ES2302696T3 - Analogo de factor x con mejor capacidad de activacion. - Google Patents

Abstract

Análogo de Factor X que contiene una modificación entre Glu226 e Ile235, con respecto a la numeración de aminoácidos según la Figura 1, caracterizado porque contiene una secuencia de factor X con Glu226-R8-R7-R6-R5- R4-R3-R2-Arg234-R1 donde a) R1 es Ile; b) R2 es Thr; c) R3 es Phe; d) R4 es Asp; e) R5 es Asn; f) R6 es Phe; g) R7 es Ser y h) R8 es Gln.

Description

Análogo de factor X con mejor capacidad de activación.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a análogos de factor X con una capacidad incrementada para ser activados por medio de una sustitución en la región del péptido de activación, a una preparación que contiene los análogos de factor X de acuerdo con la presente invención y a un método para la producción de análogos de factor X de cadena única y de doble cadena.

Antecedentes de la invención

Una vez iniciado el proceso de coagulación sanguíneo, la cascada de coagulación pasa por las etapas de activar secuencialmente varias proenzimas (zimógenos) sanguíneas en sus formas activas, las serina-proteasas. Estas incluyen, entre otras, el factor XII/XIIa, factor XI/XIa, factor IX/IXa, factor X/Xa, factor VII/VIIa y protrombina/trombina. La mayoría de estas enzimas están activas en estado fisiológico solamente cuando están asociadas a un complejo sobre una superficie de membrana. Los iones Ca están implicados en muchos de estos procesos. La coagulación sanguínea sigue tanto la vía intrínseca, en cuyo caso todos los componentes proteicos están presentes en la sangre, como la vía extrínseca, en la cual el factor tisular de la membrana celular desempeña un papel crítico. Finalmente, el cierre de la herida se produce como resultado de la conversión del fibrinógeno en fibrina mediante la acción de la
trombina.

El complejo protrombinasa es el responsable de la activación de la protrombina para formar trombina. La trombina es una enzima importante que puede actuar tanto como procoagulante como anticoagulante. El complejo protrombinasa, en el que, entre otros, participan el factor Va (como cofactor) y el factor Xa (como serina-proteasa), se reúne en una asociación dependiente del Ca en la superficie de los fosfolípidos. Se supone que el componente catalítico del complejo protrombinasa es el factor Xa.

El factor X (también denominado factor de Stuart-Prower o factor de Prower) es una glicoproteína de coagulación dependiente de la vitamina K que participa en la cascada intrínseca y en la extrínseca de la coagulación sanguínea. El producto primario de traducción del factor X (pre-pro-FX) contiene 488 aminoácidos y es sintetizado en el hígado por las células de hepatoma humano en primer lugar como proteína precursora de cadena única de 75 kD. En el plasma, el factor X está presente principalmente como molécula de doble cadena (Fair y col., Blood 64 (1984), pp. 194-204).

Durante la biosíntesis, después de la segmentación de la presecuencia por una peptidasa señal (entre Ser23 y Leu24) y el propéptido (entre Arg40 y Ala41), la molécula de factor X de cadena única es segmentada mediante el procesamiento y la deleción del tripéptido Arg180-Lys181-Arg182 en la forma de cadena doble, que comprende una cadena ligera de aproximadamente 22 kD y una cadena pesada de aproximadamente 50 kD, estando conectadas ambas cadenas por medio de un puente disulfuro (Figura 1). Por tanto, el factor X circula en el plasma como molécula de doble cadena.

Durante el proceso de coagulación sanguínea, el factor X se convierte desde el zimógeno inactivo en factor Xa proteasa activa mediante una acción proteolítica limitada, durante la cual la activación del factor X para formar el Factor Xa puede tener lugar en uno de los 2 complejos unidos a membrana: el complejo factor VIIa extrínseco/factor tisular o el complejo Ca fosfolípido factor VIIIa intrínseco/factor IXa, el denominado "complejo tenasa" (Mertens y col., Biochem. J. 185 (1980), pp. 647-658). La segmentación proteolítica entre los aminoácidos Arg234 e Ile235 conduce a la liberación de un péptido de activación de 52 aminoácidos de longitud desde el extremo N-terminal de la cadena pesada y, por tanto, a la formación de la enzima activa, factor Xa. El centro catalítico del factor Xa está localizado en la cadena pesada.

La activación vía el complejo factor VIIa-TF (extrínseco) conduce a la formación del factor Xa\alpha (35 kD) y del factor Xa\beta (31 kD), y, cuando las concentraciones de factor VIIa en el complejo son bajas, también está presente un polipéptido de 42 kD.

La formación del factor Xa\alpha tiene lugar vía una segmentación en Arg234/Ile235 de la cadena pesada y representa la activación del factor X para formar el factor Xa. La presencia del factor Xa\beta probablemente es resultado de una segmentación autocatalítica en Arg469/Gly470 en el extremo C-terminal de la cadena pesada del factor Xa\alpha y de la segmentación de un péptido de 4,5 kD. Como el factor Xa\alpha, el factor Xa\beta tiene también actividad catalítica. Se ha demostrado, sin embargo, que durante la segmentación del factor Xa\alpha para formar Xa\beta, se forma un sitio de unión con el receptor plasminógeno y que el factor Xa\beta puede tener también actividad fibrinolítica y puede participar como cofactor en la fibrinolisis. La conversión del factor Xa\alpha en el factor Xa\beta, sin embargo, continúa más lentamente que la formación de trombina, a consecuencia de lo cual se impide la iniciación de la fibrinolisis antes de la formación de un coágulo de sangre (Pryzdial y col., J. Biol. Chem. 271 (1996), pp. 16614-16620; Pryzdial y col., J. Biol. Chem. 271 (1996), pp. 16621-16626).

El polipéptido de 42 kD es resultado de un procesamiento en el extremo C-terminal de la cadena pesada entre Arg426 y Gly470 sin procesamiento previo entre Arg234 e Ile235. De forma similiar a un fragmento de factor Xa\gamma, este intermedio que se forma como consecuencia de la proteolisis en Lys370 tampoco tiene actividad catalítica (Mertens y col., Biochem. J. 185 (1980), pp. 647-658; Pryzdial y col., J. Biol. Chem. 271 (1996), pp. 16614-16620).

La activación del factor X en la ruta intrínseca es catalizada por el complejo factor IXa-factor VIIIa. Durante la activación, se obtienen los mismos productos de proceso, pero el producto del factor Xa\beta se obtiene con un rendimiento mayor que otros productos de proceso del factor X (Jesty y col., J. Biol. Chem. 249 (1974), p. 5614).

In vitro, el factor X se puede activar, por ejemplo, por medio del Veneno de Víbora de Russell (RVV) o de tripsina (Bajaj y col., J. Biol. Chem. 248, (1973), pp. 7729-7741) o mediante activadores fisiológicos purificados, tales como el complejo FVIIa/TF o el complejo factor IXa/factor VIIIa (Mertens y col., Biochem. J. 185 (1980), pp. 647-
658).

En la mayoría de los casos, los productos de factor X comerciales de plasma contienen una mezcla de factor Xa\alpha y factor Xa\beta, ya que después de la activación del factor X para formar el factor Xa, principalmente se forma el factor Xa\alpha, el cual, a su vez, es segmentado en un proceso autocatalítico para formar el factor Xa\beta.

Para conseguir un producto uniforme de factor Xa con una alta integridad molecular, la EP 0 651 054 propuso que el factor X fuera activado durante un período de tiempo relativamente largo con RVV, con el resultado de que el producto final resultante contenía principalmente factor Xa\beta. Ambos subproductos, por ejemplo, el factor Xa\alpha, y la proteasa fueron eliminados posteriormente en varios pasos cromatográficos.

Se aisló y caracterizó el cADN para el factor X (Leytus y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1984), pp. 3699-3702; Fung y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), pp. 3591-3595). Se expresó el factor X humano in vitro en diversos tipos celulares, tales como células embrionarias de riñón humano o células CHO (Wolf y col., J. Biol. Chem. 266 (1991), pp. 13726-13730). Se descubrió, sin embargo, que en la expresión recombinante del factor X humano, contrariamente a la situación in vivo, el procesamiento en la posición Arg 40/Ala41 era ineficaz y que se formaban distintos N-terminales en la cadena ligera del factor X (Wolf y col., J. Biol Chem. 266 (1991), pp. 13726-13730). In vitro, el factor X recombinante (rFX) se activó por medio de RVV para formar el factor Xa recombinante (rFXa) o se expresó directamente el rFXa, durante lo cual se suprimió el péptido de activación del aminoácido 183 al aminoácido 234 y se sustituyó por un tripéptido para permitir el procesamiento directo en una forma rFXa de doble cadena. Se procesó aproximadamente el 70% de rFX purificado para formar una cadena ligera y pesada y el 30% restante constituyó el rFX de cadena única de 75 kD. Aunque la expresión directa o el rFXa condujera realmente a la formación del factor Xa activo, condujo también a intermedios inactivos. Además, Wolf y col., (J. Biol. Chem. 266 (1991), pp. 13726-13730) observaron también una disminución de la actividad del factor X recombinante, lo que atribuyeron a la menor capacidad de activación de rFX mediante RVV y a la población inactiva de proteínas y polipéptidos de la molécula precursora de cadena única. En particular, descubrieron que el rFXa, cuando es expresado por células recombinantes, es muy inestable, lo que atribuyeron a la alta proporción de autoproteolisis.

La WO 98/38317 describe análogos de factor X en los que pueden modificarse los aminoácidos entre Glu228 y Arg234, a consecuencia de lo cual estos constructos pueden activarse, por ejemplo, mediante proteasas como furina.

Para estudiar la función del péptido C-terminal del factor Xa\alpha, Eby y col., (Blood 80 (Suppl. 1) (1992), pp. 1214 A) introdujeron un codón de parada en la posición Gly430 de la secuencia del factor X. Sin embargo, no encontraron diferencia entre la velocidad de activación del factor Xa (FXa\alpha) con un \beta-péptido y un mutante por deleción sin un \beta-péptido (FXa\beta).

El factor Xa es un componente importante del complejo protrombinasa y por ello se utiliza para interrumpir rápidamente el sangrado, así como en pacientes con trastornos de la coagulación sanguínea, por ejemplo con hemofilia. Especialmente en el tratamiento de pacientes que padecen hemofilia, la cual se caracteriza por una deficiencia de factor VIII o de factor IX, con concentrados de factor que se producen a partir de plasma, con frecuencia surge la complicación de que se forman anticuerpos inhibidores de estos factores. Por ello se han desarrollado múltiples alternativas para tratar pacientes que padecen hemofilia con factores con una actividad bypass. Así, por ejemplo, se ha propuesto la utilización uso de un concentrado de complejo protrombina, de un complejo protrombinasa parcialmente activado (APPC), factor VIIa, o FEIBA. Las preparaciones comerciales con actividad bypass inhibidora de factor VIII incluyen, por ejemplo, FEIBA® o Autoplex®. FEIBA, por ejemplo, contiene unidades comparables de factor II, factor VII, factor IX, factor X y FEIBA, pequeñas cantidades de factor VIII y factor V y trazas de factores de coagulación activados, tales como trombina y factor Xa y/o un factor con actividad análoga a la del factor Xa (Elsinger, Activated Prothrombin Complex Concentrates. Eds. Mariani, Russo, Mandelli (1982), pp. 77-87). Elsinger recalca especialmente la importancia de una actividad "análoga a la del factor Xa" en FEIBA. La actividad bypass inhibidora del factor VIII fue demostrada por Giles y col., (British J. Hematology 9 (1988), pp. 491-497) en un modelo animal, en particular para una combinación de factor Xa purificado y fosfolípidos.

Por tanto, existe una necesidad notable y una diversidad de distintos campos de aplicación para el factor X/Xa o para proteínas análogas al factor X/Xa, bien sea por sí mismas o como componentes de un complejo de coagulación en la terapia hemostática. En comparación con la vida media del zimógeno, la vida media del factor Xa se reduce considerablemente tanto in vivo como in vitro. Así, por ejemplo, el factor X se puede almacenar de forma estable en glicerol durante 18 meses, mientras que, en las mismas condiciones, el factor Xa es estable solamente durante 5 meses (Bajaj y col., J. Biol. Chem. 248 (1973), pp. 7729-2241), o, cuando se almacena en glicerol a 4ºC durante 8 meses, muestra una reducción de la actividad en más del 60% (Teng y col., Thrombosis Res. 22 (1981), pp. 213-220). En suero, la vida media del factor Xa es solamente de 30 segundos.

Debido a la inestabilidad del factor Xa, se ha propuesto que se administren preparaciones de factor X (US
4.501.731). Sin embargo, en casos donde el sangrado amenaza la vida, en particular en pacientes que padecen de hemofilia, la administración de factor X no produce efecto, ya que, debido a la falta de "complejo tenasa" funcional, no es posible que se produzca una activación eficaz del factor X en factor Xa en la vía intrínseca de coagulación sanguínea y ya que una activación por medio de la vía extrínseca a menudo es demasiado lenta para tener un efecto rápido. Además, los pacientes que padecen de hemofilia tienen un suministro suficiente de factor X; sin embargo, en comparación con el factor Xa, el factor X tiene una actividad protrombinasa 1.000 veces menor. En casos de este tipo, el factor Xa activado debe ser administrado de forma directa, posiblemente en combinación con fosfolípidos, tal como se describe en Giles y col. (British J. Haematology 9 (1988), pp. 491-497), o con otros factores de coagulación, por ejemplo, con la actividad bypass inhibidora del factor VIII. Himmelspach y col., Thrombosis and Haemostasis, 1999, página 758, describen diversos derivados de factor X recombinante en los que se sustituyen los residuos que preceden directamente al sitio de segmentación de la activación y conservan la activabilidad por el factor VII/TF, pero han adquirido la predisposición a la segmentación del factor XIa (véase el resumen). Además, la WO 98/38317 describe análogos de factor X que tienen una modificación en la zona del sitio de segmentación de activación del factor Xa de origen natural, representando dicha modificación un sito de procesamiento de una proteasa que no se segmenta de forma natural en esta zona de la secuencia de factor X (véase el resumen).

Hasta ahora, en la producción del factor Xa a partir del factor X, la activación se ha desencadenado principalmente por medio de activadores no fisiológicos de origen animal, tales como RVV o tripsina, pero esto significa que se ha de tener cuidado en asegurar con absoluta certeza que el producto final esté totalmente libre de estas proteasas. Tal como se ha mencionado anteriormente, durante la activación del factor X en factor Xa, se forma una gran cantidad de intermedios inactivos (Bajaj y col., J. Biol. Chem. 248 (1973), pp. 7729-7741, Mertens y col., Biochem. J. 185 (1980), pp. 647-658). La presencia de estos intermedios conduce a una disminución de la actividad específica del producto y potencialmente incluso al tipo de intermedios que pueden servir de antagonistas de la serina-proteasa activa. Así, para producir un producto uniforme, puro, con alta actividad específica, por medio de métodos convencionales, se necesitan procedimientos que llevan tiempo y son complicados para activar y llevar a cabo la purificación cromatográfica.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona una preparación que contiene un polipéptido con la actividad del factor X/Xa, que, en comparación con la técnica anterior, puede ser activado más fácilmente por el factor XIa o por un derivado del mismo, presentando una alta estabilidad, y que puede ser activado por medio del factor XIa o por un derivado del mismo, sin tener que utilizar una de las proteasas empleadas en la técnica anterior para activar el factor X natural, particularmente una de origen animal, tal como RVV o tripsina. Otro objetivo de la presente invención consiste en conseguir una preparación farmacéutica con actividad bypass inhibidora del factor VIII.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos del factor X (Seq. ID NO. 1 y 2).

Figura 2: representación esquemática del análogo de factor X con un sitio de corte proteasa modificado en la región del péptido de activación.

Figura 3: muestra un análisis Western Blot del factor X recombinante expresado en células CHO.

Figura 4: muestra un análisis Western Blot después de la activación in vitro del análogo de factor X con el factor XIa.

Figura 5: muestra la purificación del rfX/rFXIa (Q-R/I) por cromatografía de intercambio aniónico.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona un análogo de Factor X con una modificación en la región de los residuos de aminoácidos 226-235 con referencia a la secuencia mostrada en la Figura 1, caracterizado porque contiene una secuencia de factor X con Glu226-R8-R7-R6-R5-R4-R3-R2-Arg234-R1, donde

a)

R1 es Ile;

b)

R2 es Thr;

c)

R3 es Phe;

d)

R4 es Asp;

e)

R5 es Asn;

f)

R6 es Phe;

g)

R7 es Ser y

h)

R8 es Gln.

Aquí, el término "modificación" se refiere a una mutación, deleción, inserción o sustitución de un residuo de aminoácido dentro de la secuencia designada. El término "sustitución" se refiere a la sustitución de un residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido diferente dentro del polipéptido. El término "deleción" se refiere a la ausencia de al menos uno de los residuos de aminoácido dentro del polipéptido, sin sustitución por otro residuo de aminoácido. El término "inserción" se refiere a la colocación de un residuo de aminoácido extra dentro del polipéptido. El término "mutación" se refiere a cualquier cambio en la secuencia del polinucleótido o del polipéptido designado, cambio que puede ser una deleción, una inserción o una sustitución de uno o más ácidos nucleicos o aminoácidos dentro de la secuencia designada de ácidos nucleicos o aminoácidos. Preferentemente, en la presente invención, la modificación es una sustitución de al menos un aminoácido.

La modificación del aminoácido en esta región crea un nuevo sitio de reconocimiento y procesamiento para el factor XIa o para un derivado del mismo, sitio que no es de origen natural en esta posición en el polipéptido. El factor XIa o un derivado del mismo no segmenta normalmente Fx en la región de Glu-Arg-Gly-Asp-Asn-Asp-Phe-Thr-Arg/Ile de los aminoácidos 226-234. Sorprendentemente, el análogo de factor X de acuerdo con la presente invención tiene una mayor capacidad, al menos 2 veces superior, preferentemente al menos 5 veces superior y especialmente al menos 10 veces superior, para ser activado por el factor XIa en comparación con el análogo de factor X según la WO 98/38317.

Además, fue sorprendente descubrir que el análogo de factor X de acuerdo con la presente invención, a una concentración de antígenos de 4-8 \mug/ml, es capaz de reducir el tiempo de coagulación de plasma deficiente en factor IX o FVIII de forma más eficaz que > 200 mU, preferentemente > 500 mU, especialmente > 1.000 mU del factor plasmático IX o FVIII.

La modificación se selecciona para garantizar que el procesamiento por medio del factor XIa conduce a un polipéptido que corresponde al factor natural Xa y que se parece esencialmente a la secuencia del factor Xa de origen natural y que tiene también la actividad del factor Xa.

Preferentemente, el aminoácido isoleucina del NH_{2}-terminal de la cadena pesada debe mantenerse después de la activación, ya que este aminoácido desempeña un papel importante en la formación del bolsillo de unión al sustrato (Watzke y col. (1995), Molecular Basis of Thrombosis and Hemostasis, eds. Katherine High and Harold Roberts). En comparación con la secuencia del factor X natural, los análogos de factor X de acuerdo con la presente invención son estructuralmente diferentes, en particular a nivel de aminoácidos, pero su capacidad para ser activados es comparable con el factor X de origen natural y, después de la activación, tienen actividad de factor Xa.

La invención permite disponer de análogos de factor X que están modificados en el péptido de activación en comparación con la secuencia de factor X de origen natural y que tienen una especificidad de proteasa modificada. Las modificaciones de los aminoácidos pueden tener lugar en la posición Ile235 (R1), Arg234, Thr233 (R2), Leu232 (R3), Asn231 (R4), Asn230 (R5), Asp229 (R6), Gly228 (R7) y Arg229 (R8), mientras que Arg234, sin embargo, permanece preferentemente sin cambios.

Los análogos de factor X de acuerdo con la presente invención tienen una secuencia de factor X con Glu226-R8-R7-R6-R5-R4-R3-R2-Arg234-R1, donde

a)

R1 es Ile;

b)

R2 es Thr;

c)

R3 es Phe;

d)

R4 es Asp;

e)

R5 es Asn;

f)

R6 es Phe;

g)

R7 es Ser; y

h)

R8 es Gln.

Preferentemente, las secuencias de aminoácidos son del tipo que corresponde a las secuencias de aminoácidos del péptido de activación del factor IX. Estas secuencias pueden corresponder a las regiones del péptido de activación del factor IX humano, pero también animal (por ejemplo murino, porcino, etc.).

Las modificaciones pueden llevarse a cabo, por ejemplo, por mutagénesis in vitro específica del sitio o por PCR o por cualquier otro método de ingeniería genética conocido en la técnica anterior que sea adecuado para cambiar específicamente una secuencia de ADN con el fin de llevar a cabo intercambios específicos de aminoácidos.

De acuerdo con la presente invención, la activación del análogo de factor X de acuerdo con la presente invención para formar un factor Xa natural o un análogo de factor Xa se lleva a cabo por medio del factor XIa o un derivado del mismo.

Una de las dificultades encontradas en la producción del factor Xa activo es su inestabilidad, ya que, además del factor Xa\alpha, como resultado de la autocatálisis se forman factor Xa\beta y otros intermedios, algunos posiblemente inactivos.

Por tanto, para producir el factor X/Xa activo sustancialmente intacto y/o moléculas similares al factor X/Xa, sería deseable obtener solamente proteínas que llevan a productos finales estables.

Es conocido que un sitio de segmentación preferente para procesar el factor Xa\alpha (FXa\alpha) para formar el factor Xa\beta (FXa\beta) se localiza entre Arg469 y Gly470. Según los estudios de Eby y col. (Blood, Vol. 80, Suppl. 1 (1992), p. 1214), además de un péptido carboxi terminal prominente (residuos de aminoácidos 476-487) de factor X, se encuentra un péptido adicional más corto (residuos de aminoácidos 474 a 477), que se forma como consecuencia de la autocatálisis del factor Xa\alpha. Para concentrarse en el procesamiento específico del factor X intacto para formar el factor Xa activo sin obtener intermedios inactivos de procesamiento, los análogos de factor X de acuerdo con la presente invención tienen otras modificaciones.

Así, de acuerdo con una realización especial de esta invención, el análogo de factor X de acuerdo con la presente invención se modifica además en la región C-terminal de la secuencia de aminoácidos de factor X.

De acuerdo con una realización de la presente invención, un análogo de factor X del tipo descrito anteriormente contiene un péptido-\beta intacto (FX\alpha). Aquí, el término "péptido-\beta" se refiere a un glicopéptido de 4 kD tal como se conoce de la técnica anterior. El primer sitio de segmentación para la eliminación del péptido-\beta por el plásmido se localiza en Arg469 según la secuencia de aminoácidos de la Fig. 1, lo que resulta en la eliminación del extremo C-terminal completo, es decir, el péptido-\beta (Pryzdial E. y Kessler G., J. Biol. Chem., 1996, pp. 16614-16620). En particular, el análogo de factor X según la presente invención tiene una modificación en la región del sitio de segmentación del péptido-\beta C-terminal que garantiza que la segmentación del péptido-\beta a partir del factor X se vea impedida después de que el factor X haya sido activado para formar el factor Xa. Esto resulta en una molécula de factor Xa de la que hasta un 100% puede aislarse en forma de una molécula intacta de factor Xa\alpha.

La modificación puede ser una mutación, deleción o inserción en la región de la secuencia de aminoácidos de factor X entre las posiciones de los aminoácidos Arg469 y Ser476 y potencialmente de Lys370. Sin embargo, una modificación de aminoácidos preferente es aquella en la que no es posible que tenga lugar una multiplicación del polipéptido, lo que influiría en la estructura y con ello posiblemente en la función y la actividad de la proteína como consecuencia del intercambio de aminoácidos.

De acuerdo con otra realización de la presente invención, los análogos de factor X de acuerdo con esta invención comprenden un intercambio de uno de los aminoácidos en la posición Arg469 y/o Gly470, siendo intercambiado preferentemente Arg469 por Lys, His o Ile y siendo intercambiado preferentemente Gly470 por Ser, Ala, Val o Thr.

Además de una mutación en la posición Arg469 y/o Gly470, los análogos de factor X de acuerdo con la presente invención pueden contener una mutación adicional en la posición Lys370 y/o Lys475 y/o Ser476.

Como resultado de una modificación de aminoácidos en una de estas posiciones, se evita el procesamiento del factor Xa\alpha en factor Xa\beta o en factor Xa\gamma, ya que la(s) secuencia(s) de procesamiento de origen natural es (son) modificada(s) para garantizar que ya no es posible que tenga lugar una segmentación autocatalítica potencial del péptido carboxi terminal.

De acuerdo todavía con otra realización de la presente invención, el análogo de factor X de acuerdo con la presente invención tiene una deleción del péptido-\beta carboxi-terminal (FX\beta). Este análogo de factor X puede obtenerse mediante la expresión de un cADN que codifica para un análogo de factor X en un sistema de expresión recombinante, con solamente aquellas secuencias clonadas que codifican para los aminoácidos Met1 a Arg469.

En todavía otra realización de la presente invención, el análogo de factor X de acuerdo con esta invención tiene una señal de parada de traducción en la región C-terminal de la secuencia de factor X. Esta señal de parada de traducción se encuentra preferentemente en la posición siguiente a un aminoácido C-terminal que se forma después del procesamiento natural. Por tanto, la señal de parada de traducción se encuentra preferentemente en la posición del aminoácido 470 de la secuencia de factor X, de modo que se mantiene el terminal Arg469 del factor Xa\beta. Para garantizar esto, el codón GGC que codifica para el aminoácido Gly470 es intercambiado por TAA, TAG o TGA.

Otra característica de la presente invención se refiere a análogos de factor X que se activan mediante su tratamiento in vivo e in vitro con factor XIa o con un derivado del mismo para obtener el factor Xa nativo o un análogo de factor Xa, es decir, análogos de factor X activados. Dependiendo del análogo de factor X que se utiliza y activa, se obtiene un polipéptido que corresponde y es esencialmente idéntico al factor Xa natural o un polipéptido que, aunque tenga la actividad del factor Xa, tiene modificaciones en comparación con la secuencia del factor Xa natural, modificaciones que, sin embargo, no perjudican a la actividad biológica. Cuando los análogos de factor X de acuerdo con la presente invención, que se modifican en la región del péptido de activación en la secuencia del péptido de activación, se activan, se obtienen solamente los polipéptidos que corresponden a la molécula natural de factor Xa. Si este análogo de factor X contiene también una señal de parada de traducción adicional en la región C-terminal del péptido-\beta, se obtienen moléculas homólogas al factor Xa\beta. Si, por otra parte, se utiliza un análogo de factor X que tiene una o más modificaciones dentro de la secuencia de péptidos-\beta cuyos efectos son la partición del péptido-\beta, se obtiene un análogo de factor Xa\alpha con un intercambio de aminoácidos en el C-terminal de la molécula.

Los análogos de factor X de acuerdo con la presente invención tienen solamente modificaciones que cambian la especificidad por la capacidad de activación y que no tienen un efecto negativo sobre dicha actividad. Por tanto, en todos los casos se obtienen moléculas de factor Xa y análogos de factor Xa biológica y funcionalmente activos.

La activación in vivo e in vitro se puede llevar a cabo por medio del factor XIa o un derivado del mismo. En este contexto, un derivado del factor XIa puede ser un polipéptido o una proteína derivada del factor XIa que es diferente del factor XIa natural, por ejemplo, en cuanto a su longitud (por ejemplo formas truncadas) o que se ha obtenido por modificación de los aminoácidos. En todos los casos, es importante garantizar que el derivado de factor XIa tenga también la actividad proteasa específica que es característica del factor XIa.

De acuerdo con una realización especial, la presente invención consigue análogos de factor X que están preferentemente presentes en forma purificada como moléculas de cadena única. La molécula de factor X de una sola cadena se caracteriza por su alta estabilidad e integridad molecular. Hasta ahora no había sido posible aislar una molécula de factor X de cadena única en la forma purificada, ya que es procesada muy rápidamente en su forma de cadena doble (Fair y col., Blood 64 (1984), pp. 194-204). Los análogos de factor X recombinante de cadena única se pueden procesar mediante un procesamiento específico para formar un factor X de doble cadena y se pueden activar posteriormente en factor Xa o en análogo de factor Xa. Esto se puede llvarse a cabo haciendo que el análogo de factor X de cadena única se ponga en contacto con furina, procesándolo y posteriormente activándolo por medio de factor XIa o con un derivado del mismo.

El análogo de factor X de doble cadena puede activarse para formar el factor Xa o un análogo de factor Xa. Esto se puede llevar a cabo, por ejemplo, utilizando un análogo de factor X que, como consecuencia de la modificación de acuerdo con la presente invención en la región del péptido de activación, tiene un sitio de segmentación del factor XIa, que se expresa y aísla en una célula recombinante como molécula de cadena única y que se procesa posteriormente poniéndolo en contacto con furina y segmentándose luego por medio del factor XIa o con un derivado del mismo para formar una molécula de factor Xa activada.

Se puede tratar directamente un análogo de factor X que se aisló como molécula de doble cadena de un cultivo celular con el factor XIa o con un derivado del mismo.

Debido a la reacción de procesamiento selectiva y específica del sitio, un factor Xa o un análogo de factor Xa así obtenido posee una gran estabilidad e integridad estructural y, en particular, carece de los intermedios del análogo de factor X/Xa inactivos y de productos de degradación autoproteolíticos. Además, el análogo de factor X de acuerdo con la presente invención en particular puede ser fácilmente activado por medio del factor XIa o con un derivado del mismo, con la capacidad de ser activado, incrementándose en al menos 2 veces, preferentemente al menos 5 veces y especialmente al menos 10 veces, su actividad en comparación con los análogos de factor X descritos en la WO 98/38317. Sorprendentemente, se descubrió que los constructos de acuerdo con la presente invención pueden ser activados más fácilmente debido al hecho de que un mínimo de 4, preferentemente un mínimo de 6 de los aminoácidos 226-235 son aminoácidos diferentes a los que se encuentran en la molécula de factor X natural y que preferentemente al menos 3 de los aminoácidos intercambiados se encuentran seguidos inmediatamente uno tras otro.

Una característica adicional de la presente invención se refiere a un ADN recombinante que codifica para los análogos de factor X de acuerdo con la presente invención. Después de su expresión, el ADN recombinante resulta, en una célula huésped adecuada, en un análogo de factor X con una secuencia de aminoácidos que se corresponde con el factor X humano, excepto por una modificación que influye en la especificidad de procesamiento y en los productos de procesamiento. La actividad de coagulación biológica, sin embargo, no se ve influenciada negativamente en modo alguno; en su lugar, sorprendentemente, incluso frecuentemente, resulta un aumento de la actividad.

De acuerdo todavía con otra característica de la presente invención, se consiguen también células transformadas que contienen el ADN recombinante.

Una característica adicional de la presente invención se refiere a una preparación que contiene un análogo de factor X purificado o una proteína precursora del mismo que tiene la modificación de aminoácidos de acuerdo con la presente invención, en la región del sitio de activación del factor Xa de origen natural. La modificación en la región del sitio de segmentación de activación es un sitio de segmentación de nuevo reconocimiento y procesamiento -que no es de origen natural en esta posición en el polipéptido- para el factor XIa o para un derivado del mismo, que no es procesada normalmente por el polipéptido en esta posición. La preparación puede ser una preparación purificada de análogos de factor X, obteniéndose los polipéptidos a partir de un sistema de cultivo celular, bien sea después del aislamiento del sobrenadante del cultivo celular o a partir de un extracto de un cultivo celular. Un análogo de factor X recombinante prepurificado procedente de un sistema de cultivo celular se puede purificar además utilizando procedimientos conocidos de la técnica anterior. En este contexto, procesos cromatográficos tales como la cromatografía de filtración en gel, de intercambio iónico o de afinidad son particularmente adecuados para su utilización.

De acuerdo con una realización de la invención, la preparación de acuerdo con esta invención contiene preferentemente el análogo de factor X como molécula de una sola cadena en forma aislada. Esta preparación se produce mediante el aislamiento de un análogo de factor X, que se obtuvo por producción recombinante, como molécula de una sola cadena, procedente de un sistema celular, preferentemente procedente de un cultivo celular de células deficientes en endoproteasas.

Una característica especial de la presente invención se refiere al hecho de que la preparación contiene un análogo de factor X de una sola cadena con una modificación que, después del procesamiento por medio de furina, permite una activación in vitro del factor Xa por medio del factor XIa o de un derivado del mismo. La activación se realiza colocando el análogo de factor X en contacto con las proteasas, lo que conduce a una segmentación en la forma madura del factor X y, como consecuencia de la modificación, a una segmentación del péptido de activación y a la formación del factor Xa, así como del análogo de factor Xa.

En la preparación de acuerdo con la presente invención, el análogo de factor X puede estar presente bien como factor X\alpha (FX\alpha) o con una deleción del péptido-\beta.

La preparación contiene, en particular, un análogo de factor X en una forma enzimáticamente inactiva con una pureza mínima de un 80%, preferentemente un 90% y especialmente un 95%, y no contiene ningún intermedio proteolítico inactivo de análogo de factor X/Xa.

De acuerdo con otra realización de la presente invención, la preparación según esta invención contiene preferentemente el análogo de factor X como molécula de doble cadena en forma aislada. Para conseguirlo, por ejemplo un análogo de factor X que ha sido obtenido por medio de una producción recombinante como molécula de una sola cadena procedente de un sistema celular se segmenta in vitro, es decir fuera de la célula, por medio de furina, para obtener la forma en doble cadena. Esto se puede llevar a cabo mezclando la proteasa directamente con el sobrenadante del cultivo de los clones que expresan el análogo de factor X, bien sea mezclando la proteasa purificada o un sobrenadanete de un cultivo celular que expresa la proteasa en forma recombinante o por medio de un cocultivo de los clones que expresan el análogo de factor X y la proteasa.

De acuerdo con una realización especial de la presente invención, la preparación que contiene el análogo de factor X purificado de una sola cadena o de doble cadena contiene una matriz fisiológicamente aceptable y se formula potencialmente como una preparación farmacéutica. La preparación se puede formular básicamente utilizando los métodos conocidos de la técnica anterior, se puede mezclar con un tampón que contiene sales, tales como NaCl, CaCl_{2}, y aminoácidos como glicina y/o lisina, en un rango de pH de 6 a 8, y se puede formular como preparación farmacéutica. Hasta que se necesite, la preparación purificada que contiene el análogo de factor X puede almacenarse en forma de solución acabada o en forma liofilizada o congelada. Preferentemente, la preparación se almacena en forma liofilizada y se disuelve en una solución visualmente transparente utilizando una solución de reconstitución apropiada.

Pero la preparación de acuerdo con la presente invención también puede obtenerse como preparación líquida o como líquido en forma congelada.

La preparación de acuerdo con la presente invención es especialmente estable, es decir, se puede dejar reposar en forma disuelta durante un tiempo prolongado antes de su aplicación. Se ha descubierto que la preparación de acuerdo con esta invención se puede dejar reposar durante varias horas e incluso días sin que pierda su actividad.

La preparación de acuerdo con la presente invención se puede colocar en un dispositivo adecuado, preferentemente en un dispositivo de aplicación, en combinación con factor XIa o con un derivado del mismo.

La preparación de acuerdo con la presente invención que contiene un análogo de factor X en combinación con factor XIa o con un derivado del mismo, que es capaz de activar el análogo de factor X en factor Xa o en análogo de factor Xa, se puede conseguir en forma de una preparación combinada que incluye un recipiente para el factor XIa inmovilizado en una matriz, potencialmente en forma de una minicolumna o de una jeringa complementada por una proteasa, y un recipiente que contiene la preparación farmacéutica con el análogo de factor X. Para activar el análogo de factor X, la solución que contiene el análogo de factor X, por ejemplo, se puede comprimir sobre la proteasa inmovilizada. Durante el almacenamiento de la preparación, la solución que contiene el análogo de factor X preferentemente está espacialmente separada de la proteasa. La preparación de acuerdo con la presente invención se puede almacenar en el mismo recipiente que la proteasa, pero los componentes están espacialmente separados por una partición impermeable que se puede eliminar fácilmente antes de la administración de la preparación. Las soluciones se pueden almacenar también en recipientes individuales y ponerse en contacto una con otra sólo poco tiempo antes de la administración.

El análogo de factor X se puede activar en factor Xa poco tiempo antes de su uso inmediato, es decir, antes de la administración al paciente. La activación se puede llevar a cabo colocando un análogo de factor X en contacto con una proteasa inmovilizada o mezclando las soluciones que contienen una proteasa, por una parte, y el análogo de factor X, por otra. Así, es posible mantener separados los dos componentes en la solución y mezclarlos por medio de un dispositivo de infusión adecuado, donde los componentes se ponen en contacto uno con otro a medida que pasan por el dispositivo, provocando así la activación en el factor Xa o en el análogo de factor Xa. El paciente recibe así una mezcla de factor Xa y, además, una serina-proteasa que está a cargo de la activación. En este contexto, es especialmente importante prestar mucha atención a la dosificación, ya que la administración adicional de una serina-proteasa activa también el factor X endógeno, lo que puede acortar el tiempo de coagulación.

De acuerdo con una realización útil de la invención, la preparación farmacéutica se dispone en un dispositivo adecuado, preferentemente en un dispositivo de aplicación, bien sea en forma de líquido congelado o en forma liofilizada. Un dispositivo de aplicación adecuado, por ejemplo, es una jeringa de doble compartimento del tipo descrito en la AT 366 916 o AT 382 783.

Una característica especialmente útil de esta invención es que la preparación puede contener un análogo de factor X con una modificación que hace posible la activación in vivo del análogo de factor X en factor Xa. En particular, los análogos de factor X de la preparación de acuerdo con la presente invención tienen una modificación que representa un sitio de reconocimiento y segmentación para el factor XIa o para un derivado del mismo, permitiendo así que sean segmentados por esta proteasa in vivo para formar el factor Xa natural o el análogo de factor Xa. Como consecuencia, la preparación de acuerdo con la presente invención se puede utilizar para interrumpir el sangrado tanto en pacientes con deficiencia en factor IX y factor VIII, como en pacientes con inhibidor de factor VIII.

La preparación de acuerdo con la presente invención se puede disponer como preparación farmacéutica con actividad de factor Xa en forma de preparación de un solo componente o, en combinación con otros factores, en forma de una preparación multicomponente.

Antes de procesar la proteína purificada en una preparación farmacéutica, la proteína purificada se somete a los controles de calidad convencionales y se elabora en una forma de presentación terapéutica. En particular, durante la fabricación recombinante, se comprueba que la preparación purificada en no contiene ácidos nucleicos celulares o ácidos nucleicos que proceden del vector de expresión, preferentemente empleando un método tal como el descrito en la EP 0 714 987.

Debido a que cualquier material biológico puede estar contaminado con microorganismos infecciosos, es posible que la preparación tenga que ser tratada de forma especial para inactivar o disminuir los virus con el fin de garantizar la obtención de una preparación segura.

Otra característica de esta invención se refiere a la obtención de una preparación que contiene un análogo de factor Xa de alta estabilidad e integridad estructural, así como, en particular, libre de intermedios inactivos de análogo de factor X/Xa y de productos de degradación autoproteolítica, y que se pueda producir mediante la activación de un análogo de factor X del tipo descrito anteriormente y mediante su formulación en una preparación adecuada.

Una característica adicional de la presente invención se refiere a la utilización de una preparación del tipo descrito anteriormente para producir un medicamento. Un medicamento que contiene un análogo de factor X y/o un análogo de factor Xa de acuerdo con la presente invención es especialmente adecuado para el tratamiento de pacientes con trastornos de la coagulación sanguínea, tales como aquellos que padecen de hemofilia o hemofílicos con anticuerpos inhibidores y, en particular, como preparación con actividad bypass inhibidora de factor VIII.

Otra característica de esta invención se refiere a la utilización de un ácido nucleico que contiene las secuencias de codificación del análogo de factor X de acuerdo con esta invención para la producción de un medicamento. En este contexto, el ácido nucleico, debido al hecho de que contiene secuencias de control de expresión adecuadas, se puede administrar en forma de ácido nucleico desnudo, se puede integrar en un vector de expresión recombinante o puede enlazarse a una matriz, tal como un fosfolípido o una partícula viral. El ácido nucleico se puede utilizar para fabricar un medicamento que sea especialmente adecuado para su utilización en el tratamiento de pacientes con trastornos de la coagulación sanguínea, tal como pacientes con hemofilia o hemofílicos con anticuerpos inhibidores. Otra aplicación potencial es la utilización del ácido nucleico en la terapia genética.

Otra característica de la presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de los análogos de factor X de acuerdo con esta invención y a una preparación que contiene un análogo de factor X de acuerdo con esta invención. Para llevarlo a cabo, se introduce una secuencia que codifica para un análogo de factor X en un sistema de expresión adecuado y las células relevantes, preferentemente las líneas celulares permanentes, son transfijadas por el ADN recombinante. Se cultivan las células en condiciones óptimas para la expresión del gen y se aíslan los análogos de factor X del extracto del cultivo celular o del sobrenadante del cultivo celular. La purificación de la molécula recombinante se puede llevar a cabo además utilizando todos los procedimientos cromatográficos convencionales conocidos, tal como cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de afinidad o de inmunoafinidad o una combinación de las mismas.

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Para producir los análogos de factor X de acuerdo con la presente invención, el cADN completo que codifica para el factor X se clona en un vector de expresión. Esto se lleva a cabo por medio de las técnicas de clonación generalmente conocidas. La secuencia de nucleótidos que codifica para el factor X se modifica posteriormente para garantizar que la secuencia de codificación en la región del péptido de activación,y posiblemente en la región del péptido-\beta C-terminal, se cambia para garantizar que se pueda producir una molécula de factor X del tipo descrito anteriormente. Para ello se utilizan métodos de ingeniería genética conocidos de la técnica anterior, por ejemplo mutagénesis in vitro específica del sitio o deleción de secuencias, por ejemplo, por medio de una digestión mediante la restricción por las endonucleasas y la inserción de secuencias cambiadas, distintas, o por PCR. Los mutantes de factor X así producidos se insertan entonces en un sistema de expresión adecuado para la expresión recombinante y se expresan posteriormente.

Los análogos de factor X de acuerdo con la presente invención pueden producirse también por medio de síntesis química.

Los análogos de factor X se producen preferentemente por medio de una expresión recombinante. La producción por métodos de ingeniería genética se puede llevar a cabo con todos los sistemas de expresión conocidos, por ejemplo con líneas celulares permanentes o sistemas de expresión viral. Las líneas celulares permanentes se producen mediante la integración estable de ADN exógeno en el cromosoma de la célula huésped, por ejemplo de Vero, MRC5, CHO, BHK, 293, Sk-Hep 1, especialmente células hepáticas y renales, o mediante un vector episomal procedente, por ejemplo, de papilomavirus. Se pueden utilizar también sistemas de expresión viral, como el virus Vaccinia, baculovirus o sistemas retrovirales. Las líneas celulares normalmente utilizadas son Vero, MRC5, CHO, BHK, 293, Sk-Hep 1, células glandulares, hepáticas y renales. Los sistemas de expresión eucarióticos a utilizar incluyen levaduras, glándulas endógenas (por ejemplo glándulas de animales transgénicos) y demás tipos celulares. Por supuesto, también es posible utilizar animales transgénicos para expresar los polipéptidos de acuerdo con la presente invención o sus derivados. Para expresar las proteínas recombinantes, se ha demostrado que las células CHO-DHFR son especialmente útiles (Urlaub y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, (1980), pp. 4216-4220).

Para la producción recombinante de los análogos de factos X según la presente invención también es posible utilizar sistemas de expresión procarióticos. Especialmente adecuados son aquellos sistemas que permiten la expresión en E. coli o B. subtilis.

Los análogos de factor X se expresan en los sistemas de expresión apropiados utilizando un promotor adecuado. Para la expresión en eucariotas se pueden utilizar todos los promotores conocidos, tales como SV40, CMV, RSV, HSV, EBV, \beta-actina, hGH, o promotores inducibles tales como el promotor hsp o metalotioneína. Los análogos de factor X se expresan preferentemente utilizando el promotor de \beta-actina en células CHO-DHFR.

De acuerdo con una realización de la invención, el método para producir la preparación de acuerdo con la presente invención comprende los siguientes pasos: preparación de un ADN que codifica para un análogo de factor X, transformación de una célula con el ADN recombinante, expresión del análogo de factor X, potencialmente en presencia de una proteasa, aislamiento del análogo de factor X y purificación potencial por medio de un procedimiento cromatográfico.

De acuerdo con una realización del método, el análogo de factor X se aísla como molécula de doble cadena.

Con este propósito, el análogo de factor X se expresa en una célula que permite el procesamiento de los análogos del profactor X en análogos de factor X de doble cadena.

Posteriormente, el análogo de factor X de doble cadena así obtenido puede ser aislado, purificado y, tal como se describe anteriormente, almacenado de forma estable hasta su posterior uso.

De acuerdo con una realización de esta invención, la activación se desencadena mediante un paso cromatográfico en el que la proteasa es inmovilizada en una matriz. El análogo purificado de factor X de doble cadena pasa por una matriz a la que está unida la proteasa, y a partir del eluato, se aísla el factor Xa purificado.

De acuerdo con otra realización de la invención, se mezclan los componentes y se elimina selectivamente la proteasa de la mezcla.

Además, también es posible, por supuesto, procesar un análogo del profactor X de una sola cadena en la forma del análogo de factor X de doble cadena y activarlo en factor Xa en un único proceso.

Las condiciones de reacción de la(s) reaccion(es) de procesamiento y de activación pueden ser optimizadas fácilmente por los especialistas en la técnica dependiendo del montaje experimental de cualquier situación determinada. En este contexto, se debe observar que el la velocidad de flujo de los reactivos utilizados es especialmente importante para la duración del tiempo de contacto. Este flujo debe encontrarse en el rango de 0,01 ml/min a 1 ml/min. Otros parámetros importantes son la temperatura, el pH y las condiciones de elución. Al final del tiempo de flujo, el factor Xa activado además puede ser opcionalmente purificado por medio de una cromatografía selectiva. Llevar a cabo el método con la proteasa que está unida a una matriz ofrece una ventaja especial ya que, como consecuencia de la utilización de una matriz, preferentemente de columnas cromatográficas, el montaje de la reacción permite incluir un paso adicional de purificación.

Una característica adicional de la producción de un análogo de factor X de acuerdo con esta invención consiste en que el análogo de factor X está aislado como molécula de una sola cadena. Con este propósito, el análogo de factor X se expresa en una célula en la que no puede producirse la segmentación en la cadena ligera y pesada del factor X y/o de un análogo de factor X. La furina es una de las proteasas importantes responsables de la segmentación del factor X en su cadena ligera y pesada. A partir de esta célula mutante deficiente en endoproteasa es posible aislar el análogo de factor X en forma de una molécula de una sola cadena. Un análogo de factor X que se aísla de esta manera y potencialmente se purifica también se pone posteriormente en contacto con la furina en condiciones en las que el análogo de factor X de una sola cadena se segmenta en forma del factor X de doble cadena. Los análogos de factor X de acuerdo con la presente invención, que tienen una modificación en la región del péptido de activación que posibilita una segmentación por el factor XIa, pueden activarse posteriormente por este método, posiblemente de forma directa, poniéndolos en contacto con el factor XIa o con un derivado del mismo para formar el factor Xa o el análogo de factor Xa.

De acuerdo con otra característica de esta invención, utilizando el método de acuerdo con la invención, se obtiene una preparación que contiene el factor Xa activo o un análogo del factor Xa activo sometiendo un análogo de factor X, obtenido tal como se ha descrito anteriormente, a un paso de activación y procesando el polipéptido activado en una preparación purificada, formulándose potencialmente como compuesto farmacéutico.

Utilizando los análogos de factor X de acuerdo con la invención, los cuales son activados en factor Xa por un proceso descrito anteriormente, se obtiene un factor Xa y/o un análogo de factor Xa purificado con una gran estabilidad e integridad estructural, el cual, en particular, está exento de intermedios inactivos de factor X/Xa.

Esta invención se explica de forma más detallada en base a los siguientes ejemplos y figuras, sin, sin embargo, limitar la invención en modo alguno.

Ejemplos Ejemplo 1 Construcción y expresión del factor X recombinante de tipo salvaje (rFX) y de análogos de factor X/FXIa (Q-R/I) a. Producción del vector de expresión de rFX, phAct-rFX

Se aisló cADN de FX de un banco de cADN-lambda de hígado humano tal como se describe en Messier y col. (Gene 99 (1991), pp. 291-294). Por medio de PCR, utilizando el oligonucleótido #2911, (5'-ATTACTCGAGAAGCTTAC
CATGGGGCGCCCACTG-3') (SEQ ID No. 3) como cebador 5' y el oligonucleótido #2912 (5'-ATTACAATTGCTG
CAGGGATCCAC-3') (SEQ. ID No. 4) como cebador 3', se amplificó un fragmento de ADN procedente de un clon positivo, conteniendo el fragmento de ADN la secuencia de codificación FX de 1.457 kB y 39 pb de la región no traducida 3', flanqueada por un sitio de corte Xhol en el extremo 5' y un sitio de corte MfeI en el extremo 3'. Además, por medio del iniciador #2911, se insertó la secuencia ACC delante de ATG de FX, garantizando así que se formaba una secuencia Kozak óptima de inicio de traducción. Posteriormente, este fragmento de PCR fue clonado como fragmento XhoI/MfeI en un vector de expresión phAct que había sido cortado con SalI en EcoRI. El factor de expresión phAct comprende aproximadamente 3,3 kb del promotor, 78 pb de 5'UTR y el intrón del gen de la beta-actina humana que mide aproximadamente 1 kb (Fischer y col., FEBS Lett. 351 (1994), pp. 345-348), un sitio de corte de clonación múltiple y el sitio de poliadenilación SV40. El plásmido de expresión resultante se llamó phAct-rFX.

b. Producción del plásmido de expresión phAct-rFX/FXIa (Q-R/I)

Para producir análogos de FX/FXIa (Q-R/I) recombinantes, la secuencia de aminoácidos de la posición 227 a 234 (Arg-Gly-Asp-Asn-Asn-Leu-Thr-Arg/Ile) que sirve para activar FX en FXa fue sustituida con el complejo tenasa intrínseco FIXa/FVIIIa o por el complejo extrínseco FVIIa/TF, por la secuencia Gln-Ser-Phe-Asn-Asp-Phe-Thr-Arg/Ile (denominada en adelante (Q-R/I)), específicamente activada por medio del factor XIa de coagulación (Figura 2). Q-R se preparó conforme al segundo sitio de corte FXIa, tal como está presente en el sustrato "natural" FIX. El plásmido de expresión para este análogo rFX procede del plásmido phAct/rFX. Con el propósito de clonación, el fragmento de ADN HindIII-NaeI procedente del plásmido de expresión phAct-rFX que comprende la región de codificación de FX de la posición +1 a +1116 se insertó en los sitios de corte de restricción HindIII-SmaI del plásmido pUC19. El plásmido resultante se llamó pUC/FX. Esto hizo posible que la secuencia FX del nucleótido 508 a 705, que corresponde a los aminoácidos 160 a 235, se eliminara del plásmido pUC/FX vía cortes de restricción Bsp 120I y BstXI y se sustituyera por un fragmento de ADN mutado FX. El fragmento de ADN mutado contiene el sitio de segmentación exógena FX para FXIa en lugar del sitio FIXa/FVIIIa y FVIIa/TF, y se obtiene por medio de PCR. El plásmido phAct/rFX sirve de modelo para la PCR. Para producir el sitio de segmentación de Gln-Ser-Phe-Asn-Asp-Phe-Thr-Arg/Ile (Q-R/I), se utiliza el oligonucleótido #4211 (5'-GGCAAGGCCTGCATTCCCACA-3') (SEQ. ID. No. 5) como cebador 5' y el oligonucleótido #5039 (5'-GCGCTCCCACGATCCTGGTGAAGTCATTAAAGCTTTGCTCAGGCTGCGT CTGGTT-3') (SEQ. ID. No. 6) se utiliza como cebador 3'. Por tanto, los aminoácidos Arg, Gly, Asp, Asn y Leu se reemplazan en las posiciones 227, 228, 229, 231 y 232 por Gln, Ser, Phe, Asp y Phe. El producto de PCR se recorta con Bsp120I y BstXI y se inserta en el plásmido pUC-FX que había sido abierto con Bsp120I/BstXI. Posteriormente, el fragmento de ADN que contiene el nuevo sitio de segmentación se reinserta vía HindIII/AgeI en phact-FX, que había sido cortado con las mismas enzimas de restricción. El plásmido resultante se llama phAct-FX/FXIa (Q-R/I).

c. Expresión de rFX y del análogo de rFX/FXIa (Q-R/I) en células CHO

Para establecer líneas celulares estables que expresan rFX/FXIa, el plásmido de expresión phAct-rFX y phAct-rFX/FXa (Q-R/I) es cotransfijado por el marcador de selección pSV-dhfr en células CHO deficientes en dhfr (Fischer y col., FEBs Lett. 351 (1994), pp. 345-348). Para todos los demás análisis de expresión y función, los cultivos celulares se incuban después de un cambio completo de los medios con un medio de selección libre de suero en presencia de 10 \mug/ml de vitamina K durante 24 horas. La expresión de rFX en los clones celulares resultantes se demuestra en base a la cantidad de antígeno (ELISA, Asserachrom, Boehringer Mannheim), y la proteína recombinante se caracteriza posteriormente con SDS-PAFW (Figura 3). Tal como se puede observar también en el Western Blot, las moléculas tanto de tipo salvaje rFX como rFX/FXIa (Q-R/I) están presentes en forma de una cadena ligera (LC) de aproximadamente 22 kD y de una cadena pesada (HC) de aproximadamente 50 kD, correspondiéndose a las formas plasmáticas del factor X. Además, se puede ver una banda de proteínas de 75 kD. La proteína de 75 kD corresponde a la molécula FX de una sola cadena (SC), cuya presencia había sido ya descrita en los sobrenadantes de las células CHO transfijadas por FX (Wolf y col., J. Biol. Chem. 266 (1991), pp. 13729-13730) y en el plasma humano (Fair y col., Blood 64 (1984), pp. 194-204).

Ejemplo 2 Activación in vitro de las moléculas rFX/FXIa (Q-R/I) por medio del factor XIa

Para demostrar la segmentabilidad de los sitios de activación recientemente insertados por medio del factor XIa, los sobrenadantes del cultivo celular se mezclan con factor XIa purificado en presencia de 5 mM de CaCl_{2}. Se investigan partes alícuotas de los lotes de reacción en busca de la segmentación, tanto antes de la incubación como después de los distintos tiempos de incubación a 37ºC, por medio de análisis Western Blot (Figura 4). La identificación de las moléculas rFX se lleva a cabo por medio de un anticuerpo policlonal FX anti-humano. Como control positivo se utiliza factor IX plasmático purificado (Stago), que es el sustrato natural para FXIa. Para trabajar en condiciones constantes, se diluye FIX antes de su uso en los sobrenadantes del cultivo celular de células CHO no transfijadas. La conversión de FIX en formas activadas (FIXa y FIXb) muestra que FXIa es capaz de segmentar su sitio de corte homólogo en FIX en los sobrenadantes del cultivo celular. El lote de reacción con rFX de tipo salvaje sirve como control negativo, ya que esta molécula no contiene ningún sitio de segmentación de FXIa y, por tanto, no tendría que ser reconocida específicamente y segmentada por FXIa. Tal como se espera, en comparación con rFX en ausencia de FXIa, no es visible ningún cambio para rFX en el modelo de proteína después de la incubación con FXIa.

Por el contrario, después de un tiempo de incubación de 1 hora a 37ºC en presencia de CaCl_{2}, el lote de reacción de FXIa con rFX/FXIa (Q-R/I) como sustrato muestra bandas de proteína de aproximadamente 36 kD y de 32 kD que se parecen a las formas activadas alfa y beta (aHCa y bHCa) de la cadena pesada de FX. En ausencia de FXIa, estas moléculas segmentadas no están presentes. La presencia de una forma que es similar a bHCa y que se forma como consecuencia de la segmentación autocatalítica de los aminoácidos C-terminales de la cadena pesada de aHCa señala la funcionalidad de las moléculas rFXa activadas generadas. Estos resultados demuestran que, mediante la sustitución de la secuencia de activación que existe de forma natural en FX, con un sitio de segmentación de activación para FXIa, es posible generar moléculas análogas rFX que pueden ser activadas por FXIa y que posteriormente se pueden convertir en moléculas que son similares a FXa.

El método descrito se puede utilizar para someter ensayar todos los demás análogos de factor X en cuanto a sus propiedades de acuerdo con la presente invención.

Ejemplo 3 a. Actividad del análogo rFX/FXIa (Q-R/I) en comparación con rFX de tipo salvaje en plasma deficiente en FIX

Para someter a prueba la funcionalidad del análogo rFX, se mezcla plasma deficiente en FIX con el sobrenadante del cultivo celular de CHO-rFX/FXIa (Q-R/I) y se mide la cascada de los tiempos de coagulación después de haber activado la cascada de coagulación intrínseca (Tabla 1). Para ello, se mezclaron 50 \mul del sobrenadante parcialmente concentrado por ultrafiltración, 50 \mul de plasma deficiente en FIX y 50 \mul de DAPPTIN (Baxter AG). Después de un tiempo de incubación de 4 min a 37ºC, se inicia la reacción con 50 \mul de CaCl_{2} 25 mM que había sido precalentado a 37ºC. Se mide el tiempo de coagulación en un coagulómetro (Amelung, KC10A). La actividad, en mU, FIX se determina utilizando una recta de calibración generada con FIX plasmático. Los tiempos de coagulación obtenidos con los análogos rFX se muestran como mU FIX equivalentes. Los sobrenadantes del cultivo celular de células CHO que expresan rFX de tipo salvaje (CHO-rFX) y los del cultivo celular de células CHO no transfectadas (CHO neg.) sirven como control. Para excluir los efectos no específicos y tener en cuenta las variaciones experimentales debidas a las condiciones del cultivo celular, se ensayaron de 7 a 10 sobrenadantes de cultivo celular diferentes de células que tienen las mismas etapas de crecimiento y similares grados de expresión, para cada constructo.

Los sobrenadantes de los cultivos celulares de CHO-rFX y CHO neg. conducen a tiempos de coagulación similares a los del tampón de dilución en los que los estándares y las muestras se diluyen y, por tanto, se muestran como equivalente de FIX "<1,56" mU (el valor más pequeño valorable en las pruebas de coagulación debido a la recta de calibrado).

En comparación con los tiempos de coagulación que habían sido determinados con 200 mU de FIX plasmático, sin embargo, los tiempos de coagulación para los sobrenadantes de las células CHO-rFX/FXIa (Q-R/I) determinados con concentraciones de análogos en un rango de 4,1 a 7,7 \mug/ml fueron notablemente más cortos y, por ello, se muestran como FIX ">200" mU equivalente.

Estos resultados muestran que al sustituir los 8 aminoácidos C-terminales del péptido de activación de FX por los 8 aminoácidos C-terminales del péptido de activación del factor IX se genera una molécula de análogo rFX que, después de la activación de la cascada de coagulación intrínseca, conduce a una coagulación significativa de un plasma deficiente en factor IX.

b. Determinación de la actividad funcional del análogo rFX/FXIa (Q-R/I) en plasmas deficientes en FIX y FVIII después de un pretratamiento de los sobrenadantes del cultivo celular con inhibidores de serina-proteasa

Para poder eliminar la posibilidad de que los tiempos de coagulación obtenidos con los análogos de rFX/FXIa (Q-R/I) no fueran consecuencia de la presencia de trazas de moléculas de rFX ya activadas en los sobrenadantes del cultivo celular, sino que, en su lugar, eran consecuencia de la conversión de los análogos de rFX en rFXa después de la activación de la cascada de coagulación intrínseca por DAPPTIN, antes de su utilización se mezclan todos los sobrenadantes con un inhibidor de serina-proteasa (1 mM Pefabloc, Boehringer Mannheim) que inactiva permanentemente las serina proteasas activadas. El inhibidor excedente que inhibiría la coagulación después de la activación por DAPPTIN se elimina posteriormente por medio de diálisis contra Tris pH 7,4, 50 mM NaCl, 0,01% Tween. Los sobrenadantes así tratados se utilizan posteriormente en la prueba de coagulación.

Se seleccionó la concentración de inhibidor de serina proteasa para garantizar que las cantidades de FXa que conducen a una coagulación similar a la de los sobrenadantes no tratados del cultivo celular rFX/FXIa (Q-R/I) estaban completamente inhibidas (Tabla 2). Los resultados de estos experimentos preliminares demuestran que una concentración de inhibidor de 1 mM es capaz de inactivar completamente cantidades de FXa con tiempos notablemente más cortos de coagulación en plasma deficiente en FIX que los obtenidos con los análogos de rFX/FXIa (Q-R/I) (comparación con la Tabla 1).

La funcionalidad de los sobrenadantes así pretratados se mide en la prueba de coagulación tanto de FIX como de FVIII (Tabla 3). La prueba de coagulación de FVIII se lleva a cabo de la misma manera que la prueba de coagulación de FIX, excepto que en lugar de plasma deficiente en FIX se utiliza plasma deficiente en FVIII, que la incubación antes de la iniciación con CaCl_{2} dura 3 min y que la curva de calibrado se representa con FVIII plasmático.

Los sobrenadantes de las células CHO-rFX se encuentran por debajo del límite de evaluación (1,56 mU) en el plasma deficiente tanto en FIX como en FVIII. De forma similar, el sobrenadante de CHO neg no conduce a un tiempo más corto de coagulación, incluso cuando este sobrenadante ha sido tratado con 1 mU de FXa antes del tratamiento con el inhibidor. Estos controles demuestran que, aunque el FX estuviera ya preactivado, sería inactivado por el inhibidor en el sobrenadante del cultivo celular y que la coagulación no es mediada por las proteasas específicas de CHO potencialmente ya existentes.

El FIX plasmático pretratado (FIX) en comparación con el FIX que no ha sido pretratado (FIX sin inhibidor y diálisis) tiene una actividad más baja de coagulación en el plasma deficiente en FIX, lo que indica que o bien una parte de las serina proteasas, incluso en la forma inactivada, es inhibida por el inhibidor o bien que se pierde como consecuencia del proceso (diálisis).

A pesar del pretratamiento del inhibidor, en las pruebas de coagulación de FIX y FVIII no se observan cambios significativos en los valores medidos en los sobrenadantes de CHO-rFX/FXIa (Q-R/I) cuando se comparan con los sobrenadantes no tratados.

Estos experimentos demuestran que después de la activación de la cascada de coagulación intrínseca, las moléculas del análogo FX recombinante que tienen un sitio de segmentación de activación de FIX para FXIa conducen a una coagulación significativa de los plasmas deficientes en FIX y FVIII. En resumen, se ha demostrado que estas moléculas de análogo FX/FXIa (Q-R/I) recombinante tienen propiedades que indican que las moléculas pueden ser candidatos de éxito para la producción de preparaciones terapéuticas útiles en el tratamiento de pacientes que padecen de hemofilia o de hemofilia con anticuerpos inhibidores.

TABLA 1 Actividad funcional de las moléculas de rFX/FXIa (Q-R/I) en plasma deficiente en FIX

1

TABLA 2 Determinación de la inactivación de FXa por medio de pretratamiento con Pefabloc y diálisis posterior en la prueba de coagulación de FIX

2

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TABLA 3 Actividad funcional de los sobrenadantes de CHO-rFX/FXIa (W-R/I) de un cultivo celular después de pretratamiento con Pefabloc y diálisis en pruebas de coagulación en deficientes en FIX y FVIII

3

4

Ejemplo 4 Actividad de las moléculas purificadas de rfX/fXIa (Q-R/I) in vitro e in vivo

Se purificaron las moléculas de rfX/fXIa (Q-R/I) a partir de sobrenadantes de cultivos celulares de clones celulares estables CHO-rfX/fXIa (Q-R/I) (establecidos tal como se describe en el Ejemplo 1.c) mediante cromatografía de intercambio aniónico. Debido a la presencia de moléculas rfX precursoras inmaduras de manera parcial, proteolítica e incompleta en el sobrendante de las líneas celulares recombinantes utilizadas para la purificación (Figura 5, línea 8), se preincubó primero el sobrenadante durante 4 horas a 37ºC con un medio acondicionado procedente de clones celulares de CHO que expresan una forma secretada de la endoproteasa furina. La furina es una serina-proteasa que realiza la conversión de la única cadena de fX en cadena pesada/ligera, así como elimina el propéptido in vitro. Mediante este tratamiento se lleva a cabo el procesamiento de las moléculas fX inmaduras in vitro (Figura 5, línea 2 frente a 8) evitando la copurificación de las moléculas fX inmaduras inactivas. Después de añadir 10 mM de EDTA, un 0,1% de Tween 80, 0,1 mM de Pefabloc y ajustar el pH a 7,4, se cargó el sobrenadante en una columna Fractogel EMD TMAE 650 (M) equilibrada con el Tampón A (20 mM Tris, 120 mM NaCl, 10 mM EDTA, un 0,1% Tween 80, pH 7,4). Se lavó la columna con 20 mM Tris, 180 mM NaCl, un 0,1% Tween 80, pH 7,4. Se eluyeron las moléculas rfX con el Tampón C (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl_{2}, un 0,1% Tween, pH 7,4). El análisis Western Blot de las distintas fracciones de purificación (Figura 5) muestra que casi todas las moléculas de rfX/fXI (Q-R/I) de la fracción de elución están presentes en forma de doble cadena madura (HC, LC; línea 6), de manera similar al fX plasmático purificado (línea 7). Con el fin de inhibir las cantidades residuales de rfXa potencialmente presente que podrían haberse formado durante el cultivo celular o durante el procedimiento de purificación, se trató posteriormente la fracción de elución con 10 \muM de ERGck (Hematological Technologic Inc.), inhibidor específico de fXa. Se eliminó el sobrante de este inhibidor por medio de un paso posterior de diafiltración con 10 mM Tris, 8 g/l de NaCl, 4 g/l de Na-citrato, un 0,01% de Tween 80, pH 7. Se almacenó la preparación a -80ºC hasta su utilización. Se utilizó el mismo procedimiento de purificación para la preparación de rfX de tipo salvaje empleado como control en los siguientes experimentos.

a. Determinación de la actividad funcional de rfX/fXIa (Q-R/I) purificado en plasma humano y murino deficiente en fVIII y fIX

Para confirmar la actividad funcional de las moléculas purificadas de rfX/fXIa (Q-R/I), se midió el aPTT (Tiempo de Tromboplastina Parcial Activada) en plasma deficiente en fVIII y fIX de origen humano y murino en presencia de moléculas de rfX. Se mezclaron 100 \mul de plasma deficiente (plasma humano inmunoempobrecido, Baxter AG; plasma de ratones noqueados de fVIII o fIX) con 50 \mul de una preparación molecular de fX purificado de 10 \mug/ml (véase anteriormente), 150 \mul de DAPPTIN (Baxter AG) y se incubó durante 3 min a 37ºC. La reacción de coagulación se inició mediante 150 \mul de 25 mM CaCl_{2}. El tiempo de coagulación se estimó tal como se describe en el Ejemplo 3. El porcentaje de actividad se determinó utilizando una curva Log estándar (% de actividad) contra un Log(tiempo de coagulación). Para la curva estándar, se mezclaron 100 \mul de un 100%, 80%, 50%, 25% ó 12,5% de plasma de referencia humana o murina con 50 \mul del tampón de fX y 150 \mul de DAPPTIN y se incubó durante 3 min a 37ºC. La iniciación de la coagulación y la estimación del tiempo de coagulación se realizaron tal como se describe anteriormente. Los plasmas de referencia se componen de plasma humano normal (Baxter AG) o de un pool de plasma procedente de ratones normales, mezclados en distintas proporciones con plasmas deficientes en fVIII o fIX. El tiempo de coagulación y el porcentaje de actividad comparados con plasma normal figuran en la Tabla 4. Los resultados muestran que una reducción notable del tiempo de coagulación es mediada por rfX/ fXIa (Q-R/I) purificado en todos los plasmas deficientes sometidos a prueba, de origen humano o murino. Se observa incluso una normalización del aPTT en el plasma humano y murino deficiente en fIX y en el plasma murino deficiente en fVIII. Por contraste con el análogo de rfX, las moléculas de rfX wt en las concentraciones correspondientes no median en la reducción notable del tiempo de coagulación en estos plasmas. Además, la normalización del aPTT en el plasma de ratón deficiente indica que las moléculas de rfX/fXIa (Q-R/I) pueden interactuar con las proteínas correspondientes de coagulación en murino que median en la actividad bypass de fVIII y FIX observada in vitro en el plasma humano, prerrequisito para someter a prueba estas moléculas in vivo en un modelo animal de ratón.

b. Actividad funcional de la variante de rfX/fXIa (Q-R/I) in vivo

Se sometió a prueba in vivo la funcionalidad de rfX/fXIa (Q-R/I) como molécula que muestra una actividad bypass de fVIII utilizando ratones noqueados en fVIII (Tabla 5). La validez de los ratones noqueados de fVIII como sistema de modelo animal para someter a prueba la actividad bypass de fVIII fue controlada por medio de plasma comercial procedente de la preparación FEIBA (Baxter, AG). Como control negativo se utilizó una preparación de rfX wt purificado. Con el fin de comparar el efecto de rfX/fXIa (Q-R/I) y rfXwt, la definición de la unidad para la dosis a administrar se basó en la actividad de fX determinada en el ensayo de PT (tiempo de la protrombina). Para el ensayo de PT, 100 \mul de la preparación molecular de fX y 100 \mul de plasma deficiente en fX (Baxter AG) se incubaron durante 2 min a 37ºC. La coagulación se inició con 100 \mul de una mezcla de Calcio/Tromboplastina (Baxter AG). Se estimó el tiempo de coagulación tal como se describe en el Ejemplo 3. La actividad de fX en unidades se determinó utilizando una curva estándar establecida con un estándar de referencias de fX (Baxter AG). Las preparaciones se administraron vía intravenosa bajo anestesia a la dosis indicada en U/kg (Tabla 5). A los 30 min de la inyección, se indujo el sangrado mediante el corte de la cola a una distancia de 1 cm de su extremo. El porcentaje de supervivencia de los animales después de 48 horas sirve de parámetro para la funcionalidad.

La reducción notable de mortalidad observada para los animales tratados con FEIBA demuestra que los ratones noqueados de fVIII representan un sistema modelo adecuado. Ninguno de los animales tratados con 300 U de rfXwt/kg sobrevivió, resultado esperado teniendo en cuenta los descubrimientos in vitro. Sin embargo, la aplicación de rfX/fXIa (Q-R/I) a 300 U/kg resultó en una mejora significativa del porcentaje de supervivencia (60%). Este resultado demostró que las moléculas del análogo de rfX muestran una actividad bypass significativa de fVIII in vivo a la dosificación utilizada.

TABLA 5 Determinación del porcentaje de supervivencia de ratones noqueados de fVIII tratados con la variante de rfX/fXIa (Q-R/I) y rfX wt

5

En conclusión, las propiedades funcionales de la molécula de rfX/fXIa (Q-R/I) descritas en estos experimentos demuestran que representa un candidato importante para el desarrollo de un agente terapéutico alternativo para el tratamiento de hemofílicos que tienen anticuerpos inhibitodores desarrollados.

<110> Baxter AG

\hskip1.05cmHimmelspach, Michele

\hskip1.05cmSchlokat, Uwe

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\vskip0.400000\baselineskip

<120> Análogo de factor X con una capacidad mejorada para ser activado

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<130> FA235

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\vskip0.400000\baselineskip

<140> A1377/99

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<141> 1999-08-10

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\vskip0.400000\baselineskip

<160> 6

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\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1467

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<212> ADN

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<213> humano

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<400> 1

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6

7

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<210> 2

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<211> 488

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<212> PRT

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<213> humano

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<400> 2

8

9

10

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<210> 3

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<211> 34

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador de PCR

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<400> 3

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\hskip-.1em\dddseqskip

attactcgag aagcttacca tggggcgccc actg

\hfill

34

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

attacaattg ctgcagggat ccac

\hfill

24

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcaaggcct gcattcccac a

\hfill

21

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 55

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador PCR

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

gcgctcccac gatcctggtg aagtcattaa agctttgctc aggctgcgtc tggtt

\hfill

55

Claims (35)

1. Análogo de Factor X que contiene una modificación entre Glu226 e Ile235, con respecto a la numeración de aminoácidos según la Figura 1, caracterizado porque contiene una secuencia de factor X con Glu226-R8-R7-R6-R5-R4-R3-R2-Arg234-R1 donde

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a)

R1 es Ile;

b)

R2 es Thr;

c)

R3 es Phe;

d)

R4 es Asp;

e)

R5 es Asn;

f)

R6 es Phe;

g)

R7 es Ser y

h)

R8 es Gln.

\vskip1.000000\baselineskip

2. Análogo de factor X según la reivindicación 1, caracterizado porque la modificación forma un sitio de procesamiento para el factor XIa o para un derivado del mismo.

3. Análogo de factor X según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque tiene una modificación adicional en la región de la secuencia de aminoácidos C-terminal del factor X.

4. Análogo de factor X según la reivindicación 3, caracterizado porque tiene una modificación en la región C-terminal del sitio de segmentación del \beta-péptido.

5. Análogo de factor X según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque dicha modificación permite una activación in vivo del análogo de factor X en el factor Xa natural o en un análogo de factor Xa.

6. Análogo de factor X según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicha modificación permite una activación in vitro del análogo de factor X en el factor Xa natural o en un análogo de factor Xa.

7. Análogo de factor X según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque dicho análogo contiene un \beta-péptido intacto.

8. Análogo de factor X según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en forma de una molécula de doble cadena.

9. Análogo de factor X según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 que tiene una región C-terminal acortada.

10. ADN recombinante que codifica para el análogo de factor X según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 contenido en un vector para la expresión recombinante de la proteína codificada.

11. Preparación que contiene un análogo de factor X purificado o una proteína precursora del mismo, conteniendo dicho análogo de factor X una modificación entre Glu226 e Ile235 tal como se define en la reivindicación 1 ó 2.

12. Preparación según la reivindicación 11, caracterizada porque el análogo de factor X está presente en forma de FX\alpha.

13. Preparación según la reivindicación 11, caracterizada porque el análogo de factor X tiene una secuencia de aminoácidos C-terminal acortada.

14. Preparación según la reivindicación 11, caracterizada porque contiene el análogo de factor X como molécula de doble cadena.

15. Preparación según la reivindicación 11, caracterizada porque contiene un análogo de factor X de una cadena única en una forma enzimáticamente inactiva, con una pureza mínima del 80% y porque no contiene intermedios proteolíticos inactivos de análogo de factor X/Xa.

16. Preparación según la reivindicación 11, caracterizada porque contiene el análogo de factor X como molécula de una sola cadena.

17. Preparación según la reivindicación 11, caracterizada porque contiene un análogo de factor X que tiene una modificación que permite una activación in vivo del análogo de factor X en el factor Xa natural o en un análogo de factor Xa.

18. Preparación según la reivindicación 11, caracterizada porque contiene un análogo de factor X que tiene una modificación que permite una activación in vitro del análogo de factor X en el factor Xa natural o en un análogo de factor Xa.

19. Preparación según la reivindicación 11, caracterizada porque se formula como una preparación farmacéutica.

20. Preparación que contiene un análogo de factor X activado que se puede obtener mediante la activación del análogo de factor X según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, teniendo dicho análogo de factor X activado una gran estabilidad e integridad estructural, estando libre dicha preparación de intermedios inactivos de análogo de factor X/Xa y de productos de la descomposición autoproteolítica del factor X.

21. Preparación según la reivindicación 20, caracterizada porque contiene una matriz fisiológicamente aceptable y está presente en una forma que es estable durante el almacenamiento.

22. Preparación según la reivindicación 20, caracterizada porque contiene un factor sanguíneo o una forma activada de un factor sanguíneo como componente adicional.

23. Preparación según la reivindicación 22, caracterizada porque contiene como mínimo un componente con actividad bypass inhibidora de factor VIII como componente adicional.

24. Preparación según la reivindicación 11, caracterizada porque se formula como un compuesto farmacéutico y está presente como una preparación multicomponente.

25. Utilización de la preparación según la reivindicación 11 para producir un medicamento.

26. Utilización del ADN recombinante según la reivindicación 10 para producir un medicamento.

27. Método para la producción de la preparación según la reivindicación 11, caracterizado porque el análogo de factor X que ha sido obtenido por medio de la producción recombinante se aísla y purifica por medio de un proceso cromatográfico.

28. Método para la producción de la preparación de un análogo de factor X, comprendiendo dicho método los siguientes pasos:

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-

preparación de un ADN recombinante que codifica para el análogo de factor X según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 contenido en un vector para la expresión recombinante de la proteína codificada,

-

transformación de una célula adecuada,

-

expresión del análogo de factor X,

-

aislamiento del análogo de factor X y

-

purificación del análogo de factor X por medio de un proceso cromatográfico.

\vskip1.000000\baselineskip

29. Método según la reivindicación 28, caracterizado porque después de la expresión del análogo de factor X, éste es activado por el factor XIa o por un derivado del mismo.

30. Método según la reivindicación 27, caracterizado porque el análogo de factor X se aísla en forma de una molécula de doble cadena.

31. Método según la reivindicación 27, caracterizado porque el análogo de factor X de doble cadena está segmentado con el factor XIa de un derivado del mismo.

32. Método según la reivindicación 27, caracterizado porque el análogo de factor X se aísla en forma de molécula de una sola cadena.

33. Método según la reivindicación 31, caracterizado porque un análogo de factor X de una sola cadena se procesa con furina o con un derivado de la misma y porque permite además la activación con el factor XIa o con un derivado del mismo en el factor Xa o en el análogo de factor Xa.

\newpage

34. Método para la producción de una preparación que contiene factor Xa activado o un análogo de factor Xa, caracterizado por el hecho de que un análogo de factor X que se produjo mediante la utilización del método según la reivindicación 27 está sometido a un paso de activación.

35. Método según la reivindicación 27, caracterizado por el hecho de que se obtiene un análogo de factor Xa purificado con una gran estabilidad e integridad estructural que está libre de intermedios de factor X/Xa inactivos.