wartości ELISA), jak również obliczone z tego aktywności swoiste, podano w tabeli 2.

W celu wykluczenia nieswoistych aktywności amidolitycznych w roztworze r-furyny i w zasobie z hodowli komórek CHO, zbadano także na aktywność FXa (CHO+r-furyna) mieszaninę zasobu nie poddanych transfekcji komórek CHO. W tej mieszaninie, tak samo jak w mieszaninie analog rFX/bufor (rFX + bufor), nie stwierdzono także aktywności FXa po 72 godzinach inkubacji. W przeciwieństwie do tego w przypadku reakcji z r-furynąjuż po 6-godzinach inkubacji była mierzalna aktywność rFXa wynosząca 56 mU, która wzrastała podczas dalszej inkubacji i po 72 godzinach osiągnęła 133 mU. Chociaż w tym czasie, według Western Biot, tylko około połowa analogu rFX została przetworzona w aktywowane postacie a i p (fig. 10A, ślad 8), to aktywowany in vitro materiał analogu rFX osiągając 190 mU/pg miał dużą, większą aktywność swoistą niż całkowicie aktywowany przy użyciu RVV FX z osocza (153 mU/pg). Zmierzone wzrosty aktywności mają swoje odbicie w występowaniu postaci a i p w Western Blot (fig. 10A, ślady 5 - 8).

W ten sposób stwierdzono, że w FX można wbudowywać niejednorodne miejsca cięcia dla proteazy, miejsca te mogą być rozpoznawane i rozszczepiane przez przynależną proteazę i można wytwarzać rekombinacyjnie wysokowartościowy rFXa (lub ewentualnie analogi rFXa z aktywnością FXa) w funkcjonalnej postaci.

T a b el a 2

Czas inkubacji w godzinach	Aktywność w mU/ml	Ilość antygenu w pg/ml	Aktywność swoista w mU/pg
_rpx^RRKR +bufor	0	<25	0,7	0
	6	<25	0,7	0
	24	<25	0,7	0
	48	<25	0,7	0
	72	<25	0,7	0
rFX^RRR -H-Turyna	0	<25	0,7	0
6	56	0,7	80
	24	101	0,7	144
	48	124	0,7	177
	72	133	0,7	190
CHO + r-fryna	0	<25	0
6	<25	0
	24	<25	0
	48	<25	0
	72	<25	0
FX z osocza aktywowany przez RVV	614	4

190 734

Przykład 11

Aktywowanie in vitro analogu rFX z rozszczepienia FXIa Asp-Phe-Thr-Arg/Val (rFX ) przez FXIa z osocza

Przez mutagenezę sekwencji aktywacyjnej FX na miejsce rozszczepienia FXIa otrzymano konstrukt analogu FX. Następnie wytworzono stabilne klony komórek CHO, które poddają ekspresji te cząsteczki. Zasób hodowli komórek CHO z rFX zmieszano z oczyszczonym FXIa z osocza (100 pg/ml) w obecności 10 mM tris, pH 7,3 150 mM NaCl, 8mM CaCl2, PCPS i 0,1% BSA i inkubowano w temperaturze 37°C w ciągu różnych czasów. Jako kontrolę ujemną inkubowano zasób hodowli komórek tylko z buforem zawierającym BSA. Białko rFX i wynikowe produkty aktywowania scharakteryzowano za pomocą analizy Western Biot (fig. 11).

Jak można rozpoznać w mieszaninie bez FXIa przed inkubacją (t=0), rekombinowane białko (fig. 11, ślad 5) jest wydzielona w postaci dwułańcuchowej prawie identycznej jak FX z osocza (ślad 2) z tą różnicą, że ciężki łańcuch (HC), jak już to zaobserwowano u rFXRRR*z przykładu 8, ma masę cząsteczkową trochę mniejszą niz 50 kD. Podczas inkubacji tej mieszaniny w temperaturze 37°C (fig. 11, ślad 6) nie jest widoczna żadna istotna zmiana wzoru pasma. W mieszaninie CHO-rFX/FXIa można rozpoznać, już na krótko przed dodaniem oczyszczonego FXIa ale jeszcze przed właściwą inkubacją zasobu hodowli komórkowej (fig. 11, ślad 3), pasma białkowe 35 kD i 31 kD, które odpowiadają pod względem wielkości osoczowym postaciom a i β ciężkiego łańcucha (fig. 11, ślad 9). Obydwie te postacie powiększają się mocno po 4-godzinnej inkubacji z FXIa (fig. 11, ślad 4).

Tym samym pokazano, że analog FX, który obejmuje niejednorodne proteazowe miejsce rozszczepienia dla enzymu proteolitycznego aktywnego w kaskadzie krzepnięcia, może zostać skutecznie przekształcony przez ten ostatni.

Przez wystąpienie pasm rFXaβ została skutecznie pokazana, dodatkowo do wyniku aktywności autoproteolitycznej analogu rFXaa, funkcjonalna aktywność tak powstałego rFXaa.

190 734

Lista sekwencji (1) Ogólne dane (i) Zzłaszzjący (A) Nazwa: Baxter AG (B) Ulica: Industriestrasse 67 (C) Miejscowość: Wiedeń (D) Kraj federalny: Austria (E) Kraj:AusAia (F) Pocztowy numer kierunkowy: 1220 (A) Imię i nazwisko: Michele Himmelspach (B) Ulica; Breitstetten 19 (C) Miejscowość: Leopoldsdorf (D) Kraj federalny: Austria (E) Kraj: Austria (F) Pocztowy numer kierunkowy: 2285 (A) Imię i nazwisko: Uwe Schlokat (B) Ulica: Hauptstrasse 51 (C) Miejscowość: Orth/Donau (D) Kraj federalny: Austria (E) Kraj: Austria (F) Pocztowy numer kierunkowy: 2304 (A) Imię i nazwisko: Andreas Fisch (B) Ulica: Tellstrasse 19 (c) Miejscowość: St. Gallen (D) Kraj federalny: Austria (E) Kraj: Szwajcaria (F) Pocztowy numer kierunkowy: 9000 (A) Imię i nazwisko: Friedrich Domer (B) Ulica: Peterlinigasse 17 (C) Miejscowość: Wiedeń (D) Kraj federalny: Austria (E) Kraj: Austria (F) Pocztowy numer kierunkowy: 1230 (A) Imię i nazwisko: Johann Eibl (B) Ulica: Gustav Tschermakgasse 2 (C) Miejscowość: Wiedeń (D) Kraj federalny: Austria (E) Kraj: Austria (F) Pocztowy numer kierunkowy: 1180 (ii) Tytuł wynalazku: Analog czynnika X, rekombinowany DNA, kompozycje, zastosowanie rekombinowanego kwasu nuikleinowego DNA oraz sposoby wytwarzania kompozycji (iii) Liczba sekwencji: 27 (iv) Tekst czytelny dla komputera:

(A) Nośnik danych: dyskietka (B) Komputer: kompatybilny z IBM PC (C) System pracy: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln wydanie #1.0, wersja #1.30 (EPA)

190 734 (2) Dane dla SEQ ID NR: 1 :

(i) Cechy sekwencji:

(A) Długość: 34 pary zasad (B) Rodzaj: nukleotyd (C) Postać nici: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: genomowy DNA (xi) opis sekwencji: SEQ ID NR: 1:

ATTACTCGAG AAGCTTACCA TGGGGCGCCC ACTG 34 (2) Dane dla SEQ ID. Nr: 2:

(i) Cechy sekwencji (A) Długość: -24 pary zasad (B) Rodzaj: nukleotyd (C) Postać nici: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: genomowy DNA (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NR: 2:

ATTACAATTG CTGCAGGGAT CCAC 24 (2) Dane dla SEQ ID NR: 3:

(i) Cechy sekwencji:

(A) Długość: 21 par zasad (B) Rodzaj: nukleotyd (C) Postać nici: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: genomowy DNA (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NR: 3:

CCCACAGGGC CCTACCCCTG T 21 (2) Dane dla SEQ ID NR: 4:

(i) Cechy sekwencji:

(A) Długość: 37 par zasad (B) Rodzaj: nukleotyd (C) Postać nici: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: genomowy DNA (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NR: 4:

ACCAGTTAAC CCTGGTGAAG TCGTTGTCGC CCCTCTC 37 (2) Dane dla SEQ ID NR: 5:

(i) Cechy sekwencji:

(A) Długość: 28 par zasad (B) Rodzaj: nukleotyd (C) Postać nici: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: genomowy DNA (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NR: 5:

ACCATCGCGA CCTGGTCAGG TTGTTGTC 28 (2) Dane dla SEQ ID NR: 6:

(i) Cechy sekwencji:

190 734 (A) Długość: 39 par zasad (B) Rodzaj: nukleotyd (C) Postać nici: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: genomowy DNA (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NR: 6:

ACCAGAATCG ATTCTGGGTT TGATGTTGTC GCCCCTCTC 39 (2) Dane dla SEQ ID NR: 7:

(i) Cechy sekwencji:

(A) Długość: 39 par zasad (B) Rodzaj: nukleotyd (C) Postać nici: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: genomowy DNA (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NR: 7:

ACCAGAATCG ATTCTGGTCA TGCTGTTGTC GCCCCTCTC 39 (2) Dane dla SEQ ED NR: 8:

(i) Cechy sekwencji:

(A) Długość: 39 par zasad (B) Rodzaj: nukleotyd (C) Postać nici: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: genomowy DNA (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NR: 8:

ACCAGAATCG ATTCTTCCTT GGGGGTTGTC GCCCCTCTC 39 (2) Dane dla SEQ ID NR: 9:

(i) Cechy sekwencji:

(A) Długość: 39 par zasad (B) Rodzaj: nukleotyd (C) Postać nici: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: genomowy DNA (xi) Opis sekwencji: SEQ ED NR: 9:

ACCAGAATCG ATTCTCGTTT TCATGTTGTC GCCCCTCTC 39 (2) Dane dla SEQ ED NR: 10:

(i) Cechy sekwencji:

(A) Długość: 39 par zasad (B) Rodzaj: nukleotyd (C) Postać nici: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: genomowy DNA (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NR: 10:

ACCAGAATCG ATTCTTCCCT CGATGTTGTG GCCCCTCTC 39 (2) Dane dla SEQ ID NR: 11:

(i) Cechy sekwencji:

(A) Długość: 39 par zasad (B) Rodzaj: nukleotyd (C) Postać nici: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa

190 734 (ii) Rodzaj cząsteczki: genomowy DNA (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NR: 11:

ACCAGAATCG ATTCTTTTCC TCCTGTTGTC GCCCCTCTC 39 (2) Dane dla SEQ ID NR: 12:

(i) Cechy sekwencji:

(A) Długość: 39 par zasad (B) Rodzaj: nukleotyd (C) Postać nici: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: genomowy DNA (xi) Opis sekwencji: SEQ ID,NR: 12:

ACCAGAATCG ATTCTCCTCA CCCTGTTGTC GCCCCTCTC 39 (2) Dane dla SEQ ID NR: 13:

(i) Cechy sekwencji:

(A) Długość: 39 par zasad (B) Rodzaj: nukleotyd (C) Postać nici: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: genomowy DNA (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NR: 13:

ACCAGAATCG ATTCTCCTCC TCCTGTTGTC GCCCCTCTC 39 (2) Dane dla SEQ ID NR: 14:

(i) Cechy sekwencji:

(A) Długość: 39 par zasad (B) Rodzaj: nukleotyd (C) Postać nici: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: genomowy DNA (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NR: 14:

ACCAGAATCG ATTCTTTTGG GCCTGTTGTC GCCCCTCTC 39 (2) Dane dla SEQ ID NR: 15:

(i) Cechy sekwencji:

(A) Długość: 39 par zasad (B) Rodzaj: nukleotyd (c) Postać nici: nić pojedyncza (D)Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: genomowy DNA (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NR: 15:

ACCAGAATCG ATTCTTTTCC TGATGTTGTC GCCCCTCTC 39 (2) Dane dla SEQ ID NR: 16:

(i) Cechy se^e^k^^^^c^:

190 734 (ii) Rodzaj cząsteczki: genomowy DNA (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NR: 16:

ACCAGAATCG ATTCTTTTGC TCCTGTTGTC GCCCCTCTC 39 (2) Dane dla SEQ ID NR: 17:

(i) Cechy sekwencji:

(A) Długość: 39 par zasad (B) Rodzaj: nukleotyd (C) Postać nici: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: genomowy DNA (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NR: 17:

ACCAGAATCG ATTCTGGTCA CCCTGTTGTC GCCCCTCTC 39 (2) Dane dla SEQ ID NR: 18:

(i) Cechy sekwencji:

(A) Długość: 39 par zasad (B) Rodzaj: nukleotyd (C) Postać nici: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: genomowy DNA (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NR: 18:

ACCAGAATCG ATTCTTTTGA GCCTGTTGTC GCCCCTCTC 39 (2) Dane dla SEQ ID NR: 19:

(i) Cechy sekwencji:

(A) Długość: 39 par zasad (B) Rodzaj: nukleotyd (C) Postać nici: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: genomowy DNA (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NR: 19:

ACCAGAATCG ATTCTCGTGC TCGTGTTGTC GCCCCTCTC 39 (2) Dane dla SEQ ID NR: 20:

(i) Cechy sekwencji:

(A) Długość: 49 par zasad (B) Rodzaj : nukleotyd (C) Postać nici: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: genomowy DNA (xi) Opis sekwencji: SEQ DD NR: 20:

GTCACCGCCT TCCTCAAGTG GATCGACAGG TCCATGAAAA CCAGGTGAA 49 (2) Dane dla SEQ ID NR: 21:

(i) Cechy selcwencji:

(A) Długość: 48 par zasad (B) Rodzaj: nukleotyd (C) Postać nici: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa

190 734 (ii) Rodzaj cząsteczki: genomowy DNA (xi) Opis sekwencji: SEQ DD NR: 21:

CTAGTTCACC TGGTTTTCAT GGACCTGTCG ATCCACTTGA GGAAGGCG 48 (2) Dane dla SEQ ID NR: 22:

(i) Cechy sekwencji (A) Długość: 57 par zasad (B) Rodzaj: nukleotyd (C) Postać nici: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: genomowy DNA (xi) Opis sekwencji: SEQ ED NR: 22:

GTCACCGCCT TCCTCAAGTG GATCGACAGG TCCATGAAAA CCAAGGGCTT GCCCAAG 57 (2) Dane dla SEQ ID NR: 23:

(i) Cechy sekwencji:

(A) Długość: 57 par zasad (B) Rodzaj: nukleotyd (C) Postać nici: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: genomowy DNA (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NR: 23:

TTGGCCTTGG GCAAGCCCTT GGTTTTCATG GACCTGTCGA TCCACTTGAG GAAGGCG 55 (2) Dane dla SEQ ID NR: 24:

(i) Cechy sekwencji:

(A) Długość: 55 par zasad (B) Rodzaj: nukleotyd (C) Postać nici: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: genomowy DNA (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NR: 24:

GCCAAGAGCC ATGCCCCGGA GGTCATAACG TCCTCTCCAT TAAAGTGAGA TCCCA 55 (2) Dane dla SEQ ID NR: 25:

(i) Cechy sekwencji:

(A) Długość: 54 pary zasad (B) Rodzaj: nukleotyd (C) Postać nici: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: genomowy DNA (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NR: 25:

190 734

CTAGTGGGAT CTCACTTTAA TGGAGAGGAC GTTATGACCT CCGGGGCATG GCTC 54 (2) Dane dla SEQ ID NR: 26:

(i) Cechy sekwencji:

(A) Długość: 1467 par zasad (B) Rodzaj: nukleotyd (C) Postać nici: nić pojedyńcza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: genomowy DNA (ix) Charakterystyka:

(A) Nazwa/klucz: CDS (B) Położenie: 1..1467 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NR: 26:

ATG

GGG

CGC

CCA

CTG

CAC

CTC

GTC

CTG

CTC

AGT

GCC

TCC

CTG

GCT

GGC

48

Met

Gly

Arg

Pro

Leu

His

Leu

Val

Leu

Ser

Ala

Ser

Leu

Ala

Gly

1

5

10

15

CTC

CTG

CTC

GGG

GAA

AGT

CTG

TTC

ATC

CGC

AGG

GAG

CAG

GCC

AAC

96

Leu

Gly

Glu

Ser

Leu

Phe

Ile

Arg

Glu

Gln

Ala

Asn

20

25

30

AAC

ATC

CTG

GCG

AGG

GTC

ACG

AGG

GCC

AAT

TCC

TTT

CTT

GAA

GAG

ATG

144

Asn

Ile

Leu

Ala

Arg

Val

Thr

Arg

Ala

Asn

Ser

Phe

Leu

Glu

Met

35

40

45

AAG

AAA

GGA

CAC

CTC

GAA

AGA

GAG

TGC

ATG

GAA

GAG

ACC

TGC

TCA

TAC

192

Lys

Gly

His

Leu

Glu

Arg

Glu

Cys

Met

Glu

Thr

Cys

Ser

Tyr

50

55

60

GAA

GAG

GCC

CGC

GAG

GTC

TTT

GAG

GAC

AGC

GAC

AAG

ACG

AAT

GAA

TTC

240

Glu

Ala

Arg

Glu

Val

Phe

Glu

Asp

Ser

Asp

Lys

Thr

Asn

Glu

Phe

190 734

TGG

AAT

AAA

TAC

AAA

GAT

GGC

GAC

CAG

TGT

GAG

ACC

AGT

CCT

TGC

CAG

288

Trp

Asn

Lys

Tyr

Lys

Asp

Gly

Asp

Gln

Cys

Glu

Thr

Ser

Pro

Cys

Gln

85

90

95

AAC

CAG

GGC

AAA

TGT

AAA

GAC

GGC

CTC

GGG

GAA

TAC

ACC

TGC

ACC

TGT

336

Asn

Gln

Gly

Lys

Cys

Lys

Asp

Gly

Leu

Gly

Glu

Tyr

Thr

Cys

Thr

Cys

100

105

110

TTA

GAA

GGA

TTC

GAA

GGC

AAA

AAC

TGT

GAA

TTA

TTC

ACA

CGG

AAG

CTC

384

Leu

Glu

Gly

Phe

Glu

Gly

Lys

Asn

Cys

Glu

Leu

Phe

Thr

Arg

Lys

Leu

115

120

125

TGC

AGC

CTG

GAC

AAC

GGG

GAC

TGT

GAC

CAG

TTC

TGC

CAC

GAG

GAA

CAG

432

Cys

Ser

Leu

Asp

Asn

Gly

Asp

Cys

Asp

Gln

Phe

Cys

His

Glu

Gln

130

135

140

AAC

TCT

GTG

TGC

TCC

TGC

GCC

CGC

GGG

TAC

ACC

CTG

GCT

GAC

AAC

480

Asn

Ser

Val

Cys

Ser

Cys

Ala

Arg

Gly

Tyr

Thr

Leu

Ala

Asp

Asn

145

150

155

160

GGC

AAG

GCC

TGC

ATT

CCC

ACA

GGG

CCC

TAC

CCC

TGT

GGG

AAA

CAG

ACC

528

Gly

Lys

Ala

Cys

Ile

Pro

Thr

Gly

Pro

Tyr

Pro

Cys

Gly

Lys

Gln

Thr

165

170

175

CTG

GAA

CGC

AGG

AAG

AGG

TCA

GTG

GCC

CAG

GCC

ACC

AGC

GGG

576

Leu

Glu

Arg

Lys

Arg

Ser

Val

Ala

Gln

Ala

Thr

Ser

Gly

180

185

190

GAG

GCC

CCT

GAC

AGC

ATC

ACA

TGG

AAG

CCA

TAT

GAT

GCA

GCC

GAC

CTG

624

Glu

Ala

Pro

Asp

Ser

Ile

Thr

Trp

Lys

Pro

Tyr

Asp

Ala

Asp

Leu

195

200

205

GAC

CCC

ACC

GAG

AAC

CCC

TTC

GAC

CTG

CTT

GAC

TTC

AAC

CAG

ACG

CAG

672

Asp

Pro

Thr

Glu

Asn

Pro

Phe

Asp

Leu

Asp

Phe

Asn

Gln

Thr

Gln

210

215

220

190 734

CCT GAG	AGG GGC	GAC	AAC AAC CTC	ACC AGG	ATC	GTG GGA	GGC CAG GAA	720
Pro Glu	Arg Gly	Asp	Asn Asn Leu	Thr Arg	Ile	Val Gly	Gly Gln Glu
225			230		235		240
TGC AAG	GAC GGG	GAG	TGT CCC TGG	CAG GCC	CTG	CTC ATC	AAT GAG GAA	768
Cys Lys	Asp Gly	Glu	Cys Pro Trp	Gln Ala	Leu	Leu Ile	Asn Glu Glu
		245		250			255
AAC GAG	GGT TTC	TGT	GGT GGA ACT	ATT CTG	AGC	GAG TTC	TAC ATC CTA	816
Asn Glu	Gly Phe	Cys	Gly Gly Thr	Ile Leu	Ser	Glu Phe	Tyr Ile Leu
	260			265			270
ACG GCA	GCC CAC	TGT	CTC TAC CAA	GCC AAG	AGA	TTC AAG	GTG AGG GTA	864
Thr Ala	Ala His	Cys	Leu Tyr Gln	Ala Lys	Arg	Phe Lys	Val Arg Val
	275		280			285
GGG GAC	CGG AAC	ACG	GAG CAG GAG	GAG GGC	GGT	GAG GCG	GTG CAC GAG	912
Gly Asp	Arg Asn	Thr	Glu Gln Glu	Glu Gly	Gly	Glu Ala	Val His Glu
290			295			300
GTG GAG	GTG GTC	ATC	AAG CAC AAC	CGG TTC	ACA	AAG GAG	ACC TAT GAC	960
Val Glu	Val Val	Ile	Lys His Asn	Arg Phe	Thr	Lys Glu	Thr Tyr Asp
305			310		315		320
TTC GAC	ATC GCC	GTG	CTC CGG CTC	AAG ACC	CCC	ATC ACC	TTC CISC ATG 1008
Phe Asp	Ile Ala	Val	Leu Arg Leu	Lys Thr	Pro	Ile Thr	Phe Arg Met
		325		330			335
AAC GTG	GCG CCT	GCC	TGC CTC CCC	GAG CGT	GAC	TGG GCC	GAG TCC ACG 1056
Asn Val	Ala Pro	Ala	Cys Leu Pro	Glu Arg	Asp	Trp Ala	Glu Ser Thr
	340			345			350
CTG ATG	ACG CAG	AAG	ACG GGG ATT	GTG AGC	GGC	TTC GGG	CGC ACC CAC 1104
Leu Met	Thr Gln	Lys	Thr Gly Ile	Val Ser	Gly	Phe Gly	Arg Thr His

355

360

365

190 734

GAG AAG GGC CGG	CAG TCC ACC AGG CTC AAG ATG	CTG GAG	GTG CCC TAC 1152
Glu Lys Gly Arg	Gln Ser Thr Arg Leu Lys Met	Leu Glu	Val Prc Tyr
370	375	380
GTG GAC CGC AAC	AGC TGC AAG CTG TCC AGC AGC	TTC ATC	ATC ACC CAG 1200
Val Asp Arg Asn	Ser Cys Lys Leu Ser Ser Ser	Phe Ile	Ile Thi Gln
385	390 395		400
AAC ATG TTC TGT	GCC GGC TAC GAC ACC AAG CAG	GAG GAT	GCC TGC CAG 1248
Asn Met Phe Cys	Ala Gly Tyr Asp Thr Lys Gln	Glu Asp	Ala Cys Gln
	405 410		415
GGG GAC AGC GGG	GGC CCG CAC GTC ACC CGC TTC	AAG GAC	ACC TAC TTC 1296
Gly Asp Ser Gly	Gly Pro His Val Thr Arg Phe	Lys Asp	Thr Tyr Phe
420	425		430
GTG ACA GGC ATC	GTC AGC TGG GGA GAG AGC TGT	GCC CGT	AAG GGG AAG 1344
Val Thr Gly Ile	Val Ser Trp Gly Glu Ser Cys	Ala Arg	Lys Gly Lys
435	440	445
TAC GGG ATC TAC	ACC AAG GTC ACC GCC TTC CTC	AAG TGG ATC GAC AGG 1392
Tyr Gly Ile Tyr	Thr Lys Val Thr Ala Phe Leu	Lys Trp	Ile Asp Arg
450	455	460
TCC ATG AAA ACC	AGG GGC TTG CCC AAG GCC AAG	AGC CAT GCC CCG GAG 1440
Ser Met Lys Thr	Arg Gly Leu Pro Lys Ala Lys	Ser His	Ala Pro Glu
465	470 475		480
GTC ATA ACG TCC	TCT CCA TTA AAG TGA		1467
Val Ile Thr Ser	Ser Pro Leu Lys *

485 (2) Dane dla SEQ ID NR: 27:

(i) Cechy sekwencji:

(A) Długość:: 489 aminokwasów (B) Rodzaj: aminokwas

190 734 (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: białko

	(xi) Opis	sekwencj i:	SEQ	ID NR:	27:
Met	Gly Arg Pro	Leu His Leu	Val	Leu Leu	Ser Ala Ser Leu Ala Gly
1		5		10	15
Leu	Leu Leu Leu	Gly Glu Ser	Leu	Phe Ile	Arg Arg Glu Gln Ala Asn
	20			25	30
Asn	Ile Leu Ala	Arg Val Thr	Arg	Ala Asn	Ser Phe Leu Glu Glu Met
	35		40		45
Lys	Lys Gly His	Leu Glu Arg	Glu	Cys Met	Glu Glu Thr Cys Ser Tyr
	50	55			60
Glu	Glu Ala Arg	Glu Val Phe	Glu	Asp Ser	Asp Lys Thr Asn Glu Phe
65		70			75 80
Trp	Asn Lys Tyr	Lys Asp Gly	Asp	Gln Cys	Glu Thr Ser Pro Cys Gln
		85		90	95
Asn	Gln Gly Lys	Cys Lys Asp	Gly	Leu Gly	Glu Tyr Thr Cys Thr Cys
	100			105	110
Leu	Glu Gly Phe	Glu Gly Lys	Asn	Cys Glu	Leu Phe Thr Arg Lys Leu
	115		120		125
Cys	Ser Leu Asp	Asn Gly Asp	Cys	Asp Gln	Phe Cys His Glu Glu Gln
	130	135			140
Asn	Ser Val Val	Cys Ser Cys	Ala	Arg Gly	Tyr Thr Leu Ala Asp Asn
145		150			155 160
Gly	Lys Ala Cys	Ile Pro Thr	Gly	Pro Tyr	Pro Cys Gly Lys Gln Thr
		165		170	175
Leu	Glu Arg Arg	Lys Arg Ser	Val	Ala Gln	Ala Thr Ser Ser Ser Gly
	180			185	190
Glu	Ala Pro Asp	Ser Ile Thr	Trp	Lys Pro	Tyr Asp Ala Ala Asp Leu

195

200

205

190 734

Asp

Pro 210

Thr

Glu Asn Pro

Phe Asp 215

Leu Leu Asp

Phe 220

Asn

Gln

Thr

Gln

Pro

Glu

Arg

Gly

Asp

Asn

Leu

Thr

Arg

Ile

Val

Gly

Gln

Glu

225

230

235

240

Cys

Lys

Asp

Gly

Glu

Cys

Pro

Trp

Gln

Ala

Leu

Ile

Asn

Glu

245

250

255

Asn

Glu

Gly

Phe

Cys

Gly

Thr

Ile

Leu

Ser

Glu

Phe

Tyr

Ile

Leu

260

265

270

Thr

Ala

His

Cys

Leu

Tyr

Gln

Ala

Lys

Arg

Phe

Lys

Val

Arg

Val

275

280

285

Gly

Asp

Arg

Asn

Thr

Glu

Gln

Glu

Gly

Glu

Ala

Val

His

Glu

290

295

300

Val

Glu

Val

Ile

Lys

His

Asn

Arg

Phe

Thr

Lys

Glu

Thr

Tyr

Asp

305

310

315

320

Phe

Asp

Ile

Ala

Val

Leu

Arg

Leu

Lys

Thr

Pro

Ile

Thr

Phe

Arg

Met

325

330

335

Asn

Val

Ala

Pro

Ala

Cys

Leu

Pro

Glu

Arg

Asp

Trp

Ala

Glu

Ser

Thr

340

345

350

Leu

Met

Thr

Gln

Lys

Thr

Gly

Ile

Val

Ser

Gly

Phe

Gly

Arg

Thr

His

355

360

365

Glu

Lys

Gly

Arg

Gln

Ser

Thr

Arg

Leu

Lys

Met

Leu

Glu

Val

Pro

Tyr

370

375

380

Val

Asp

Arg

Asn

Ser

Cys

Lys

Leu

Ser

Phe

Ile

Thr

Gln

385

390

395

400

Asn

Met

Phe

Cys

Ala

Gly

Tyr

Asp

Thr

Lys

Gln

Glu

Asp

Ala

Cys

Gln

405

410

415

Gly

Asp

Ser

Gly

Pro

His

Val

Thr

Arg

Phe

Lys

Asp

Thr

Tyr

Phe

420 425 430

190 734

Val

Thr

Gly

Ile

Val

Ser

Trp

Gly

Glu

Ser

Cys

Ala

Arg

Lys

Gly

Lys

435

440

445

Tyr

Gly

Ile

Tyr

Thr

Lys

Val

Thr

Ala

Phe

Leu

Lys

Trp

Ile

Asp

Arg

450

455

460

Ser

Met

Lys

Thr

Arg

Gly

Leu

Pro

Lys

Ala

Lys

Ser

His

Ala

Pro

Glu

465

470

475

480

Val

Ile

Thr

Ser

Pro

Leu

Lys

485

190 734 (-40)

Met Gly Arg Pro Leu Hi3 Leu Val Leu Leu Ser Ala Ser Leu Ala Gly Leu Leu Leu ATG GGG CGC CCA CTG CAC CTC GTC CTG CTC AGT GCC TCC CTG GCT GGC CTC CTG CTG

	9	18	27	36	45	54
					(-4)	(-1
						40
Leu Gly Glu Ser Leu Phe Ile Arg Arg Glu Gln Ala Asn Asn Ile Leu Ala Arg Val Thr Arg
CTC GGG GAA AGT CTG TTC ATC CGC AGG GAG CAG GCC AAC AAC ATC CTG GCG AGG GTC ACG AGG
	66 75	• 84	ί 93	i 102	111	120
(+D
41
Ala	. Asn Ser Phe Leu Glu	Glu Met Lys	Lys Gly His	Leu Glu Arg Glu	Cy3 Met Glu	Glu Thr
GCC	AAT TCC TTT CTT GAA	GAG ATG AAG	AAA GGA CAC	CTC GAA AGA GAG	: TGC ATG GAA	GAG ACC
	129 138	147	156	165	174	183
Cys	Ser Tyr Glu Glu Ala	Arg Glu Val	Phe Glu Asp	Ser Asp Lys Thr	Asn Glu Phe	Trp Asn
TGC	TCA TAC GAA GAG GCC	CGC GAG GTC	TTT GAG GAC	AGC GAC AAG ACG	AAT GAA TTC	TGG AAT
	192 201	210	219	228	237	246
Lys	Tyr Lys Asp Gly Asp	Gln Cys Glu	Thr Ser Pro	Cys Gln Asn Gln	Gly Lys Cys	Lys Asp
AAA	TAC AAA GAT GGC GAC	CAG TCT GAG	ACC AGT CCT	TGC CAG AAC CAG	GGC AAA TCT	AAA GAC
	255 264	273	282	291	300	309
Gly	Leu Gly Glu Tyr Thr	Cys Thr Cys	Leu Glu Gly	Phe Glu Gly Lys	Asn Cy3 Glu	Leu Phe
GGC	CTC GGG GAA TAC ACC	TGC ACC TCT	TTA GAA GGA	TTC GAA GGC AAA	AAC TGT GAA	TTA TTC
	318 327	336	345	3S4	363	372
Thr	Arg Lys Leu Cys Ser	Leu Asp Asn	Gly Asp Cys	Asp Gln Phe Cys	His Glu Glu	Gln Asn
ACA	CGG AAG CTC TGC AGC	CTG GAC AAC	GGG GAC TCT	GAC CAG TTC TGC	CAC GAG GAA	CAG AAC
	381 390	399	408	417	426	435
Ser	Val val Cys Ser Cys	Ala Arg Gly	Tyr Thr Leu	Ala Asp Asn Gly	Lys Ala Cys	Ile Pro
TCT	GTG GTG TGC TCC TGC	GCC CGC GGG	TAC ACC CTG	GCT GAC AAC GGC	AAG GCC TGC	ATT CCC
	444 453	462	471	480	489	498
			178	179 180 181 182	183
Thr	Gly Pro Tyr Pro Cys	Gly Lys Gln	Thr Leu Glu	Arg Arg Lys Arg	Ser Val Ala	Gln Ala
ACA	GGG COC TAC CCC TGT	GGG AAA CAG	ACC CTG GAA	OGC AGG AAG AGG	TCA GTG GCC	CAG GCC
	507 516	525	534	543	552	561
Thr	Ser Ser Ser Gly Glu	Ala Pro Asp	Ser Ile Thr	Trp Lys Pro Tyr	Asp Ala Ala	Asp Leu
ACC	AGC AGC AGC GGG GAG	GCC CCT GAC	AGC ATC ACA	TGG AAG CCA TAT	GAT GCA GCC	GAC CTG
	570 579	588	597	606	615	624
						R6
						229
Asp	Pro Thr Glu Asn Pro	Phe Asp Leu	Leu Asp Phe	Asn Gln Thr Gln	Pro Glu Arg	Gly Asp
GAC	CCC ACC GAG AAC CCC	TTC GAC CTG	CTT GAC TTC	AAC CAG ACG CAG	CCT GAG AGG	GGC GAC
	633 642	651	660	669	678	687
R5	R4 R3 R2 Rl
	234 235
Asn	A3n Leu Thr Arg Ile	Val Gly Gly	Gln Glu Cys	Lys Asp Gly Glu	Cys Pro Trp	Gln Ala
AAC	AAC CTC ACC AGG ATC	GTG GGA GGC	CAG GAA TGC	AAG GAC GGG GAG	TGT CCC TGG	CAG GCC
	696 705	714	723	732	74 L	750

Fig. 1-1

190 734

Leu Leu Ile CTG CTC ATC

759

Asn Glu Glu AAT GAG GAA

768

Asn Glu Gly AAC GAG GGT

777

Phe Cys Gly TTC TGT GGT

786

Gly Thr Ile GGA ACT ATT

795

Leu Ser Glu CTG AGC GAG

804

Phe Tyr Ile TTC TAC ATC

813

Leu Thr Ala CTA ACG GCA

822

Ala His Cy3 GCC CAC TGT

831

Leu Tyr Gln CTC TAC CAA

840

Ala Lys Arg GCC AAG AGA

849

Phe Lys Val TTC AAG GTG

858

Arg Val Gly AGG GTA GGG

867

Asp Arg Asn GAC CGG AAC

876

Thr Glu Gln ACG GAG CAG

885

Glu Glu Gly GAG GAG GGC

894

Gly Glu Ala GGT GAG GCG

903

Val His Glu GTG CAC GAG

912

Val Glu Val GIG GAG GTG

921

Val Ile Lys GTC ATC AAG

930

His Asn Arg CAC AAC CGG

939

Phe Thr Lys TTC ACA AAG

948

Glu Thr Tyr GAG ACC TAT

957

Asp Phe Asp GAC TTC GAC

966

Ile Ala Val ATC GCC GTG

975

Leu Arg Leu CTC CGG CTC

984

Lys Thr Pro AAG ACC CCC

993

Ile Thr Phe ATC ACC TTC

1002

Arg Met Asn CGC ATG AAC

1011

Val Ala Pro GTG GCG OCT

1020

Ala Cys Leu GOC TGC CTC

1029

Pro Glu Arg CCC GAG CGT

1038

Asp Trp Ala GAC TGG GCC

1047

Glu Ser Thr GAG TCC ACG

1056

Leu Met Thr CTG ATG ACG

1065

Gln Lys Thr CAG AAG ACG

1074

Gly Ile Val GGG ATT GTG

1083

Ser Gly Phe AGC GGC TTC

1092

Gly Arg Thr GGG CGC ACC

1101

His Glu Lys CAC GAG AAG

1110

Gly Arg Gln GGC CGG CAG

1119

Ser Thr Arg TCC ACC AGG

1128

Leu Lys Met CTC AAG ATG

1137

Leu Glu Val CTG GAG GTG

1146

Pro Tyr Val COC TAC GTG

1155

Asp Arg Asn GAC CGC AAC

1164

Ser Cys Lys AGC TGC AAG

1173

Leu Ser Ser CTG TCC AGC

1182

Ser Phe Ile AGC TTC ATC

1191

Ile Thr Gln ATC ACC CAG

1200

Asn Met Phe AAC ATG TTC

1209

Cys Ala Gly TGT GCC GGC

1218

Tyr Asp Thr TAC GAC ACC

1227

Lys Gln Glu AAG CAG GAG

1236

Asp Ala Cys GAT GCC TGC

1245

Gln Gly Asp CAG GGG GAC

1254

Ser Gly Gly AGC GGG GGC

1263

Pro His Val CCG CAC GTC

1272

Thr Arg Phe ACC CGC TTC

1281

Lys Asp Thr AAG GAC ACC

1290

Tyr Phe Val TAC TTC GTG

1299

Thr GLy Ile ACA GGC ATC

1308

Val Ser Trp GTC AGC TGG

1317

Gly Glu Ser GGA GAG AGC

1326

Cys Ala Arg TGT GCC CGT

1335

Lys Gly Lys AAG GGG AAG

1344

Tyr Gly Ile TAC GGG ATC

1353

Tyr Thr Lys TAC ACC AAG

1362

Val Thr Ala GTC ACC GCC

1371

Phe Leu Lys TTC CTC AAG

1380

Trp Ile Asp TGG ATC GAC

1389

Arg Ser Met AGG TCC ATG

1398

Ile Thr Ser ATA ACG TCC

1452

Ser Pro Leu TCT CCA TTA

1461

469 Lys Thr Arg AAA ACC AGG 1407

488

Lys TER AAG TGA

1467

470

Gly Leu Pro GGC TTG CCC

1416

475 Lys Ala Lys AAG GCC AAG 1425

476

Ser His Ala AGC CAT GCC

1434

480 Pro Glu Val CCG GAG GTC

1443

Pre-/propeptyd Peptyd łączący Peptyd aktywacyjny

Fig. 1-2

190 734 ftf

4J •N α

5	flj
Ό	•H
M	G
Φ	m
e	Z
•H	0
	G
Λ	O
nJ	rH Λί
M (d	O
CM	Ό

CM s

o g

τ-

id □

CN

Fig.

> X G Pm

O G ύ>

<D <y ν Ρί Ό

H

Λί

190 734 <β

•p4 C ti Z £ c
*0	0
	iH
a)	Λί
6
•H	0
M	TJ
Qi	ti
ti	P
M	>1
ti	*N
Ai	3

ΙΟ ο

^ćcca:^:

££££ΐ£££

Α4444444 (EccflCtncccEffia:

COCOCOCOPOCOCOCO δ: i a: a: a: a: a: cc ιτπ* » ο-’Γ S'’ S %iff <5 Ab °% r-4 i ł I »“ł i ł l f—4 r—1 TJ W Tl TT) TJ tj «flr-ałgO^cfJT 88800000 gggglggg rł^- a

CN

Fig ti •w a

0) a >

O) C ti

Q>	N				>1	ti	25
U	0		ti	ti X		X	X
OJ	N		X	u.		LU	U-
ΓΛ	ti		u.		*H
a)	N	ti
•H s	0 M	<—i TJ	U4	u.	O	X	—

190 734

Fig. 3

190 734

VI •rł

X

OJ

KLONY

INICJALNE

SUBKLONY 799-6 ♦H fi

N

O <0

G

N

OJ

N

O

Ul o

O a

U

O				00 ·*	O\
m	en	r*		i-*	wH
O\	ds	*A	iA	<A	A
os	os	CM	CM	CM	CM
e*-	C	00	00	00	00

O m

I m

cm

220kD

97kD

66kD

46kD.

30kD

213kD.

-f τ,-

-..tj· <

Ul

H

X

Φ

SC

HC

LC

G

H υ

nl £

CO <e

N

O

Ul o

AMPLIFIKACJA NA 20nM METOTREKSACIE en «

Ό r*·

Ό

o>		r->	en	TT
«—4	os		Tt	»4
r^·	C*	r-·
so	so	Ό	SO	Ό
0Q	00	OO	00	00

220kD

97kD

66kD

46kD·

30kD

21.5kO

|53i mi ¢$91JWŚI ϋ** >

14kl)

Fig. 4

SC

HC

LC

190 734

Fig. 5 (O

N

O o

O) o

CHO-rFTCCHO CHO-rFX7CHQ· ,

II II II fi II II 11 u

97,4 kD 66 kD 4ńkD kD

213kD 143 kD

«· *9 Μ BBB*

SC

HC

LC

Surowica anty-FX

N o

o ω

o

CHO-rFX/CHO CHO-rFX/CHO^-^fury^na

II II II II II II II II

W W *4 -W x

213 kD 143 kl^

O C4 Tf Ό

CM β· Ό

- —

SC

LC anty-FX LC mAb t = czas inkubacji w temperaturze 37 C podany w godzinach

190 734

Fig. 6


<	fc tH ł-H p	£ fc
N U	fc	u
tn O	ó	O	o
N	ffi	W	ffi
X fc	u	o	U

U—4

SC

HC

(LC)

190 734 nukleotydów nj h

<d id •H c

fd o

c o

rd

X o

Ό id

4J >, «Ν to

190 734 ^4 •N

W >1 £

•ΓΊ

U

Ss u

Ai

AJ

s.

μ

Q<

<u

Om

cn	m	<n	<0
H	t-	t-	ł-
<	<	<	<
σ	a	σ	σ
<r	<	<	<
>	>	>	>
ω	m	CZ)	0)

NL”

Ό >,

-P <D

CM

O

M

Q<

(U	UJ	Ul
UJ	IU	UJ
_j	-i	u
u.	u.	u.
cn	cn	cn
z	z	z
A.	SL	a.

UJ

σ		σ
Ul		Ul
s		ac
Ł		X
UL		u.
-1		U

Cn

Ή &4 ferencyjny iki typ FX

X

Uh* ó

X o

X

O AJ x 5 o ^H o° rm ω

N >9 M c μ <a M Φ i*

Φ μ (ϋ

X * h O

Ϊ3

O X aj c CJ -H

ra			<a
G			G
X			>1
μ			M
3			3
μ			M
1 O			i a
MO			MO
I			t r·*
O <*i			O
W			X
o ω			U o
N			N
>1 M		X	Μ M
3	X		3
>1 μ	U.	M	X μ
G <ti	Iw	1	g <a

0)

CU

E <U •U

Q

U.

Ó

X o

ι—I (0 ι-l $ Q O

O Ai X G U -H

M

OJ e¹ (U μ

(T5 (U

190 734

220 kD 97,4 kD

kD

210 kD


		N
N	X	U
O	tl	O
O		tn
cn		O
o	C3
	O	tg
<SJ		ni
X tl	§	X tl

Fig. 9 •SC

HC aHC pHC

LC2

LC4

190 734 oh <u c

e cn =k m

OJ

CU ω

fl

N

O

W

O + r-furyna

G

O ε

o o

U*) f0

N o

o cn

O

N

220 kD °70kD ćbkD 46 kD kD

210 kD

cr

3s

HC aHC pHC

LC2

LC4 s

ci oi <u

G

O x

u nj

N

U

O

W

O

N

X fc + r-furyna o

II

Ό li

TT c4

II

TT li (M r*

II

220 kD 97,5 kD kD 46 kD kD

21,5 kD

HC

LC2

LC4

Fig. 10

190 734 ιβ

Ν

Ο

Ο «

Ο

Μ

Ο

Ψι

Λ

220 kD 97,4 kD kD 46 kD kD

21,5kD

es

Fig,

190 734

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz

Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Analog czynnika X, znamienny tym, że posiada modyfikację w rejonie naturalnie występującego miejsca rozszczepienia aktywacyjnego do czynnika Xa w sekwencji czynnika X Gly228-R6-R5-R4-R3-R2-Arg234-R1, przy czym modyfikacja ta stanowi miejsce przekształcania dla nienaturalnie w tym rejonie sekwencji czynnika X rozszczepiającej proteazy, a

R1 oznacza aminokwas wybrany z grupy Ile, Val, Ser, Thr lub Ala

R2 oznacza aminokwas wybrany z grupy Pro, Gly, Lys lub Arg

R3 oznacza aminokwas wybrany z grupy Phe, Lys, Met, Gln, Glu, Ser, Val, Arg lub Pro

R4 oznacza aminokwas wybrany z grupy Asp, Ile, Ser, Met, Pro, Thr, Arg lub Lys

R5 oznacza aminokwas wybrany z grupy Asn, Lys, Ser, Glu, Ala, Gln, His lub Arg i

R6 oznacza aminokwas wybrany z grupy Asp, Phe, Thr, Arg, Leu lub Ser.
2. Analog czynnika X według zastrz. 1, znamienny tym, że modyfikacja dotyczy co najmniej jednego aminokwasu wewnątrz sekwencji aminokwasowej peptydu aktywacyjnego.
3. Analog czynnika X według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że modyfikacja stanowi wymianę co najmniej jednego aminokwasu między Gly228 a Arg 234 oraz ewentualnie Ile235, w odniesieniu do numeracji aminokwasów według fig. 1.
4. Analog czynnika X według zastrz. 1, znamienny tym, że modyfikacja stanowi miejsce przekształcania dla proteazy wybranej z grupy endoproteaz, takich jak np. keksyna/Kex2, furyna/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7, proteaz serynowych, takich jak np. czynnik IIa, czynnik XHa, czynnik XIa, czynnik Xa, lub kalikreiny, albo pochodnej tych proteaz.
5. Analog czynnika X według zastrz. 1, znamienny tym, że posiada modyfikację w rejonie C-końcowej sekwencji aminokwasowej czynnika X.
6. Analog czynnika X według zastrz. 5, znamienny tym, że posiada modyfikację w rejonie C-końcowego miejsca rozszczepienia β-peptydu.
7. Analog czynnika X według zastrz. 6, znamienny tym, że modyfikację stanowi mutacja, delecja lub insercja w rejonie sekwencji aminokwasowej czynnika X między pozycjami aminokwasów Arg469 a Ser476.
8. Analog czynnika X według zastrz. 5 albo 6, albo 7, znamienny tym, że modyfikacja zapobiega odszczepieniu β-peptydu.
9. Analog czynnika X według zastrz. 5, znamienny tym, że posiada delecję β-peptydu czynnika X.
10. Analog czynnika X według zastrz. 5, znamienny tym, że posiada sygnał zatrzymania translacji w rejonie C-końcowym sekwencji czynnika X.
11. Analog czynnika X według zastrz. 10, znamienny tym, że posiada sygnał zatrzymania translacji w pozycji aminokwasu 470 sekwencji czynnika X.
12. Analog czynnika X według zastrz. 1, znamienny tym, że modyfikacja w rejonie peptydu aktywacyjnego umożliwia aktywowanie in vitro analogu czynnika X do natywnego czynnika Xa lub analogu czynnika Xa.
13. Analog czynnika X według zastrz. 12, znamienny tym, że modyfikacja umożliwia aktywowanie przez proteazę wybraną z grupy endoproteaz, takich jak keksyna/Kex2, furyna/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC7PC7, grupy proteaz serynowych, takich jak np. czynnik IIa, czynnik XIIa, czynnik XIa, czynnik Xa, lub kalikreinę, albo pochodną tych proteaz.
14. Analog czynnika X według zastrz. 1, znamienny tym, że modyfikacja umożliwia aktywowanie in vivo analogu czynnika X do natywnego czynnika Xa lub analogu czynnika Xa.
15. Analog czynnika X według zastrz. 14, znamienny tym, że modyfikacja umożliwia aktywowanie przez proteazę wybraną z grupy proteaz serynowych, takich jak np. czynnik XHa, czynnik XIa, czynnik IIa, czynnik Xa, lub przez kalikreinę.

190 734
16. Analog czynnika X według zastrz. 1, znamienny tym, że stanowi analog czynnika X z nienaruszonym β-peptydem lub analog czynnika skrócony na C-końcu.
17. Analog czynnika X według zastrz. 1, znamienny tym, że stanowi cząsteczkę jednołańcuchową
18. Rekombinowany DNA znamienny tym, ze koduje analog czynnika X jak określono w zastrz. 1 do 17, i zawarty jest w wektorze do rekombinacyjnej ekspresji kodowanego białka.
19. Kompozycja, znamienna tym, że zawiera oczyszczony analog czynnika X lub jego białko prekursorawe z modyfikacją w rejonie naturalnie występującego miejsca rozszczepienia aktywacyjnego czynnika X w sekwencji czynnika X w sekwencji Gly228-R6-R5-R4-R3-R2-Arg234-R1, przy czym modyfikacja ta stanowi miejsce przekształcenia nienaturalnie w tym rejonie sekwencji czynnika X rozszczepiającej proteazy, a

R1 oznacza aminokwas wybrany z grupy Ile, Val, Ser, Thr lub Ala

R2 oznacza aminokwas wybrany z grupy Pro, Gly, Lys lub Arg

R3 oznacza aminokwas wybrany z grupy Phe, Lys, Met, Gln, Glu, Ser, Val, Arg lub Pro

R4 oznacza aminokwas wybrany z grupy Asp, Ile, Ser, Met, Pro, Thr, Arg lub Lys

R5 oznacza aminokwas wybrany z grupy Asn, Lys, Ser, Glu, Ala, Gln, His lub Arg i

R6 oznacza aminokwas wybrany z grupy Asp, Phe, Thr, Arg, Leu lub Ser.
20. Kompozycja według zastrz. 19, znamienna tym, że modyfikacja stanowi miejsce rozszczepienia dla proteazy, wybranej z grupy endoproteaz dwuzasadowych, takich jak np. keksyna/Kex2, furyna/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7, proteaz serynowych, takich jak np. czynnik IIa, czynnik XHa, czynnik XIa, czynnik Xa, lub kalikreiny.
21. Kompozycja według zastrz. 19 albo 20, znamienna tym, że analog czynnika X stanowi analog FXe.
22. Kompozycja według jednego z zastrz. 19 albo 20, znamienna tym, że analog czynnika X stanowi analog czynnika X skrócony na C-końcu.
23. Kompozycja według zastrz. 19, znamienna tym, że zawiera analog czynnika X jako cząsteczkę jednołańcuchową w postaci wyodrębnionej.
24. Kompozycja według zastrz. 23, znamienna tym, ze zawiera jednołańcuchowy analog czynnika X w enzymatycznie nieaktywnej postaci o czystości co najmniej 80%, korzystnie 90%, szczególnie korzystnie 95%, i nie zawiera nieaktywnych, proteolitycznych produktów pośrednich analogu czynnika X7Xa.
25. Kompozycja według zastrz. 19, znamienna tym, że zawiera analog czynnika X jako cząsteczkę dwułańcuchową w postaci wyodrębnionej.
26. Kompozycja według zastrz. 19, znamienna tym, że zawiera analog czynnika X, posiadający modyfikację, która umożliwia aktywowanie in vitro analogu czynnika X do natywnego czynnika Xa lub analogu czynnika Xa.
27. Kompozycja według zastrz. 19, znamienna tym, ze ma postać preparatu farmaceutycznego.
28. Kompozycja według zastrz. 19, znamienna tym, że jest umieszczona w odpowiednim urządzeniu, zwłaszcza w urządzeniu aplikacyjnym, w kombinacji z proteazą, wybraną z grupy endoproteaz, takich jak np. keksyna/Kex2, furyna/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7, grupy proteaz serynowych, takich jak np. czynnik XHa, czynnik XIa, czynnik Xa, lub kalikreiną, albo pochodną tych proteaz.
29. Kompozycja według zastrz. 28, znamienna tym, że składniki są oddzielone od siebie przestrzennie.
30. Kompozycja według zastrz. 19, znamienna tym, że zawiera analog czynnika X, posiadający modyfikację, która umożliwia aktywowanie in vivo analogu czynnika X do natywnego czynnika Xa lub analogu czynnika Xa.
31. Kompozycja, znamienna tym, że zawiera analog czynnika Xa i jest wolna od nieaktywnych produktów pośrednich analogu czynnika X/Xa, i autoproteolitycznych produktów rozkładu czynnika X, i może być otrzymywana przez aktywowanie analogu czynnika X jak określono w zastrz. 1 do 17.
32. Kompozycja według zastrz. 19, znamienna tym, że zawiera dopuszczalny fizjologicznie nośnik i jest w postaci stabilnej podczas składowania.

190 734
33. Kompozycja według zastrz. 19, znamienna tym, że zawiera ewentualnie jako dalszą część składową czynnik krwi lub aktywowaną postać czynnika krwi.
34. Kompozycja według zastrz. 33, znamienna tym, że zawiera jako dalszą część składową co najmniej jeden składnik z czynnikiem VIII o aktywności bypass'owej.
35. Kompozycja według zastrz. 19, znamienna tym, że stanowi składnik zestawu farmaceutycznego i ewentualnie ma postać preparatu kilku-składnikowego.
36. Zastosowanie kompozycji jak określono w zastrz. 19 do 35 do wytwarzania środka leczniczego.
37. Zastosowanie rekombinowanego kwasu nukleinowego DNA kodującego analog czynnika X jak określono w zastrz. 1 do 17 i zawartego w wektorze do rekombinacyjnej ekspresji kodowanego białka do wytwarzania środka leczniczego.
38. Sposób wytwarzania kompozycji zawierającej oczyszczony rekombinowany analog czynnika X, znamienny tym, że otrzymany rekombinacyjnie analog czynnika X wyodrębnia się i oczyszcza metodą chromatograficzną.
39. Sposób według zastrz. 38, znamienny tym, że:

- dostarcza się kwas nukleinowy określony w zastrz. 18

- transformuje się odpowiednią komórkę

- poddaje się ekspresji analog czynnika X

- ewentualnie inkubuje się analog czynnika X z proteazą

- wyodrębnia się analog czynnika X i

- oczyszcza się analog czynnika X metodą chromatograficzną,
40. Sposób według zastrz. 39, znamienny tym, że analog czynnika X wyodrębnia się jako cząsteczkę dwułańcuchową.
41. Sposób według zastrz. 38 albo 39, albo 40, znamienny tym, że dwułańcuchowy analog czynnika X kontaktuje się z proteazą wybraną z grupy endoproteaz, takich jak np. keksyna/Kex2, furyna/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7, grupy proteaz serynowych, takich jak np. czynnik IIa, czynnik XIIa, czynnik XIa, czynnik Xa, lub kalikreiną, albo pochodną tych proteaz, w warunkach, w których analog czynnika X aktywuje się do natywnego czynnika Xa lub analogu czynnika Xa.
42. Sposób według zastrz. 41, znamienny tym, że stosuje się komórkę, która może przeprowadzać rozszczepianie pojedynczego łańcucha na lekki i ciężki łańcuch czynnika X lub analogu czynnika X, nie eksprymuje i ewentualnie posiada deficyt proteazy.
43. Sposób według zastrz. 42, znamienny tym, że stosuje się komórkę nie eksprymującą endoproteazy, takiej jak np. keksyna, furyna, PACE lub ich pochodna.
44. Sposób według zastrz. 42 albo 43, znamienny tym, że analog czynnika X wyodrębnia się jako cząsteczkę jednołańcuchową.
45. Sposób według zastrz. 44, znamienny tym, że jednołańcuchowy ewentualnie wyodrębniony analog czynnika X kontaktuje się z proteazą wybraną z grupy endoproteaz, takich jak keksyna/Kex2, furyna/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPC/PC7, lub pochodną tych proteaz, w warunkach w jakich rozszczepia się jednołańcuchowy analog czynnika X do dwułańcuchowej postaci czynnika X.
46. Sposób według zastrz. 45, znamienny tym, że jednołańcuchowy analog czynnika X ewentualnie przez kontaktowanie z proteazą aktywuje się bezpośrednio do czynnika Xa lub analogu czynnika Xa.
47. Sposób według zastrz. 45, znamienny tym, że dwułańcuchowy analog czynnika X kontaktuje się z dalszą inną niż poprzednia proteazą i aktywuje do analogu czynnika Xa lub natywnego czynnika Xa.
48. Sposób według zastrz. 38, znamienny tym, że stosuje się proteazę unieruchomioną
49. Sposób wytwarzania kompozycji zawierającej aktywny czynnik Xa lub analog czynnika Xa, znamienny tym, że analog czynnika X otrzymany sposobem określonym w zastrz. 38 poddaje się operacji aktywowania.

190 734