ES2302696T3 - Analogo de factor x con mejor capacidad de activacion. - Google Patents
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Abstract
Análogo de Factor X que contiene una modificación entre Glu226 e Ile235, con respecto a la numeración de aminoácidos según la Figura 1, caracterizado porque contiene una secuencia de factor X con Glu226-R8-R7-R6-R5- R4-R3-R2-Arg234-R1 donde a) R1 es Ile; b) R2 es Thr; c) R3 es Phe; d) R4 es Asp; e) R5 es Asn; f) R6 es Phe; g) R7 es Ser y h) R8 es Gln.
Description
Análogo de factor X con mejor capacidad de
activación.
La presente invención se refiere a análogos de
factor X con una capacidad incrementada para ser activados por
medio de una sustitución en la región del péptido de activación, a
una preparación que contiene los análogos de factor X de acuerdo
con la presente invención y a un método para la producción de
análogos de factor X de cadena única y de doble cadena.
Una vez iniciado el proceso de coagulación
sanguíneo, la cascada de coagulación pasa por las etapas de activar
secuencialmente varias proenzimas (zimógenos) sanguíneas en sus
formas activas, las serina-proteasas. Estas
incluyen, entre otras, el factor XII/XIIa, factor XI/XIa, factor
IX/IXa, factor X/Xa, factor VII/VIIa y protrombina/trombina. La
mayoría de estas enzimas están activas en estado fisiológico
solamente cuando están asociadas a un complejo sobre una superficie
de membrana. Los iones Ca están implicados en muchos de estos
procesos. La coagulación sanguínea sigue tanto la vía intrínseca,
en cuyo caso todos los componentes proteicos están presentes en la
sangre, como la vía extrínseca, en la cual el factor tisular de la
membrana celular desempeña un papel crítico. Finalmente, el cierre
de la herida se produce como resultado de la conversión del
fibrinógeno en fibrina mediante la acción de la
trombina.
trombina.
El complejo protrombinasa es el responsable de
la activación de la protrombina para formar trombina. La trombina
es una enzima importante que puede actuar tanto como procoagulante
como anticoagulante. El complejo protrombinasa, en el que, entre
otros, participan el factor Va (como cofactor) y el factor Xa (como
serina-proteasa), se reúne en una asociación
dependiente del Ca en la superficie de los fosfolípidos. Se supone
que el componente catalítico del complejo protrombinasa es el
factor Xa.
El factor X (también denominado factor de
Stuart-Prower o factor de Prower) es una
glicoproteína de coagulación dependiente de la vitamina K que
participa en la cascada intrínseca y en la extrínseca de la
coagulación sanguínea. El producto primario de traducción del
factor X (pre-pro-FX) contiene 488
aminoácidos y es sintetizado en el hígado por las células de
hepatoma humano en primer lugar como proteína precursora de cadena
única de 75 kD. En el plasma, el factor X está presente
principalmente como molécula de doble cadena (Fair y col., Blood 64
(1984), pp. 194-204).
Durante la biosíntesis, después de la
segmentación de la presecuencia por una peptidasa señal (entre Ser23
y Leu24) y el propéptido (entre Arg40 y Ala41), la molécula de
factor X de cadena única es segmentada mediante el procesamiento y
la deleción del tripéptido
Arg180-Lys181-Arg182 en la forma de
cadena doble, que comprende una cadena ligera de aproximadamente 22
kD y una cadena pesada de aproximadamente 50 kD, estando conectadas
ambas cadenas por medio de un puente disulfuro (Figura 1). Por
tanto, el factor X circula en el plasma como molécula de doble
cadena.
Durante el proceso de coagulación sanguínea, el
factor X se convierte desde el zimógeno inactivo en factor Xa
proteasa activa mediante una acción proteolítica limitada, durante
la cual la activación del factor X para formar el Factor Xa puede
tener lugar en uno de los 2 complejos unidos a membrana: el complejo
factor VIIa extrínseco/factor tisular o el complejo Ca fosfolípido
factor VIIIa intrínseco/factor IXa, el denominado "complejo
tenasa" (Mertens y col., Biochem. J. 185 (1980), pp.
647-658). La segmentación proteolítica entre los
aminoácidos Arg234 e Ile235 conduce a la liberación de un péptido
de activación de 52 aminoácidos de longitud desde el extremo
N-terminal de la cadena pesada y, por tanto, a la
formación de la enzima activa, factor Xa. El centro catalítico del
factor Xa está localizado en la cadena pesada.
La activación vía el complejo factor
VIIa-TF (extrínseco) conduce a la formación del
factor Xa\alpha (35 kD) y del factor Xa\beta (31 kD), y, cuando
las concentraciones de factor VIIa en el complejo son bajas,
también está presente un polipéptido de 42 kD.
La formación del factor Xa\alpha tiene lugar
vía una segmentación en Arg234/Ile235 de la cadena pesada y
representa la activación del factor X para formar el factor Xa. La
presencia del factor Xa\beta probablemente es resultado de una
segmentación autocatalítica en Arg469/Gly470 en el extremo
C-terminal de la cadena pesada del factor
Xa\alpha y de la segmentación de un péptido de 4,5 kD. Como el
factor Xa\alpha, el factor Xa\beta tiene también actividad
catalítica. Se ha demostrado, sin embargo, que durante la
segmentación del factor Xa\alpha para formar Xa\beta, se forma
un sitio de unión con el receptor plasminógeno y que el factor
Xa\beta puede tener también actividad fibrinolítica y puede
participar como cofactor en la fibrinolisis. La conversión del
factor Xa\alpha en el factor Xa\beta, sin embargo, continúa más
lentamente que la formación de trombina, a consecuencia de lo cual
se impide la iniciación de la fibrinolisis antes de la formación de
un coágulo de sangre (Pryzdial y col., J. Biol. Chem. 271 (1996),
pp. 16614-16620; Pryzdial y col., J. Biol. Chem.
271 (1996), pp. 16621-16626).
El polipéptido de 42 kD es resultado de un
procesamiento en el extremo C-terminal de la cadena
pesada entre Arg426 y Gly470 sin procesamiento previo entre Arg234
e Ile235. De forma similiar a un fragmento de factor Xa\gamma,
este intermedio que se forma como consecuencia de la proteolisis en
Lys370 tampoco tiene actividad catalítica (Mertens y col., Biochem.
J. 185 (1980), pp. 647-658; Pryzdial y col., J.
Biol. Chem. 271 (1996), pp. 16614-16620).
La activación del factor X en la ruta intrínseca
es catalizada por el complejo factor IXa-factor
VIIIa. Durante la activación, se obtienen los mismos productos de
proceso, pero el producto del factor Xa\beta se obtiene con un
rendimiento mayor que otros productos de proceso del factor X (Jesty
y col., J. Biol. Chem. 249 (1974), p. 5614).
In vitro, el factor X se puede activar,
por ejemplo, por medio del Veneno de Víbora de Russell (RVV) o de
tripsina (Bajaj y col., J. Biol. Chem. 248, (1973), pp.
7729-7741) o mediante activadores fisiológicos
purificados, tales como el complejo FVIIa/TF o el complejo factor
IXa/factor VIIIa (Mertens y col., Biochem. J. 185 (1980), pp.
647-
658).
658).
En la mayoría de los casos, los productos de
factor X comerciales de plasma contienen una mezcla de factor
Xa\alpha y factor Xa\beta, ya que después de la activación del
factor X para formar el factor Xa, principalmente se forma el
factor Xa\alpha, el cual, a su vez, es segmentado en un proceso
autocatalítico para formar el factor Xa\beta.
Para conseguir un producto uniforme de factor Xa
con una alta integridad molecular, la EP 0 651 054 propuso que el
factor X fuera activado durante un período de tiempo relativamente
largo con RVV, con el resultado de que el producto final resultante
contenía principalmente factor Xa\beta. Ambos subproductos, por
ejemplo, el factor Xa\alpha, y la proteasa fueron eliminados
posteriormente en varios pasos cromatográficos.
Se aisló y caracterizó el cADN para el factor X
(Leytus y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1984), pp.
3699-3702; Fung y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
82 (1985), pp. 3591-3595). Se expresó el factor X
humano in vitro en diversos tipos celulares, tales como
células embrionarias de riñón humano o células CHO (Wolf y col., J.
Biol. Chem. 266 (1991), pp. 13726-13730). Se
descubrió, sin embargo, que en la expresión recombinante del factor
X humano, contrariamente a la situación in vivo, el
procesamiento en la posición Arg 40/Ala41 era ineficaz y que se
formaban distintos N-terminales en la cadena ligera
del factor X (Wolf y col., J. Biol Chem. 266 (1991), pp.
13726-13730). In vitro, el factor X
recombinante (rFX) se activó por medio de RVV para formar el factor
Xa recombinante (rFXa) o se expresó directamente el rFXa, durante lo
cual se suprimió el péptido de activación del aminoácido 183 al
aminoácido 234 y se sustituyó por un tripéptido para permitir el
procesamiento directo en una forma rFXa de doble cadena. Se procesó
aproximadamente el 70% de rFX purificado para formar una cadena
ligera y pesada y el 30% restante constituyó el rFX de cadena única
de 75 kD. Aunque la expresión directa o el rFXa condujera realmente
a la formación del factor Xa activo, condujo también a intermedios
inactivos. Además, Wolf y col., (J. Biol. Chem. 266 (1991), pp.
13726-13730) observaron también una disminución de
la actividad del factor X recombinante, lo que atribuyeron a la
menor capacidad de activación de rFX mediante RVV y a la población
inactiva de proteínas y polipéptidos de la molécula precursora de
cadena única. En particular, descubrieron que el rFXa, cuando es
expresado por células recombinantes, es muy inestable, lo que
atribuyeron a la alta proporción de autoproteolisis.
La WO 98/38317 describe análogos de factor X en
los que pueden modificarse los aminoácidos entre Glu228 y Arg234, a
consecuencia de lo cual estos constructos pueden activarse, por
ejemplo, mediante proteasas como furina.
Para estudiar la función del péptido
C-terminal del factor Xa\alpha, Eby y col., (Blood
80 (Suppl. 1) (1992), pp. 1214 A) introdujeron un codón de parada
en la posición Gly430 de la secuencia del factor X. Sin embargo, no
encontraron diferencia entre la velocidad de activación del factor
Xa (FXa\alpha) con un \beta-péptido y un
mutante por deleción sin un \beta-péptido
(FXa\beta).
El factor Xa es un componente importante del
complejo protrombinasa y por ello se utiliza para interrumpir
rápidamente el sangrado, así como en pacientes con trastornos de la
coagulación sanguínea, por ejemplo con hemofilia. Especialmente en
el tratamiento de pacientes que padecen hemofilia, la cual se
caracteriza por una deficiencia de factor VIII o de factor IX, con
concentrados de factor que se producen a partir de plasma, con
frecuencia surge la complicación de que se forman anticuerpos
inhibidores de estos factores. Por ello se han desarrollado
múltiples alternativas para tratar pacientes que padecen hemofilia
con factores con una actividad bypass. Así, por ejemplo, se ha
propuesto la utilización uso de un concentrado de complejo
protrombina, de un complejo protrombinasa parcialmente activado
(APPC), factor VIIa, o FEIBA. Las preparaciones comerciales con
actividad bypass inhibidora de factor VIII incluyen, por ejemplo,
FEIBA® o Autoplex®. FEIBA, por ejemplo, contiene unidades
comparables de factor II, factor VII, factor IX, factor X y FEIBA,
pequeñas cantidades de factor VIII y factor V y trazas de factores
de coagulación activados, tales como trombina y factor Xa y/o un
factor con actividad análoga a la del factor Xa (Elsinger, Activated
Prothrombin Complex Concentrates. Eds. Mariani, Russo, Mandelli
(1982), pp. 77-87). Elsinger recalca especialmente
la importancia de una actividad "análoga a la del factor Xa"
en FEIBA. La actividad bypass inhibidora del factor VIII fue
demostrada por Giles y col., (British J. Hematology 9 (1988), pp.
491-497) en un modelo animal, en particular para una
combinación de factor Xa purificado y fosfolípidos.
Por tanto, existe una necesidad notable y una
diversidad de distintos campos de aplicación para el factor X/Xa o
para proteínas análogas al factor X/Xa, bien sea por sí mismas o
como componentes de un complejo de coagulación en la terapia
hemostática. En comparación con la vida media del zimógeno, la vida
media del factor Xa se reduce considerablemente tanto in
vivo como in vitro. Así, por ejemplo, el factor X se
puede almacenar de forma estable en glicerol durante 18 meses,
mientras que, en las mismas condiciones, el factor Xa es estable
solamente durante 5 meses (Bajaj y col., J. Biol. Chem. 248 (1973),
pp. 7729-2241), o, cuando se almacena en glicerol a
4ºC durante 8 meses, muestra una reducción de la actividad en más
del 60% (Teng y col., Thrombosis Res. 22 (1981), pp.
213-220). En suero, la vida media del factor Xa es
solamente de 30 segundos.
Debido a la inestabilidad del factor Xa, se ha
propuesto que se administren preparaciones de factor X (US
4.501.731). Sin embargo, en casos donde el sangrado amenaza la vida, en particular en pacientes que padecen de hemofilia, la administración de factor X no produce efecto, ya que, debido a la falta de "complejo tenasa" funcional, no es posible que se produzca una activación eficaz del factor X en factor Xa en la vía intrínseca de coagulación sanguínea y ya que una activación por medio de la vía extrínseca a menudo es demasiado lenta para tener un efecto rápido. Además, los pacientes que padecen de hemofilia tienen un suministro suficiente de factor X; sin embargo, en comparación con el factor Xa, el factor X tiene una actividad protrombinasa 1.000 veces menor. En casos de este tipo, el factor Xa activado debe ser administrado de forma directa, posiblemente en combinación con fosfolípidos, tal como se describe en Giles y col. (British J. Haematology 9 (1988), pp. 491-497), o con otros factores de coagulación, por ejemplo, con la actividad bypass inhibidora del factor VIII. Himmelspach y col., Thrombosis and Haemostasis, 1999, página 758, describen diversos derivados de factor X recombinante en los que se sustituyen los residuos que preceden directamente al sitio de segmentación de la activación y conservan la activabilidad por el factor VII/TF, pero han adquirido la predisposición a la segmentación del factor XIa (véase el resumen). Además, la WO 98/38317 describe análogos de factor X que tienen una modificación en la zona del sitio de segmentación de activación del factor Xa de origen natural, representando dicha modificación un sito de procesamiento de una proteasa que no se segmenta de forma natural en esta zona de la secuencia de factor X (véase el resumen).
4.501.731). Sin embargo, en casos donde el sangrado amenaza la vida, en particular en pacientes que padecen de hemofilia, la administración de factor X no produce efecto, ya que, debido a la falta de "complejo tenasa" funcional, no es posible que se produzca una activación eficaz del factor X en factor Xa en la vía intrínseca de coagulación sanguínea y ya que una activación por medio de la vía extrínseca a menudo es demasiado lenta para tener un efecto rápido. Además, los pacientes que padecen de hemofilia tienen un suministro suficiente de factor X; sin embargo, en comparación con el factor Xa, el factor X tiene una actividad protrombinasa 1.000 veces menor. En casos de este tipo, el factor Xa activado debe ser administrado de forma directa, posiblemente en combinación con fosfolípidos, tal como se describe en Giles y col. (British J. Haematology 9 (1988), pp. 491-497), o con otros factores de coagulación, por ejemplo, con la actividad bypass inhibidora del factor VIII. Himmelspach y col., Thrombosis and Haemostasis, 1999, página 758, describen diversos derivados de factor X recombinante en los que se sustituyen los residuos que preceden directamente al sitio de segmentación de la activación y conservan la activabilidad por el factor VII/TF, pero han adquirido la predisposición a la segmentación del factor XIa (véase el resumen). Además, la WO 98/38317 describe análogos de factor X que tienen una modificación en la zona del sitio de segmentación de activación del factor Xa de origen natural, representando dicha modificación un sito de procesamiento de una proteasa que no se segmenta de forma natural en esta zona de la secuencia de factor X (véase el resumen).
Hasta ahora, en la producción del factor Xa a
partir del factor X, la activación se ha desencadenado
principalmente por medio de activadores no fisiológicos de origen
animal, tales como RVV o tripsina, pero esto significa que se ha de
tener cuidado en asegurar con absoluta certeza que el producto final
esté totalmente libre de estas proteasas. Tal como se ha mencionado
anteriormente, durante la activación del factor X en factor Xa, se
forma una gran cantidad de intermedios inactivos (Bajaj y col., J.
Biol. Chem. 248 (1973), pp. 7729-7741, Mertens y
col., Biochem. J. 185 (1980), pp. 647-658). La
presencia de estos intermedios conduce a una disminución de la
actividad específica del producto y potencialmente incluso al tipo
de intermedios que pueden servir de antagonistas de la
serina-proteasa activa. Así, para producir un
producto uniforme, puro, con alta actividad específica, por medio
de métodos convencionales, se necesitan procedimientos que llevan
tiempo y son complicados para activar y llevar a cabo la
purificación cromatográfica.
La presente invención proporciona una
preparación que contiene un polipéptido con la actividad del factor
X/Xa, que, en comparación con la técnica anterior, puede ser
activado más fácilmente por el factor XIa o por un derivado del
mismo, presentando una alta estabilidad, y que puede ser activado
por medio del factor XIa o por un derivado del mismo, sin tener que
utilizar una de las proteasas empleadas en la técnica anterior para
activar el factor X natural, particularmente una de origen animal,
tal como RVV o tripsina. Otro objetivo de la presente invención
consiste en conseguir una preparación farmacéutica con actividad
bypass inhibidora del factor VIII.
Figura 1: muestra la secuencia de nucleótidos y
aminoácidos del factor X (Seq. ID NO. 1 y 2).
Figura 2: representación esquemática del análogo
de factor X con un sitio de corte proteasa modificado en la región
del péptido de activación.
Figura 3: muestra un análisis Western Blot del
factor X recombinante expresado en células CHO.
Figura 4: muestra un análisis Western Blot
después de la activación in vitro del análogo de factor X con
el factor XIa.
Figura 5: muestra la purificación del rfX/rFXIa
(Q-R/I) por cromatografía de intercambio
aniónico.
La presente invención proporciona un análogo de
Factor X con una modificación en la región de los residuos de
aminoácidos 226-235 con referencia a la secuencia
mostrada en la Figura 1, caracterizado porque contiene una
secuencia de factor X con
Glu226-R8-R7-R6-R5-R4-R3-R2-Arg234-R1,
donde
- a)
- R1 es Ile;
- b)
- R2 es Thr;
- c)
- R3 es Phe;
- d)
- R4 es Asp;
- e)
- R5 es Asn;
- f)
- R6 es Phe;
- g)
- R7 es Ser y
- h)
- R8 es Gln.
Aquí, el término "modificación" se refiere
a una mutación, deleción, inserción o sustitución de un residuo de
aminoácido dentro de la secuencia designada. El término
"sustitución" se refiere a la sustitución de un residuo de
aminoácido por un residuo de aminoácido diferente dentro del
polipéptido. El término "deleción" se refiere a la ausencia de
al menos uno de los residuos de aminoácido dentro del polipéptido,
sin sustitución por otro residuo de aminoácido. El término
"inserción" se refiere a la colocación de un residuo de
aminoácido extra dentro del polipéptido. El término "mutación"
se refiere a cualquier cambio en la secuencia del polinucleótido o
del polipéptido designado, cambio que puede ser una deleción, una
inserción o una sustitución de uno o más ácidos nucleicos o
aminoácidos dentro de la secuencia designada de ácidos nucleicos o
aminoácidos. Preferentemente, en la presente invención, la
modificación es una sustitución de al menos un aminoácido.
La modificación del aminoácido en esta región
crea un nuevo sitio de reconocimiento y procesamiento para el
factor XIa o para un derivado del mismo, sitio que no es de origen
natural en esta posición en el polipéptido. El factor XIa o un
derivado del mismo no segmenta normalmente Fx en la región de
Glu-Arg-Gly-Asp-Asn-Asp-Phe-Thr-Arg/Ile
de los aminoácidos 226-234. Sorprendentemente, el
análogo de factor X de acuerdo con la presente invención tiene una
mayor capacidad, al menos 2 veces superior, preferentemente al menos
5 veces superior y especialmente al menos 10 veces superior, para
ser activado por el factor XIa en comparación con el análogo de
factor X según la WO 98/38317.
Además, fue sorprendente descubrir que el
análogo de factor X de acuerdo con la presente invención, a una
concentración de antígenos de 4-8 \mug/ml, es
capaz de reducir el tiempo de coagulación de plasma deficiente en
factor IX o FVIII de forma más eficaz que > 200 mU,
preferentemente > 500 mU, especialmente > 1.000 mU del factor
plasmático IX o FVIII.
La modificación se selecciona para garantizar
que el procesamiento por medio del factor XIa conduce a un
polipéptido que corresponde al factor natural Xa y que se parece
esencialmente a la secuencia del factor Xa de origen natural y que
tiene también la actividad del factor Xa.
Preferentemente, el aminoácido isoleucina del
NH_{2}-terminal de la cadena pesada debe
mantenerse después de la activación, ya que este aminoácido
desempeña un papel importante en la formación del bolsillo de unión
al sustrato (Watzke y col. (1995), Molecular Basis of Thrombosis and
Hemostasis, eds. Katherine High and Harold Roberts). En comparación
con la secuencia del factor X natural, los análogos de factor X de
acuerdo con la presente invención son estructuralmente diferentes,
en particular a nivel de aminoácidos, pero su capacidad para ser
activados es comparable con el factor X de origen natural y, después
de la activación, tienen actividad de factor Xa.
La invención permite disponer de análogos de
factor X que están modificados en el péptido de activación en
comparación con la secuencia de factor X de origen natural y que
tienen una especificidad de proteasa modificada. Las modificaciones
de los aminoácidos pueden tener lugar en la posición Ile235 (R1),
Arg234, Thr233 (R2), Leu232 (R3), Asn231 (R4), Asn230 (R5), Asp229
(R6), Gly228 (R7) y Arg229 (R8), mientras que Arg234, sin embargo,
permanece preferentemente sin cambios.
Los análogos de factor X de acuerdo con la
presente invención tienen una secuencia de factor X con
Glu226-R8-R7-R6-R5-R4-R3-R2-Arg234-R1,
donde
- a)
- R1 es Ile;
- b)
- R2 es Thr;
- c)
- R3 es Phe;
- d)
- R4 es Asp;
- e)
- R5 es Asn;
- f)
- R6 es Phe;
- g)
- R7 es Ser; y
- h)
- R8 es Gln.
Preferentemente, las secuencias de aminoácidos
son del tipo que corresponde a las secuencias de aminoácidos del
péptido de activación del factor IX. Estas secuencias pueden
corresponder a las regiones del péptido de activación del factor IX
humano, pero también animal (por ejemplo murino, porcino, etc.).
Las modificaciones pueden llevarse a cabo, por
ejemplo, por mutagénesis in vitro específica del sitio o por
PCR o por cualquier otro método de ingeniería genética conocido en
la técnica anterior que sea adecuado para cambiar específicamente
una secuencia de ADN con el fin de llevar a cabo intercambios
específicos de aminoácidos.
De acuerdo con la presente invención, la
activación del análogo de factor X de acuerdo con la presente
invención para formar un factor Xa natural o un análogo de factor
Xa se lleva a cabo por medio del factor XIa o un derivado del
mismo.
Una de las dificultades encontradas en la
producción del factor Xa activo es su inestabilidad, ya que, además
del factor Xa\alpha, como resultado de la autocatálisis se forman
factor Xa\beta y otros intermedios, algunos posiblemente
inactivos.
Por tanto, para producir el factor X/Xa activo
sustancialmente intacto y/o moléculas similares al factor X/Xa,
sería deseable obtener solamente proteínas que llevan a productos
finales estables.
Es conocido que un sitio de segmentación
preferente para procesar el factor Xa\alpha (FXa\alpha) para
formar el factor Xa\beta (FXa\beta) se localiza entre Arg469 y
Gly470. Según los estudios de Eby y col. (Blood, Vol. 80, Suppl. 1
(1992), p. 1214), además de un péptido carboxi terminal prominente
(residuos de aminoácidos 476-487) de factor X, se
encuentra un péptido adicional más corto (residuos de aminoácidos
474 a 477), que se forma como consecuencia de la autocatálisis del
factor Xa\alpha. Para concentrarse en el procesamiento específico
del factor X intacto para formar el factor Xa activo sin obtener
intermedios inactivos de procesamiento, los análogos de factor X de
acuerdo con la presente invención tienen otras modificaciones.
Así, de acuerdo con una realización especial de
esta invención, el análogo de factor X de acuerdo con la presente
invención se modifica además en la región C-terminal
de la secuencia de aminoácidos de factor X.
De acuerdo con una realización de la presente
invención, un análogo de factor X del tipo descrito anteriormente
contiene un péptido-\beta intacto (FX\alpha).
Aquí, el término "péptido-\beta" se refiere a
un glicopéptido de 4 kD tal como se conoce de la técnica anterior.
El primer sitio de segmentación para la eliminación del
péptido-\beta por el plásmido se localiza en
Arg469 según la secuencia de aminoácidos de la Fig. 1, lo que
resulta en la eliminación del extremo C-terminal
completo, es decir, el péptido-\beta (Pryzdial E.
y Kessler G., J. Biol. Chem., 1996, pp.
16614-16620). En particular, el análogo de factor X
según la presente invención tiene una modificación en la región del
sitio de segmentación del péptido-\beta
C-terminal que garantiza que la segmentación del
péptido-\beta a partir del factor X se vea
impedida después de que el factor X haya sido activado para formar
el factor Xa. Esto resulta en una molécula de factor Xa de la que
hasta un 100% puede aislarse en forma de una molécula intacta de
factor Xa\alpha.
La modificación puede ser una mutación, deleción
o inserción en la región de la secuencia de aminoácidos de factor X
entre las posiciones de los aminoácidos Arg469 y Ser476 y
potencialmente de Lys370. Sin embargo, una modificación de
aminoácidos preferente es aquella en la que no es posible que tenga
lugar una multiplicación del polipéptido, lo que influiría en la
estructura y con ello posiblemente en la función y la actividad de
la proteína como consecuencia del intercambio de aminoácidos.
De acuerdo con otra realización de la presente
invención, los análogos de factor X de acuerdo con esta invención
comprenden un intercambio de uno de los aminoácidos en la posición
Arg469 y/o Gly470, siendo intercambiado preferentemente Arg469 por
Lys, His o Ile y siendo intercambiado preferentemente Gly470 por
Ser, Ala, Val o Thr.
Además de una mutación en la posición Arg469 y/o
Gly470, los análogos de factor X de acuerdo con la presente
invención pueden contener una mutación adicional en la posición
Lys370 y/o Lys475 y/o Ser476.
Como resultado de una modificación de
aminoácidos en una de estas posiciones, se evita el procesamiento
del factor Xa\alpha en factor Xa\beta o en factor Xa\gamma,
ya que la(s) secuencia(s) de procesamiento de origen
natural es (son) modificada(s) para garantizar que ya no es
posible que tenga lugar una segmentación autocatalítica potencial
del péptido carboxi terminal.
De acuerdo todavía con otra realización de la
presente invención, el análogo de factor X de acuerdo con la
presente invención tiene una deleción del
péptido-\beta carboxi-terminal
(FX\beta). Este análogo de factor X puede obtenerse mediante la
expresión de un cADN que codifica para un análogo de factor X en un
sistema de expresión recombinante, con solamente aquellas
secuencias clonadas que codifican para los aminoácidos Met1 a
Arg469.
En todavía otra realización de la presente
invención, el análogo de factor X de acuerdo con esta invención
tiene una señal de parada de traducción en la región
C-terminal de la secuencia de factor X. Esta señal
de parada de traducción se encuentra preferentemente en la posición
siguiente a un aminoácido C-terminal que se forma
después del procesamiento natural. Por tanto, la señal de parada de
traducción se encuentra preferentemente en la posición del
aminoácido 470 de la secuencia de factor X, de modo que se mantiene
el terminal Arg469 del factor Xa\beta. Para garantizar esto, el
codón GGC que codifica para el aminoácido Gly470 es intercambiado
por TAA, TAG o TGA.
Otra característica de la presente invención se
refiere a análogos de factor X que se activan mediante su
tratamiento in vivo e in vitro con factor XIa o con un
derivado del mismo para obtener el factor Xa nativo o un análogo de
factor Xa, es decir, análogos de factor X activados. Dependiendo del
análogo de factor X que se utiliza y activa, se obtiene un
polipéptido que corresponde y es esencialmente idéntico al factor
Xa natural o un polipéptido que, aunque tenga la actividad del
factor Xa, tiene modificaciones en comparación con la secuencia del
factor Xa natural, modificaciones que, sin embargo, no perjudican a
la actividad biológica. Cuando los análogos de factor X de acuerdo
con la presente invención, que se modifican en la región del péptido
de activación en la secuencia del péptido de activación, se
activan, se obtienen solamente los polipéptidos que corresponden a
la molécula natural de factor Xa. Si este análogo de factor X
contiene también una señal de parada de traducción adicional en la
región C-terminal del
péptido-\beta, se obtienen moléculas homólogas al
factor Xa\beta. Si, por otra parte, se utiliza un análogo de
factor X que tiene una o más modificaciones dentro de la secuencia
de péptidos-\beta cuyos efectos son la partición
del péptido-\beta, se obtiene un análogo de
factor Xa\alpha con un intercambio de aminoácidos en el
C-terminal de la molécula.
Los análogos de factor X de acuerdo con la
presente invención tienen solamente modificaciones que cambian la
especificidad por la capacidad de activación y que no tienen un
efecto negativo sobre dicha actividad. Por tanto, en todos los
casos se obtienen moléculas de factor Xa y análogos de factor Xa
biológica y funcionalmente activos.
La activación in vivo e in vitro
se puede llevar a cabo por medio del factor XIa o un derivado del
mismo. En este contexto, un derivado del factor XIa puede ser un
polipéptido o una proteína derivada del factor XIa que es diferente
del factor XIa natural, por ejemplo, en cuanto a su longitud (por
ejemplo formas truncadas) o que se ha obtenido por modificación de
los aminoácidos. En todos los casos, es importante garantizar que
el derivado de factor XIa tenga también la actividad proteasa
específica que es característica del factor XIa.
De acuerdo con una realización especial, la
presente invención consigue análogos de factor X que están
preferentemente presentes en forma purificada como moléculas de
cadena única. La molécula de factor X de una sola cadena se
caracteriza por su alta estabilidad e integridad molecular. Hasta
ahora no había sido posible aislar una molécula de factor X de
cadena única en la forma purificada, ya que es procesada muy
rápidamente en su forma de cadena doble (Fair y col., Blood 64
(1984), pp. 194-204). Los análogos de factor X
recombinante de cadena única se pueden procesar mediante un
procesamiento específico para formar un factor X de doble cadena y
se pueden activar posteriormente en factor Xa o en análogo de
factor Xa. Esto se puede llvarse a cabo haciendo que el análogo de
factor X de cadena única se ponga en contacto con furina,
procesándolo y posteriormente activándolo por medio de factor XIa o
con un derivado del mismo.
El análogo de factor X de doble cadena puede
activarse para formar el factor Xa o un análogo de factor Xa. Esto
se puede llevar a cabo, por ejemplo, utilizando un análogo de factor
X que, como consecuencia de la modificación de acuerdo con la
presente invención en la región del péptido de activación, tiene un
sitio de segmentación del factor XIa, que se expresa y aísla en una
célula recombinante como molécula de cadena única y que se procesa
posteriormente poniéndolo en contacto con furina y segmentándose
luego por medio del factor XIa o con un derivado del mismo para
formar una molécula de factor Xa activada.
Se puede tratar directamente un análogo de
factor X que se aisló como molécula de doble cadena de un cultivo
celular con el factor XIa o con un derivado del mismo.
Debido a la reacción de procesamiento selectiva
y específica del sitio, un factor Xa o un análogo de factor Xa así
obtenido posee una gran estabilidad e integridad estructural y, en
particular, carece de los intermedios del análogo de factor X/Xa
inactivos y de productos de degradación autoproteolíticos. Además,
el análogo de factor X de acuerdo con la presente invención en
particular puede ser fácilmente activado por medio del factor XIa o
con un derivado del mismo, con la capacidad de ser activado,
incrementándose en al menos 2 veces, preferentemente al menos 5
veces y especialmente al menos 10 veces, su actividad en comparación
con los análogos de factor X descritos en la WO 98/38317.
Sorprendentemente, se descubrió que los constructos de acuerdo con
la presente invención pueden ser activados más fácilmente debido al
hecho de que un mínimo de 4, preferentemente un mínimo de 6 de los
aminoácidos 226-235 son aminoácidos diferentes a los
que se encuentran en la molécula de factor X natural y que
preferentemente al menos 3 de los aminoácidos intercambiados se
encuentran seguidos inmediatamente uno tras otro.
Una característica adicional de la presente
invención se refiere a un ADN recombinante que codifica para los
análogos de factor X de acuerdo con la presente invención. Después
de su expresión, el ADN recombinante resulta, en una célula huésped
adecuada, en un análogo de factor X con una secuencia de aminoácidos
que se corresponde con el factor X humano, excepto por una
modificación que influye en la especificidad de procesamiento y en
los productos de procesamiento. La actividad de coagulación
biológica, sin embargo, no se ve influenciada negativamente en modo
alguno; en su lugar, sorprendentemente, incluso frecuentemente,
resulta un aumento de la actividad.
De acuerdo todavía con otra característica de la
presente invención, se consiguen también células transformadas que
contienen el ADN recombinante.
Una característica adicional de la presente
invención se refiere a una preparación que contiene un análogo de
factor X purificado o una proteína precursora del mismo que tiene la
modificación de aminoácidos de acuerdo con la presente invención,
en la región del sitio de activación del factor Xa de origen
natural. La modificación en la región del sitio de segmentación de
activación es un sitio de segmentación de nuevo reconocimiento y
procesamiento -que no es de origen natural en esta posición en el
polipéptido- para el factor XIa o para un derivado del mismo, que
no es procesada normalmente por el polipéptido en esta posición. La
preparación puede ser una preparación purificada de análogos de
factor X, obteniéndose los polipéptidos a partir de un sistema de
cultivo celular, bien sea después del aislamiento del sobrenadante
del cultivo celular o a partir de un extracto de un cultivo
celular. Un análogo de factor X recombinante prepurificado
procedente de un sistema de cultivo celular se puede purificar
además utilizando procedimientos conocidos de la técnica anterior.
En este contexto, procesos cromatográficos tales como la
cromatografía de filtración en gel, de intercambio iónico o de
afinidad son particularmente adecuados para su utilización.
De acuerdo con una realización de la invención,
la preparación de acuerdo con esta invención contiene
preferentemente el análogo de factor X como molécula de una sola
cadena en forma aislada. Esta preparación se produce mediante el
aislamiento de un análogo de factor X, que se obtuvo por producción
recombinante, como molécula de una sola cadena, procedente de un
sistema celular, preferentemente procedente de un cultivo celular de
células deficientes en endoproteasas.
Una característica especial de la presente
invención se refiere al hecho de que la preparación contiene un
análogo de factor X de una sola cadena con una modificación que,
después del procesamiento por medio de furina, permite una
activación in vitro del factor Xa por medio del factor XIa o
de un derivado del mismo. La activación se realiza colocando el
análogo de factor X en contacto con las proteasas, lo que conduce a
una segmentación en la forma madura del factor X y, como
consecuencia de la modificación, a una segmentación del péptido de
activación y a la formación del factor Xa, así como del análogo de
factor Xa.
En la preparación de acuerdo con la presente
invención, el análogo de factor X puede estar presente bien como
factor X\alpha (FX\alpha) o con una deleción del
péptido-\beta.
La preparación contiene, en particular, un
análogo de factor X en una forma enzimáticamente inactiva con una
pureza mínima de un 80%, preferentemente un 90% y especialmente un
95%, y no contiene ningún intermedio proteolítico inactivo de
análogo de factor X/Xa.
De acuerdo con otra realización de la presente
invención, la preparación según esta invención contiene
preferentemente el análogo de factor X como molécula de doble
cadena en forma aislada. Para conseguirlo, por ejemplo un análogo
de factor X que ha sido obtenido por medio de una producción
recombinante como molécula de una sola cadena procedente de un
sistema celular se segmenta in vitro, es decir fuera de la
célula, por medio de furina, para obtener la forma en doble cadena.
Esto se puede llevar a cabo mezclando la proteasa directamente con
el sobrenadante del cultivo de los clones que expresan el análogo de
factor X, bien sea mezclando la proteasa purificada o un
sobrenadanete de un cultivo celular que expresa la proteasa en forma
recombinante o por medio de un cocultivo de los clones que expresan
el análogo de factor X y la proteasa.
De acuerdo con una realización especial de la
presente invención, la preparación que contiene el análogo de
factor X purificado de una sola cadena o de doble cadena contiene
una matriz fisiológicamente aceptable y se formula potencialmente
como una preparación farmacéutica. La preparación se puede formular
básicamente utilizando los métodos conocidos de la técnica
anterior, se puede mezclar con un tampón que contiene sales, tales
como NaCl, CaCl_{2}, y aminoácidos como glicina y/o lisina, en un
rango de pH de 6 a 8, y se puede formular como preparación
farmacéutica. Hasta que se necesite, la preparación purificada que
contiene el análogo de factor X puede almacenarse en forma de
solución acabada o en forma liofilizada o congelada.
Preferentemente, la preparación se almacena en forma liofilizada y
se disuelve en una solución visualmente transparente utilizando una
solución de reconstitución apropiada.
Pero la preparación de acuerdo con la presente
invención también puede obtenerse como preparación líquida o como
líquido en forma congelada.
La preparación de acuerdo con la presente
invención es especialmente estable, es decir, se puede dejar reposar
en forma disuelta durante un tiempo prolongado antes de su
aplicación. Se ha descubierto que la preparación de acuerdo con
esta invención se puede dejar reposar durante varias horas e incluso
días sin que pierda su actividad.
La preparación de acuerdo con la presente
invención se puede colocar en un dispositivo adecuado,
preferentemente en un dispositivo de aplicación, en combinación con
factor XIa o con un derivado del mismo.
La preparación de acuerdo con la presente
invención que contiene un análogo de factor X en combinación con
factor XIa o con un derivado del mismo, que es capaz de activar el
análogo de factor X en factor Xa o en análogo de factor Xa, se
puede conseguir en forma de una preparación combinada que incluye un
recipiente para el factor XIa inmovilizado en una matriz,
potencialmente en forma de una minicolumna o de una jeringa
complementada por una proteasa, y un recipiente que contiene la
preparación farmacéutica con el análogo de factor X. Para activar
el análogo de factor X, la solución que contiene el análogo de
factor X, por ejemplo, se puede comprimir sobre la proteasa
inmovilizada. Durante el almacenamiento de la preparación, la
solución que contiene el análogo de factor X preferentemente está
espacialmente separada de la proteasa. La preparación de acuerdo con
la presente invención se puede almacenar en el mismo recipiente que
la proteasa, pero los componentes están espacialmente separados por
una partición impermeable que se puede eliminar fácilmente antes de
la administración de la preparación. Las soluciones se pueden
almacenar también en recipientes individuales y ponerse en contacto
una con otra sólo poco tiempo antes de la administración.
El análogo de factor X se puede activar en
factor Xa poco tiempo antes de su uso inmediato, es decir, antes de
la administración al paciente. La activación se puede llevar a cabo
colocando un análogo de factor X en contacto con una proteasa
inmovilizada o mezclando las soluciones que contienen una proteasa,
por una parte, y el análogo de factor X, por otra. Así, es posible
mantener separados los dos componentes en la solución y mezclarlos
por medio de un dispositivo de infusión adecuado, donde los
componentes se ponen en contacto uno con otro a medida que pasan
por el dispositivo, provocando así la activación en el factor Xa o
en el análogo de factor Xa. El paciente recibe así una mezcla de
factor Xa y, además, una serina-proteasa que está a
cargo de la activación. En este contexto, es especialmente
importante prestar mucha atención a la dosificación, ya que la
administración adicional de una serina-proteasa
activa también el factor X endógeno, lo que puede acortar el tiempo
de coagulación.
De acuerdo con una realización útil de la
invención, la preparación farmacéutica se dispone en un dispositivo
adecuado, preferentemente en un dispositivo de aplicación, bien sea
en forma de líquido congelado o en forma liofilizada. Un
dispositivo de aplicación adecuado, por ejemplo, es una jeringa de
doble compartimento del tipo descrito en la AT 366 916 o AT 382
783.
Una característica especialmente útil de esta
invención es que la preparación puede contener un análogo de factor
X con una modificación que hace posible la activación in vivo
del análogo de factor X en factor Xa. En particular, los análogos
de factor X de la preparación de acuerdo con la presente invención
tienen una modificación que representa un sitio de reconocimiento y
segmentación para el factor XIa o para un derivado del mismo,
permitiendo así que sean segmentados por esta proteasa in
vivo para formar el factor Xa natural o el análogo de factor
Xa. Como consecuencia, la preparación de acuerdo con la presente
invención se puede utilizar para interrumpir el sangrado tanto en
pacientes con deficiencia en factor IX y factor VIII, como en
pacientes con inhibidor de factor VIII.
La preparación de acuerdo con la presente
invención se puede disponer como preparación farmacéutica con
actividad de factor Xa en forma de preparación de un solo
componente o, en combinación con otros factores, en forma de una
preparación multicomponente.
Antes de procesar la proteína purificada en una
preparación farmacéutica, la proteína purificada se somete a los
controles de calidad convencionales y se elabora en una forma de
presentación terapéutica. En particular, durante la fabricación
recombinante, se comprueba que la preparación purificada en no
contiene ácidos nucleicos celulares o ácidos nucleicos que proceden
del vector de expresión, preferentemente empleando un método tal
como el descrito en la EP 0 714 987.
Debido a que cualquier material biológico puede
estar contaminado con microorganismos infecciosos, es posible que
la preparación tenga que ser tratada de forma especial para
inactivar o disminuir los virus con el fin de garantizar la
obtención de una preparación segura.
Otra característica de esta invención se refiere
a la obtención de una preparación que contiene un análogo de factor
Xa de alta estabilidad e integridad estructural, así como, en
particular, libre de intermedios inactivos de análogo de factor
X/Xa y de productos de degradación autoproteolítica, y que se pueda
producir mediante la activación de un análogo de factor X del tipo
descrito anteriormente y mediante su formulación en una preparación
adecuada.
Una característica adicional de la presente
invención se refiere a la utilización de una preparación del tipo
descrito anteriormente para producir un medicamento. Un medicamento
que contiene un análogo de factor X y/o un análogo de factor Xa de
acuerdo con la presente invención es especialmente adecuado para el
tratamiento de pacientes con trastornos de la coagulación
sanguínea, tales como aquellos que padecen de hemofilia o
hemofílicos con anticuerpos inhibidores y, en particular, como
preparación con actividad bypass inhibidora de factor VIII.
Otra característica de esta invención se refiere
a la utilización de un ácido nucleico que contiene las secuencias
de codificación del análogo de factor X de acuerdo con esta
invención para la producción de un medicamento. En este contexto,
el ácido nucleico, debido al hecho de que contiene secuencias de
control de expresión adecuadas, se puede administrar en forma de
ácido nucleico desnudo, se puede integrar en un vector de expresión
recombinante o puede enlazarse a una matriz, tal como un
fosfolípido o una partícula viral. El ácido nucleico se puede
utilizar para fabricar un medicamento que sea especialmente adecuado
para su utilización en el tratamiento de pacientes con trastornos
de la coagulación sanguínea, tal como pacientes con hemofilia o
hemofílicos con anticuerpos inhibidores. Otra aplicación potencial
es la utilización del ácido nucleico en la terapia genética.
Otra característica de la presente invención se
refiere a un procedimiento para la producción de los análogos de
factor X de acuerdo con esta invención y a una preparación que
contiene un análogo de factor X de acuerdo con esta invención. Para
llevarlo a cabo, se introduce una secuencia que codifica para un
análogo de factor X en un sistema de expresión adecuado y las
células relevantes, preferentemente las líneas celulares
permanentes, son transfijadas por el ADN recombinante. Se cultivan
las células en condiciones óptimas para la expresión del gen y se
aíslan los análogos de factor X del extracto del cultivo celular o
del sobrenadante del cultivo celular. La purificación de la
molécula recombinante se puede llevar a cabo además utilizando todos
los procedimientos cromatográficos convencionales conocidos, tal
como cromatografía de intercambio aniónico o catiónico,
cromatografía de afinidad o de inmunoafinidad o una combinación de
las mismas.
\newpage
Para producir los análogos de factor X de
acuerdo con la presente invención, el cADN completo que codifica
para el factor X se clona en un vector de expresión. Esto se lleva a
cabo por medio de las técnicas de clonación generalmente conocidas.
La secuencia de nucleótidos que codifica para el factor X se
modifica posteriormente para garantizar que la secuencia de
codificación en la región del péptido de activación,y posiblemente
en la región del péptido-\beta
C-terminal, se cambia para garantizar que se pueda
producir una molécula de factor X del tipo descrito anteriormente.
Para ello se utilizan métodos de ingeniería genética conocidos de
la técnica anterior, por ejemplo mutagénesis in vitro
específica del sitio o deleción de secuencias, por ejemplo, por
medio de una digestión mediante la restricción por las endonucleasas
y la inserción de secuencias cambiadas, distintas, o por PCR. Los
mutantes de factor X así producidos se insertan entonces en un
sistema de expresión adecuado para la expresión recombinante y se
expresan posteriormente.
Los análogos de factor X de acuerdo con la
presente invención pueden producirse también por medio de síntesis
química.
Los análogos de factor X se producen
preferentemente por medio de una expresión recombinante. La
producción por métodos de ingeniería genética se puede llevar a
cabo con todos los sistemas de expresión conocidos, por ejemplo con
líneas celulares permanentes o sistemas de expresión viral. Las
líneas celulares permanentes se producen mediante la integración
estable de ADN exógeno en el cromosoma de la célula huésped, por
ejemplo de Vero, MRC5, CHO, BHK, 293, Sk-Hep 1,
especialmente células hepáticas y renales, o mediante un vector
episomal procedente, por ejemplo, de papilomavirus. Se pueden
utilizar también sistemas de expresión viral, como el virus
Vaccinia, baculovirus o sistemas retrovirales. Las líneas celulares
normalmente utilizadas son Vero, MRC5, CHO, BHK, 293,
Sk-Hep 1, células glandulares, hepáticas y renales.
Los sistemas de expresión eucarióticos a utilizar incluyen
levaduras, glándulas endógenas (por ejemplo glándulas de animales
transgénicos) y demás tipos celulares. Por supuesto, también es
posible utilizar animales transgénicos para expresar los
polipéptidos de acuerdo con la presente invención o sus derivados.
Para expresar las proteínas recombinantes, se ha demostrado que las
células CHO-DHFR son especialmente útiles (Urlaub y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, (1980), pp.
4216-4220).
Para la producción recombinante de los análogos
de factos X según la presente invención también es posible utilizar
sistemas de expresión procarióticos. Especialmente adecuados son
aquellos sistemas que permiten la expresión en E. coli o
B. subtilis.
Los análogos de factor X se expresan en los
sistemas de expresión apropiados utilizando un promotor adecuado.
Para la expresión en eucariotas se pueden utilizar todos los
promotores conocidos, tales como SV40, CMV, RSV, HSV, EBV,
\beta-actina, hGH, o promotores inducibles tales
como el promotor hsp o metalotioneína. Los análogos de factor X se
expresan preferentemente utilizando el promotor de
\beta-actina en células
CHO-DHFR.
De acuerdo con una realización de la invención,
el método para producir la preparación de acuerdo con la presente
invención comprende los siguientes pasos: preparación de un ADN que
codifica para un análogo de factor X, transformación de una célula
con el ADN recombinante, expresión del análogo de factor X,
potencialmente en presencia de una proteasa, aislamiento del
análogo de factor X y purificación potencial por medio de un
procedimiento cromatográfico.
De acuerdo con una realización del método, el
análogo de factor X se aísla como molécula de doble cadena.
Con este propósito, el análogo de factor X se
expresa en una célula que permite el procesamiento de los análogos
del profactor X en análogos de factor X de doble cadena.
Posteriormente, el análogo de factor X de doble
cadena así obtenido puede ser aislado, purificado y, tal como se
describe anteriormente, almacenado de forma estable hasta su
posterior uso.
De acuerdo con una realización de esta
invención, la activación se desencadena mediante un paso
cromatográfico en el que la proteasa es inmovilizada en una matriz.
El análogo purificado de factor X de doble cadena pasa por una
matriz a la que está unida la proteasa, y a partir del eluato, se
aísla el factor Xa purificado.
De acuerdo con otra realización de la invención,
se mezclan los componentes y se elimina selectivamente la proteasa
de la mezcla.
Además, también es posible, por supuesto,
procesar un análogo del profactor X de una sola cadena en la forma
del análogo de factor X de doble cadena y activarlo en factor Xa en
un único proceso.
Las condiciones de reacción de la(s)
reaccion(es) de procesamiento y de activación pueden ser
optimizadas fácilmente por los especialistas en la técnica
dependiendo del montaje experimental de cualquier situación
determinada. En este contexto, se debe observar que el la velocidad
de flujo de los reactivos utilizados es especialmente importante
para la duración del tiempo de contacto. Este flujo debe encontrarse
en el rango de 0,01 ml/min a 1 ml/min. Otros parámetros importantes
son la temperatura, el pH y las condiciones de elución. Al final
del tiempo de flujo, el factor Xa activado además puede ser
opcionalmente purificado por medio de una cromatografía selectiva.
Llevar a cabo el método con la proteasa que está unida a una matriz
ofrece una ventaja especial ya que, como consecuencia de la
utilización de una matriz, preferentemente de columnas
cromatográficas, el montaje de la reacción permite incluir un paso
adicional de purificación.
Una característica adicional de la producción de
un análogo de factor X de acuerdo con esta invención consiste en
que el análogo de factor X está aislado como molécula de una sola
cadena. Con este propósito, el análogo de factor X se expresa en
una célula en la que no puede producirse la segmentación en la
cadena ligera y pesada del factor X y/o de un análogo de factor X.
La furina es una de las proteasas importantes responsables de la
segmentación del factor X en su cadena ligera y pesada. A partir de
esta célula mutante deficiente en endoproteasa es posible aislar el
análogo de factor X en forma de una molécula de una sola cadena. Un
análogo de factor X que se aísla de esta manera y potencialmente se
purifica también se pone posteriormente en contacto con la furina
en condiciones en las que el análogo de factor X de una sola cadena
se segmenta en forma del factor X de doble cadena. Los análogos de
factor X de acuerdo con la presente invención, que tienen una
modificación en la región del péptido de activación que posibilita
una segmentación por el factor XIa, pueden activarse posteriormente
por este método, posiblemente de forma directa, poniéndolos en
contacto con el factor XIa o con un derivado del mismo para formar
el factor Xa o el análogo de factor Xa.
De acuerdo con otra característica de esta
invención, utilizando el método de acuerdo con la invención, se
obtiene una preparación que contiene el factor Xa activo o un
análogo del factor Xa activo sometiendo un análogo de factor X,
obtenido tal como se ha descrito anteriormente, a un paso de
activación y procesando el polipéptido activado en una preparación
purificada, formulándose potencialmente como compuesto
farmacéutico.
Utilizando los análogos de factor X de acuerdo
con la invención, los cuales son activados en factor Xa por un
proceso descrito anteriormente, se obtiene un factor Xa y/o un
análogo de factor Xa purificado con una gran estabilidad e
integridad estructural, el cual, en particular, está exento de
intermedios inactivos de factor X/Xa.
Esta invención se explica de forma más detallada
en base a los siguientes ejemplos y figuras, sin, sin embargo,
limitar la invención en modo alguno.
Se aisló cADN de FX de un banco de
cADN-lambda de hígado humano tal como se describe en
Messier y col. (Gene 99 (1991), pp. 291-294). Por
medio de PCR, utilizando el oligonucleótido #2911,
(5'-ATTACTCGAGAAGCTTAC
CATGGGGCGCCCACTG-3') (SEQ ID No. 3) como cebador 5' y el oligonucleótido #2912 (5'-ATTACAATTGCTG
CAGGGATCCAC-3') (SEQ. ID No. 4) como cebador 3', se amplificó un fragmento de ADN procedente de un clon positivo, conteniendo el fragmento de ADN la secuencia de codificación FX de 1.457 kB y 39 pb de la región no traducida 3', flanqueada por un sitio de corte Xhol en el extremo 5' y un sitio de corte MfeI en el extremo 3'. Además, por medio del iniciador #2911, se insertó la secuencia ACC delante de ATG de FX, garantizando así que se formaba una secuencia Kozak óptima de inicio de traducción. Posteriormente, este fragmento de PCR fue clonado como fragmento XhoI/MfeI en un vector de expresión phAct que había sido cortado con SalI en EcoRI. El factor de expresión phAct comprende aproximadamente 3,3 kb del promotor, 78 pb de 5'UTR y el intrón del gen de la beta-actina humana que mide aproximadamente 1 kb (Fischer y col., FEBS Lett. 351 (1994), pp. 345-348), un sitio de corte de clonación múltiple y el sitio de poliadenilación SV40. El plásmido de expresión resultante se llamó phAct-rFX.
CATGGGGCGCCCACTG-3') (SEQ ID No. 3) como cebador 5' y el oligonucleótido #2912 (5'-ATTACAATTGCTG
CAGGGATCCAC-3') (SEQ. ID No. 4) como cebador 3', se amplificó un fragmento de ADN procedente de un clon positivo, conteniendo el fragmento de ADN la secuencia de codificación FX de 1.457 kB y 39 pb de la región no traducida 3', flanqueada por un sitio de corte Xhol en el extremo 5' y un sitio de corte MfeI en el extremo 3'. Además, por medio del iniciador #2911, se insertó la secuencia ACC delante de ATG de FX, garantizando así que se formaba una secuencia Kozak óptima de inicio de traducción. Posteriormente, este fragmento de PCR fue clonado como fragmento XhoI/MfeI en un vector de expresión phAct que había sido cortado con SalI en EcoRI. El factor de expresión phAct comprende aproximadamente 3,3 kb del promotor, 78 pb de 5'UTR y el intrón del gen de la beta-actina humana que mide aproximadamente 1 kb (Fischer y col., FEBS Lett. 351 (1994), pp. 345-348), un sitio de corte de clonación múltiple y el sitio de poliadenilación SV40. El plásmido de expresión resultante se llamó phAct-rFX.
Para producir análogos de FX/FXIa
(Q-R/I) recombinantes, la secuencia de aminoácidos
de la posición 227 a 234
(Arg-Gly-Asp-Asn-Asn-Leu-Thr-Arg/Ile)
que sirve para activar FX en FXa fue sustituida con el complejo
tenasa intrínseco FIXa/FVIIIa o por el complejo extrínseco FVIIa/TF,
por la secuencia
Gln-Ser-Phe-Asn-Asp-Phe-Thr-Arg/Ile
(denominada en adelante (Q-R/I)), específicamente
activada por medio del factor XIa de coagulación (Figura 2).
Q-R se preparó conforme al segundo sitio de corte
FXIa, tal como está presente en el sustrato "natural" FIX. El
plásmido de expresión para este análogo rFX procede del plásmido
phAct/rFX. Con el propósito de clonación, el fragmento de ADN
HindIII-NaeI procedente del plásmido de expresión
phAct-rFX que comprende la región de codificación
de FX de la posición +1 a +1116 se insertó en los sitios de corte de
restricción HindIII-SmaI del plásmido pUC19. El
plásmido resultante se llamó pUC/FX. Esto hizo posible que la
secuencia FX del nucleótido 508 a 705, que corresponde a los
aminoácidos 160 a 235, se eliminara del plásmido pUC/FX vía cortes
de restricción Bsp 120I y BstXI y se sustituyera por un fragmento
de ADN mutado FX. El fragmento de ADN mutado contiene el sitio de
segmentación exógena FX para FXIa en lugar del sitio FIXa/FVIIIa y
FVIIa/TF, y se obtiene por medio de PCR. El plásmido phAct/rFX
sirve de modelo para la PCR. Para producir el sitio de segmentación
de
Gln-Ser-Phe-Asn-Asp-Phe-Thr-Arg/Ile
(Q-R/I), se utiliza el oligonucleótido #4211
(5'-GGCAAGGCCTGCATTCCCACA-3') (SEQ.
ID. No. 5) como cebador 5' y el oligonucleótido #5039
(5'-GCGCTCCCACGATCCTGGTGAAGTCATTAAAGCTTTGCTCAGGCTGCGT
CTGGTT-3') (SEQ. ID. No. 6) se utiliza como cebador
3'. Por tanto, los aminoácidos Arg, Gly, Asp, Asn y Leu se
reemplazan en las posiciones 227, 228, 229, 231 y 232 por Gln, Ser,
Phe, Asp y Phe. El producto de PCR se recorta con Bsp120I y BstXI y
se inserta en el plásmido pUC-FX que había sido
abierto con Bsp120I/BstXI. Posteriormente, el fragmento de ADN que
contiene el nuevo sitio de segmentación se reinserta vía
HindIII/AgeI en phact-FX, que había sido cortado con
las mismas enzimas de restricción. El plásmido resultante se llama
phAct-FX/FXIa (Q-R/I).
Para establecer líneas celulares estables que
expresan rFX/FXIa, el plásmido de expresión
phAct-rFX y phAct-rFX/FXa
(Q-R/I) es cotransfijado por el marcador de
selección pSV-dhfr en células CHO deficientes en
dhfr (Fischer y col., FEBs Lett. 351 (1994), pp.
345-348). Para todos los demás análisis de expresión
y función, los cultivos celulares se incuban después de un cambio
completo de los medios con un medio de selección libre de suero en
presencia de 10 \mug/ml de vitamina K durante 24 horas. La
expresión de rFX en los clones celulares resultantes se demuestra
en base a la cantidad de antígeno (ELISA, Asserachrom, Boehringer
Mannheim), y la proteína recombinante se caracteriza posteriormente
con SDS-PAFW (Figura 3). Tal como se puede observar
también en el Western Blot, las moléculas tanto de tipo salvaje rFX
como rFX/FXIa (Q-R/I) están presentes en forma de
una cadena ligera (LC) de aproximadamente 22 kD y de una cadena
pesada (HC) de aproximadamente 50 kD, correspondiéndose a las
formas plasmáticas del factor X. Además, se puede ver una banda de
proteínas de 75 kD. La proteína de 75 kD corresponde a la molécula
FX de una sola cadena (SC), cuya presencia había sido ya descrita en
los sobrenadantes de las células CHO transfijadas por FX (Wolf y
col., J. Biol. Chem. 266 (1991), pp. 13729-13730) y
en el plasma humano (Fair y col., Blood 64 (1984), pp.
194-204).
Para demostrar la segmentabilidad de los sitios
de activación recientemente insertados por medio del factor XIa,
los sobrenadantes del cultivo celular se mezclan con factor XIa
purificado en presencia de 5 mM de CaCl_{2}. Se investigan partes
alícuotas de los lotes de reacción en busca de la segmentación,
tanto antes de la incubación como después de los distintos tiempos
de incubación a 37ºC, por medio de análisis Western Blot (Figura 4).
La identificación de las moléculas rFX se lleva a cabo por medio de
un anticuerpo policlonal FX anti-humano. Como
control positivo se utiliza factor IX plasmático purificado (Stago),
que es el sustrato natural para FXIa. Para trabajar en condiciones
constantes, se diluye FIX antes de su uso en los sobrenadantes del
cultivo celular de células CHO no transfijadas. La conversión de
FIX en formas activadas (FIXa y FIXb) muestra que FXIa es capaz de
segmentar su sitio de corte homólogo en FIX en los sobrenadantes del
cultivo celular. El lote de reacción con rFX de tipo salvaje sirve
como control negativo, ya que esta molécula no contiene ningún
sitio de segmentación de FXIa y, por tanto, no tendría que ser
reconocida específicamente y segmentada por FXIa. Tal como se
espera, en comparación con rFX en ausencia de FXIa, no es visible
ningún cambio para rFX en el modelo de proteína después de la
incubación con FXIa.
Por el contrario, después de un tiempo de
incubación de 1 hora a 37ºC en presencia de CaCl_{2}, el lote de
reacción de FXIa con rFX/FXIa (Q-R/I) como sustrato
muestra bandas de proteína de aproximadamente 36 kD y de 32 kD que
se parecen a las formas activadas alfa y beta (aHCa y bHCa) de la
cadena pesada de FX. En ausencia de FXIa, estas moléculas
segmentadas no están presentes. La presencia de una forma que es
similar a bHCa y que se forma como consecuencia de la segmentación
autocatalítica de los aminoácidos C-terminales de la
cadena pesada de aHCa señala la funcionalidad de las moléculas rFXa
activadas generadas. Estos resultados demuestran que, mediante la
sustitución de la secuencia de activación que existe de forma
natural en FX, con un sitio de segmentación de activación para
FXIa, es posible generar moléculas análogas rFX que pueden ser
activadas por FXIa y que posteriormente se pueden convertir en
moléculas que son similares a FXa.
El método descrito se puede utilizar para
someter ensayar todos los demás análogos de factor X en cuanto a
sus propiedades de acuerdo con la presente invención.
Para someter a prueba la funcionalidad del
análogo rFX, se mezcla plasma deficiente en FIX con el sobrenadante
del cultivo celular de CHO-rFX/FXIa
(Q-R/I) y se mide la cascada de los tiempos de
coagulación después de haber activado la cascada de coagulación
intrínseca (Tabla 1). Para ello, se mezclaron 50 \mul del
sobrenadante parcialmente concentrado por ultrafiltración, 50
\mul de plasma deficiente en FIX y 50 \mul de DAPPTIN (Baxter
AG). Después de un tiempo de incubación de 4 min a 37ºC, se inicia
la reacción con 50 \mul de CaCl_{2} 25 mM que había sido
precalentado a 37ºC. Se mide el tiempo de coagulación en un
coagulómetro (Amelung, KC10A). La actividad, en mU, FIX se
determina utilizando una recta de calibración generada con FIX
plasmático. Los tiempos de coagulación obtenidos con los análogos
rFX se muestran como mU FIX equivalentes. Los sobrenadantes del
cultivo celular de células CHO que expresan rFX de tipo salvaje
(CHO-rFX) y los del cultivo celular de células CHO
no transfectadas (CHO neg.) sirven como control. Para excluir los
efectos no específicos y tener en cuenta las variaciones
experimentales debidas a las condiciones del cultivo celular, se
ensayaron de 7 a 10 sobrenadantes de cultivo celular diferentes de
células que tienen las mismas etapas de crecimiento y similares
grados de expresión, para cada constructo.
Los sobrenadantes de los cultivos celulares de
CHO-rFX y CHO neg. conducen a tiempos de coagulación
similares a los del tampón de dilución en los que los estándares y
las muestras se diluyen y, por tanto, se muestran como equivalente
de FIX "<1,56" mU (el valor más pequeño valorable en las
pruebas de coagulación debido a la recta de calibrado).
En comparación con los tiempos de coagulación
que habían sido determinados con 200 mU de FIX plasmático, sin
embargo, los tiempos de coagulación para los sobrenadantes de las
células CHO-rFX/FXIa (Q-R/I)
determinados con concentraciones de análogos en un rango de 4,1 a
7,7 \mug/ml fueron notablemente más cortos y, por ello, se
muestran como FIX ">200" mU equivalente.
Estos resultados muestran que al sustituir los 8
aminoácidos C-terminales del péptido de activación
de FX por los 8 aminoácidos C-terminales del
péptido de activación del factor IX se genera una molécula de
análogo rFX que, después de la activación de la cascada de
coagulación intrínseca, conduce a una coagulación significativa de
un plasma deficiente en factor IX.
Para poder eliminar la posibilidad de que los
tiempos de coagulación obtenidos con los análogos de rFX/FXIa
(Q-R/I) no fueran consecuencia de la presencia de
trazas de moléculas de rFX ya activadas en los sobrenadantes del
cultivo celular, sino que, en su lugar, eran consecuencia de la
conversión de los análogos de rFX en rFXa después de la activación
de la cascada de coagulación intrínseca por DAPPTIN, antes de su
utilización se mezclan todos los sobrenadantes con un inhibidor de
serina-proteasa (1 mM Pefabloc, Boehringer Mannheim)
que inactiva permanentemente las serina proteasas activadas. El
inhibidor excedente que inhibiría la coagulación después de la
activación por DAPPTIN se elimina posteriormente por medio de
diálisis contra Tris pH 7,4, 50 mM NaCl, 0,01% Tween. Los
sobrenadantes así tratados se utilizan posteriormente en la prueba
de coagulación.
Se seleccionó la concentración de inhibidor de
serina proteasa para garantizar que las cantidades de FXa que
conducen a una coagulación similar a la de los sobrenadantes no
tratados del cultivo celular rFX/FXIa (Q-R/I)
estaban completamente inhibidas (Tabla 2). Los resultados de estos
experimentos preliminares demuestran que una concentración de
inhibidor de 1 mM es capaz de inactivar completamente cantidades de
FXa con tiempos notablemente más cortos de coagulación en plasma
deficiente en FIX que los obtenidos con los análogos de rFX/FXIa
(Q-R/I) (comparación con la Tabla 1).
La funcionalidad de los sobrenadantes así
pretratados se mide en la prueba de coagulación tanto de FIX como
de FVIII (Tabla 3). La prueba de coagulación de FVIII se lleva a
cabo de la misma manera que la prueba de coagulación de FIX,
excepto que en lugar de plasma deficiente en FIX se utiliza plasma
deficiente en FVIII, que la incubación antes de la iniciación con
CaCl_{2} dura 3 min y que la curva de calibrado se representa con
FVIII plasmático.
Los sobrenadantes de las células
CHO-rFX se encuentran por debajo del límite de
evaluación (1,56 mU) en el plasma deficiente tanto en FIX como en
FVIII. De forma similar, el sobrenadante de CHO neg no conduce a un
tiempo más corto de coagulación, incluso cuando este sobrenadante ha
sido tratado con 1 mU de FXa antes del tratamiento con el
inhibidor. Estos controles demuestran que, aunque el FX estuviera ya
preactivado, sería inactivado por el inhibidor en el sobrenadante
del cultivo celular y que la coagulación no es mediada por las
proteasas específicas de CHO potencialmente ya existentes.
El FIX plasmático pretratado (FIX) en
comparación con el FIX que no ha sido pretratado (FIX sin inhibidor
y diálisis) tiene una actividad más baja de coagulación en el plasma
deficiente en FIX, lo que indica que o bien una parte de las serina
proteasas, incluso en la forma inactivada, es inhibida por el
inhibidor o bien que se pierde como consecuencia del proceso
(diálisis).
A pesar del pretratamiento del inhibidor, en las
pruebas de coagulación de FIX y FVIII no se observan cambios
significativos en los valores medidos en los sobrenadantes de
CHO-rFX/FXIa (Q-R/I) cuando se
comparan con los sobrenadantes no tratados.
Estos experimentos demuestran que después de la
activación de la cascada de coagulación intrínseca, las moléculas
del análogo FX recombinante que tienen un sitio de segmentación de
activación de FIX para FXIa conducen a una coagulación
significativa de los plasmas deficientes en FIX y FVIII. En resumen,
se ha demostrado que estas moléculas de análogo FX/FXIa
(Q-R/I) recombinante tienen propiedades que indican
que las moléculas pueden ser candidatos de éxito para la producción
de preparaciones terapéuticas útiles en el tratamiento de pacientes
que padecen de hemofilia o de hemofilia con anticuerpos
inhibidores.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se purificaron las moléculas de rfX/fXIa
(Q-R/I) a partir de sobrenadantes de cultivos
celulares de clones celulares estables CHO-rfX/fXIa
(Q-R/I) (establecidos tal como se describe en el
Ejemplo 1.c) mediante cromatografía de intercambio aniónico. Debido
a la presencia de moléculas rfX precursoras inmaduras de manera
parcial, proteolítica e incompleta en el sobrendante de las líneas
celulares recombinantes utilizadas para la purificación (Figura 5,
línea 8), se preincubó primero el sobrenadante durante 4 horas a
37ºC con un medio acondicionado procedente de clones celulares de
CHO que expresan una forma secretada de la endoproteasa furina. La
furina es una serina-proteasa que realiza la
conversión de la única cadena de fX en cadena pesada/ligera, así
como elimina el propéptido in vitro. Mediante este
tratamiento se lleva a cabo el procesamiento de las moléculas fX
inmaduras in vitro (Figura 5, línea 2 frente a 8) evitando
la copurificación de las moléculas fX inmaduras inactivas. Después
de añadir 10 mM de EDTA, un 0,1% de Tween 80, 0,1 mM de Pefabloc y
ajustar el pH a 7,4, se cargó el sobrenadante en una columna
Fractogel EMD TMAE 650 (M) equilibrada con el Tampón A (20 mM Tris,
120 mM NaCl, 10 mM EDTA, un 0,1% Tween 80, pH 7,4). Se lavó la
columna con 20 mM Tris, 180 mM NaCl, un 0,1% Tween 80, pH 7,4. Se
eluyeron las moléculas rfX con el Tampón C (20 mM Tris, 150 mM NaCl,
10 mM CaCl_{2}, un 0,1% Tween, pH 7,4). El análisis Western Blot
de las distintas fracciones de purificación (Figura 5) muestra que
casi todas las moléculas de rfX/fXI (Q-R/I) de la
fracción de elución están presentes en forma de doble cadena madura
(HC, LC; línea 6), de manera similar al fX plasmático purificado
(línea 7). Con el fin de inhibir las cantidades residuales de rfXa
potencialmente presente que podrían haberse formado durante el
cultivo celular o durante el procedimiento de purificación, se
trató posteriormente la fracción de elución con 10 \muM de ERGck
(Hematological Technologic Inc.), inhibidor específico de fXa. Se
eliminó el sobrante de este inhibidor por medio de un paso
posterior de diafiltración con 10 mM Tris, 8 g/l de NaCl, 4 g/l de
Na-citrato, un 0,01% de Tween 80, pH 7. Se almacenó
la preparación a -80ºC hasta su utilización. Se utilizó el mismo
procedimiento de purificación para la preparación de rfX de tipo
salvaje empleado como control en los siguientes experimentos.
Para confirmar la actividad funcional de las
moléculas purificadas de rfX/fXIa (Q-R/I), se midió
el aPTT (Tiempo de Tromboplastina Parcial Activada) en plasma
deficiente en fVIII y fIX de origen humano y murino en presencia de
moléculas de rfX. Se mezclaron 100 \mul de plasma deficiente
(plasma humano inmunoempobrecido, Baxter AG; plasma de ratones
noqueados de fVIII o fIX) con 50 \mul de una preparación molecular
de fX purificado de 10 \mug/ml (véase anteriormente), 150 \mul
de DAPPTIN (Baxter AG) y se incubó durante 3 min a 37ºC. La
reacción de coagulación se inició mediante 150 \mul de 25 mM
CaCl_{2}. El tiempo de coagulación se estimó tal como se describe
en el Ejemplo 3. El porcentaje de actividad se determinó utilizando
una curva Log estándar (% de actividad) contra un Log(tiempo
de coagulación). Para la curva estándar, se mezclaron 100 \mul de
un 100%, 80%, 50%, 25% ó 12,5% de plasma de referencia humana o
murina con 50 \mul del tampón de fX y 150 \mul de DAPPTIN y se
incubó durante 3 min a 37ºC. La iniciación de la coagulación y la
estimación del tiempo de coagulación se realizaron tal como se
describe anteriormente. Los plasmas de referencia se componen de
plasma humano normal (Baxter AG) o de un pool de plasma procedente
de ratones normales, mezclados en distintas proporciones con
plasmas deficientes en fVIII o fIX. El tiempo de coagulación y el
porcentaje de actividad comparados con plasma normal figuran en la
Tabla 4. Los resultados muestran que una reducción notable del
tiempo de coagulación es mediada por rfX/ fXIa
(Q-R/I) purificado en todos los plasmas deficientes
sometidos a prueba, de origen humano o murino. Se observa incluso
una normalización del aPTT en el plasma humano y murino deficiente
en fIX y en el plasma murino deficiente en fVIII. Por contraste con
el análogo de rfX, las moléculas de rfX wt en las concentraciones
correspondientes no median en la reducción notable del tiempo de
coagulación en estos plasmas. Además, la normalización del aPTT en
el plasma de ratón deficiente indica que las moléculas de rfX/fXIa
(Q-R/I) pueden interactuar con las proteínas
correspondientes de coagulación en murino que median en la
actividad bypass de fVIII y FIX observada in vitro en el
plasma humano, prerrequisito para someter a prueba estas moléculas
in vivo en un modelo animal de ratón.
Se sometió a prueba in vivo la
funcionalidad de rfX/fXIa (Q-R/I) como molécula que
muestra una actividad bypass de fVIII utilizando ratones noqueados
en fVIII (Tabla 5). La validez de los ratones noqueados de fVIII
como sistema de modelo animal para someter a prueba la actividad
bypass de fVIII fue controlada por medio de plasma comercial
procedente de la preparación FEIBA (Baxter, AG). Como control
negativo se utilizó una preparación de rfX wt purificado. Con el
fin de comparar el efecto de rfX/fXIa (Q-R/I) y
rfXwt, la definición de la unidad para la dosis a administrar se
basó en la actividad de fX determinada en el ensayo de PT (tiempo
de la protrombina). Para el ensayo de PT, 100 \mul de la
preparación molecular de fX y 100 \mul de plasma deficiente en fX
(Baxter AG) se incubaron durante 2 min a 37ºC. La coagulación se
inició con 100 \mul de una mezcla de Calcio/Tromboplastina
(Baxter AG). Se estimó el tiempo de coagulación tal como se describe
en el Ejemplo 3. La actividad de fX en unidades se determinó
utilizando una curva estándar establecida con un estándar de
referencias de fX (Baxter AG). Las preparaciones se administraron
vía intravenosa bajo anestesia a la dosis indicada en U/kg (Tabla
5). A los 30 min de la inyección, se indujo el sangrado mediante el
corte de la cola a una distancia de 1 cm de su extremo. El
porcentaje de supervivencia de los animales después de 48 horas
sirve de parámetro para la funcionalidad.
La reducción notable de mortalidad observada
para los animales tratados con FEIBA demuestra que los ratones
noqueados de fVIII representan un sistema modelo adecuado. Ninguno
de los animales tratados con 300 U de rfXwt/kg sobrevivió,
resultado esperado teniendo en cuenta los descubrimientos in
vitro. Sin embargo, la aplicación de rfX/fXIa
(Q-R/I) a 300 U/kg resultó en una mejora
significativa del porcentaje de supervivencia (60%). Este resultado
demostró que las moléculas del análogo de rfX muestran una actividad
bypass significativa de fVIII in vivo a la dosificación
utilizada.
En conclusión, las propiedades funcionales de la
molécula de rfX/fXIa (Q-R/I) descritas en estos
experimentos demuestran que representa un candidato importante para
el desarrollo de un agente terapéutico alternativo para el
tratamiento de hemofílicos que tienen anticuerpos inhibitodores
desarrollados.
<110> Baxter AG
\hskip1.05cmHimmelspach, Michele
\hskip1.05cmSchlokat, Uwe
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Análogo de factor X con una
capacidad mejorada para ser activado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> FA235
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> A1377/99
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
1999-08-10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1467
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 488
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Iniciador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattactcgag aagcttacca tggggcgccc actg
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattacaattg ctgcagggat ccac
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcaaggcct gcattcccac a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgctcccac gatcctggtg aagtcattaa agctttgctc aggctgcgtc tggtt
\hfill55
Claims (35)
1. Análogo de Factor X que contiene una
modificación entre Glu226 e Ile235, con respecto a la numeración de
aminoácidos según la Figura 1, caracterizado porque contiene
una secuencia de factor X con
Glu226-R8-R7-R6-R5-R4-R3-R2-Arg234-R1
donde
\vskip1.000000\baselineskip
- a)
- R1 es Ile;
- b)
- R2 es Thr;
- c)
- R3 es Phe;
- d)
- R4 es Asp;
- e)
- R5 es Asn;
- f)
- R6 es Phe;
- g)
- R7 es Ser y
- h)
- R8 es Gln.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Análogo de factor X según la reivindicación
1, caracterizado porque la modificación forma un sitio de
procesamiento para el factor XIa o para un derivado del mismo.
3. Análogo de factor X según la reivindicación 1
ó 2, caracterizado porque tiene una modificación adicional
en la región de la secuencia de aminoácidos
C-terminal del factor X.
4. Análogo de factor X según la reivindicación
3, caracterizado porque tiene una modificación en la región
C-terminal del sitio de segmentación del
\beta-péptido.
5. Análogo de factor X según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque dicha
modificación permite una activación in vivo del análogo de
factor X en el factor Xa natural o en un análogo de factor Xa.
6. Análogo de factor X según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicha
modificación permite una activación in vitro del análogo de
factor X en el factor Xa natural o en un análogo de factor Xa.
7. Análogo de factor X según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque dicho análogo
contiene un \beta-péptido intacto.
8. Análogo de factor X según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7 en forma de una molécula de doble cadena.
9. Análogo de factor X según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8 que tiene una región
C-terminal acortada.
10. ADN recombinante que codifica para el
análogo de factor X según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9
contenido en un vector para la expresión recombinante de la proteína
codificada.
11. Preparación que contiene un análogo de
factor X purificado o una proteína precursora del mismo, conteniendo
dicho análogo de factor X una modificación entre Glu226 e Ile235
tal como se define en la reivindicación 1 ó 2.
12. Preparación según la reivindicación 11,
caracterizada porque el análogo de factor X está presente en
forma de FX\alpha.
13. Preparación según la reivindicación 11,
caracterizada porque el análogo de factor X tiene una
secuencia de aminoácidos C-terminal acortada.
14. Preparación según la reivindicación 11,
caracterizada porque contiene el análogo de factor X como
molécula de doble cadena.
15. Preparación según la reivindicación 11,
caracterizada porque contiene un análogo de factor X de una
cadena única en una forma enzimáticamente inactiva, con una pureza
mínima del 80% y porque no contiene intermedios proteolíticos
inactivos de análogo de factor X/Xa.
16. Preparación según la reivindicación 11,
caracterizada porque contiene el análogo de factor X como
molécula de una sola cadena.
17. Preparación según la reivindicación 11,
caracterizada porque contiene un análogo de factor X que
tiene una modificación que permite una activación in vivo
del análogo de factor X en el factor Xa natural o en un análogo de
factor Xa.
18. Preparación según la reivindicación 11,
caracterizada porque contiene un análogo de factor X que
tiene una modificación que permite una activación in vitro
del análogo de factor X en el factor Xa natural o en un análogo de
factor Xa.
19. Preparación según la reivindicación 11,
caracterizada porque se formula como una preparación
farmacéutica.
20. Preparación que contiene un análogo de
factor X activado que se puede obtener mediante la activación del
análogo de factor X según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9,
teniendo dicho análogo de factor X activado una gran estabilidad e
integridad estructural, estando libre dicha preparación de
intermedios inactivos de análogo de factor X/Xa y de productos de
la descomposición autoproteolítica del factor X.
21. Preparación según la reivindicación 20,
caracterizada porque contiene una matriz fisiológicamente
aceptable y está presente en una forma que es estable durante el
almacenamiento.
22. Preparación según la reivindicación 20,
caracterizada porque contiene un factor sanguíneo o una forma
activada de un factor sanguíneo como componente adicional.
23. Preparación según la reivindicación 22,
caracterizada porque contiene como mínimo un componente con
actividad bypass inhibidora de factor VIII como componente
adicional.
24. Preparación según la reivindicación 11,
caracterizada porque se formula como un compuesto
farmacéutico y está presente como una preparación
multicomponente.
25. Utilización de la preparación según la
reivindicación 11 para producir un medicamento.
26. Utilización del ADN recombinante según la
reivindicación 10 para producir un medicamento.
27. Método para la producción de la preparación
según la reivindicación 11, caracterizado porque el análogo
de factor X que ha sido obtenido por medio de la producción
recombinante se aísla y purifica por medio de un proceso
cromatográfico.
28. Método para la producción de la preparación
de un análogo de factor X, comprendiendo dicho método los
siguientes pasos:
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- preparación de un ADN recombinante que codifica para el análogo de factor X según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 contenido en un vector para la expresión recombinante de la proteína codificada,
- -
- transformación de una célula adecuada,
- -
- expresión del análogo de factor X,
- -
- aislamiento del análogo de factor X y
- -
- purificación del análogo de factor X por medio de un proceso cromatográfico.
\vskip1.000000\baselineskip
29. Método según la reivindicación 28,
caracterizado porque después de la expresión del análogo de
factor X, éste es activado por el factor XIa o por un derivado del
mismo.
30. Método según la reivindicación 27,
caracterizado porque el análogo de factor X se aísla en forma
de una molécula de doble cadena.
31. Método según la reivindicación 27,
caracterizado porque el análogo de factor X de doble cadena
está segmentado con el factor XIa de un derivado del mismo.
32. Método según la reivindicación 27,
caracterizado porque el análogo de factor X se aísla en forma
de molécula de una sola cadena.
33. Método según la reivindicación 31,
caracterizado porque un análogo de factor X de una sola
cadena se procesa con furina o con un derivado de la misma y porque
permite además la activación con el factor XIa o con un derivado
del mismo en el factor Xa o en el análogo de factor Xa.
\newpage
34. Método para la producción de una preparación
que contiene factor Xa activado o un análogo de factor Xa,
caracterizado por el hecho de que un análogo de factor X que
se produjo mediante la utilización del método según la
reivindicación 27 está sometido a un paso de activación.
35. Método según la reivindicación 27,
caracterizado por el hecho de que se obtiene un análogo de
factor Xa purificado con una gran estabilidad e integridad
estructural que está libre de intermedios de factor X/Xa
inactivos.
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