HU225246B1

HU225246B1 - Factor x analogues with a modified protease cleavage site

Info

Publication number: HU225246B1
Application number: HU0100652A
Authority: HU
Inventors: Michele Himmelspach; Uwe Schlokat; Friedrich Dorner; Andreas Fisch; Johann Eibl
Original assignee: Baxter Ag
Priority date: 1997-02-27
Filing date: 1998-02-27
Publication date: 2006-08-28
Also published as: US6573071B1; NO994139D0; PL190734B1; IL131346A0; AU744428B2; BR9807627A; EP0966536A1; CA2282707A1; AT405516B; DE59813518D1; ATA33597A; NO994139L; EP0966536B1; US7220569B2; ES2263199T3; NO327878B1; AU6200298A; CZ303299A3; PL335382A1; CZ298298B6

Description

(57) Kivonat

A találmány olyan X faktor analógra vonatkozik, amely a természetben előforduló Xa aktiválási hasítási hely szakaszában módosítást tartalmaz, az analóg tartalmaz egy Gly228-R6-R5-R4-R3-R2-Arg234-R1 X faktor szekvenciát, ahol az aminosavszámozás az 1. ábra szerinti, és ahol

a) R1 egy olyan aminosav, amelyet az Ile, Val, Ser, Thr vagy Alá közül választanak ki,

b) R2 egy olyan aminosav, amelyet a Pro, Gly, Lys vagy Arg közül választanak ki,

c) R3 egy olyan aminosav, amelyet a Phe, Lys, Met, Gin, Glu, Ser, Val, Arg vagy Pro közül választanak ki,

d) R4 egy olyan aminosav, amelyet az Asp, Ile, Ser, Met, Pro, Thr, Arg vagy Lys közül választanak ki,

e) R5 egy olyan aminosav, amelyet az Asn, Lys, Ser, Glu, Alá, Gin, His vagy Arg közül választanak ki, és

f) R6 egy olyan aminosav, amelyet az Asp, Phe, Thr, Arg, Leu vagy Ser közül választanak ki, és a módosítás egy, a X faktor szekvencia ezen szakaszában természetszerűen nem hasító proteáz számára hoz létre hasítási helyet.

A találmány kiterjed a találmány szerinti X faktor analógot kódoló DNS-re, tisztított X faktor analógot vagy ennek egy előproteinjét tartalmazó készítményre, Xa faktor analógot tartalmazó készítményre, tisztított rekombináns X faktor analógot tartalmazó készítmény előállítási eljárására, aktív Xa faktort, illetve Xa faktor analógot tartalmazó készítmény előállítási eljárására, valamint a találmány szerinti DNS és a találmány szerinti készítmények alkalmazására is.

A leírás terjedelme 42 oldal (ezen belül 13 lap ábra)

HU 225 246 Β1

A találmány olyan X faktor analógokra vonatkozik, amelyek az aktiválási pepiid területén tartalmaznak módosítást, továbbá a találmány szerinti X faktor analógokat tartalmazó készítményekre, valamint az egyláncú és kétláncú X faktor analógok előállítására szolgáló eljárásra.

A véralvadási folyamat megindulása után az alvadási kaszkád a vérben lévő különböző proenzimek (zimogének) egymás után következő aktiválásán át alakulnak át aktív formáikká, azaz szerinproteázokká. Ilyenek többek között a Xll/Xlla faktor, a Xl/XIa faktor, a IX/IXa faktor, X/Xa faktor, a Vll/Vlla faktor és a protrombin/trombin. Az enzimek legtöbbje fiziológiai körülmények között csak akkor aktív, ha egy komplexben membránfelülethez kapcsolódik. A folyamatok nagy részében Ca-ionok is részt vesznek. A véralvadás vagy intrinsic úton megy végbe, amelyben minden proteinkomponens a vérben áll rendelkezésre, vagy extrinsic úton, amelyben meghatározó szerepet játszik a sejtmembrán szöveti faktor. A sebelzáródás végül akkor következik be, amikor a trombin a fibrinogént fibrinné hasítja.

A protrombinázkomplex felelős a protrombin trombinná aktiválásáért. A trombin egy fontos enzim, amely prokoagulánsként és antikoagulánsként is képes hatni. A protrombinázkomplex, amelyben az Va faktor kofaktorként és a Xa faktor szerinproteázként vesz részt, foszfolipidek felületén szerelődik össze mint Ca-függő társulás. Vitatják, hogy a protrombinázkomplex katalitikus komponense a Xa faktor lenne.

A X faktor (Stuart/Prower faktor) egy K-vitamin-függő koagulációs glikoprotein, amely az intrinsic és extrinsic véralvadási kaszkád révén aktiválódhat. A X faktor primer transzlációs terméke (pre-pro FX) 488 aminosavat tartalmaz, és a máj- vagy a hepatomasejtek először mint egyláncú, 75 kD molekulatömegű előproteint szintetizálják. A X faktor a plazmában főképpen kétláncú molekulaként fordul elő [Fair et al., Blood, 64, 194-204 (1984)].

A bioszintézis folyamán a preszekvenciának (Ser23/Leu24 között) és a propeptidnek (Arg40/Ala41 között) egy szignálpeptidázzal való lehasítása után az egyláncú X faktor molekula hasítás és az Arg180Lys181-Arg182 tripeptid eltávolítása révén olyan kétláncú formává hasítódik, amely egy diszulfidhíddal összekapcsolt, körülbelül 22 kD molekulatömegű könnyű láncból és körülbelül 50 kD molekulatömegű nehéz láncból áll (1. ábra). A X faktor tehát mint kétláncú molekula kering a plazmában.

A véralvadási folyamat alatt a X faktort az inaktív zimogénből aktív proteáz Xa faktorrá egy korlátozott proteolízis konvertálja, amikor is a X faktor Xa faktorrá való aktiválása két, membránhoz kötött komplexben mehet végbe: az extrinsic Vlla faktor-szöveti faktor komplexben vagy az intrinsic Villa faktor-IXa foszfolipid-Ca komplexben vagy „tenase-komplex”-ben [Mertens et al., Biochem. J., 185, 647-658 (1980)]. Az Arg234/lle235 aminosavak közti proteolitikus hasítás egy 52 aminosav hosszú aktiválási peptidet szabadít fel a nehéz lánc N-terminális végéről, és így képződik az aktív enzim, a Xa faktor. A Xa faktor katalitikus centruma a nehéz láncon helyezkedik el.

A Vlla/TF (extrinsic) komplexen át végbemenő aktiválás a Xaa faktor (35 kD) és Xap faktor (31 kD) képződéséhez vezet, amikor amennyiben a Vlla faktor koncentrációja a komplexben alacsony, egy 42 kD molekulatömegű poiipeptid jelenik meg. A Xaa faktor a nehéz láncban lévő Arg234/lle235 hasításakor képződik, és ez mutatja a X faktor Xa faktorrá történő aktiválódását. A Xap faktor megjelenését valószínűleg a Xaa faktor nehéz lánc C-terminális végén, az Arg469/Gly470 aminosavaknál bekövetkező autokatalitikus hasadás és egy 4,5 kD peptid lehasadása eredményezi. A Χθβ faktornak, ugyanúgy, mint a Xaa faktornak, katalitikus aktivitása van. Kimutatták azonban, hogy a Xaa faktor Xap faktorrá hasadásakor egy plazminogén-kötőhely keletkezik, és adott esetben a Χθβ faktor fibrinolitikus aktivitást fejt ki, illetve a fibrinolízisnél mint kofaktor vesz részt. A Xaa faktor Χθβ faktorrá való átalakulása azonban lassabb, mint a trombinképződés, és ez meggátolja a fibrinolízis megindulását véralvadék kialakulása előtt [Pryzdial et al., J. Bioi. Chem., 271, 16 614-16 620 (1996); Pryzdial et al., J. Bioi. Chem., 271, 16 621-16 626(1996)].

A 42 kD polipeptidet a nehéz lánc C-terminális végén lévő Arg469/Gly470 közötti hasadás eredményezi anélkül, hogy előzőleg az Arg234/lle235 között a hasadás megtörtént volna. Ennek a köztiterméknek ugyanúgy nincs katalitikus aktivitása, mint egy Xa-/ fragmentumnak, amely a Lys370-nél végbemenő proteolízis révén keletkezik [Mertens et al., Biochem. J., 185, 647-658 (1980); Pryzdial et al., J. Bioi. Chem., 271, 16 614-16 620(1996)].

A X faktor aktiválódását az intrinsic reakcióúton a IXa faktor—Villa faktor komplex katalizálja. Az aktiválás folyamán ugyanezen hasítási termékek keletkeznek, azonban a Xa6 faktor termékből nagyobb mennyiség képződik, mint a többi X faktor hasítási termékből [Jesty et al., J. Bioi. Chem., 249, 5614 (1974)].

A X faktor például in vitro aktiválható Russel-víperaméreggel (Russell's Viper Venom=RVV) vagy tripszinnel [Bajaj et al., J. Bioi. Chelm., 248, 7729-7741 (1973)], vagy tisztított fiziológiás aktivátorokkal, mint az FVIIa/TF komplex vagy IXa faktor/VIlla faktor komplex [Mertens et al., Biochem. J., 185, 647-658 (1980)].

A kereskedelemben kapható, plazmából előállított X faktor termékek többnyire Xaa faktorból és Χθβ faktorból álló keveréket tartalmaznak, ugyanis a X faktor Xa faktorrá való aktiválódása után elsősorban Xaa faktor keletkezik, amely egy autokatalitikus folyamatban Χββ faktorrá hasad. Molekuláris szempontból nagymértékben azonos, egységes Xa faktor termék előállítása érdekében az EP 0 051 054 számú szabadalmi leírásban javasolták a X faktor hosszabb ideig történő aktiválását, hogy a kapott végtermék lényegében Xap faktort tartalmazzon. Mind a melléktermékeket, például a Xaa faktort, mind a proteázokat ezután több kromatográfiás lépésben el lehet távolítani.

A X faktornak megfelelő cDNS-t izolálták és analizálták [Leytus et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 82,

HU 225 246 Β1

3591-3595 (1985)]. A humán X faktort in vitro különböző sejttípusokban, például humán embrionális vesesejtekben vagy CHO-sejtekben fejezték ki [Rudolph et al., Prot. Expr. Purif., 10, 373-378 (1997); Wolf et al., J. Bioi. Chem., 266, 13 726-13 730 (1991)]. Megállapították azonban, hogy a humán X faktor rekombináns expressziójánál az Arg40/Ala41 pozícióknál a hasítás az in vivő helyzettel ellentétben hatástalanul megy végbe, és a X faktor könnyű láncán különböző N-terminális végek keletkeznek [Wolf et al., J. Bioi. Chem., 266, 13 726-13 730 (1991)]. A rekombináns X faktort (rFX) rW-vel in vitro Xa faktorrá (rFXa) aktiválták, vagy mint rFXa faktort közvetlenül expresszálták, amikor is az aktiválási peptidet a 183. aminosavtól a 234. aminosavig törölték és egy tripeptiddel helyettesítették, hogy lehetővé váljék egy kétláncú rFXa formává való közvetlen feldolgozás. A tisztított rFX mintegy 70%-át könnyű és nehéz lánccá alakították, míg a maradék 30%, mint 75 kD molekulatömegű egyláncú rFX volt jelen. Az rFXa direkt expessziója, jóllehet aktív Xa faktor képződéséhez vezetett, azonban inaktív köztitermékek is keletkeztek. Wolf és munkatársai [J. Bioi., Chem., 266, 13 726-13 730 (1991)] továbbá megállapították, hogy a rekombináns X faktornak csökkent az aktivitása, amit az rFX RVV-vel való rosszabb aktiválhatóságára, valamint az egyláncú előmolekula inaktív protein- és polipeptidpopulációjára vezettek vissza. Megállapították, hogy a rekombináns sejtek által kifejezett rFXa különösen nagy mértékben instabil, véleményük szerint ez az autoproteolízis nagy sebességének tudható be.

Annak érdekében, hogy megvizsgálják a Xaa faktor C-terminális peptidfunkcióját, Eby és munkatársai [Blood, 80, (Suppl. 1.) 1214 A (1992)] egy stopkodont vezettek be a X faktor szekvenciába, a Gly430 pozíciónál. Nem találtak azonban különbséget a β-peptidet tartalmazó Xa faktor (Fxaa) vagy egy β-peptid nélküli deléciós mutáns (Ρχββ) aktiválási sebessége között.

A Xa faktor a protrombinázkomplex egy fontos alkotórésze, ezért véralvadási zavaroktól, például hemofíliától szenvedő betegek kezelésére használható.

A Vili faktor vagy IX faktor hiányos hemofíliás betegek kezelése plazmidból előállított faktorkoncentrátumokkal, különösen hosszabb kezelési idő esetén, gyakran azért válik bonyolulttá, mivel ezek ellen a faktorok ellen gátlóantitestek képződnek. Ezért egy sor alternatívát dolgoztak ki, hogy a hemofíliás betegeket bypassaktivitású faktorokkal kezelhessék. Javasolták a protombinkomplex-koncentrátum, a részben aktivált protrombinázkomplex (APPC), a Vlla faktor vagy a FEIBA alkalmazását. Vili faktor bypass aktivitású (FEIBA) kereskedelmi készítmény például a FEIBA^R vagy az Autoplex^R. A FEIBA II faktorból, VII faktorból, IX faktorból, X faktorból és FElBA-ból körülbelül összehasonlítható egységeket, a Vili faktorból és az V faktorból csekély mennyiségeket, továbbá aktivált alvadási faktorokból, mint a trombin és a Xa faktor, illetve egy X faktorszerű aktivitást kifejtő faktor [Elsinger: Activated Protrombin Complex Concentrates, szerk.: Mariani, Russo, Mandelli (1982), 77-87. old.], nyomokat tartalmaz. Elsinger különösen a FEIBA készítményben lévő „X faktorszerű” aktivitás jelentőségére mutatott rá. Giles és munkatársai [British J. Haematology, 9, 391-497 (1988)] a tisztított Xa faktorból és foszfolipidekből álló kombinációnál Vili faktor bypass aktivitást mutatott ki állatmodellben.

Nagy igény van tehát a X/Xa faktorra vagy X/Xaszerű proteinekre, akár egyedül, akár egy koagulációs komplex alkotórészeiként a vérzéscsillapítás terápiájában, egy sor különböző alkalmazási területen.

A Xa felezési ideje a zimogénnel szemben igen rövid mind in vivő, mind in vitro. A X faktor glicerinben mintegy 18 hónapig stabilan tárolható, míg a Xa azonos feltételek mellett csak 5 hónapig stabil [Bajaj et al., J. Bioi. Chem., 248, 7729-7741 (1973)], illetve glicerinben 4 °C-on 8 hónap múlva az aktivitása több mint 60%-os csökkenést mutat [Teng et al., Thrombosis Rés., 22, 213-220 (1981)]. A Xa faktor felezési ideje szérumban csak 30 másodperc.

A Xa faktor instabilitása miatt X faktor készítmények adását javasolták (4,501,731 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). Életveszélyes vérzéseknél, különösen hemofíliás betegek esetében azonban a X faktor adása hatástalan, mivel az intrinsic véralvadási folyamatban a funkciós „tenase-komplex” hiánya miatt a X faktor nem aktiválódik eléggé ahhoz, hogy Xa faktorrá alakuljon, és az extrinsic úton történő aktiválás gyakran túl lassú egy gyors hatás eléréséhez. Továbbá a hemofíliás betegeknél elegendő X faktor van jelen, amely azonban, összehasonlítva a Xa faktorral, ezerszer kisebb protrombinázaktivitással rendelkezik. Ilyen esetekben szükség van az aktivált Xa faktor közvetlen alkalmazására, adott esetben foszfolipidekkel együtt - Giles és munkatársai szerint [British J. Haematology, 9, 491-497 (1988)] - vagy egyéb, esetleg Vili faktor bypass aktivitású alvadási faktorokkal együtt.

A Xa faktor X faktorból való előállításánál az aktiválás eddig többnyire állati eredetű, nem fiziológiás aktivátorokkal történt, például RVV-vel vagy tripszinnel, amikor is tökéletesen biztosnak kellett lenni abban, hogy a végtermék teljesen mentes ezektől a proteázoktól. Mint a fentiekben már említettük, a X faktor Xa faktorrá történő aktiválásakor számos, részben inaktív köztitermék képződik [Bajaj et al., J. Bioi. Chem., 248, 7729-7741 (1973); Mertens et al., Biochem. J„ 185, 647-658 (1980)]. Az ilyen köztitermékek jelenléte a termék specifikus aktivitásának csökkenéséhez vezet, és adott esetben olyan köztitermékekhez, amelyek az aktív szerinproteázok antagonistáiként működhetnek. Magas specifikus aktivitású, egységes, tiszta termék előállításához tehát a hagyományos módszerek mellett az aktiváláshoz, valamint a kromatográfiás tisztításhoz költséges eljárásokra van szükség.

A találmány feladatát képezi ennélfogva, hogy egy olyan készítményt bocsássunk rendelkezésre, amely egy X/Xa faktor aktivitású polipeptidet tartalmaz, amely nagymértékben stabil, és amely a szokásos, főként állati eredetű proteázok - mint például az RW vagy a tripszin - alkalmazása nélkül aktiválható Xa faktorrá. További célunk, hogy egy Vili faktor bypass aktivitású gyógyszerkészítményt biztosítsunk.

HU 225 246 Β1

A feladatot a találmány szerint úgy oldjuk meg, hogy egy olyan X faktor analógot állítunk elő, amely a természetben előforduló Xa faktor aktiváláshoz szolgáló hasítási hely területén módosítást tartalmaz. Az aktiválási hasítási helyet tartalmazó szakaszban lévő módosítás egy új felismerő-, illetve hasítási helyet hoz létre - amely a polipeptid ezen pozíciójában nem fordul elő a természetben - egy olyan proteáz számára, amely a polipeptidet normálkörülmények között nem ezen a helyen hasítja.

A fentiek alapján a találmány olyan X faktor analóg, amely a természetben előforduló Xa aktiválási hasítási hely szakaszában módosítást tartalmaz, az analóg tartalmaz egy Gly228-R6-R5-R4-R3-R2-Arg234-R1 X faktor szekvenciát, ahol az aminosavszámozás az 1. ábra szerinti, és ahol

a) R1 olyan aminosav, amelyet az Ile, Val, Ser, Thr vagy Alá közül választunk ki,

b) R2 olyan aminosav, amelyet a Pro, Gly, Lys vagy Arg közül választunk ki,

c) R3 olyan aminosav, amelyet a Phe, Lys, Met, Gin, Glu, Ser, Val, Arg vagy Pro közül választunk ki,

d) R4 olyan aminosav, amelyet az Asp, Ile, Ser, Met, Pro, Thr, Arg vagy Lys közül választunk ki,

e) R5 olyan aminosav, amelyet az Asn, Lys, Ser, Glu, Alá, Gin, His vagy Arg közül választunk ki, és

f) R6 olyan aminosav, amelyet az Asp, Phe, Thr, Arg, Leu vagy Ser közül választunk ki, és a módosítás egy, a X faktor szekvencia ezen szakaszában természetszerűen nem hasító proteáz számára hoz létre hasítási helyet.

A találmány kiterjed tisztított X faktor analógot vagy ennek egy előproteinjét tartalmazó készítményre, amelyben az analóg vagy előprotein a természetben előforduló X faktor aktiválási hely szakaszában olyan módosítást tartalmaz, amely a X faktor szekvencia ezen szakaszában természetszerűen nem hasító proteáz számára hoz létre hasítási helyet, az analóg tartalmaz egy Gly228-R6-R5-R4-R3-R2-Arg234-R1 X faktor szekvenciát, ahol az aminosavszámozás az 1. ábra szerinti, és ahol

b) R2 olyan aminosav, amelyet a Pro, Gly, Lys vagy Arg közül választunk ki,

f) R6 olyan aminosav, amelyet az Asp, Phe, Thr, Arg, Leu vagy Ser közül választunk ki.

A találmány szerinti X faktor analóg tehát főképpen az aktiválási pepiidben - amely a X faktor aktiválásakor lehasad, hogy Xa faktor keletkezzen - tartalmaz módosítást. A módosítás előnyösen legalább egy aminosavat érint a X faktor aktiválási peptid aminosavszekvenciáján belül. A módosítás előnyösen az aktiválási peptidben főképpen a C-terminális területére esik, és legalább egy aminosav legalább egy cseréjére vonatkozik a X faktor aminosavszekvenciájának Gly228 és Arg234 pozíciói között. Az aminosavpozíciók számozása az 1. ábra szerinti szekvencia számozását követi, amely Met1-től kezdődik és Lys488-cal végződik.

A találmány szerinti X faktor analógban a módosítás előnyösen abból áll, hogy egy ezen a helyen előforduló Vlla faktor, illetve IXa faktor hasítási helyet egy másik proteáz alternatív hasítási helyével cserélünk ki. Itt a módosítás legalább egy aminosav szubsztitúcióját jelentheti, vagy egy olyan peptidszekvencia inszercióját, amely egy proteázfelismerő, illetve -hasítási helyet tartalmaz. A találmány szerinti X faktor analógban a módosítás előnyösen azt jelenti, hogy az endoproteázok - mint például a kexin/kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7 [lásd például: Bass et al., Cell, 66, 1-3 (1991), vagy 5,460,950 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás] -, a szerinproteázok - mint például a Xlla faktor, Xla faktor, lla faktor - vagy a kallikrein, vagy e proteázok egy származéka csoportjából egy proteáz számára felismerő-, illetve hasítási szekvenciát biztosít.

A módosítást előnyösen úgy választjuk meg, hogy egy ilyen proteázzal való kezelés natív Xa faktornak megfelelő polipeptidet eredményezzen, amelynek a szekvenciája lényegében a Xa faktor szekvenciájához hasonló és ugyancsak Xa faktor aktivitást mutat.

Optimális feldolgozás eléréséhez egyes esetekben szükség lehet még pótlólag az Ile235 aminosav cseréjére is. Előnyös azonban, ha a nehéz lánc N-terminális aminosav, az izoleucin, az aktiválás után megmarad, mivel ez az aminosav a szubsztrátumkötő zseb képződésénél lényeges szerephez jut [Watzke et al.: „Molecular Basis of Thrombosis and Hemostasis”, szerk.: Katherine High és Harold Roberts (1995)]. A találmány szerinti X faktor analógok szerkezete - főképpen aminosavak vonatkozásában - különbözik a natív X faktor szekvenciától, azonban aktiválhatóságukat a természetben előforduló X faktorhoz hasonlíthatjuk, illetve aktiválás után a Xa faktor aktivitáshoz.

A találmány számos olyan X faktor analógot ismertet példaként, amelyek az aktiválási peptidben a természetben előforduló X faktor szekvenciára vonatkoztatva módosítást tartalmaznak, és megváltozott proteázspecificitást mutatnak.

Módosításokat végezhetünk a Gly228 és Arg234 aminosavak közötti szakaszon egy vagy több pozícióban és adott esetben az Ile235-nél a X faktor szekvenciára vonatkoztatva, amelynek a számozása az 1. ábra szerint Met1-től Lys488-ig terjed. Aminosavszubsztitúciók lehetnek a következő pozíciókban: Ile235 (R1), Arg234, Thr233 (R2), Leu232 (R3), Asn231 (R4), Asn230 (R5) és Asp229 (R6), előnyös azonban, ha az Arg234 változatlan marad.

Előnyös, ha a X faktor analógok a következő X faktor szekvenciát tartalmazzák: Gly228-R6-R5-R4-R3R2-Arg234, ahol R1=lle, Val, Alá, Ser vagy Thr; R2=Thr, Pro, Gly, Lys vagy Arg; R3=Leu, Phe, Lys, Glu, Met, Gin, Ser, Val, Arg vagy Pro; R4=Asn, Asp,

HU 225 246 Β1

Ile, Ser, Met, Pro, Thr, Lys vagy Arg; és R6=Asp, Phe, Thr, Arg, Leu vagy Ser.

A találmány szerinti X faktor analógok előnyös kiviteli formái a következő módosításokat tartalmazó X faktor analógok:

a) R1=Val, R2=Thr, R3=Phe, R4=Asp, R5=Asn és adott esetben R6=Phe (2A. ábra), és a Xla faktor hasítja;

b) R1=Ser, R2=Arg, R3=Thr, R4=Leu (2B. ábra), és az Flla hasítja;

c) R1=lle, R2=Pro, R3=Lys, R4=lle és adott esetben R5=Lys és/vagy R6=Thr (2C. ábra), vagy R1=lle, R2=Thr, R3=Ser, R4=Thr és adott esetben R5=Lys és/vagy R6=Thr (2I. ábra), és a Xlla faktor hasítja;

d) R1=lle, R2=Thr, R3=Met, R4=Ser és adott esetben R5=Ser és/vagy R6=Leu (2D. ábra), és kallikrein hasítja;

e) R1=lle, R2=Gly, R3=Gln, R4=Pro és adott esetben R5=Lys és/vagy R6=Ser (2H. ábra), vagy R1=lle, R2=Thr, R3=Lys és R4=Met (2E. ábra), vagy R1=lle, R2=Gly, R3=Glu és R4=lle (2F. ábra), és a Xa faktor hasítja;

f) R1=lle, R2=Lys, R3=Arg, R4=Arg és adott esetben R5=Glu és/vagy R6=Leu, vagy R1=lle, R2=Thr, R3=Val, R4=Arg és adott esetben R5=Ala és/vagy R6=Leu, vagy R1=lle, R2=Arg, R3=Val, R4=Arg és adott esetben R5=Gln és/vagy R6=Leu, vagy R1=lle, R2=Arg, R3=Arg, R4=Arg és adott esetben R5=His és/vagy R6=Leu, vagy R1=lle, R2=Lys, R3=Pro, R4=Arg és adott esetben R5=Asn és/vagy R6=Leu, vagy R1=lle, R2=Lys, R3=Arg, R4=lle és adott esetben R5=Arg és/vagy R6=Leu, vagy R1=lle, R2=Lys, R3=Ser és R4=Arg, vagy R1=lle, R2=Thr, R3=Val és R4=Arg, vagy R1=lle, R2=Lys, R3=Leu és R4=Arg (lásd a 2G. ábrát), az f) alatt említett analógokat egy kétbázisú endoproteáz, ilyenek a furin, PACE, kexin/kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, vagy ezen proteázok egy származéka hasítja.

A megváltozott proteázspecificitást előidéző módosítások és aminosavcserék lehetséges választékát a 2A-I. ábrákon mutatjuk be.

A módosításokat például irányított in vitro mutagenezissel vagy PCR-rel vagy a technika állása szerinti, már ismert géntechnikai módszerekkel vihetjük be, amelyek alkalmasak egy DNS-szekvencia specifikus megváltoztatására, egy célzott aminosavcsere megvalósítása érdekében.

A találmány szerinti X faktor analóg natív Xa faktorrá, illetve Xa faktor analóggá való aktiválását a találmány szerint előnyösen proteáz alkalmazásával végezzük, amelyet az endoproteázok közül - ilyenek például a kexin/kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7 -, vagy a szerinproteázok közül mint például a Xlla faktor, Xla faktor, Xa faktor, Ha faktor - és a kallikrein közül, vagy ezen proteázok származékai közül választunk ki.

A Xa faktor előállításakor az egyik nehézséget instabilitása jelenti, ugyanis autokatalízis révén a Xaa faktor és Xap faktor mellett más, inaktív intermedier termékek is keletkeznek. A lényegében ép, aktív X/Xa faktor, illetve X/Xa faktorszerű molekulák előállításakor tehát kívánatos lenne, ha csak olyan proteineket kapnánk, amelyek stabil végtermékeket eredményeznek.

Ismert, hogy a Xaa faktor (FXaa) Xajf faktorrá (ΕΧθβ) való hasításának kitüntetett hasítási helye az Arg469/Gly470 csoport között van. Eby és munkatársai [Blood, 80, Suppl. 1. 1214 (1992)] vizsgálatai szerint egy X faktor eredetű prominens karboxiterminális peptid (476-487 aminosavmaradékok) mellett egy további rövidebb peptid (474-477 aminosavmaradékok) található, amely a Xaa faktorból keletkezik autokatalízis által.

Annak érdekében, hogy az intakt X faktor célzott hasítása lényegében aktív Xa faktort eredményezzen anélkül, hogy inaktív hasítási melléktermékek keletkezzenek, a találmány szerinti X faktor analógok adott esetben további módosításokat tartalmaznak.

A találmány szerinti X faktor analóg ezért egy speciális kiviteli alakban egy további módosítást tartalmaz a X faktor aminosavszekvencia C-terminális szakaszában.

Az egyik kiviteli alakban a fent leírt típusú X faktor analóg egy intakt β-peptidet (FXa) tartalmaz. A találmány szerinti X faktor analóg ezért a C-terminális β-peptid-hasítási hely területén egy olyan módosítást tartalmaz, amely megakadályozza, hogy a X faktor Xa faktorrá történő aktiválása után a X faktorról lehasadjon a β-peptid. Ezáltal egy olyan Xa faktor molekulát kapunk, amelyet 100%-ig intakt Xaa faktor molekulaként izolálhatunk.

A módosítás lehet mutáció, deléció vagy inszerció a X faktor aminosavszekvencia Arg469 és Ser474 közötti aminosavpozíciók területén, vagy adott esetben a Lys370-nél. Előnybe helyezünk azonban egy olyan aminosavszubsztitúciót, amelynél az aminosavcsere következményeként a polipeptid felgombolyodása - ami a protein szerkezetét, és ezért adott esetben a funkcióját és aktivitását befolyásolná - nem következhet be.

Az egyik kiviteli alak szerint a találmány szerinti X faktor analógokban a következő pozíciókban hajtunk végre aminosavcserét: az Arg469 és/vagy Gly470 helyen, ahol az Arg469-et előnyösen Lys, His vagy Ile helyettesíti, és a Gly470-et előnyösen Ser, Alá, Val vagy Thr helyettesíti.

A találmány szerinti X faktor analógok az Arg469 és/vagy Gly470 pozícióban lévő mutáción kívül további mutációt tartalmazhatnak a Lys370 és/vagy Lys475 és/vagy Ser476 pozíciókban.

Egy ilyen pozícióban végrehajtott aminosavszubsztitúció révén elkerüljük a Xaa faktor Χθβ faktorrá, illetve Xay faktorrá való hasadását, mivel a természetben előforduló hasítási szekvencia (szekvenciák) úgy módosuknak), hogy adott esetben a karboxiterminális peptid autokatalitikus lehasadása már nem történhet meg.

Egy másik kiviteli alak szerint a találmány szerinti X faktor analógban a karboxiterminális β-peptid (ΕΧβ) deletált. Egy ilyen X faktor analóg úgy állítható elő, hogy egy X faktor analógot kódoló cDNS-t egy olyan rekombináns expressziós rendszerben fejezünk ki, amelybe csak azokat a szekvenciákat klónoztuk be, amelyek a Met1-Arg469 aminosavakat kódolják.

Egy további kiviteli alak szerint a találmány szerinti X faktor analóg a X faktor szekvencia C-terminális szaka5

HU 225 246 Β1 szában egy transzlációs stopszignált tartalmaz. Előnyös, ha a transzlációs stopszignál olyan pozícióban van, amely a természetes hasadáskor keletkező C-terminális aminosavat követi. Ezért a transzlációs stopszignál előnyösen a X faktor szekvencia 470. aminosavánál van, hogy a Χθβ faktorban a végállású Arg469 megmaradjon. Ezért a Gly470 aminosavat kódoló GGC kodont TAA, TAG vagy TGA kodonnal szubsztituáljuk.

A találmány egy további vonatkozásában olyan X faktor analógokra vonatkozik, amelyeket megfelelő proteázzal való in vitro kezeléssel natív Xa faktorrá, illetve Xa faktor analóggá aktiválunk. A felhasznált, aktiválandó X faktor analógtól függően egy natív Xa faktornak megfelelő és lényegében ezzel azonos polipeptidet kapunk, illetve egy olyan polipeptidet, amely bár Xa faktor aktivitást mutat a natív Xa szekvenciára vonatkoztatva, azonban olyan módosításokat tartalmaz, amelyek a biológiai aktivitást nem csökkentik.

Azon X faktor analógok aktiválásakor, amelyek a módosításokat az aktiválási peptid területén az aktiválási peptid szekvenciában tartalmazzák, kizárólag a natív Xa faktor molekulának megfelelő polipeptideket kapjuk meg. Amennyiben egy ilyen X faktor analóg adott esetben még transzlációs stopszignált is tartalmaz a β-peptid C-terminális szakaszán, úgy Χθβ faktor homológ molekulákat nyerünk. Amennyiben azonban olyan X faktor analógot használunk, amely a módosítást (módosításokat) a β-peptidszekvenciában tartalmazza - amely(ek) ahhoz vezet(nek), hogy a β-peptid nem hasad le -, akkor egy olyan Xaa faktor analógot kapunk, amely a molekula C-terminális végén egy aminosavcserével rendelkezik.

A találmány szerinti X faktor analógok kizárólag olyan módosításokat tartalmaznak, amelyek az aktiválhatóságot illető specificitást változtatják meg, de nem befolyásolják az aktivitást. Tehát minden esetben biológiailag és funkcionálisan aktív Xa faktor molekulákat, illetve Xa faktor analógokat nyerünk.

Az in vitro aktiválást végezhetjük egy proteázzal, amelyet az endoproteázok csoportjából - ilyen például a kexin/kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, IPC/PC7 - vagy a szerinproteázok csoportjából például XIla faktor, Xla faktor, Xa faktor - vagy a kallikrein közül választunk ki, vagy ezen proteázok származékai közül. Azonban minden tetszés szerinti proteáz felhasználható a találmány keretén belül - kivéve az RVV, tripszin, IXa faktor vagy VIla faktor használatát amennyiben alkalmasak a találmány szerinti X faktor analóg Xa faktorrá való feldolgozására.

A találmány egy további kiviteli alakja szerint a X faktor analóg egy olyan módosítást tartalmaz, amely lehetővé teszi in vivő a X faktor analóg Xa faktorrá, előnyösen natív Xa faktorrá történő aktiválását. Ebben az összefüggésben a „natív” Xa faktor azt jelenti, hogy az aktivált, találmány szerinti X faktor analógból származó Xa faktor a natív Xa faktornak felel meg, és az ezzel homológ aminosavszekvenciából áll, és Xa faktor aktivitása van. A módosítást ezért úgy választjuk meg, hogy a X faktornak Xa faktorrá hasítását egy in vivő, azaz a szervezetben előforduló proteáz, előnyösen a véralvadási kaszkádban előforduló egy proteáz végezze. Ez a proteáz egy olyan proteáz lehet, amelyet a szerinproteázok csoportjából választunk ki, például a Ha faktort, Xlla faktort, Xla faktort, Xa faktort, vagy lehet a kallikrein. Azok a X faktor analógok, amelyek az aktivációs peptidben lévő módosításon kívül a X faktor molekula C-terminális szakaszában is tartalmaznak módosítást, mint fent leírtuk, in vivő is a megfelelő Xa faktor analógokká aktiválódnak.

Jóllehet Wolf és munkatársai [J. Bioi. Chem., 266, 13 726-13 730 (1991)] feltételezték, hogy egy endopeptidáz - például a kex2, furin vagy PACE - vesz részt a csoportjuk által leírt Xa faktor deléciós mutánsok hasításában, azonban nem adtak semmilyen utalást egy ilyen proteáz befolyására a X faktor feldolgozása vonatkozásában. Az 5,660,950 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban szintén csak a PACE rekombináns előállítása és a proteáz K-vitamin-függő proteinek hasításának javítására való felhasználása szerepel. Egy sor más vérfaktorral együttes felsorolásban a X faktort is említik, azonban a közlést igazoló adatok hiányoznak.

E találmány keretében mi mutattuk ki először egyértelműen, hogy a X faktor érési folyamatához szükséges proteáz egy kétbázisú endoproteáz, azaz az endogén előforduló furin. Az endoproteáz in vivő elsősorban az egyláncú X faktor molekula hasítását végzi, amikor is az érett forma keletkezik, amely nehéz és könnyű láncból áll. In vitro ezenkívül a X faktor propeptid szekvenciát is lehasítja (2. példa).

A találmány szerinti X faktor analógok, amelyek egy sejtben nem a természetben előforduló proteáz számára tartalmaznak proteáz hasítási helyet, a szelektív hasítási reakciókban azokon a helyeken hasítódnak, amelyek a natív X faktorban is hasadnak. Ezáltal olyan rekombináns X faktor molekulát kapunk, amely csak a 22 kD könnyű láncból és a körülbelül 50 kD nehéz láncból áll, és nem jön létre aspecifikus hasítás révén fellépő inaktív X faktor molekula. Ezeket a módosított X faktor molekulákat, ugyanúgy, mint a natív X faktor molekulákat, nem az intracelluláris proteázok aktiválják Xa faktorrá. Ezeket végül a megfelelő proteázok (előnyösen szerinproteázok vagy szubtilizinrokon proteázok) aktiválják Xa faktorrá.

Egy kiviteli alak szerint ezért egy kétláncú X faktor analógot ismertetünk.

Egy speciális kiviteli alak szerint olyan X faktor analógokat állítunk elő, amelyek tisztított formában előnyösen mint egyláncú molekulák léteznek. Kétbázisú proteázhiányos sejtben a X faktor analóg expressziója révén a X profaktort egyláncú molekulaként kapjuk meg. Az egyláncú X faktor molekula nagyfokú stabilitásával és molekuláris integritásával tűnik ki. Eddig nem tudtak tisztított formában egyláncú X faktor molekulát izolálni, mivel nagyon gyorsan kétláncú formává hasadt [Fair et al., Blood, 64, 194-204 (1984)]. A rekombináns egyláncú X faktor analógot specifikus hasítással kétláncú X faktor formává alakíthatjuk, ezután pedig Xa faktorrá, illetve Xa faktor analóggá aktiválhatjuk. Ezt úgy valósíthatjuk meg, hogy egy proteázhiányos sejtből izolált

HU 225 246 Β1 egyláncú rekombináns X faktor molekulát egy kétbázisú proteázzal - ilyen a furin/PACE vagy a kex2 - hozzuk érintkezésbe, és kétláncú X faktor analóggá hasítjuk.

A kétláncú X faktor analógot Xa faktorrá, illetve Xa faktor analóggá aktiválhatjuk. Ezt például úgy érhetjük el, hogy egy X faktor analógot, amely módosítás következtében az aktiválási peptid szakaszban egy furinspecifikus hasítási hellyel rendelkezik, egy furinhiányos sejtből egyláncú molekulaként izolálunk, majd egy endoproteázzal való reagáltatás révén aktivált Xa molekulává alakítjuk.

Egy izolált, egyláncú X faktor analógot - amely olyan módosítást tartalmaz az aktiválási pepiidben, amely lehetővé teszi, hogy a szerinproteázok csoportjából egy proteáz vagy a kallikrein itt alternatív módon hasítsa először egy kétbázisú endoproteázzal - például furinnal - való kezeléssel kétláncú X faktor molekulává hasítunk, és ezt a továbbiakban egy szerinproteázzal olyan módon hozzuk érintkezésbe, hogy megtörténjék a Xa faktorrá, illetve Xa faktor analóggá való aktiválás.

A sejttenyészetböl izolált X faktor analógot, mint kétláncú molekulát közvetlenül kezelhetjük a specifikus aktiválóproteázzal.

Az ilyen módon előállított Xa faktor, illetve Xa faktor analóg a szelektív és irányított hasítási reakció következtében nagymértékű stabilitással és strukturális integritással rendelkezik, és főképpen nem tartalmaz inaktív X/Xa faktor analóg köztitermékeket és autoproteolitikus lebontási termékeket.

A találmány a továbbiakban a találmány szerinti X faktor analógokat kódoló rekombináns DNS-re vonatkozik. A rekombináns DNS kifejeződés után olyan X faktor analógot eredményez, amelynek az aminosavszekvenciája a humán X faktorénak felel meg, kivéve, hogy olyan módosítást tartalmaz, amely a hasítási specificitást és a hasítási termékeket befolyásolja, ugyanakkor biológiai koaguláns aktivitása lényegében változatlan marad.

Egy további szempont szerint a rekombináns DNS-t tartalmazó transzformált sejteket is rendelkezésre bocsátjuk.

A találmány egy további alakjában egy tisztított X faktor analógot vagy ennek egy előproteinjét tartalmazó készítményt ismertetünk, amely a természetben előforduló Xa faktor aktiválási hely területén módosítást tartalmaz. Az aktiválási hasítási helyet tartalmazó szakaszban lévő módosítás egy új felismerő-, illetve hasítási helyet képez - amely a polipeptid ezen pozíciójában nem fordul elő a természetben - egy olyan proteáz számára, amely rendes körülmények között a polipeptidet nem ezen a helyen hasítja. A készítmény egy egyláncú vagy kétláncú X faktor analógból álló tisztított készítmény lehet, amikor is a polipeptidet egy sejttenyésztő rendszerből tisztítjuk vagy egy sejttenyészet felülúszójából, vagy egy sejttenyészet kivonatából való izolálás után. Egy sejttenyésztő rendszerből előtisztítással előállított rekombináns X faktor analóg a technika állása szerinti ismert eljárásokkal tovább tisztítható. Erre különösen alkalmasak a kromatográfiás eljárások, mint a gélszűrés, ioncserés vagy affinitáskromatográfia.

Egy kiviteli alakban a találmány szerinti készítmény a X faktor analógot előnyösen egyláncú molekulaként, izolált formában tartalmazza. Egy ilyen készítményt úgy állítunk elő, hogy egy rekombináns technikával kapott X faktor analógot egyláncú molekulaként izolálunk egy sejtrendszerből, előnyösen olyan sejtek tenyészetéből, amelyekből hiányzik az endoproteáz, amely az egyetlen láncot nehéz és könnyű lánccá hasítaná.

Egy speciális szempontnak megfelelően a készítmény egyláncú X faktor analógot tartalmaz olyan módosítással, amely lehetővé teszi Xa faktorrá való aktiválását in vitro egy olyan proteázzal, amelyet kétbázisú endoproteázok - ilyen például a kexin/kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4 és LPC/PC7 - csoportjából választunk ki. Az aktiválás úgy történik, hogy a X faktor analógot összehozzuk a proteázzal, amikor is, mint a természetben előforduló folyamatban, az érett X faktor formában hasadás következik be, és a módosítás következtében az aktiválási peptid lehasad, miáltal Xa faktor, illetve Xa faktor analóg keletkezik.

A találmány szerinti készítmény a X faktor analógot - mint egyláncú molekulát - Xa faktorként (FXa) vagy a β-peptid deléciójával tartalmazhatja. A készítmény a X faktor analógot enzimesen inaktív formában tartalmazza, legalább 80%-os, előnyösen 90%-os, különösen előnyösen 95%-os tisztaságban, és nem tartalmaz X/Xa faktor analógból származó inaktív, proteolitikus köztitermékeket.

Egy további kiviteli alakban a találmány szerinti készítmény a X faktor analógot előnyösen kétláncú molekulaként - izolált formában - tartalmazza. Ehhez például egy sejtrendszerből rekombináns technikával egyláncú molekula formában izolált X faktor analógot in vitro - tehát a sejten kívül - egy proteázzal, előnyösen egy kétbázisú proteázzal kétláncú formává hasítunk. Ezt a következőképpen végezhetjük el: a proteázt közvetlenül a X faktor analógot kifejező klón tenyészetének felülúszójához keverjük, vagy úgy, hogy a tisztított proteázt keverjük hozzá, vagy egy proteázt rekombináns formában kifejező sejttenyészet felülúszóját adjuk hozzá, vagy pedig együtt tenyésztjük a X faktor analógot és a proteázt kifejező kiónokat.

A X faktor analógot tartalmazó sejttenyészet felülúszóját vagy a tisztított X faktor analógot immobilizált proteázzal is összehozhatjuk, amikor is megtörténik a kétláncú formává való átalakulás. Ennél az eljárásnál a proteáz előnyösen mátrixhoz van kötve, és a sejttenyészet felülúszóját vagy a tisztított készítményt, amelyek a X faktor analógot tartalmazzák, átvezetjük ezen a mátrixon. A X faktor analóg immobilizálása is elképzelhető, mialatt a proteáz van a mobil fázisban. Az egymással reagáló komponenseket (X faktor analóg és proteáz) is összekeverhetjük és meghatározott ideig inkubálhatjuk. A proteázt végül a keverékből, például affinitáskromatográfiával, eltávolítjuk.

A X faktor analóg kétláncú formáját úgy is megkaphatjuk, ha a proteázt és a X faktor analógot egy adott

HU 225 246 Β1 sejtben közvetlenül együtt fejezzük ki, majd adott esetben tisztítjuk.

A találmány egy speciális kiviteli formájában a készítményben lévő egyláncú vagy kétláncú X faktor analóg olyan módosítást tartalmaz, amely lehetővé teszi in vitro Xa faktorrá, illetve Xa faktor analóggá való aktiválását. A X faktor Xa faktorrá, illetve Xa faktor analóggá történő aktiválását úgy végezzük, hogy a X faktor analógot egy proteázzal hozzuk érintkezésbe, amelyet a kétbázisú endoproteázok - ilyen például a kexin/kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7 csoportjából, a szerinproteázok - ilyen például a XIla faktor, Xla faktor, Ha faktor, Xa faktor - vagy a kallikrein közül, vagy ezen proteázok származékai közül választunk ki. A proteázokat hordozón immobilizálhatjuk.

A találmány szerinti készítmény kiindulási anyagként szolgálhat a Xa faktor előállításához és kinyeréséhez. Ekkor a készítményt, amely az egyláncú vagy a kétláncú X faktor analógot tartalmazza, egy üzemi méretű gyártási tételben, például adott esetben egy immobilizált proteázzal hozzuk össze olyan feltételek mellett, amelyek a X faktor analóg Xa faktorrá való optimális aktiválását teszik lehetővé, és így kapjuk a Xa faktort, illetve Xa faktor analógot. Az ilyen módon kapott Xa faktor analógot ezután általánosan ismert módszerekkel gyógyszerkészítménnyé alakíthatjuk.

Egy speciális kiviteli alakban a tisztított egyláncú vagy kétláncú X faktor analógot tartalmazó készítmény egy fiziológiai szempontból elfogadott hordozót tartalmaz, és adott esetben gyógyászati készítményként formulázzuk. A formulázást a szokásos módon végezzük, azaz sókat - például nátrium-kloridot, kalcium-kloridot tartalmazó pufferrel és aminosavakkal - például glicinnel és/vagy lizinnel - keverjük 6-8 pH-tartományban, majd gyógyszerkészítménnyé alakítjuk. A X faktor analógot tartalmazó készítményt kész oldat alakjában vagy liofilizált formában, vagy a felhasználásig mélyfagyasztva, mint tárolásra alkalmas terméket állítjuk elő. Előnyös, ha a készítményt liofilizált formában tároljuk, és megfelelő oldószerrel optikailag tiszta oldattá oldjuk fel.

A találmány szerinti készítmény azonban folyékony készítményként, illetve folyékony-mélyfagyasztott formában is forgalomba hozható. A találmány szerinti készítmény különösen stabil, azaz alkalmazás előtt oldott formában is hosszabb ideig állni hagyhatjuk. Kimutatjuk, hogy a találmány szerinti készítmény több órán át-napokig semmiféle aktivitásveszteséget nem mutat.

A találmány szerinti készítményt egy megfelelő eszközben, előnyösen alkalmazásra szolgáló eszközben bocsáthatjuk rendelkezésre, mégpedig egy proteázzal kombinálva, amelyet az endoproteázok - ilyen például a kexin/kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7 - csoportjából, vagy a szerinproteázok, mint például a Ha faktor, Xlla faktor, Xla faktor, Xa faktor, vagy a kallikrein közül választunk ki, vagy ezen proteázok származékai közül választunk ki.

Azt a találmány szerinti készítményt, amely a X faktor analógot proteázzal - amely a X faktor analógot Xa faktorrá képes aktiválni - kombinálva tartalmazza, kombinált készítményként állítjuk elő. Az ilyen kombinált készítmény egy hordozón immobilizált proteázt tartalmazó tartályból - adott esetben minioszlop formában vagy proteázzal töltött fecskendő formában - és a X faktor analógot tartalmazó készítménnyel töltött tartályból áll. A X faktor analóg aktiválásához a X faktor analógot tartalmazó oldatot például átnyomjuk az immobilizált proteázon. A X faktor analógot tartalmazó oldat a készítmény tárolása alatt a proteáztól előnyösen térbelileg el van választva. A találmány szerinti készítmény ugyanabban a tartályban lehet, mint a proteáz, azonban a komponensek egy impermeábilis választófallal, amelyet az esetleges felhasználás előtt könnyen el lehet távolítani, térbelileg el vannak választva. Az oldatokat saját külön tartályaikban is tárolhatjuk, és csak röviddel a felhasználás előtt keverjük össze egymással.

Egy speciális kiviteli alakban az aktiváláshoz használt proteáz egy olyan szerinproteáz, amely a természetben is részt vesz a véralvadásban. Ilyen például a Xlla faktor vagy a Xla faktor, amelyeket az alkalmazás előtt nem szükséges a Xa faktortól elválasztani, hanem ezzel együtt alkalmazhatók.

A X faktor analóg Xa faktorrá aktiválódását röviddel a közvetlen felhasználás előtt, azaz a betegnél való alkalmazás előtt végezhetjük el. Az aktiválás immobilizált proteázzal való kontaktus révén érhető el, vagy oldatok összekeverésével, amelyek közül az egyik proteázt, a másik X faktor analógot tartalmaz. Ezáltal lehetséges a két komponenst elválasztva oldatban tartani, és egy alkalmas infúziós eszköz révén, amelyben az átfolyás alatt a komponensek érintkeznek, összekeverni, és így a mindenkori molekulát Xa faktorrá, illetve Xa faktor analóggá aktiválni. A betegnek így egy Xa faktorból és egy további szerinproteázból - amely az aktiválást végezte - álló keveréket adunk be. Ekkor főképpen az adagolásra kell ügyelni, mivel a ráadásul bevitt szerinproteáz az endogén X faktort is aktiválja, és ezáltal megrövidülhet az alvadási idő.

Egy előnyös kiviteli alakban a gyógyszerkészítményt alkalmas eszközben, előnyösen alkalmazásra szolgáló eszközben, vagy folyékony-fagyasztott, vagy liofilizált formában bocsátjuk rendelkezésre. Alkalmazásra szolgáló megfelelő eszköz lehet a 366 916 számú vagy 382 783 számú ausztriai szabadalmi leírásban ismertetett kétkamrás fecskendő.

A találmány egyik alakjában a készítmény a X faktor analógot olyan módosított formában tartalmazza, amely lehetővé teszi in vivő a X faktor analóg Xa faktorrá aktiválását. A találmány szerinti készítményben lévő X faktor analógok főként olyan módosítást tartalmaznak, amely felismerési helyként/hasítási helyként szolgál egy proteáz számára, amelyet a szerinproteázok például Xlla faktor, Xla faktor, Xa faktor - vagy a kallikrein közül választunk ki, és az említett analógokat az egyik említett proteáz in vivő Xa faktorrá, illetve Xa faktor analóggá hasítja. Terápiás felhasználáshoz különösen az olyan X faktor analógok előnyösek, amelyek az alvadási kaszkádon belül a Vlla/szöveti faktor komplextől és a tenázkomplextől független proteáz számára tartalmaznak felismerő/hasítási helyet. Ennélfogva a találmány szerinti készítmény IX faktor és VII faktor

HU 225 246 Β1 hiányos betegeknél is, és Vili faktor hiányos betegeknél is felhasználható vérzéscsillapításra. Azoknál a betegeknél, akiknél a véralvadási zavar XI faktor vagy XII faktor hiányra vezethető vissza, nem szabad használni olyan X faktor analógot tartalmazó gyógyszerkészítményeket, amelyeket Xlla faktor vagy Xla faktor aktivál. Például XI faktor hiány esetén egy Xlla faktor hasítási helyet tartalmazó X faktor analóg felhasználható lenne.

A találmány egy további alakja szerint a találmány szerinti készítmény mint további alkotórészt - adott esetben - egy vérfaktort tartalmaz zimogén formában, vagy egy aktív szerinproteázt. Ekkor további alkotórészként Vili faktor bypass aktivitású komponenseket tartunk előnyösnek. Ilyenek főképpen a II faktor, VII faktor, IX faktor, Vili faktor, V faktor és/vagy ezek közül az aktív szerinproteázok. További alkotórészek lehetnek a foszfolipidek, kalciumionok stb. A találmány egy speciális kiviteli formája szerint a találmány szerinti készítmény további Vili faktor bypass aktivitású komponenseket tartalmazhat.

A találmány szerinti készítmény mint Xa aktivitású gyógyszerkészítmény egykomponensű készítményként vagy más faktorokkal kombinálva, többkomponensű készítményként állhat rendelkezésre.

Gyógyszerkészítménnyé való feldolgozás előtt a tisztított proteint a szokásos minőség-ellenőrző vizsgálatoknak vetjük alá, majd terápiásán alkalmazható formává formulázzuk. Rekombináns technikával való előállítás esetén a tisztított preparátumot főképpen celluláris nukleinsavak és az expressziós vektorból származó nukleinsavak hiányára teszteljük, előnyösen a 0 714 987 számú európai szabadalmi leírásban megadott eljárás szerint.

Minthogy elvben minden biológiai anyag fertőző csírákkal lehet szennyezett, veszélytelen preparátum előállítása érdekében a készítményt adott esetben vírusok inaktiválása, illetve gyérítése céljából kezeljük.

A találmány egy további szempontja szerint egy kiváló stabilitással és strukturális integritással rendelkező Xa faktor analógot tartalmazó készítményt állítunk elő, amely mentes inaktív X/Xa faktor analóg köztitermékektől és autoproteolitikus lebontási termékektől. A készítményt előállíthatjuk úgy, hogy egy X faktor analógot a fent leírt módon aktiválunk, majd megfelelő készítményhez készítjük elő.

A találmány egy még további szempontját egy fent leírt tulajdonságú készítmény alkalmazása képezi, gyógyszer előállítására. Egy gyógyszer, amely a találmány szerinti X faktor analógot, illetve Xa faktor analógot tartalmazza, különösen jól beválik véralvadási zavarokkal küszködő betegek kezelésére - ilyen betegek például a hemofíliás betegek vagy az olyan betegek, akik gátlóantitesteket termeltek a szokásosan kezelésükre használt Vili faktor és/vagy IX faktor ellen - és mint Vili faktor bypass aktivitású preparátum.

A találmány további tárgyát képezi a találmány szerinti X faktor analógot kódoló szekvenciát tartalmazó nukleinsav alkalmazása gyógyszer előállítására. A nukleinsavat - amennyiben megfelelő expressziószabályozó szekvenciákat tartalmaz, puszta nukleinsavként alkalmazható - rekombináns expressziós vektorba integrálhatjuk, vagy hordozóra köthetjük, amely lehet foszfolipid- vagy víruspartikula. E nukleinsavat tehát gyógyszer előállítására alkalmazhatjuk, amely legfőképpen véralvadási zavarokkal küszködő betegek kezelésére alkalmas, mégpedig hemofíliás betegek vagy gátlóantitesteket termelő hemofíliás betegek kezelésére. A nukleinsav génterápiában való felhasználása is elképzelhető.

A találmány a találmány szerinti X faktor analógok előállítására szolgáló eljárásra is vonatkozik, és egy olyan készítményre, amely egy találmány szerinti X faktor analógot tartalmaz. Ennek érdekében egy X faktor kódoló szekvenciát egy megfelelő expressziós rendszerbe viszünk be, és megfelelő sejteket - előnyösen állandó sejtvonalakat - transzferálunk a rekombináns DNS-sel. A sejteket a génexpresszióhoz optimális körülmények között tenyésztjük, és a X faktor analógot vagy a sejttenyészet kivonatából, vagy a sejttenyészet felülúszójából izoláljuk. A rekombináns molekula tisztítását minden ismert kromatográfiás eljárással ilyen az anioncserés, kationcserés, affinitás- vagy immunaffinitás-kromatográfia - elvégezhetjük, vagy ezek kombinálásával tovább tisztíthatjuk.

A találmány szerinti X faktor analógok előállításához a teljes X faktort kódoló cDNS-t egy expressziós vektorba klónozzuk be. A klónozást az általánosan ismert klónozási technikáknak megfelelően végezzük. A X faktort kódoló nukleotidszekvenciát ezután úgy módosítjuk, hogy az aktiválási peptid szakaszban és adott esetben a C-terminális β-peptid szakaszban a kódolószekvencia olyan módon változzék meg, hogy egy fent leírt típusú X faktor molekula jöhessen létre. Ezt a technika jelenlegi állása szerint, ismert géntechnikai módszerekkel valósítjuk meg. Ilyen módszer a specifikusan irányított in vitro mutagenezis, vagy a szekvenciák deléciója, például a restrikciós endonukleázokkal való emésztés, vagy más, módosított szekvenciák inszerciója, vagy a PCR. Az így előállított X faktor mutánsokat ezután egy rekombináns expresszióhoz alkalmas expressziós rendszerbe építjük be, és ebben fejezzük ki.

A találmány szerinti X faktor analógokat kémiai szintézissel is előállíthatjuk.

A X faktor analógokat előnyösen rekombináns expresszió segítségével állítjuk elő. A géntechnológiai előállítás minden szokásos expressziós rendszerrel ilyenek például az állandó sejtvonalak vagy a virális expressziós rendszerek - kivitelezhető. Az állandó sejtvonalakat az idegen DNS-nek a gazdasejt kromoszómájába való stabil integrációjával állítják elő. Ilyen gazdasejtek például a Verő-, MRC5, CHO-, BHK-, 292, SK-Hep1 és különösen a máj- és vesesejtek. Az előállítás például papillomavírusból származó episzomális vektor révén is történhet. Virális expressziós rendszerek is alkalmazhatók, ilyenek például a vacciniavírus, bakulovírus vagy a retrovirális rendszerek. Általában a Verő-, MRC5, CHO-, BHK-, 293, Sk-Hep1 sejtvonalakat használják, valamint a mirigy-, máj- és vesesejteket. Eukarióta expressziós rendszerként alkalmazhatók az élesztők, endogén mirigyek (például transzgenikus állatok mirigyei) és más sejttípusok is. Természetesen

HU 225 246 Β1 transzgenikus állatok is használhatók a találmány szerinti polipeptidek és ezek származékai expressziójához. A rekombináns proteinek kifejezésére a speciális CHO-DHFR- sejtek váltak be [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 77, 4216-4220 (1980)].

A találmány szerinti X faktor analógok rekombináns technikával való előállítására prokarióta expressziós rendszerek is felhasználhatók. Ehhez leginkább azok a rendszerek alkalmasak, amelyek lehetővé teszik az E. coliban vagy B. substilisban való expressziét.

A X faktor analógok a megfelelő expressziós rendszerekben egy alkalmas promoter szabályozása alatt fejeződnek ki. Eukariótákban való kifejeződés esetében minden ismert promoter megfelel, például ilyenek az SVHO-, CMV-, RSV-, HSV-, EBV-, β-aktin-, hGHpromoterek vagy az indukálható promoterek, mint például a hsp- vagy metallotioneinpromoter. Előnyös, ha a X faktor analógokat a β-aktinpromoter szabályozása alatt, CHO-sejtekben fejezzük ki.

A találmány egyik kiviteli formája szerint a találmány szerinti készítmény előállításához alkalmazott eljárás a következő lépéseket tartalmazza: egy X faktor analógot kódoló DNS előállítása, egy sejt transzformálása a rekombináns DNS-sel, a X faktor analóg kifejezése, adott esetben egy proteáz jelenlétében, a X faktor analóg izolálása és adott esetben kromatográfiás eljárással való tisztítása.

Az eljárás egy kiviteli formája szerint a X faktor analógot mint kétláncú molekulát izoláljuk. Ekkor a X faktor analógot olyan sejtben fejezzük ki, amely lehetővé teszi a pro-X faktor analóg kétláncú X faktor analóggá való feldolgozását. A sejt ekkor előnyösen egy olyan sejt, amely egy X faktor előmolekula feldolgozására képes proteázt, például egy kétbázisú proteázt - mint a furin vagy ennek egy származéka - fejez ki. Adott esetben a feldolgozó hatékonyság növelése, illetve javítása érdekében a sejtet úgy módosíthatjuk, hogy az a proteázt erőteljesebben fejezze ki. Ezt például egy megfelelő kétbázisú endoproteáz, például furin/PACE, kex2 vagy ezek származékainak a koexpressziójával érhetjük el. A találmány szerinti X faktor analógot olyan sejtben is kifejezhetjük, amely normálkoncentrációban, vagyis a feldolgozáshoz szuboptimális koncentrációban tartalmaz proteázt, és ennélfogva a kétláncú formává való feldolgozás tökéletlenül megy végbe. Az ezután következő feldolgozás nehéz és könnyű lánccá ebben az esetben - amennyiben az egyláncú X faktor analóg a sejtfelülúszóba szekretálódik - a fent leírtak szerint megy végbe, azaz proteázkifejező sejtekkel való együtt tenyésztés révén, vagy úgy, hogy a felülúszót egy adott esetben immobilizált proteázzal hozzuk érintkezésbe. A sejtfelülúszót hordozómátrixon - amelyhez proteázt kötöttünk - is átnyomathatjuk, és ekkor az eluátum kétláncú X faktor analógot fog tartalmazni. A reakció komponenseit oldatba is bekeverhetjük, amelyet meghatározott időtartamig inkubálunk, majd a proteázt például affinitásmátrixon távolítjuk el.

Az így kapott kétláncú X faktor analógot ezután izoláljuk, tisztítjuk, és további felhasználásig, mint fent leírtuk, stabilan tároljuk.

Egy jellegzetes kiviteli alakban a kétláncú, adott esetben tisztított X faktor analógot in vitro egy proteázzal - amelyet az endoproteázok csoportjából választunk ki, ilyen például a kexin/kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7 vagy a szerinproteázok csoportjából választunk ki, ilyen például a Xlla faktor, Xla faktor, Xa faktor, lla faktor, vagy a kallikrein közül, vagy ezen proteázok származékai közül választunk ki - hozzuk érintkezésbe olyan körülmények között, amelyek között a X faktor analóg natív Xa faktorrá vagy egy Xa faktor analóggá aktiválódik.

Egy kiviteli forma szerint az aktiválás olyan kromatográfiás lépésben történik, amelyben a proteáz hordozón van immobilizálva. A tisztított kétláncú X faktor analógot olyan mátrixon vezetjük át, amelyhez hozzákötöttük a proteázt, és az eluátumból tisztított Xa faktort izolálunk.

Egy másik kiviteli forma szerint a komponenseket összekeverjük, és a proteázt a keverékből szelektíven eltávolítjuk.

Az egyláncú X profaktor analógnak a kétláncú X faktor analóg formává való processzálása és Xa faktorrá aktiválása természetesen kombinációban, egyetlen eljárásban is lehetséges. Az egyláncú X faktor analógot vagy ennek egy előformáját közvetlenül összehozzuk egy kétbázisú proteázzal - előnyösen furinnal vagy egy származékával -, amely lehetővé teszi nehéz és könnyű lánccá processzálását és Xa faktorrá aktiválását. Azt a X faktor analógot, amely a furin vagy egy származéka számára nem tartalmaz hasítási helyet az aktiválási peptidben, adott esetben egy további proteázzal - a különböző proteázok közül olyannal, amely lehetővé teszi az aktiválást - reagáltatjuk. A proteázok ezekben az esetekben keverékben, például furinból és Xla faktorból álló keverékben állhatnak rendelkezésre.

Az aktiválást a két lépés kombinálásával is el lehet végezni, egymás után kapcsolt, egymással közvetlen összeköttetésben lévő készülék segítségével, előnyösen hordozókkal, mint például oszlopokkal, amelyeken a proteázt (proteázokat) immobilizáltuk. Az első hordozón megtörténik a X faktor nehéz és könnyű lánccá hasítása, és a másodikon a Xa faktorrá való aktiválás az immobilizált proteáz révén. A hordozókat úgy kapcsolhatjuk össze, hogy az első oszlop kifolyóját közvetlenül összekötjük a második oszlop bemeneti nyílásával.

A feldolgozási reakció(k) és az aktiválás reakciófeltételeit a szakemberek minden további nélkül optimalizálhatják az adott keretfeltételeknek megfelelő kísérleti előírás szerint. Itt a szóban forgó reagáló partnerek átfolyási sebességének különös jelentősége van a kontaktus időtartama szempontjából. A sebesség ideális esetben 0,01 ml/perc és 1 ml/perc között van. Mint további paramétereknek, a hőmérsékletnek, pH-értéknek és a kioldás körülményeinek van jelentősége. Az átfolyás után az aktivált Xa faktor, adott esetben szelektív kromatográfiával, tovább tisztítható. Az eljárás kivitele a hordozóhoz kötött mindenkori proteázzal azért különösen előnyös, mivel a reakció elrendezettsége hordozó alkalmazásával - előnyösen kromatográfiás oszlopokkal - további tisztítási lépést tesz lehetővé.

HU 225 246 Β1

Egy további alak szerint egy X faktor analóg előállításához a X faktor analógot egyláncú molekulaként izoláljuk. Ennek érdekében a X faktor analógot olyan sejtben fejezzük ki, amely az egyedi láncnak könnyű és nehéz lánccá való precesszálását nem támogatja. Előnyös, ha ebből a sejtből ekkor hiányzik egy kétbázisú endoproteáz, mint például a kexin, furin és PACE. A találmány szerint megállapítottuk, hogy a X faktor könnyű és nehéz lánccá hasításáért felelős lényeges proteázok egyike a furin. Egy ilyen endoproteázhiányos mutáns sejtből izolálhatjuk egyláncú molekulaként a X faktor analógot. Egy ilyen módon izolált és adott esetben tisztított X faktor analógot ezután egy proteázzal amelyet a következő endoproteázok közül választunk ki: kexin/kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7 - hozunk össze, olyan körülmények mellett, az egyláncú X faktor analóg a kétláncú X faktor formává hasítódik. A találmány szerinti X faktor analógokat, amelyek az aktivitásért felelős peptidszakaszban olyan módosítást tartalmaznak, amelyek egy ilyen proteáz által történő hasítást tesznek lehetővé, ezen eljárás révén, adott esetben az endoproteázzal közvetlenül érintkezésbe hozva, az egyláncú X faktor analógot Xa faktorrá, illetve Xa faktor analóggá aktiválhatjuk.

Azokat a X faktor analógokat, amelyek az aktiválási peptid szakaszban olyan módosítást tartalmaznak, amely lehetővé teszi, hogy egy szerinproteáz vagy a kallikrein ott hasítson, kétláncú X faktor analóggá való előállításuk után az első különböző proteázok közül egy további proteázzal hozzuk érintkezésbe, és Xa faktor analóggá aktiváljuk.

A találmány egy alakja szerint egy aktív Xa faktort, illetve aktív Xa faktor analógot tartalmazó készítményt olyan eljárás segítségével kapunk, amelyben egy fent leírtak szerint előállított X faktor analógot egy aktiválási lépésben aktiválunk, és az aktivált polipeptidet a továbbiakban tisztított készítménnyé - amelyet adott esetben gyógyszerkészítménnyé formulálunk - dolgozzuk fel.

A találmány szerinti X faktor analógokkal, amelyeket egy fent leírt eljárásban Xa faktorrá aktiválunk, kiváló stabilitással és strukturális integritással rendelkező olyan tisztított Xa faktort, illetve Xa faktor analógot nyerünk, amely különösképpen mentes inaktív X/Xa faktor köztitermékektől.

A találmányt a következő példák és ábrák jobban szemléltetik, azonban ezek a speciális kiviteli példák nem korlátozzák a találmányt.

Az 1. példa egy rX faktor szerkesztését és expresszióját írja le; a 2. példa leírja az rX faktor furinnal végzett feldolgozását nehéz és könnyű lánccá; a 3. példa a X profaktor immobilizált proteázzal való feldolgozását ismerteti; a 4. példa az in vitro processzált rX faktor aktivitását írja le; az 5. példa az rX faktor furinhiányos sejtekben való expresszióját írja le; a 6. példa az rX faktor analógok szerkesztését és expresszióját ismerteti; a 7. példa a X faktor hasítási termékek N-terminális végének meghatározását írja le. A 8. példa az Arg-Arg-Lys-Arg/lle furin hasítási hellyel rendelkező FX analóg expresszióját és vizsgálatát írja le (rFX^RRKR/J);

a 9. példa az rFX^RRKR/J protein rfurinszármazékkal való in vitro aktiválását írja le; a 10. példa az rFX^RRKR/J in vitro aktivált rekombináns FX analóg működőképességét ismerteti; a 11. példa az Asp-Phe-Thr-Arg/Val FXIa hasítási hellyel rendelkező rFX analóg FXIa-vá való in vitro aktiválását írja le.

Az alábbiakban az ábrák leírása következik.

1- 1. és 1-2. ábra: a X faktor nukleotid- és aminosavszekvenciája;

2- 1. és 2-2. ábra: az aktiválásért felelős peptidszakaszban módosított proteáz hasítási hellyel rendelkező X faktor analógok vázlatos ábrázolása;

3. ábra: a phAct-rFX expressziós vektor vázlatos ábrázolása;

4. ábra: a CHO-sejtekben kifejezett rX faktor Western-blot-analízise sokszorozás előtt és után;

5. ábra: az rX faktor Western-blot-analízise furinszármazékkal való in vitro hasítás után;

6. ábra: furintartalmú és furinhiányos sejtekben kifejezett rX faktor molekulák Western-blot-analízise;

7. ábra: rFX/rFXa analóg szerkezetek - amelyekben megváltoztattuk a nehéz lánc C-terminális végét - vázlatos ábrázolása;

8. ábra: furintartalmú és furinhiányos CHO-sejtekből származó rX faktor processzálási termékek N-terminális végének vázlatos ábrázolása rfurinnal való kezelés előtt és után;

9. ábra: CHO-sejtekben kifejezett rFX^RRKR/J faktor

Western-blot-analízise;

10. ábra: rFX^RRKR/J faktor Western-blot-analízise furinszármazékkal végzett in vitro aktiválás után;

11. ábra: rFX^DFTR/v faktor Western-blot-analízise furinszármazékkal végzett in vitro aktiválás után.

Az expressziós vektorokat standard klónozótechnikákkal állítottuk elő [Maniatis et el.: „Molecular Cloning. A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1983)]. A DNS-fragmentumok polimeráz-láncreakcióval (PCR) való előállítása általános módszerekkel történt [Clackson et al., „PCR A Practical Approach”, McPherson, Quirke, Taylor (szerk.); 187-214. old. (1991)].

1. példa

Egyláncú rFX expressziója és feldolgozása rFX könnyű/nehéz lánccá a) rFX expressziós vektor előállítása A rekombináns FX (rFX) előállítására az FX cDNS-t egy humán máj lambda-cDNS-bankból izoláltuk Messier és munkatársai leírása szerint [Gene, 99, 291-294 (1991)]. Egy pozitív klónból PCR segítségével, valamint a 2911. számú oligonukleotiddal (5’-ATTACTCGAGAAGCTTACCATGGGGCGCCCACTG-3’) (1. számú szekvencia), mint 5’ primerrel, és a 2912. számú oligonukleotiddal

HU 225 246 Β1 (5’-ATTACAATTGCTGCAGGGATCCAC-3') (2. számú szekvencia), mint 3' primerrel egy olyan DNS-t sokszoroztunk, amely az 1467 kb FX-kódoló szekvenciát tartalmazta, valamint a 39 bp méretű 3’ nem transzlatált régiót - amelyet egy Xhol hasítási hely határol 5’-végén - és a 3’-végen egy Mfel hasítási helyet. Ezenkívül a 2911. számú primer révén az FX ATG elé egy ACC szekvenciát építettünk be úgy, hogy egy optimális Kozák transzlációt indító szekvencia keletkezett. Ezt a PCR-terméket ezután, mint Xhil/Mfel fragmentumot, a Sall-gyel és EcoRI-gyel hasított phAct expressziós vektorba klónoztuk be. A kapott expressziós plazmidot phAct-rFX-nek neveztük el (3. ábra). A phAct expressziós vektor a következőket foglalja magában, a humán béta-aktinpromotert, a 78 bp UTR-t, valamint az intront, egy sokszoros klónozó hasítási helyet és az SV40 poliadenilációs helyet (UTR=untranslated region).

b) Az rFX expressziója CHO-sejtekben

Stabil, rFX-kifejező sejtvonal előállítása céljából a dhfr-hiányos CHO-sejteket a phAct-rFX expressziós plazmiddal és a pSV-dhfr szelekciós marker plazmiddal kotranszfektáltuk. Minden további expresszió- és funkcióanalízis számára a sejttenyészeteket szérummentes szelekciós táptalajjal, 10 pg/ml K-vitamin jelenlétében 24 óra hosszat inkubáltuk. A kapott sejtklónokban az rFX expresszióját az antigén mennyisége alapján mutattuk ki (ELISA, Asserachrom, Boehringer Mannheim), majd a rekombináns proteint SDS-PAGE módszerrel vizsgáltuk (4A. és 4B. ábra). A kiindulási kiónokban és ezek szubklónjaiban a rekombináns FX protein - mint a Western-blotban felismerhető (4A. ábra) - egy 22 kD könnyű lánc (LC) és egy körülbelül 50 kD nehéz lánc (HC) formában fordul elő, amelyek azonosak a plazma X faktor proteinnel. Felismerhető még egy 750 kD proteinsáv, amely az egyláncú (SC) molekulának felel meg, amelynek a jelenlétét leírták FX-zel transzfektált CHO-sejtekben [Wolf et al., J. Bioi. Chem., 266, 13 726-13 730 (1991)] és humán plazmában [Fair et al., Blood, 64, 194-204 (1984)]. Erőteljesen kifejező kiónok előállításához a kiindulási kiónokat növekvő mennyiségű metotrexáttal szaporítottuk, majd stabilizálásig szubklónoztuk. Az expressziót körülbelül 200-500 ng/10 E6 sejt, illetve 1 pg/ml/24 óráról 78 pg/10 E6 sejt, illetve 120 pg/ml/24 órára tudtuk növelni. Ezen magas szinten kifejeződő sejtklón felülúszóinak Western-blot-analízise (4B. ábra és 5A. ábra: 2. nyomsáv) az egyláncú rFX molekulák feldúsulását mutatta, és a könnyű lánc további formáinak jelenlétét. A könnyű lánc 22 kD formája mellett, amely a plazmatíkus formának felel meg (teljesen karboxilált és propeptid nélküli forma), a könnyű lánc három további variánsa, körülbelül 21 kD, 22,5 kD és 20 kD molekulatömeggel, fordul elő. Ezekben a kiónokban a könnyű lánc heterogenitását - a rekombináns anyag N-terminális szekvenálása segítségével a propeptid nem tökéletes lehasadására (itt: az rFX anyag körülbelül 50%-a), valamint a nem teljes karboxilezettségre (itt: az rFX anyag körülbelül 50%-a) tudtuk visszavezetni. A 21 kD protein egy alulkarboxilezett propeptidtartalmú és a 20 kD protein egy alulkarboxilezett propeptidmentes formája a könnyű láncnak, míg a

22,5 kD sáv a teljesen karboxilezett, de propeptidtartalmú LC-formát képviseli.

2. példa

Az egyláncú rFX könnyű/nehéz lánccá való feldolgozása rfurinszármazékkal A X faktor propeptid/könnyű lánc N-termínális vég közötti (RVTR4-A) és a könnyü/nehéz lánc közötti (RRKRiS) hasítási helyeknek a furin-konszenzusfelismerő szekvenciával (RXK/RRiX) való hasonlósága alapján fennáll annak a lehetősége, hogy mind az egyláncú, mind a propeptidtartalmú rFX molekula feldolgozását rfurinszármazékkal in vitro javítsuk. Az irodalomban mindkét feldolgozási lépésnél proteázokat gyanítanak, azonban ezeknél nem furinról van szó [Rehemtulla et al., Blood, 79, 2349-2355 (1992); Wallin et al., Thromb. Rés., 395-403 (1994)].

CHO-rFX és CHO-rfurin ATM6xHis (0 775 750 A2 számú európai szabadalmi bejelentés), valamint CHO-rFX és nem transzfektált CHO (mint negatív kontrollok) sejttenyészet-felülúszókat 1:1 arányban összekevertünk és 37 °C-on inkubáltunk. A reakcióelegy részleteit az inkubáció előtt (t=0) és különböző inkubációs idők után (t=2, 4, 5 óra) Western-blot-módszerrel analizáltuk processzált rFX-re (5. ábra). A sejttenyészet-felülúszókban az rFX kimutatását egy antihumán FX antiszérummal (5A. ábra), illetve egy FX könnyű láncra specifikus monoklonális antitesttel (5B. ábra) végeztük.

A CHO-rFX/CHO keverékkel ellentétben a CHO-rFX/CHO-rfurin már 2 órás 37 °C-on való inkubálás után (5A. ábra, 7. nyomsáv; 5B. ábra, 8. nyomsáv) majdnem teljes feldolgozást mutat. Az egyláncú rFX nagyrészt a könnyű és nehéz lánc formává alakult át. A könnyű lánc területén a 22 kD (karboxilezett forma) és 20 kD (alulkarboxilezett forma) processzált propeptidmentes formákat találtuk csak, még körülbelül 50:50 százalék arányban. A sejttenyésztés feltételeinek az optimalizálásával ez az arány a karboxilezett forma javára javítható. A proszekvencia helyes lehasítását Arg-1 és Ala+2 között és a könnyű lánc N-terminális végének a homogenitását N-terminális szekvenálással állapítottuk meg. A kontrollkísérletben, amelyben a CHO-rFX-et CHO-felülúszókkal kevertük össze, még 6 órás inkubáció után sem észleltünk az rFX sávmintában változást (5A. ábra, 5. nyomsáv; 5B. ábra, 6. nyomsáv). Ezzel mutattuk ki, hogy az rfurin a CHOsejtfelülúszóban biológiailag aktív, és mind a propeptid, mind az rFX nehéz/könnyű lánccá hasítását el tudja végezni.

3. példa

X faktor feldolgozása kelát-Tentakel gélen immobilizált rfurinnal

Annak megállapítására, hogy vajon egy szubsztrátumot oszlophoz kötött rfurinszármazékkal el lehet-e hasítani, egy kísérleti sarzsban megvizsgáltuk, hogy oszlopmátrixként a Ni²⁺-NTA-agaróz helyett használ12

HU 225 246 Β1 ható-e a Fractogel EMD-Tentakelgel (Merck). Mivel itt a fémionok összehasonlítva a Ni²⁺-NTA-agarózzal térbelileg távolabb vannak a tulajdonképpeni oszlopmátrixtól, ez a szubsztrátumnak jobb térbeli hozzáférhetőséget biztosíthat a kötött rfurinszármazékhoz. A szóban forgó reakciókeverékben a X profaktort a Tentakelgelhez kötött rfurinszármazék dolgozza fel: a Fractogel EMD-Tentakelgelre az előállító cég előírása szerint Ni²⁺-ionokat viszünk fel, és friss szérummentes sejttenyésztő táptalajjal hozzuk egyensúlyba. Ezután az oszlopra szérummentes CHO-rfurin-származék felülúszót viszünk fel. Növekvő imidazolkoncentrációjú 40 mM-ig - szérummentes sejttenyésztő táptalajjal való mosás következik. Ezután a X profaktort mint szérummentes CHO-felülúszót visszük az oszlopra. Az oszlopon átfolyt folyadékban Western-blot-anal ízissei specifikus X faktor antiszérummal mutatjuk ki a X profaktor kétláncú X faktorrá történő processzálását.

4. példa

Az in vitro feldolgozott rekombináns X faktor aktivitása

Rekombináns X faktor előmolekulát rfurinnal és enélkül inkubálunk 4 °C-on. Különböző időpontokban mintát veszünk, és a mintákat -20 °C-ra lefagyasztjuk. Az inkubálás befejezése után (4 nap múlva) minden mintát FX-Coatest kittel (Chromogenix) FX-aktivitásra tesztelünk. Úgy járunk el, hogy az egyes felülúszók 50 μΙ-éhez 50 μΙ FX-hiányos humán plazmát adunk, majd az előállító cég előírásának megfelelően az rFX-et kígyóméreggel (RVV), kalcium-klorid jelenlétében, rFXa-vá konvertáljuk; ezt követően az rFXa a kromogén szubsztrátumot (S-2337) hidrolizálja, ami sárga színű para-nitro-anilin felszabadulásához vezet. Minthogy az rFXa mennyisége és a színintenzitás egymással egyenes arányban van, standardgörbe segítségével - amelyet egy plazmahígítási sor értékeivel veszünk fel - az rFXa-vá aktiválható rFX/ml sejttenyészet-felülúszó mennyisége meghatározható. Ezekkel az eredményekkel és az ismert rFX antigén mennyiséggel (ELISA-adatok) a Xa faktorrá aktiválható rX faktor rész százaléka kiszámítható. Az eredményeket az 1. táblázat foglalja össze.

Annak érdekében, hogy a CHO- és CHO-rfurin-felülúszókban lévő aspecifikus proteolitikus aktivitást kizárjuk, mindkét sejttenyészet-felülúszót ugyanígy vizsgáltuk.

A CHO-felülúszókkal inkubált CHO-rFX (rfurin nélkül) - kontroll - még 4 nap múlva sem mutatott lényeges változást az rFXa aktivitásban, amely a kísérleti ingadozások miatt körülbelül 800 mU/ml körül volt és 55-61 X működőképes rFX-nek felelt meg. Amikor összehasonlításul CHO-rFX-et CHO-rfurinnal inkubáltunk, az inkubációs idő alatt az rFX-aktivitás állandóan növekedett, és körülbelül 61%-ról (időpont: t=0) 86%-ra emelkedett (1. táblázat).

Kimutattuk tehát, hogy a magas szinten kifejező klónokból származó CHO-rFX rfurinszármazékkal való in vitro feldolgozása révén a működőképes rFXa-vá aktiválható rFX rész lényegesen javult.

1. táblázat

	Inkubálás (nap)	Aktivitás (mU)	Antigénmennyisóg (pg/ml)	Működőképes rFX rész (%)
CHO-FX+CHO	0	814	14	58
	1	847	14	61
	2	835	14	60
	3	790	14	56
	4	763	14	55
CHO-rFx+CHO-rfurin	0	853	14	61
	1	1018	14	73
	2	1099	14	79
	3	1135	14	81
	4	1198	14	86
CHO+CHO-rfurin		0
Plazma FX 500 mU		585

5. példa

Rekombináns X faktor kifejezése furinhiányos sejtekben 55

Mint az előző példákban kimutattuk, a X faktor előproteinnél mind a propeptid lehasítását, mind az egyláncú molekula könnyű/nehéz lánccá történő in vitro hasítását a furin közvetítette. Feltételezhető tehát, hogy ezek a lépések az ubikviter előforduló furin révén, 60 a mindenkori kifejezett rX faktor mennyiségétől függően, a sejten is endogén végbemennek változó hatékonysággal. Ez megint heterogén rX faktor formák keverékének keletkezéséhez vezet.

Egy lehetőleg homogén és emellett stabil rX faktor molekula előállításának egyik lehetőségét az jelenti, hogy az rX faktor endogén proteázok - főképpen furin - által történő hasítását megakadályozzuk, és ezzel

HU 225 246 Β1 funkcionálisan inaktív rX faktor előmolekulát (amelyet későbbi downstream processzálással funkcionálisan aktív formájává - ideálisan közvetlenül a felhasználása előtt - változtatunk) állítunk elő.

Ez az eljárás speciálisan olyan FX analógok előállításánál használható, amelyek furin hasítási helyet tartalmaznak az eredeti aktiválási hely helyett. Ezeknél a szerkezeteknél egy ilyen rekombináns rFX mutáns aktiválása in vivő az endogén furin révén történhet meg, és aktivált instabil rFX formák szekréciójához vezethet. Ezeknek a formáknak a degradációja CHO-proteázok hatására, például nagymértékű sejtlízissel járó sejttenyésztési körülmények között, a sejttenyészet-felülúszók tárolása alatt, vagy a tisztítási eljárás alatt, vagy autoproteolízis következtében inaktív lebontási termékeket eredményezhet (Wolf et al., 1991).

Ezt a célt például úgy érhetjük el, hogyha a sejttenyésztő táptalajt olyan szerrel egészítjük ki, amely az intracelluláris furin aktivitást csökkenteni, illetve megszüntetni képes.

Egy másik lehetőség, ha a priori furinhiányos sejteket alkalmazunk [Möhring et al., Infect. Immun., 41, 998-1009 (1983); Ohniski et al., J. Virol, 68, 4075-4079 (1994); Gordon et al., Infect. Immun., 63, 82-87 (1995)].

Mi az FD11 furinhiányos CHO-sejtklónt [Gordon et al., Infect. Immun., 63, 82-87 (1995)] 20 pg phAct-FX-zel és 1 pg pVCSV-neo plazmiddal (a pVC vektorban neomicinrezisztencia-gént tartalmaz az SV40 promoter szabályozása alatt) kotranszfektáltuk. Stabil klón előállítása érdekében a táptalajt ml-enként 0,8 pg G418-cal egészítettük ki. Egy furint tartalmazó és egy furinhiányos CHO-klón által szérummentes felülúszókba szekretált rX faktor molekulák összehasonlításakor azt mutatta a Western-blot-analízis, hogy a furinhiányos sejtekben az rX faktor előmolekula feldolgozása elmarad, és csak egyláncú X faktor előmolekula van jelen (6. ábra); ezzel szemben az rX faktort a „normál”-sejtek mérsékeltebb expressziónál, endogén furin dacára, már csak nagyon korlátozottan processzálják. Az alkalmazott sejtklón csekély rFX expressziós foka miatt az rX faktor könnyű lánca a bloton itt nem látható.

6. példa

X faktor analógok előállítása (véleményünk szerint a találmány legjobb kiviteli módja)

6.1 Expressziós plazmidok szerkesztése X faktor analógok előállításához

Rekombináns rX faktor analóg előállításához az Asn-Leu-Thr-Arg/lle hasítási helyet (231-235 aminosav), amely a X faktor Xa faktorrá aktiválására szolgál, egy másik proteáz számára - például furin, FXIa, Fxa, FXIIa, Flla vagy kallikrein számára - specifikus hasítási hellyel cseréltük ki. Ezen X faktor analógokhoz való expressziós plazmidokat mind a phAct-FX plazmidból (lásd az 1. példát) vezettük le.

Annak érdekében, hogy a X faktor expressziós plazmidok klónozását egyszerűsítsük, a phAct-FX expressziós plazmidból a Hindlll-Nael DNS-fragmentumot, amely a X faktor kódoló régiót a +1. pozíciótól a +116. pozícióig tartalmazza, a pVC19 Hindiil/Smal restrikciós hasítási helyére építettük be. A kapott plazmidot pVC/FX-nek neveztük el.

Ezáltal az 508-705. pozíciójú nukleotidokból álló X faktor szekvenciát (160-235. aminosav) könnyen el tudtuk távolítani a pVC/FX plazmidból, és ezt különböző mutáns X faktor DNS-fragmentummal tudtuk helyettesíteni. Ezek a DNS-fragmentumok azonosak a deletált vad típusú X faktor szekvenciával, kivéve a 691-705. pozíciókat (231-235. aminosav), amelyek új hasítási helyeket kódolnak.

A vad típusú X faktor szekvenciát a pVC/FX plazmidból Bsp120l és BstXI restrikciós hasításokon áttávolítottuk el. A BstXI helyen lévő 3’ túlnyúló véget mung bean nukleázzal (Biolab) távolítottuk el.

A mutált X faktor DNS-fragmentumokat PCR-rel állítottuk elő. Az 5'-primerek minden klónozáshoz azonosak voltak, és a 496-516. pozíciókból álló szekvenciát tartalmazták. A 3’-primerek egy X faktor komplementer szekvenciát tartalmaztak (676-690. pozíciók), és egy nem komplementer 5’ túlnyúló véget, amely egy új hasítási helyhez és egy restrikciós hasítási helyhez tartalmaz szekvenciákat. A felsokszorozott PCR-terméket végül a megfelelő restrikciós enzimmel (enzimekkel) még hasítottuk és az előkészített pVC/FX vektorba (lásd fentebb) klónoztuk.

Ezután a mutált X faktor DNS-fragmentumokat a pVC/FX plazmidokból Hindlll-Agel révén a phACt-FX vektorba klónoztuk át. A végső szerkezeteket a 2.1 és

2.2 ábra vázlatosan mutatja be. Referenciaszerkezetként a vad típusú X faktort adtuk meg. Az aminosavakat egybetűs kóddal jelöltük, és a mutált pozíciókat ezenkívül satíroztuk.

Egy Asp-Phe-Thr-Arg/Val FXIa hasítási hely előállításához 5’-primerként az 1001. számú oligonukleotidot (5-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3’) (3. számú szekvencia) és 3'-primerként az 1002. számú oligonukleotidot (5-ACCA GTT AAC CCT GGT GAA GTC GTT GTC GCC CCT CTC-3’) (4. számú szekvencia) használtuk. Ezzel a X faktor szekvenciában a 231., 232. és 235. pozícióban az Asn, Leu és He aminosavat Asp, Phe és Val aminosavval helyettesítettük. A PCR-fragmentumot Bst120l-gyel és Hpal-gyel hasítottuk (2A. ábra).

Egy Arg/Ser Flla hasítási hely előállításához 5’-primerként az 1001. számú oligonukleotidot (5’-ACCA TCG CGA CCT GGT CAG GTT GTT GTC-3’) (3. számú szekvencia) és 3’ primerként az 1003. számú oligonukleotidot (5-ACCA TCG CGA CCT GGT CAG GTT GTT GTC-3’) (5. számú szekvencia) használtuk. Ezzel a 235. pozícióban lévő He aminosavat Ser aminosawá mutagenizáltuk. A PCR-fragmentumot végül Bs120l-gyel és Nrul-gyel hasítottuk (2B. ábra).

Egy lle-Lys-Pro-Arg/lle FXIIa hasítási hely előállításához 5'-primerként az 1001. számú oligonukleotidot (5’-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3’) (3. számú szekvencia) és 3’-primerként az 1004. számú oligonukleotidot (5’-ACC AGA ATC GAT TCT GGG TTT GAT GTT GTC GCC CCCT CTC-3’) (6. számú szekvencia) használtuk. Ezzel az FX szekvencia 231., 232. és 233.

HU 225 246 Β1 pozíciójában az Asn, Leu és Thr aminosavat Ile, Lys és Pro aminosavra mutagenizáltuk. A PCR-fragmentumot végül Bst120l-gyel és Xmnl-gyel részlegesen hasítottuk (2C. ábra).

Egy Ser-Met-Thr-Arg/lle kallikrein hasítási hely előállításához 5'-primerként az 1001. számú oligonukleotidot (5’-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3') (3. számú szekvencia) és 3’-primerként az 1005. számú oligonukleotidot (5’-ACC AGA ATC GAT TCT GGT CAT GCT GTT GTC GCC CCT CTC-3’) (7. számú szekvencia) használtuk. Ezzel a X faktor szekvencia 231. és 232. pozíciójában az Asn és Leu aminosavat Ser és Met aminosavra mutagenizáltuk. A PCR-fragmentumot végül Bst120l-gyel és Xmnl-gyel részlegesen hasítottuk (2D. ábra).

Egy Pro-GIn-Gly-Arg/lle Fxa hasítási hely előállításához 5'-primerként az 1001. számú oligonukleotidot (5-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3’) (3. számú szekvencia) és 3’-primerként az 1016. számú oligonukleotidot (5’-ACC ABA ATC GAT TCT TCC TTG GGG GTT GTAC GCC CCT CTC-3') (8. számú szekvencia) használtuk. Ezzel az FX protein 231., 232. és 233. pozíciójában az Asn, Leu és Thr aminosavat Pro, Glu és Gly aminosavra mutagenizáltuk. A PCR-fragmentumot végül Bst120l-gyel és Xmnl-gyel részlegesen hasítottuk (2H. ábra).

Egy Met-Lys-Thr-Arg/lle FXa hasítási hely előállításához 3’-primerként az 1001. számú oligonukleotidot (5’-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3’) (3. számú szekvencia) és 3'-primerként az 1014. számú oligonukleotidot (5’-ACC AGA ATC GAT TCT CGT TTT CAT GTT GTC GCC CCT CTC-3) (9. számú szekvencia) használtuk. Ezzel az FX protein 231. és 232. pozíciójában az Asn és Leu aminosavat Met és Lys aminosavra mutagenizáltuk. A PCR-fragmentumot végül Bst120lgyel és Xmnl-gyel részleges hasítottuk (2E. ábra).

Egy lle-Glu-Gly-Arg/lle Fxa hasítási hely előállításához 5’-primerként az 1001. számú oligonukleotidot (5'-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3’) (3. számú szekvencia) és 3'-primerként az 1015. számú oligonukleotidot (5-ACC AGA ATC GAT TCT TCC CTC GAT GTT GTC GCC CCT CTC-3') (10. számú szekvencia) használtuk. Ezzel az FX protein 231-233. pozícióiban az Asn, Leu, Thr aminosavat Ile, Glu, Gly aminosavra mutagenizáltuk. A PCR-fragmentumot végül Bst120l-gyel és Xmnl-gyel részlegesen hasítottuk (2F. ábra).

Egy Arg-Arg-Lys-Arg/lle furin hasítási hely előállításához 5’-primerként az 1001. számú oligonukleotidot (5-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3’) (3. számú szekvencia) és 3'-primerként az 1006. számú oligonukleotidot (5’-ACC AGA ATC GAT TCT TTT CCT CCT GTT GTC GCC CCT CTC-3’) (11. számú szekvencia) használtuk. Ezáltal a 231-233. pozíciókban az Asn, Leu és Thr aminosavat Arg, Arg és Lys aminosavra mutagenizáltuk. A PCR-fragmentumot végül Bsp120l-gyel és Xmnl-gyel hasítottuk (2G. ábra).

Egy Arg-Val-Arg-Arg/lle furin hasítási hely előállításához 5’-primerként az 1001. számú oligonukleotidot (5’-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3’) (3. számú szekvencia) és 3’-primerként az 1007. számú oligonukleotidot (5-ACC AGA ATC GAT TCT CCT CAC CCT GTT GTC GCC CCT CTC-3’) (12. számú szekvencia) használtuk. Ezáltal a 231-233. pozíciókban az Asn, Leu és Thr aminosavat Arg, Val, Arg aminosavra mutagenizáltuk. A PCR-fragmentumot végül Bsp120l-gyel és Xmnl-gyel részlegesen hasítottuk (2G. ábra).

Egy Arg-Arg-Arg-Arg/lle furin hasítási hely előállításához 5’-primerként az 1001. számú oligonukleotidot (5’-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3’) (3. számú szekvencia) és 3’-primerként az 1008. számú oligonukleotidot (5’-ACC AGA ATC GAT TCT CCT CCT CCT GTT GTC GCC CCT CTC-3’) (13. számú szekvencia) használtuk. Ezáltal a 231-233. pozíciókban az Asn, Leu és Thr aminosavat Arg, Arg és Arg aminosavra mutagenizáltuk. A PCR-fragmentumot végül Bsp120lgyel és Xmnl-gyel részlegesen hasítottuk (2G. ábra).

Egy Arg-Pro-Lys-Arg/lle furin hasítási hely előállításához 5’-primerként az 1001. számú oligonukleotidot (5-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3’) (3. számú szekvencia) és 3’-primerként az 1009. számú oligonukleotidot (5-ACC AGA ATC GAT TCT TTT GGG CCT GTT GTC GCC CCT CTC-3') (14. számú szekvencia) használtunk. Ezáltal a 231-233. pozíciókban az Asn, Leu és Thr aminosavat Arg, Pro és Lys aminosavra mutagenizáltuk. A PCR-fragmentumot végül Bsp120lgyel és Xmnl-gyel részlegesen hasítottuk (2G. ábra).

Egy lle-Arg-Lys-Arg/lle furin hasítási hely előállításához 5’-primerként az 1001. számú oligonukleotidot (5-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3’) (3. számú szekvencia) és 3’-primerként az 1010. számú oligonukleotidot (5’-ACC AGA ATC GAT TCT TTT CCT GAT GTT GTC GCC CCT CTC-3’) (15. számú szekvencia) használtuk. Ezzel a 231-233. pozíciókban az Asn, Leu és Thr aminosavat Ile, Arg és Lys aminosavra mutagenizáltuk. A PCR-fragmentumot végül Bsp120l-gyel és Xmnl-gyel részlegesen hasítottuk (2G. ábra).

Egy Arg-Ser-Lys-Arg/lle furin hasítási hely előállításához 5’-primerként az 1001. számú oligonukleotidot (5-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3’) (3. számú szekvencia) és 3'-primerként az 1011. számú oligonukleotidot (5-ACC AGA ATC GAT TCT TTT GCT CCT GTT GTC GCC CCT CTC-3’) (16. számú szekvencia) használtuk. Ezáltal a 231-233. pozícióban az Asn, Leu és Thr aminosavat Arg, Ser és Lys aminosavvá mutagenizáltuk. A PCR-fragmentumot végül Bsp120l-gyel és Xmnl-gyel részlegesen hasítottuk (2G. ábra).

Egy Arg-Val-Thr-Arg/lle furin hasítási hely előállításához 5' primerként az 1001. számú oligonukleotidot (5-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3’) (3. számú szekvencia) és 3'-primerként az 1012. számú oligonukleotidot (5’-ACC AGA ATC GAT TCT GGT CAC CCT GTT GTC GCC CCT CTC-3') (17. számú szekvencia) használtuk. Ezáltal a 231. és 232. pozícióban az Asn és Leu aminosavat Arg és Val aminosavvá mutagenizáltuk. A PCR-fragmentumot végül Bsp120l-gyel és Xmnl-gyel részlegesen hasítottuk (2G. ábra).

Egy Arg-Leu-Lys-Arg/lle furin hasítási hely előállításához 3’-primerként az 1001. számú oligonukleotidot (5-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3’) (3. számú szekvencia) és 3’-primerként az 1013. számú oligonuk15

HU 225 246 Β1 leotidot (5-ACC AGA ATC GAT TCT TTT GAG CCT GTT GTC GCC CCT CTC-3’) (18. számú szekvencia) használtuk. Ezáltal a 231. és 233. pozícióban az Asn és Thr aminosavat Arg és Lys aminosavvá mutagenizáltuk. A PCR-fragmentumot végül Bsp120l-gyel és Xmnl-gyel részlegesen hasítottuk (2G. ábra).

Egy Thr-Ser-Thr-Arg/lle FXIIa hasítási hely előállításához 5’-primerként az 1001. számú oligonukleotidot (5-CCC ACA GGG CCC TAC CCC TGT-3’) (3. számú szekvencia) és 3’-primerként az 1017. számú oligonukleotidot (5-ACC AGA ATC GAT TCT CGT GCT CGT GTT GTC GCC CCT CTC-3’) (19. számú szekvencia) használtuk. Ezáltal az FX protein 231. és 232. pozícióiban az Asn és Leu aminosavat lle és Lys aminosavvá mutagenizáltuk. A PCR-fragmentumot végül Bst120lgyel és Xmnl-gyel részlegesen hasítottuk (2I. ábra).

6.2 Expressziós plazmidok szerkesztése FXp analógok előállításához

Ezeket a szerkezeteket a fent leírt X faktor analóg szerkezetekből vezettük le, amennyiben egy TGA stopkodont építettünk be a 470. pozícióba. Ennek érdekében cDNS-szinten a 457. pozíciótól a stopkodonig Spel-gyel és részleges BstEII-vel való emésztéssel eltávolítottuk az aminosavakat, és a következő oligonukleotidpárral helyettesítettük: 0003 (5’-GTC ACC GCC TTC CTC AAG TGG ATC GAC AGG TCC ATG AAA ACC AGG TGA A-3’) (20. számú szekvencia) és 0004 (5’-CTA GTT CAC CTG GTT TTC ATG GAC CTG TCG ATC CAC TTG AGG AAG GCG-3’) (21. számú szekvencia). A 7. ábrán vázlatosan mutatjuk be a Χβ faktor analóg szerkezeteket. Az ábra egyszerűsítése végett a Χβ faktor analógokat mint általános szerkezetet ábrázoltuk, amelyben a hasítási hely régióban lévő variábilis aminosavakat satírozott „X”-ként tüntettük fel.

6.3 Expressziós plazmidok szerkesztése FXa analógok előállításához

A X faktor aktiválásával, amely a nehéz lánc N-terminális végén lévő 4,5 kD tömegű aktiválási peptid lehasítása által történik, keletkezik a Xaa forma. Ez a forma ezután autoproteolitikus hatás révén és a nehéz lánc C-terminális végének, Arg 469 és Gly 470 közötti lehasadása révén Ρχθβ formává változik. A X faktor expressziós plazmidok előállításánál, amelyek a X faktor termelését célozzák, úgy járunk el, hogy a X faktorban, amely aktiválás után kizárólag mint FXAa forma fordul elő, intakt β-peptiddel az Arg469-et Lys-re mutagenizáljuk, hogy a nehéz lánc C-terminális szakaszában ne fordulhasson elő átalakulás.

Ennek érdekében a X faktor C-terminális aminosavszekvenciáját az 1363. pozíciótól a stopszignálig részleges BstEII-Spel emésztéssel eltávolítjuk, és két egymáshoz ligáit oligonukleotidpárral helyettesítjük. A 0005. számú oligonukleotidot (5’-GTC ACC GCC TTC CTC AAG TGG ATC GAC AGG TCC ATG AAA ACC AAG GGC TTG CCC AAG-3’) (22. számú szekvencia) és a 0006. számú oligonukleotidot (5’-TTG GCC TTG GGC AAG CCC TTG GTT TTC ATG GAC CTG TCG ATC CAC TTG AGG AAG GCG-3’) (23. számú szekvencia) a 0007. számú oligonukleotíddal (5’-GCC AAG AGC CAT GCC CCG GAG GTC ATA

ACG TCC TCT CCA TTA AAG TGA GAT CCC A-3’) (24. számú szekvencia) és a 0008. számú oligonukleotiddal (5’-CTA GTG GGA TCT CAC TTT AAT GGA GAG GAC GTT ATG ACC TCC GGG GCA TGG CTC-3’) (25. számú szekvencia) ligáljuk. Az Arg469 aminosav mutációját a 0005-0006 oligonukleotidpárral vezetjük be. A 7. ábra vázlatosan mutatja az FX analógokat.

7. példa

A X faktor N-terminális végek meghatározása és az rfurinnal és enélkül feldolgozott termékek A rekombináns X faktort, mint az 1. példában leírtuk, endogén furint tartalmazó CHO-sejtekben, illetve, mint az 5. példában leírtuk, furinhiányos sejtekben fejeztük ki. Az rX faktort a) előkezelés nélküli, b) további 12 órán át 37 °C-on inkubált és c) 12 órán át CHO-rfurin-felülúszóval előkezelt magas szinten kifejező CHO-rFX-klón felülúszóból, valamint d) előkezelés nélküli, e) 12 órán át 37 °C-on CHO-rfurin-felülúszóval előkezelt CHO-FD11-RFX-klón sejttenyészet-felülúszóból izoláltuk. A X faktor és az egyes reakcióelegyekben - a)-tól e)-ig - processzált termékek N-terminális aminosavait Edman-analízissel határoztuk meg. Az eredmények vázlatos bemutatása a 8. ábrán látható.

A magas szinten kifejező CHO-sejtekből kapott rX faktor érett nehéz és könnyű lánc formában, valamint egyláncú, részben még propeptidet tartalmazó formában jelenik meg. Ezen sejttenyészet-felülúszók 12 órán 37 °C-on való inkubálása (b) után, mint Wolf és munkatársai leírták [J. Bioi. Chem., 266, 13 726-13 730 (1991)], az rFX könnyű lánc további hibás N-terminális végekkel, 3 további aminosavval - Val38-Thr39-Arg40 lép fel. Ezeket a homályos eredetű (cryptic) végeket az előkezelés nélküli CHO-FD11-sejtekből (d) származó rFX anyag szekvenálásakor is megtaláltuk. Ez a megfigyelés azt mutatja, hogy ezeket a hibás N-terminális végeket el lehet kerülni, ha optimalizált körülményeket, illetve sejttenyésztési feltételeket, tárolási és tisztítási eljárásokat használunk a CHO-proteázok általi rFX-proteolízis minimalizálására.

A CHO-sejtekből származó tisztított anyaggal [a) és b)] ellentétben a nem szaporított, furinhiányos sejtekből származó rFX (d) csak feldolgozatlanul, egyláncú előmolekula formában fordul elő. Olyan N-terminális szekvenciák sem találhatók, amelyek a propeptidrésznek felelnek meg. Ezzel kimutattuk, hogy az egyláncú rFX előmolekulák könnyű/nehéz lánccá való feldolgozása a furinhiányos CHO-sejtekben (d) már nem történik meg, ami arra enged következtetni, hogy az endoproteáz furin ebben a feldolgozási lépésben in vivő központi szerepet tölt be.

Ezenkívül bemutattuk, hogy a propeptidtartalmú rFX molekulák feldolgozása a furinhiányos CHO-sejtekben is végbemegy, tehát a furin in vivő ebben a feldolgozási lépésben nem játszik lényeges szerepet. A CHO-sejtekből (c) és a CHO-FD11-sejtekből (e) származó rFX furin jelenlétében való inkubálása révén kizárólag korrekt N-terminális végű könnyű és nehéz láncokat kaptunk. Ezzel kimutattuk, hogy mind az egy16

HU 225 246 Β1 láncú FX előmolekulák, mind a propeptidtartalmú rFX molekulák in vitro feldolgozással homogén, érett X faktorrá alakíthatók. A furin jelenlétében processzált X faktor rendkívüli szerkezeti integritást és homogenitást mutat.

8. példa

Az Arg-Arg-Lys-Arg/lle hasítási helyet tartalmazó

FX analóg (rFX^RRKR/l) expressziója és vizsgálata

A rekombináns rFX^RRKR/5 protein előállításához az Arg-Arg-Lys-Arg/lle hasítási helyet tartalmazó, FX expressziós plazmiddal (lásd a 6.1 példát és a 2G. ábrát) és a pSV/dhfr szelekciós plazmiddal - mint az 1. példában leírtuk - CHO-sejteket kotranszfektáltunk. A sejttenyészet-felülúszó Western-blot-analízisével kimutattuk, hogy a rekombináns protein túlnyomórészt kétláncú formában fordul elő. A plazma FX-zel összehasonlítva a nehéz lánc a 46 kD helyen vándorol 50 kD helyett, ami feltehetően a rekombináns protein különböző glikozilációjának tudható be. Ezenkívül, mint már a vad típusú rFX expressziójánál megfigyeltük (1.b) példa), csekély mennyiségű előmolekula (SC), valamint a könnyű lánc LC4 izoforma látható. Az rFX analóg ezen molekulaformái mind az egyláncú FX előmolekula endogén proteázok által végzett feldolgozásának, mind a könnyű lánc γ-karboxilezettségének a limitált voltára is rámutatnak. Jóllehet az FX analógba bevitt hasítási hely egy furin-konszenzusszekvenciát képvisel, nem láthatóak olyan proteinsávok, amelyek a protein aktivált formáinak felelnek meg (35 kD, 31 kD). A hasítási hely területén lévő struktúrák, valamint a körülötte lévő aminosavszekvenciák ahhoz vezethettek, hogy a módosított aktiválási hely processzálása furin által csak szuboptimális körülmények között történhetett.

9. példa

Az rFX^RRKR/l protein in vitro aktiválása rfurinszármazékokkal

A rekombináns FX analóg rfurinnal való in vitro aktiválhatóságát α (35 kD) és β (31 kD) Fxa - amint azt a 2. példában a keverékkísérleteknél leírtuk - vizsgáltuk azzal a különbséggel, hogy tisztított rfurin Δ-Cys-space-10xHis rfurinszármazékot - leírását lásd a 0 775 750 európai szabadalmi bejelentésben - használtunk 150 mM nátrium-kloridot, 2 mM kalcium-kloridot és 0,2% BSA-t tartalmazó 10 mM HEPES-pufferben (pH 7,0) CHO rFX analóg felülúszó helyett. Az rfurin nélküli kontrolikísérletben a CHO-rFX analóg felülúszót 1:1 arányban kevertük a 150 mM NaCI-, 2 mM CaCI₂- és 0,2% BSA-tartalmú 10 mM HEPES- (pH 7,0) pufferrel. A reakcióelegyek részleteit a 6, 24, 48 és 72 órás (t=0, 6, 24, 48, 72) inkubációs idő 37 °C-on - előtt és után Western-blot-módszerrel rFX aktiválásra teszteltük (10. ábra). Míg az rFX^RRKR/l sávmintázata az rfurinszármazék nélkül még 72 órás inkubálás után is változatlan volt (10B. ábra), addig rfurin jelenlétében már 6 óra múlva egy 35 kD tömegű proteinsáv vált láthatóvá (10A. ábra, 5. nyomsáv), amely a plazmatikus FX α-formájának felel meg (10A. ábra, 9. nyomsáv). Az inkubáció folyamán ez az α-forma felszaporodik, és 72 órás inkubálás után (10A. ábra, 8. nyomsáv) a kiindulási anyag (HC) mintegy 50%-a az aktivált formává alakult át. A további 31 kD tömegű proteinsáv, amely 24 óra múlva vált felismerhetővé (10A. ábra, 6. nyomsáv), és amely az aktivált plazma FX β-formájának (10A. ábra, 9. nyomsáv) felel meg, azt mutatta, hogy a rekombináns FX analógból keletkező α-forma autoproteolitikus aktivitást fejt ki, és ekképpen működik.

Ezek az eredmények arra mutatnak, hogy az rFX analógban lévő heterológ Arg-Arg-Lys-Arg/lle aktivációs hasítási helyet az rfurinszármazék in vitro specifikusan felismeri és korrekt módon hasítja, tehát alkalmas az rFX analógnak a- és β-Fxa molekulává való aktiválására.

10. példa

Az in vitro aktivált rekombináns rFX^RRKR/l FX analóg működőképessége

A 9. példa szerinti kísérleti keverékek részleteit egy kromogén teszt használatával FXa aktivitásra teszteltük. A részletekhez S2337 kromogén szubsztrátumot (600 μΜ) - 150 mM nátrium-kloridot és 0,1% BSA-t tartalmazó 50 mM trisz-pufferben (pH 7,3) - adtunk. Három perc 37 °C-on való inkubálás után a reakciót 20%-os ecetsavval állítottuk le, majd az OD-értéket 405 nm-en mértük. Egy standardgörbével összehasonlítva - a görbét RVV-vel aktivált, tisztított plazma FXa-val vettük fel - a reakcióelegyekben meghatároztuk a rekombináns Fxa aktivitás mennyiségét. Ennek az analízisnek az eredményeit, a felhasznált antigénmennyiségeket (ELISA-értékek), valamint az ebből számított specifikus aktivitást a 2. táblázat mutatja be.

Annak érdekében, hogy az rfurinoldatban és a CHO-sejttenyészet-felülúszóban az aspecifikus amidolitikus aktivitásokat kizárjuk, nem transzfektált sejtek felülúszójának tisztított rfurinszármazékkal való keverékét FXa aktivitásra (CHO+rfurin) vizsgáltuk. Ebben a keverékben, ugyanúgy, mint az rFX analóg/puffer keverékben (rFX^RRKR/,/rfurin reakciónál), már 6 órás inkubáció után 56 mV rFXa aktivitás volt mérhető, amely az inkubáció folyamán fokozatosan nőtt, és 72 óra múlva elérte a 133 mU értéket. Jóllehet ebben az időpontban - Western-blot szerint - az rFX analógnak csak mintegy a fele változott át az aktivált a- és β-formává (10A. ábra, 8. nyomsáv), az in vitro aktivált rFX analóg anyag 190 mU/pg értékével messze magasabb specifikus aktivitást ért el, mint az RW-vel teljesen aktivált plazma FX (153 mU/pg). A mért aktivitásnövekedések az a- és β-formák Western-blotban való fellépésében tükröződnek vissza (10A. ábra, 5-8 nyomsávok).

Ezzel kimutattuk, hogy az FX-be be lehet építeni heterológ proteáz hasítási helyeket, amelyeket a megfelelő proteázok felismernek és hasítanak, és hogy magas értékű rFXa (vagy adott esetben rFXa aktivitású rFXa analógok) állítható elő működőképes formában, rekombináns technikával.

HU 225 246 Β1

2. táblázat

	Inkubáció (óra)	Aktivitás (mU/ml)	Antigénmennyiség (pg/ml)	Specifikus aktivitás (mU/pg)
rFX^RRKR/l+puffer	0	<25	0,7	0
	6	<25	0,7	0
	24	<25	0,7	0
	48	<25	0,7	0
	72	<25	0,7	0
rFX^RRKR/l+rfurin	0	<25	0,7	0
	6	56	0,7	80
	24	101	0,7	144
	48	124	0,7	177
	72	133	0,7	190
CHO+rfurin	0	<25	0
	6	<25	0
	24	<25	0
	48	<25	0
	72	<25	0
RW aktivált plazma FX		614	4	153

11. példa

Asp-Phe-Thr-Arg/Val FXIa hasítási helyet tartalmazó rFX analóg (rFX^DFTR/v) in vitro aktiválása plazmatikus FXIa-val

Az FX aktiválási szekvencia FXIa hasítási helyként viselkedő szekvenciává mutagenizálásával előállítottunk egy FX analóg szerkezetet. Ezután stabil CHO-sejtklónokat készítettünk, amelyek ezeket a molekulákat kifejezik. Az rFX^DFTFW-t tartalmazó CHO-sejttenyészet-felülúszót 150 mM nátrium-kloridot, 8 mM kalcium-kloridot, PCPS-t és 0,1% BSA-t tartalmazó 10 mM trisz-puffer (pH 7,3) jelenlétében, tisztított plazmatikus FXIa-val (100 (pg/ml) kevertük össze, és a keveréket 37 °C-on különböző ideig inkubáltuk. Negatív kontrollként a sejttenyészet-felülúszót csak BSA-tartalmú pufferrel inkubáltuk. Az rFX^DITR/v proteint és a kapott aktiválási termékeket Western-blot-analízissel vizsgáltuk (11. ábra). Mint az inkubáció előtti (t=0) FXIa nélküli keverékben felismerhető, a rekombináns protein (11. ábra, 5, nyomsáv) a plazmatikus FX-hez (2. nyomsáv) majdnem azonos módon, kétláncú formában szekretálódik, azzal a különbséggel, hogy a nehéz láncnak (HC), mint ezt már az rFX^RRKR-nél a 8. példából is megfigyelhettük, 50 kD-nál valamivel kisebb a molekulatömege. Ennek a keveréknek a sávmintázatában 37 °C-on való inkubálás alatt (11. ábra, 6. nyomsáv) semmiféle lényeges változás nem volt látható. A CHO-rFX/rFXIa keverékben, már röviddel a tisztított FXIa hozzáadása után, de a sejttenyészet-felülúszó tulajdonképpeni inkubálása előtt (11. ábra, 3. nyomsáv) 35 kD és 31 kD proteinsávok ismerhetők fel, amelyek a plazmatikus nehéz lánc a- és β-formák nagyságának (11. ábra, 9. nyomsáv) felelnek meg. Ez a két forma 4 órás FXIa-val való inkubálás után erősen megnő (11. ábra, 4. nyomsáv).

Kimutattuk tehát, hogy egy olyan FX analógot, amely egy véralvadási kaszkádban lévő aktív proteolitikus enzim számára megfelelő heterológ proteáz hasítási helyet hordoz, ez az enzim is eredményesen képes hasítani.

Ezenkívül az τΡΧβ sáv megjelenése - amely az rFXaa analóg autoproteolitikus aktivitásának eredménye - eredményesen mutatta a keletkezett rFXaa analóg funkcionális aktivitását.

SZEKVENCIAPROTOKOLL (2) AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 34 bázispár (B) TÍPUS: nukleotid (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genom) (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATTACTCGAG AAGCTTACCA TGGGGCGCCC ACTG 34

HU 225 246 Β1 (2) A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 24 bázispár (B) TÍPUS: nukleotid (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATiPUS: DNS (genom) (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATTACAATTG CTGCAGGGAT CCAC (2) A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleotid (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genom) (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CCCACAGGGC CCTACCCCTG T (2) A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 37 bázispár (B) TÍPUS: nukleotid (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genom) (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ACCAGTTAAC CCTGGTGAAG TCGTTGTCGC CCCTCTC (2) AZ 5. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 28 bázispár (B) TÍPUS: nukleotid (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genom) (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ACCATCGCGA CCTGGTCAGG TTGTTGTC (2) A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 39 bázispár (B) TÍPUS: nukleotid (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genom) (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ACCAGAATCG ATTCTGGGTT TGATGTTGTC GCCCCTCTC (2) A 7. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

ACCAGAATCG ATTCTGGTCA TGCTGTTGTC GCCCCTCTC

HU 225 246 Β1 (2) A 8. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

ACCAGAATCG ATTCTTCCTT GGGGGTTGTC GCCCCTCTC 39 (2) A 9. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

ACCAGAATCG ATTCTCGTTT TCATGTTGTC GCCCCTCTC 39 (2) A 10. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

ACCAGAATCG ATTCTTCCCT CGATGTTGTC GCCCCTCTC 39 (2) A 11. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

ACCAGAATCG ATTCTTTTCC TCCTGTTGTC GCCCCTCTC 39 (2) A 12. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

ACCAGAATCG ATTCTCCTCA CCCTGTTGTC GCCCCTCTC 39 (2) A 13. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

ACCAGAATCG ATTCTCCTCC TCCTGTTGTC GCCCCTCTC 39

HU 225 246 Β1 (2) A 14. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

ACCAGAATCG ATTCTTTTGG GCCTGTTGTC GCCCCTCTC 39 (2) A 15. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

ACCAGAATCG ATTCTTTTCC TGATGTTGTC GCCCCTCTC 39 (2) A 16. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

ACCAGAATCG ATTCTTTTGC TCCTGTTGTC GCCCCTCTC 39 (2) A 17. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

ACCAGAATCG ATTCTGGTCA CCCTGTTGTC GCCCCTCTC 39 (2) A 18. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

ACCAGAATCG ATTCTTTTGA GCCTGTTGTC GCCCCTCTC 39 (2) A 19. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

ACCAGAATCG ATTCTCGTGC TCGTGTTGTC GCCCCTCTC 39

HU 225 246 Β1 (2) A 20. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 49 bázispár (B) TÍPUS: nukleotid (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genom) (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GTCACCGCCT TCCTCAAGTG GATCGACAGG TCCATGAAAA CCAGGTGAA 49 (2) A 21. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 48 bázispár (B) TÍPUS: nukleotid (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genom) (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CTAGTTCACC TGGTTTTCAT GGACCTGTCG ATCCACTTGA GGAAGGCG 48 (2) A 22. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 57 bázispár (B) TÍPUS: nukleotid (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genom) (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GTCACCGCCT TCCTCAAGTG GATCGACAGG TCCATGAAAA CCAAGGGCTT GCCCAAG 57 (2) A 23. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

TTGGCCTTGG GCAAGCCCTT GGTTTTCATG GACCTGTCGA TCCACTTGAG GAAGGCG 57 (2) A 24. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 55 bázispár (B) TÍPUS: nukleotid (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genom) (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GCCAAGAGCC ATGCCCCGGA GGTCATAACG TCCTCTCCAT TAAAGTGAGA TCCCA 55 (2) A 25. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 54 bázispár (B) TÍPUS: nukleotid (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genom) (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CTAGTGGGAT CTCACTTTAA TGGAGAGGAC GTTATGACCT CCGGGGCATG GCTC 54

HU 225 246 Β1 (2) A 26. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 1467 bázispár (B) TÍPUS: nukleotid (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genom) (ix) JELLEMZŐ:

(A) NÉV/KULCS: CDS (B) ELHELYEZKEDÉS: 1...1467 (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATG Met 1

GGG Gly

CGC Arg

CCA Pro

CTG Leu 5

CAC His

CTC Leu

GTC Val

CTG Leu

CTC Leu 10

AGT Ser

GCC Alá

TCC Ser

CTG Leu

GCT Alá 15

GGC Gly

48

CTC

CTG

CTC

GGG

GAA

AGT

CTG

TTC

ATC

CGC

AGG

GAG

CAG

GCC

AAC

96

Leu

Gly

Glu

Ser

Leu

Phe

Ile

Arg

Glu

Gin

Alá

Asn

20

25

30

AAC

ATC

CTG

GCG

AGG

GTC

ACG

AGG

GCC

AAT

TCC

TTT

CTT

GAA

GAG

ATG

144

Asn

Ile

Leu

Alá

Arg

Val

Thr

Arg

Alá

Asn

Ser

Phe

Leu

Glu

Met

35

40

45

AAG

AAA

GGA

CAC

CTC

GAA

AGA

GAG

TGC

ATG

GAA

GAG

ACC

TGC

TCA

TAC

192

Lys

Gly

His

Leu

Glu

Arg

Glu

Cys

Met

Glu

Thr

Cys

Ser

Tyr

50

55

60

GAA

GAG

GCC

CGC

GAG

GTC

TTT

GAG

GAC

AGC

GAC

AAG

ACG

AAT

GAA

TTC

240

Glu

Alá

Arg

Glu

Val

Phe

Glu

Asp

Ser

Asp

Lys

Thr

Asn

Glu

Phe

65

70

75

80

TGG

AAT

AAA

TAC

AAA

GAT

GGC

GAC

CAG

TGT

GAG

ACC

AGT

CCT

TGC

CAG

288

Trp

Asn

Lys

Tyr

Lys

Asp

Gly

Asp

Gin

Cys

Glu

Thr

Ser

Pro

Cys

Gin

85

90

95

AAC

CAG

GGC

AAA

TGT

AAA

GAC

GGC

CTC

GGG

GAA

TAC

ACC

TGC

ACC

TGT

336

Asn

Gin

Gly

Lys

Cys

Lys

Asp

Gly

Leu

Gly

Glu

Tyr

Thr

Cys

Thr

Cys

100

105

110

TTA

GAA

GGA

TTC

GAA

GGC

AAA

AAC

TGT

GAA

TTA

TTC

ACA

CGG

AAG

CTC

384

Leu

Glu

Gly

Phe

Glu

Gly

Lys

Asn

Cys

Glu

Leu

Phe

Thr

Arg

Lys

Leu

115

120

125

TGC

AGC

CTG

GAC

AAC

GGG

GAC

TGT

GAC

CAG

TTC

TGC

CAC

GAG

GAA

CAG

432

Cys

Ser

Leu

Asp

Asn

Gly

Asp

Cys

Asp

Gin

Phe

Cys

His

Glu

Gin

130

135

140

AAC

TCT

GTG

TGC

TCC

TGC

GCC

CGC

GGG

TAC

ACC

CTG

GCT

GAC

AAC

480

Asn

Ser

Val

Cys

Ser

Cys

Alá

Arg

Gly

Tyr

Thr

Leu

Alá

Asp

Asn

145

150

155

160

GGC

AAG

GCC

TGC

ATT

CCC

ACA

GGG

CCC

TAC

CCC

TGT

GGG

AAA

CAG

ACC

528

Gly

Lys

Alá

Cys

Ile

Pro

Thr

Gly

Pro

Tyr

Pro

Cys

Gly

Lys

Gin

Thr

165

170

175

CTG

GAA

CGC

AGG

AAG

AGG

TCA

GTG

GCC

CAG

GCC

ACC

AGC

GGG

576

Leu

Glu

Arg

Lys

Arg

Ser

Val

Alá

Gin

Alá

Thr

Ser

Gly

180

185

190

HU 225 246 Β1

GAG Glu

GCC Alá

CCT Pro 195

GAC Asp

AGC Ser

ATC Ile

ACA Thr

TGG Trp 200

AAG Lys

CCA Pro

TAT Tyr

GAT Asp

GCA Alá 205

GCC Alá

GAC Asp

CTG Leu

624

GAC

CCC

ACC

GAG

AAC

CCC

TTC

GAC

CTG

CTT

GAC

TTC

AAC

CAG

ACG

CAG

672

Asp

Pro

Thr

Glu

Asn

Pro

Phe

Asp

Leu

Asp

Phe

Asn

Gin

Thr

Gin

210

215

220

CCT

GAG

AGG

GGC

GAC

AAC

CTC

ACC

AGG

ATC

GTG

GGA

GGC

CAG

GAA

720

Pro

Glu

Arg

Gly

Asp

Asn

Leu

Thr

Arg

Ile

Val

Gly

Gin

Glu

225

230

235

240

TGC

AAG

GAC

GGG

GAG

TGT

CCC

TGG

CAG

GCC

CTG

CTC

ATC

AAT

GAG

GAA

768

Cys

Lys

Asp

Gly

Glu

Cys

Pro

Trp

Gin

Alá

Leu

Ile

Asn

Glu

245

250

255

AAC

GAG

GGT

TTC

TGT

GGT

GGA

ACT

ATT

CTG

AGC

GAG

TTC

TAC

ATC

CTA

816

Asn

Glu

Gly

Phe

Cys

Gly

Thr

Ile

Leu

Ser

Glu

Phe

Tyr

Ile

Leu

260

265

270

ACG

GCA

GCC

CAC

TGT

CTC

TAC

CAA

GCC

AAG

AGA

TTC

AAG

GTG

AGG

GTA

864

Thr

Alá

His

Cys

Leu

Tyr

Gin

Alá

Lys

Arg

Phe

Lys

Val

Arg

Val

275

280

285

GGG

GAC

CGG

AAC

ACG

GAG

CAG

GAG

GGC

GGT

GAG

GCG

GTG

CAC

GAG

912

Gly

Asp

Arg

Asn

Thr

Glu

Gin

Glu

Gly

Glu

Alá

Val

His

Glu

290

295

300

GTG

GAG

GTG

GTC

ATC

AAG

CAC

AAC

CGG

TTC

ACA

AAG

GAG

ACC

TAT

GAC

960

Val

Glu

Val

Ile

Lys

His

Asn

Arg

Phe

Thr

Lys

Glu

Thr

Tyr

Asp

305

310

315

320

TTC

GAC

ATC

GCC

GTG

CTC

CGG

CTC

AAG

ACC

CCC

ATC

ACC

TTC

CGC

ATG

1008

Phe

Asp

Ile

Alá

Val

Leu

Arg

Leu

Lys

Thr

Pro

Ile

Thr

Phe

Arg

Met

325

330

335

AAC

GTG

GCG

CCT

GCC

TGC

CTC

CCC

GAG

CGT

GAC

TGG

GCC

GAG

TCC

ACG

1056

Asn

Val

Alá

Pro

Alá

Cys

Leu

Pro

Glu

Arg

Asp

Trp

Alá

Glu

Ser

Thr

340

345

350

CTG

ATG

ACG

CAG

AAG

ACG

GGG

ATT

GTG

AGC

GGC

TTC

GGG

CGC

ACC

CAC

1104

Leu

Met

Thr

Gin

Lys

Thr

Gly

Ile

Val

Ser

Gly

Phe

Gly

Arg

Thr

His

355

360

365

GAG

AAG

GGC

CGG

CAG

TCC

ACC

AGG

CTC

AAG

ATG

CTG

GAG

GTG

CCC

TAC

1152

Glu

Lys

Gly

Arg

Gin

Ser

Thr

Arg

Leu

Lys

Met

Leu

Glu

Val

Pro

Tyr

370

375

380

GTG

GAC

CGC

AAC

AGC

TGC

AAG

CTG

TCC

AGC

TTC

ATC

ACC

CAG

1200

Val

Asp

Arg

Asn

Ser

Cys

Lys

Leu

Ser

Phe

Ile

Thr

Gin

385

390

395

400

AAC

ATG

TTC

TGT

GCC

GGC

TAC

GAC

ACC

AAG

CAG

GAG

GAT

GCC

TGC

CAG

1248

Asn

Met

Phe

Cys

Alá

Gly

Tyr

Asp

Thr

Lys

Gin

Glu

Asp

Alá

Cys

Gin

405

410

415

GGG

GAC

AGC

GGG

GGC

CCG

CAC

GTC

ACC

CGC

TTC

AAG

GAC

ACC

TAC

TTC

1296

Gly

Asp

Ser

Gly

Pro

His

Val

Thr

Arg

Phe

Lys

Asp

Thr

Tyr

Phe

420

425

430

HU 225 246 Β1

GTG Val

ACA Thr

GGC Gly 435

ATC Ile

GTC Val

AGC Ser

TGG Trp

GGA Gly 440

GAG Glu

AGC Ser

TGT Cys

GCC Alá

CGT Arg 445

AAG Lys

GGG Gly

AAG Lys

TAC

GGG

ATC

TAC

ACC

AAG

GTC

ACC

GCC

TTC

CTC

AAG

TGG

ATC

GAC

AGG

Tyr

Gly

Ile

Tyr

Thr

Lys

Val

Thr

Alá

Phe

Leu

Lys

Trp

Ile

Asp

Arg

450

455

460

TCC

ATG

AAA

ACC

AGG

GGC

TTG

CCC

AAG

GCC

AAG

AGC

CAT

GCC

CCG

GAG

Ser

Met

Lys

Thr

Arg

Gly

Leu

Pro

Lys

Alá

Lys

Ser

His

Alá

Pro

Glu

465

470

475

480

GTC

ATA

ACG

TCC

TCT

CCA

TTA

AAG

TGA

Val

Ile

Thr

Ser

Pro

Leu

Lys

★

485 (2) A 27. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: (A) HOSSZÚSÁG: 489 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: protein

Val

Leu

Leu 10

Ser

Alá

Ser

Leu

Alá 15

Gly

(xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Leu

Met 1

Gly

Arg

Pro

Leu 5

His

Leu

Gly

Glu

Ser

Leu

Phe

Ile

Arg

Glu

Gin

Alá

Asn

20

25

30

Asn

Ile

Leu

Alá

Arg

Val

Thr

Arg

Alá

Asn

Ser

Phe

Leu

Glu

Met

35

40

45

Lys

Gly

His

Leu

Glu

Arg

Glu

Cys

Met

Glu

Thr

Cys

Ser

Tyr

50

55

60

Glu

Alá

Arg

Glu

Val

Phe

Glu

Asp

Ser

Asp

Lys

Thr

Asn

Glu

Phe

65

70

75

80

Trp

Asn

Lys

Tyr

Lys

Asp

Gly

Asp

Gin

Cys

Glu

Thr

Ser

Pro

Cys

Gin

85

90

95

Asn

Gin

Gly

Lys

Cys

Lys

Asp

Gly

Leu

Gly

Glu

Tyr

Thr

Cys

Thr

Cys

100

105

110

Leu

Glu

Gly

Phe

Glu

Gly

Lys

Asn

Cys

Glu

Leu

Phe

Thr

Arg

Lys

Leu

115

120

125

Cys

Ser

Leu

Asp

Asn

Gly

Asp

Cys

Asp

Gin

Phe

Cys

His

Glu

Gin

130

135

140

Asn

Ser

Val

Cys

Ser

Cys

Alá

Arg

Gly

Tyr

Thr

Leu

Alá

Asp

Asn

145

150

155

160

Gly

Lys

Alá

Cys

Ile

Pro

Thr

Gly

Pro

Tyr

Pro

Cys

Gly

Lys

Gin

Thr

165

170

175

Leu

Glu

Arg

Lys

Arg

Ser

Val

Alá

Gin

Alá

Thr

Ser

Gly

180

185

190

HU 225 246 Β1

Glu Alá Pro Asp Ser 195

Asp Pro Thr Glu Asn 210

Pro Glu Arg Gly Asp 225

Cys Lys Asp Gly Glu 245

Asn Glu Gly Phe Cys 260

Thr Alá Alá His Cys 275

Gly Asp Arg Asn Thr 290

Val Glu Val Val Ile 305

Phe Asp Ile Alá Val 325

Asn Val Alá Pro Alá 340

Leu Met Thr Gin Lys 355

Glu Lys Gly Arg Gin 370

Val Asp Arg Asn Ser 385

Asn Met Phe Cys Alá 405

Gly Asp Ser Gly Gly 420

Val Thr Gly Ile Val 435

Tyr Gly Ile Tyr Thr 450

Ser Met Lys Thr Arg 465

Val Ile Thr Ser Ser 485

Ile Thr Trp Lys Pro Tyr 200

Pro Phe Asp Leu Leu Asp 215

Asn Asn Leu Thr Arg Ile 230 235

Cys Pro Trp Gin Alá Leu 250

Gly Gly Thr Ile Leu Ser 265

Leu Tyr Gin Alá Lys Arg 280

Glu Gin Glu Glu Gly Gly 295

Lys His Asn Arg Phe Thr 310 315

Leu Arg Leu Lys Thr Pro 330

Cys Leu Pro Glu Arg Asp 345

Thr Gly Ile Val Ser Gly 360

Ser Thr Arg Leu Lys Met 375

Cys Lys Leu Ser Ser Ser 390 395

Gly Tyr Asp Thr Lys Gin 410

Pro His Val Thr Arg Phe 425

Ser Trp Gly Glu Ser Cys 440

Lys Val Thr Alá Phe Leu 455

Gly Leu Pro Lys Alá Lys 470 475

Pro Leu Lys *

Asp Alá Alá Asp Leu 205

Phe Asn Gin Thr Gin 220

Val Gly Gly Gin Glu 240

Leu Ile Asn Glu Glu 255

Glu Phe Tyr Ile Leu 270

Phe Lys Val Arg Val 285

Glu Alá Val His Glu 300

Lys Glu Thr Tyr Asp 320

Ile Thr Phe Arg Met 335

Trp Alá Glu Ser Thr 350

Phe Gly Arg Thr His 365

Leu Glu Val Pro Tyr 380

Phe Ile Ile Thr Gin 400

Glu Asp Alá Cys Gin 415

Lys Asp Thr Tyr Phe 430

Alá Arg Lys Gly Lys 445

Lys Trp Ile Asp Arg 460

Ser His Alá Pro Glu 480

HU 225 246 Β1

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims

1. X faktor analóg, azzal jellemezve, hogy a természetben előforduló Xa aktiválási hasítási hely szakaszában módosítást tartalmaz, az analóg tartalmaz egy Gly228-R6-R5-R4-R3-R2-Arg234-R1 X faktor szekvenciát, ahol az aminosavszámozás az 1. ábra szerinti, és ahol

a) R1 olyan aminosav, amelyet az lle, Val, Ser, Thr vagy Alá közül választunk ki,

b) R2 olyan aminosav, amelyet a Pro, Gly, Lys vagy Arg közül választunk ki,

d) R4 olyan aminosav, amelyet az Asp, lle, Ser, Met, Pro, Thr, Arg vagy Lys közül választunk ki,

2. Az 1. igénypont szerinti X faktor analóg, azzal jellemezve, hogy a módosítás legalább egy aminosavat érint az aktiválási peptid aminosavszekvenciáján belül.

3. Az 1. vagy a 2. igénypont szerinti X faktor analóg, azzal jellemezve, hogy a módosítás a Gly228 és Arg234 között legalább egy aminosav és adott esetben az Ile235 cseréjét jelenti, ahol az aminosavszámozás az 1. ábra szerinti.

4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti X faktor analóg, azzal jellemezve, hogy a módosítás egy olyan proteáz számára jelent hasítási helyet, amelyet az endoproteázok, például a kexin/kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, a szerinproteázok, például a lla faktor, Xlla faktor, Xla faktor, Xa faktor, vagy a kallikrein közül, vagy ezen proteázok származékai közül választunk ki.

5. Az 1—4. igénypontok bármelyike szerinti X faktor analóg, azzal jellemezve, hogy további módosítást tartalmaz a X faktor aminosavszekvencia C-terminális szakaszában.

6. Az 5. igénypont szerinti X faktor analóg, azzal jellemezve, hogy módosítást tartalmaz a β-peptid hasítási hely C-terminális szakaszában.

7. A 6. igénypont szerinti X faktor analóg, azzal jellemezve, hogy a módosítás egy mutációt, deléciót vagy inszerciót jelent a X faktor aminosavszekvenciában az Arg469 és Ser476 aminosavpozíciók közötti szakaszban.

8. Az 5-7. igénypontok bármelyike szerinti X faktor analóg, azzal jellemezve, hogy a módosítás meggátolja a β-peptid lehasítását.

9. Az 5. igénypont szerinti X faktor analóg, azzal jellemezve, hogy a X faktor β-peptid deletált.

10. Az 5. igénypont szerinti X faktor analóg, azzal jellemezve, hogy a X faktor szekvencia C-terminális szakaszában transzlációs stopszignált tartalmaz.

11. A 10. igénypont szerinti X faktor analóg, azzal jellemezve, hogy a X faktor szekvenciában a 470. pozíciójú aminosavnál transzlációs stopszignált tartalmaz.

12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti X faktor analóg, azzal jellemezve, hogy az aktiválási peptid szakaszban végrehajtott módosítás lehetővé teszi a X faktor analóg natív Xa faktorrá, illetve Xa faktor analóggá történő in vitro aktiválását.

13. A 12. igénypont szerinti X faktor analóg, azzal jellemezve, hogy a módosítás egy proteáz által történő aktiválást tesz lehetővé, a proteázt az endoproteázok, például a kexin/kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, a szerinproteázok, például a lla faktor, Xlla faktor, Xla faktor, Xa faktor, vagy a kallikrein közül, vagy ezen proteázok származékai közül választjuk.

14. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti X faktor analóg, azzal jellemezve, hogy a módosítás lehetővé teszi a X faktor analóg natív Xa faktorrá, illetve Xa faktor analóggá történő in vivő aktiválását.

15. A 14. igénypont szerinti X faktor analóg, azzal jellemezve, hogy a módosítás egy proteáz által végzett aktiválást tesz lehetővé, a proteázt szerinproteázok, például Xlla faktor, Xla faktor, lla faktor, Xa faktor, vagy a kallikrein közül választjuk ki.

16. Az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti X faktor analóg, azzal jellemezve, hogy intakt β-peptidet tartalmazó X faktor analóg vagy C-terminális végén megrövidített X faktor analóg.

17. Az 1-16. igénypontok bármelyike szerinti X faktor analóg, azzal jellemezve, hogy egyláncú molekula.

18. Az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti X faktor analógot kódoló DNS, amelyet a kódolt protein rekombináns expressziójához alkalmas vektor tartalmaz.

19. Tisztított X faktor analógot vagy ennek egy előproteinjét tartalmazó készítmény, amelyben az analóg vagy előprotein a természetben előforduló X faktor aktiválási hely szakaszában olyan módosítást tartalmaz, amely a X faktor szekvencia ezen szakaszában természetszerűen nem hasító proteáz számára hoz létre hasítási helyet, az analóg tartalmaz egy Gly228-R6R5-R4-R3-R2-Arg234-R1 X faktor szekvenciát, ahol az aminosavszámozás az 1. ábra szerinti, és ahol

b) R2 olyan aminosav, amelyet a Pro, Gly, Lys vagy Arg közül választunk ki,

20. A 19. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a módosítás olyan proteáz számára hoz létre hasítási helyet, amelyet a kétbázisú endoproteázok, például a kexin/kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, a szerinproteázok, például a

HU 225 246 Β1

Ha faktor, Xlla faktor, Xla faktor, Xa faktor, vagy a kallikrein közül választunk ki.

21. A 19. vagy 20. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a X faktor analóg Xa faktor analóg.

22. A 19. vagy 20. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a X faktor analóg C-terminális végén megrövidített X faktor analóg.

23. A 19-22. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a X faktor analógot mint egyláncú molekulát, izolált formában tartalmazza.

24. A 19-23. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy egyláncú X faktor analógot tartalmaz enzimatikusan inaktív formában, legalább 80%-os, előnyösen 90%-os, különösen előnyösen 95%-os tisztaságban, és nem tartalmaz X/Xa faktor proteolitikus köztitermékeket.

25. A 19-24. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a X faktor analógot mint kétláncú molekulát, izolált formában tartalmazza.

26. A 19-25. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy olyan módosítással rendelkező X faktor analógot tartalmaz, amely lehetővé teszi a X faktor analóg natív Xa faktorrá, illetve Xa faktor analóggá történő in vitro aktiválását.

27. A 19-26. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy gyógyszerkészítménnyé formuláit.

28. A 19-27. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy megfelelő eszközben, előnyösen alkalmazásra szolgáló eszközben van, egy olyan proteázzal kombinálva, amelyet az endoproteázok, például a kexin/kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, a szerinproteázok, például a Xlla faktor, Xla faktor, Xa faktor, Ha faktor, vagy a kallikrein közül, vagy ezen proteázok származékai közül választunk ki.

29. A 28. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az alkotórészek térben el vannak egymástól választva.

30. A 19-25. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy olyan módosítással rendelkező X faktor analógot tartalmaz, amely lehetővé teszi a X faktor analóg natív Xa faktorrá, illetve Xa faktor analóggá történő in vivő aktiválását.

31. Xa faktor analógot tartalmazó készítmény, amely különösképpen mentes inaktív X/Xa faktor analóg köztitermékektől és autoproteolitikus X faktor lebontási termékektől, és amely előállítható az 1-18. igénypontok bármelyike szerinti X faktor analóg aktiválásával.

32. A 19-31. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy fiziológiailag elfogadható hordozót tartalmaz, és stabilan tárolható.

33. A 19-32. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy adott esetben további alkotórészként véralvadási faktort tartalmaz, vagy egy véralvadási faktor aktivált formáját tartalmazza.

34. A 33. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy további alkotórészként legalább egy Vili faktor bypass aktivitású komponenst tartalmaz.

35. A 19-34. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy gyógyszerkészítménnyé formuláit és adott esetben többkomponensű.

36. A 19-35. igénypontok bármelyike szerinti készítmény alkalmazása gyógyszer előállítására.

37. A 18. igénypont szerinti nukleinsav alkalmazása gyógyszer előállítására.

38. Eljárás tisztított rekombináns X faktor analógot tartalmazó készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti, rekombináns technikával előállított X faktor analógot izolálunk, majd kromatográfiás eljárással tisztítjuk.

39. A 38. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tartalmazza a következő lépéseket:

- előállítunk egy 18. igénypont szerinti nukleinsavat,

- megfelelő sejteket transzformálunk,

- kifejezzük a X faktor analógot,

- adott esetben egy proteázzal inkubáljuk a X faktor analógot,

- izoláljuk a X faktor analógot, és

- a X faktor analógot kromatográfiás eljárással tisztítjuk.

40. A 39. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a X faktor analógot mint kétláncú molekulát izoláljuk.

41. A 38-40. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kétláncú X faktor analógot egy proteázzal hozzuk érintkezésbe, amelyet az endoproteázok, például a kexin/kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, a szerinproteázok, például a Ha faktor, Xlla faktor, Xla faktor, Xa faktor, vagy a kallikrein közül, vagy ezen proteázok származékai közül választunk ki, az érintkeztetést olyan körülmények mellett végezzük, amelyeknél a X faktor analógot natív Xa faktorrá vagy egy Xa faktor analóggá hasítjuk.

42. A 41. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan sejtet használunk, amely nem fejez ki olyan proteázt, amely az egyláncú molekulát a X faktor, illetve egy X faktor analóg könnyű és nehéz láncává hasítja, és a sejt adott esetben proteázhiányos.

43. A 42. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtek nem fejeznek ki endoproteázt, például kexint, furint, PACE-t vagy ennek származékát.

44. A 42. vagy 43. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a X faktor analógot mint egyláncú molekulát izoláljuk.

45. A 44. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az egyláncú, adott esetben izolált X faktor analógot egy, az endoproteázok közül, például a kexin/kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE 4, LPC/PC7, vagy az endoproteázok származékai közül választott proteázzal hozzuk érintkezésbe, olyan körülmények között, amelyek mellett az egyláncú X faktor analógot kétláncú X faktor formává hasítjuk.

46. A 45. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy egyláncú X faktor analógot, adott esetben a proteázzal való érintkeztetéssel, közvetlenül Xa faktorrá vagy Xa faktor analóggá aktiválunk.

HU 225 246 Β1

49. Eljárás aktív Xa faktort, illetve Xa faktor analógot tartalmazó készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a 38-45. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított X faktor analógot egy aktiválási lépésnek vetünk alá.

47. A 45. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kétláncú X faktor analógot egy, az elsőtől eltérő proteázzal hozzuk érintkezésbe, és Xa faktor analóggá vagy natív Xa faktorrá aktiváljuk.

48. A 38-47. igénypontok bármelyike szerinti eljá- 5 rás, azzal jellemezve, hogy a proteáz immobilizált.

HU 225 246 Β1

Int. Cl.: C12N9/64 (-40,

Met Gly Arg Pro Leu CTG His Leu Val Leu Leu Ser Alá Ser Leu Alá Gly Leu Leu Leu ATG GGG CGC 9 CCA CAC 18 CTC GTC CTG 27 CTC AGT GCC 36 TCC CTG GCT GGC CTC CTG CTG 45 54 (-4) (-D 40 Leu Gly Glu Ser Leu Phe He Arg Arg Glu Gin Alá Asn Asn Xle Leu Alá Arg Val Thr Arg CTC GGG GAA AGT CTG TTC ATC CGC AGG GAG CAG GCC AAC AAC ATC CTG GCG AGG GTC ACG AGG 66 75 84 93 102 111 120

(+1)

41 Alá Asn Ser Phe Leu Glu Glu Met Lys Lys Gly His Leu Glu Arg Glu Cys Met Glu Glu Thr ACC 183 GCC AAT TOC TTT CTT GAA GAG ATG AAG AAA 147 GGA CAC 156 CTC GAA AGA 165 GAG TGC ATG 174 GAA GAG 129 138 Cys Ser Tyr Glu Glu Alá Arg Glu Val Phe GlU Asp Ser Asp Lys Thr Asn Glu Phe Trp Asn TGC TCA TAC GAA GAG GCC CGC GAG GTC TTT GAG GAC AGC GAC AAG ACG AAT GAA TTC TGG AAT 192 201 210 219 228 237 246 Lys Tyr Lys Asp Gly Asp Gin Cys Glu Thr Ser Pro Cys Gin Asn Gin Gly Lys Cys Lys Asp AAA TAC AAA GAT GGC GAC CAG TGT GAG ACC AGT OCT TGC CAG AAC CAG GGC AAA TCT AAA GAC 255 264 273 282 291 300 309 Gly Leu Gly Glu Tyr Thr Cys Thr Cys Leu Glu Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys Glu Leu Phe GGC CTC GGG GAA TAC ACC TGC ACC TCT TTA GAA GGA TTC GAA GGC AAA AAC TCT GAA TTA TTC 318 327 336 345 354 363 372 Thr Arg Lys Leu Cys Ser Leu Asp Asn Gly Asp Cys Asp Gin Phe Cys His Glu Glu Gin Asn ACA CGG AAG CTC TGC AGC CTG GAC AAC GGG GAC TGT GAC CAG TTC TGC CAC GAG GAA CAG AAC 381 390 399 408 417 426 435 Ser Val Val Cys Ser Cys Alá Arg Gly Tyr Thr Leu Alá Asp Asn Gly Lys Alá Cys lle Pro TCT GTG CTG TGC TOC TGC GCC CGC GGG TAC ACC CTG GCT GAC AAC GGC AAG GCC TGC ATT CCC 444 453 462 471 480 489 498 178 179 180 181 182 183 Thr Gly Pro Tyr Pro Cys Gly Lys Gin Thr Leu Glu Arg Arg Lys Arg Ser Val Alá Gin Alá ACA GGG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG ACC CTG GAA CGC AGG AAG AGG TCA GTG GCC CAG GCC 507 516 525 534 543 552 561 Thr Ser Ser Ser Gly Glu Alá Pro Asp Ser lle Thr Trp Lys Pro Tyr Asp Alá Alá Asp Leu ACC AGC AGC AGC GGG GAG GCC CCT GAC AGC ATC ACA TGG AAG CCA TAT GAT GCA GCC GAC CTG 570 579 588 597 606 615 624 R6 229 Asp Pro Thr Glu Asn Pro Phe Asp Leu Leu Asp Phe Asn Gin Thr Gin Pro Glu Arg Gly Asp GAC CCC ACC GAG AAC CCC TTC GAC CTG CTT GAC TTC AAC CAG ACG CAG OCT GAG AGG GGC GAC 633 642 651 660 669 678 687 R5 R4 R3 R2 RÍ 234 235 Asn Asn Leu Thr Arg lle Val Gly Gly Gin Glu Cys Lys Asp Gly Glu Cys Pro Trp Gin Alá AAC AAC CTC ACC AGG ATC GTG GGA GGC CAG GAA TGC AAG GAC GGG GAG TGT CCC TGG CAG GÓC 696 705 714 723 732 741 750

1.1. ábra

HU 225 246 Β1

Int. Cl.: C12N 9/64

Leu Leu CTG CTC Ile Asn Glu Glu Asn Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr Ile Leu Ser Glu Phe Tyr Ile ATC AAT 759 GAG GAA 768 AAC GAG GGT TTC TGT GCT GGA ACT ATT CTG AGC GAG TTC TAC ATC 777 786 795 804 813 Leu Thr Alá Alá His Cys Leu Tyr Gin Alá Lys Arg Phe Lys Val Arg Val Gly Asp Arg Asn CTA ACG GCA GCC CAC TGT CTC TAC CAA GCC AAG AGA TTC AAG GTG AGG GTA GGG GAC CGG AAC 822 831 840 849 858 867 876 Thr Glu Gin Glu Glu Gly Gly Glu Alá Val His Glu Val Glu Val Val Ile Lys His Asn Arg ACG GAG CAG GAG GAG GGC GGT GAG GCG GTG CAC GAG GTG GAG GTG GTC ATC AAG CAC AAC CGG 885 894 903 912 921 930 939 Phe Thr Lys Glu Thr Tyr Asp Phe Asp Ile Alá Val Leu Arg Leu Lys Thr Pro Ile Thr Phe TTC ACA AAG GAG ACC TAT GAC TTC GAC ATC GCC GTG CTC CGG CTC AAG ACC CCC ATC ACC TTC 948 957 966 975 984 993 1002 Arg Met Asn Val Alá Pro Alá Cys Leu Pro Glu Arg Asp Trp Alá Glu Ser Thr Leu Met Thr CGC ATG AAC GTG GCG CCT GGC TGC CTC CCC GAG CCT GAC TGG GÓC GAG TCC ACG CTG ATG ACG 1011 1020 1029 1038 1047 1056 1065 Gin Lys Thr Gly Ile Val Ser Gly Phe Gly Arg Thr His Glu Lys Gly Arg Gin Ser Thr Arg CAG AAG ACG GGG ATT GTG AGC GGC TTC GGG CGC ACC CAC GAG AAG GGC CGG CAG TOC ACC AGG 1074 1083 1092 1101 1110 1119 1128 Leu Lys Met Leu Glu Val Pro Tyr Val Asp Arg Asn Ser Cys Lys Leu Ser Ser Ser Phe Ile CTC AAG ATG CTG GAG GTG CCC TAC GTG GAC CGC AAC AGC TGC AAG CTG TCC AGC AGC TTC ATC

1137 1146 1155 1164 1173 1182 1191

Ile Thr Gin Asn Met Phe Cya Alá Gly Tyr Asp Thr Lys Gin Glu Asp Alá Cys Gin Gly Asp

ATC ACC CAG AAC ATG TTC TGT GCC GGC TAC GAC ACC AAG CAG GAG GAT GCC TGC CAG GGG GAC

1200 1209 1218 1227 1236 1245 1254

Ser Gly Gly Pro His Val Thr Arg Phe Lys Asp Thr Tyr Phe Val Thr Gly Ile Val Ser Trp

AGC GGG GGC CCG CAC GTC ACC CGC TTC AAG GAC ACC TAC TTC GTG ACA GGC ATC GTC AGC TGG

1263 1272 1281 1290 1299 1308 1317

Gly Glu Ser Cys Alá Arg Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Thr Alá Phe Leu Lys

GGA GAG AGC TGT GCC CGT AAG GGG AAG TAC GGG ATC TAC ACC AAG GTC ACC GCC TTC CTC AAG

1326 1335 1344 1353 1362 1371 1380

469 470 475 476 480

Trp Ile Asp Arg Ser Met Lys Thr Arg Gly Leu Pro Lys Alá Lys Ser His Alá Pro Glu Val

TGG ATC GAC AGG TOC ATG AAA ACC AGG GGC TTC CCC AAG GCC AAG AGC CAT GCC CCG GAG GTC

1389 1398 1407 1416 1425 1434 1443

488

Ile Thr Ser Ser Pro Leu Lys TÉR

ATA ACG TCC TCT CCA TTA AAG TGA 1452 1461 1467

1.2. ábra

HU 225 246 Β1

Int. Cl.: C12N9/64

M n

Λ

2! m §88 V- T~ »— §88 •H n

d n

N c

0}

Kallikrein TLEfl RKR SVA 8MTRI IVGG 1001/1005 '9 9 » -d 9 U o< e d φ -P M «

Ό *W « « > M

HU 225 246 B1

Int. Cl.: C12N 9/64

4J

H

Mi fi

N «1 mhhnnnnn ooeqooeo rf3«fi*fiifi4343ifi«fi i I 1 I I I I I xccocx tú > cc a. i m > _i cctccccc Eccc cc

Λ4444444 ^tcccgccccccg

M

O

Λ a

'fll

N fi

Ό rd '«

CU h

IO

O u

CU s

V—

Or-® g> ο »-«Υ « 8880000 88888888 to o

ΓΤΟ

Prepro könnyű lánc (LC)[ nehéz lánc (HC) ro

1_

JO '03

Csi

•H tt te € <0 'Ál (0 X X ±i X u. LL U- Ή >i ll » H <a « 33 jC Ul LL. 0 I

to

u.

HU 225 246 Β1

Int. Cl.: C12N 9/64

3. ábra

HU 225 246 Β1

Int. Cl.: C12N 9/64

JV

AA

U

WJ *8 >!

Cb §

€ cs

Kezdő kiónok 799-6 szubklónok

Fb ur 00 Os o o 1 fO 1 r> 1 a—í 1 w • ab 1 rn 1 Os Os m m •n «η V> HM r \ O\ os n n t· f 00 00 00 00 oo

220kD

97kD