ES2229264T5 - Receptor il-17. - Google Patents
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Abstract
SE DESCUBREN RECEPTORES AISLADOS PARA IL ODIFICAN DICHOS RECEPTORES Y COMPOSICIONES FARMACEUTICAS FABRICADAS A PARTIR DE ELLOS. LOS RECEPTORES AISLADOS PUEDEN SER UTILIZADOS PARA REGULAR UNA RESPUESTA INMUNITARIA.
Description
Receptor IL-17.
De un modo general, la presente invención se
refiere al campo de los receptores de citoquinas y más
específicamente a las proteínas receptoras de citoquinas que tienen
actividad inmunorreguladora.
Las citoquinas son moléculas semejantes a
hormonas que regulan diversos aspectos de la respuesta inmunitaria
o inflamatoria. Las citoquinas ejercen sus efectos uniéndose de un
modo específico a receptores presentes en las células y
transduciendo una señal en las células. Rouvier y col. (J. Immunol.
150: 5445; 1993) publicaron un ADNc novedoso que denominaron
CTLA-8. La proteína CTLA-8 putativa
es homóloga en un 57% a la secuencia de aminoácidos predicha de una
fase de lectura abierta (ORF) presente en el herpesvirus saimiri
(HSV) denominada HVS13 (Nicholas y col., Virol. 179:1 89,1990;
Albrecht y col., J. Virol. 66: 5047; 1992). Sin embargo, no se
conoce la función, si tuvieran alguna, ni de CTLA-8
ni de HVS13, ni se conoce un receptor o proteína de unión ni para
CTLA-8 ni para HVS13. De este modo, antes de la
presente invención, había una necesidad en la técnica para
determinar la función de CTLA-8 y HVS13 y para
identificar las moléculas receptoras o proteínas de unión que
jueguen un papel en la función de estas proteínas.
La presente invención identifica un receptor
novedoso que se une a la IL-17
(CTLA-8) y a la HVS13, un homólogo vírico de la
IL-17; se proporcionan los ADN que codifican el
receptor novedoso y las proteínas receptoras novedosas. El receptor
es una proteína transmembranal del tipo I; el receptor del ratón
tiene 864 restos de aminoácidos, el receptor humano tiene 866
restos de aminoácidos. Las formas solubles del receptor pueden
prepararse y usarse para regular respuestas inmunitarias en un
sentido terapéutico; de acuerdo con esto, también se proporcionan
composiciones farmacéuticas que comprenden formas solubles del
receptor novedoso. También se describen las formas delecionadas y
las proteínas de fusión que comprenden el receptor novedoso y los
homólogos de las mismas. También se proporcionan métodos para
regular una respuesta inmunitaria y métodos para suprimir el rechazo
de órganos y tejidos injertados. Estos y otros aspectos de la
presente invención se harán evidentes en referencia a la siguiente
descripción detallada de la invención.
Se expresaron una proteína IL-17
(CTLA-8) soluble y una ORF presente en el
herpesvirus saimiri (HVS13) como proteínas de fusión que comprenden
una región Fc de inmunoglobulinas y se usaron para rastrear células
en busca de la expresión de un receptor para IL-17.
Se encontró que las células EL4 del timoma de linfocitos T se unían
a las proteínas de fusión HVS13/Fc así como a la CTLA8
(IL-17) murina /Fc. Se preparó una genoteca de ADNc
a partir de las células EL4 y se rastreó en busca de expresión del
receptor. El receptor es una proteína transmembranal del tipo I con
864 restos de aminoácidos, que se denomina IL-17R
(CTLA-8R). Se prepararon diversas formas del
IL-17R, incluyendo la proteína
IL-17R/Fc, un IL-17R soluble que
contiene el péptido de señalización y el dominio extracelular del
IL-17R, y una construcción
IL-17R/Flag® soluble. Se aisló un
IL-17R humano a partir de una genoteca de
linfocitos de sangre periférica mediante hibridación cruzada entre
especies que muestra similitudes con el IL-17R
murino. También se describen sondas y cebadores de
oligonucleótidos.
EL CTLA-8 se refiere a un ADNc
clonado a partir de un clon activado del hibridoma de linfocitos T
(Rouvier y col., J. Immunol. 150: 5445; 1993). El análisis de
transferencia Northern indicó que la transcripción de
CTLA-8 fue muy específica de tejido. Se encontró que
el gen CTLA-8 se cartografía en el sitio cromosómico
1a en los ratones y en el 2q31 en los seres humanos. Aunque Rouvier
y col. nunca identificaron una proteína codificada por el gen
CTLA-8, se encontró que la secuencia de aminoácidos
predicha del CTLA-8 era homóloga en un 57% a la
secuencia de aminoácidos predicha de una ORF presente en el
herpesvirus Saimiri, HVS13. La proteína CTLA-8 se
denomina en el presente documento interleuquina-17
(IL-17).
Se ha publicado la secuencia completa de
nucleótidos del genoma del HVS (Albrecht y col., J. Virol. 66: 5047;
1992). Se describen estudios adicionales en una de las fases de
lectura abierta (ORF) del HVS, HVS13, en Nicholas y col., Virol.
179:1 89; 1990. HVS13 es un gen tardío que está presente en el
fragmento HindIII-G del HVS. Se cree que los
antisueros desarrollados frente a los péptidos que derivan del HVS13
reaccionan con una proteína tardía (Nicholas y col.,
supra).
Tal como se describe en el documento USSN
08/462.353, una continuación en parte del documento USSN
08/410.
536, presentada el 23 de marzo de 1995, se expresaron la proteína CTLA-8 murina completa y una proteína de fusión CTLA-8/Fc, se analizaron y se encontró que actúan como un co-estímulo en la proliferación de los linfocitos T. Se identificó la IL-17 (CTLA-8) humana mediante el uso de sondas en una genoteca de linfocitos T humanos usando un fragmento de ADN que deriva a partir de PCR degenerada; también se espera que existan homólogos de la IL-17 (CTLA-8) en otras especies. También se expresaron una proteína HVS13 completa, así como una proteína de fusión HVS13/Fc, y se encontró que actúan de una manera similar a la proteína IL-17 (CTLA-8). Por otro lado, también es probable que otras especies de herpesvirus codifiquen proteínas homólogas a la que codifica HVS13.
536, presentada el 23 de marzo de 1995, se expresaron la proteína CTLA-8 murina completa y una proteína de fusión CTLA-8/Fc, se analizaron y se encontró que actúan como un co-estímulo en la proliferación de los linfocitos T. Se identificó la IL-17 (CTLA-8) humana mediante el uso de sondas en una genoteca de linfocitos T humanos usando un fragmento de ADN que deriva a partir de PCR degenerada; también se espera que existan homólogos de la IL-17 (CTLA-8) en otras especies. También se expresaron una proteína HVS13 completa, así como una proteína de fusión HVS13/Fc, y se encontró que actúan de una manera similar a la proteína IL-17 (CTLA-8). Por otro lado, también es probable que otras especies de herpesvirus codifiquen proteínas homólogas a la que codifica HVS13.
La presente invención proporciona el
IL-17R y homólogos del mismo aislados que tienen
actividad inmunorreguladora. Tales proteínas están sustancialmente
libres de sustancias endógenas contaminantes y, de un modo opcional,
sin el patrón de glucosilación natural asociado. Los derivados del
IL-17R dentro del alcance de la invención también
incluyen diversas formas estructurales de la proteína primaria que
retienen la actividad biológica. Debido a la presencia de grupos
amino y carboxilo ionizables, por ejemplo, una proteína
IL-17R puede encontrarse en la forma de sales
ácidas o básicas, o puede encontrarse en la forma neutra. También
pueden modificarse mediante oxidación o reducción restos de
aminoácidos individuales.
La estructura primaria de aminoácidos puede
modificarse conformando conjugados covalentes o agregados con otros
restos químicos, tales como grupos glucosilo, lípidos, fosfato,
grupos acetilo y similares, o creando mutantes de la secuencia de
aminoácidos. Los derivados covalentes se preparan uniendo grupos
funcionales particulares a las cadenas laterales de los aminoácidos
o al extremo N- o C-terminal.
Las formas solubles del IL-17R
también están dentro del alcance de la invención. Las secuencias de
nucleótidos y de aminoácidos predicha del IL-17R
murino se muestran en las SEQ ID Nº: 1 y 2. El análisis por
ordenador indicó que la proteína tiene un péptido de señalización
N-terminal con un sitio de corte entre el aminoácido
31 y el 32. Los expertos en la técnica reconocerán que el sitio
real de corte puede ser diferente del predicho por el análisis por
ordenador. De este modo, se espera que el aminoácido
N-terminal del péptido cortado esté dentro de los,
aproximadamente, cinco aminoácidos a ambos lados del sitio de corte
predicho. El péptido de señalización está seguido por un dominio
extracelular de 291 aminoácidos, un dominio transmembranal de
veintiún aminoácidos y una cola citoplásmica de 521 aminoácidos. El
IL-17R soluble comprende el péptido de señalización
y el dominio extracelular (restos 1 a 322 de la SEQ ID Nº: 1) o un
fragmento del mismo. De un modo alternativo, pueden sustituirse los
restos 1 a 31 de la SEQ ID Nº: 1 por un péptido de señalización
diferente.
Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos
predicha del IL-17R humano se muestran en las SEQ ID
Nº: 9 y 10. Este comparte muchas características con el
IL-17R murino. El análisis por ordenador indicó que
la proteína tiene un péptido de señalización
N-terminal con un sitio de corte entre el aminoácido
27 y el 28. Los expertos en la técnica reconocerán que el sitio
real de corte puede ser diferente del predicho por el análisis por
ordenador. De este modo, se espera que el aminoácido
N-terminal del péptido cortado esté dentro de los,
aproximadamente, cinco aminoácidos a ambos lados del sitio de corte
predicho. El péptido de señalización está seguido por un dominio
extracelular de 293 aminoácidos, un dominio transmembranal de 21
aminoácidos y una cola citoplásmica de 525 aminoácidos. El
IL-17R soluble comprende el péptido de señalización
y el dominio extracelular (restos 1 a 320 de la SEQ ID Nº: 1) o un
fragmento del mismo. De un modo alternativo, puede sustituirse el
péptido de señalización natural por un péptido de señalización
diferente.
Otros derivados de la proteína
IL-17R y de los homólogos de la misma dentro del
alcance de la invención incluyen conjugados covalentes o agregados
de la proteína o sus fragmentos con otras proteínas o polipéptidos,
tales como fusiones N-terminales o
C-terminales de síntesis en cultivo recombinante.
Por ejemplo, el péptido conjugado puede ser una secuencia
polipeptídica de señalización (o líder) en la región
N-terminal de la proteína que, de un modo
co-traduccional o post-traduccional,
dirija la transferencia de la proteína desde su sitio de síntesis a
su sitio de función dentro o fuera de la membrana celular o pared
(por ejemplo, el líder del factor \alpha de la levadura).
Las fusiones de proteínas pueden comprender
péptidos añadidos para facilitar la purificación o identificación
de las proteínas IL-17R y los homólogos (por
ejemplo, poli-His). La secuencia de aminoácidos de
las proteínas de la invención también puede estar unida a un
péptido de identificación tal como el descrito por Hopp y col.,
Bio/Technology 6: 1204 (1988). Un péptido muy antigénico como ese
proporciona un epítopo que se une de un modo reversible a un
anticuerpo monoclonal específico, permitiéndose el análisis rápido y
la purificación fácil de la proteína recombinante expresada. La
secuencia de Hopp y col. también es cortada específicamente por la
enteroquinasa de la mucosa bovina, permitiéndose la eliminación del
péptido de la proteína purificada. Las proteínas de fusión
coronadas con tales péptidos también pueden ser resistentes a la
degradación intracelular en E. coli.
Las proteínas de fusión comprenden
adicionalmente la secuencia de aminoácidos de un
IL-17R unido a una región Fc de inmunoglobulinas.
Una región Fc de ejemplo es una IgG1 humana que tiene las secuencias
de nucleótidos y de aminoácidos indicadas en la SEQ ID Nº: 4.
también pueden usarse fragmentos de una región Fc, así como
muteínas Fc como las descritas en el documento USSN 08/145.830,
presentado el 29 de octubre de 1993. Dependiendo de la porción de
la región Fc usada, una proteína de fusión puede expresarse en forma
de un dímero, por medio de la formación de puentes disulfuro
intercatenarios. Si las proteínas de fusión se hacen con las cadenas
pesada y ligera de un anticuerpo, es posible conformar un oligómero
de proteína con tantas como cuatro regiones
IL-17R.
En otra realización, el IL-17R y
los homólogos del mismo comprenden adicionalmente un dominio de
oligomerización en cremallera. Los dominios en cremallera se
describen en el documento USSN 08/107.353, presentado el 13 de
agosto de 1993, cuya pertinente descripción se incorpora en el
presente documento como referencia. Los ejemplos de los dominios de
cremalleras de leucina son los que se encuentran en el factor GCN4
de transcripción de la levadura y en una proteína de unión a ADN
termoestable encontrada en el hígado de rata (C/EBP; Landschulz y
col., Science 243: 1689, 1989), en las proteínas nucleares
transformantes, fos y jun, que forman preferentemente
un heterodímero (O'Shea y col., Science 245: 646, 1989; Turner y
Tjian, Science 243: 1689, 1989), y en el producto génico del
proto-oncogén murino c-myc
(Landschulz y col., Science 240: 1759, 1988). Las proteínas
fusogénicas de diversos virus diferentes, incluyendo paramixovirus,
coronavirus, el virus del sarampión y muchos retrovirus, también
poseen dominios de cremalleras de leucina (Auckland y Wild, Nature
338: 547, 1989; Britton, Nature 353: 394, 1991; Delwart y Mosialos,
AIDS Research and Human Retroviruses 6: 703, 1990).
Los derivados del IL-17R también
pueden usarse como inmunógenos, como reactivos en análisis in
vitro, o como agentes de unión en procedimientos de
purificación por afinidad. Tales derivados también pueden obtenerse
mediante agentes de reticulación, tales como el éster de succinimida
y M-maleimidobenzoilo y
N-hidroxisuccinimida, en los restos de cisteína y
lisina. Las proteínas de la invención también pueden unirse
covalentemente a través de grupos laterales reactivos a diversos
sustratos insolubles, tales como estructuras de agarosa activadas
con bromuro cianógeno, activadas con bisoxirano, activadas con
carbonildiimidazol o activadas con tosilo, o mediante absorción a
superficies de poliolefina (con o sin reticulación con
glutaraldehído). Una vez unidas a un sustrato, las proteínas pueden
usarse para unir selectivamente (con fines de análisis o
purificación) anticuerpos producidos contra el
IL-17R o contra otras proteínas que sean similares
al IL-17R, así como otras proteínas que se unan al
IL-17R o sus proteínas homólogas.
La presente invención también incluye al
IL-17R con o sin el patrón del glucosilación natural
asociado. Las proteínas expresadas en los sistemas de expresión de
mamíferos o de levaduras, por ejemplo, las células
COS-7, pueden ser similares o ligeramente
diferentes en su peso molecular y en el patrón de glucosilación a
las moléculas naturales, dependiendo del sistema de expresión. La
expresión de los ADN que codifican las proteínas de la invención en
bacterias tales como E. coli proporciona moléculas sin
glucosilar. Pueden producirse análogos mutantes funcionales de la
proteína IL-17R o de los homólogos de la misma que
tengan sitios de N-glucosilación inactivados
mediante síntesis de oligonucleótidos y ligación o mediante técnicas
de mutagénesis dirigida. Estas proteínas análogas pueden producirse
en una forma homogénea hipocarbohidratada con un buen rendimiento
usando los sistemas de expresión en levadura. Los sitios de
N-glucosilación en las proteínas eucarióticas se
caracterizan por el triplete de aminoácidos
Asn-A_{1}-Z, en el que A_{1} es
cualquier aminoácido excepto Pro, y Z es Ser o Thr. En esta
secuencia, la asparagina proporciona un grupo amino lateral para la
unión covalente de carbohidratos. Un sitio como ése puede
eliminarse sustituyendo la Asn o el resto Z por otro aminoácido,
delecionando la Asn o Z, o insertando un aminoácido que no sea Z
entre A_{1} y Z, o un aminoácido distinto de Asn entre Asn y
A_{1}.
Los derivados de la proteína
IL-17R también pueden obtenerse mediante mutaciones
del IL-17R natural o sus subunidades. Una proteína
mutada IL-17R, tal como se denomina en el presente
documento, es un polipéptido homólogo a una proteína
IL-17R pero que tiene una secuencia de aminoácidos
diferentes del IL-17R natural debido a una o a una
pluralidad de deleciones, inserciones o sustituciones. El efecto que
cualquier mutación hace en un ADN que codifica un péptido
IL-17R puede determinarse fácilmente analizando la
capacidad del péptido IL-17R mutado para inhibir la
co-estimulación de los linfocitos T o B mediante
IL-17 (CTLA-8) o mediante proteínas
homólogas, o la unión de proteínas que se unen específicamente a
IL-17R (por ejemplo, anticuerpos o proteínas
codificadas por el ADNc CTLA-8 o por la ORF HVS13).
Por otro lado, la actividad de los análogos, muteínas, o derivados
del IL-17R puede determinarse mediante cualquiera de
los métodos de análisis descritos en el presente documento. Pueden
hacerse mutaciones similares en los homólogos del
IL-17R y analizarlos de una manera similar.
Los análogos biológicamente equivalentes de las
proteínas de la invención pueden construirse, por ejemplo, haciendo
diversas sustituciones de restos o secuencias o delecionando restos
terminales o internos o secuencias no necesarias para la actividad
biológica. Por ejemplo, pueden delecionarse o sustituirse restos de
cisteína por otros aminoácidos para impedir la formación de puentes
disulfuro intramoleculares incorrectos después de la
renaturalización. Otros abordajes de mutagénesis implican la
modificación de restos de aminoácidos dibásicos adyacentes para
aumentar la expresión en los sistemas de levadura en los que está
presente la actividad de la proteasa KEX2.
De un modo general, las sustituciones deben
hacerse de un modo conservativo; es decir, los aminoácidos
sustitutos más preferidos son aquellos que no afectan la capacidad
de las proteínas de la invención de unir sus ligandos de una manera
sustancialmente equivalente al mIL-17R o al
hIL-17R naturales. Los ejemplos de sustituciones
conservativas incluyen la sustitución de aminoácidos de fuera del
dominio o dominios de unión y la sustitución de aminoácidos que no
alteren la estructura secundaria y/o terciaria del
IL-17R y los homólogos del mismo. Los ejemplos
adicionales incluyen la sustitución de un resto alifático por otro,
tales como Ile, Val, Leu, o Ala entre ellos, o sustituciones de un
resto polar por otro, tales como entre Lys y Arg; Glu y Asp; o Gln
y Asn. Se conocen muy bien otras sustituciones conservativas
como esas, por ejemplo, las sustituciones de regiones enteras que tienen similares características de hidrofobia.
como esas, por ejemplo, las sustituciones de regiones enteras que tienen similares características de hidrofobia.
De un modo similar, cuando se adopta una
estrategia de deleción o inserción, debe considerarse el potencial
efecto de la deleción o inserción en la actividad biológica. Las
subunidades de las proteínas de la invención pueden construirse
delecionando restos o secuencias terminales o internos. Pueden
prepararse fácilmente fragmentos del IL-17R que se
unan a la IL-17 (por ejemplo, usando enzimas de
restricción para delecionar porciones del ADN) y analizando su
capacidad de unirse a la IL-17. Se proporcionan
consejos adicionales acerca de los tipos de mutaciones que pueden
hacerse mediante una comparación de la secuencia del
IL-17R con proteínas que tienen estructuras
similares, así como mediante la realización de un análisis
estructural de las proteínas de la invención.
Por supuesto, las mutaciones en las secuencias
de nucleótidos construidas para la expresión de análogos del
IL-17R (CTLA-8R) deben conservar la
fase de lectura abierta de las secuencias codificantes y,
preferentemente, no crearán regiones de complementariedad que
podrían hibridar para producir estructuras secundarias de ARNm
tales como bucles u horquillas que afectarían de un modo adverso a
la traducción del ARNm del receptor. Aunque puede predeterminarse
un sitio para la mutación, no es necesario predeterminar
específicamente la naturaleza de la mutación. Por ejemplo, para
seleccionar las características óptimas de los mutantes en un sitio
dado, puede realizarse mutagénesis aleatoria en el codón diana y
rastrear las proteínas víricas mutadas y expresadas en busca de la
actividad
deseada.
deseada.
No todas las mutaciones en la secuencia de
nucleótidos que codifica una proteína IL-17R o un
homólogo de la misma se expresarán en un producto final, por
ejemplo, pueden hacerse sustituciones de nucleótidos para aumentar
la expresión, principalmente para evitar los bucles de estructura
secundaria en el ARNm transcrito (véase el documento EPA 75.444A,
incorporado en el presente documento por referencia), o para
proporcionar codones que se traduzcan más fácilmente mediante el
hospedador seleccionado, por ejemplo, los codones de preferencia de
E. coli bien conocidos para la expresión en E.
coli.
Las mutaciones pueden introducirse en loci
particulares mediante síntesis de oligonucleótidos que contengan
una secuencia mutante, flanqueada por sitios de restricción que
permitan una ligación a los fragmentos de la secuencia natural.
Después de la ligación, la secuencia reconstruida resultante
codifica un análogo que tiene la inserción, sustitución o deleción
de aminoácidos deseada.
De un modo alternativo, pueden emplearse
procedimientos de mutagénesis específica de sitio y dirigida por
oligonucleótidos para proporcionar un gen alterado que tenga codones
particulares alterados de acuerdo con la sustitución, deleción o
inserción requerida. Los métodos de ejemplo para hacer las
alteraciones indicadas anteriormente se describen en Walter y col.
(Gene 42: 133, 1986); Bauer y col. (Gene 37: 73, 1985); Craik
(Biotechniques, enero de 1985,12-19); Smith y col.
(Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981);
y las patentes de Estados Unidos Nº 4.518.584 y 4.737.462 describen
técnicas adecuadas y se incorporan en el presente documento como
referencia.
Debido a la degeneración del código, puede haber
una considerable variación en las secuencias de nucleótidos que
codifican la misma secuencia de aminoácidos. Otras realizaciones
incluyen secuencias capaces de hibridar en condiciones
moderadamente estrictas (solución de prelavado de 5 X SSC, SDS 0,5%,
EDTA 1,0 mM (pH 8,0) y condiciones de hibridación de 50ºC, 5 X SSC,
toda una noche) con las secuencias de ADN que codifican el
IL-17R, y otras secuencias que están degeneradas
con respecto a la que codifica el IL-17R. En una
realización preferida, los análogos del IL-17R son,
al menos, aproximadamente, idénticos en un 70% de la secuencia de
aminoácidos a la secuencia de aminoácidos de las proteínas
IL-17R tal como se indica en la SEQ ID Nº: 1 ó SEQ
ID Nº: 9. De un modo similar, los análogos de los homólogos del
IL-17R son, al menos, aproximadamente, idénticos en
un 70% de la secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos
de las proteínas homólogas naturales. En una realización más
preferida, los análogos del IL-17R o los homólogos
del mismo son, al menos, aproximadamente, idénticos en un 80% de la
secuencia de aminoácidos a la forma natural de las proteínas de la
invención.
El porcentaje de identidad puede determinarse
usando un programa informático, por ejemplo, el programa informático
GAP descrito por Devereux y col. (Nucl. Acids Res. 12: 387, 1984) y
disponible en el grupo de genética por ordenador de la universidad
de Wisconsin (UWGCG). Para los fragmentos que derivan de la proteína
IL-17R, la identidad se calcula en base a la
porción de la proteína IL-17R que está presente en
el fragmento. Pueden usarse métodos similares para analizar los
homólogos del IL-17R.
La capacidad de los análogos del
IL-17R de unirse al CTLA-8 puede
determinarse analizando la capacidad de los análogos para inhibir
la proliferación de los linfocitos T inducida por la
IL-17 (CTLA-8). De un modo
alternativo, pueden usarse análisis adecuados, por ejemplo, un
enzimoinmunoanálisis o una transferencia por puntos, empleando
CTLA-8 o HSV13 (o un homólogo de los mismos que se
una al IL-17R natural) para valorar la capacidad de
los análogos del IL-17R de unirse al
CTLA-8. Tales métodos son bien conocidos en la
técnica.
Las proteínas IL-17R y los
análogos descritos en el presente documento tendrán numerosos usos,
incluyendo la preparación de composiciones farmacéuticas. Las
proteínas de la invención también serán útiles para preparar kits
que se usan para detectar la IL-17 o el
IL-17R, por ejemplo, en especímenes de pacientes.
Tales kits también se usarán para detectar la interacción de la
IL-17 y el IL-17R, tal como se
necesita cuando se rastrea en busca de antagonistas o miméticos de
esta interacción (por ejemplo, péptidos o pequeñas moléculas que
inhiban o imiten, respectivamente, la interacción). Es útil en
tales kits una diversidad de formatos de análisis, que incluyen
(pero no están limitados a) ELISA, transferencia por puntos,
análisis de unión en fase sólida (tales como los que usan un
biosensor), análisis de formato rápido y bioanálisis.
Las proteínas de la presente invención se
producen, preferentemente, mediante métodos del ADN recombinante
insertando una secuencia de ADN que codifica la proteína
IL-17R o un homólogo de la misma en un vector de
expresión recombinante y expresando la secuencia de ADN en un
sistema de expresión microbiano recombinante en condiciones que
promuevan la expresión. Las secuencias de ADN que codifican las
proteínas proporcionadas por esta invención pueden montarse a
partir de fragmentos de ADNc y engarzadores cortos de
oligonucleótidos o a partir de una serie de oligonucleótidos, para
proporcionar un gen sintético que es capaz de ser insertado en un
vector de expresión recombinante y expresado en una unidad
transcripcional recombinante.
Los vectores de expresión recombinantes incluyen
fragmentos de ADN sintéticos o derivados de ADNc que codifican el
IL-17R, homólogos, o análogos bioequivalentes,
operativamente unidos a elementos de regulación transcripcional o
traduccional adecuados que derivan de genes de mamíferos,
microbianos, víricos o de insectos. Tales elementos de regulación
incluyen un promotor transcripcional, una secuencia operadora
opcional para controlar la transcripción, una secuencia que
codifica sitios adecuados de unión al ribosoma en el ARNm, y
secuencias que controlan la terminación de la transcripción y la
traducción, tal como se describe en detalle más adelante. La
capacidad de replicación en un hospedador se confiere, normalmente,
por un origen de replicación y puede incorporarse, adicionalmente,
un gen de selección para facilitar el reconocimiento de los
transformantes.
Las regiones de ADN están operativamente unidas
cuando están relacionadas funcionalmente entre sí. Por ejemplo, el
ADN de un péptido de señalización (líder para la secreción) se une
operativamente al ADN de un polipéptido si se expresa como un
precursor que participa en la secreción del polipéptido; un promotor
está operativamente unido a una secuencia codificante si controla
la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma
esta unido operativamente a una secuencia codificante si está
colocado de tal forma que permita la traducción. De un modo
general, estar operativamente unidos significa contiguo y, en el
caso de los líderes para la secreción, contiguo y en fase de
lectura. Las secuencias de ADN que codifican el
IL-17R o los homólogos que deben ser expresados en
un microorganismo, preferentemente, no contendrán intrones que
podrían hacer terminar la transcripción del ADN en ARNm de un modo
prematuro.
Los vectores de expresión útiles en el uso con
bacterias pueden comprender un marcador de selección y un origen de
replicación bacteriano que deriven de plásmidos comercialmente
disponibles que comprenden elementos genéticos del vector de
clonación bien conocido pBR322 (ATCC 37.017). Tales vectores
comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3
(Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y pGEM1 (Promega Biotec,
Madison, WI, Estados Unidos). Estas secciones de "cadenas
principales" del pBR322 se combinan con un promotor apropiado y
con la secuencia estructural a ser expresada. Típicamente, E.
coli se transforma usando derivados del pBR322, un plásmido que
deriva de una especie de E. coli (Bolivar y col., Gene 2: 95,
1977). El pBR322 contiene genes de resistencia a la ampicilina y la
tetraciclina y, de este modo, proporciona un medio sencillo para
identificar las células transformadas.
Los promotores que se usan comúnmente en los
vectores de expresión microbianos recombinantes incluyen el de la
\beta-lactamasa (penicilinasa) y el sistema
promotor de la lactosa (Chang y col., Nature 275: 615, 1978; y
Goeddel y col., Nature 281: 544, 1979), el sistema promotor del
triptófano (trp) (Goeddel y col., Nucl. Acids Res. 8: 4057, 1980; y
el documento EPA 36.776) y el promotor tac (Maniatis, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, pág.
412, 1982). Un sistema de expresión bacteriano particularmente útil
emplea el promotor P_{L} del fago \lambda y el represor
termolábil cI857ts. Los vectores plasmídicos disponibles en la
colección americana de cultivos tipo que incorporan derivados del
promotor P_{L} del fago \lambda incluyen el plásmido pHUB2,
residente en la cepa JMB9 de E. coli (ATCC 37.092) y pPLc28,
residente en la cepa RR1 de E. coli (ATCC 53.082).
Las secuencias promotoras adecuadas en los
vectores para levaduras incluyen los promotores de la
metalotioneína, quinasa del 3-fosfoglicerato
(Hitzeman y col., J. Biol. Chem. 255: 2073, 1980) u otras enzimas
glucolíticas (Hess y col., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 1968; y
Holland y col., Biochem. 17: 4900, 1978), tales como la enolasa,
deshidrogenasa del
gliceraldehído-3-fosfato,
hexoquinasa, descarboxilasa del piruvato, fosfofructoquinasa,
isomerasa de la glucosa-6-fosfato,
mutasa del 3-fosfoglicerato, quinasa del piruvato,
isomerasa de las triosafosfato, isomerasa de la fosfoglucosa, y
glucoquinasa. Los vectores y promotores adecuados para usar en la
expresión en levaduras se describen adicionalmente en R. Hitzeman y
col., documento EPA 73.657.
Los vectores de levaduras preferidos pueden
montarse usando secuencias de ADN del pBR322 para la selección y
replicación en E. coli (gen Amp^{r} y origen replicación) y
secuencias de ADN de levadura que incluyen un promotor ADH2
reprimible por glucosa y el líder para la secreción del factor
\alpha. El promotor ADH2 ha sido descrito por Russell y col. (J.
Biol. Chem. 258: 2674, 1982) y por Beier y col. (Nature 300: 724,
1982). El líder del factor \alpha de la levadura, que dirige la
secreción de las proteínas heterólogas, puede insertarse entre el
promotor y el gen estructural a ser expresado. Véase, por ejemplo,
Kurjan y col., Cell 30: 933, 1982; y Bitter y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 81: 5330, 1984. La secuencia líder puede modificarse
para contener, cerca de su extremo 3', uno o más sitios de
restricción útiles para facilitar la fusión de la secuencia líder a
los genes foráneos.
Las secuencias de control de la transcripción y
la traducción en los vectores de expresión que se usan en células
de vertebrados para transformar pueden proporcionarse mediante
fuentes víricas. Por ejemplo, los promotores e intensificadores
usados comúnmente derivan del virus de polioma, del adenovirus 2,
del virus 40 del simio (SV40), y del citomegalovirus humano. Las
secuencias de ADN que derivan del genoma vírico del SV40, por
ejemplo, el origen del SV40, el promotor temprano y tardío, el
intensificador y los sitios de procesamiento y poliadenilación
pueden usarse para proporcionar los otros elementos genéticos
requeridos para la expresión de una secuencia de ADN heteróloga.
Los promotores temprano y tardío son particularmente útiles porque
ambos se obtienen fácilmente a partir del virus en forma de un
fragmento que también contiene el origen de replicación vírico del
SV40 (Fiers y col., Nature 273: 113, 1978). También pueden usarse
fragmentos del SV40 más pequeños o mayores, con la condición de que
se incluya la secuencia de aproximadamente 250 pb que se extiende
desde el sitio HindIII hasta el sitio BglII localizado en el origen
de replicación vírico. Adicionalmente, pueden utilizarse secuencias
de señalización y/o control de promotores genómicos víricos con la
condición de que tales secuencias de control sean compatibles con
la célula hospedadora elegida. Los vectores de ejemplo pueden
construirse tal como se describe en Okayama y Berg (Mol. Cell.
Biol. 3: 280, 1983).
Puede construirse un sistema útil para la
expresión estable de alto nivel de ADNc de receptores de mamíferos
en células C127 epiteliales mamarias y murinas como se describe,
sustancialmente, en Cosman y col. (Mol. Immunol. 23: 935, 1986). Un
vector eucariótico preferido para la expresión del ADN del
IL-17R se denomina pDC406 (McMahan y col., EMBO J.
10: 2821, 1991), e incluye secuencias reguladoras que derivan del
SV40, del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y del virus de
Epstein-Barr (EBV). Otros vectores preferidos
incluyen el pDC409 y el pDC410, que derivan del pDC406. El pDC410
deriva del pDC406 mediante sustitución del origen de replicación del
EBV consecuencias que codifican el antígeno T grande del SV40. El
pDC409 difiere del pDC406 en que se ha delecionado un sitio de
restricción BglII de fuera del sitio de multiclonación, haciéndose
único el sitio BglII de dentro del sitio de multiclonación.
Una línea celular útil que permite la
replicación episómica de vectores de expresión, tales como el pDC406
y el pDC409, que contienen el origen de replicación del EBV, es la
CV-1/EBNA (ATCC CRL 10.478). La línea celular
CV-1/EBNA deriva por transfección con un gen que
codifica el antígeno 1 nuclear del virus de
Epstein-Barr (EBNA-1) de la línea
celular CV-1 y expresa de un modo constitutivo el
EBNA-1 controlado por el intensificador/promotor
inmediatamente temprano del CMV humano.
Las células hospedadoras transformadas son
células que han sido transformadas o transfectadas con vectores de
expresión construidos usando técnicas del ADN recombinante y que
contienen secuencias que codifican las proteínas de la presente
invención. Las células hospedadoras transformadas pueden expresar la
proteína deseada (IL-17R u homólogos del mismo),
pero las células hospedadoras transformadas con fines de clonación o
amplificación del ADN de la invención no necesitan expresar la
proteína. Preferentemente, las proteínas expresadas se secretarán
en el sobrenadante del cultivo, dependiendo del ADN seleccionado,
pero pueden depositarse en la membrana celular.
Las células hospedadoras adecuadas para la
expresión de proteínas víricas incluyen células procariotas,
levaduras o eucariotas superiores bajo el control de los promotores
apropiados. Los procariotas incluyen organismos gramnegativos o
grampositivos, por ejemplo, E. coli o Bacillus spp.
Las células eucariota superiores incluyen líneas celulares
establecidas con origen en mamíferos, como se describe más adelante.
También pueden emplearse los sistemas de traducción sin células
para producir proteínas víricas usando ARN que derive de las
construcciones de ADN descritas en el presente documento. Los
vectores de clonación y expresión apropiados para el uso con
hospedadores celulares bacterianos, fúngicos, de levaduras y de
mamíferos se describen en Pouwels y col. (Cloning Vectors. A
Laboratory Manual,
Elsevier, Nueva York, 1985), cuya descripción pertinente se incorpora en el presente documento como referencia.
Elsevier, Nueva York, 1985), cuya descripción pertinente se incorpora en el presente documento como referencia.
Los hospedadores de expresión procariotas pueden
usarse para la expresión del IL-17R o los homólogos
que no requieran un procesamiento proteolítico y de puentes
disulfuro amplio. Generalmente, los vectores de expresión
procariotas comprenden uno o más marcadores de selección fenotípica,
por ejemplo, un gen que codifique proteínas que confieran
resistencia frente a antibióticos o suministro de un requerimiento
autotrófico, y un origen de replicación reconocido por el
hospedador para asegurar la amplificación dentro del hospedador. Los
hospedadores procariotas adecuados para la transformación incluyen
E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella
typhimurium, y diversas especies dentro de los géneros
Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus,
aunque también pueden emplearse otros por preferencia.
El IL-17R recombinante también
puede expresarse en hospedadores de levaduras, preferentemente, de
especies de Saccharomyces, tales como S. cerevisiae.
También pueden emplearse levaduras de otros géneros, tales como
Pichia o Kluyveromyces. Generalmente, los vectores de
levaduras contendrán un origen de replicación del plásmido 2 \mu
de levadura o una secuencia de replicación autónoma (ARS), promotor,
ADN que codifique la proteína vírica, secuencias para la
poliadenilación y la terminación de la transcripción y un gen de
selección. Preferentemente, los vectores de levaduras incluirán un
origen de replicación y un marcador de selección que permita la
transformación de tanto levaduras como E. coli, por ejemplo,
el gen de resistencia a la ampicilina de E. coli y el gen
trp1 de S. cerevisiae, que proporciona un marcador de
selección de una cepa mutante de levaduras carente de la capacidad
de crecer en triptófano, y un promotor que derive de un gen de
levadura muy expresado para inducir la transcripción de una
secuencia estructural cadena abajo. De este modo, la presencia de
la disfunción del trp1 en el genoma de la célula hospedadora de
levadura proporciona un ambiente eficaz para la detección de la
transformación mediante crecimiento en ausencia del triptófano.
Los protocolos de transformación de levaduras
adecuados son conocidos por los expertos en la técnica; la técnica
de ejemplo se describe por INEN y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
75: 1929, 1978, que selecciona transformantes Trp^{+} en medio de
selección que consiste en extracto de levadura 0,67%, casaminoácidos
0,5%, glucosa 2%, adenina 10 \mug/ml y uracilo 20 \mug/ml. Las
cepas hospedadoras transformadas con vectores que comprenden el
promotor ADH2 pueden hacerse crecer para la expresión en un medio
rico que consiste en extracto de levadura 1%, peptona 2% y glucosa
1% complementado con adenina 80 \mug/ml y uracilo 80 \mug/ml. La
desrepresión del promotor ADH2 ocurre después del agotamiento de la
glucosa del medio. Los sobrenadantes brutos de levadura se recogen
mediante filtración y se mantienen a 4ºC antes de la purificación
adicional.
Pueden emplearse diversos sistemas de cultivo de
células de mamífero o de insecto para expresar la proteína
recombinante. Se examinan los sistemas de baculovirus para la
producción de proteínas heterólogas en células de insectos en
Luckow y Summers, Bio/Technology 6:47 (1988). Los ejemplos de líneas
celulares hospedadoras de mamíferos adecuadas incluyen las líneas
COS-7 de células de riñón de mono, descritas por
Gluzman (Cell 23: 175, 1981), y otras líneas celulares capaces de
expresar un vector apropiado incluyendo, por ejemplo, las líneas
celulares CV-1/EBNA (ATCC CRL 10.478), células L,
C127, 3T3, del ovario de hámster chino (CHO), HeLa y BHK. Los
vectores de expresión de mamíferos pueden comprender elementos que
no se transcriben tales como un origen de replicación, un promotor
adecuado y un intensificador unidos al gen a ser expresado, y otras
secuencias que no se transcriben flanqueantes 5' ó 3', y secuencias
que no se traducen 5' ó 3', tales como los sitios de unión al
ribosoma, un sitio de poliadenilación, sitios de procesamiento
donadores y aceptadores, y secuencias de terminación de la
transcripción necesarias.
El IL-17R, los homólogos o
análogos purificados se preparan cultivando sistemas de
hospedador/vector adecuados para expresar los productos
recombinantes de la traducción de los ADN de la presente invención
que, seguidamente, se purifican a partir del medio de cultivo o a
partir de extractos celulares. Por ejemplo, los sobrenadantes de
los sistemas que secretan la proteína recombinante en el medio de
cultivo se pueden concentrar primero usando un filtro de
concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo,
una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon.
Después de la etapa de concentración, el
concentrado puede aplicarse a una matriz de purificación adecuada.
Por ejemplo, una matriz de afinidad adecuada puede comprender una
estructura opuesta de moléculas de proteína o lectina o anticuerpo
unidas a un soporte adecuado. De un modo alternativo, puede
emplearse una resina de intercambio aniónico, por ejemplo, una
matriz o sustrato que tenga grupos dimetilaminoetilo (DEAE)
pendientes. Las matrices pueden ser de acrilamida, agarosa,
dextrano, celulosa o de otros tipos empleados comúnmente en la
purificación de proteínas. De un modo alternativo, puede emplearse
una etapa de intercambio catiónico. Los intercambiadores catiónicos
adecuados incluyen diversas matrices insolubles que comprenden
grupos sulfopropilo o carboximetilo. Los grupos sulfopropilo son
los preferidos. La cromatografía de filtración en gel también
proporciona un medio para purificar las proteínas de la
invención.
La cromatografía de afinidad es un método
particularmente preferido para purificar el IL-17R y
los homólogos del mismo. Por ejemplo, puede purificarse un
IL-17R expresado en forma de una proteína de fusión
que comprende una región Fc de inmunoglobulinas usando la
cromatografía de afinidad con la proteína A o la proteína G. Por
otro lado, puede purificarse una proteína IL-17R que
comprende un dominio de oligomerización en cremallera en una resina
que comprende un anticuerpo específico frente al dominio de
oligomerización en cremallera. También pueden ser útiles los
anticuerpos monoclonales frente a la proteína IL-17R
en la purificación mediante cromatografía por afinidad, utilizando
métodos que son bien conocidos en la técnica. También puede usarse
un ligando (por ejemplo, IL-17 o
HVS-13) para preparar una matriz de afinidad para la
purificación por afinidad del IL-17R.
Finalmente, pueden emplearse una o más etapas de
cromatografía líquida de alta resolución y fase inversa
(RP-HPLC) que emplean medios hidrófobos para
RP-HPLC, por ejemplo, gel de sílice que tenga grupos
metilo u otros grupos alifáticos pendientes, para purificar
adicionalmente una composición de IL-17R. También
pueden emplearse algunas o todas las etapas de purificación
anteriores, en diversas combinaciones, para proporcionar una
proteína recombinante homogénea.
La proteína recombinante producida en el cultivo
bacteriano se aísla, normalmente, mediante extracción inicial a
partir de los sedimentos celulares, seguido de una o más etapas de
concentración, precipitación por sales, cromatografía de
intercambio iónico acuoso o cromatografía de exclusión por tamaño.
Finalmente, puede emplearse una cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC) en las etapas de purificación final. Las células
microbianas empleadas en la expresión de la proteína vírica
recombinante pueden romperse mediante cualquier método conveniente,
incluyendo los ciclos de congelación-descongelación,
sonicación, ruptura mecánica o uso de agentes de lisis celular.
La fermentación de las levaduras que expresan la
proteína de la invención en forma de una proteína secretada
simplifica mucho la purificación. La proteína recombinante secretada
que proviene de una fermentación a gran escala puede purificarse
mediante métodos análogos a los descritos en Urdal y col. (J.
Chromatog. 296: 171, 1984). En este antecedente se describen dos
etapas de HPLC de fase inversa secuenciales para la purificación
del GM-CSF humano recombinante en una columna
preparativa de HPLC.
La proteína sintetizada en cultivos
recombinantes se caracteriza por la presencia de componentes
celulares, incluyendo proteínas, en cantidades y en un carácter que
depende de las etapas de purificación que se han llevado a cabo
para recuperar la proteína de la invención a partir del cultivo. De
un modo ordinario, estos componentes tendrán origen en las
levaduras, procariotas o eucariota superiores no humanos y,
preferentemente, están presentes en cantidades contaminantes
inocuas, en el orden de menos del, aproximadamente, 1% en peso.
Adicionalmente, el cultivo celular recombinante permite la
producción de las proteínas de la invención sin otras proteínas que
pueden estar normalmente asociadas con las proteínas tal como se
encuentran en la naturaleza en las especies de origen.
La presente invención proporciona métodos para
usar composiciones terapéuticas que comprenden una cantidad eficaz
de una proteína y un diluyente y vehículo adecuados, y métodos para
regular una respuesta inmunitaria. El uso del
IL-17R o los homólogos junto con receptores de
citoquinas solubles o citoquinas, u otras moléculas
inmunorreguladoras también se contempla. Por otro lado, el ADN que
codifica el IL-17R soluble también será útil; un
tejido u órgano a ser trasplantado puede ser transfectado con el ADN
mediante cualquier método conocido en la técnica. De este modo, el
órgano o tejido expresa el IL-17R soluble, que actúa
en el área localizada del injerto para suprimir el rechazo del
injerto. También mostrarán eficacia métodos similares que comprendan
la administración de tales ADN en el sitio del injerto a la hora de
mejorar el rechazo del injerto.
Para el uso terapéutico, la proteína purificada
se administra a un paciente, preferentemente, un ser humano, para
el tratamiento de una manera adecuada con la indicación. De este
modo, por ejemplo, las composiciones de la proteína
IL-17R administradas para regular la función
inmunitaria pueden administrarse mediante una inyección de dosis
rápida, infusión continua, liberación sostenida a partir de
implantes, u otra técnica adecuada. De modo típico, se administrará
un agente terapéutico en la forma de una composición que comprenda
el IL-17R purificado, junto con vehículos,
excipientes o diluyentes fisiológicamente aceptables. Tales
vehículos serán atóxicos para los receptores en las dosis y
concentraciones empleadas.
De un modo ordinario, la preparación de tales
composiciones de proteínas conlleva la combinación de la proteína
de la invención con tampones, antioxidantes tales como ácido
ascórbico, polipéptidos de bajo peso molecular (menos de,
aproximadamente, 10 restos), proteínas, aminoácidos, carbohidratos
incluyendo glucosa, sacarosa o dextrinas, agentes quelantes tales
como EDTA, glutatión y otros estabilizantes y excipientes. Son
ejemplos de diluyentes apropiados la solución salina neutra o la
solución salina mezclada con seroalbúmina conespecífica.
Preferentemente, el producto se formula en forma de liofilizado
usando soluciones apropiadas de excipientes (por ejemplo, sacarosa)
como diluyentes. Las dosis apropiadas pueden determinarse en
estudios. La cantidad y frecuencia de la administración dependerá,
por supuesto, de factores tales como la naturaleza y la gravedad de
la indicación a ser tratada, de la respuesta deseada, del estado del
paciente y demás.
Los receptores de la IL-17
(CTLA-8) pueden administrarse con el fin de inhibir
la proliferación de los linfocitos T o para inhibir la activación
de los linfocitos T. De este modo, el IL-17R soluble
es probable que sea útil para prevenir o tratar el rechazo de
órganos o injertos, las enfermedades autoinmunitarias, alergia o
asma. Las proteínas receptoras de la invención también serán útiles
para la prevención o tratamiento de las enfermedades inflamatorias
en las que los linfocitos T activados juegan un papel. De modo
similar, el HVS13 y los homólogos del mismo estimulan la
proliferación de los linfocitos B y la secreción de
inmunoglobulinas; de este modo, los receptores que se unen a HVS13
o CTLA-8 serán útiles in vivo para inhibir la
proliferación de células B o la secreción de inmunoglobulinas. Los
receptores del CTLA-8 también serán útiles para
inhibir la unión del HVS13 o del CTLA-8 a las
células que expresan el IL-17R.
Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar
y no para limitar. Los expertos en la técnica reconocerán que
pueden hacerse variaciones de la invención realizada en los
ejemplos, especialmente a la luz de las enseñanzas de diversos
antecedentes citados en el presente documento, cuyas descripciones
se incorporan como referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo describe la identificación de
células que expresan un receptor (o estructura opuesta) para
HVS13/
mCTLA-8. Se preparó una proteína quimérica (HVS13/Fc de tipo II) que consiste en una región Fc de una inmunoglobulina humana (SEQ ID Nº: 4) seguida de los aminoácidos 19 a 151 del HVS13 (SEQ ID Nº: 8). Se construyó una CTLA8 murino/Fc (mCTLA-8/Fc) fusionando los aminoácidos 22 a 150 del mCTLA-8 (SEQ ID Nº: 6) a la región Fc de la IgG1 humana. Se construyó una proteína Fc control mediante un método similar. Se expresaron las proteínas HVS13/Fc y mCTLA-8 y se usaron para identificar fuentes celulares mediante citometría de flujo.
mCTLA-8. Se preparó una proteína quimérica (HVS13/Fc de tipo II) que consiste en una región Fc de una inmunoglobulina humana (SEQ ID Nº: 4) seguida de los aminoácidos 19 a 151 del HVS13 (SEQ ID Nº: 8). Se construyó una CTLA8 murino/Fc (mCTLA-8/Fc) fusionando los aminoácidos 22 a 150 del mCTLA-8 (SEQ ID Nº: 6) a la región Fc de la IgG1 humana. Se construyó una proteína Fc control mediante un método similar. Se expresaron las proteínas HVS13/Fc y mCTLA-8 y se usaron para identificar fuentes celulares mediante citometría de flujo.
Se incubaron previamente las células (1 x
10^{6}) en hielo durante 30 minutos en 100 \mul de tampón FACS
(PBS, FCS 1% y NaN_{3} 0,1%) que contenía suero normal de cabra 2%
y suero normal de conejo 2% para bloquear la unión inespecífica. Se
añadieron 100 \mul de HVS13/Fc, mCTLA-8/Fc o
proteína Fc de control a 5 \mug/ml y se incubó en hielo durante 30
minutos. Después de lavar, las células se tiñeron con
anti-IgG humana (específica de Fc) marcada con
biotina seguido de estreptavidina conjugada con PE (Becton Dickson
& Co, Mountain View, CA) en 100 \mul de tampón FACS.
Seguidamente, se lavaron las células y se analizaron usando un
FACScan (Becton Dickinson). Se analizaron un mínimo de 5000 células
en cada muestra. Se seleccionaron más de una docena de líneas
celulares y se encontró que las proteínas de fusión HVS13/Fc y
mCTLA-8/Fc se unían específicamente a la línea
celular EL4 del timoma murino. Estas células no se unían a la
proteína de fusión control/Fc.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo describe la clonación del gen que
codifica el IL-17R. Después de la identificación de
una fuente de una estructura opuesta al HVS13, se rastreó una
genoteca de expresión de las EL4 de mamífero mediante el método
autorradiográfico de unión en portaobjetos (Gearing y col., EMBO J.
8: 3667, 1989). Se mantuvieron las células CV1/EBNA en medio de
Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía suero fetal de
ternera (FCS) 10% (vol./vol.) a 37ºC en una atmósfera húmeda que
contenía CO_{2} 10% y con dos pases a la semana. Se transfectaron
monocapas de células CV1/EBNA en subconfluencia sobre portaobjetos
con cámara tratados con fibronectina (Labtek) mediante un
procedimiento con DEAE-dextrano mediado por
cloroquina con ADN plasmídico que provenía de transformantes
mezclados (2000 transformantes por conjunto) de la genoteca de ADNc
de las EL4 murinas.
Se analizaron las células CV1/EBNA transfectadas
con los conjuntos de ADNc de las EL4 murinas en busca de unión a la
HVS13/Fc dos días después de la transfección usando la unión de
anti-IgG humana de cabra marcada con [^{125}I] y
autorradiografía en portaobjetos. Se lavaron las monocapas de
células transfectadas con medio de unión (RPMI 1640 que contiene
seroalbúmina bovina 1% y leche desnatada en polvo 50 mg/ml),
seguidamente, se incubaron con 1 \mug/ml de HVS13/Fc durante una
hora a temperatura ambiente. Se lavaron las células y se incubaron
con anti-IgG humana de cabra marcada con ^{125}I
(New England Nuclear Cambridge, MA). Las células se lavaron dos
veces con medio de unión, tres veces con PBS, y se fijaron en PBS
que contenía glutaraldehído 2,5% durante 30 minutos, se lavaron dos
veces más con PBS y se dejaron secar al aire. Seguidamente, los
portaobjetos con cámara se sumergieron en emulsión fotográfica
GTNB-2 de Kodak y se expusieron durante 3 días a 4ºC
antes de revelar.
Se transfectaron células CV1/EBNA con 40
conjuntos de, aproximadamente, 2000 ADNc. Se encontró que dos
conjuntos de ADNc conferían unión a la proteína HVS13/Fc. Estos
conjuntos se dividieron en conjuntos de 100 ADNc y,
subsecuentemente, hasta clones individuales. Se aislaron dos clones
de ADNc únicos. Se transfectaron células CV1/EBNA con estos clones
para determinar si la proteína codificada confería, de este modo,
unión tanto a la HVS13/Fc como a la mCTLA-8/Fc.
Tanto la HVS/Fc como la mCTLA-8/Fc se unían a las
células CV1/EBNA transfectadas con el ADNc clonado, pero no a las
células transfectadas con el vector vacío. El control/Fc no se unía
a ninguna de ellas.
Mediante la secuenciación de estos clones se
encontró que contenían un inserto de 3,2 kb y de 1,7 kb derivado
del mismo ARNm. El clon de 3,2 kb contenía una fase de lectura
abierta de 2595 pb rodeada de 120 pb en la secuencia no codificante
5' y de 573 pb en la secuencia no codificante 3'. No había codones
de terminación en fase cadena arriba del inicio predicho de
metionina, que está precedido por un resto de purina (guanina) en
la posición -3, que es la más importante indicación de un buen
sitio de inicio de la traducción (Kozak, Mol. Cell. Biol. 9: 5134,
1989). También tiene una guanina en la posición +4, que lo hace un
inicio de traducción óptimo. Es previsible que la fase de lectura
abierta codifique una proteína transmembranal del tipo I de 864
aminoácidos. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos predicha
se muestran en las SEQ ID Nº 1 y 2.
El análisis por ordenador indicó que la proteína
tiene un péptido de señalización N-terminal con un
sitio de corte entre los aminoácidos 31 y 32. El péptido de
señalización está seguido de un dominio extracelular de 291
aminoácidos, un dominio transmembranal de veintiún aminoácidos, y
una cola citoplásmica de 521 aminoácidos. Hay ocho sitios
potenciales de glucosilación ligada a N en el dominio extracelular
de la proteína. El peso molecular predicho de esta proteína es 97,8
kilodaltons con un punto isoeléctrico estimado de 4,85. La
comparación de tanto la secuencia de nucleótidos como la de
aminoácidos con las bases de datos GenBank o EMBL no encontró
homología significativa consecuencias de nucleótidos y de proteínas
conocidas.
Para determinar la distribución celular y
tisular del ARNm del IL-17R, se examinó ARN
poli(A)^{+} que provenía de diversas líneas
celulares o tejidos murinos mediante análisis de transferencia
Northern, usando el ADNc del IL-17R como sonda. Se
compraron filtros que contenían ARN poli(A)+ (2 \mug por
línea) de diversos tejidos a Clontech (Palo Alto, CA). Se aisló el
ARN poliadenilado de diversas células o líneas celulares, se
fraccionó (2 \mug por línea) en un gel de agarosa 1%-formaldehído
y se transfirió a una membrana de nailon Hybond (Amersham). Los
filtros se sometieron a la sonda con una sonda de ARN
anti-sentido de ARN que corresponde a la región
codificante del ADNc del IL-17R. Se realizó la
hibridación a 63ºC seguida de tres lavados en 0,2% x SSC, SDS 0,1%
a 68ºC. Las membranas se expusieron durante 8 a 48 horas a
-70ºC.
La sonda del IL-17R hibridó con
una especie única de ARNm de, aproximadamente, 3,7 kb, en todos los
tejidos. Dentro de los tejidos examinados, se observaron señales de
hibridación fuertes en el bazo y el riñón. Se observaron señales
moderadas en el pulmón y en el hígado y señales débiles en el
cerebro, corazón, músculo esquelético y testículos. Se detectaron
ARNm de un tamaño similar en las siguientes células y líneas
celulares: células epiteliales del hígado fetal (D11), fibroblastos
(3T3), células epiteliales del intestino de rata (1CE6), linfocitos
B esplénicos, células musculares (BB4), mastocitos (H7), células del
timo negativas triples (TN), pre-linfocitos B
(70Z/3), hibridoma de linfocitos T (EL4); y los clones de linfocitos
T 7C2 y D10. Se encontró que todas las líneas celulares analizadas
expresaban el ARNm del IL-17R, lo que sugiere una
expresión ubicua del mensajero del IL-17R.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo describe la construcción de una
construcción para expresar una proteína IL-17R/Flag®
soluble denominada IL17R/Flag. La IL17R/Flag® contiene una
secuencia líder y la región del IL-17R del
aminoácido 1 al aminoácido 322 (SEQ ID Nº: 1) y el octapéptido
denominado Flag® (SEQ ID Nº: 3). Esencialmente, la construcción se
prepara como se describe para otras construcciones solubles, ligando
un fragmento de ADN que codifica los aminoácidos 1 a 322 de la SEQ
ID Nº: 1 (preparado como se describe en el ejemplo 4) a un vector de
expresión apropiado que contiene una secuencia líder adecuada. Se
transfecta una línea celular adecuada tal como la línea celular de
riñón de mono CV-1/EBNA (ATCC CRL 10.478) con la
construcción de ADN resultante. La IL-17R/Flag®
puede purificarse usando una columna de afinidad de anticuerpos para
Flag® y analizarse su actividad biológica usando cualquiera de los
métodos descritos en el presente documento.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo describe la construcción de una
construcción de ADN del IL-17R para expresar una
proteína de fusión IL17R/Fc. Se construyó una forma soluble del
IL-17R fusionado con la región Fc de la IgG1 humana
en el vector de expresión de mamíferos pDC409 del siguiente modo. Se
sintetizaron un par de cebadores de oligonucleótidos que contenían
una secuencia con sentido y una secuencia antisentido del
IL-17R. El cebador con sentido contenía un sitio
SalI en el extremo 5' del ADNc y el cebador antisentido contenía un
sitio BglII y contenía el IL-17R cortado justo
antes de la región transmembranal y un codón de terminación. El
fragmento de ADN de 980 pb se amplificó a partir del ADNc del
IL-17R. El producto de la PCR se cortó con SalI y
BglII y se usó en una ligación a tres bandas con un fragmento que
llevaba la región IgG1 humana cortada con BglII y NotI y con el
plásmido (pDC409; véase el documento USSN 08/235.397) cortado
previamente con SalI y NotI. El inserto codificado contenía los
nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos del resto 1 al
322 del IL-17R (SEQ ID Nº: 1). La secuencia se
confirmó mediante secuenciación de la región entera.
Se transfectaron células
CV-1/EBNA con los plásmidos de expresión del
IL17R/Fc y se recogieron los sobrenadantes durante 1 semana. Se
purificaron las proteínas de fusión CTLA-8/Fc en una
columna de sefarosa de proteína A (Pharmacia, Uppsala, Suecia) como
se describe más adelante. Se determinó la concentración de proteínas
en un enzimoinmunoanálisis específico para el dominio constante de
la IgG1 humana y mediante análisis BCA (Pharmacia), y se confirmó
la pureza mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida-SDS seguido de tinción con plata
del
gel.
gel.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo describe la purificación de las
proteínas de fusión del IL-17R. Se purificó la
proteína de fusión IL-17R/Fc mediante métodos
ordinarios usando cromatografía con proteína A o proteína G. Se
purifica, aproximadamente, un litro del sobrenadante del cultivo
que contiene la proteína de fusión IL-17R/Fc
mediante filtración de los sobrenadantes de las células de mamífero
(por ejemplo, en un filtro de 0,45 \mu) y se aplica el filtrado a
una columna de afinidad con anticuerpos y proteína A/G (Schleicher y
Schuell, Keene, NH) de 1,5 cm x 12,0 cm, a 4ºC y a una velocidad de
flujo de 80 ml/hora. Se lavó la columna con NaCl 0,5 M en PBS hasta
que no se detectó proteína libre en el tampón de lavado.
Finalmente, la columna se lavó con PBS. La proteína de fusión unida
se eluye de la columna con tampón de citrato 25 mM, pH 2,8, y se
lleva a pH 7 con tampón de Hepes 500 mM, pH 9,1.
Una proteína de fusión del
IL-17R que comprende el Flag® también puede
detectarse y/o purificarse usando un anticuerpo que se una al
Flag®, sustancialmente como se describe en Hopp y col.,
Bio/Technology 6: 1204 (1988). Se mide la actividad biológica
mediante la inhibición de la actividad del CTLA-8 en
cualquier análisis biológico que cuantifique el efecto
co-estimulador del CTLA-8, por
ejemplo, tal como se describe en los ejemplos del presente
documento.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo ilustra la preparación de
anticuerpos monoclonales frente al IL-17R. Por
ejemplo, se emplean preparaciones purificadas del
IL-17R recombinante o células transfectadas que
expresen altas concentraciones del IL-17R, para
generar anticuerpos monoclonales frente al IL-17R
usando técnicas ordinarias, tales como las que se describen en la
patente de Estados Unidos Nº 4.411.993. Es probable que tales
anticuerpos sean útiles para interferir en la unión del
IL-17R al CTLA-8, como componentes
de análisis de diagnóstico o de investigación para el
IL-17R, o en la purificación por afinidad del
IL-17R.
Para inmunizar roedores, el inmunógeno de
IL-17R se emulsiona en un adyuvante (tal como el
adyuvante de Freund completo o incompleto, alumbre, u otro
adyuvante, tal como el adyuvante R700 de Ribi (Ribi, Hamilton, MT))
y se inyecta subcutáneamente, en cantidades que varían de 10 a 100
\mug, en un roedor seleccionado, por ejemplo, ratones BALB/c o
ratas de Lewis. De diez días a tres semanas después, los animales
inmunizados se someten a una dosis de recuerdo con inmunógeno
adicional y después, de un modo periódico, se someten a una dosis
de recuerdo en un programa de inmunización semanal, cada dos semanas
o cada tres semanas. Periódicamente, se toman muestras de suero
mediante hemorragia retro-orbital o mediante
escisión de la punta de la cola para analizarlas mediante análisis
de transferencia por puntos (en sándwich de anticuerpos), ELISA
(enzimoinmunoanálisis), inmunoprecipitación, u otros análisis
adecuados, que incluyen el análisis FACS. Después de la detección de
una valoración apropiada del anticuerpo, se somete a los animales
positivos a una inyección intravenosa con el antígeno en solución
salina. Tres a cuatro días después, se sacrifican los animales, se
recogen los esplenocitos y se fusionan con una línea celular de
mieloma murino (por ejemplo, NS1 o, preferentemente, Ag 8,653 [ATCC
CRL 1580]). Las líneas celulares de hidridomas generadas mediante
este procedimiento se siembran en placas múltiples de
microvaloración en un medio de selección (por ejemplo, uno que
contenga hipoxantina, aminopterina, y timidina, o HAT) para inhibir
la proliferación de las células sin fusionar, de los híbridos
mieloma-mieloma y de los híbridos
esplenocito-esplenocito.
De este modo, los clones de los hibridomas
generados pueden rastrearse mediante ELISA en busca de reactividad
con el IL-17R, por ejemplo, mediante adaptaciones de
las técnicas descritas por Engvall y col., Immunochem. 8: 871
(1971) y en la patente de Estados Unidos Nº 4.703.004. Una técnica
de rastreo preferida es la técnica de captura del anticuerpo
descrita por Beckman y col., J. Immunol. 144: 4212 (1990).
Seguidamente, los clones positivos se inyectan en las cavidades
peritoneales de los roedores isogenéticos para producir ascitis que
contengan altas concentraciones (>1 mg/ml) del anticuerpo
monoclonal anti-IL-17R. El
anticuerpo monoclonal resultante puede purificarse mediante
precipitación en sulfato amónico seguida de cromatografía de
exclusión en gel. De modo alternativo, también puede usarse la
cromatografía de afinidad en base a la unión del anticuerpo a la
proteína A o la proteína G, así como la cromatografía de afinidad en
base a la unión a la proteína IL-17R.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo ilustra la capacidad del
IL-17R de inhibir la respuesta de proliferación de
los linfocitos T a los mitógenos. Se recogieron, de un modo
aséptico, los órganos linfoides y se creó una suspensión celular.
Se aislaron los linfocitos T esplénicos y del nódulo linfático a
partir de la suspensión celular. La pureza de las preparaciones de
linfocitos T esplénicos resultantes fue, habitualmente, >95% de
CD3^{+} y <1% de sIgM^{+}. Los linfocitos T esplénicos
murinos purificados (2 x 10^{5}/pocillo) se cultivaron con PHA 1%
o bien con Con A 1 \mug/m, y se valoró un IL-17R
soluble en el análisis. Se determinó la proliferación después de
tres días con adición de 1 \muCi de [^{3}H]timidina. Se
determina la secreción de citoquinas (interleuquina 2) en los
linfocitos T murinos cultivados durante 24 horas con 1 \mug/ml de
Con A en presencia o ausencia de 10 \mug/ml de
IL-17R/Fc o en presencia de una proteína Fc control.
Se midió la producción de IL-2 mediante ELISA y se
produjeron resultados expresados en ng/ml
de IL-2.
de IL-2.
El IL-17R/Fc soluble inhibía
significativamente la proliferación inducida por mitógeno de los
linfocitos T esplénicos murinos purificados de una manera
dependiente de dosis, mientras que un Fc control no tuvo efecto
sobre la proliferación de los linfocitos T murinos. Se observó la
inhibición completa de la proliferación inducida por mitógeno a una
concentración de IL-17R/Fc soluble de 10 \mug/ml.
El análisis de la producción de IL-2 por los
linfocitos T esplénicos activados con Con A en presencia o ausencia
de IL-17R/Fc en el cultivo reveló que la adición de
IL-17R/Fc al cultivo de linfocitos T inhibió la
producción de IL-2 hasta concentraciones
8-9 veces inferiores que las observadas en los
cultivos que contenían medio solo o medio más una proteína Fc
control. Se observaron resultados similares cuando se usaron
linfocitos T humanos purificados.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo presenta el aislamiento de un ADN
que codifica el IL-17R humano mediante hibridación
cruzada entre especies. Se preparó una genoteca de linfocitos
humanos de sangre periférica y se rastreó, sustancialmente, como se
describe en el documento USSN 08/249189, usando ADN del
IL-17R murino en condiciones de una moderadamente
alta estrictez. Se obtuvieron diversos clones de diversas
longitudes. Los datos de la secuenciación indicaron que el
IL-17R humano era, aproximadamente, idéntico en un
76% al IL-17R murino al nivel de nucleótidos. Las
secuencias de nucleótidos y de aminoácidos predicha del
IL-17R humano se muestran en las SEQ ID Nº: 10 y 11.
Se depositó un plásmido (pGEMBL) que contenía ADN que codifica el
receptor humano de la IL-17 (denominado
pGEMBL-HuIL-17R) en E. coli
DH10 en la colección americana de cultivos tipo, 12.301 Parklawn
Drive, Rockville, MD 20.852-1776, Estados Unidos,
el 5 de junio de 1995, bajo las condiciones del tratado de Budapest,
y se le asignó el número de acceso 69.834.
El IL-17R humano comparte muchas
características con el IL-17R murino. El análisis
por ordenador indicó que la proteína tiene un péptido de
señalización N-terminal con un sitio de corte entre
el aminoácido 27 y el 28. El péptido de señalización está seguido
por un dominio extracelular de 293 aminoácidos, un dominio
transmembranal de 21 aminoácidos, y una cola citoplásmica de 525
aminoácidos. El IL-17R soluble comprende el péptido
de señalización y el dominio extracelular (restos 1 a 320 de la SEQ
ID Nº: 1) o un fragmento del mismo. De modo alternativo, puede
sustituirse el péptido de señalización natural por un péptido de
señalización diferente. Se preparó una proteína de fusión con Fc
del tipo I (en la que el ADN que codifica la región Fc de una
molécula de inmunoglobulina se fusiona con el ADN que codifica el
IL-17R inmediatamente antes, y el lugar del ADN que
codifica la región transmembranal del IL-17R),
sustancialmente como se describe en el ejemplo 4. También puede
expresarse una proteína hIL-17R soluble
sustancialmente como se describe en el ejemplo 3, o mediante
cualquier otro método para preparar y expresar el dominio
extracelular del IL-17R o un fragmento del
mismo.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo presenta la localización y la
cartografía fina del gen del IL-17R murino. Se
analizó un panel de muestras de ADN de un cruzamiento
interespecífico que había sido caracterizado con por encima de 900
marcadores genéticos a lo largo del genoma. Los marcadores
genéticos incluidos en este mapa abarcaban entre 50 y 80
centi-Morgans en cada autosoma del ratón y en el
cromosoma X (Chr) (Saunders y Seldin, Genomics 8: 524, 1990; Watson
y col., Mammalian Genome 2: 158, 1992).
Inicialmente, se digirió el ADN de los dos
ratones parentales [C3H/HeJ-gld y (C3H/HeJ-gld x
Mus spretus) F1] con diversas endonucleasas de restricción y
se hibridó con la sonda de ADNc del IL-17R para
determinar los variantes de longitud de los fragmentos de
restricción (RFLV), para permitir el análisis del haplotipo. Se
detectaron RFLV de BglII informativos: C3H/HeJ-gld, 10,0 kb;
Mus spretus, 7,8 kb y 2,2 kb). En cada ratón retrocruzado se
observaron o bien la banda parental del C3H/HeJ-gld o bien
todas las tres bandas (ambas bandas del Mus spretus y una
banda del C3H/HeJ-gld de intensidad media) indicando que se
detectó un locus único.
La comparación de la distribución del haplotipo
de los RFLV del IL-17R indicó que este gen se
co-segregaba en 111 de los 114 eventos meióticos
examinados junto con el locus del gen Raf1 del Chr 6 del ratón. El
mejor orden génico (Bishop, Genet. Epidemiol. 2: 349, 1985) \pm
la desviación típica (Green, en Genetics and Probability in Animal
Breeding Experiments. E. Green, ed; Macmillan, Nueva York, págs:
77-113, 1981) fue: (centrómero) Raf1-2,6 cM
\pm 1,5 cM-IL-17R-2,5 cM \pm 1,5
cM-Cd4.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo demuestra que el
IL-17R soluble suprime el rechazo de injertos de
órganos in vivo. Se trasplantaron corazones de ratones
C57BL/6 (H-2^{b}) recién nacidos (menos de 24
horas de edad) en el pabellón auditivo de receptores BALB/c
(H-2^{b}) adultos sustancialmente como se describe
en la patente de Estados Unidos Nº 5.492.888, expedida el 20 de
febrero de 1996 (utilizando el método de Fulmer y col., Am. J. Anat.
113: 273, 1963, modificado como describen Trager y col.,
Transplantation 47: 587, 1989, y Van Buren y col., Transplant.
Proc. 15: 2967, 1983). Se valoró la supervivencia de los corazones
trasplantados mediante inspección visual de los injertos en busca
de actividad pulsátil, tal como se determina mediante examen de los
injertos oreja-corazón de los receptores
anestesiados en un microscopio de disección con luz débil reflejada
comenzando el día 5 ó 6 después del trasplante. Se definió el
tiempo del rechazo del injerto como el día después del trasplante
en el que cesa la actividad contráctil.
En un conjunto de experimentos, se eliminaron
los corazones de los recién nacidos, se enjuagaron con PBS estéril
para eliminar el exceso de sangre y se colocaron en pabellones
auditivos preparados. Se administró a los ratones receptores o bien
IL-17R murino/Fc (100 \mug en 200 \mul; véase el
ejemplo 4 del presente documento) soluble o bien IgG de rata como
control, intraperitonealmente en los días 0 a 3 después del
trasplante. En un segundo conjunto de experimentos, se inyectó a
los ratones receptores IL-17R o IgG humana en los
días 0, 1 y 2; la cantidad y la ruta de inyección fueron como
previamente. Los resultados de estos experimentos se muestran en la
tabla 1.
La tabla 1 muestra que los aloinjertos de
corazón sobreviven, aproximadamente, 13 días en los ratones control
individuales tratados con IgG de rata. Cuando se administró a los
receptores del aloinjerto hasta cuatro inyecciones diarias de
IL-17R soluble, se prolongó la supervivencia del
injerto, con una supervivencia media de 20, aproximadamente, siete
días mayor que el tiempo de supervivencia de los injertos idénticos
en los ratones control. Cuando se obtuvo una liberación prolongada
del IL-17R mediante encapsulación del
IL-17R soluble en perlas de alginato, se observó
que una administración única de 100 \mug del
IL-17R soluble prolongó la supervivencia del
injerto virtualmente de la misma manera que la observada previamente
con el IL-17R soluble en solución. Estos resultados
demuestran que el IL-17R soluble suprime el rechazo
de los tejidos injertados.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo demuestra que el ADN que codifica
el IL-17R soluble será útil en la supresión del
rechazo de los injertos de órganos in vivo. Se trasplantaron
corazones de ratones C57BL/6 (H-2^{b}) recién
nacidos en el pabellón auditivo de receptores BALB/c
(H-2^{b}) adultos como se describe anteriormente
en el ejemplo 10, excepto en que se inyectaron a los corazones 15
\mul de PBS que contenía o bien ADN que codifica
IL-17R/Fc
(pDC409-IL-17R; ejemplo 4) o bien
ADN control (pDC409 vacío) a una concentración de, aproximadamente,
1 mg/ml, en el ventrículo. Se usó una aguja de 0,254 mm y se tuvo
cuidado en minimizar el trauma en la oreja. Seguidamente, se
trasplantaron los corazones transfectados en receptores BALB/c y se
determinó la supervivencia del injerto como se describe
previamente. Los resultados se presentan en la tabla 2.
La tabla 2 muestra que los aloinjertos de
corazón sobreviven, aproximadamente, 15 días en los ratones control
individuales trasplantados con corazones transfectados con el vector
vacío. Cuando los corazones trasplantados se transfectaron con ADN
que codifica el IL-17R soluble, se prolongó la
supervivencia del injerto. Para tres de los cinco ratones de este
grupo, los injertos sobrevivieron como término medio,
aproximadamente, 24 días, nueve días más que el tiempo de
supervivencia de los injertos idénticos en los ratones control. Los
injertos de los otros dos ratones a un eran pulsátiles (es decir,
no mostraron rechazo) más de 60 días después del trasplante y,
aparentemente, habían sido aceptados por los receptores. Estos
resultados demuestran que la transfección de tejidos que van a ser
injertados con ADN que codifica el IL-17R soluble
mejora el rechazo de estos tejidos por el receptor.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (I)
- SOLICITANTE: Yao, Zhengbin.
\hskip3.9cmSpriggs, Melanie
\hskip3.9cmFanslow, William
\vskip0.800000\baselineskip
- (II)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Novel Receptor That Binds IL-17
\vskip0.800000\baselineskip
- (III)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 10
\vskip0.800000\baselineskip
- (IV)
- DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A.
- DESTINATARIO: Immunex Corporation
\vskip0.500000\baselineskip
- B.
- CALLE: 51 University Street
\vskip0.500000\baselineskip
- C.
- CIUDAD: Seattle
\vskip0.500000\baselineskip
- D.
- ESTADO: Washington
\vskip0.500000\baselineskip
- E.
- PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.500000\baselineskip
- F.
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 98101
\vskip0.800000\baselineskip
- (V)
- FORMA INFORMÁTICA LEGIBLE:
\vskip0.500000\baselineskip
- A.
- SOPORTE INFORMÁTICO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- B.
- ORDENADOR: Apple Macintosh
\vskip0.500000\baselineskip
- C.
- SISTEMA OPERATIVO: Apple Operating system 7.1
\vskip0.500000\baselineskip
- D.
- PROGRAMA: Microsoft Word for Apple, version 5.1a
\vskip0.800000\baselineskip
- (VI)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- A.
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- B.
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- C.
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (VII)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- A.
- NÚMERO DE SOLICITUD: 08/538.765
\vskip0.500000\baselineskip
- B.
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 7 de agosto de 1995
\vskip0.500000\baselineskip
- C.
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (VII)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- A.
- NÚMERO DE SOLICITUD: 08/410.535
\vskip0.500000\baselineskip
- B.
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 23 de marzo de 1995
\vskip0.500000\baselineskip
- C.
- CLASIFICACIÓN
\vskip0.800000\baselineskip
- (VIII)
- INFORMACIÓN DEL REPRESENTANTE/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- A.
- NOMBRE: Perkins, Patricia Anne
\vskip0.500000\baselineskip
- B.
- NÚMERO DE REGISTRO: 34.695
\vskip0.500000\baselineskip
- C.
- NÚMERO DE EXPEDIENTE DE REFERENCIA: 2617-WO
\vskip0.800000\baselineskip
- (IX)
- INFORMACIÓN PARA LA TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- A.
- TELÉFONO: (206) 587-0430
\vskip0.500000\baselineskip
- B.
- TELEFAX: (206)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1.
\vskip0.800000\baselineskip
- (I)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A.
- LONGITUD: 3288 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- B.
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- C.
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- D.
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (II)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm
\vskip0.800000\baselineskip
- (III)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (IV)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (VI)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- A.
- ORGANISMO: Ratón
\vskip0.500000\baselineskip
- B.
- CLON: Receptor HVS13
\vskip0.800000\baselineskip
- (IX)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A.
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- B.
- LOCALIZACIÓN:121...2715
\vskip0.800000\baselineskip
- (XI)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 2.
\vskip0.800000\baselineskip
- (I)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- A.
- LONGITUD: 865 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- B.
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- D.
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (II)
- TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (XI)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (I)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A.
- LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- B.
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- C.
- CADENA: sin relevancia
\vskip0.500000\baselineskip
- D.
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (II)
- TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (VII)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- C.
- CLON: Péptido FLAG®
\vskip0.800000\baselineskip
- (XI)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (I)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A.
- LONGITUD: 213 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- B.
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- C.
- CADENA: sin relevancia
\vskip0.500000\baselineskip
- D.
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (II)
- TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (VI)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- A.
- ORGANISMO: Ser humano
\vskip0.800000\baselineskip
- (VII)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- B.
- CLON: Fc de la IgG1
\vskip0.800000\baselineskip
- (XI)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA. SEQ ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (I)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A.
- LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- B.
- TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- C.
- CADENA: sin relevancia
\vskip0.500000\baselineskip
- D.
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (II)
- TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (VI)
- FUENTE INMEDIATA.
\vskip0.500000\baselineskip
- B.
- CLON: Poliengarzador
\vskip0.800000\baselineskip
- (XI)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (I)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A.
- LONGITUD: 498 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- B.
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- C.
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- D.
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (II)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNC a ARNm
\vskip0.800000\baselineskip
- (III)
- HIPOTÉTICO. NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (IV)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (VI)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- A.
- ORGANISMO: CTLA-8 murino
\vskip0.800000\baselineskip
- (IX)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A.
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- B.
- LOCALIZACIÓN: 14..490
\vskip0.800000\baselineskip
- (IX)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A.
- NOMBRE/CLAVE: péptido_sig
\vskip0.500000\baselineskip
- B.
- LOCALIZACIÓN: 14..88
\vskip0.800000\baselineskip
- (IX)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A.
- NOMBRE/CLAVE: péptido_mat
\vskip0.500000\baselineskip
- B.
- LOCALIZACIÓN: 89..487
\vskip0.800000\baselineskip
- (XI)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (I)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A.
- LONGITUD: 159 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- B.
- TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- C.
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (II)
- TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (XI)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (I)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A.
- LONGITUD: 151 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- B.
- TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- C.
- CADENA: sin relevancia
\vskip0.500000\baselineskip
- D.
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (II)
- TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (III)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (IV)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (VI)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- A.
- ORGANISMO: Herpesvirus saimiri
\vskip0.500000\baselineskip
- B.
- CLON: ORF13
\vskip0.800000\baselineskip
- (XI)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (I)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A.
- LONGITUD: 3223 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- B.
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- C.
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- D.
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (II)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm
\vskip0.800000\baselineskip
- (III)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (IV)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (VI)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- A.
- ORGANISMO: Ser humano
\vskip0.500000\baselineskip
- B.
- CLON: IL-17R
\vskip0.800000\baselineskip
- (IX)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A.
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- B.
- LOCALIZACIÓN: 93..2693
\vskip0.800000\baselineskip
- (XI)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (I)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A.
- LONGITUD: 867 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- B.
- TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- D.
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (II)
- TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (XI)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 10:
Claims (17)
1. ADN aislado o recombinante seleccionado del
grupo constituido por:
- (a)
- ADN que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos del aminoácido 1 al 322 de la SEQ ID Nº: 2;
- (b)
- ADN que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos del aminoácido 1 al 320 de la SEQ ID Nº: 10; y
- (c)
- ADN capaz de hibridar con el ADN de (a) o (b) en condiciones estrictas, y que codifica el IL-17R que se une a la IL-17; y
- (d)
- ADN que codifica un fragmento de una proteína codificada por el ADN de (a), (b), o (c), cuyo fragmento se une a la IL-17.
\vskip1.000000\baselineskip
2. ADN aislado o recombinante seleccionado del
grupo constituido por:
- (a)
- ADN que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos del aminoácido 1 al 322 de la SEQ ID Nº: 2;
- (b)
- ADN que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos del aminoácido 1 al 320 de la SEQ ID Nº: 10; y
- (c)
- moléculas de ADN que codifican proteínas que son al menos 70% idénticas en la secuencia de aminoácidos a las proteínas de (a) o (b) y que se une a la IL-17; y
- (d)
- moléculas de ADN que codifican fragmentos de proteínas codificadas por el ADN de (a), (b), o (c), cuyos fragmentos se unen a la IL-17.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Un vector de expresión recombinante que
comprende una secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 1 o
la reivindicación 2.
4. Un vector de expresión recombinante de
acuerdo con la reivindicación 4, que expresa un
IL-17R soluble.
5. Una célula hospedadora transformada o
transfectada con un vector de expresión de acuerdo con la
reivindicación 3 o la reivindicación 4.
6. Un procedimiento para preparar una proteína
IL-17R, que comprende cultivar una célula
hospedadora según la reivindicación 5 en condiciones que promuevan
la expresión y recuperar el IL-17R.
7. Una proteína receptora de la
interleuquina-17 (IL-17R) aislada y
purificada que se une a la IL-17, seleccionada del
grupo constituido por:
- (a)
- una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos del aminoácido 1 al 322 de la SEQ ID Nº: 2;
- (b)
- una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos del aminoácido 1 al 320 de la SEQ ID Nº: 10;
- (c)
- una proteína codificada por una molécula de ADN capaz de hibridar con un ADN que codifica una proteína de (a) o (b) en condiciones estrictas, y que se une a la IL-17; y
- (d)
- un fragmento de una proteína de (a), (b), o (c), que se une a la IL-17.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Una proteína IL-17R aislada y
purificada, seleccionada del grupo constituido por:
- (a)
- una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos del aminoácido 1 al 322 de la SEQ ID Nº: 2;
- (b)
- una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos del aminoácido 1 al 320 de la SEQ ID Nº: 10;
- (c)
- una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que es, al menos, aproximadamente, idéntica en un 70% a las secuencias de aminoácidos de las proteínas (a) o (b), y que se une a la IL-17; y
- (d)
- fragmentos de las proteínas de (a), (b), o (c), que se unen a la IL-17.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Un IL-17R aislado y
purificado de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende un
IL-17R soluble.
10. Una composición que comprende una proteína
IL-17R de acuerdo con la reivindicación 7 o la
reivindicación 8 o la reivindicación 9 y un diluyente o vehículo
adecuado.
11. Una proteína IL-17R según la
reivindicación 7 o la reivindicación 8 o la reivindicación 9 o una
composición, según la reivindicación 10, para el uso en la
regulación de una respuesta inmunitaria o inflamatoria en un
mamífero.
12. Un anticuerpo que inmunorreaccione con el
IL-17R.
13. Un anticuerpo según la reivindicación 12,
que es un anticuerpo monoclonal.
14. Una proteína o una composición, según la
reivindicación 11, para el uso en la supresión del rechazo de un
órgano injertado o un tejido injertado en un receptor de
injertos.
15. El uso de una proteína
IL-17R según la reivindicación 7 o la reivindicación
8 o la reivindicación 9 en la preparación de una composición para
suprimir el rechazo de un órgano injertado o un tejido injertado en
un receptor de injertos.
16. El uso de un ADN que codifica un
IL-17R soluble de acuerdo con la reivindicación 1 o
la reivindicación 2 en la preparación de una composición para
suprimir el rechazo de un órgano injertado o un tejido injertado en
un receptor de injertos.
17. El uso de un ADN que codifica un
IL-17R soluble de acuerdo con la reivindicación 1 o
la reivindicación 2 o una proteína IL-17R de
acuerdo con la reivindicación 7 o la reivindicación 8 o la
reivindicación 9 en la preparación de una composición o
composiciones para la administración separada, simultánea o
secuencial para suprimir el rechazo de un órgano injertado un
tejido injertado en un receptor de injertos.
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