NO327878B1 - Faktor X-analoger med modifiserte spaltningsseter for proteaser - Google Patents
Faktor X-analoger med modifiserte spaltningsseter for proteaser Download PDFInfo
- Publication number
- NO327878B1 NO327878B1 NO19994139A NO994139A NO327878B1 NO 327878 B1 NO327878 B1 NO 327878B1 NO 19994139 A NO19994139 A NO 19994139A NO 994139 A NO994139 A NO 994139A NO 327878 B1 NO327878 B1 NO 327878B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- factor
- analogue
- protease
- amino acid
- chain
- Prior art date
Links
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 title claims description 321
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 title claims description 126
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 title claims description 126
- 239000004365 Protease Substances 0.000 title claims description 125
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 title claims description 91
- 230000007017 scission Effects 0.000 title claims description 90
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 claims description 161
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 claims description 111
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 claims description 96
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 91
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 claims description 74
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 72
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 69
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 58
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 58
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 54
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 46
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 46
- 102100035233 Furin Human genes 0.000 claims description 37
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 34
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 31
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 31
- 101710118538 Protease Proteins 0.000 claims description 26
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 claims description 26
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 claims description 26
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 22
- 101800001401 Activation peptide Proteins 0.000 claims description 21
- 102400000069 Activation peptide Human genes 0.000 claims description 21
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 21
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 20
- 108060005987 Kallikrein Proteins 0.000 claims description 19
- 102000001399 Kallikrein Human genes 0.000 claims description 19
- 101710172072 Kexin Proteins 0.000 claims description 17
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 15
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 13
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 claims description 13
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 claims description 12
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 claims description 12
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 claims description 12
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 11
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 9
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 9
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 claims description 9
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 8
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 6
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 claims description 6
- 230000000468 autoproteolytic effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 6
- 108010029144 Factor IIa Proteins 0.000 claims description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 5
- 229960000182 blood factors Drugs 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 2
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 claims description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims 1
- 229940012426 factor x Drugs 0.000 description 251
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 44
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 41
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 37
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 30
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 25
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Chemical group NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 24
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 21
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 19
- 125000002059 L-arginyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])C(=N[H])N([H])[H] 0.000 description 17
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 17
- 101100275473 Caenorhabditis elegans ctc-3 gene Proteins 0.000 description 16
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 16
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 16
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 16
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 15
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 9
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 8
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 7
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 108010048049 Factor IXa Proteins 0.000 description 6
- 108010018823 anti-inhibitor coagulant complex Proteins 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 229940105776 factor viii inhibitor bypassing activity Drugs 0.000 description 6
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 6
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 101001030665 Dictyostelium discoideum GDP-L-fucose synthase Proteins 0.000 description 5
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 5
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 5
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical group NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 5
- 108010014806 prothrombinase complex Proteins 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 5
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 description 4
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 4
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 4
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 4
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 4
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100456896 Drosophila melanogaster metl gene Proteins 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 101100383370 Squalus acanthias CFTR gene Proteins 0.000 description 3
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108090001015 cancer procoagulant Proteins 0.000 description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 3
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 3
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 101800005309 Carboxy-terminal peptide Proteins 0.000 description 2
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108010014172 Factor V Proteins 0.000 description 2
- 108010061932 Factor VIIIa Proteins 0.000 description 2
- 108010074864 Factor XI Proteins 0.000 description 2
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 2
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 2
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 2
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000005844 autocatalytic reaction Methods 0.000 description 2
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 2
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 2
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 2
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 2
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- -1 except RW Proteins 0.000 description 2
- 230000006624 extrinsic pathway Effects 0.000 description 2
- 229940012414 factor viia Drugs 0.000 description 2
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000006623 intrinsic pathway Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 description 2
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 description 2
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- 101710112984 20 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101710091601 21 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 4-nitroaniline Chemical compound NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800003158 5 kDa peptide Proteins 0.000 description 1
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 241000024188 Andala Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 101800001415 Bri23 peptide Proteins 0.000 description 1
- 101800000655 C-terminal peptide Proteins 0.000 description 1
- 102400000107 C-terminal peptide Human genes 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 241000271032 Daboia russelii Species 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 206010016077 Factor IX deficiency Diseases 0.000 description 1
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 description 1
- 108010054265 Factor VIIa Proteins 0.000 description 1
- 108010074105 Factor Va Proteins 0.000 description 1
- 108010080865 Factor XII Proteins 0.000 description 1
- 102000000429 Factor XII Human genes 0.000 description 1
- 201000007176 Factor XII Deficiency Diseases 0.000 description 1
- 201000007371 Factor XIII Deficiency Diseases 0.000 description 1
- 108010071241 Factor XIIa Proteins 0.000 description 1
- 108010080805 Factor XIa Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241001123589 Gorilla papillomavirus Species 0.000 description 1
- 101000756632 Homo sapiens Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 101710159910 Movement protein Proteins 0.000 description 1
- 101100194604 Mus musculus Rfxap gene Proteins 0.000 description 1
- 101100537555 Mus musculus Tnfrsf9 gene Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 1
- 102100038124 Plasminogen Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 102000002085 Prothrombin/thrombin Human genes 0.000 description 1
- 108050009405 Prothrombin/thrombin Proteins 0.000 description 1
- 101710130181 Protochlorophyllide reductase A, chloroplastic Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 101710090398 Viral interleukin-10 homolog Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 108091005605 Vitamin K-dependent proteins Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- OJYGBLRPYBAHRT-UHFFFAOYSA-N alphachloralose Chemical class O1C(C(Cl)(Cl)Cl)OC2C(O)C(C(O)CO)OC21 OJYGBLRPYBAHRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- INJRKJPEYSAMPD-UHFFFAOYSA-N aluminum;silicic acid;hydrate Chemical compound O.[Al].[Al].O[Si](O)(O)O INJRKJPEYSAMPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003024 amidolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 208000015294 blood coagulation disease Diseases 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 1
- 230000009852 coagulant defect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 201000007219 factor XI deficiency Diseases 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 230000006251 gamma-carboxylation Effects 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 208000009429 hemophilia B Diseases 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 229940029329 intrinsic factor Drugs 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- SBUYBNIDQXQZSZ-UHFFFAOYSA-N p-aminophenylphosphocholine Chemical compound C[N+](C)(C)CCOP([O-])(=O)OC1=CC=C(N)C=C1 SBUYBNIDQXQZSZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000003805 procoagulant Substances 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 229940024790 prothrombin complex concentrate Drugs 0.000 description 1
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000003998 snake venom Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 239000002821 viper venom Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6432—Coagulation factor Xa (3.4.21.6)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21006—Coagulation factor Xa (3.4.21.6)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Oppfinnelsen vedrører faktor X-analoger med en modifikasjon i området av aktiveringspeptidet idet X-analogene ifølge oppfinnelsen har en sammensetning som angitt i krav 1, et preparat som inneholder faktor X-analogene ifølge oppfinnelsen som angitt i krav 19, samt en fremgangsmåte ved fremstilling av rensede rekombinante faktor X-analoger som angitt i krav 38.
Etter initiering av blodlevringsprosessen forløper levringskaskaden ved en sekvensiell aktivering av forskjellige proenzymer (zymogener) i blodet til sine aktive former, nemlig serinproteasene. Til disse hører bl.a. faktor XII/XIIa, faktor XI/XIa, faktor IX/IXa, faktor X/Xa, faktor VII/Vila og protrombin/trombin. De fleste av disse enzymer er i fysiologiske tilstander kun aktive hvis de er forbundet i et kompleks på en membranoverflate. Ca-ioner er omfattet i mange av disse prosesser. Blodlevringen følger enten den intrinsiske vei, hvor alle proteinkomponenter foreligger i blodet, eller den ekstrinsiske vei, hvor cel-lemembran-vevfaktor spiller en kritisk rolle. En sårleging finner til slutt sted ved spaltning av fibrinogen til fibrin ved hjelp av trombin.
Protrombinasekompleks er ansvarlig for aktiveringen av pro-trombin til trombin. Trombin er et viktig enzym, som kan virke både som prokoagulasjonsmiddel og som antikoagula-sjonsmiddel. Protrombinasekompleks, i hvilket bl.a. faktor Va (som kofaktor) og faktor Xa (som serinprotease) er omfattet, samles i en Ca-avhengig assosiasjon på overflaten av fosfolipider. Det diskuteres at faktor Xa kan være den katalytiske komponent av protrombinasekomplekset i denne sammenheng.
Faktor X (Stuart/Prower-faktor) er et vitamin K-avhengig koagulasjonsglykoprotein, som kan aktiveres ved den intrinsiske og den ekstrinsiske blodlevringskaskade. Det primære translasjonsprodukt av faktor X (pre-pro-FX) har 488 aminosyrer og syntetiseres av leveren eller humane hepatoma-celler til å begynne med som enkeltkjedet 75 kDa stort forlø-perprotein. I plasma foreligger faktor X til stor del som tokjedet molekyl (Fair et al., 1984, Blood 64: 194-204).
Under biosyntesen spaltes etter avspaltning av pre-sekvensen ved hjelp av et signalpeptidase (mellom Ser23/Leu24) og av propeptidet (mellom Arg40/Ala41), det enkeltkjedede faktor X-molekyl til den tokjedede form, som består av den ca.
22 kDa store lette kjede og den ca. 50 kDa store tunge
kjede som er forbundet med hverandre via en disulfid-bro, ved prosessering og fjerning av tripeptidet Argl80-Lysl81-Argl82 (figur 1). Faktor X sirkulerer dermed i plasma i form av et tokjedet molekyl.
Under blodlevringsprosessen konverteres faktor X fra et inaktivt zymogen til det aktive protease faktor Xa ved en begrenset proteolyse, hvorved aktiveringen av faktor X til faktor Xa kan finne sted i ett av to membranbundne komplek-ser: den ekstrinsiske faktor Vlla/vevfaktor-kompleks, eller det intrinsiske faktor Villa/faktor IXa/fosfolipid-Ca-kompleks, eller "tenase-kompleks" (Mertens et al., 1980, Biochem. J. 185: 647-658). En proteolytisk spaltning mellom aminosyrene Arg234/Ile235 fører til en frigivning av et 52 aminosyrer langt aktiveringspeptid fra N-terminus av den tunge kjede, og dermed til dannelsen av det aktive enzym, nemlig faktor Xa. Det katalytiske sentrum av faktor Xa befinner seg på den tunge kjede.
Aktiveringen via faktor VIIa/Tf(ekstrinsisk)-kompleks fører til dannelse av faktor Xaa (35 kDa) og faktor Xa|3 (31 kDa), hvorved det ved lave konsentrasjoner av faktor Vila i kom-plekset også opptrer et polypeptid med 42 kDa lengde. Dannelsen av faktor Xaa finner sted ved spaltning ved Arg234/Ile235 av den tunge kjede, og representerer aktiveringen av faktor X til faktor Xa. Opptreden av faktor XaP stammer antakelig fra en autokatalytisk spaltning ved Arg469/Gly470 i C-terminus av den tunge kjede av faktor Xaa og en avspaltning av et 4,5 kDa langt peptid. Faktor XaP har, liksom også faktor Xaa, katalytisk aktivitet. Det er imidlertid blitt vist at det ved spaltning av faktor Xaa til faktor XaP opptrer en plasminogen-bindingsposisjon, og at faktor XaP eventuelt har fibrinolytisk aktivitet eller omfattes i fibrinolysen i form av en kofaktor. Omdannelsen av faktor Xaa til faktor XaP er imidlertid langsommere enn dannelsen av trombin, hvorved en initiering av fibrinolysen før dannelsen av et blodaggregat, forhindres (Pryzdial et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 16614-16620; Pryzdial et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 16621-16626).
Det 42 kDa store polypeptid dannes ved en prosessering i C-terminus av den tunge kjede mellom Arg469/Gly470 uten en tidligere prosessering mellom Arg234/Ile235. Dette mellom-produkt har, slik som også et faktor Xay-fragment som dannes ved proteolyse ved Lys370, ingen katalytisk aktivitet (Mertens et al., 1980, Biochem. J. 185: 647-658; Pryzdial et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 16614-16620).
En aktivering av faktor X i den intrinsiske bane katalyse-res av faktor IXa/faktor VIIIa-kompleks. Under aktiveringen erholdes de samme prosesseringsprodukter, men faktor XaP~ produktet erholdes imidlertid i et høyere utbytte enn andre faktor X-prosesseringsprodukter (Jesty et al., 1974, J. Biol. Chem. 249: 5614).
In vitro kan faktor X aktiveres f.eks. med "Russell's Viper Venom" (RVV) eller trypsin (Bajaj et al., 1973, J. Biol. Chem. 248: 7729-7741) eller rensede fysiologiske aktivatorer såsom FVIIa/TF-kompleks eller faktor IXa/faktor Vllla-kompleks (Mertens et al., 1980, Biochem. J. 185: 647-658).
Handelstilgjengelige faktor X-produkter fra plasma inneholder som regel en blanding av faktor Xaa og faktor XaP, fordi det etter aktivering av faktor X til faktor Xa i før-ste rekke dannes faktor Xaa, som i sin tur spaltes til faktor XaP i en autokatalytisk prosess. For å fremstille et enhetlig faktor Xa-produkt med høy molekylær integritet ble det i EP 0.651.054 foreslått å aktivere faktor X med RW over et lengre tidsrom, slik at det dannede sluttprodukt hovedsaklig inneholdt faktor Xap. Både biproduktene, f.eks. faktor Xaa, og proteaset ble deretter fjernet ved flere kromatografiske trinn.
cDNA for faktor X er blitt isolert og kjennetegnet (Leytus et al., 1984, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82: 3699-3702; Fung et al., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 82: 3591-3595). Human faktor X ble uttrykt in vitro i forskjellige celletyper, såsom humane embryonale nyreceller eller CHO-celler (Rudolph et al., 1997, Prot. Expr. Purif. 10: 373-378, Wolf et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 13726-13730). Man har imidlertid slått fast at prosesseringen i posisjon Arg40/Ala41 under en rekombinant ekspresjon av human faktor X er ueffisient i motsetning til in vivo-situasjonen, og at det dannes forskjellige N-termini i den lette kjede av faktor X (Wolf et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 13726-13730). Rekombinant faktor X (rFX) ble ved hjelp av RVV aktivert in vitro til rFaktor Xa (rFXa), eller rFXa ble direkte uttrykt, hvorved aktiveringspeptidet fra aminosyre 183 til aminosyre 234 ble deletert og erstattet med et tripeptid for å muliggjøre en umiddelbar prosessering til en tokjedet rFXa-form. Renset rFX ble til ca. 70% prosessert til den lette og den tunge kjede, mens de øvrige 30% var enkeltkjedet rFX med 75 kDa. En direkte ekspresjon av rFXa førte riktignok til dannelsen av aktiv faktor Xa, men imidlertid også til inaktive mellomprodukter. Wolf et al.
(1991, J. Biol. Chem. 266: 13726-13730) fant også at rekombinant faktor X hadde en nedsatt aktivitet, som de mente skyldtes en dårlig aktiverbarhet av rFX ved hjelp av RW, samt den inaktive populasjon av proteiner og polypeptider i det enkeltkjedede forløpermolekyl. Spesielt fant de en høy
instabilitet av rFXa ved ekspresjon ved hjelp av rekombinante celler, som de mente skyldtes en høy autoproteolyse-rate.
For å undersøke funksjonen av det C-terminale peptid av faktor Xaa, innførte Eby et al. (1992, Blood 80 (suppl. 1): 1214 A) et stopkodon i posisjon Gly430 av faktor X-sekvensen. De fant imidlertid ingen forskjell mellom akti-veringsraten av faktor Xa (FXaa) med p-peptid og en dele-sjonsmutant uten p-peptid (FXaP).
Faktor Xa er en viktig bestanddel av protrombinasekompleks, og kan derfor eventuelt brukes for behandling av pasienter med forstyrret blodlevring, f.eks. hemofili.
Spesielt behandlingen av hemofilipasienter med faktor VIII-eller faktor IX-mangel med faktorkonsentrater fremstilt av plasma, blir ved lengre terapivarighet ofte komplisert ved at det dannes inhibitoriske antistoffer mot disse faktorer. Det er derfor blitt utviklet en rekke alternativer for å behandle hemofilipasienter med faktorer med en bypass-aktivitet. Således er en anvendelse av protrombinkomplekskon-sentrat, partsielt aktivert protrombinasekompleks (APPC), faktor Vila eller FEIBA blitt foreslått. Handelstilgjengelige preparater med faktor Vlll-bypassaktivitet (FEIBA) er f.eks. "FEIBA" eller "Autoplex". "FEIBA" inneholder f.eks. omtrent like mengder av faktor II, faktor VII, faktor IX, faktor X og FEIBA, mindre mengder av faktor VIII og faktor V, samt spor av aktiverte koagulasonsfaktorer såsom trombin og faktor Xa eller en faktor med faktor X-lignende aktivitet (Elsinger, 1982, Activated Prothrombin Complex Concen-trates, utg. Mariani, Russo, Mandelli, s. 77-87). Elsinger viser spesielt til betydningen av en "faktor Xa-lignende" aktivitet i FEIBA. Faktor Vlll-bypass-aktiviteten ble demonstrert av Giles et al. (1988, British J. Haematology 9: 491-497) for en kombinasjon av renset faktor Xa og fosfolipider i en dyremodell.
Det finnes derfor et stort behov og en rekke forskjellige anvendelsesområder for faktor X/Xa eller faktor X/Xa-lignende proteiner, enten for seg selv eller som bestanddel av et koagulasjonskompleks i blodlevringsterapien.
Halveringstiden av faktor Xa er, sammenlignet med zymoge-net, sterkt nedsatt både in vivo og in vitro. Slik kan f.eks. faktor X oppbevares stabilt i glycerin i 18 måneder, mens faktor Xa under like betingelser kun er stabil i 5 måneder (Bajaj et al., 1973, J. Biol. Chem. 248: 7729-2241), hhv. i glycerin ved 4°C etter 8 måneder oppviser en med over 60% nedsatt aktivitet (Teng et al., 1981, Thrombosis Res. 22: 213-220). Halveringstiden av faktor Xa er kun 30 sekunder i serum.
På grunn av instabiliteten av faktor Xa er det blitt foreslått å administrere faktor X-preparater (US 4.501.731). Ved livstruende blødninger, spesielt hos hemofili-pasienter, er imidlertid en administrasjon av faktor X virknings-løs, fordi mangelen på funksjonelt "tenasekompleks" i den intrinsiske blodlevringsbane gjør at det ikke kan finne sted noen tilstrekkelig aktivering av faktor X til faktor Xa, og aktiveringen via den ekstrinsiske bane finner ofte sted for langsomt for å oppnå en rask virkning. I tillegg har hemofili-pasienter tilstrekkelig faktor X, som imidlertid har en 1000 ganger svakere protrombinase-aktivitet enn faktor Xa. I slike tilfeller er det nødvendig å administrere aktivert faktor Xa direkte, eventuelt sammen med fosfolipider slik det beskrives av Giles et al. (1988, British J. Haematology 9: 491-497), eller med andre koagulasjons-faktorer, f.eks. med faktor Vlll-bypass-aktivitet.
Ved fremstilling av faktor Xa fra faktor X har aktiveringen hittil funnet sted via ikke-fysiologiske aktivatorer av animalsk opphav, såsom RW eller trypsin, hvorved det imidlertid måtte sikres absolutt at sluttproduktet var fullstendig fritt for disse proteaser. Slik det allerede ble nevnt ovenfor, dannes ved aktivering av faktor X til faktor Xa et flertall delvis også inaktive mellomprodukter (Bajaj et al., 1973, J. Bio. Chem. 248: 7729-7741, Mertens et al., 1980, Biochem. J. 185: 647-658). Nærværet av slike mellomprodukter fører til en nedsettelse av den spesifikke aktivitet av produktet, og eventuelt også til mellomprodukter som kan virke som antagonister av det aktive serinprotease. For fremstilling av et enhetlig, rent produkt med en høy spesifikk aktivitet er det ved konvensjonelle metoder derfor nødvendig med kompliserte fremgangsmåter for aktivering og for kromatografisk rensing.
Oppgaven for foreliggende oppfinnelse er derfor å tilveiebringe et preparat som inneholder et polypeptid med faktor X/Xa-aktivitet, som har høy stabilitet og som kan aktiveres til faktor Xa uten bruk av et av de vanlige proteaser, spesielt av animalsk opphav, såsom f.eks. RW eller trypsin. Et ytterligere formål er å tilveiebringe et farmasøytisk preparat med faktor Vlll-bypass-aktivitet.
Oppgaven løses ifølge oppfinnelse ved at det tilveiebringes en faktor X-analog som oppviser en modifikasjon i området av den naturlig foreliggende faktor Xa-aktiveringsspalt-ningsstilling og som har en sammensetning som angitt i krav 1. Modifikasjonen i området av aktiveringsspaltningsstillingen er en ny gjenkjennings- hhv. prosesseringsstilling som ikke foreligger naturlig i denne posisjon av polypeptidet, for et protease som ikke normalt spalter polypeptidet på dette sted.
Faktor X-analogen ifølge oppfinnelsen oppviser her spesielt i aktiveringspeptidet, som avspaltes ved aktivering av faktor X til faktor Xa, en modifikasjon. Modifikasjonen vedrø-rer her minst én aminosyre i aminosyresekvensen av aktiveringspeptidet av faktor X. Modifikasjonen foreligger her spesielt i C-terminalt område av aktiveringspeptidet, og utgjør minst én erstatning av en aminosyre mellom posisjon Gly228 og Arg234 av faktor X-aminosyresekvensen. Posisjonen av aminosyrene angis i henhold til nummereringen ifølge sekvensen som vises på fig. 1, begynnende med Metl og slut-tende med Lys488.
Modifikasjonen i faktor X-analogene ifølge oppfinnelsen er fortrinnsvis en erstatning av en faktor VIIA- hhv. Faktor IXa-prosesseringsstilling som forekommer på dette sted, med en alternativ spaltningsstilling for et annet protease. Modifikasjonen kan her være en substitusjon av minst én aminosyre eller en innføyelse av en peptidsekvens som utgjør en proteasegjenkjennings- hhv. spaltningsposisjon. Modifikasjonen i faktor X-analogen ifølge oppfinnelsen er fortrinnsvis slik at den for et protease fra gruppen endoproteaser, såsom f.eks. kexin/Kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7 (slik som beskrevet i Barr et al., 1991, Cell, 66: 1-3 eller i US 5.460.950), serinproteaser, så som f.eks. faktor Xlla, faktor Xla, faktor Ila, faktor Xa, eller kallikrein, eller et derivat av disse proteaser, utgjør en gjenkjennings- hhv. spaltningssekvens.
Modifikasjonen velges fortrinnsvis slik at prosesseringen ved hjelp av et av disse proteaser fører til et polypeptid som tilsvarer nativ faktor Xa, som i det vesentlige er lik naturlig forekommende faktor Xa-sekvens og som likeledes har faktor Xa-aktivitet.
For å oppnå en optimal prosessering kan det i enkelte tilfeller være nødvendig å i tillegg skifte ut aminosyren Ile235. Fortrinnsvis bør imidlertid den NH2-terminale aminosyre isoleucin av den tunge kjede bevares etter aktiveringen, fordi denne aminosyre har en vesentlig funksjon ved dannelse av substratbindingslommen (Watzke et al., 1995, Molecular Basis of Thrombosis and Hemostasis, utg. Kathe-rine High & Harold Roberts). Faktor X-analogene ifølge oppfinnelsen har en strukturell forskjell, spesielt på amino-syrenivå sammenlignet med den native faktor X-sekvens, men har imidlertid en lignende aktiverbarhet som naturlig forekommende faktor X, hhv. faktor Xa-aktivitet etter aktiveringen .
Oppfinnelsen tilveiebringer et antall faktor X-analoger i form av eksempler, som har en modifikasjon i aktiveringspeptidet sammenlignet med den naturlig forekommende faktor X-sekvens, og oppviser en forandret proteasespesifisitet.
Modifikasjoner kan foreligge i én eller flere posisjoner i området mellom aminosyre Gly228 og Arg234, og eventuelt Ile235, i henhold til faktor X-sekvensen med nummereringen fra Metl til Lys488 ifølge figur 1. Aminosyresubstitusjoner kan være i posisjon Ile235 (RI), Arg234, Thr233 (R2), Leu232 (R3), Asn231 (R4), Asn230 (R5) og Asp229 (R6), hvor Arg234 imidlertid fortrinnsvis holdes uforandret.
Faktor X-analogene ifølge oppfinnelsen inneholder fortrinnsvis en faktor X-sekvens med Gly228-R6-R5-R4-R3-R2-Arg234 med RI = Ile, Val, Ala, Ser eller Thr, R2 = Thr, Pro, Gly, Lys eller Arg; R3 = Leu, Phe, Lys, Glu, Met, Gin, Ser, Val, Arg eller Pro; R4 = Asn, Asp, Ile, Ser, Met, Pro, Thr, Lys eller Arg; R5 = Asn, Lys, Ser, Glu, Ala, Gin, His eller Arg, og R6 = Asp, Phe, Thr, Arg, Leu eller Ser.
Foretrukne utførelser av faktor X-analogene ifølge oppfinnelsen er faktor X-analoger som oppviser en modifikasjon med
a) RI = Val, R2 = Thr, R3 = Phe, R4 = Asp, R5 = Asn og eventuelt R6 = Phe (figur 2A) og som prosesseres av
faktor Xla; b) RI = Ser, R2 = Arg, R3 = Thr, R4 = Leu (fig. 2 B) og som prosesseres av Fila;
c) RI = Ile, R2 = Pro, R3 = Lys, R4 = Ile og eventuelt
R5 = Lys og/eller R6 = Thr (fig. 2C) eller
RI = Ile, R2 = Thr, R3 = Ser, R4 = Thr og eventuelt
R5 = Lys og/eller R6 = Thr (fig. 2 I) og som prosesseres av faktor Xlla;
d) RI = Ile, R2 = Thr, R3 = Met, R4 = Ser og eventuelt
R5 = Ser og/eller R6 = Leu (fig. 2 D) og som prosesseres av kallikrein;
e) RI = Ile, R2 = Gly, R3 = Gin, R4 = Pro og eventuelt
R5 = Lys og/eller R6 = Ser (fig. 2H) eller
RI = Ile, R2 = Thr, R3 = Lys, R4 = Met (fig. 2E) eller RI = Ile, R2 = Gly, R3 = Glu, R4 = Ile (fig. 2F) og
som prosesseres av faktor Xa;
f) RI = Ile, R2 = Lys, R3 = Arg, R4 = Arg og eventuelt
R5 = Glu og/eller R6 = Leu eller
RI = Ile, R2 = Thr, R3 = Val, R4 = Arg og eventuelt
R5 = Ala og/eller R6 = Leu eller
RI = Ile, R2 = Arg, R3 = Val, R4 = Arg og eventuelt
R5 = Gin og/eller R6 = Leu eller
RI = Ile, R2 = Arg, R3 = Arg, R4 = Arg og eventuelt
R5 = His og/eller R6 = Leu eller
RI = Ile, R2 = Lys, R3 = Pro, R4 = Arg og eventuelt
R5 = Asn og/eller R6 = Leu eller
RI = Ile, R2 = Lys, R3 = Arg, R4 = Ile og eventuelt
R5 = Arg og/eller R6 = Leu eller
RI = Ile, R2 = Lys, R3 = Ser og R4 = Arg eller
RI = Ile, R2 = Thr, R3 = Val og R4 = Arg eller
RI = Ile, R2 = Lys, R3 = Leu og R4 = Arg (jfr. for alle fig. 2G),
hvor de som er nevnt i punkt f), prosesseres av et bibasisk endoprotease, så som furin, PACE, kexin/Kex2, furin/PACE, PCI/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7 eller et derivat av disse proteaser.
Et mulig utvalg av modifikasjoner og aminosyreerstatninger som fører til en endret proteasespesifisitet, vises på fig.
2 A-I.
Modifikasjonene kan utføres f.eks. ved målrettet in vitro-mutagenese eller PCR eller ved andre gentekniske metoder som er kjent innen faget og som er egnet for å spesifikt endre en DNA-sekvens, for en målrettet utførelse av aminosyreerstatninger .
Aktiveringen av faktor X-analogene ifølge oppfinnelsen til nativ faktor Xa hhv. en faktor Xa-analog utføres ifølge oppfinnelsen derfor fortrinnsvis ved hjelp av en protease utvalgt fra gruppen av endoproteaser, så som f.eks. kexin/- Kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, gruppen serinproteaser, så som f.eks. faktor Xlla, faktor Xla, faktor Xa, faktor Ila, eller kallikrein, eller et derivat av disse proteaser.
En av vanskelighetene ved fremstilling av aktiv faktor Xa er dens instabilitet, fordi det, foruten faktor Xaa og faktor XaP, ved autokatalyse dessuten dannes andre, inaktive mellomprodukter. For fremstilling av hovedsaklig intakte, aktive faktor X/Xa- hhv. Faktor X/Xa-lignende molekyler ville det derfor være ønskelig å kun erholde proteiner som fører til stabile sluttprodukter.
Det er kjent at en foretrukken spaltningsposisjon for prosesseringen av faktor Xaa (FXaa) til faktor XaP (FXaP) ligger mellom Arg469/Gly470. På grunnlag av undersøkelser som er blitt foretatt av Eby et al. (1992, Blood. Vol. 80, suppl. 1, 1214), finnes i tillegg til et prominent karboksyterminalt peptid (aminosyrerester 476-487) av faktor X, også et ytterligere, kortere peptid (aminosyrerester 474-477), som dannes ved autokatalyse av faktor Xaa. For å fokusere en målrettet prosessering av intakt faktor X til hovedsaklig aktiv faktor Xa, uten å erholde inaktive pro-sesseringsmellomprodukter, oppviser faktor X-analogene ifølge oppfinnelsen eventuelt ytterligere modifikasjoner.
Faktor X-analogene ifølge oppfinnelsen oppviser dermed i henhold til en spesiell utførelse en ytterligere modifikasjon i C-terminalt område av faktor X-aminosyresekvensen.
I henhold til en utførelsesform oppviser en faktor X-analog av den ovenfor beskrevne type et intakt p-peptid (FXa). Faktor X-analogene ifølge oppfinnelsen har spesielt en modifikasjon i området av den C-terminale p-peptidspalt-ningsposisjon, som forhindrer at det etter aktivering av faktor X til faktor Xa finner sted en avspaltning av P~ peptidet av faktor X. På denne måte erholdes et faktor Xa-molekyl som til 100% kan isoleres som intakt faktor Xaa-molekyl.
Modifikasjonen kan være en mutasjon, delesjon eller innføy-else i området av faktor X-aminosyresekvensen mellom aminosyreposisjon Arg469 og Ser476 og eventuelt av Lys370. Imidlertid foretrekkes en aminosyresubstitusjon, hvor det på grunn av aminosyreerstatningen ikke kan finne sted noen folding av polypeptidet som kunne påvirke strukturen og dermed eventuelt funksjonen og aktiviteten av proteinet.
Ifølge én utførelse oppviser faktor X-analogene ifølge oppfinnelsen en erstatning av aminosyrene i posisjon Arg469 og/eller Gly470, hvor Arg469 fortrinnsvis er erstattet med Lys, His eller Ile, og Gly470 fortrinnsvis er erstattet med Ser, Ala, Val eller Thr.
Faktor X-analogene ifølge oppfinnelsen kan foruten en mutasjon i posisjon Arg469 og/eller Gly470, oppvise en ytterligere mutasjon i posisjon Lys370 og/eller Lys475 og/eller Ser476.
Ved en aminosyresubstitusjon i en av disse posisjoner, unngås en prosessering av faktor Xaa til faktor XaP hhv. faktor Xay, fordi den eller de naturlig forekommende prosesse-ringssekvenser er modifisert således at det ikke lenger kan finne sted noen eventuelt autokatalytisk avspaltning av et karboksyterminalt peptid.
Ifølge en annen utførelse oppviser faktor X-analogen ifølge oppfinnelsen en delesjon av det karboksyterminale p-peptid (FXP). En slik faktor X-analog kan fremstilles ved at et cDNA som koder for faktor X-analog, uttrykkes i et rekombinant ekspresjonssystem, hvor kun sekvensene som koder for aminosyrene Metl til Arg469, klones.
Ifølge en ytterligere utførelse oppviser faktor X-analogene ifølge oppfinnelsen et translasjonsstopsignal i C-terminalt område av faktor X-sekvensen. Translasjonsstopsignalet foreligger fortrinnsvis i en posisjon som følger en C-terminal aminosyre som oppstår ved naturlig prosessering. Translasjonsstopsignalet foreligger dermed fortrinnsvis i posisjonen av aminosyre 470 av faktor X-sekvensen, slik at det endestående Arg469 av faktor XaP bevares. Med denne hensikt erstattes kodonet GGC som koder for aminosyren Gly470, med TAA, TAG eller TGA.
Et ytterligere trekk av foreliggende oppfinnelse vedrører faktor X-analoger som aktiveres in vitro til faktor Xa hhv. en faktor Xa-analog. Avhengig av faktor X-analogen som brukes og aktiveres, erholdes et polypeptid som tilsvarer, og i det vesentlige er identisk med, nativ faktor Xa, hhv. et polypeptid som riktignok oppviser faktor Xa-aktivitet, men sammenlignet med nativ faktor Xa-sekvens oppviser modifikasjoner som imidlertid ikke forstyrrer den biologiske aktivitet. Ved aktivering av faktor X-analoger som oppviser modifikasjonen i området av aktiveringspeptidet i sekvensen av aktiveringspeptidet, erholdes utelukkende polypeptider som tilsvarer nativ faktor Xa-molekyl. Hvis en slik faktor X-analog eventuelt i tillegg oppviser et translasjonsstopsignal i C-terminalt område av p-peptidet, erholdes faktor XaP-homologe molekyler. Ved bruk av en faktor X-analog som oppviser én eller flere modifikasjoner i p-peptidsekvensen som fører til at p-peptidet ikke avspaltes, erholdes imidlertid en faktor Xaa-analog med en aminosyreerstatning i C-terminus av molekylet.
Faktor X-analogene ifølge oppfinnelsen oppviser utelukkende modifikasjoner som endrer spesifisiteten for aktiverbarheten og som ikke påvirker aktiviteten. Det erholdes dermed i hvert fall biologisk og funksjonelt aktive faktor Xa-molekyler hhv. faktor Xa-analoger.
Aktiveringen in vitro kan utføres ved hjelp av en protease valgt fra gruppen endoproteaser, så som f.eks. kexin/Kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, serinproteaser, såsom f.eks. faktor Xlla, faktor Xla, faktor Xa, eller kallikrein, eller et derivat av disse proteaser. Det ligger imidlertid innen rammen for foreliggende oppfinnelse å bruke hvilket som helst vilkårlige protease, unntatt RW, trypsin, faktor IXa eller faktor Vila, så sant det er egnet for prosessering av faktor X-analogen ifølge oppfinnelsen til en faktor Xa.
Ifølge en ytterligere utførelsesform av oppfinnelsen inneholder faktor X-analogen en modifikasjon som tillater en aktivering av faktor X-analogen til faktor Xa, fortrinnsvis nativ faktor Xa, in vivo. "Nativ" faktor Xa betyr i denne sammenheng at den aktiverte faktor Xa, avledet fra faktor X-analogen ifølge oppfinnelsen, oppviser en homolog aminosyresekvens som tilsvarer aminosyresekvensen av nativ faktor Xa, og som har faktor Xa-aktivitet. Modifikasjonen velges slik at prosesseringen fra faktor X til faktor Xa utfø-res ved hjelp av et in vivo, dvs. i kroppen forekommende, protease, fortrinnsvis et protease som er innblandet i blodlevringskaskaden. Proteaset kan i denne sammenheng være en protease valgt fra gruppen serinproteaser, såsom f.eks. faktor Ila, faktor Xlla, faktor Xla, faktor Xa eller kallikrein. Faktor X-analoger som i tillegg til modifikasjonen i aktiveringspeptidet, også oppviser en modifikasjon i C-terminalt område av faktor X-molekylet, aktiveres, slik det ble beskrevet ovenfor, også in vivo til de tilsvarende faktor Xa-analoger.
Selv om f.eks. Wolf et al. (1991, J. Biol. Chem. 266: 13726-137309) formodet at et endopeptidase så som Kex2, furin eller PACE er omfattet i prosesseringen av faktor Xa-delesjonsmutantene som beskrives av denne gruppe, gir de ingen informasjon om virkningen av disse proteaser ved prosesseringen av faktor X. Likeledes beskrives i US 5.660.950 en rekombinant fremstilling av PACE og bruk av proteasen for forbedring av prosessering av vitamin K-avhengige proteiner. I en rekke opplistinger med andre blodfaktorer benevnes også faktor X, men imidlertid mangler data som sannsynliggjør denne utsagn.
Innen rammen for foreliggende oppfinnelse er det for første gang entydig blitt vist at et av proteasene som er nødven-dig for modningsprosessen av faktor X, er et bibasisk endoprotease, spesielt endogent forekommende furin. In vivo formidler endoproteaset i første rekke spaltningen av det enkeltkjedede faktor X-molekyl til den modne form bestående av tung og lett kjede. In vitro formidler det dessuten avspaltningen av faktor X pro-peptid-sekvensen (eksempel 2) .
Faktor X-analoger ifølge oppfinnelsen som oppviser en pro-teasespaltningsposisjon for en protease som ikke forekommer naturlig i en celle, spaltes ved selektiv prosesserings-reaksjon kun i de posisjoner som også spaltes i nativ faktor X. På denne måte erholdes rekombinant faktor X-molekyl som kun består av den 22 kDa store lette kjede og den ca. 50 kDa store tunge kjede, og ikke oppviser inaktive faktor X-molekyler som opptrer på grunn av en uspesifikk prosessering. Disse modifiserte faktor X-molekyler aktiveres, slik som heller ikke de native faktor X-molekyler, ikke av den intracellulære protease til faktor Xa. De aktiveres først deretter ved hjelp av de tilsvarende proteaser (fortrinnsvis serinproteaser eller subtilisin-beslektede proteaser) til faktor Xa.
Ifølge én utførelse tilveiebringes derfor en tokjedet faktor X-analog.
Ifølge en spesiell utførelsesform tilveiebringes faktor X-analoger som fortrinnsvis foreligger i renset form som enkeltkjedet molekyl. Ved ekspresjon av faktor X-analogen i en celle som mangler et bibasisk protease, erholdes pro-faktor X som enkeltkjedet molekyl. Det enkeltkjedede faktor X-molekyl utmerker seg ved sin høye stabilitet og molekylære integritet. Hittil kunne man ikke isolere noe enkeltkjedet faktor X-molekyl i renset form, fordi det prosesseres til den tokjedede form meget raskt (Fair et al., 1984, Blood 64: 194-204). De rekombinante enkeltkjedede faktor X-analoger kan ved en spesifikk prosessering prosesseres til den tokjedede faktor X-form og deretter aktiveres til faktor Xa hhv. faktor Xa-analog. Dette kan utføres ved at et enkeltkjedet rekombinant faktor X-molekyl som er isolert fra en protease-manglende celle, bringes i berøring med et bibasisk protease, så som furin/PACE eller Kex2, og prosesseres til tokjedet faktor X-analog.
Tokjedet faktor X-analog kan aktiveres til faktor Xa hhv.
faktor Xa-analog. Dette kan f.eks. utføres ved at en faktor X-analog som på grunn av en modifikasjon i området av aktiveringspeptidet oppviser en furin-spesifikk spaltningsposisjon, isoleres fra en furin-manglende celle i form av et
enkeltkjedet molekyl, og deretter prosesseres til et aktivert faktor Xa-molekyl ved å bringes i berøring med en endoprotease.
Likeledes kan en isolert, enkeltkjedet faktor X-analog som oppviser en modifikasjon i aktiveringspeptidet, hvilken modifikasjon muliggjør en alternativ prosessering ved hjelp av en protease fra gruppen serinproteaser eller kallikrein, først spaltes til et tokjedet faktor X-molekyl ved behandling med en bibasisk endoprotease, så som furin, og dette kan deretter bringes i berøring med en serinprotease slik at det finner sted en aktivering til faktor Xa hhv. faktor Xa-analog.
En faktor X-analog som er blitt isolert som tokjedet molekyl fra en cellekultur, kan behandles direkte med proteasen som er spesifikk for aktiveringen.
En på denne måte fremstilt faktor Xa hhv. faktor Xa-analog har på grunn av den selektive og målrettede prosesserings-reaksjon en høy stabilitet og strukturell integritet, og er spesielt fri for inaktive faktor X/Xa-analog-mellomprodukter og autoproteolytiske spaltningsprodukter.
Et ytterligere trekk av foreliggende oppfinnelse vedrører det rekombinante DNA som koder for faktor X-analogene ifølge oppfinnelsen. Det rekombinante DNA fører etter ekspresjon til en faktor X-analog med en aminosyresekvens som tilsvarer human faktor X, unntatt at den oppviser en modifikasjon som påvirker prosesseringsspesifisiteten og pro-sesseringsproduktene, mens den biologiske koagulans-aktivitet i det vesentlige forblir uforandret.
Ifølge et ytterligere trekk tilveiebringes også transfor-merte celler som inneholder det rekombinante DNA.
Et ytterligere trekk ifølge oppfinnelsen vedrører et preparat som inneholder en renset faktor X-analog eller et for-løperprotein derav, som oppviser en modifikasjon i området av den naturlig forekommende faktor Xa-aktiveringsposisjon. Modifikasjonen i området av aktiveringsspaltningsstillingen er en ny gjenkjennings- hhv. spaltningsstilling som ikke forekommer naturlig i denne posisjon av polypeptidet, for en protease som normalt ikke prosesserer polypeptidet på dette sted. Preparatet kan være et renset preparat som inneholder enkeltkjedet eller tokjedet faktor X-analog, hvor polypeptidene erholdes fra et cellekultursystem enten etter isolering fra cellekultursupernatanten eller fra et ekstrakt av en cellekultur. En rekombinant faktor X-analog som er forhåndsrenset fra et cellekultursystem, kan renses ytterligere ved bruk av fremgangsmåter som er kjent innen teknikkens stand. Til dette egner seg spesielt kromatografiske teknikker, så som gelfiltrasjon, ionebytter- eller affinitetskromatografi.
Ifølge én utførelse inneholder preparatet ifølge oppfinnelsen faktor X-analogen fortrinnsvis som enkeltkjedet molekyl i isolert form. Et slikt preparat fremstilles ved at en faktor X-analog som er blitt erholdt ved rekombinant fremstilling, som enkeltkjedet molekyl fra et cellesystem, fortrinnsvis en cellekultur av celler som mangler endoprotease, som spalter den enkelte kjede til en tung og en lett kjede.
Ifølge et spesielt trekk inneholder preparatet enkeltkjedet X-analog med en modifikasjon som muliggjør en in vitro-aktivering til faktor Xa-analoger ved hjelp av en protease valgt fra gruppen av bibasiske endoproteaser, så som f.eks. kexin/Kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/- PC7,. Aktiveringen skjer ved å bringe faktor X-analogen i berøring med proteasen, hvor det på grunnlag av den naturlig forekommende prosessering, finner sted en spaltning til den modne faktor X-form, og det ved hjelp av modifikasjonen finner sted en avspaltning av aktiveringspeptidet og det oppstår faktor Xa hhv. faktor Xa-analog.
I preparatet ifølge oppfinnelsen kan faktor X-analogen foreligge som enkeltkjedet molekyl, enten som faktor Xa
(FXa) eller med en delesjon av p-peptidet. Preparatet inneholder spesielt faktor X-analog i enzymatisk inaktiv form med en renhet på minst 80%, fortrinnsvis 90%, spesielt foretrukket 95%, og inneholder ingen inaktive, proteolytiske mellomprodukter av faktor X/Xa-analog.
Ifølge en ytterligere utførelse inneholder preparatet ifølge oppfinnelsen faktor X-analogen fortrinnsvis i form av et tokjedet molekyl i isolert form. Med denne hensikt spaltes en faktor X-analog som f.eks. ved rekombinant fremstilling er blitt erholdt som enkeltkjedet molekyl fra et cellesystem, in vitro, dvs. utenfor cellen, ved hjelp av en protease, fortrinnsvis en bibasisk protease, til den tokjedede form. Dette kan utføres ved at proteasen blandes direkte med kultursupernatanten av de faktor X-analog-uttrykkende kloner, enten ved blanding av det rensede protease eller av en cellekultursupernatant av en cellekultur som uttrykker proteasen i rekombinant form, eller ved ko-kultivering av faktor X-analog- og protease-uttrykkende kloner.
Likeledes kan cellekultursupernatanten som inneholder faktor X-analogen eller den rensede faktor X-analog, bringes i berøring med en immobilisert protease, hvorved det finner sted en prosessering til den tokjedede form. Ved denne fremgangsmåte er proteasen fortrinnsvis bundet på en matriks, og cellekultursupernatanten eller et renset preparat som inneholder faktor X-analogen, føres over denne matriks. Imidlertid er også en immobilisering av faktor X-analogen tenkbar, mens proteasen befinner seg i den mobile fase. Likeledes kan reaktantene (faktor X-analog og protease) blandes og inkuberes over et visst tidsrom. Proteasen fjernes deretter fra blandingen, f.eks. ved affinitetskromatografi .
Den tokjedede form av faktor X-analogen kan også erholdes ved ko-ekspresjon av proteasen og faktor X-analogen direkte i en gitt celle, og eventuelt renses.
Ifølge en spesiell utførelse av oppfinnelsen inneholder preparatet en enkeltkjedet eller tokjedet faktor X-analog med en modifikasjon som tillater en aktivering til faktor Xa hhv. faktor Xa-analog in vitro. Aktiveringen av faktor X-analogen til faktor Xa hhv. faktor Xa-analog kan finne sted ved å bringe faktor X-analogen i berøring med en protease valgt fra gruppen bibasiske endoproteaser, så som f.eks. kexin/Kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, gruppen serinproteaser, så som f.eks. faktor Xlla, faktor Xla, faktor Ila, faktor Xa, eller kallikrein, eller et derivat av disse proteaser. Proteasen kan være immobilisert på en bærer.
Preparatet ifølge oppfinnelsen kan tjene som utgangsstoff for fremstilling og utvinning av faktor Xa-analoger. I en storteknisk fremgangsmåte bringes preparatet, som inneholder en enkeltkjedet eller tokjedet faktor X-analog, i berø-ring med f.eks. en eventuelt immobilisert protease, under betingelser som tillater en optimal aktivering av faktor X-analogen til faktor Xa-analogen, og det erholdes en faktor Xa-analog. Den således erholdte faktor Xa/faktor Xa-analog kan deretter renses ved allment kjente fremgangsmåter til en farmasøytisk sammensetning.
Ifølge en spesiell utførelse inneholder preparatet som inneholder den rensede, enkeltkjedede eller tokjedede faktor X-analog, en fysiologisk akseptabel bærer, og er eventuelt formulert som farmasøytisk preparat. Formuleringen kan utføres på i og for seg vanlig måte, og kan være blandet med en buffer som inneholder salter, så som NaCl, CaCl2, og aminosyrer, så som glycin og/eller lysin, i et pH-område fra 6-8, og formulert som farmasøytisk preparat. Det rensede preparat som inneholder faktor X-analog, kan tilveiebringes som ferdig oppløsning, lyofilisat eller dypfrosset inntil sluttbruken som lagerstabilt produkt. Fortrinnsvis utføres lagringen av preparatet i lyofilisert form, og løses med en tilsvarende rekonstitusjonsoppløsning opp til å bli en optisk klar oppløsning.
Preparatet ifølge foreliggende oppfinnelse kan imidlertid også tilveiebringes som flytende preparat hhv. i flytende dypfrossen form. Preparatet ifølge oppfinnelsen er spesielt stabilt, dvs. det kan også i oppløst form få stå over lengre tid før anvendelse. Det har vist seg at preparatet ifølge oppfinnelsen ikke oppviser noe tap av aktivitet i løpet av flere timer til dager.
Preparatet ifølge oppfinnelsen kan foreligge i en egnet anordning, fortrinnsvis en applikasjonsanordning, i kombinasjon med en protease valgt fra gruppen endoproteaser, så som f.eks. kexin/Kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4,
PACE 4, LPC/PC7, gruppen serinproteaser, så som f.eks. faktor Ila, faktor Xlla, faktor Xla, faktor Xa, eller kallikrein, eller et derivat av disse proteaser.
Preparatet ifølge oppfinnelsen som inneholder en faktor X-analog i kombinasjon med en protease som er i stand til å aktivere faktor X-analogen til faktor Xa hhv. faktor Xa-analog, kan tilveiebringes som kombinasjonspreparat bestående av en beholder som inneholder en protease som er immobilisert på en bærer, eventuelt i form av en minisøyle eller en sprøyte som er utstyrt med protease, og en beholder som inneholder det farmasøytiske preparat med faktor X-analog. For aktiering av faktor X-analogen presses den faktor X-analog-holdige oppløsning f.eks. over det immobiliserte protease. Den faktor X-analog-holdige oppløsning holdes i dette tilfelle fortrinnsvis under lagring av preparatet romslig adskilt fra proteasen. Preparatet ifølge oppfinnelsen kan foreligge i samme beholder som proteasen, hvor komponentene imidlertid holdes romslig adskilt fra hverandre ved hjelp av en ugjennomtrengelig skillevegg som er lett å fjerne før bruk. Oppløsningene kan også oppbevares i hver sin beholder og først kort tid før bruk bringes i berøring med hverandre.
I en spesiell utførelse er proteasen som brukes for aktiveringen, en serinprotease som også naturlig er involvert i blodlevring, så som f.eks. faktor Xlla eller faktor Xla, som da ikke trenger å adskilles fra den aktiverte faktor Xa-analogen før bruk, men kan administreres sammen med den.
Aktiveringen av faktor X-analogen til faktor Xa kan finne sted rett før den direkte bruk, dvs. før administrasjonen til pasienten. Aktiveringen kan utføres ved å bringe den i berøring med en immobilisert protease eller ved blanding av oppløsninger hvorav den ene inneholder protease og den andre inneholder faktor X-analogen. Det er dermed mulig å holde de to komponenter i oppløsning adskilt fra hverandre og å blande dem sammen ved hjelp av en egnet infusjons-anordning, hvor komponentene bringes i berøring med hverandre under gjennomstrømningen, og å således aktivere molekylet til faktor Xa hhv. faktor Xa-analog. Til pasienten administreres dermed en blanding av faktor Xa og en ytterligere serinprotease som har bevirket aktiveringen. I denne sammenheng er doseringsmengden spesielt viktig, fordi den ytterligere administrasjon av et serinprotease også bevir-ker en aktivering av endogen faktor X, og levringstiden kan dermed avkortes.
Ifølge en foretrukken utførelsesform tilveiebringes det farmasøytiske preparat i en egnet anordning, fortrinnsvis en applikasjonsanordning, enten i flytende-frossen eller lyofilisert form. En egnet applikasjonsanordning kan være en dobbeltkammersprøyteanordning ifølge AT 366.916 eller AT 382.783.
Ifølge et trekk av oppfinnelsen inneholder preparatet en faktor X-analog med en modifikasjon som tillater en aktivering av faktor X-analogen til en faktor Xa-analog in vivo. Faktor X-analogene i preparatet ifølge oppfinnelsen oppviser spesielt en modifikasjon som utgjør en gjenkjennings-posisjon/spaltningsposisjon for et protease valgt fra gruppen serinproteaser, så som f.eks. faktor Xlla, faktor Xla, faktor Xa, eller kalikrein, og spaltes av et av de nevnte proteaser in vivo til nativ faktor Xa hhv. faktor Xa-analog. Spesielt for den terapeutiske anvendelse er slike faktor X-analoger fordelaktige som oppviser en gjenkjennings/- spaltningsposisjon for en protease som i levringskaskaden er uavhengig av faktor VTIa/vev-kompleks og tenasekomplek-set. På denne måte kan preparatet ifølge oppfinnelsen brukes ved blødningsstansing hos pasienter med mangler av faktor IX, faktor VII og faktor VIII. Hos pasienter hvor en forstyrrelse av blodlevringen opptrer på grunn av en faktor XI- eller faktor XII-mangel, bør ingen farmasøytiske preparater som inneholder faktor X-analoger som aktiveres av faktor Xlla eller faktor Xla, brukes. Ved f.eks. faktor XI-mangel kunne man bruke en faktor X-analog med en faktor Xlla-spaltningsposisjon.
Ifølge et ytterligere trekk av oppfinnelsen inneholder preparatet ifølge oppfinnelsen eventuelt som ytterligere bestanddel en blodfaktor i form av zymogen eller en aktiv serinprotease. Herved foretrekkes som ytterligere bestanddeler komponenter med faktor Vlll-bypass-aktivitet. Til disse hører spesielt faktor II, faktor VII, faktor IX, faktor VIII, faktor V og/eller de aktive serinproteaser derav. Ytterligere bestanddeler kan imidlertid også være fosfolipider, Ca-ioner o.l. Ifølge en spesiell utførelse av oppfinnelsen inneholder preparatet ifølge oppfinnelsen minst én ytterligere komponent med faktor Vlll-bypass-aktivitet.
Preparatet ifølge oppfinnelsen kan tilveiebringes som far-masøytisk preparat med faktor Xa-aktivitet som énkomponent-preparat, eller i kombinasjon med andre faktorer som fler-komponent-preparat.
Før opparbeidelse til et farmasøytisk preparat underkastes det rensede protein de vanlige kvalitetskontroller og bringes i en terapeutisk administrerbar form. Spesielt testes ved den rekombinante fremstilling det rensede preparat for å bekrefte fraværet av cellulære eller fra ekspresjonsvektoren stammende nukleinsyrer, fortrinnsvis ifølge en fremgangsmåte så som den som beskrives i EP 0.714.987.
På grunn av at i prinsippet ethvert biologisk materiale kan være kontaminert med smittekimer, blir preparatet eventuelt behandlet for å inaktivere hhv. utarme viruser, for fremstilling av et sikkert preparat.
Ifølge et ytterligere trekk av foreliggende oppfinnelse tilveiebringes et preparat som inneholder en faktor Xa-analog med høy stabilitet og strukturell integritet, som spesielt er fritt for inaktive faktor X/Xa-analog-mellomprodukter og autoproteolytiske spaltningsprodukter, og som kan erholdes ved at en faktor X-analog av den ovenfor beskrevne type aktiveres og tilberedes i et tilsvarende preparat.
Et ytterligere trekk av oppfinnelsen vedrører anvendelsen av et preparat av den ovennevnte type for fremstilling av et legemiddel med faktor X/Xa-aktivitet. Et legemiddel som inneholder en faktor X-analog hhv. faktor Xa-analog, er spesielt godt egnet for behandling av pasienter med forstyrret blodlevring, såsom f.eks. hemofili-pasienter eller pasienter som har utviklet inhiberende antistoffer mot faktor VIII og/eller IX som vanligvis brukes ved behandlingen, og spesielt som preparat med faktor VIII-bypass-aktivitet.
En nukleinsyre som inneholder de kodende sekvenser av faktor X-analogene ifølge oppfinnelsen, kan anvendes ved fremstilling av et legemiddel. Nukleinsyren kan, såfremt den inneholder egnede ekspresjonsstyrende sekvenser, appliseres som naken nukleinsyre, være integrert i en rekombinant ekspresjonsvektor eller være bundet på en bærer, enten et fosfolipid eller en viral partikkel. Nukleinsyren kan brukes til fremstilling av et legemiddel som spesielt er egnet for behandling av pasienter med forstyrret blodlevring, så som f.eks. hemofili-pasienter eller hemofili-pasienter med inhibitoriske antistoffer. Anvendelsen av nukleinsyren i genterapi er også tenkbar.
Et ytterligere trekk av oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte ved fremstilling av faktor X-analogene ifølge oppfinnelsen, og et preparat som inneholder en faktor X-analog ifølge oppfinnelsen. Med denne hensikt bringes en sekvens som koder for faktor X-analogen, inn i et egnet ekspresjonssystem, og tilsvarende celler, fortrinnsvis permanente cellelinjer, transfiseres med det rekombinante DNA. Cellene dyrkes under optimale betingelser for genekspresjonen, og faktor X-analoger isoleres enten fra ekstraktet av en cellekultur eller av cellekultursupernatanten. Det rekombinante molekyl kan renses ytterligere ved hvilke som helst kjente kromatografiske fremgangsmåter, så som anione- eller kationebytter-, affinitets- eller immunoaffinitetskromato-grafi eller en kombinasjon derav.
For fremstilling av faktor X-analogene ifølge oppfinnelsen klones det fullstendige cDNA som koder for faktor X, i en ekspresjonsvektor. Dette utføres ved allment kjente klone-teknikker. Nukleotidsekvensen som koder for faktor X, modi-fiseres deretter slik at den kodende sekvens forandres i området av aktiveringspeptidet og eventuelt også i området av det C-terminale p-peptid, slik at det kan fremstilles et faktor X-molekyl av den ovenfor beskrevne type. Dette utfø-res ved gentekniske fremgangsmåter som er kjent innen faget, så som spesifikk målrettet in vitro-mutagenese, eller delesjon av sekvenser, f.eks. ved restriksjonsspaltning ved hjelp av endonukleaser og innføyelse av andre forandrede sekvenser, eller ved PCR. De således fremstilte faktor X-mutanter innføyes deretter i et ekspresjonssystem som er egnet for rekombinant ekspresjon, og uttrykkes.
Faktor X-analogene ifølge oppfinnelsen kan også fremstilles ved kjemisk syntese.
Faktor X-analogene fremstilles fortrinnsvis ved rekombinant ekspresjon. Den gentekniske fremstilling kan utføres med alle vanlige ekspresjonssystemer, så som f.eks. permanente cellelinjer eller virale ekspresjonssystemer. De permanente cellelinjer fremstilles ved en stabil integrasjon av frem-med-DNA'et i vertcellekromosomet av f.eks. Vero, MRC5, CHO, BHK, 293, SK-Hepl, spesielt lever- og nyreceller, eller ved hjelp av en episomal vektor avledet fra f.eks. papilloma-virus. Virale ekspresjonssystemer så som f.eks. vaccinia-virus, baculovirus eller retrovirale systemer, kan også brukes. Som cellelinjer brukes generelt Vero, MRC5, CHO, BHK, 293, Sk-Hepl, kjertel-, lever- og nyreceller. Som eukaryotiske ekspresjonssystemer kan også gjærer, endogene kjertler (f.eks. kjertler av transgene dyr) og andre celletyper brukes. Naturligvis kan også transgene dyr brukes for ekspresjon av polypeptidene ifølge oppfinnelsen eller derivater derav. For ekspresjon av de rekombinante proteiner har spesielt CHO-DHFR"-celler vist seg å være nyttige (Urlaub et al., 1980, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 77: 4216-4220).
For en rekombinant fremstilling av faktor X-analogene ifølge oppfinnelsen kan også prokaryotiske ekspresjonssystemer brukes. Til dette egner seg spesielt systemer som tillater en ekspresjon i E. coli eller B. subtilis.
Faktor X-analogene uttrykkes i de tilsvarende ekspresjonssystemer under styring av en egnet promotor. I tilfel-let av ekspresjon i eukaryoter, egner seg alle kjente promotorer, så som SV40-, CMV-, RSV-, HSV-, EBV-, p-aktin-, hGH eller induserbare promotorer såsom f.eks. hsp- eller metallotionein-promotor. Fortrinnsvis eksprimeres faktor X-analogene under styring av p-aktin-promotoren i CHO-celler.
Preparatet ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved trinnene å: tilveiebringe DNA som koder for en faktor X-analog, transformere en celle med det rekombinante DNA, uttrykke faktor X-analogen, eventuelt i nærvær av et protease, isolere faktor X-analogen og eventuelt rense ved en kromatografisk metode.
Ifølge en utførelse av fremgangsmåten isoleres faktor X-analogen direkte i form av et dobbeltkjedet molekyl. Med denne hensikt eksprimeres en faktor X-analog in en celle som tillater en prosessering av pro-faktor X-analog til tokjedet faktor X-analog. Cellen er i denne sammenheng fortrinnsvis en celle som uttrykker en protease som har evnen til prosessering av faktor X-forløperen, f.eks. en bibasisk protease så som furin eller et derivat derav. Eventuelt kan man for å heve hhv. forbedre prosesseringseffisiensen, modifisere cellen slik at proteasen uttrykkes forsterket. Dette kan f.eks. utføres ved koekspresjon av en tilsvarende bibasisk endoprotease, så som furin/PACE, Kex2 eller et derivat derav. Faktor X-analogen ifølge oppfinnelsen kan likeledes eksprimeres i en celle som oppviser en normal, dvs. for prosesseringen suboptimal, endogen konsentrasjon av en protease, og hvor det dermed finner sted en ufullstendig prosessering til den tokjedede aktive form. Den påfølgende prosessering til tung og lett kjede finner i dette tilfelle sted, hvis enkeltkjedet faktor X-analog secerneres i cellekultursupernatenten slik det ble beskrevet ovenfor, ved kokultivering med protease-uttrykkende celler eller ved å bringe den i berøring med et eventuelt immobilisert protease. Cellesupernatanten kan også pumpes over en bærermatriks som det er bundet et protease på, hvorved man i eluatet erholder tokjedet faktor X-analog. Reaktantene kan også blandes i oppløsning og inkuberes over et bestemt tidsrom, og proteasen kan deretter fjernes f.eks. over en affinitetsmatriks.
Den således erholdte faktor Xa-analog kan deretter isoleres, renses og slik det ble beskrevet ovenfor, lagres stabilt inntil videre bruk.
I en spesiell utførelse bringes tokjedet, eventuelt renset faktor X-analog in vitro i berøring med en protease valgt fra gruppen endoproteaser, så som f.eks. kexin/Kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, gruppen serinproteaser, så som f.eks. faktor Xlla, faktor Xla, faktor Xa, faktor Ila, eller kallikrein, eller et derivat av disse proteaser, under betingelser under hvilke faktor X-analogen aktiveres til nativ faktor Xa eller en faktor Xa-analog.
Ifølge en utførelse finner aktiveringen sted ved et kromatografisk trinn hvor proteasen er immobilisert på en bærer. Renset tokjedet faktor X-analog føres med denne hensikt over en matriks som proteasen er bundet på, og fra eluatet isoleres renset faktor Xa-analog.
Ifølge en annen utførelse blandes komponentene, og proteasen fjernes selektivt fra blandingen.
Det er naturligvis også mulig med en kombinasjon av prosessering av enkeltkjedet pro-faktor X-analog til den tokjedede faktor X-analogform og aktivering til faktor Xa i én enkelt fremgangsmåte. Enkeltkjedet faktor X-analog eller et fortrinn derav bringes med denne hensikt direkte i berøring med en bibasisk protease, fortrinnsvis furin eller et derivat derav, som tillater en prosessering til tung og lett kjede og en aktivering til faktor Xa. Faktor X-analoger som ikke oppviser noen spaltningsposisjon for furin eller et derivat derav i aktiveringspeptidet, bringes eventuelt i berøring med en ytterligere protease som er forskjellig fra det første, men som muligjør en aktivering. Proteasene kan da foreligge i en blanding, f.eks. av furin og faktor Xla.
Aktiveringen kan også finne sted ved en kombinasjon av de to trinn ved hjelp av etter hverandre koblede, direkte med hverandre forbundne anordninger, fortrinnsvis av bærere, så som f.eks. søyler, som proteasen eller proteasene er immobilisert på. Da finner det på den første bærer sted en spaltning av faktor X til den tunge og den lette kjede, og på den andre finner det sted en aktivering til faktor Xa ved hjelp av den immobiliserte protease. En kobling av bærerne kan utføres ved en direkte forbindelse av utløpet fra den første søyle med innløpet til den andre søyle.
Reaksjonsbetingelsene for prosesseringsreaksjonen(e) og aktiveringen kan uten videre optimeres av fagmannen avhengig av forsøksanordningen og de gitte rammebetingelser. I denne sammenheng er strømningshastigheten av de foreliggende reaktanter av spesiell betydning for berøringsvarig-heten. Den bør ideelt ligge mellom 0,01 ml/min og 1 ml/min. Som ytterligere parametere er temperaturen, pH-verdien og elueringsbetingelsene av betydning. Etter gjennomløpet kan aktivert faktor Xa-analog eventuelt renses ytterligere ved selektiv kromatografi. Gjennomføringen av fremgangsmåten med en protease som er bundet på en bærer, er spesielt for-delaktig på grunn av at reaksjonsanordningen ved bruk av en bærer, fortrinnsvis kromatografisøyler, muliggjør et ytterligere rensetrinn.
Ifølge et ytterligere trekk for fremstilling av en faktor X-analog isoleres faktor X-analogen som enkeltkjedet molekyl. Med denne hensikt eksprimeres faktor X-analogen i en celle som ikke støtter prosesseringen av den enkle kjede til en lett og en tung kjede. Cellen oppviser fortrinnsvis en mangel på en bibasisk protease, så som f.eks. kexin, furin, PACE. Slik det ble bestemt innen rammen for oppfinnelsen, er et av de vesentlige proteaser som er ansvarlig for spaltningen av faktor X til lett og tung kjede, furin. Fra en slik endoprotease-manglende mutantcelle kan faktor X-analog isoleres som enkeltkjedet molekyl. En på denne måte isolert og eventuelt renset faktor X-analog bringes deretter i berøring med en protease valgt fra gruppen endoproteaser, så som f.eks. kexin/Kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, under betingelser under hvilke enkeltkjedet faktor X-analog spaltes til den tokjedede faktor X-form. Faktor X-analoger ifølge oppfinnelsen som oppviser en modifikasjon i området av aktiveringspeptidet som muliggjør en spaltning ved hjelp av et av disse endoproteaser, kan ved denne fremgangsmåte eventuelt aktiveres direkte fra enkeltkjedet faktor X-analog til faktor Xa hhv. faktor Xa-analog ved å bringe den i berøring med endoproteasen.
Faktor X-analoger ifølge oppfinnelsen som oppviser en modifikasjon som muliggjør en spaltning ved hjelp av serinprotease eller kallikrein, i området av aktiveringspeptidet, bringes etter fremstillingen til tokjedet faktor X-analog, i berøring med en ytterligere protease, som skiller seg fra det første, og aktiveres til faktor Xa-analog.
Ifølge et trekk av oppfinnelsen erholdes ved hjelp av fremgangsmåten et preparat som inneholder aktiv faktor Xa hhv. en aktiv faktor Xa-analog, ved at en faktor X-analog som er blitt fremstilt som beskrevet ovenfor, underkastes et aktiveringstrinn, og det aktiverte polypeptid viderebearbeides til et renset preparat som eventuelt kan være formulert som farmasøytisk sammensetning.
Med faktor X-analogene ifølge oppfinnelsen, som aktiveres til faktor Xa ved en fremgangsmåte som beskrevet ovenfor, erholdes renset faktor Xa hhv. faktor Xa-analog med høy stabilitet og strukturell integritet, og som spesielt er fri for inaktive faktor X/Xa-mellomprodukter.
Oppfinnelsen skal beskrives nærmere ved hjelp av de føl-gende eksempler og de vedlagte tegninger.
Eksempel 1 beskriver konstruksjonen og ekspresjonen av en rFaktor X; eksempel 2 beskriver prosesseringen av rFaktor X til tung og lett kjede ved hjelp av furin; eksempel 3 beskriver prosessering av pro-faktor X ved hjelp av immobilisert protease; faktor 4 beskriver aktiviteten av in vitro-prosessert rFaktor X; eksempel 5 beskriver ekspresjonen av rFaktor X i furin-manglende celler; eksempel 6 beskriver konstruksjon og ekspresjon av rFaktor X-analoger; eksempel 7 beskriver bestemmelsen av N-termini av faktor X-prosesse-ringsproduktene. Eksempel 8 beskriver ekspresjonen og karakteriseringen av FX-analogen med furin-spaltningsposisjonen Arg-Arg-Lys-Arg/Ile (rFXRRKR/I) ; eksempel 9 beskriver in vi tro-aktiveringen av rFX<RRKR/I->proteinet ved hjelp av rFurin-derivater; eksempel 10 beskriver funksjonaliteten av den in vi tro-aktiverte rekombinante FX-analog rFX1^^1; eksempel 11 beskriver in vitro-aktiveringen av rFX-analogen
med FXIa-spaltningsposisjonen Asp-Phe-Thr-Arg/Val for FXIa.
Figur 1 viser nukleotid- og aminosyresekvensen av faktor
X;
Figur 2 viser skjematisk faktor X-analogene med modifiserte protease-spaltningsposisjoner i området av aktiveringspeptidet; Figur 3 viser skjematisk ekspresjonsvektoren phAct-rFX; Figur 4 viser en "western blot"-analyse av rFaktor X som er eksprimert i CHO-celler, før og etter ampli-fikasjon; Figur 5 viser en "western blot"-analyse av rFaktor X
etter in vitro-spaltning med furinderivater; Figur 6 viser en "western blot"-analyse av rFaktor X-molekyler som ble uttrykt i furin-holdige og furin-manglende celler; Figur 7 viser skjematisk rFX/rFXa-analog-konstruktene med forandrede C-termini i den tunge kjede; Figur 8 viser skjematisk N-termini av rFaktor X-proses-seringsproduktene fra furin-holdige og furin-manglende CHO-celler, før og etter behandling med rFurin; Figur 9 viser en "western blot"-analyse av rFaktor FXRRKR/I, eksprimert i CHO-celler; Figur 10 viser en "western blot"-analyse av rFaktor FX<RRKR/I> etter in vi tro-aktivering med furinderi-vat; og Figur 11 viser en "western blot"-analyse av rfaktor FX<DFRT/V> etter in vi tro-aktivering med furinderi-vat.
Ekspresjonsvektorene ble fremstilt ved standard-klonetek-nikker (Maniatis et al., " Molecular Cloning" - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA, 1983). Fremstillingen av DNA-fragmenter ved hjelp av polymerase-kjedereaksjon (PCR) ble utført ved vanlige metoder (Clackson et al., 1991, PCR A practical ap-proach., utg. McPherson, Quirke, Taylor, s. 187-214).
Eksempel 1:
Ekspresjon og prosessering av enkeltkjedet rFX til rFX-lett/tung kjede
a. Fremstilling av rFX-ekspresjonsvektor
For fremstilling av rekombinant FX (rFX) ble cDNA av FX isolert fra en human lever-lambda-cDNA-bank slik det beskrives av Messier et al. (1991, Gene 99: 291-294). Fra en positiv klon amplifiserte man ved PCR med oligonukleotid nr. 2911 (5'-ATTACTCGAGAAGCTTACCATGGGGCGCCCACTG-3') (SEKV. ID NR: 1) som 5'-primer og oligonukleotid nr. 2912 (5'-ATTACAATTGCTGCAGGGATCCAC-3') (SEKV. ID NR: 2) som 3'-primer et DNA-fragment som inneholdt den 1,467 kB lange FX-kodende sekvens samt 39 bp av ikke-translatert 3'-region, flankert av en Xhol-spaltningsposisjon i 5'-ende og en Mfel-spaltningsposisjon i 3'-ende. I tillegg innførte man ved hjelp av primer nr. 2911 sekvensen ACC før ATG av FX, slik at det oppstod en optimal Kozak-translasjonsinitieringssekvens. Deretter ble dette PCR-produkt klonet inn i den med Sali og EcoRI spaltede ekspresjonsvektor phAct, i form av et Xhol/Mfel-fragment. Den dannede ekspresjonsplasmid ble benevnt phAct-rFX (figur 3). Ekspresjonsvektoren phAct omfatter human betaaktin-promoter, 78 bp 5'UTR samt intro-net, en multippel kloningsspaltningsposisjon og SV40-poly-adenyleringsposisj onen.
b. Ekspresjon av rFX i CHO-celler
For etablering av en stabil rFX-uttrykkende cellelinje ble dhfr-defisiente CHO-celler ko-transfisert med ekspresjons-plasmidet phAct-rFX og seleksjonsmarkerplasmidet pSV-dhfr. For alle andre ekspresjons- og funksjonsanalyser ble celle-kulturene inkubert med serumfritt seleksjonsmedium i nærvær av 10 ug/ml vitamin K i 24 timer. Ekspresjonen av rFX i de dannede cellekloner ble bestemt på grunnlag av antigenmeng-den (ELISA, Asserachrom, Boehringer Mannheim), og det rekombinante protein ble deretter kjennetegnet ved hjelp av SDS-PAGE (figur 4A og 4B). I initialklonene og subklonene derav foreligger, slik det fremgår av "western blot" (figur 4A), det rekombinante FX-protein i form av en lett kjede (LC) med 22 kDa lengde, og en tung kjede (HC) med ca. 50 kDa lengde, som er identiske med plasmatisk faktor X-protein. I tillegg synes et proteinbånd ved 75 kDa, som tilsvarer enkeltkjedet (SC)-molekyl, og hvis nærvær er blitt beskrevet i FX-transfiserte CHO-celler (Wolf et al., J. Biol. Chem. 266: 13726-13730, 1991) samt i human plasma (Fair et al., Blood 64: 194-204, 1984). For fremstilling av høyt uttrykkende kloner ble initialklonene amplifisert med økende mengder metotreksat og deretter subklonet inntil stabilisering. Ekspresjonen kunne heves fra ca. 200-500 ng/10E6 celler hhv. 1 ug/ml til 78 ^g/10E6 celler hhv. 120 Hg/ml pr. 24 timer. En "western blot"-analyse av disse høyt uttrykkende celleklonsupernatanter (figur 4B og figur 5A, spor 2), viser en anrikning av det enkeltkjedede rFX-molekyl samt nærværet av ytterligere former for den lete kjede. Foruten den 22 kDa lange form for den lette kjede, som tilsvarer den plasmatiske form (fullstendig karboksylert og uten propeptid), foreligger tre ytterligere varianter av den lette kjede, med ca. 21 kDa, 22,5 kDa og 20 kDa. Hete-rogenisiteten av den lette kjede i disse kloner kunne ved hjelp av en N-terminal sekvensiering av det rekombinante materiale føres tilbake på en ufullstendig avspaltning av propeptidet (her: ca. 50% av rFX-materialet) samt en under-karboksylasjon (her: ca. 50% av rFX). Det 21 kDa lange protein er en underkarboksylert propeptid-holdig, og det 20 kDa lange protein en underkarboksylert propeptid-fri form for den lette kjede, mens 22,5 kDa-båndene representerer en fullstendig karboksylert, men imidlertid pro-peptid-holdig LC-form.
Eksempel 2:
Prosessering av enkeltkjedet rFX til rFX lett/tung kjede ved hjelp av rFurin-derivater
På grunn av likheten mellom spaltningsposisjonene for faktor X propeptid/N-terminus av den lette kjede (RVTR^A) og mellom den lette/tunge kjede (RRKR^S) med furin-konsensus-gjenkjenningssekvensen (RXK/RR^X), hadde man muligheten til å forbedre prosesseringen in vitro av både enkeltkjedede og propeptid-holdige rFX-molekyler ved hjelp av rFurin-derivater. I litteraturen formodes proteaser for de to prosesse-ringstrinnene, men det dreier seg der imidlertid ikke om furin (Rehemtulla et al., 1992, Blood 79: 2349-2355; Wallin et al., 1994, Thromb. Res. 1994: 395-403).
Cellekultursupernatanter fra CHO-rFX og CHO-rFurin ATM6xHis (patentsøknad EP 0.775.750 A2) samt CHO-rFX og ikke-transfiserte CHO (som negativkontroll) ble blandet i forholdet 1:1 og inkubert ved 37°C. Alikvoter av reaksjonsblandingene ble før inkuberingen (t=0) og etter forskjellige inkuba-sjonsvarigheter (t=2, 4, 6 timer) testet ved "western blot" for å påvise prosessert rFX (figur 5). Påvisningen av rFX i cellekultursupernatantene ble utført ved hjelp av et anti-humant FX-antiserum (figur 5A) hhv. et monoklonalt anti-stoff som var spesifikt for den lette kjede av FX (figur 5B) .
I motsetning til CHOrFX/CHO-blandingen oppviser CHO-rFX/CHO-rFurin allerede etter 2 timers inkubasjon ved 37°C (figur 5A spor 7; figur 5B spor 8) en nesten fullstendig prosessering. Enkeltkjedet rFX er i det vesentlige blitt omsatt til den lette og den tunge kjedeform. I området av den lette kjede fant man kun de prosesserte propeptid-frie former med 22 kDa (karboksylert form) og 20 kDa (underkarboksylert form) i et forhold på ca. 50:50. Ved optime-ring av cellekulturbetingelsene kan dette forhold forbedres i den karboksylerte forms gunst. En riktig avspaltning av pro-sekvensen mellom Arg-1 og Ala+1, og homogeniteten av N-terminus av den lette kjede ble fastslått ved N-terminal sekvensiering. I kontrolleksperimentet, hvor CHO-rFX ble blandet med CHO-supernatanter, kan man heller ikke etter 6 timers inkubasjon se noen forandring av rFX-båndmønstret (Fig. 5A, spor 5; Figur 5B, spor 6). Dermed er det bevist at rFurin i supernatanten av CHO-celler er biologisk aktivt, og kan gjennomføre både prosesseringen av propeptidet og av den tunge/lette kjede av rFX.
Eksempel 3:
Prosessering av faktor X ved hjelp av på chelattentakkelgel immobilisert rFurin
For å bestemme om et substrat kan spaltes ved hjelp av et søyle-bundet rFurin-derivat, undersøkte man om man som søy-lematriks i en eksperimentell fremgangsmåte kan bruke "Fractogel EMD"-tentakkelgel (firma Merck) istedenfor Ni<2+->NTA-agarose. På grunn av at metallionene her befinner seg i en større avstand fra den egentlige søylematriks enn i til-fellet av Ni<2+->NTA-agarose, kunne det være mulig å oppnå en forbedret sterisk tilgjengelighet for substratet til det bundne rFurin-derivat. I denne fremgangsmåte ble pro-faktor X prosessert av rFurin-derivat som var bundet på tentakkel-gel: "Fractogel EMD"-tentakkelgel ble ladet med Ni<2+->ioner ifølge produsentens anvisninger, og ble ekvilibrert med ferskt serumfritt cellekulturmedium. Deretter ble søylen ladet med serumfri CHO-rFurin-derivat-supernatant. Vaske-trinn ble utført med serumfritt cellekulturmedium som inneholdt økende imidazolkonsentrasjoner opptil 40 mM. Deretter ble pro-faktor X ledet over søylen i form av en serumfri CHO-supernatant. Ved hjelp av "western blot"-analyse med spesifikt faktor X-antiserum ble prosesseringen av pro-faktor X til tokjedet faktor X påvist i gjennomløpet av søy-len .
Eksempel 4:
Aktivitet av in vitro-prosessert rekombinant faktor X
Rekombinant faktor X-forløper ble inkubert ved 4°C med og uten rFurin. Til forskjellige tidspunkter tok man prøver og frøs dem ned ved -20°C. Etter avsluttet inkubasjon (etter 4 dager) ble alle probene testet ved hjelp av "FX-Coatest Kit" (firma Chromogenix) for å bestemme FX-aktiviteten. Med denne hensikt ble 50 ^1 av hver supernatant blandet med 50 ^1 FX-manglende, humant plasma, og rFX ble omsatt til rFXa med slangegift (RW) ifølge produsentens anvisninger i nærvær av CaCl2; rFXa hydrolyserer deretter det kromogene substrat (S-2337) og fører til en frigivning av gult para-nitroanilin. På grunn av at mengden av rFXa og fargeinten-siteten er proporsjonale med hverandre, kan man på grunnlag av en justeringslinje som er interpolert fra verdier av en plasma-fortynningsrekke, bestemme mengden av rFX/ml-cellekultursupernatant som kan aktiveres til rFXa. Med disse resultater og den kjente rFX-antigenmengde (ELISA-data) kan andelen av rFaktor X som er aktivert til faktor Xa, bereg-nes i prosent. Resultatene vises i tabell 1.
For å utelukke en uspesifikk, proteolytisk aktivitet i CHO-og CHO-rFurin-supernatanter, ble også blandingen av disse to cellekultursupernatanter undersøkt.
CHO-rFX inkubert med CHO-supernatanter (uten rFurin) som kontroll viste heller ikke etter 4 dager noen vesentlig endring av rFXa-aktiviteten, som på grunn av de eksperimen-telle forandringer lå på ca. 800 mU/ml og tilsvarte 50-61% funksjonelt rFX. Hvis man som sammenligning inkuberte CHO-rFX med CHO-rFurin, oppstod under inkubasjonstiden en konstant stigning av rFX-aktiviteten, som steg fra ca. 61%
(tidspunkt T = 0) til 86% (tabell 1).
På denne måte beviste man at andelen av rFX som kan aktiveres til funksjonelt rFXa, forbedres vesentlig ved in vitro-prosessering av CHO-rFX fra høyuttrykkende kloner ved hjelp av rFurin-derivat.
Eksempel 5:
Ekspresjon av rekombinant faktor X i furin-manglende celler
Slik det ble vist i eksemplene ovenfor, formidles for faktor X-forløperproteinet såvel propeptid-avspaltningen som spaltningen av den enkle kjede til lett/tung kjede in vitro av furin. Dette gjør det nærliggende at disse trinn også i cellen utføres endogent ved det ubikvitært foreliggende furin, avhengig av den uttrykte rFaktor X-mengde med forskjellig effisiens. Dette fører i sin tur til dannelsen av en blanding av heterogene rFaktor X-former.
En mulighet til å fremstille en mest mulig homogen og i tillegg stabil form for rFaktor X-molekyler, er å unngå en spaltning av rFaktor X ved hjelp av endogene proteaser, spesielt furin, og dermed danne funksjonelt inaktiv rFaktor X-forløper (som ved en senere nedstrømsprosessering, ideelt direkte før bruk, kan omdannes til sin funksjonelt aktive form).
Denne fremgangsmåte vil spesielt være nyttig ved fremstilling av FX-analoger som inneholder en furin-spaltningsposisjon istedenfor den opprinnelige aktiveringsposisjon. Med disse konstrukter kan aktiveringen av en slik rekombinant rFX-mutant finne sted in vivo ved hjelp av det endogene furin, og føre til utsondring av aktiverte ustabilere rFX-former. Degraderingen av disse former av CHO-proteaser, f.eks. i cellekulturbetingelser med høy cellelyse, under lagring av cellekultursupernatantene eller rensemetoden eller ved autoproteolyse, kan føre til inaktive spaltningsprodukter (Wolf et al., 1991).
Dette mål kan f.eks. oppnås ved supplementering av celle-kulturmediet med midler som kan redusere eller utelukke den intracellulære furinaktivitet.
En annen mulighet er å bruke a priori furin-manglende celler (Mohring et al., 1983, Infect. Immun. 41: 998-1009; Ohnishi et al., 1994, J. Virol. 68: 4075-4079; Gordon et al., 1995, Infect. Immun. 63: 82-87).
Med denne hensikt ble en furin-manglende CHO-celleklon FD11 (Gordon et al., 1995, Infect. Immun. 63: 82-87) ko-transfisert med 20 ^g phAct-FX og 1 fKj pUCSV-neo (som inneholdt neomycin-resistensgenet i pUC-vektor under styring av SV40-promotor). For å erholde stabile kloner, ble mediet supple-mentert med 0,8 ^g G418/ml. Ved sammenligning av secernerte rFaktor X-molekyler i serumfrie supernatanter av en furin-holdig og en furin-manglende CHO-klon, viser det seg i "western blot" at rFaktor X-forløper-prosesseringen uteblir i furin-manglende celler og at det kun foreligger enkeltkjedet faktor X-forløper (fig. 6); i motsetning til dette blir rFaktor X fra "normale" celler ved beskjeden ekspresjon prosessert fullstendig, men ved høyere ekspresjon, til tross for endogent furin, kun prosessert delvis. På grunn av den lave rFX-ekspresjonsgrad av den brukte celleklon, er den lette kjede av rFaktor X her ikke synlig på "blotten".
Eksempel 6:
Fremstilling av faktor X-analoger (for tiden etter Søkers mening den beste måte å utøve oppfinnelsen)
6.1. Konstruksjon av ekspresjonsplasmider for fremstilling
av FX-delesjonsmutanter
For fremstilling av rekombinant rFaktor X-analog ble spaltningsposisjonen Asn-Leu-Thr-Arg/Ile (aminosyre 231 til 235), som tjener til aktivering av faktor X til faktor Xa, erstattet med en spaltningsposisjon som var spesifikk for en annen protease, så som furin, FXIa, FXa, FXIIa, Fila eller kallikrein. Ekspresjonsplasmidene for disse faktor X-analoger er alle avledet fra plasmidet phAct-FX (beskrevet i eksempel 1).
For å forenkle kloningen av faktor X-ekspresjonsplasmidene, ble HindIII-NaeI-DNA-fragmentet fra phAct-FX-ekspresjons-plasmidet, som omfatter det faktor X-kodende parti fra posisjon +1 til +1116, innskåret i Hindlll/Smal-restrik-sjonsspaltningsposisjonene av plasmid pUC19. Det dannede plasmid ble benevnt pUC/FX.
På denne måte kunne faktor X-sekvensen fra nukleotidet i posisjon 508 til 705 (aminosyre 160 til 235) lett fjernes fra pUC/FX-plasmidet og erstattes med forskjellige muterte faktor X-DNA-fragmenter. Disse DNA-fragmenter er identiske med den deleterte villtype-faktor X-sekvens, unntatt posisjonene 691 til 705 (aminosyre 231 til 235), som koder for nye spaltningsposisjoner.
Villtype-faktor X-sekvensen ble fjernet fra pUC/FX-plasmidet ved Bspl20l- og BstXI-restriksjonsspaltning. 3'-over-henget av BstXI-posisjonen ble i tillegg fjernet med "Mung Bean"-nuklease (Biolab).
De muterte faktor X-DNA-fragmenter ble fremstilt ved PCR. 5'-primer er identisk for alle kloninger, og inneholder faktor X-sekvensen fra posisjon 496 til 516. 3'-primerne inneholder en faktor X-komplementerende sekvens (posisjon 676 til 690) og et ikke-komplementerende 5'-overheng som bærer sekvensene for en ny spaltningsposisjon og en restriksjonsspaltningsposisjon. Det amplifiserte PCR-produkt ble deretter etterspaltet med det eller de tilsvarende restriksjonsenzymer, og klonet inn i den forbedrede pUC/FX-vektor (se ovenfor).
Deretter ble de muterte faktor X-DNA-fragmenter omklonet ved Hindlll-Agel fra pUC/FX-plasmidene til phAct-FX-vektor. Sluttkonstruktene vises skjematisk på figur 2.1 og 2.2. Som referansekonstrukt angis faktor X-villtype. Aminosyrene er angitt i énbokstavs-kode, og de muterte posisjoner er i tillegg skyggelagt.
For fremstilling av en FXIa-spaltningsposisjon Asp-Phe-Thr-Arg/Val brukte man som 5'-primer oligonukleotid nr. 1001 (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') (SEKV. ID NR: 3) og som 3'-primer oligonukleotid nr. 1002 (5'-ACCA GTT AAC CCT GGT GAA GTC GTT GTC GCC CCT CTC-3') (SEKV. ID NR: 4). Dermed erstattet man aminosyrene Asn, Leu og Ile i posisjonene 231, 232 og 235 av faktor X-sekvensen med Asp, Phe og Val. PCR-fragmentet ble etterspaltet med Bstl20l og Hpal (fig. 2
A) .
For fremstilling av en Flla-spaltningsposisjon Arg/Ser brukte man som 5'-primer oligonukleotid nr. 1001 (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') (SEKV. ID NR: 3) og som 3'-primer oligonukleotid nr. 1003 (5'-ACCA TCG CGA CCT GGT CAG GTT GTT GTC-3') (SEKV. ID NR: 5). Dermed ble aminosyren Ile 1 posisjon 235 mutert til Ser. PCR-fragmentet ble etterspaltet med Bstl20l og Nrul (fig. 2 B).
For fremstilling av en FXIIa-spaltningsposisjon Ile-Lys-Pro-Arg/Ile brukte man som 5'-primer oligonukleotid nr. 1001 (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') (SEKV. ID NR: 3) og som 3'-primer oligonukleotid nr. 1004 (5'-ACC AGA ATC
GAT TCT GGG TTT GAT GTT GTC GCC CCT CTC-3') (SEKV. ID NR:
6) . Dermed ble aminosyrene Asn, Leu og Thr i posisjonene 231, 232 og 233 av faktor X-sekvensen mutert til Ile, Lys og Pro. PCR-fragmentet ble partielt etterspaltet med Bstl20l og XmnI (fig. 2 C). For fremstilling av en kallikrein-spaltningsposisjon Ser-Met-Thr-Arg/Ile brukte man som 5'-primer oligonukleotid nr. 1001 (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') (SEKV. ID NR: 3) og som 3'-primer oligonukleotid nr. 1005 (5'-ACC AGA ATC GAT TCT GGT CAT GCT GTT GTC GCC CCT CTC-3') (SEKV. ID NR 7) . Dermed ble aminosyrene Asn og Leu i posisjonene 231 og 232 av faktor X-sekvensen mutert til Ser og Met. PCR-fragmentet ble partielt etterspaltet med Bstl20l og XmnI (fig.
2 D) .
For fremstilling av en FXa-spaltningsposisjon Pro-Gln-Gly-Arg/Ile brukte man som 5'-primer oligonukleotid nr. 1001 (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') (SEKV. ID NR: 3) og som 3'-primer oligonukleotid nr. 1016 (5'-ACC AGA ATC GAT TCT TCC TTG GGG GTT GTC GCC CCT CTC-3') (SEKV. ID NR: 8). Dermed ble aminosyrene Asn, Leu og Thr i posisjonene 231, 232 og 233 av FX-proteinet mutert til Pro, Gin og Gly. PCR-fragmentet ble partielt etterspaltet med Bstl20l og XmnI (fig. 2 H).
For fremstilling av en FXa-spaltningsposisjon Met-Lys-Thr-Arg/Ile brukte man som 5'-primer oligonukleotid nr. 1001 (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') (SEKV. ID NR: 3) og som 3'-primer oligonukleotid nr. 1014 (5'-ACC AGA ATC GAT TCT CGT TTT CAT GTT GTC GCC CCT CTC-3') (SEKV. ID NR: 9). Dermed ble aminosyrene Asn og Leu i posisjonene 231 og 232 av FX-proteinet mutert til Met og Lys. PCR-fragmentet ble partielt etterspaltet med Bstl20l og XmnI (fig. 2 E).
For fremstilling av en FXa-spaltningsposisjon Ile-Glu-Gly-Arg/Ile brukte man som 5'-primer oligonukleotid nr. 1001 (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') (SEKV. ID NR: 3) og som 3'-primer oligonukleotid nr. 1015 (5'-ACC AGA ATC GAT TCT TCC CTC GAT GTT GTC GCC CCT CTC-3') (SEKV. ID NR: 10). Dermed ble aminosyrene Asn, Leu og Thr i posisjonene 231 til 233 av FX-proteinet mutert til Ile, Glu og Gly. PCR-fragmentet ble partielt etterspaltet med Bstl20l og XmnI (fig.
2 F) .
For fremstilling av en furin-spaltningsposisjon Arg-Arg-Lys-Arg/Ile brukte man som 5'-primer oligonukleotid nr. 1001 (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') (SEKV. ID NR: 3) og som 3'-primer oligonukleotid nr. 1006 (5'-ACC AGA ATC
GAT TCT TTT CCT CCT GTT GTC GCC CCT CTC-3') (SEKV. ID NR:
11). Dermed ble aminosyrene Asn, Leu og Thr i posisjonene 231 til 233 mutert til Arg, Arg og Lys. PCR-fragmentet ble etterspaltet med Bspl20l og XmnI (fig. 2 G). For fremstilling av en furin-spaltningsposisjon Arg-Val-Arg-Arg/Ile brukte man som 5'-primer oligonukleotid nr. 1001 (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') (SEKV. ID NR: 3) og som 3'-primer oligonukleotid nr. 1007 (5'-ACC AGA ATC GAT TCT CCT CAC CCT GTT GTC GCC CCT CTC-3') (SEKV. ID NR: 12) . Dermed ble aminosyrene Asn, Leu og Thr i posisjonene 231 til 233 mutert til Arg, Val og Arg. PCR-fragmentet ble partielt etterspaltet med Bspl20l og XmnI (fig. 2 G). For fremstilling av en furin-spaltningsposisjon Arg-Arg-Arg-Arg/Ile brukte man som 5'-primer oligonukleotid nr. 1001 (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') (SEKV. ID NR: 3) og som 3'-primer oligonukleotid nr. 1008 (5'-ACC AGA ATC GAT TCT CCT CCT CCT GTT GTC GCC CCT CTC-3') (SEKV. ID NR: 13) . Dermed ble aminosyrene Asn, Leu og Thr i posisjonene 231 til 233 mutert til Arg, Arg og Arg. PCR-fragmentet ble partielt etterspaltet med Bspl20l og XmnI (fig. 2 G). For fremstilling av en furin-spaltningsposisjon Arg-Pro-Lys-Arg/Ile brukte man som 5'-primer oligonukleotid nr. 1001 (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') (SEKV. ID NR: 3) og som 3'-primer oligonukleotid nr. 1009 (5'-ACC AGA ATC GAT TCT TTT GGG CCT GTT GTC GCC CCT CTC-3') (SEKV. ID NR: 14) . Dermed ble aminosyrene Asn, Leu og Thr i posisjonene 231 til 233 mutert til Arg, Pro og Lys. PCR-fragmentet ble partielt etterspaltet med Bspl20l og XmnI (fig. 2 G). For fremstilling av en furin-spaltningsposisjon Ile-Arg-Lys-Arg/Ile brukte man som 5'-primer oligonukleotid nr. 1001 (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') (SEKV. ID NR: 3) og som 3'-primer oligonukleotid nr. 1010 (5'-ACC AGA ATC GAT TCT TTT CCT GAT GTT GTC GCC CCT CTC-3') (SEKV. ID NR: 15) . Dermed ble aminosyrene Asn, Leu og Thr i posisjonene 231 til 233 mutert til Ile, Arg og Lys. PCR-fragmentet ble partielt etterspaltet med Bspl20l og XmnI (fig. 2 G). For fremstilling av en furin-spaltningsposisjon Arg-Ser-Lys-Arg/Ile brukte man som 5'-primer oligonukleotid nr. 1001 (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') (SEKV. ID NR: 3) og som 3'-primer oligonukleotid nr. 1011 (5'-ACC AGA ATC GAT TCT TTT GCT CCT GTT GTC GCC CCT CTC-3') (SEKV. ID NR: 16) . Dermed ble aminosyrene Asn, Leu og Thr i posisjonene 231 til 233 mutert til Arg, Ser og Lys. PCR-fragmentet ble partielt etterspaltet med Bspl20l og XmnI (fig. 2 G). For fremstilling av en furin-spaltningsposisjon Arg-Val-Thr-Arg/Ile brukte man som 5'-primer oligonukleotid nr. 1001 (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') (SEKV. ID NR: 3) og som 3'-primer oligonukleotid nr. 1012 (5'-ACC AGA ATC GAT TCT GGT CAC CCT GTT GTC GCC CCT CTC-3') (SEKV. ID NR: 17) . Dermed ble aminosyrene Asn og Leu i posisjonene 231 og 232 mutert til Arg og Val. PCR-fragmentet ble partielt etterspaltet med Bspl20l og XmnI (fig. 2 G). For fremstilling av en furin-spaltningsposisjon Arg-Leu-Lys-Arg/Ile brukte man som 5'-primer oligonukleotid nr. 1001 (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') (SEKV. ID NR: 3) og som 3'-primer oligonukleotid nr. 1013 (5'-ACC AGA ATC GAT TCT TTT GAG CCT GTT GTC GCC CCT CTC-3') (SEKV. ID NR: 18) . Dermed ble aminosyrene Asn og Thr i posisjonene 231 og 233 mutert til Arg og Lys. PCR-fragmentet ble partielt etterspaltet med Bspl20l og XmnI (fig. 2 G). For fremstilling av en FXIIa-spaltningsposisjon Thr-Ser-Thr-Arg/Ile brukte man som 5'-primer oligonukleotid nr. 1001 (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') (SEKV. ID NR: 3) og som 3'-primer oligonukleotid nr. 1017 (5'-ACC AGA ATC GAT TCT CGT GCT CGT GTT GTC GCC CCT CTC-3') (SEKV. ID NR: 19) . Dermed ble aminosyrene Asn og Leu i posisjonene 231 og 232 av FX-proteinet mutert til Ile og Lys. PCR-fragmentet ble partielt etterspaltet med Bstl20l og XmnI (fig. 2 I).
6.2. Konstruksjon av ekspresjonsplasmider for fremstilling
av Fxp-analoger
Disse konstrukter ble avledet fra de ovenfor beskrevne faktor X-analog-konstrukter idet det ble satt inn et TGA-stopkodon i posisjon 470. Med denne hensikt ble aminosyrene fra posisjon 457 frem til stopkodonet fjernet på cDNA-nivå ved hjelp av Spel- og partiell BstEII-spaltning og erstattet med oligonukleotid-parret nr. 0003 (5'-GTC ACC GCC TTC CTC
AAG TGG ATC GAC AGG TCC ATG AAA ACC AGG TGA A-3') (SEKV. ID
NR: 20) og nr. 0004 (5'-CTA GTT CAC CTG GTT TTC ATG GAC CTG TCG ATC CAC TTG AGG AAG GCG-3') (SEKV. ID NR: 21). En skjematisk visning av faktor xp-analog-konstruktene finnes på fig. 7. For forenkling av avbildningen vises alle faktor xp-analoger som en generell konstrukt, hvor de variable aminosyrer i spaltningsposisjonsområdet vises i form av et skyggelagt "X".
6.3. Konstruksjon av ekspresjonsplasmider for fremstilling
av FXa-analoger
Med aktiveringen av faktor X ved avspaltning av det 4,5 kDa store aktiveringspeptid i N-terminal ende av den tunge kjede, dannes faktor Xaa-formen. Denne form omsettes deretter ved autoproteolytisk aktivitet og avspaltning av C-terminus av den tunge kjede mellom Arg469 og Gly470 til FXap-formen. For fremstilling av faktor X-ekspresjonsplasmider som fører til dannelsen av faktor X-analoger som etter aktiveringen foreligger utelukkende i FXaa-form med intakt p-peptid, ble aminosyren Arg469 mutert til Lys, slik at det ikke lenger kan finne sted noen prosessering i C-terminalt område av den tunge kjede.
Med denne hensikt ble den C-terminale aminosyresekvens av faktor X fra posisjon 1363 til stopkodon, fjernet ved partiell BstEII-Spel-spaltning og erstattet med to sammen-ligerte oligonukleotid-par. Oligonukleotidene nr. 0005 (5'-
GTC ACC GCC TTC CTC AAG TGG ATC GAC AGG TCC ATG AAA ACC AAG
GGC TTG CCC AAG-3') (SEKV. ID NR: 22) og oligonukleotid nr.
0006 (5'-TTG GCC TTG GGC AAG CCC TTG GTT TTC ATG GAC CTG
TCG ATC CAC TTG AGG AAG GCG-3') (SEKV. ID NR: 23) ble ligert med oligonukleotid nr. 0007 (5'-GCC AAG AGC CAT GCC
CCG GAG GTC ATA ACG TCC TCT CCA TTA AAG TGA GAT CCC A-3')
(SEKV. ID NR: 24) og oligonukleotid nr. 0008 (5'-CTA GTG
GGA TCT CAC TTT AAT GGA GAG GAC GTT ATG ACC TCC GGG GCA TGG
CTC-3') (SEKV. ID NR: 25). Mutasjonen av aminosyren Arg469 innføres ved hjelp av oligonukleotid-parret nr. 0005-0006. En skjematisk visning av FX-analogen finnes på figur 7.
Eksempel 7:
Bestemmelse av N-termini for faktor X og prosesseringsprodukter med og uten rFurin Rekombinant faktor X ble, slik det ble beskrevet i eksempel 1, uttrykt i CHO-celler med endogent furin, hhv. slik det ble beskrevet i eksempel 5, i furin-manglende celler. rFaktor X ble isolert både fra cellekultursupernatant av høytuttrykkende CHO-rFX-kloner som a) ikke var forbehandlet, b) var blitt inkubert i ytterligere 12 timer ved 37°C og c) var blitt forbehandlet i 12 timer ved 37°C med CHO-rFurin-supernatant, men også fra cellekultursupernatant fra CHO-FDll-rFX-kloner som d) ikke var forbehandlet, og e) var blitt forbehandlet i 12 timer ved 37°C med CHO-rFurin-supernatant. De N-terminale aminosyrer av faktor X og pro-sesseringsproduktene av de enkelte reaksjonssatser a) til e) ble bestemt ved en Edman-analyse. Figur 8 viser skjematisk resultatene.
rFaktor X fra høytuttrykkende CHO-celler opptrer i form av den modne tunge og lette kjede, samt enkeltkjedet, til dels fortsatt propeptid-holdig. Etter en inkubasjon av disse cellekultursupernatanter i 12 timer ved 37°C (b) opptrer i tillegg, slik det allerede ble beskrevet av Wolf et al.
(1991, J. Bio. Chem. 266: 13726-13730), feilaktige N-
termini av rFX-lett kjede med 3 ytterligere aminosyrer Val38-Thr39-Arg40. Disse kryptiske ender finnes også ved sekvensieringen av rFX-materiale fra ikke-forbehandlede CHO-FDll-celler (d). Denne observasjon viser at opptreden av disse feilaktige N-termini kan unngås hvis man bruker optimerte betingelser hhv. cellekulturbetingelser, lagring og rensemetoder for minimering av CHO-proteasers rFX-proteolyse.
I motsetning til det rensede materiale fra CHO-celler (a og b), foreligger rFX fra ikke-amplifiserte, furin-manglende celler (d) kun i form av uprosessert enkeltkjedet forløper.
Man finner heller ingen N-terminale sekvenser som tilsvarer propeptid-delen. Dermed ble det vist at prosesseringen av enkeltkjedet rFX-forløper til den lette/tunge kjede i furin-manglende CHO-celler (d) ikke lenger finner sted, hvilket tyder på at endoproteasen furin spiller en sentral rolle in vivo i dette prosesseringstrinn.
I tillegg ble det vist at prosesseringen av propeptid-holdige rFX-molekyler også finner sted i furin-manglende CHO-celler, og at furin dermed ikke spiller noen vesentlig rolle in vivo i dette prosesseringstrinn. Ved inkubasjon av rFX fra CHO-celler (c) og CHO-FDll-celler (e) i nærvær av furin finnes utelukkende lette og tunge kjeder med korrekte N-termini. Dermed ble det vist at både den enkeltkjedede FX-forløper og de propeptid-holdige rFX-molekyler omsettes ved in vitro-prosessering til homogent, modent faktor X. Dermed oppviser faktor X som ble prosessert i nærvær av furin, en usedvanlig strukturell integritet og homogenitet.
Eksempel 8:
Ekspresjon og karakterisering av FX-analogen med furin-spaltningsposis jonen Arg-Arg-Lys-Arg/Ile (rFX<RRKR/I>)
For fremstilling av rekombinant rFX<RRKR/I->protein ble FX-eks-presjonsplasmidet med spaltningsposisjonen Arg-Arg-Lys-
Arg/Ile (jfr. eksempel 6.1, fig. 2G) og seleksjonsplasmidet pSV/dhrf ko-transfisert i CHO-celler slik det ble beskrevet i eksempel 1. "Western blot"-analyse av cellekultursupernatantene (figur 9) viser at det rekombinante protein over-veiende foreligger i dobbeltkjedet form. Sammenlignet med plasma-FX forløper den tunge kjede ved 46 kDa istedenfor 50 kDa, hvilket sannsynligvis skyldes en forskjellig for-sukring av det rekombinante protein. I tillegg er, slik det også ble observert ved ekspresjonen av villtype-rFX (eksempel l.b.), små mengder av enkeltkjedet forløper (SC) samt LC4-isoformen av den lette kjede synlige. Disse molekylære former av rFX-analog tyder på en begrensning både av prosesseringen av den enkeltkjedede FX-forløper ved hjelp av endogene proteaser, og også av y-karboksyleringen av den lette kjede. Selv om spaltningsposisjonen som ble innført i FX-analogen, representerer en furin-konsens-sekvens, er ingen proteinbånd som tilsvarer de aktiverte former av proteinet (35 kDa, 31 kDa), synlige. Strukturen i området av spaltningsposisjonen samt den kringliggende aminosyresekvens fører antakelig til at prosesseringen av den modifiserte aktiveringsposisjon ved hjelp av furin kun utgjør suboptimale betingelser.
Eksempel 9:
In vitro-aktivering av rFX<RRKR/I->protein ved hjelp av rFurin-derivater
Aktiverbarheten av den rekombinante FX-analog til a- (35 kDa) og P~ (31 kDa) FXa-formene ved hjelp av rFurin in vitro ble testet slik det ble beskrevet i eksempel 2 for blandingseksperimenter, med den forskjell at rensede rFurin-derivater rFurinACys-avstandsholder-lOxHis, som beskrevet i patentsøknaden EP 0.775.750 A2, i 10 mM Hepes, pH 7,0, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2 og 0,2% BSA ble benyttet istedenfor CHO-rFurin-supernatanter. I kontrolleksperimentet uten rFurin ble CHO-rFX-analog-supernatanen blandet i forholdet 1:1 med bufferen 10 mM Hepes, pH 7,0, 150 mM
NaCl, 2 mM CaCl2 og 0,2% BSA. Alikvoter av satsene før og
etter en inkubasjonsvarighet på 6, 24, 48 og 72 timer (t=0, 6, 24, 48 og 72) ved 37°C ble testet ved "western blot" for å bestemme rFX-aktiveringen (fig. 10). Mens båndmønstret av rFX<RRKR/I> i fravær av rFurin-derivatet er uforandret selv etter 72 timers inkubasjon (fig. 10 B), blir det i nærvær av rFurin allerede etter 6 timer (fig. 10 A, spor 5) synlig et 35 kDa tungt proteinbånd som tilsvarer a-formen av plasmatisk FX (fig. 10 A, spor 9). I løpet av inkubasjonen akkumuleres denne a-form, og etter 72 timers inkubasjon
(fig. 10 A, spor 8) er ca. 50% av utgangsstoffet (HC) blitt omsatt til den aktiverte form. Det ytterligere 31 kDa tunge proteinbånd som blir synlig etter 24 timer (fig. 10 A, spor 6) og som tilsvarer p-formen av aktivert plasma-FX (fig. 10 A, spor 9), viser at a-formen som dannes fra rekombinant
FX-analog, har en autoproteolytisk aktivitet og dermed er funksj onell.
Disse resultater beviser at den heterologe aktiverings-spaltningsposisjon Arg-Arg-Lys-Arg/Ile i rFX-analogen gjenkjennes spesifikt in vitro av rFurin-derivater og spaltes riktig, og dermed er egnet for aktivering av rFX-analogen til a- og p-FXa-molekyler.
Eksempel 10:
Funksjonalitet av den in vitro aktiverte rekombinante FX-analog rFX<RRKR/I>
Alikvoter av blandingseksperimentene fra eksempel 9 ble un-dersøkt for å bestemme deres FXa-aktivitet ved en Chromogen-test. Med denne hensikt ble alikvotene blandet med Chromogen-substrat S2337 (600 pM) i 50 mM Tris, pH 7,3, 150 mM NaCl, 0,1% BSA. Etter en inkubasjonstid på 3 minutter ved 37°C ble reaksjonen stanset med 20% eddiksyre, og deretter ble OD-verdiene ved 405 nm målt. Sammenlignet med en justeringslinje som ble satt opp ved hjelp av renset, RW-aktivert plasma-FXa, ble mengden av rekombinant FXa-aktivitet i reaksjonssatsene bestemt. Resultatene av denne analyse, de anvendte antigenmengder (ELISA-verdier) og den derav beregnede spesifikke aktivitet vises i tabell 2.
For å utelukke uspesifikke amidolytiske aktiviteter i rFurin-oppløsningen og CHO-cellekultursupernatanten, ble også blandingen av en supernatant fra ikke-transfiserte CHO-celler med renset rFurin-derivat testet for sin FXa-aktivitet (CHO+rFurin). I denne blanding, akkurat som i rFX-analog/buffer-blandingen (rFXRRKR/I+buf f er) , kunne man ikke engang etter 72 timers inkubasjon måle noen FXa-aktivitet. I motsetning til dette var en rFXa-aktivitet på 56 mU målbar i rFX<RRKR/I>/rFurin-reaksjonen allerede etter 6 timers inkubasjon, og denne aktivitet steg konstant i løpet av inkubasjonen og nådde etter 72 timer 133 mU. Selv om til dette tidspunkt ifølge "western blot" kun ca. halvparten av rFX-analogen var blitt omsatt til de aktiverte a- og p-former (fig. 10 A, spor 8), oppnådde det in vitro aktiverte rFX-analog-materiale med 190 mU/^g en meget høyere spesifikk aktivitet enn den med RW fullstendig aktiverte plasma-FX (153 mU/^g). De målte aktivitetsøkninger gjen-speiles i opptreden av a- og p-formen ifølge "western blot"
(fig. 10 A, spor 5-8).
På denne måte ble det vist at man i FX kan innlemme heterologe protease-spaltningsposisjoner, at disse gjenkjennes og spaltes av det tilsvarende protease, og at høyverdig rFXa (eller eventuelt rFXa-analoger med FXa-aktivitet) kan fremstilles rekombinant i funksjonell form.
Eksempel 11:
In vitro-aktivering av rFX-analog med FXIa-spaltningsposisjonen Asp-Phe-Thr-Arg/Val (rFX<DFTR/v>) ved hjelp av plasmatisk FXIa
Ved mutagenese av FX-aktiveringssekvensen til en FXIa-spaltningsposisjon ble det fremstilt en FX-analog-konstrukt. Deretter ble stabile CHO-cellekloner fremstilt som eksprimerer disse molekyler. CHO-cellekultursupernatant med rFX<DFTR/v> ble i nærvær av 10 mM Tris, pH 7,3, 150 mM NaCl, 8 mM CaCl2, PCPS og 0,1% BSA blandet med renset plasmatisk FXIa (100 ug/ml) og inkubert ved 37°C over forskjellige tidsrom. Som negativkontroll ble cellekultursupernatanten inkubert kun med den BSA-holdige buffer. rFX<DFTR/v->proteinet og de dannede aktiveringsprodukter ble karakterisert ved hjelp av "western blot"-analyse (figur 11). Slik det fremgår av blandingen uten FXIa før inkubasjonen (t=0), utsond-res det rekombinante protein (fig. 11, spor 5) nesten identisk med plasmatisk FX (spor 2) i den dobbeltkjedede form, med den forskjell at den tunge kjede (HC), slik det også ble observert for rFX<RRKR> i eksempel 8, har en noe mindre molekylvekt enn 50 kDa. Under inkubasjonen av denne blanding ved 37°C (fig. 11, spor 6) er det ikke synlig noen vesentlig endring av båndmønsteret. I CHO-rFX/FXIa-blandingen er det allerede kort etter tilsetningen av renset FXIa, men før den egentlige inkubasjon av cellekultursupernatanten (fig. 11, spor 3), synlig proteinbånd med 35 kDa og 31 kDa, som tilsvarer størrelsen av den plasmatiske a- og P~ form av den tunge kjede (fig. 11, spor 9). Disse to former øker etter 4 timers inkubasjon med FXIa sterkt (fig. 11, spor 4).
Dermed er det blitt vist at en FX-analog som bærer den heterologe protease-spaltningsposisjon for et proteolytisk enzym som er aktivt i levringskaskaden, kan prosesseres med fremgang av proteasen.
I tillegg viser opptreden av rFXap-båndet, som er et resul-tat av den autoproteolytiske aktivitet av rFXaa-analogen, fremgangsrikt den funksjonelle aktivitet av den dannede rFXaa-analog.
Claims (50)
1. Faktor X-analog,
karakterisert ved at det oppviser en modifikasjon i området av den naturlig forekommende faktor Xa-aktiveringsspaltningsposisjon med en faktor X-sekvens Gly228-R6-R5-R4-R3-R2-Arg234-Rl, hvor modifikasjonen utgjør en prosesseringsposisjon for en protease som ikke naturlig spalter i dette område av faktor X-sekvensen, og a) RI er en aminosyre valgt fra gruppen Ile, Val, Ser, Thr eller Ala, b) R2 er en aminosyre valgt fra gruppen Pro, Gly, Lys eller Arg, c) R3 er en aminosyre valgt fra gruppen Phe, Lys, Met, Gin, Glu, Ser, Val, Arg eller Pro, d) R4 er en aminosyre valgt fra gruppen Asp, Ile, Ser, Met, Pro, Thr, Arg eller Lys, e) R5 er en aminosyre valgt fra gruppen Asn, Lys, Ser, Glu, Ala, Gin, His eller Arg, og f) R6 er en aminosyre valgt fra gruppen Asp, Phe, Thr, Arg, Leu eller Ser.
2. Faktor X-analog ifølge krav 1, karakterisert ved at modifikasjonen ved-rører minst én aminosyre i aminosyresekvensen av aktiveringspeptidet .
3. Faktor X-analog ifølge et av kravene 1 eller 2, karakterisert ved at modifikasjonen utgjør en erstatning av minst én av aminosyrene mellom Gly228 og Arg234, og eventuelt Ile235, i henhold til aminosyrenumme-reringen ifølge fig. 1.
4. Faktor X-analog ifølge et av kravene 1 til 3, karakterisert ved at modifikasjonen utgjør en prosesseringsposisjon for en protease valgt fra gruppen endoproteaser, så som f.eks. kexin/Kex2, furin/PACE, PC1/- PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, serinproteaser, så som f.eks. faktor Ila, faktor Xlla, faktor Xla, faktor Xa, eller kallikrein, eller et derivat av disse proteaser.
5. Faktor X-analog ifølge et av kravene 1 til 4, karakterisert ved at den oppviser en ytterligere modifikasjon i området av C-terminal faktor X-aminosyresekvens.
6. Faktor X-analog ifølge krav 5, karakterisert ved at den oppviser en modifikasjon i C-terminalt område av p-peptid-spaltningsposisjonen.
7. Faktor X-analog ifølge krav 6, karakterisert ved at modifikasjonen er en mutasjon, delesjon eller innføyelse i området av faktor X-aminosyresekvensen mellom aminosyreposisjon Arg4 69 og Ser476.
8. Faktor X-analog ifølge et av kravene 5 til 7, karakterisert ved at modifikasjonen forhindrer en avspaltning av p-peptidet.
9. Faktor X-analog ifølge krav 5, karakterisert ved at den oppviser en delesjon av faktor X-p-peptidet.
10. Faktor X-analog ifølge krav 5, karakterisert ved at den oppviser et translasjonsstoppsignal i C-terminalt område av faktor X-sekvensen.
11. Faktor X-analog ifølge krav 10, karakterisert ved at den oppviser et
translasjonsstoppsignal i posisjonen av aminosyre 470 av faktor X-sekvensen.
12. Faktor X-analog ifølge et av kravene 1 til 11, karakterisert ved at modifikasjonen i området av aktiveringspeptidet tillater en in vitro-aktivering av faktor X-analogen til nativ faktor Xa hhv. en faktor Xa-analog.
13. Faktor X-analog ifølge krav 12, karakterisert ved at modifikasjonen tillater en aktivering ved hjelp av en protease valgt fra gruppen endoproteaser, så som f.eks. kexin/Kex2, furin/- PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, gruppen serinproteaser, så som f.eks. faktor Ila, faktor Xlla, faktor Xla, faktor Xa, eller kallikrein, eller et derivat av disse proteaser.
14. Faktor X-analog ifølge et av kravene 1-11, karakterisert ved at modifikasjonen tillater en in vivo-aktivering av faktor X-analogen til nativ faktor Xa hhv. en faktor Xa-analog.
15. Faktor X-analog ifølge krav 14, karakterisert ved at modifikasjonen tillater en aktivering ved hjelp av en protease valgt fra gruppen serinproteaser, så som f.eks. faktor Xlla, faktor Xla, faktor Ila, faktor Xa, eller ved hjelp av kallikrein.
16. Faktor X-analog ifølge et av kravene 1 til 15, karakterisert ved at det foreligger som faktor X-analog med intakt p-peptid, eller som C-terminalt avkortet faktoranalog.
17. Faktor X-analog ifølge et av kravene 1 til 16, karakterisert ved at det foreligger som enkeltkjedet molekyl.
18. Rekombinant DNA som koder for en faktor X-analog ifølge et av kravene 1 til 17, som foreligger i en vektor for en rekombinant ekspresjon av det kodede protein.
19. Preparat som inneholder en renset faktor X-analog eller et forløperprotein derav med en modifikasjon i området av den naturlig forekommende faktor X-aktiveringsspalt-ningsposisjon med en Faktor X-sekvens Gly228-R6-R5-R4-R3-R2-Arg234-Rl, hvor modifikasjonen utgjør en prosesseringsposisjon for en protease som ikke naturlig spalter i dette område av faktor X-sekvensen a) RI er en aminosyre valgt fra gruppen Ile, Val, Ser, Thr eller Ala, b) R2 er en aminosyre valgt fra gruppen Pro, Gly, Lys eller Arg, c) R3 er en aminosyre valgt fra gruppen Phe, Lys, Met, Gin, Glu, Ser, Val, Arg eller Pro, d) R4 er en aminosyre valgt fra gruppen Asp, Ile, Ser, Met, Pro, Thr, Arg eller Lys, e) R5 er en aminosyre valgt fra gruppen Asn, Lys, Ser, Glu, Ala, Gin, His eller Arg, og f) R6 er en aminosyre valgt fra gruppen Asp, Phe, Thr, Arg, Leu eller Ser.
20. Preparat ifølge krav 19,
karakterisert ved at modifikasjonen utgjør en spaltningsposisjon for en protease valgt fra gruppen bibasiske endoproteaser, så som f.eks. kexin/Kex2, furin/- PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, serinproteaser, så som f.eks. faktor Ila, faktor Xlla, faktor Xla, faktor Xa, eller kallikrein.
21. Preparat ifølge et av kravene 19 eller 20, karakterisert ved at faktor X-analogen foreligger som FXa-analog.
22. Preparat ifølge et av kravene 19 eller 20, karakterisert ved at faktor X-analogen foreligger som C-terminalt avkortet faktor X-analog.
23. Preparat ifølge et av kravene 19 til 22, karakterisert ved at det inneholder faktor X-analog som enkeltkjedet molekyl i isolert form.
24. Preparat ifølge et av kravene 19 til 23, karakterisert ved at det inneholder en enkeltkjedet faktor X-analog i enzymatisk inaktiv form med en renhet på minst 80%, fortrinnsvis 90%, spesielt foretrukket 95%, og ingen inaktive, proteolytiske mellomprodukter av faktor X/Xa-analog.
25. Preparat ifølge et av kravene 19 til 24, karakterisert ved at det inneholder faktor X-analog som tokjedet molekyl i isolert form.
26. Preparat ifølge et av kravene 19 til 25, karakterisert ved at det inneholder en faktor X-analog som oppviser en modifikasjon som tillater en in vitro-aktivering av faktor X-analogen til nativ faktor Xa hhv. til en faktor Xa-analog.
27. Preparat ifølge et av kravene 19 til 26, karakterisert ved at det er formulert som farmasøytisk preparat.
28. Preparat ifølge et av kravene 19 til 27, karakterisert ved at det foreligger i en egnet anordning, fortrinnsvis en applikasjonsanordning, i kombinasjon med en protease valgt fra gruppen endoproteaser, så som f.eks. kexin/Kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, gruppen serinproteaser, så som f.eks. faktor Xlla, faktor Xla, faktor Xa, faktor Ila, eller kallikrein, eller et derivat av disse proteaser.
29. Preparat ifølge krav 28,
karakterisert ved at komponentene foreligger romslig atskilt fra hverandre.
30. Preparat ifølge et av kravene 19 til 25, karakterisert ved at det inneholder en faktor X-analog som oppviser en modifikasjon som tillater en in vivo-aktivering av faktor X-analog til nativ faktor Xa hhv. faktor Xa-analog.
31. Preparat ifølge krav 19,
karakterisert ved at det inneholder en faktor X-analog som spesielt er fritt for inaktive faktor X/Xa-analog-mellomprodukter og autoproteolytiske faktor X-spaltningsprodukter, som kan erholdes ved aktivering av en faktor X-analog ifølge et av kravene 1 til 18.
32. Preparat ifølge et av kravene 19 til 31, karakterisert ved at det inneholder en fysiologisk akseptabel bærer og foreligger i en lagerstabil form.
33. Preparat ifølge et av kravene 19 til 32, karakterisert ved at det eventuelt som ytterligere bestanddel inneholder en blodfaktor eller en aktivert form av en blodfaktor.
34. Preparat ifølge krav 33,
karakterisert ved at det som ytterligere bestanddel innholder minst én komponent med faktor VIII-bypassaktivitet.
35. Preparat ifølge et av kravene 19 til 34, karakterisert ved at det er formulert som farmasøytisk sammensetning og eventuelt foreligger som flerkomponentpreparat.
36. Anvendelse av et preparat ifølge et av kravene 19 til 35 ved fremstilling av et legemiddel med faktor X/Xa-aktivitet.
37. Anvendelse av en nukleinsyre ifølge krav 18 ved fremstilling av en faktor X-analog som er egnet som legemiddel med faktor X/Xa-aktivitet.
38. Fremgangsmåte ved fremstilling av et preparat ifølge krav 19-35 som inneholder renset rekombinant faktor X-analog,
karakterisert ved at en ved rekombinant fremstilling dannet faktor X-analog isoleres og renses ved en kromatografisk metode.
39. Fremgangsmåte ifølge krav 38, karakterisert ved at den omfatter de føl-gende trinn: - tilveiebringelse av en nukleinsyre ifølge krav 18, transformasjon av en egnet celle,
ekspresjon av en faktor X-analog,
eventuelt inkubasjon av faktor X-analogen med en pro
tease,
isolasjon av faktor X-analogen og - rensing av faktor X-analogen ved en kromatografisk metode.
40. Fremgangsmåte ifølge krav 39, karakterisert ved at faktor X-analogen isoleres som tokjedet molekyl.
41. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 38 til 40, karakterisert ved at den tokjedede faktor X-analog bringes i berøring med en protease valgt fra gruppen endoproteaser, så som f.eks. kexin/Kex2, furin/PACE, PCI/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, gruppen serinproteaser, så som f.eks. faktor Ila, faktor Xlla, faktor Xla, faktor Xa, eller kallikrein, eller et derivat av disse proteaser, under betingelser under hvilke faktor X-analogen spaltes til nativ faktor Xa eller en faktor Xa-analog.
42. Fremgangsmåte ifølge krav 41, karakterisert ved at cellen er en celle som ikke eksprimerer en protease som kan utføre en spaltning av den enkle kjede til en lett og en tung kjede av faktor X hhv. av en faktor X-analog, og eventuelt oppviser en mangel på protease.
43. Fremgangsmåte ifølge krav 42, karakterisert ved at cellen ikke eksprimerer noen endoproteaser, så som f.eks. kexin, furin, PACE eller et derivat derav.
44. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 42 eller 43, karakterisert ved at faktor X-analogen isoleres som enkeltkjedet molekyl.
45. Fremgangsmåte ifølge krav 44, karakterisert ved at enkeltkjedet, eventuelt isolert faktor X-analog bringes i berøring med en protease valgt fra gruppen endoproteaser, så som f.eks. kexin/Kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, eller et derivat av disse proteaser, under betingelser under hvilke enkeltkjedet faktor X-analog spaltes til den tokjedede faktor X-form.
46. Fremgangsmåte ifølge krav 45, karakterisert ved at en enkeltkjedet faktor X-analog eventuelt aktiveres direkte til faktor Xa hhv. faktor Xa-analog ved å bringes i berøring med proteasen.
47. Fremgangsmåte ifølge krav 45, karakterisert ved at tokjedet faktor X-analog bringes i berøring med en ytterligere protease som skiller seg fra det første, og aktiveres til en faktor Xa-analog eller nativ faktor Xa.
48. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 38 til 47, karakterisert ved at proteasen er immobilisert.
49. Fremgangsmåte ifølge krav 38 ved fremstilling av et preparat som inneholder aktiv faktor Xa hhv. faktor Xa-analog,
karakterisert ved at en faktor X-analog som er blitt fremstilt, underkastes et aktiveringstrinn.
50. Fremgangsmåte ifølge krav 49, karakterisert ved at det erholdes renset faktor Xa-analog eller nativ faktor Xa som spesielt er fri for inaktive faktor X/Xa-mellomprodukter.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AT0033597A AT405516B (de) | 1997-02-27 | 1997-02-27 | Faktor x-analoge mit modifizierter proteasespaltstelle |
| PCT/AT1998/000045 WO1998038317A1 (de) | 1997-02-27 | 1998-02-27 | Faktor x-analoge mit modifizierter proteasespaltstelle |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO994139D0 NO994139D0 (no) | 1999-08-26 |
| NO994139L NO994139L (no) | 1999-10-27 |
| NO327878B1 true NO327878B1 (no) | 2009-10-12 |
Family
ID=3487868
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO19994139A NO327878B1 (no) | 1997-02-27 | 1999-08-26 | Faktor X-analoger med modifiserte spaltningsseter for proteaser |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6573071B1 (no) |
| EP (1) | EP0966536B1 (no) |
| JP (1) | JP4317976B2 (no) |
| AR (1) | AR012034A1 (no) |
| AT (2) | AT405516B (no) |
| AU (1) | AU744428B2 (no) |
| BR (1) | BR9807627A (no) |
| CA (1) | CA2282707A1 (no) |
| CZ (1) | CZ298298B6 (no) |
| DE (1) | DE59813518D1 (no) |
| ES (1) | ES2263199T3 (no) |
| HU (1) | HU225246B1 (no) |
| IL (2) | IL131346A0 (no) |
| NO (1) | NO327878B1 (no) |
| PL (1) | PL190734B1 (no) |
| SK (1) | SK286359B6 (no) |
| WO (1) | WO1998038317A1 (no) |
Families Citing this family (46)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT405517B (de) * | 1997-02-27 | 1999-09-27 | Immuno Ag | Faktor x-deletionsmutanten und analoge davon |
| IL129427A0 (en) * | 1999-04-13 | 2000-02-17 | Yeda Res & Dev | Preparation of biologically active molecules |
| AT410216B (de) * | 1999-08-10 | 2003-03-25 | Baxter Ag | Faktor x-analogon mit verbesserter aktivierbarkeit |
| AU2001249389A1 (en) * | 2000-03-22 | 2001-10-03 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Modified blood clotting factors and methods of use |
| US7223577B2 (en) * | 2000-11-17 | 2007-05-29 | Allergan, Inc. | Post-translational modifications and Clostridial neurotoxins |
| FR2831170B1 (fr) * | 2001-10-19 | 2004-03-19 | Inst Nat Sante Rech Med | Proteines c modifiees activables directement par la thrombine |
| FR2841904B1 (fr) * | 2002-07-03 | 2004-08-20 | Inst Nat Sante Rech Med | Analogues de facteurs x clivables par la thrombine |
| WO2004033630A2 (en) * | 2002-10-04 | 2004-04-22 | Schering Aktiengesellschaft | Modified hepsin molecules having a substitute activation sequence and uses thereof |
| CA2592521A1 (en) * | 2004-08-17 | 2006-02-23 | Csl Behring Gmbh | Modified vitamin k dependent polypeptides |
| EP1728798A1 (en) * | 2005-06-01 | 2006-12-06 | ZLB Behring GmbH | Coagulation factor X polypeptides with modified activation properties |
| US7846445B2 (en) * | 2005-09-27 | 2010-12-07 | Amunix Operating, Inc. | Methods for production of unstructured recombinant polymers and uses thereof |
| US7855279B2 (en) * | 2005-09-27 | 2010-12-21 | Amunix Operating, Inc. | Unstructured recombinant polymers and uses thereof |
| MX336958B (es) * | 2005-11-15 | 2016-02-05 | Philadelphia Children Hospital | Metodos y composiciones para modular la hemostasia. |
| EP1820508A1 (en) * | 2006-02-21 | 2007-08-22 | CSL Behring GmbH | Coagulation factor X polypeptides with modified activation properties |
| ATE548380T1 (de) | 2006-04-20 | 2012-03-15 | Kringle Pharma Inc | Mutante des hgf-precursor-proteins und aktivierte form davon |
| GB0710321D0 (en) * | 2007-05-30 | 2007-07-11 | Nhs Blood & Transplant | Method |
| US9956272B2 (en) | 2007-05-30 | 2018-05-01 | Bio Products Laboratory Limited | Methods for preparing factor X, activated factor X, inactivated factor X and inactivated factor Xa, and pharmaceutical compositions comprising same |
| EP2185701A4 (en) * | 2007-08-15 | 2011-03-02 | Amunix Operating Inc | COMPOSITIONS AND METHODS FOR ENHANCING THE PRODUCTION OF RECOMBINANT POLYPEPTIDES |
| LT3078743T (lt) | 2007-09-28 | 2020-09-25 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Antikūnai xa veiksnio inhibitoriams ir jų naudojimo būdai |
| JP5709316B2 (ja) * | 2008-11-14 | 2015-04-30 | ポートラ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド | 第Ｘａ因子阻害剤のための解毒剤および血液凝固剤と組み合わせて該解毒剤を使用する方法 |
| US8680050B2 (en) * | 2009-02-03 | 2014-03-25 | Amunix Operating Inc. | Growth hormone polypeptides fused to extended recombinant polypeptides and methods of making and using same |
| US8703717B2 (en) | 2009-02-03 | 2014-04-22 | Amunix Operating Inc. | Growth hormone polypeptides and methods of making and using same |
| EA020843B1 (ru) | 2009-02-03 | 2015-02-27 | Амуникс Оперейтинг Инк. | Удлиненные рекомбинантные полипептиды и содержащие их композиции |
| EP2414517B1 (en) | 2009-03-30 | 2016-09-21 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Antidotes for factor xa inhibitors and methods of using the same |
| US9849188B2 (en) | 2009-06-08 | 2017-12-26 | Amunix Operating Inc. | Growth hormone polypeptides and methods of making and using same |
| ES2705249T3 (es) | 2009-06-08 | 2019-03-22 | Amunix Operating Inc | Polipéptidos reguladores de glucosa y métodos para su producción y uso |
| CA2767858C (en) | 2009-07-15 | 2019-02-12 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Unit dose formulation of antidotes for factor xa inhibitors and methods of using the same |
| CA2772051C (en) * | 2009-08-24 | 2020-08-18 | Amunix Operating Inc. | Coagulation factor ix compositions and methods of making and using same |
| US8557961B2 (en) | 2010-04-02 | 2013-10-15 | Amunix Operating Inc. | Alpha 1-antitrypsin compositions and methods of making and using same |
| WO2013049804A1 (en) * | 2011-09-30 | 2013-04-04 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Compositions and methods for modulating hemostasis |
| EP3549953A1 (en) | 2012-02-15 | 2019-10-09 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Recombinant factor viii proteins |
| EP2814840B1 (en) | 2012-02-15 | 2019-11-13 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Factor viii compositions and methods of making and using same |
| EP2819788B1 (en) | 2012-02-27 | 2018-08-22 | Amunix Operating Inc. | Xten conjugate compositions and methods of making same |
| GB201211617D0 (en) | 2012-06-29 | 2012-08-15 | Univ Aberdeen | Production of cyclic peptides |
| WO2014018120A1 (en) | 2012-07-25 | 2014-01-30 | Catalyst Biosciences, Inc. | Modified factor x polypeptides and uses thereof |
| US20150343034A1 (en) | 2013-01-31 | 2015-12-03 | Pfizer Inc. | Compositions and methods for counteracting factor xa inhibition |
| FR3001729B1 (fr) * | 2013-02-04 | 2015-03-06 | Lab Francais Du Fractionnement | Mutants du facteur x |
| CN105008530A (zh) * | 2013-03-12 | 2015-10-28 | 诺和诺德股份有限公司 | 凝血酶敏感性凝固因子x分子 |
| US10548953B2 (en) | 2013-08-14 | 2020-02-04 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Factor VIII-XTEN fusions and uses thereof |
| MY173548A (en) | 2013-09-24 | 2020-02-04 | Pfizer | Fxa variant compositions |
| RU2585532C2 (ru) * | 2014-01-31 | 2016-05-27 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук"(ФИЦ Биотехнологии РАН) | Плазмида для экспрессии рекомбинантного фактора свёртываемости крови ix человека, клетка сно - продуцент рекомбинантного фактора свёртываемости крови ix человека и способ получения указанного фактора |
| US10676731B2 (en) | 2014-08-19 | 2020-06-09 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Compositions and methods for modulating factor IX function |
| WO2017024060A1 (en) | 2015-08-03 | 2017-02-09 | Biogen Ma Inc. | Factor ix fusion proteins and methods of making and using same |
| EP3341009A4 (en) | 2015-08-28 | 2019-05-01 | Amunix Pharmaceuticals, Inc. | CHIMERIC POLYPEPTIDE ASSEMBLY AND METHODS OF PREPARING AND USING THE SAME |
| TW202015723A (zh) | 2018-05-18 | 2020-05-01 | 美商百歐維拉提夫治療公司 | 治療ａ型血友病的方法 |
| KR102613936B1 (ko) * | 2020-11-13 | 2023-12-15 | 한국생명공학연구원 | 자가분해능이 저하된 켁신 효소 및 이의 생산 방법 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT366916B (de) | 1980-04-02 | 1982-05-25 | Immuno Ag | Vorrichtung zur applikation eines gewebeklebstoffes auf basis von menschlichen oder tierischenproteinen |
| US4501731A (en) | 1983-06-27 | 1985-02-26 | Tishkoff Garson H | Treatment of disparate bleeding disorders with factor X zymogen |
| AT382783B (de) | 1985-06-20 | 1987-04-10 | Immuno Ag | Vorrichtung zur applikation eines gewebeklebstoffes |
| US5597799A (en) | 1990-09-04 | 1997-01-28 | Cor Therapeutics, Inc. | Recombinant agents affecting thrombosis |
| ES2109336T3 (es) | 1990-11-26 | 1998-01-16 | Genetics Inst | Expresion de pace en celulas huesped y metodos de utilizacion de la misma. |
| US5621039A (en) | 1993-06-08 | 1997-04-15 | Hallahan; Terrence W. | Factor IX- polymeric conjugates |
| DE4325872C1 (de) | 1993-08-02 | 1994-08-04 | Immuno Ag | Virusinaktivierte Faktor Xa-Präparation |
| AT401270B (de) | 1994-09-26 | 1996-07-25 | Immuno Ag | Verfahren zur quantifizierung von genomischer dna |
| AT404838B (de) | 1995-11-24 | 1999-03-25 | Immuno Ag | Herstellung von proteinen aus pro-proteinen durch fusionsproteine abgeleitet von furin oder furinanalogen |
| AT405517B (de) | 1997-02-27 | 1999-09-27 | Immuno Ag | Faktor x-deletionsmutanten und analoge davon |
-
1997
- 1997-02-27 AT AT0033597A patent/AT405516B/de not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-02-25 AR ARP980100832A patent/AR012034A1/es not_active Application Discontinuation
- 1998-02-27 EP EP98903943A patent/EP0966536B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-27 SK SK1171-99A patent/SK286359B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1998-02-27 PL PL98335382A patent/PL190734B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1998-02-27 ES ES98903943T patent/ES2263199T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-27 HU HU0100652A patent/HU225246B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1998-02-27 BR BR9807627-2A patent/BR9807627A/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-02-27 JP JP53706298A patent/JP4317976B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-27 IL IL13134698A patent/IL131346A0/xx active IP Right Grant
- 1998-02-27 US US09/367,791 patent/US6573071B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-27 CZ CZ0303299A patent/CZ298298B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-02-27 CA CA002282707A patent/CA2282707A1/en not_active Abandoned
- 1998-02-27 DE DE59813518T patent/DE59813518D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-27 AT AT98903943T patent/ATE324454T1/de active
- 1998-02-27 WO PCT/AT1998/000045 patent/WO1998038317A1/de active IP Right Grant
- 1998-02-27 AU AU62002/98A patent/AU744428B2/en not_active Ceased
-
1999
- 1999-08-10 IL IL131346A patent/IL131346A/en not_active IP Right Cessation
- 1999-08-26 NO NO19994139A patent/NO327878B1/no not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-04-04 US US10/407,123 patent/US7220569B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6573071B1 (en) | 2003-06-03 |
| NO994139D0 (no) | 1999-08-26 |
| PL190734B1 (pl) | 2005-12-30 |
| IL131346A0 (en) | 2001-01-28 |
| HU225246B1 (en) | 2006-08-28 |
| AU744428B2 (en) | 2002-02-21 |
| BR9807627A (pt) | 2000-02-22 |
| EP0966536A1 (de) | 1999-12-29 |
| CA2282707A1 (en) | 1998-09-03 |
| AT405516B (de) | 1999-09-27 |
| DE59813518D1 (de) | 2006-06-01 |
| ATA33597A (de) | 1999-01-15 |
| NO994139L (no) | 1999-10-27 |
| EP0966536B1 (de) | 2006-04-26 |
| US7220569B2 (en) | 2007-05-22 |
| ES2263199T3 (es) | 2006-12-01 |
| AU6200298A (en) | 1998-09-18 |
| CZ303299A3 (cs) | 2000-02-16 |
| PL335382A1 (en) | 2000-04-25 |
| CZ298298B6 (cs) | 2007-08-22 |
| IL131346A (en) | 2007-05-15 |
| JP4317976B2 (ja) | 2009-08-19 |
| ATE324454T1 (de) | 2006-05-15 |
| HUP0100652A3 (en) | 2003-01-28 |
| HUP0100652A1 (hu) | 2001-06-28 |
| WO1998038317A1 (de) | 1998-09-03 |
| JP2001513631A (ja) | 2001-09-04 |
| US20030181381A1 (en) | 2003-09-25 |
| SK286359B6 (sk) | 2008-08-05 |
| SK117199A3 (en) | 2000-05-16 |
| AR012034A1 (es) | 2000-09-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO327878B1 (no) | Faktor X-analoger med modifiserte spaltningsseter for proteaser | |
| NO328022B1 (no) | Faktor XΔ-analog, rekombinant DNA som koder for denne, celler inneholdende slikt DNA samt preparat, anvendelse av preparatet og fremgangsmate for fremstilling av slike preparater inneholdende XΔ-analogene | |
| US9249404B2 (en) | Coagulation factor X polypeptides with modified activation properties | |
| US6958322B1 (en) | Factor X analog with an improved ability to be activated | |
| MXPA99007817A (en) | Factor x deletion mutants and analogues thereof | |
| MXPA99007768A (en) | Factor x analogues with a modified protease cleavage site |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |